PL183781B1

PL183781B1 - Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków

Info

Publication number: PL183781B1
Application number: PL95317234A
Authority: PL
Inventors: Kathrin U. Jansen; Iii James C. Cook; Hugh A. George; Kathryn J. Hofmann; Joseph G. Joyce; Ernest D. Lehman; Henry Z. Markus; Mark Rosolowsky; Loren D. Schultz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-05-16
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2002-07-31
Also published as: RU2206608C2; WO1995031532A1; MXPA96005662A; RO117541B1; BG100974A; FI964592A; SK147696A3; FI964592A0; CA2189882C; BR9507657A; DK0757717T3; PT757717E; JP3863559B2; AU693203B2; NO964862D0; SI0757717T1; DE69535018T2; HU9603155D0; DE69535018D1; JPH10500847A

Abstract

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków, (HPV), do podawania ludziom, zawierajacej czastki wiroidalne (VLP), znamienny tym, ze obejmuje etapy: a) transformowania drozdzy czasteczka DNA, kodujaca bialko L 1 HPV albo bialka L1+L2 HPV, z wytworzeniem transformowanej komórki drozdzy; b) hodowania transformowanej komórki drozdzy w warunkach umozliwiajacych wytwarzanie bialek rekombinowanych i ich spontaniczne laczenie sie w VLP; c) zbierania VLP z transformowanych komórek; d) oczyszczanie VLP przez przynajmniej jeden etap chromatografii; i e) wytwarzanie szczepionki. 2. Sposób wedlug zastrz. 1 , znamienny tym, ze szczepem drozdzy jest Saccharomy- ces cerevisiae. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 , znamienny tym, ze HPV wybrany jest z grupy obejmu- jacej HPV typu 6a, HPV typu 6b, HPV typu 11, HPV typu 16 i HPV typu 18. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków.

Zakażenia wirusem brodawczaków następują u różnych zwierząt, w tym u ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i bydła. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonka, ogólnie, wywołując łagodne guzy nabłonkowe albo włóknistonabłonkowe w miejscu zakażenia. Wirusy brodawczaków stanowią gatunkowo swoisty czynnik zakaźny: ludzkie wirusy brodawczaków nie zakażają zwierząt nie będących ludźmi.

Wirusy brodawczaków mogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakażają. Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) są dalej dzielone na ponad 60 rodzajów, w oparciu o homologię sekwencji DNA (patrz, praca przeglądowa: Papillomaviruses and Human Cancers, H. Pfister (ed.) CRC Press Inc., 1990). Wydaje się, że rodzaje wirusa brodawczaków są immunogenami swoistymi dla rodzaju, i odporność neutralizująca jeden rodzaj wirusa brodawczaków nie zapewnia odporności w stosunku do innego rodzaju wirusa brodawczaków.

U ludzi, różne rodzaje HPV powodują różne choroby. HPV typów 1, 2, 3, 4, 7, 10 i 26-29 powodują łagodne brodawki u osobników zarówno normalnych jak i poddanych immunosupresji. HPV typów 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 i 46-50 powodują płytkie owrzodzenia u osobników poddanych immunosupresji. HPV typów 6, 11, 34, 39, 41-44 i 51-55 powodują niezłośliwe kłykciny na śluzówce narządów płciowych lub układu oddechowego. HPV typów 16 i 18 powodują dysplazję nabłonkową na śluzówce narządów płciowych i są związane z większością raków in situ i inwazyjnych szyjki macicy, pochwy, sromu i kanału odbytu. HPV 6 i HPV 11 są czynnikami przyczynowymi ponad 90% wszystkich kłykcin (brodawek genitalnych) i brodawczaków krtani. Najbardziej rozpowszechnionym HPV 6 jest podtyp HPV 6a.

Badania immunologiczne na zwierzętach wykazały, że wytwarzanie przeciwciał neutralizujących przeciwko antygenom wirusa brodawczaków zapobiega zakażeniu przez wirus homologiczny. Opracowanie efektywnych szczepionek przeciwko wirusowi brodawczaków zostało spowolnione przez trudności związane z hodowlą wirusów brodawczaków in vitro. Opracowanie efektywnej szczepionki przeciwko HPV zostało szczególnie spowolnione przez

183 781 brak odpowiedniego modelu zwierzęcego.

Wydaje się, że neutralizacja wirusów brodawczaków przez przeciwciała jest swoista dla rodzaju i zależy od epitopów konformacyjnych na powierzchni wirusa.

Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozahedralnymi wirusami DNA, kodującymi do ośmiu genów wczesnych i dwa późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od El do E7 i od L1 do L2, gdzie „E” oznacza wczesny, zaś „L” oznacza późny. L1 i L2 kodują białka kapsydu wirusa. Geny wczesne (E) związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa.

Białko L1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym 55-60 kDa. Białko L2 jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym 55-60 kDa i pozornym ciężarze cząsteczkowym 75-100 kDa, co stwierdzono przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Dane immunologiczne wskazują, że większość białka L2 stanowi wnętrze białka LI. Białka L2 są silnie zakonserwowane wśród różnych wirusów brodawczaków, zwłaszcza dziesięć zasadowych aminokwasów końca C. ORF L1 jest silnie zakonserwowana wśród różnych wirusów brodawczaków.

Geny L1 i L2 stosowano do wytwarzania szczepionek do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusami brodawczaków u zwierząt. Zhou i in., (1991, 1992) wklonowali geny L1 i L2 HPV typu 16, do wektora wirusa krowianki i zakazili komórki ssaków CV-1 wektorem rekombinowanym w celu wytworzenia cząstek wiroidalnych (VLP).

Wytworzono uzyskane z bakterii rekombinowane L1 i L2 bydlęcych wirusów brodawczaków. Surowice neutralizujące w stosunku do białek z rekombinowanych bakterii w małym stopniu reagowały krzyżowo z wirusem natywnym, prawdopodobnie z powodu różnic konformacyjnych białek natywnych i uzyskanych z bakterii.

Rekombinowane bakulowirusy ekspresjonujące otwarte ramki odczytu LI HPV 6, L1 HPV 11, L1 HPV 16, L1 HPV 18, L1 HPV 31 i L2 HPV 16, zastosowano do zakażenia owadzich komórek SF9 i wytworzenia białek L1 i L2. Analiza metodą western blotting wykazała, że uzyskane z bakulowirusa białka L1 i L2 oddziaływały z przeciwciałem przeciwko HPV 16. L1 uzyskane z bakulowirusa tworzyło VLP

Carter i in., (1991) pokazali wytwarzanie białek L1 HPV 16 i L2 HPV 16 przez rekombinowany szczep Saccharomyces cerevisiae. Carter i in., pokazali również wytwarzanie białek L1 i L2 HPV 6b. Białko L1 HPV 6b nie było białkiem L1 pełnej długości. Białka te wytwarzane były wewnątrzkomórkowo, jak również jako produkt wydzielany. Białka rekombinowane miały ciężar cząsteczkowy zbliżony do białek natywnych. Gdy białka powstawały w wyniku ekspresji wewnątrzkomórkowej, większość białka była nierozpuszczalna po lizie komórek w nieobecności reagentów denaturujących. Jakkolwiek nierozpuszczalność może wspomagać oczyszczanie białka, może również wpływać ujemnie na analizę natywnych epitopów białka.

Rekombinowane białka wydzielane z drożdży zawierają, jak wykazano, węglowodany pochodzące z drożdży. Obecność tych związanych w pozycji N oligosacharydów, może maskować natywne epitopy. Dodatkowo, wydzielane białka rekombinowane mogą zawierać inne modyfikacje, takie jak zachowanie sekwencji wydzielniczej.

Byłoby użyteczne opracowanie metody wytwarzania wielkich ilości białek wirusa brodawczaków dowolnego gatunku i rodzaju przez hodowanie rekombinowanych drożdży. Byłoby również użyteczne, wytwarzanie znacznych ilości białek wirusa brodawczaków, posiadających właściwości zapewniające odporność podobnie jak białka natywne, takie jak zachowanie konformacji białka natywnego.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków z użyciem rekombinowanych białek wirusa brodawczaków, o charakterystycznych dla natywnych białek wirusa brodawczaków właściwościach wywoływania odporności, jak również sposobów wytwarzania i zastosowania takich białek. Niniejszy wynalazek dotyczy wytwarzania szczepionek profilaktycznych i prawdopodobnie leczniczych, przeciwko zakażeniom wirusem brodawczaków. Rekombinowane białka opisane w wynalazku zdolne są do tworzenia cząstek wiroidalnych. Te VLP są immunogenne i zapobiegają powstawaniu brodawek w modelu zwierzęcym. Niniejszy wynalazek stosuje model wirusa bro4

183 781 dawczaków królików (CRPV) i typu 6 (podtypu 6a) HPV.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków

Figura 1 pokazuje dwukierunkowy drożdżowy wektor ekspresyjny stosowany do ekspresji białek kapsydowych L1 i/lub L2.

Figura 2 pokazuje ekspresję L1 HPV 6a w drożdżach (badanie immunologiczne).

Figura 3 pokazuje ekspresję L1 HPV 6a w drożdżach. Badanie immunologiczne L1 HPV 6a w drożdżach; ścieżka 1, znacznik ciężaru cząsteczkowego; ścieżka 2, białko fuzyjne trpE-L2 ekspresjonowane w E. coli, jako kontrola pozytywna; ścieżka 4, L1 HPV 6a ekspresjonowane w drożdżach jako kontrola negatywna; ścieżka 5, L2 HPV 6a ekspresjonowane w drożdżach (szczegóły doświadczenia, patrz tekst).

Figura 4 pokazuje fotografię z mikroskopu elektronowego VLP L1 HPV 6a, ekspresjonowanego w drożdżach.

Figura 5 pokazuje fotografię z mikroskopu elektronowego VLP L1/L2 HPV 6a, ekspresjonowane w drożdżach.

Figura 6 pokazuje badanie immunologiczne białek L1, L2 i L1+L2 CRPV ekspresjonowanych w drożdżach. Panel (A): Ekspresja L1 CRPV mierzona aktywnością w stosunku do surowicy odpornościowej przeciwko L1 CRPV. Panel (B): ekspresja L2 CRPV mierzona aktywnością w stosunku do surowicy odpornościowej przeciwko L2 CRPV. Ścieżka 1, ,znacznik ciężaru cząsteczkowego w kDa (.Amersham Rainbow™ Markers, 14300-200000 Da), Ścieżka 2, BJ5462 zawierający wektor ekspresyjny L1 CRPV, Ścieżka 3, szczep 1569 zawierający wektor ekspresyjny L2 CRPV; Ścieżki 4 i 5, dwa izolaty szczepu 1569 stransformowanego dwoma plazmidami do koekspresji L1 i L2 CRPV; Ścieżki 6-8, trzy izolaty szczepu 1569 zawierającego pojedynczy wektor do koekspresji białek L1 i L2 CRPV; Ścieżki 9 i 10, dwa izolaty szczepu Bj5462, zawierającego pojedynczy wektor do koekspresji białek L1 i L2 CRPV. Położenia migrujących L1 i L2 zaznaczono na prawej osi odpowiedniego panelu.

Figura 7 jest schematem konstruowania szczepu 1558 Saccharomyces cerevisiae.

Figura 8 jest schematem konstruowania szczepu 1569 Saccharomyces cerevisiae.

Figura 9 przedstawia główne etapy procesu oczyszczania.

Figura 10 przedstawia listę szczepów.

Figura 11 jest zestawem badań SDS-PAGE L1+L2 HPV 16, oczyszczonych z drożdży. Dodatkowo, oprócz końcowego oczyszczania VLP, włączono oczyszczanie pozostałości z pośrednich procesów oczyszczania. Tablice podają identyfikację próbek na każdej ścieżce. Włączono żel zabarwiony koloidalnym błękitem Coomassie jak również badanie metodą western biot, znakowane surowicą odpornościową przeciwko białkom L1 i L2.

Figura 12 jest schematem alternatywnego procesu oczyszczania L1 wirusa brodawczaków królika..

Figury 13 i 14 są badaniami SDS-PAGE oczyszczonych VLP.

Opisano sposób wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków służącej do zapobiegania, charakteryzowania, wykrywania i leczenia zakażeń wirusem brodawczaków (PV). Sposoby oparte są na wytwarzaniu rekombinowanego białka L1 albo rekombinowanego białka L2 albo rekombinowanych białek L1 i L2 w drożdżach. Rekombinowane białka są zdolne do naśladowania konformacyjnych epitopów neutralizujących epitopy natywnych PV. Rekombinowane białka L1 albo L1 i L2 mogą również tworzyć cząstki wiroidalne (VLP). Kompozycje opisane w wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, rekombinowane cząsteczki DNA kodujące białka L1 albo L2 albo L1 i L2, rekombinowane białka same albo w połączeniu z innymi białkami rekombinowanymi, VLP zbudowane z przynajmniej jednego białka rekombinowanego, fragmentów białek rekombinowanych, kompozycje farmaceutyczne obejmujące białka rekombinowane, kompozycje szczepionek obejmujące białka rekombinowane, przeciwciała przeciwko białkom rekombinowanym albo VLP, kompozycje immunogenne obejmujące przynajmniej jedno białko rekombinowane oraz zestaw diagnostyczny obejmujący rekombinowaną cząsteczkę DNA albo białka rekombinowane. Procesy opisane w wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, sposób wytwarzania białka rekombinowanego, obejmujący transformację odpowiedniej komórki gospodarza drożdżowego

183 781 rekombinowaną cząsteczką DNA, hodowanie transformowanych drożdży w warunkach umożliwiających ekspresję DNA kodującego białko rekombinowane oraz oczyszczanie białka rekombinowanego. Procesy opisane w wynalazku obejmują również podawanie białka rekombinowanego, kompozycji białka rekombinowanego albo VLP zwierzęciu, w tym, ale nie wyłącznie, człowiekowi. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują, ale nie wyłącznie, szczepy drożdży rodzaju Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces i Hansenula.

Zakażenie wirusem brodawczaków zachodzi u różnych zwierząt, w tym u ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i bydła. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonka, ogólnie, wywołując łagodne guzy nabłonkowe albo włóknistonabłonkowe w miejscu zakażenia.

Wirusy brodawczaków mogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakażają Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) są dalej dzielone na ponad 60 rodzajów, w oparciu o homologię sekwencji DNA (patrz, praca przeglądowa: Papillomaviruses and Human Cancers, H. Pfister (ed.) CRC Press Inc., 1990). Wydaje się, że rodzaje wirusa brodawczaków są immunogenami swoistymi dla rodzaju, i odporność neutralizująca jeden rodzaj wirusa brodawczaków nie zapewnia odporności w stosunku do innego rodzaju wirusa brodawczaków.

Badania immunologiczne na zwierzętach wykazały, że wytwarzanie przeciwciał neutralizujących przeciwko antygenom wirusa brodawczaków zapobiega zakażeniu przez wirus homologiczny. Opracowanie efektywnych szczepionek przeciwko wirusowi brodawczaków zostało spowolnione przez trudności związane z hodowlą wirusów brodawczaków in vitro. Opracowanie efektywnej szczepionki przeciwko HPV zostało szczególnie spowolnione przez brak odpowiedniego modelu zwierzęcego.

Neutralizacja wirusów brodawczaków przez przeciwciała wydaje się być swoista dla rodzaju i zależy od epitopów konformacyjnych na powierzchni wirusa.

Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozahedralnymi wirusami DNA, kodującymi do ośmiu genów wczesnych i dwa późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od E1 do E7 i od L1 do L2, gdzie „E” oznacza wczesny, zaś „L” oznacza późny. L1 i L2 kodują białka kapsydu wirusa. Geny wczesne (E) związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa.

Białko L1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym 55-60 kDa. Białko L2 jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym 55-60 kDa i pozornym ciężarze cząsteczkowym 75-100 kDa, co stwierdzono przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym.

Opisano wytwarzanie białek L1 HPV 16, L2 HPV 16 i L1 HPV typu 6 przez rekombinowane szczepy Saccharomyces cerevisiae. Byłoby użyteczne opracowanie metody wytwarzania wielkich ilości białek wirusa brodawczaków dowolnego gatunku i rodzaju przez hodowanie rekombinowanych drożdży'. Byłoby również użyteczne, wytwarzanie znacznych ilości białek wirusa brodawczaków, posiadających właściwości zapewniające odporność podobnie jak białka natywne, takie jak zachowanie konformacji białka natywnego.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania szczepionki z użyciem rekombinowanych białek wirusa brodawczaków o charakterystycznych dla natywnych białek wirusa brodawczaków właściwościach wywoływania odporności, jak również sposobów zastosowa6

183 781 nia takich białek. Niniejszy wynalazek dotyczy szczególnie wytwarzania szczepionek profilaktycznych i prawdopodobnie leczniczych, przeciwko zakażeniom wirusem brodawczaków. Niniejszy wynalazek przedstawiono na przykładzie modelu wirusa brodawczaków królików (CRPV) i ludzkiego wirusa brodawczaków typu 6 (HPV typu 6 albo HPV 6). Ten przykład nie ogranicza zakresu wynalazku, który obejmuje inne rodzaje i podtypy wirusów brodawczaków (PV), w tym, choć nie wyłącznie HPV typu 11, HPV typu 16 i hPv typu 18 jak również HPV podtypu 6a i HPV podtypu 6b.

Kompozycje użyteczne farmaceutycznie obejmujące białka albo VLP, mogą być wytwarzane znanymi sposobami, takimi jak wytwarzanie mieszaniny z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie. Przykłady takich nośników i sposobów tworzenia szczepionek, można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences. Kompozycja dopuszczalna farmaceutycznie, odpowiednia do efektywnego podawania, powinna zawierać efektywną ilość białka albo VLP. Kompozycje takie mogą zawierać białka albo VLP uzyskane z więcej niż jednego rodzaju HPV.

Kompozycje terapeutyczne albo diagnostyczne podawane są osobnikowi w ilości odpowiedniej do leczenia albo diagnozowania zakażenia PV. Ilość efektywna może być różna w zależności od stanu osobnika, ciężaru, płci i wieku. Inne czynniki dotyczą sposobu podawania. Ogólnie, kompozycja powinna być podawana w dawkach zawierających się od około 1 pg do około 250 pg.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczone osobnikowi wieloma drogami, jak podskórna, miejscowa, doustna, śluzówkowa i domięśniowa.

Szczepionki wytworzone sposobem według wynalazku obejmują białka rekombinowane albo VLP, zawierające determinanty antygenowe niezbędne do wywołania tworzenia przeciwciał neutralizujących u gospodarza. Szczepionki takie są wystarczająco bezpieczne, by podawać je bez niebezpieczeństwa zakażenia, nie wykazują toksycznych efektów ubocznych; mogą być podawane efektywną drogą; są stabilne i kompatybilne z nośnikami szczepionek.

Szczepionki mogą być podawane różnymi drogami, jak doustna, pozajelitowa, podskórna, śluzówkowa albo domięśniowa. Dawkowanie może zmieniać się w zależności od stanu, płci, ciężaru i wieku osobnika; drogi podania i rodzaju PV. Szczepionki mogą być stosowane w postaciach użytkowych, takich jak kapsułki, zawiesiny, eliksiry albo roztwory wodne. Szczepionki mogą być łączone z immunologicznie dopuszczalnym nośnikiem.

Szczepionki są podawane w ilościach efektywnych terapeutycznie, tzn. w ilościach odpowiednich do wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej. Efektywna terapeutycznie ilość może być zmienna w zależności od rodzaju PV. Szczepionka może być podawana w dawce pojedynczej albo wielokrotnej .

Sposoby według wynalazku umożliwiają tworzenie szczepionek podjednostkowych do zapobiegania zakażeniom PV. Stosując te sposoby, można wykonać szczepionki monowalentne albo poliwalentne przeciwko PV. Przykładowo, przez włączenie do szczepionki rekombinowanego białka L1 HPV albo białka L2 albo L1 i L2 można wytworzyć szczepionkę monowalentną przeciwko HPV typu 16. Alternatywnie, przez zmieszanie białek L1 albo L2 albo L1 i L2 VLP z różnych typów HPV, można wytworzyć szczepionkę poliwalentną.

Do wytwarzania kompozycji immunogennych mogą być stosowane białka rekombinowane oraz VLP według wynalazku. Kompozycje takie, po wprowadzeniu do odpowiedniego gospodarza, są zdolne do wywołania odpowiedzi odpornościowej u gospodarza.

Rekombinowane białka i VLP mogą być stosowane do wywoływania przeciwciał. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym, oznacza zarówno przeciwciało poliklonalne jak i monoklonalne, jak również ich fragmenty jak Fv, Fab i F(ab)2, które są zdolne do wiązania antygenu bądź haptenu.

Rekombinowane białka, VLP oraz przeciwciała opisane w wynalazku mogą być zastosowane w zakażeniu serotypem HPV oraz w badaniu przesiewowym na HPV. Białka rekombinowane, VLP oraz przeciwciała nadają się do zastosowania w wytwarzaniu zestawów odpowiednich do wykrywania i serotypowania HPV. Zestaw taki obejmuje „nośnik” z przegródkami, który jest odpowiedni do przetrzymywania w nim w szczelnym zamknięciu co najmniej jednego pojemnika. Nośnik powinien dalej zawierać reagenty, jak rekombinowane białko HPV albo VLP albo przeciwciała przeciwko HPV, odpowiednie do wykrywania róż183 781 nych rodzajów HPV. Nośnik może również zawierać środki konieczne do wykrywania, jak znakowany antygen albo substraty enzymu itp. .

Rekombinowane białka oraz VLP opisane w wynalazku są również przydatne jako znaczniki ciężaru cząsteczkowego oraz wielkości cząsteczkowej.

Poniższe przykłady dostarczono w celu dalszego określenia wynalazku, jednakże bez ograniczania wynalazku do szczegółów poniższych przykładów.

PRZYKŁAD1

Przygotowanie szczepu drożdży U9

Szczep 2150-2-3 Saccharomyces cerevisiae (MATa, leu 2-04, ade 1, cir°) uzyskano od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA). Komórki szczepu 2150-2-3 namnożono przez noc w 30°C w 5 ml pożywki YEHD (Carty i in., J. Ind. Micro., 2 (1987) 117-121). Komórki przepłukano trzykrotnie w sterylnej wodzie destylowanej, zawieszono w 2 ml wody i posiano 0,1 ml zawiesiny komórek na sześciu płytkach z kwasem 5-fluoro-orotowym (FOA), w celu selekcji mutantów ura3 (Cold Spring Harbor Manual of Yeast Genetics). Płytki inkubowano w 30°C. Pożywka zawierała 3,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokwasów i siarczanu amonowego; 0,5 g kwasu 5-fluoro-orotowego; 25 mg uracylu i 10 g dekstrozy na 250 ml wody.

Pożywkę sterylizowano przez filtrację przez błonę 0,2 pm i zmieszano z 250 ml 4% Bacto-Agaru (Difco), utrzymywanego w temperaturze 50°C, 10 ml roztworu 1,2 mg/ml adeniny i 5 ml roztworu L-leucyny (180 mg/50 ml). Powstałą pożywkę rozporcjowano na 20 ml szalki Petri'ego.

Po 5 dniach inkubacji, pojawiły się liczne kolonie. Izolowano pojedyncze kolonie, przez rozsianie kolonii z początkowych płytek FOA na świeże płytki FOA, które następnie inkubowano w 30°C. Liczne kolonie z wtórnych płytek FOA badano w kierunku obecności mutacji ura3, przez posiew odbitkowy na płytkach YEHD i płytkach bez uracylu. Pożądanym wynikiem był wzrost na podłożu YEHD i brak wzrostu na płytce bez uracylu. Właściwości te wykazywał jeden z izolatów (U9). Przechowywano go (szczep #325) w -70°C w roztworze glicerolowym do dalszego zastosowania.

PRZYKŁAD2

Przygotowanie wektora do zniszczenia genu drożdży MNN9

W celu wykonania wektora do zniszczenia genu MNN9, konieczne było uprzednie sklonowanie genu MNN9 z genomowego DNA S. cerevisiae. Uzyskano to standardową reakcją łańcuchowąpolimerazy (PCR). Starter sensowny 5' i antysensowny 3' do PCR pełnej długości sekwencji kodującej MNN9, zaprojektowano w oparciu o opublikowaną sekwencję genu MNN9 drożdży (Zymogenetics: zgłoszenie EPO Nr 88117834,7, publikacja Nr 0-314-096-A2). Zastosowano następujące startery oligodezoksynukleotydowe, zawierające flankujące miejsca Hindlll (podkreślone):

starter sensowny:

5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (Identyfikator Sekw. Nr 1) i starter antysensowny:

5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 2).

Kodon początkowej metioniny genu MNN9 zaznaczono wytłuszczeniem. PCR przeprowadzono stosując, jako matrycę, genomowy DNA S. cerevisiae. szczepu JRY188, polimerazę DNA Taq (Perkin Elmer) i 25 cykli amplifikacji (94°C przez 1 minutę, 37°C przez 2 minuty i 72°C przez 3 minuty). Powstały fragment PCR wielkości 1,2 kbp trawiono Hindlll, oczyszczono na żelu i poddano ligacji z trawionym Hindlll, traktowanym fosfatazą alkaliczną pUC13 (Pharmacia). Powstały plazmid oznaczono jako pl 183.

W celu zniszczenia genu MNN9 genem URA3 drożdży, plazmid pBR322-URA3 (zawierający fragment Hindlll, wielkości 1,1 kbp, kodujący gen URA3 S. cerevisiae, wklonowany w miejsce Hindlll pBR322) trawiono Hindlll, po czym fragment wielkości 1,1 kbp, zawierający funkcjonalny gen URA3 oczyszczono na żelu, stępiono końce polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z trawionym Pmll plazmidem p 1183 (Pmll tnie w sekwencji kodującej

183 781

MNN9). Powstały plazmid p 1199 zawierał gen MNN9 zniszczony funkcjonalnym genem URA3.

PRZYKŁAD3

Konstruowanie szczepu 1372, pochodzącego od U9, zawierającego zniszczony gen MNN9

W celu zniszczenia MNN9 w szczepie U9 (#25), 30 pg plazmidu pH9 9 trawiooo Hindlll, tworząc liniową kasetę niszczącą mnn9::URA3. Komórki szczepu 325 transformowano trawionym Hindlll DNA p1199, metodą sferoplastu (Hinnen i in., 1978, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933) zaś transformanty wybierano na syntetycznym podłożu agarowym pozbawionym uracylu i zawierającym 1,0 M sorbitol. Pożywka syntetyczna zawierała w litrze wody destylowanej: agar, 20 g; „yeast nitrogen base” bez aminokwasów, 6,7 g; adeninę, 0,04 g; L-tyrozynę, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukozę, 20 g i „roztwór bez leucyny #2”, 10 ml. Roztwór bez leucyny #2 zawierał w litrze wody destylowanej: L-argininę, 2 g; L-histydynę, 1 g; L-leucynę, 6 g; L-izoleucynę, 6 g; L-lizynę, 4 g; L-metioninę, 1 g; L-fenyloalaninę, 6 g; L-treoninę, 6 g i L-tryptofan, 4 g.

Płytki inkubowano w 30°C przez pięć dni, po czym pojawiły się liczne kolonie. Z 10 kolonii wykonano preparaty DNA chromosomalnego i trawiono je EcoRI i Hindlll. Trawienia DNA badano metodą Southema (J. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) stosując jako sondę fragment Hindlll, wielkości 1,2 kbp, zawierający gen MNN9 (izolowany z plazmidu p1199). Określono jeden z izolatów (szczep #1372), wykazujący oczekiwane przesunięcie prążków DNA w badaniu Southema, jak również cechę fenotypową charakterystyczną dla mutantów MNN9, polegającą na wyjątkowej zdolności do zbijania się w bryłki.

PRZYKŁAD4

Konstruowanie wektora do zniszczenia genu HIS3 drożdży

W celu skonstruowania kasety niszczącej, w której gen HIS3 S. cerevisiae jest zniszczony genem URA3, plazmid YEp6 (K. Struhl i in., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1035) trawiono BamHI. Fragment BamHI, wielkości 1,7 kbp, zawierający gen HIS3, oczyszczono na żelu, stępiono końce polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z pUC18, trawionym uprzednio BamHI i traktowanym polimerazą DNA T4. Powstały plazmid (oznaczony p1501 albo pUC18-HIS3) trawiono Nhel (tnącym sekwencji kodującej HIS3), po czym fragment wektora oczyszczono na żelu, stępiono końce polimerazą DNA T4 i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną. Gen URA3 izolowano z plazmidu pBR322-URA3 przez trawienie Hindlll, po czym fragment wielkości 1,1 kbp, zawierający gen URA3, oczyszczono na żelu, stępiono końce polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z opisanym wyżej fragmentem Nhel pUC18-HIS3. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-his3::URA3 albo p1505) zawierał kasetę niszczącą, w której gen drożdżowy HIS3 był przerwany funkcjonalnym genem URA3.

PRZYKŁAD5

Konstruowanie wektora do zniszczenia genu PRB1 drożdży przez gen HIS3

Plazmid FP8AH, zawierający gen PRB1 S. cerevisiae dostarczył Dr E. Jones z CarnegieMellon Univ. (C. M. Moehle i in., 1987, Genetics 115:255-263). Trawiono go Hindlll i XhoI, po czym fragment wielkości 3,2 kbp, zawierający gen PRB1 oczyszczono na żelu i stępiono końce przez działanie polimerazą DNA T4. Plazmid pUC18 trawiono BamHI, oczyszczono na żelu i stępiono końce działaniem polimerazą DNA T4. Powstały fragment wektora poddano ligacji z fragmentem zawierającym gen PRB1, otrzymując plazmid pUC18-PRB1. Plazmid YEp6, zawierający gen HIS3, trawiono BamHI. Powstały fragment BamHI, wielkości 1,7 kbp, zawierający funkcjonalny gen HIS3, oczyszczono na żelu i stępiono końce działaniem polimerazą T4. pUC18-PRBl trawiono EcoRI i Ncol, które cięły w sekwencji kodującej PRB1 i usuwały miejsce aktywne proteazy B oraz sekwencję flankującą. Fragment EcoRV-NcoI, wielkości 5,7 kbp, zawierający pozostałe części 5' i 3' sekwencji kodującej PRB1 w pUC18, oczyszczono na żelu, stępiono końce działaniem polimerazą DNA T4, defosforylowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną i poddano ligacji z tępo zakończonym fragmentem HIS3 opisanym wyżej. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-prb1::HIS3, roztwór #1245) zawierał funkcjonalny gen HIS3 w miejscu części genu PRB1, który został usunięty.

183 781

PRZYKŁAD6

Konstruowanie pokrewnego z U9 szczepu zawierającego zniszczone geny MNN9 oraz

PRB1

Szczep 1372, pokrewny z U9, zawierający zniszczony gen MNN9 opisano w przykładzie 3. Izolaty klonów szczepu 1372 pasażowano na płytkach FOA w celu selekcji mutantów ura3. Uzyskano znaczną liczbę izolatów ura3 szczepu 1372, zaś jeden z izolatów (szczep 12930-190-S1-1) wybrano do dalszego zniszczenia genu HIS3. Wektor niszczący gen pUC18his::URA3 (p1505) trawiono Xbal i EcoRI, tworząc liniową kasetę niszczącą his3::URA3, i zastosowano ją do transformacji szczepu 12930-190-S 1-1 metodą octanu litowego (Methods in Enzymology 194:290 (1991)). Transformanty Ura+ selekcjonowano na syntetycznym podłożu agarowym pozbawionym uracylu, posiano ponownie na tym samym podłożu w celu izolacji klonalnej, a następnie posiano odbitkowo na podłożu pozbawionym zarówno uracylu jak i histydyny, w celu odnalezienia izolatów równocześnie Ura+ i His'. Jeden z izolatów (szczep 12930-230-1) wybrano do dalszego zniszczenia genu PRB1. Wektor niszczący PRB1 (pUC18-prbl::HIS3, roztwór #1245) trawiono SacI i Xbal, tworząc liniową kasetę niszczącą prbl::HlS3 i zastosowano ją do transformacji szczepu 12930-230-1 metodą octanu litowego. Transformanty His+ selekcjonowano na podłożu agarowym pozbawionym histydyny i ponownie rozsiewano w celu izolacji klonalnej. Z licznych powstałych izolatów His+ wykonano DNA genomowy, trawiono EcoRl i poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Wykonano analizę metodą Southerna, z użyciem znakowanej radioaktywnie sondy genu PRB1, wielkości 617 bp, wykonanej przez PCR z następującymi starterami oligodezoksynukleotydowymi:

5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3' (Identyfikator Sekw. Nr 3) i

5' CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (Identyfikator Sekw. Nr 4).

Uzyskano jedenaście izolatów wykazujących oczekiwaną hybrydyzację sondy z fragmentem DNA prbl::HIS3, wielkości 2,44 kbp. W przypadku dzikiego PRB1 hybrydyzacja zachodziła z fragmentem wielkości 1,59 kbp. Jeden z izolatów zawierających pożądane zniszczenie prb1::HIS3 wybrano do dalszych zastosowań, oznaczając go jako szczep #1558.

PRZYKŁAD 7

Konstruowanie wektora do zniszczenia genu PEP4 drożdży

Gen PEP4 S. cerevlslae sklonowano z biblioteki genomowej drożdży w następujący sposób. Komórki E. coli, zawierające bibliotekę genomową drożdży pLS101 (Schultz i Friesen, 1983, J. Bacteriol., 155:8-14) namnożono przez noc w 5 ml pożywki LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny. Rozcieńczenia 10'⁴ i 10'⁵ tej hodowli wysiano na płytki LB z ampicyliną. Odbitki kolonii wykonano stosując filtry z nitrocelulozy. Sondę drożdżowego genu PEP4, wielkości 600 bp, wykonano przez pCr stosując polimerazę DNA Taq, całkowity DNA plazmidowy z biblioteki drożdżowej pLS101 i następujące startery oligodezoksynukleotydowe, oparte na opublikowanej sekwencji DNA PEP4 (C. A. Woolford i in.. Mol. Celi. Biol., 6:2500 (1986)).

Starter sensowny:

5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 5) i starter antysensowny:

5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 6).

PCR przeprowadzono w 25 cyklach (94°C przez 1 minutę, 37°C przez 2 minuty i 72°C przez 3 minuty). Sondę PCR oczyszczono na żelu, znakowano radioaktywnie i hybrydyzowano z wyżej opisanymi filtrami. Kilka kolonii, które były pozytywne po hybrydyzacji z sondą PEP4, rozsiano na płytkach LB z ampicyliną w celu izolacji pojedynczych klonów. Stosując lizę alkaliczną z SDS (Sambrook i in., wyżej) wykonano DNA plazmidowe z kilku izolatów i trawiono je BamHI. Obserwowano oczekiwany prążek wektora wielkości 14 kbp, i prążek wstawki PEP4 wielkości 6,9 kbp. Po podwójnym trawieniu EcoRI i XhoI, obserwowano oczekiwany prążek wielkości 1,5 kbp, odpowiadający PEP4. Do dalszych badań wybrano jeden ze szczepów (szczep #860) wykazujący oczekiwany wynik. DNA plazmidowy szczepu #860 trawiono BamHI, po czym fragment BamHI, wielkości 6,9 kbp zawierający chromosomalny gen PEP4 klonowano w miejsce BamHI pUC13, uzyskując plazmid p890. Plazmid

183 781 p890 trawiono Ncol (tnącym w sekwencji kodującej PEP4), oczyszczono na żelu, stępiono końce przez działanie polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z tępo zakończonym fragmentem, wielkości 1,1 kbp, zawierającym funkcjonalny gen URA3 (wykonanym według przykładu 2). Powstały plazmid zawierający gen PEP4 zniszczony genem URA3 oznaczono pUC13pep4::URA3 (szczep #906).

PRZYKŁAD8

Konstruowanie szczepu drożdży #1569, będącego pochodną szczepu U9, zawierającą równocześnie mutacje prbl i pep4

W celu zniszczenia genu HIS3 szczepu U9, wektor niszczący pUC18-his3::URA3 trawiono EcoRI i Xbal i zastosowano do transformacji szczepu U9 metodą octanu litowego. Transformanty Ura+ selekcjonowano na podłożu agarowym pozbawionym uracylu i rozsiewano na tym samym podłożu w celu izolacji klonów. Następnie, wiele powstałych izolatów Ura+ posiewano odbitkowo na podłoże agarowe pozbawione uracylu bądź histydyny, poszukując izolatów będących równocześnie Ura+ i His'. Jeden z izolatów (szczep #1524) wybrano do dalszego niszczenia genu PRB1. Wektor niszczący gen PRB1 pUC18-prbl::HIS3 trawiono SacI i Xbal, a następnie stosowano do transformacji szczepu #1524 sposobem z octanem litu. Transformanty His selekcjonowano na agarze pozbawionym histydyny i rozsiewano w celu izolacji klonów na tym samym podłożu. Z licznych izolatów His+ wykonano DNA genomowe badano metodą hybrydyzacji Southema z sondą PRBI znakowaną radioaktywnie. Jeden z izolatów (szczep #1537), wykazujący pożądane zniszczenie genu PRB1 przez HIS3 (tzn. prbl::HIS3) wybrano do dalszego zniszczenia genu PEP4. Szczep #1537 pasażowano na płytkach FOA w celu uzyskania izolatów ura3, i jeden z izolatów (szczep #1541) wybrano do dalszego stosowania.

W celu zniszczenia genu PEP4 szczepu #1541, wektor niszczący PEP4, pUC13pep4::URA3, trawiono Xhol tworząc liniową kasetę niszczącą pep4::URA3, zastosowaną do transformacji szczepu #1541 metodą octanu litowego. Transformanty Ura+ selekcjonowano na podłożu agarowym pozbawionym uracylu i rozsiewano na tym samym podłożu w celu izolacji klonów. Z licznych transformantów Ura+ przygotowano DNA genomowe i badano je metodą Southema stosując znakowaną radioaktywnie sondę genu PEP4. Jeden z izolatów (szczep #1569), wykazujący pożądane zniszczenie genu PEP4 przez URA3 wybrano do dalszych zastosowań.

PRZYKŁAD9

Konstruowanie wektora ekspresyjnego CRPV L1

Gen L1 CRPV amplifikowano przez PCR z plazmidu pLAII, zawierającego kompletny genom wirusowy CRPV (Dr P. Howley, NC1) stosując polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc.); 36 cykli amplifikacji (94°C przez 1 minutę, 50°C przez 1 minutę i 72°C przez minuty) oraz startery oligodezoksynukleotydowe zawierające flankujące sekwencje Bglll (podkreślone):

Starter sensowny:

5-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3' (Identyfikator Sekw Nr 7) i starter antysensowny:

5'-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 8).

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L1 CRPV (wytłuszczony). Produkt PCR L1, wielkości 16 kbp trawiono Bglll, oczyszczono na żelu i wklonowano w miejsce Bglll wektora pSP72 (Promega) uzyskując plazmid pSP72-CRPV-Ll (p 12930-314-4-1).

Jeden z klonów sekwencjonowano w całości i odkryto, że różni się czterema nukleotydami od opublikowanej sekwencji L1 CRPV. Zmiana nie wywoływała zmiany sekwencji aminokwasowej. Gen L1 wycięto z pSP72-CRPV-L1 jako fragment Bglll i wklonowano w unikalne miejsce BamHI, położone pomiędzy drożdżowym promotorem GALIO i terminatorem transkrypcji ADH1, w drożdżowym wektorze ekspresyjnym pC1/1-GAL10p-ADH1t, zawierającym promotor GALIO z YEp52 (Broach i in., Exp. Manipulation of Gene

183 781

Expression, 1983, 83:81-116) i terminator transkrypcji ADH1 w szkielecie wektora pCl/1. Powstały plazmid nazwano pI29 30-32 3-6-1.

PRZYKŁAD 10

Konstruowanie wektora ekspresyjnego CRPV L2

Gen L2 CRPV amplifikowano przez PCR stosując polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc) z plazmidu pLAII, po trawieniu Sali, oczyszczeniu na żelu fragmentu wielkości 7,9 kbp i religacji. Zastosowano trzydzieści pięć cykli amplifikacji (90°C, 1 minuta; 50°C, 1 minuta; 72°C, 2 minuty) i startery oligodezoksynukleotydowe zawierające flankujące miejsca EcoRI (podkreślone):

Starter sensowny:

'-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 9), i starter antysensowny:

5'-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 10).

Starter sensowny wprowadzał drożdżową, nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L1 CRPV (wytłuszczony). Produkt PCR, wielkości 1,5 kbp, trawiono EcoRI, oczyszczano na żelu i wklonowano w miejsce EcoRI wektora o dwukierunkowym promotorze pUC18-GAL1p-GAL10p, zawierającego promotor drożdżowy GAL1/GAL1O. Wektor zawierał unikalne miejsce BamHI, pomiędzy promotorem GAL1 i pierwszą kopią terminatora transkrypcji ADH1, unikalne miejsca EcoRI i Smal, położone pomiędzy promotorem GAL10 i drugą kopią terminatora transkrypcji ADH1. Powstała kaseta ekspresji była zawarta we fragmencie SphI, wielkości 1,4 kbp. Jeden z klonów (pl2930-295-2-2) zawierający pożądaną wstawkę L2, styczną do promotora GALIO, sekwencjonowano w całości i stwierdzono, że różni się 6 nukleotydami od sekwencji opublikowanej, przy czym cztery z nich powodują zmianę aminokwasów. Analiza sekwencji oryginalnej matrycy DNA potwierdziła, że zmiany te są również obecne pLAII, a nie wprowadzone przez PCR. Wektor pUC18-GAL1p-GAL10p zawierający gen L2 przecięto SphI, po czym fragment wielkości 2,9 kbp, zawierający kasetę ekspresji ADHlt-GAL1p-GAL10p-L2-ADHlt poddano ligacji z dużym fragmentem SphI drożdżowego wektora wahadłowego pCl/1. Powstały plazmid oznaczono pl2930-323-2-3 fcCl/l-GAIllp-GM1l(p>CRPV-L2).

PRZYKŁAD 11

Ekspresja białek kapsydowych L1 CRPV i L2 CRPV w drożdżach

Plazmidy pl2930-323-6-l i pl2930-323-2-3 (pC1/1-GAL10p-CRPV/L1 i pCl/1GAL1p-GAL10p-CRPV/L2) zastosowano do transformacji S. cerevisiae szczepu #1569, BJ5462 (E. W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453) i BJ1995 (Jones, tamże). Izolaty klonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHD zawierającej 2% galaktozy, przez 48-72 godziny. Po zebraniu komórek, peletki komórkowe rozbito szklanymi perełkami, dodano Triton Χ-100 do stężenia końcowego 0,5% zaś powstałe lizaty badano w kierunku ekspresji L1 i L2 CRPV metodą immunologiczną. Próbki zawierające 40 pg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na żelach z 12% Tris-glicyną (Novex) w warunkach redukujących i denaturujących i przeniesiono elektroforetycznie na błony PVDF (Novex). Białka L1 i L2 CRPV wykrywano stosując królicze poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko L1 i przeciwko L2 (dar od Dr J. Kreidera, Hershey Medical Center) jako przeciwciało pierwotne i białko A sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne. Błony wywoływano z użyciem zestawu do chemiluminescencji ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). We wszystkich próbkach zawierających plazmid ekspresjonujący L1 wykryto prążek białka L1 o ciężarze cząsteczkowym 55-61 kDa, zaś w próbkach drożdży niosących plazmid ekspresjonujący L2 wykryto prążek białka L2 wielkości ~90 kDa.

Stosując surowicę przeciwko L2 nie stwierdzono sygnału w próbkach uzyskanych z klonów drożdży niosących plazmid ekspresyjny L1 i vice versa.

PRZYKŁAD 12

A. Oczyszczanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C. Komórki,

183 781 przechowywane w -70°C, rozmrażano i zawieszano w równej objętości buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μΜ. Komórki poddano lizie przez 10-krotne przepuszczenie ich przez urządzenie „microfluidizer”. Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut. Do nadsączu dodano Tween-80 w stężeniu końcowym 0,01% (obj./obj.) i frakcjonowano go przez chromatografię żelową na kolumnie 1700 ml (ID 5 cm) z żywicy Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Zastosowano bufor 10 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 150 mm NaCl, 0,01% (obj./obj.) Tween-80. Frakcje zawierające materiał reagujący immunologicznie w badaniu „immuno-dot biot” łączono i stężano do 1/6 objętości przez ultrafiltrację stosując komorę Amicon z płaską membraną YM-100 o średnicy 76 mm (MWCO 100000). Produkt sterylizowano przez filtrację na membranie Millex-GV o średnicy porów 0,22 pm (Millipore). Oczyszczone białko kapsydu L1 CRPV adsorbowane na wodorotlenku glinowym w stężeniu 100 pg/ml.

B. Charakteryzowanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV

Tożsamość produktu końcowego potwierdzono badaniem metodą Western blot oraz sekwencjonowanie końca N. Czystość zbadano przez SDS/PAGE z barwieniem Coomassie i srebrzeniem oraz elektroforezą kapilarną (SSCE) z detekcją przy długości fali 215 nm. Czystość preparatu L1 w SSCE oceniono na 75%.

PRZYKŁAD 13

Oczyszczanie rekombinowanego białka kapsydu L2 CRPV

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C. Komórki, przechowywane w -70°C, rozmrażano i zawieszano w równej objętości buforu „L1” (20 mM fosforan sodowy, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 pM. Komórki poddano lizie przez 10-krotne przepuszczenie ich przez urządzenie „microfluidizer”. Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut. Do nadsączu dodano Tween-80 w stężeniu końcowym 0,01% (obj./obj.) i frakcjonowano go przez chromatografię żelową na kolumnie 1700 ml (ID 5 cm) z żywicy Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Zastosowano bufor 10 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 150 mm NaCl, 0,01% (obj./obj.) Tween-80. Łączono frakcje zawierające materiał reagujący immunologicznie w badaniu „immuno-dot blot”. Połączone frakcje analizowano przez SDS/PAGE (srebrzenie) oraz metodą Western blotting.

PRZYKŁAD 14

A. Oczyszczanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV - schemat 1

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C. Komórki, przechowywane w -70°C, rozmrażano i zawieszano w równej objętości buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 M. Komórki poddano lizie przez 10-krotne przepuszczenie ich przez urządzenie „microfluidizer”. Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut. Do nadsączu dodano Tween-80 w stężeniu końcowym 0,01% (obj./obj.) i frakcjonowano go przez chromatografię żelową na kolumnie 1700 ml (ID 5 cm) z żywicy Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Zastosowano bufor 10 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 150 mm NaCl, 0,01% (obj./obj.) Tween-80. Frakcje zawierające materiał reagujący immunologicznie w badaniu „immuno-dot blot” łączono i stężano do 1/6 objętości przez ultrafiltrację stosując komorę Amicon z płaską membraną YM-100 o średnicy 76 mm (MWCO 100000). Produkt sterylizowano przez filtrację na membranie Millex-GV o średnicy porów 0,22 pm (Millipore).

183 781

B. Charakteryzowanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV

Tożsamość produktu końcowego potwierdzono badaniem metodą Western blot oraz sekwencjonowanie końca N. Czystość zbadano przez SDS/PAGE z barwieniem Coomassie i srebrzeniem oraz elektroforezą kapilarną (SSCE) z detekcją optyczną przy długości fali 215 nm. Czystość preparatu L1 w SSCE oceniono na 75%. Mikroskopia elektronowa wykazała obecność VLP w zakresie wielkości 50-55 nm.

C. Analityczna chromatografia HPLC

W celu zbadania VLP, próbki frakcjonowano pod względem wielkości chromatograficznie. Chromatografię wykonano stosując urządzenie „Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC” z autoinżektorem ISS 100 wyposażonym w pętlę wtryskową 200 μ 1. Kolumnę stanowił żel TSK G5000PW, 7,5 x 600 mm (TOSOHAA.S, Montgomeryville, Pa). W celu śledzenia elucji białka z kolumny, stosowano detekcję optyczną przy długości fali 280 nm, diodą detekcyjną Perkin-Elmer LC-235. Fazę ruchomą stanowił 0,5 M NaCl w buforze 10 mM fosforanu sodowego, pH 7,2. Prędkość przepływu wynosiła 0,5 ml/inin. i zbierano frakcje po 1 ml. Kolumnę kalibrowano standardem białka z Sigma, jak również rekombinowanym antygenem powierzchniowym wirusowego zapalenia wątroby typu B (Rejombivax, Merck & Co., West Point, PA). Wykrywanie antygenu we frakcjach zebranych podczas elucji wykonywano metodą „immuno-dot blot”.

D. Badanie metodą „immuno-dot blot” pl próbki każdej z frakcji nałożono na pasek błony PVDV (Immobilion-P, Millipore Corp., Bedford, MA) zwilżonej uprzednio i umieszczony na bibule. Pasek, po wsiąknięciu próbki, umieszczano w roztworze blokującym (5% (wag./obj.) odtłuszczone mleko w proszku rozpuszczone w 0,15 M NaCl, 0,02% azydku sodu i 0,01 M fosforanie sodu, pH 7,2) i inkubowano w temperaturze pokojowej delikatnie wytrząsając przez co najmniej trzy godziny. Roztwór blokujący wylewano i zastępowano przeciwciałem pierwotnym.

Stosowane przeciwciała pierwotne były różne, w zależności od wykrywanego antygenu.

L1 CRPV badano króliczą surowicą „odpowiedzi późnej” przeciwko CRPV (Biodesign International, Kennebunk, ME). L2 CRPV badano króliczą surowicą przeciwko L2 CRPV. L1 HPV 6a badano przeciwciałem monoklonalnym MAB 837 (Chemicon Interaatioaal, Inc., Temecula, CA). L2 HPV 6a było badane mysią surowicą przeciwko fuzji L2 HPV 6a z trpE.

Wykrywanie kompleksów immuaolngijznyjh wykonywano standardowym sposobem stosując przeciwciało wtórne sprzęgnięte z fosfatazą alkaliczną i substrat chromogenny NBT/BCIP.

E. Elektroforeza kapilarna (solution sieving capillary electrophoresis - SSCE)

Próbki VLP CRPV (-~0,2 mg/ml) ogrzewano przez 15 minut w 100°C w 1%

2-merkaptoetanolu i 1% (wag./obj.) SDS. Próbkę wprowadzano elektrokinetycznie, wraz ze standardem w postaci kwasu mellitowego, do kapilary krzemionkowej, 42 cm (22 cm do detektora) z 0,05 mm ID (śr. wew.), zrównoważonej 10 objętościami 0,1 N NaOH, wody i odczynnika do filtrowania ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA). Stosowano napięcie rozdzielające rzędu 300 V/cm korzystając z urządzenia Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Elucję próbki śledzono mierząc absorbancję przy długości fali 215 nm zaś dane zbierano korzystając z oprogramowania Nelson Turbo-chrom 3.

F. Przygotowanie szczepionki z reknmbiaowaaego białka kapsydu L1 CRPV

Oczyszczone białko kapsydu L1 CRPV adsorbowano na Al(OH)3 w stężeniu 100 pg/ml.

PRZYKŁAD 15

Ochrona przed tworzeniem się brodawczaka spowodowanego przez CRPV, przez szczepienie uzyskanymi z drożdży VLP L1 CRPV królików rasó New Zeeland Hante immuramowano domieśni(.mvo iow m1 VLP LI (czystość 75%, patrz Przykład 17) albo 100 mg rekombinowanego antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia wątroby typu B (czystość 99%) adsorbowanym na wodorotlenku glinu, jako kontrola negatywna. Zwierzęta otrzymały 2 dodatkowe dawki przypominające w ciągu 8 tygodni poprzedzających ekspozycję na CRPV w 10 dni po ostatniej dawce. Przy każdym szczepieniu oraz przed ekspozycją pobierano surowice, i badano w teście ELISA na VLP L1. W celu określenia odpowiedzi przeciwciał w surowicy na ekspresj onowane w droż14

183 781 dżach VLP L1 CRPV, zastosowano pośredni test ELISA. W teście ELISA zastosowano antygen VLP L1 CRPV, ekspresjonowany w komórkach owadzich przy użyciu rekombinowanego bakulowirusa, zasadniczo jak to opisali Christiansen i in., (J. Virol., 64:3151-3156, 1990; J. Gen. Virol., 75:2271-2276 (1994)). Jako wtórne przeciwciało zastosowano koniugat koziego przeciwciała przeciwko króliczym IgG z fosfatazą alkaliczną, zaś jako substratu fosforan p-nitrofenylu (Kirkegaard and Perry Labs., Inc.). Absorbancję mierzono przy 405 nm. Miano określano jako rozcieńczenie graniczne (3-krotne rozcieńczenia począwszy od 1:100) i uważane było za pozytywne gdy absorbancja swoista dla L1 przekroczyła średni odczyt absorbancji + 2 odchylenia standardowe króliczych surowic przed immunizacją. Dokładne miana obliczono z tych danych stosując program SOFTmax wersja 2,3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).

Miana przeciwciał przeciwko L1 VLP stwierdzane były w 4 tygodnie po pierwszej immunizacji i rosły po każdej dawce przypominającej. Zwierzęta kontrolne pozostały seronegatywne. 6 tygodni po ekspozycji na CrPv szczepione zwierzęta nie miały brodawek w 15 spośród 15 miejsc ekspozycji (rozcieńczenia zawiesiny wirusa 1:2 i 1:12) podczas gdy u zwierząt kontrolnych brodawki powstały w 12 spośród 15 miejsc ekspozycji (rozcieńczenie wirusa 1:2) albo w 9 na 15 miejsc (rozcieńczenie wirusa 1:12). Po 15 tygodniach, szczepione zwierzęta nadal nie miały brodawek.

Badanie neutralizacji wirusa wykonano (zasadniczo według metody Christiansena i in., 1991, Virol. 181:572-579) przez zmieszanie surowic króliczych z CRPV i ekspozycję królików na traktowane CRPV. Standardem przeciwciał neutralizujących była całkowita neutralizacja (3/3 miejsca ekspozycji wolne od brodawek). Badano surowice od 5 szczepionych zwierząt i 5 zwierząt kontrolnych. Surowice zebrane po 1 dawce VLP L1 CRPV, zawierały przeciwciała całkowicie neutralizujące nierozcieńczonego wirusa u 80% królików (4/5). Po 2 albo 3 dawkach VLP L1 CRPV 100°% królików miało przeciwciała neutralizujące. Surowice kontrolne nie wykazywały żadnej aktywności neutralizującej. Zależnie od mian końcowych, surowice wybranych szczepionych zwierząt mogły być rozcieńczane od 10 do 1000 razy i wciąż wykazywały 100% neutralizacji.

W celu zbadania czy odpowiedź przeciwciał neutralizujących była swoista dla natywnych VLP L1 CRPV, wybrano jedną z surowic i inkubowano z kawałkami nitrocelulozy, opłaszczonymi natywnymi albo denaturowanymi VLP L1 CRPS pochodzącymi z drożdży. Kwadraty nitrocelulozy (1 cm²) opłaszczono natywnymi albo zdenaturowanymi (zredukowanymi i alkilowanymi kwasem jodooctowym w 8 M moczniku) VLP L1 CRPV. Natywne albo zdenaturowane ekstrakty drożdżowe służyły jako kontrola. Surowicę króliczą inkubowano 4-krotnie z kwadratami nitrocelulozy przez 8-14 godzin w 4°C, zanim zbadano ją w teście neutralizacji wirusa, opisanym powyżej. Wyłącznie natywne VLP L1 CRPV były zdolne do adsorbcji przeciwciał odpowiedzialnych za neutralizację CRPV, podczas gdy zdenaturowane albo kontrolne białka drożdży nie absorbowały tych przeciwciał. Dodatkowo, natywne VLP L1 CRPV usuwały aktywność ELISA na VLP L1 CRPV ekspresjonowane w komórkach owadzich (dane nie pokazane).

PRZYKŁAD 16

Konstruowanie wektora do koekspresji L1/L2 CRPV z pojedynczego plazmidu

Plazmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-1) trawiono Bglll, zaś powstały fragment Bglll, wielkości 1,5 kbp, zawierający ORF L1 CRPV z nie ulegającą translacji, drożdżową sekwencją liderową, oczyszczono na żelu. Plazmid p12930-323-2-3 (pCl/1-GALlpGAL10p-CRPV-L2) trawiono BAMHI, który ciął pomiędzy promotorem GAL1 i terminatorem transkrypcji ADH1. Liniowy fragment wektora oczyszczono na żelu i poddano ligacji ze wspomnianym fragmentem Bglll CRPV-L1, otrzymując plazmid pl2930-366-1-2 (pCl/1GAL1/10p-CRPV/L1+L2). Powstały plazmid zawierał ORF L1 CRPV pod kontrolą promotora GAL1 oraz ORF L2 cRpV pod kontrolą promotora GAL10.

PRZYKŁAD 17

Konstruowanie wektora do koekspresji L1/L2 CRPV z dwóch plazmidów

Wektor pUC18-GAL1p-GAL10p, zawierający gen L2, przecięto SphI, zaś powstały fragment wielkości 2,9 kbp, zawierający kasetę ekspresji ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2183 781

ADH1t oczyszczono na żelu a końce stępiono działaniem polimerazą DNA T4. Drożdżowy wektor wahadłowy YEp24 (Botstein i in., Gene 8:17 (1979)) trawiono BamHI, końce stępiono działaniem polimerazy DNA T4, defosforylowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną a następnie poddano ligacji z kasetą ekspresji L2, uzyskując plazmid pl594.

PRZYKŁAD 18

Koekspresja L1 i L2 CRPV w drożdżach

Plazmid pl2930-366-l-2 (pC 1/1 -GAL1/10p-CRPV/L1+L2) zastosowano do transformowania szczepów #1569 i BJ5462 S. cerevlslae (układ jednoplazmidowy) zaś powstałe transformanty selekcjonowano na syntetycznym podłożu agarowym bez leucyny. W równoległym doświadczeniu, szczep 1569 kotransformowano wektorem ekspresyjnym pl 2930-323-6-1 pCl/1-GAL10p-CRPV-L1 oraz wektorem ekspresyjnym p1594 YEp24-GAL 10p-L2 (układ dwuplazmidowy), zaś powstałe transformanty selekcjonowano na syntetycznym podłożu agarowym pozbawionym leucyny i uracylu. Izolaty klonalne układu jednoplazmidowego i dwuplazmidowego hodowano w 30°C w pożywce złożonej YEHD zawierającej 2% galaktozę przez 48-72 godziny. Po zebraniu komórek, peletki komórkowe rozbito szklanymi perełkami, dodano Triton Χ-100 do stężenia końcowego 0,5% zaś powstałe lizaty badano w kierunku ekspresji L1 i L2 CRPV metodą immunologiczną. Próbki zawierające 50 pg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na żelach o gradiencie 8-16% Tris-glicyny (Novex) w warunkach redukujących i denaturujących i przeniesiono elektroforetycznie na błony PVDF (Novex). Białka L1 i L2 CRPV wykrywano stosując królicze poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko L1 i przeciwko L2 (dar od Dr J. Kreidera, Hershey Medical Center) jako przeciwciało pierwotne i białko A sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne. Błony wywoływano z użyciem zestawu do chemiluminescencji ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). We wszystkich próbkach zawierających plazmid ekspresjonujący L1 + L2 wykryto prążki białka L1 o ciężarze cząsteczkowym 55-61 kDa, i L2 wielkości ~90 kDa. Nie stwierdzono sygnału L1 w próbkach uzyskanych z klonów drożdży niosących plazmid ekspresyjny L2.

PRZYKŁAD 19

Oczyszczanie VLP L1 CRPV i L1+L2 CRPV do badań EM

Ekspresjonowane w drożdżach białka L1 CRPV i L1 i L2 CRPV częściowo oczyszczono i stężono do badań w mikroskopie elektronowym (EM). Od 1do 1,5 litra pożywki YEHD zawierającej 2% galaktozę inokulowano szczepem #1569 albo BJ5462 S. cerevlslae, transformowanymi wektorem koekspresyjnym L1+L2 pl2930-366-1-2 (pCl/1-GALl/10pCRPV/L1+L2) i hodowano w 30°C przez 48-72 godziny. W doświadczeniu równoległym, komórki szczepu #1569 kotransformowane wektorem ekspresyjnym pl2930-323-6-l GAL10p-CRPV-L1 i plazmidem pl594 YEp24-GAL10p-L2, hodowano w analogicznych warunkach. Komórki zebrano zaś osad komórkowy zamrożono w -70°C. Wszystkie poniższe etapy przeprowadzono w 4°C. Komórki rozmrożono i zawieszono w równej objętości buforu „LI” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μΜ. Komórki poddano lizie przez 3-5-krotne przepuszczenie ich przez urządzenie „microfluidizer”. Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i białka L1, L2 albo L1 i L2 żwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut.

Do badań EM (Structure Probe, West Chester, PA) porcję każdej z próbek umieszczano na pokrytych węglem miedzianych siatkach o rozmiarze otworów 200. Na siatce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Przed badaniem TEM siatki suszono na powietrzu. Badanie przeprowadzono stosując elektronowy mikroskop transmisyjny JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrografy miały powiększenie 100000X.

We wszystkich próbkach drożdży niosących plazmid ekspresyjny L1 CRPV, bądź plazmidy do koekspresji L1 i L2 CRPV, widoczne były VLP w zakresie wielkości 50-55 nm. Nie obserwowano VLP w próbkach kontrolnych albo drożdżach niosących sam plazmid ekspre16

183 781 syjny L2 (Figury 7, 8 i 9).

PRZYKŁAD 20

Oczyszczanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV - schemat 2

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C. Komórki, przechowywane w -70°C, rozmrażano i zawieszano w równej objętości buforu lizującego (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μΜ. Komórki poddano lizie w urządzeniu BioNeb Celi Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i białko L1 odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut.

Nadsącz rozcieńczono 1:5 w PBS, ponownie sklarowano przez odwirowanie w rotorze Sorvall SA-600 przy 6500 obr/min. przez 10 minut w 4°C. Nadsącz filtrowano przez filtr strzykawkowy 0,22 μ i frakcjonowano przez chromatografię anionowymienną.

Chromatografię anionowyMienną. przeprowadzono przez zastosowanie urządzenia Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC z pętlą wtryskową 5 ml. Złożem chromatografii była żywica Fractogel EMF tMaE-650 (S) o średnicy 25-40 μ (EM Separations, Gibbstown, Nj) w szklanej kolumnie 150 mm x 10 mm. W celu śledzenia elucji białka z kolumny stosowano detektor diodowy Perkin-Elmer LC-235 przy długości fali 280 nm. Kolumnę zrównoważono 0,15 M NaCl w buforze 0,01 M fosforanu sodowego pH 7,2 (bufor A). Przepływ ustawiono na 0,75 ml/min. Próbkę wprowadzono do kolumny i przepłukano buforem A w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Materiał związany eluowano liniowym gradientem stężenia chlorku sodowego od 0,15 M do 0,65 M przez 5 minut, a następnie od 0,65 M do 1,15 M przez 30 minut. Wykrywanie antygenu we frakcjach zebranych podczas elucji wykonywano metodą immunologiczną. Połączono frakcje zawierające materiał aktywny immunologicznie (tzn. frakcje eluowane pomiędzy 0,81 Mi 1,05 M NaCl).

Połączone frakcje stężono w urządzeniu Macrosep przez odwirowanie (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) do 1/5 początkowej objętości.

Koncentrat frakcjonowano chromatografią żelową na żywicy Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) w kolumnie 87 cm x 27 mm. Rozdział przeprowadzono przy przepływie 2,5 Ml/minutę. Elucję białka śledzono przez absorbancję przy długości fali 280 nm. Antygen wykrywano immunologicznie.

Frakcje zawierające materiał aktywny immunologicznie łączono i stężano przez ultrawirowanie w komorze (Amicon, Inc., Beverly, MA) o płaskiej membranie YM-100 o średnicy 43 mm (Amicon, Inc., Beverly, MA) w atmosferze azotu pod ciśnieniem 10 psi.

Produkt końcowy charakteryzowano przez SDS/PAGE z barwieniem Coomassie oraz przez elektroforezę kapilarną (SSCE). Czystość produktu końcowego ze schematu 2 oceniono w SSCE na 88%.

PRZYKŁAD 21

A. Oczyszczanie rekombinowanego białka kapsydu L1 CRPV schemat 3

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C. Komórki, przechowywane w -70°C, rozmrażano i zawieszano w równej objętości buforu lizującego (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μM. Komórki poddano lizie w urządzeniu BioNeb Celi Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i białko L1 odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut.

Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze Li i odwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut.

Nadsącz ekstrahowano 1/2 objętości chloroformu. Fazę wodną zebrano i sklarowano

183 781 przez odwirowanie przy 12000 obr/min. w mikrowirówce Beckman przez 5 minut.

Chromatografię anionowymienną przeprowadzono przez zastosowanie urządzenia Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC z pętlą wtryskową 5 ml. Złożem chromatografii była żywica Fractogel EMF tMaE-650 (S) o średnicy 25-40 μ (EM Separations, Gibbstown, Nj) w szklanej kolumnie 150 mm x 10 mm. W celu śledzenia elucji białka z kolumny stosowano detektor diodowy Perkin-Elmer LC-235 przy długości fali 280 nm. Kolumnę zrównoważono 0,15 M NaCl w buforze 0,01 M fosforanu sodowego pH 7,2 (bufor A). Przepływ ustawiono na 0,75 ml/min. Próbkę wprowadzono do kolumny i przepłukano buforem A w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Materiał związany eluowano liniowym gradientem stężenia chlorku sodowego od 0,15 M do 0,65 M przez 5 minut, a następnie od 0,65 M do 1,15 M przez 30 minut. Wykrywanie antygenu we frakcjach zebranych podczas elucji wykonywano metodą immunologiczną. Połączono frakcje zawierające materiał aktywny immunologicznie (tzn. frakcje eluowane pomiędzy 0,81 Mi 1,05 M NaCl).

Produkt końcowy charakteryzowano przez SDS/PAGE z barwieniem Coomassie oraz przez elektroforezę kapilarną (SSCE). Czystość produktu końcowego ze schematu 3 oceniono w SSCE na 95%.

PRZYKŁAD 22

Ekspresja L1 CRPV oraz L1 HPV typu 6a (szczep 1644) we wzbogaconych, złożonych i chemicznie zdefiniowanych pożywkach

Inokula tych szczepów opracowano w syntetycznej pożywce bez leucyny jak to opisano powyżej, w celu przeniesienia do hodowli w butelkach wytrząsanych. Zastosowane butelki wytrząsane posiadały przegrody, aby zapewnić dużą zdolność napowietrzania (70 ml płynu w butelce pojemności 300 ml, Tunair Labware) zaś pożywka zawierała około 0,5 ml środka przeciwpieniącego (UCON LB-625, Union Carbide) na litr. Wzbogacona pożywka złożona zawierała (na litr): 40 mg ekstraktu drożdżowego Difco; 20 g peptonu Sheffield HySoy; 30 g glukozy; 50 g galaktozy; pH pożywki przed sterylizacją ustalono na 5,3. Zdefiniowana chemicznie pożywka była taka sama jak opisana przez Oura (Biotechnol. Bioenginer. 16:11971212, 1974) ale z dodatkiem (na litr): 0,1 g chlorku choliny; 0,4 g adeniny; 30 g glutaminianu monosodu jako źródło azotu; 0,2 g uracylu; 20 g glukozy; 40 g galaktozy. Butelki inokulowano 3 ml inokulum i inkubowano przez 66 godzin w 28°C, przy 250 obrotach na min., na wytrząsarce obrotowej. Z butelek, co jakiś czas, pobierano próbki w celu potwierdzenia ekspresji badaniem immunologicznym z użyciem surowic odpornościowych przeciwko L1 CRPV i L1 HPV 6a.

PRZYKŁAD 23

Klonowanie genomu HPV 6a

Tkanki od pacjenta ze stwierdzonymi ciężkimi kłykcinami kończystymi (dostarczone przez dra Darrona Browna, Indiana University School of Medicine) typowano trawieniem enzymami restrykcyjnymi i reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) i stwierdzono, że posiada HPV typu 6a. Z próbki tkanek ekstrahowano DNA i trawiono enzymem Hindlll. Po frakcjonowaniu przez filtrację żelową na 0,8% agarozie o niskiej temperaturze topnienia, z żelu wycięto region odpowiadający wielkości 8 kb i trawiono agarozę enzymem Gelaze™ (Epicentre Technologies, Inc.). Próbkę poddano ligacji z pUC18 trawionym Hindlll i defosforylowanym

183 781 (Pharmacia Inc.). Po transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5 (BRL), bibliotekę plazmidową przesiewano w poszukiwaniu klonów pozytywnych dla HPV 6a, stosując oligonukleotyd znakowany ³²P, komplementarny do genu L1 HPV 6a. Wyizolowano plazmid pUC18 zawierający genom HPV 6a, wielkości 8 kb, i charakteryzowano go analizą enzymami restrykcyjnymi i metodą Southema. Plazmid ten oznaczono pUC18-HPV6a. Kompletny genom HPV 6a sekwencjonowano przy użyciu urządzenia do automatycznego sekwencjonowania API (#373A), w oparciu o instrukcję producenta.

Olbrzymie zmiany, o typie kłykcin kończystych sromu, uzyskano od 25 letniej pacjentki. Fragment zmiany zamrożono w ciekłym azocie i poddano obróbce przy użyciu urządzenia Braun mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen. Germany). Powstały materiał solubilizowano w 0,6% (wag./obj.) siarczanie laurylosodu (SDS), traktowano proteinazą K (50 pg/ml) i ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy. DNA precypitowano etanolem i zmierzono ilościowo w spektrofotometrze. Obecność wielkocząsteczkowego DNA ustalono przez elektroforezę na żelu agarozowym i barwienie bromkiem etydyny.

Rodzaj DNA HPV określono przez zastosowanie układu wychwytu hybrydowego, sprzedawanego jako ViraType Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Zastosowane sondy HPV podzielono na dwie grupy których skład jest oparty na powiązaniu każdego rodzaju HPV z nowotworami narządów płciowych. Grupa A sond zawierała rodzaje HPV 6, 11, 42, 43 i 44 „niskiego ryzyka”; zaś grupa sond B zawierała rodzaje HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 i 56, „wysokiego ryzyka”. Całkowity DNA trawiono Pstl, BamHI i Hindlll oraz wykonywano analizę metodą Southema w surowych warunkach (Tm-15°C) w celu określenia podrodzaju HPV.

W celu określenia kompletnej sekwencji HPV 6a, wykonano startery sekwencjonowania, w oparciu o opublikowaną sekwencję HPV 6a. Obie nici kompletnego genomu HPV 6a, wielkości 8,1 kb, sekwencjonowano metodą przerywania łańcucha didezoksynukleotydami, zestawem PRISM™ i urządzeniem do automatycznego sekwencjonowania Applied Biosystems (ABI #373A), w oparciu o instrukcję producenta (ABI, Inc., Foster City, CA). W przypadku gdy sekwencje sensowna i antysensowna nie pasowały do siebie, wykonywano dodatkowe startery w celu ponownego sekwencjonowania niejednoznacznych obszarów, w obu kierunkach, do uzyskania zgodności.

Sekwencje DNA HPV 6a i HPV 6b wykazywały ponad 97% identyczność, z 229 bp różnic stwierdzonych w 8010 bp całości. Najważniejsze różnice wykryto, w porównaniu z HPV 6b, w długim regionie kontrolnym (LCR; nukleotydy 7205-106). Oprócz kilku zmian pojedynczych nukleotydów W LCR HPV 6a, odkryto insercje wielkości 94 bp w pozycji 7350 i 19 bp w pozycji 7804. W pozycji 7615, sześć par zasad w genomie HPV 6a uległo delecji.

PRZYKŁAD 24

Konstruowanie drożdżowego wektora ekspresyjnego L1 HPV 6a

Jako matrycy PCR użyto DNA HPV typu 6a. Gen L1 HPV 6a amplifikowano stosując polimerazę DNA Vent (New England Biolabs, Inc.), 35 cykli amplifikacji (94°C 1 min., 48°C 1 min., 72°C 1 min. 45 sek.) oraz następujące startery oligonukleotydowe, zawierające flankujące miejsca Bglll (podkreślone):

starter sensowny:

5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 11) starter antysensowny:

5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (Identyfikator Sekw. Nr 12).

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L1 HPV 6a (wytłuszczony). Produkt PCR L1, wielkości 1,5 kbp trawiono Bglll i oczyszczono na żelu. Skonstruowano wektor ekspresyjny pCl/1-GAL, przez wyizolowanie fragmentu SphI, wielkości 1,4 kbp, z wektora dwukierunkowego promotora pUC18-GAL1p-GAL10p, zawierającego rozbieżny promotor GALI/GAL1O z plazmidu pBM272 (dostarczony przez Dra Marka Johnsona, Washington

183 781

University, St. Louis) otoczony z obu stron kopiami terminatora transkrypcji ADH1 (Bennetzen, J.L. i Hall, B.D. (1982) J. Biol. Chem. 257:3018-3025). W powstałej kasecie ekspresji, miejsce BamHI położone jest pomiędzy promotorem GALI i pierwszą kopią terminatora transkrypcji ADH1, zaś miejsce Smal położone jest pomiędzy rozbieżnym promotorem GALIO i drugą kopią terminatora ADH1. Drożdżowy wektor wahadłowy pC 1/1 (Rosenberg i in., Nature 312 (1984) 77-80) trawiono SphI i poddano ligacji z fragmentem SphI, wielkości

1.4 kbp, zawierającym promotor GAL. Powstały wektor, pCl/1-GAL, linearyzowano BamHI, który ciął pomiędzy promotorem GALI i terminatorem transkrypcji ADH1. Wektor pC 1/1 GAL trawiony BamHI i fragment PCR L1 HPV 6a trawiony BglII, poddano ligacji i zastosowano do transformowania komórek E. coli DH5 (BRL). Wyizolowano plazmid pCl/1-GAL zawierający gen L1 HPV 6a i oznaczono go pl3173-357-6. Gen L1 w pl 3173-357-6 sekwencjonowano (urządzenie ABI Sequencer #373A) i wykazano jego identyczność z genem L1 klonu pUC18-HPV 6a.

PRZYKŁAD 25

Konstruowanie drożdżowego wektora ekspresyjnego L1 i L2 HPV

Plazmid pl3173-357-6 (pCl/1-GAL + L1 HPV 6a) trawiono Smal, który ciął pomiędzy promotorem GALIO i terminatorem transkrypcji ADH1. Gen L2 HPV 6a, wielkości 1,4 kbp, amplifikowano przez PCR stosując DNA pUC-HPV6a jako matrycę, polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 cykli amplifikacji PCR (94°C 1 min., 48°C 1 min., 72°C 1 min. 45 sek.) oraz następującą parę starterów oligonukleotydowych, zawierających miejsce Smal (podkreślone):

starter sensowny:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 13) starter antysensowny:

5'-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 14).

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L2 HPV 6a (wytłuszczony). Produkt PCR, wielkości

1.5 kbp trawiono Smal, oczyszczono na żelu i poddano ligacji z trawionym Smal plazmidem pl3173-357-6. Plazmid pCl/1-GAL zawierający geny L1 i L2 HPV 6a wyizolowano i oznaczono pl4049-7-2 gen L2 sekwencjonowano (urządzenie ABI Sequencer #373A) i stwierdzono, że jest identyczny z genem L2 klonu pUC18-HPV6a.

PRZYKŁAD 26

Ekspresja L1 HPV 6a i koekspresja L1 i L2 HPV 6a w drożdżach

Plazmidy pl3173-357-6 (pCl/1-GAL + HPV 6a L1) i pl4049-7-2 (pCl/1-GAL + HPV

6a L1 i L2) zastosowano do transformowania S. cerevisiae szczepów #1569 (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir°) i #1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, cir°). Powstałe szczepy rekombinowane gospodarza szczepu #1558 były szczepami #1644 (HPV 6a L1) i #1670 (HPV 6a L1+L2) jak to pokazano na tablicy. Izolaty klonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHD zawierającej 2% galaktozę przez 68-78 godziny. Po zebraniu komórek osad komórkowy rozbito szklanymi perełkami, zaś lizat komórkowy badano w kierunku ekspresji L1 HPV 6a albo L2 HPV 6a metodą immunologiczną. Próbki zawierające 40 pg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na żelach z 10% Tris-glicyną w warunkach redukujących i denaturujących i przeniesiono elektroforetycznie na błony nitrocelulozowe. Białko L1 wykrywano stosując królicze poliklonalne surowice odpornościowe' przeciwko białku fuzyjnemu trpE-HPV11 (Brown D. R. i in., Virology 201;46-54) jako przeciwciało pierwotne i ośle przeciwciało przeciwko króliczym IgG sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (HRP) (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne. Błony wywoływano z użyciem zestawu do chemiluminescencji ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). We wszystkich próbkach z wyjątkiem kontroli negatywnej (pC 1/1 bez genu L1 i L2) wykryto prążek białka L1 o ciężarze cząsteczkowym 50-55 kDa.

Białko L2 wykryto jako prążek wielkości 70 kDa analizą Western biot, stosując rozcieńczoną 1:250 surowicę myszy immunizowanej trzykrotnie białkiem fuzyjnym trpE-HPV

183 781

6a L2, wykonanym, zasadniczo, według metody opisanej przez Cartera i in., jako przeciwciało pierwotne i kozie przeciwciało przeciwko mysim IgG sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne (rozcieńczenie 1:1000).

Do badań EM (Structure Probe, West Chester, PA) porcję każdej z próbek umieszczano na pokrytych węglem miedzianych siatkach o rozmiarze otworów 200. Na siatce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolfrauowego (PTA), pH 7,0. Przed badaniem TEM siatki suszono na powietrzu. Badanie przeprowadzono stosując elektronowy mikroskop transmisyjny JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrografy miały powiększenie 100000Χ.

We wszystkich próbkach drożdży niosących plazmid ekspresyjny L1 HPV 6a, bądź plazmidy do koekspresji L1 i L2 HPV 6a, widoczne były VLP w zakresie wielkości 50-55 nm. Nie obserwowano VLP w próbkach kontrolnych.

PRZYKŁAD 27

Fermentacja L1+L2 HPV 6a (Szczep #1670)

Płytkowa hodowla powierzchniowa szczepu 1670 została przeniesiona aseptycznie do płynnej pożywki bez leucyny zawierającej (na litr): 8,5 g „Difco yeast nitrogen base”, bez aminokwasów i siarczanu amonowego; 0,2 g adeniny; 0,2 g uracylu; 10 g kwasu sukcynylowego; 5g siarczanu amonowego i 0,25 g L-tyrozyny; pH pożywki ustalono przed sterylizacją na 5,0-5,3 przy użyciu NaOH. Po hodowli przez 25 godzin w 28°C, przy 250 obr/min. na wytrząsarce obrotowej, przygotowano probówki do mrożenia kultur przez nalanie sterylnej gliceryny w stężeniu końcowym 17% (wag/obj) przed umieszczeniem w -70°C (po 1 ml na probówkę). W tej samej pożywce przygotowano inokulum do fermentacji szczepu 1670 (500 ml na butelkę 2 l) i rozpoczęto ją przez przeniesienie rozmrożonej zawartości dwóch probówek do butelek 2 litrowych i inkubację w 28°C, 250 obr/min. na wytrząsarce obrotowej przez 25 godzin. Do fermentacji szczepu 1670 wykorzystano fermentator New Brunswick SF-116 o pojemności roboczej 10 l. Zastosowana pożywka zawierała (w litrze): 20 g ekstraktu drożdżowego Difco; 10 g peptonu Sheffieid HySoy; 20 g glukozy; 20 g galaktozy; pH pożywki przed sterylizacją ustalono na 5,3. Całą zawartość (500 ml) 2-litrowej butelki przeniesiono do fermentatora, który inkubowano w 28°C, 400 obr/min., 5 l powietrza/min., ciśnienie 3,5 psi. Wytrząsanie zwiększono w celu utrzymania poziomu rozpuszczonego tlenu o saturacji wyższej niż 40%. Proces fermentacji śledzono przez pomiar glukozy (Beckman Glucose 2 Analyzer) i spektrometrii masowej (Perkin-Elmer 1200). Po 69 godzinach inkubacji, osiągnięta została gęstość komórkowa 9,9 g suchej masy/litr. Hodowlę stężono przez filtrację przez rurkowate włókna (wkład Amicon H5MP01-43 w układzie filtracyjnym Amicon DC-10) do około 2 litrów, diafiltrowano w stosunku do 2 l roztworu soli buforowanego fosforanem i dalej stężano (do około 1 l) przed rozporcjowaniem do butelek wirowniczych pojemności 500 ml. Osad komórkowy zebrano przez odwirowanie przy 8000 obr/min. (rotor Sorvall GS3) przez 20 minut w 4°C. Po zlaniu nadsączu, osad (225 g wilgotnej masy) przechowywano do momentu użycia w -70°C.

PRZYKŁAD 28

Oczyszczanie ^kombinowanych białek kapsydu L1+L2 HPV 6a

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki szczepu #1670 przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (38 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 50 ml buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 pM. Papkę komórkową poddano lizie przez 3-krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 8000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110 (Microfluidics Corp., Newton, Ma). Papkę rozbitych komórek sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający antygen L1+L2.

Płynny nadsącz rozcieńczono 1:5 buforem A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do kolumny anionowymiennej (5,0 cm (średn. wew.) x 4,0 cm) z żywicy Fractogel ® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) zrównoważonej buforem A. Po przepłukaniu buforem A, antygen eluowano gradientem 0-1,0 M NaCl w buforze A. W celu określenia.

183 781 która z frakcji z kolumny zawierała białko L1, zastosowano badanie immuno-dot blot.

Frakcje zawierające białko L1, co określono metodą immunologiczną, badano na białko całkowite metodą Bradforda a następnie przez SDS-PAGE i barwienie srebrem oraz metodą Western blot.

Połączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen stężono przez frakcjonowanie siarczanem amonowym. Stężenie siarczanu amonowego w roztworze doprowadzono do 63%, przez dodawanie suchej substancji delikatnie mieszając, przez 30 minut. Próbkę umieszczono na lodzie i pozostawiono do precypitacji przez 30 minut. Próbkę odwirowano przy 12000 obr/min. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Zawieszoną próbkę poddano chromatografii żelowej na kolumnie (89 cm x 2,6 cm śr. wew.) z żywicy Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Zastosowanym buforem był PBS. Chromatografię wykonywano w temp. 20-23°C. Frakcje analizowano przez SDS-PAGE z barwieniem srebrem i metodą Western blot. Połączono najczystsze frakcje. Powstałą pulę stężono.

Produkt końcowy badano przez SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Homogenność białek L1 i L2 określono na 85%. Tożsamość białek L1 i L2 potwierdzono badaniem Western blotz użyciem odpowiednich surowic. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 3 mg białka.

Badanie EM wykonała firma Structure Probe (West Chester, PA). Porcję każdej z próbek umieszczano na pokrytych węglem miedzianych siatkach o rozmiarze otworów 200. Na siatce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Przed badaniem TEM siatki suszono na powietrzu. Badanie przeprowadzono stosując elektronowy mikroskop transmisyjny JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrografy miały powiększenie 100000X. Potwierdzono obecność cząsteczek wiroidalnych o wielkości 50-55 nm.

PRZYKŁAD 29

Oczyszczanie L1 HPV 6a i VLP L1/L2 do badań EM

Ekspresjonowane w drożdżach białka L1 HPV 6a oraz L1 + L2 HPV 6a częściowo oczyszczono i stężono do badań w mikroskopie elektronowym (EM). Od 1do 1,5 litra pożywki YEHD zawierającej 2% galaktozę i 0,1 M sorbitol inokulowano szczepem S. cerevlslae #1558 transformowanym wektorem p 13173-357-6 (wektor ekspresyjny L1) albo transformowanym wektorem pl4049-7-2 (wektorem koekspresyjnym L1+L2) i hodowano w 30°C przez 68-72 godziny. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 4000 obr/min. zaś osad komórkowy zamrożono w -70°C. Wszystkie poniższe etapy przeprowadzono w 4°C. Komórki rozmrożono i zawieszono w równej objętości buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μΗ. Komórki poddano lizie przez 3-5-krotne przepuszczenie ich przez urządzenie „microfluidizer”. Lizat sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Nadsącz nałożono na powierzchnię 5 cm poduszki z 45% sacharozy (wag./obj.) w buforze L1 i białka L1, L2 albo L1 i L2 żwirowano przy 100000 x g przez 4 godziny. Osad zawieszono w 1/10 objętości buforu L1 i sklarowano przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut. Próbki badano EM i wykazano obecność cząstek wiroidalnych.

PRZ YKŁ AD-30

Klonowanie genów L1 i L2 HPV 16

Całkowity genomowy DNA ekstrahowano z komórek Caski (ATCC #CRL 1550) techniką standardową (Sambrook i in., wyżej). DNA trawiono endonukleazami Bst107I i SphI i poddano elektroforezie na 0,8% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Z żelu wycięto region odpowiadający wielkości ~3,5 kb i trawiono agarozę enzymem Gelaze™ (Epicentre Technologies, Inc.). Oczyszczony na żelu DNA stępiono na końcach działaniem polimerazy DNA T4 i poddano ligacji z tępymi, fosforylowanymi linkerami oligodezoksynukleotydowymi zawierającymi wewnętrzne miejsce Hindlll. Mieszaninę ligacyjną trawiono całkowicie Hindlll po czym frakcjonowano na żelu agarozowym jak to opisano wyżej. Oczyszczony na żelu DNA poddano ligacji z pUC18 trawionym Hindlll i defosforylowanym (Pharmacia Inc.).

183 781

Po transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5 (BRL), bibliotekę plazmidową przesiewano w poszukiwaniu klonów pozytywnych dla HPV 16, stosując oligonukleotyd znakowany ³2p, komplementarny do końca 3' genu L1 HPV 16 (5'-GAG aGa TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Wyizolowano plazmid pUC18 zawierający fragment genomu HPV 16, wielkości 3,3 kb, i charakteryzowano go analizą enzymami restrykcyjnymi i metodą Southerna. Plazmid oznaczono pUC18-HPV16Ll/L2 i zawierał on sekwencje DNA kodujące L1 i L2. DNA plazmidowy wykonano stosując zestaw Qiagen™ Plasmid Maxi kit (Qiagen, Inc.).

PRZ YKŁAD31

Konstruowanie drożdżowego wektora ekspresyjnego L1 HPV 16

Klon pUC18-HPV16Ll/L2 zastosowano jako matrycę PCR. Gen L1 HPV 16 amplifikowano przez PCR stosując polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 cykli amplifikacji (94°C, 1 minuta; 48°C, 1 minuta, 72°C 1 minuta 45 sek.) oraz następujące startery zawierające otaczające miejsca Bglll (podkreślone):

starter sensowny:

5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 15) i starter antysensowny:

5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 16)

Starter sensowny wprowadzał drożdżową nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L1 HpV 16 (wytłuszczony). Produkt PCR, wielkości 1,5 kbp trawiono Bglll, oczyszczono na żelu i wklonowano do wektora pCl/4-GAL, trawionego BamHI. Wyizolowano plazmid pCl/1-GAL, zawierający gen L1 HPV 16 i oznaczono go p 14049-37-1. Gen L1 w p 1-4049-37-1 sekwencjonowano zestawem PRISM™ (ABI, Inc.) i urządzenia ABI Sequencer Model #373A, według instrukcji producenta. Gen L1 w tym izolacie posiadał 3 zmiany nukleotydowe w porównaniu ze skorygowaną, opublikowaną sekwencją prototypową (Kimbauer, R. i in., (1993) J. Virol. 67:6929-6936), powodujące dwie zmiany aminokwasowe: His-202 do Asp i Thr-266 do Ala. Analiza sekwencji oryginalnej matrycy DNA potwierdziła, że zmiany te są również obecne w klonie genomowym pUC18-HPV16L1/L2 i nie zostały wprowadzone przez PCR.

PRZYKŁAD 32

Konstruowanie drożdżowego wektora ekspresyjnego L1 i L2_HPV 16

Plazmid p1404 9-37-1 (pC1/1-GAL+HPV 16 L1) trawiono SmaI, który ciął pomiędzy promotorem GAL10 i terminatorem transkrypcji ADH1. Gen L2 HPV 16, wielkości 1,4 kbp, amplifikowano przez PCR stosując DNA pUC18-HPV16L1/L2 jako matrycę, polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 cykli amplifikacji PCR (94°C 1 min., 48°C 1 min., 72°C 1 min. 45 sek.) oraz następującą parę starterów oligonukleotydowych, zawierających miejsce SmaI (podkreślone):

starter sensowny:

5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 17) starter antysensowny:

5'-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3' (Identyfikator Sekw. Nr 18).

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji sekwencję liderową, bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L2 HPV 16 (wytłuszczony). Produkt PCR, wielkości 1,4 kbp trawiono Smal, oczyszczono na żelu i poddano ligacji z trawionym Smal plazmidem p14049-37-l. Plazmid pCl/1-GAL zawierający geny L1 i L2 HPV 16 wyizolowano i oznaczono pl4049-42-2 gen L2 w pl4049-42-2 sekwencjonowano stosując zestaw PRISM™ (ABI, Inc.) i urządzenie ABI Sequencer Model #373A, według instrukcji producenta. Stwierdzono, że gen L2 w tym izolacie różni się w porównaniu ze skorygowaną, opublikowaną sekwencją prototypową (Kimbauer, R. i in., wyżej), posiadając 5 zmian nukleotydowych powodujących jedną zmianę aminokwasową: Ser-269 do Pro. Analiza sekwencji klonu genomowe183 781 go pUC18-HPV16L1/L2 potwierdziła, że zmiana ta jest również obecna w oryginalnej matrycy DNA i nie została wprowadzona przez PCR.

PRZYKŁAD 33

A. Ekspresja L1 HPV 16 i koekspresja L1 i L2 HPV 16 w drożdżach

Plazmidy pl4049-37-l (pCl/1-GAL+HPV 16 L1) i p14049-42-2 (pCl/1-GAL+HPV 16 L1 i L2) zastosowano do transformowania S. cerevisiae szczepu #1558. Powstałe szczepy rekombinowane gospodarza szczepu #1558 były szczepami #1678 (HPV 16 L1) i #1679 (HPV 16 L1+L2) jak to pokazano na tablicy. Izolaty klonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHD zawierającej 2% galaktozę przez 68-78 godziny. Po zebraniu komórek osad komórkowy rozbito szklanymi perełkami, zaś lizat komórkowy badano w kierunku ekspresji L1 HPV 16 albo L2 HPV 16 metodą immunologiczną. Próbki zawierające 40 μg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na żelach z 10% Tris-glicyną w warunkach redukujących i denaturujących i przeniesiono elektroforetycznie na błony nitrocelulozowe. Białko L1 wykrywano stosując królicze poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko białku fuzyjnemu trpE-HPV11 (Brown D. R. i in., Virology 201;46-54) jako przeciwciało pierwotne i ośle przeciwciało przeciwko króliczym IgG sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (HRP) (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne. Błony wywoływano z użyciem zestawu do cheMiluminescencji ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). We wszystkich próbkach z wyjątkiem kontroli negatywnej (pC1/1 bez genu L1 i L2) wykryto prążek białka L1 o ciężarze cząsteczkowym 50-55 kDa. Białko L2 wykryto jako prążek wielkości 70 kDa analizą immunoblot, stosując mysią surowicę przeciwko HpV 16 L2, wywołaną przeciwko białku fuzyjnemu trpE-L2, ekspresjonowanemu w E coli, jako przeciwciało pierwotne i kozie przeciwciało przeciwko mysim IgG sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne zaś filtry wywoływano jak to opisano wyżej.

B. Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1+L2 HPV 16

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (27,6 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 50 ml buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μM. Papkę komórkową poddano lizie przez

3-krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 8000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Papkę rozbitych komórek sklarowano odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający antygen L1+L2.

Płynny nadsącz rozcieńczono 1:5 buforem A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do kolumny anionowymiennej (5,0 cm (średn. wew.) x 4,0 cm) z żywicy Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) zrównoważonej buforem A. Po przepłukaniu buforem A, antygen eluowano gradientem 0-1,0 M NaCl w buforze A. W celu określenia, która z frakcji z kolumny zawierała białko L1, zastosowano badanie immuno-dot blot.

Połączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen stężono przez frakcjonowanie siarczanem amonowym. Stężenie siarczanu amonowego w roztworze doprowadzono do 48%, przez dodawanie suchej substancji delikatnie mieszając, przez 30 minut. Próbkę umieszczono na lodzie i pozostawiono do precypitacji przez 30 Minut. Próbkę odwirowano przy 12000 obr/min. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Zawieszoną próbkę poddano chromatografii żelowej na kolumnie (89 cm x 2,6 cm śr. wew.) z żywicy Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Zastosowanym buforem był PBS. Chromatografię wykonywano w temp. 20-23°C. Frakcje analizowano przez SDS-PAGE z barwieniem srebrem i metodą Western blot. Połączono najczystsze frakcje. Powstałe pule stężono w 50 ml komorze stosując płaskie błony YM-100 średnicy 43 mm (Amicon, Beverly, MA) przy ciśnieniu N 2 równym 4-6 psi.

183 781

Produkt końcowy badano przez SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Homogenność białek L1 i L2 określono na 70%. Tożsamość białek L1 i L2 potwierdzono badaniem Western blot z użyciem odpowiednich surowic. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 0,53 mg białka.

Badanie EM wykonała firma Structure Probe (West Chester, PA). Porcję każdej z próbek umieszczano na pokrytych węglem miedzianych siatkach o rozmiarze otworów 200. Na siatce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Przed badaniem TEM siatki suszono na powietrzu. Badanie przeprowadzono stosując elektronowy mikroskop transmisyjny JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrografy miały powiększenie 100000Χ. Potwierdzono obecność cząsteczek wiroidalnych o wielkości 50-55 nm.

C. Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1 i L2 HPV 16

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (92,8 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 105 ml buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μί^. Papkę komórkową poddano lizie przez

3- krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 16000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Papkę rozbitych komórek sklarowano odwirowując przy 6100 x g przez 10 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający antygen L1+L2.

Płynny nadsącz rozcieńczono 1:5 buforem A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do kolumny anionowymiennej (5,0 cm (średn. wew.) x 4,2 cm) z żywicy Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) zrównoważonej buforem A. Po przepłukaniu buforem A, antygen eluowano gradientem 0-1,0 M NaCl w buforze A. W celu określenia, która z frakcji z kolumny zawierała białko L1, zastosowano badanie immuno-dot blot.

Połączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen stężono przez frakcjonowanie siarczanem amonowym. Stężenie siarczanu amonowego w roztworze doprowadzono do 35%, przez dodawanie suchej substancji delikatnie mieszając, przez 10 minut. Próbkę umieszczono na lodzie i pozostawiono do precypitacji przez 4 godziny. Próbkę odwirowano przy 12000 obr/min. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Zawieszoną próbkę poddano chromatografii żelowej na kolumnie (89 cm x 2,6 cm śr. wew.) z żywicy Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Zastosowanym buforem był PBS z 1 mM EDTA. Frakcje analizowano przez SDS-PAGe z barwieniem srebrem i metodą Western blot. Połączono najczystsze frakcje. Powstałe pule stężono w 50 ml komorze stosując płaskie błony YM-100 średnicy 43 mm (Amicon, Beverly, MA) przy ciśnieniu N 2 równym

4- 6 psi.

Produkt końcowy badano przez SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Homogenność białek Li i L2 określono na 70%. Tożsamość białek L1 i L2 potwierdzono badaniem Western blot z użyciem odpowiednich surowic. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 3,8 mg białka.

PRZYKŁAD 34

A. Fermentacja szczepu 1679 (L1+L2 HPV 16)

Procedury zastosowane do przygotowania zamrożonych kultur wyjściowych, opracowanie inokulum, fermentacja i odzyskiwanie komórek szczepu 1679, przeprowadzono zasadniczo, jak to opisano wyżej. Po 67 godzinach inkubacji, osiągnięto gęstość komórkową równą 4,2 g suchej masy/litr, co pozwoliło uzyskać osad 93 g wilgotnej masy.

B. Fermentacja szczepu 1678 (L1 HPV 16)

Procedury zastosowane do przygotowania zamrożonych kultur wyjściowych, opracowanie inokulum, fermentacja i odzyskiwanie komórek szczepu 1678, przeprowadzono zasad183 781 niczo, jak to opisano wyżej. Po 70,5 godzinach inkubacji, połączono zawartość dwóch 10 litrowych fermentacji (gęstość komórkowa równa 8,7 g suchej masy komórek/litr), co pozwoliło uzyskać osad 258 g wilgotnej masy komórek.

C. Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1 HPV 16

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (128 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 140 ml zmodyfikowanego buforu „L1” (20 mM fosforan sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 pM. Papkę komórkową poddano lizie przez 3-krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 16000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110 (Microfluidics Corp., Newton, Ma). Papkę rozbitych komórek sklarowano odwirowując przy 11000 x g przez 40 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający antygen L1.

Płynny nadsącz rozcieńczono 1:5 buforem A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do kolumny anionowymiennej (5,0 cm (średn. wew.) x 6,4 cm) z żywicy Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown. NJ) zrównoważonej buforem A. Po przepłukaniu buforem A, antygen eluowano gradientem 0-1,0 M NaCl w buforze A. W celu określenia, która z frakcji z kolumny zawierała białko L1, zastosowano badanie immuno-dot blot.

Połączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen stężono przez frakcjonowanie siarczanem amonowym. Stężenie siarczanu amonu w roztworze doprowadzono do 35%, przez dodawanie suchej substancji delikatnie mieszając, przez 10 minut. Próbkę umieszczono na lodzie i pozostawiono do precypitacji przez 5 godzin. Próbkę odwirowano przy 12000 obr/min. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6.25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Zawieszoną próbkę poddano chromatografii żelowej na kolumnie (89 cm x 2,6 cm śr. wew.) z żywicy Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Zastosowanym buforem był PBS. Frakcje analizowano przez SDS-PAGE z barwieniem srebrem i metodą Western blot. Połączono najczystsze frakcje. Powstałe pule stężono w 50 ml komorze stosując płaskie błony YM-100 średnicy 43 mm (Amicon, Beverly, MA) przy ciśnieniu N 2 równym 4-6 psi.

Produkt końcowy badano przez SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Homogenność białka L1 określono na 70%. Tożsamość białka L1 potwierdzono badaniem Western blot z użyciem odpowiednich surowic. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 7,4 mg białka.

D. Procedury analityczne

Procedura immuno-dot blot

Próbki rozcieńczono (jeżeli to konieczne) 1:10 w Milli-Q-H 2 O i próbkę 10 pl nakroplono na błony PVDF PolyScreen™ (NEN Research Products, Boston, MA). Po wyschnięciu plamek, membrany przepłukano wodą i wysuszono. Przez rozcieńczenie odpowiedniej surowicy buforem (5% odtłuszczone mleko w proszku w 6,25 mm fosforanie sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN 3) przygotowano roztwór przeciwciał pierwotnych. Inkubacja trwała przynajmniej 1 godzinę w 20-23°C. Plamkę przepłukiwano trzykrotnie po 1 minucie w PBS (6,25 mm fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztwór przeciwciał wtórnych wykonano przez rozcieńczenie, w tym samym buforze co przeciwciała pierwotne, odpowiedniej surowicy odpornościowej sprzęgniętej z fosfatazą alkaliczną. Inkubację przeprowadzano w tych samych warunkach przez przynajmniej godzinę. Plamki przepłukiwano jak poprzednio, i wykrywano stosując jednoetapowy substrat NBP/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Do wykrywania stosowano następujące przeciwciała:

L1 HPV 6a wykrywano przeciwciałem MAB 837 (Chemicon International. Inc.,Temecula, CA). L2 HPV 6a wykrywano pulą #641 i 647 mysiej surowicy przeciwko białku fuzyjnemu L2 HPV 6a-trpE. L1 HPV 16 wykrywano przeciwciałem MAB 885 (Chemicon International, Ioc.,Temecula. CA). L2 HPV 16 wykrywano pulą #611 mysiej surowicy

183 781 przeciwko białku fuzyjnemu L2 HPV 16-trpE.

Test Bradforda na białko całkowite

Białko całkowite było badane przez zastosowanie dostępnego w handlu zestawu Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL). Próbki rozcieńczano odpowiednio Milli-Q-H?O. Wymagana objętość próbki wynosiła 0,1 ml albo 1,0 ml, zależnie od procedury, odpowiednio, mikro albo standardowej. W obu protokołach do wykreślania krzywej wzorcowej stosowano BSA (Pierce, Rockford, IL). Test wykonywano według instrukcji producenta. Krzywe wykreślano stosując oprogramowanie CricketGraph® na komputerze Macintosh IIci.

PRZYKŁAD 35

Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1 HPV 11

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (180 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 900 ml buforu do lizy (50 mM MOPS, pH 7,2, 5Ó0 mM NaCl, 1 mM CaCl₂). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz AEBSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 1 mM i 1,7 pM. Papkę komórkową poddano lizie przez 4-krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 16000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Do papki zniszczonych komórek dodano odpowiednią objętość 10% detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL) aby uzyskać stężenie końcowe 0,5% Triton X100. Papkę rozbitych komórek traktowaną Triton X100 sklarowano odwirowując przy 12000 x g przez 40 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający białko L1.

Płynny nadsącz diafiltrowano wobec pięciu objętości 20 mM fosforanu sodowego, pH 7,2, 0,5 M NaCl, stosując kasetę z membraną o przepływie stycznym, 300K (Filtron, Northborough, MA). Materiał zatrzymany na błonie zwierał białko L1, co wykazano radioimmunologicznie i metodą Western blot.

Retentat wprowadzono do wysokiej rozdzielczości kolumny powinowactwa (11,0 cm x 5,3 cm) z żywicy SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francja) zrównoważonej 20 mM fosforanem sodu, pH 7,2, 0,5 M NaCl. Po przepłukaniu tym samym buforem i przepłukaniu 20 mM fosforanem sodu, pH 7,2,1 M NaCl, białko L1 eluowano przez przepłukanie 20 mM fosforanem sodu, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Frakcje zbierano podczas płukania i elucji. Frakcje badano na białko całkowite metodą Bradforda. Następnie badano je analizą Western blot i przez SDS-PAGE i barwienie koloidalnym błękitem Coomassie.

Połączono frakcje SP Spherodex wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1.

Produkt końcowy badano przez Western blot i SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Densytometrią żeli barwionych Coomassie stwierdzono, że białko L1 jest w >90% czyste. Tożsamość białka L1 potwierdzono badaniem Western blot. Produkt końcowy sterylizowano przez filtrację przez membranę 0,22 μm. porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 202 mg białka.

Badanie EM wykonała firma Structure Probe (West Chester, PA). Porcję każdej z próbek umieszczano na pokrytych węglem miedzianych siatkach o rozmiarze otworów 200. Na siatce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Przed badaniem TEM siatki suszono na powietrzu. Badanie przeprowadzono stosując elektronowy mikroskop transmisyjny JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrografy miały powiększenie 100000X.

Badania SDS-PAGE i Western blot

Wszystkie żele, bufory i aparat elektroforetyczny pochodziły z firmy Novex (San Diego, CA) i były wykorzystywane zgodnie z instrukcją producenta. Pokrótce, próbki rozcieńczano Milli-Q-H₂0 do równych stężeń białka i mieszano z buforem inkubacyjnym zawierającym 200 mM DTT. Próbki inkubowano 15 minut w 100°C i wprowadzano do uprzednio przygotowanych żelach z 12% Tris-glicyną. Próbki poddawano elektroforezie przy napięciu 125V przez 1 godzinę i 45 minut. Żele wywoływano przez barwienie koloidalnym błękitem Coomassie, stosując dostępny w handlu zestaw (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

W badaniach Western blot, białka przenoszono na membrany PVDV przy napięciu 25V przez 40 minut. Membrany płukano Milli-Q-L^₂O i suszono na powietrzu. Jako przeciwciało

183 781 pierwotne stosowano poliklonalną surowicę króliczą wywołaną przeciwko białku fuzyjnemu trpE-L1 HPV 11 (dar od dra D. Browna). Roztwór przeciwciał pierwotnych przygotowano przez rozcieńczenie surowicy buforem (5% odtłuszczone mleko w proszku w 6,25 mm fosforanie sodu, pH 7,2, 150 mM NaC11, 0,02% NaNg). Inkubacja trwała przynajmniej 1 godzinę w 20-23°C. Membranę przepłukiwano trzykrotnie po 1 minucie w PBS (6,25 mm fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztwór przeciwciała wtórnego wykonano przez rozcieńczenie, w tym samym buforze co przeciwciała pierwotne, koziej surowicy odpornościowej przeciwko króliczym IgG, sprzęgniętej z fosfatazą alkaliczną (Pierce Rockford, IL). Inkubację przeprowadzano w tych samych warunkach przez przynajmniej godzinę. Membranę przepłukiwano jak poprzednio, i wykrywano stosując jednoetapowy substrat NBP/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

PRZYKŁAD 36

Ekspresja L1 i L2 HPV 18 w drożdżach

Plazmidy pl91-6 (pGALl-10+ HPV 18 L1) i pl95-l (pGALl-10+HPV 18 L1+L2) S. cerevisiae szczepu #1558 (MATa., leu2-04, prbl:;HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Izolaty kłonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHD zawierającej 2% galaktozę przez 68-78 godziny. Po zebraniu komórek osad komórkowy rozbito szklanymi perełkami, i badano w kierunku ekspresji L1 HPV 18 albo L2 HPV 18 metodą immunologiczną. Próbki zawierające 25 pg całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na żelach z 10% Tris-glicyną (Novex, Inc.) w warunkach redukujących i denaturujących i przeniesiono elektroforetycznie na błony nitrocelulozowe. Białko L1 wykrywano stosując królicze poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko białku fuzyjnemu trpE-HPY11 L1 (Brown D. R. i in., Virology 201; 46-54) jako przeciwciało pierwotne i ośle przeciwciało przeciwko króliczym IgG sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (HRP) (Amersham, Inc.) jako przeciwciało wtórne. Błony wywoływano z użyciem zestawu do chemiluminescencji ECL™ Detection Kit (Amersham, Inc.). We wszystkich próbkach klonów L1 jak również koeksprejonujących L1+L2 (odpowiednio, szczepy 1725 i 1727) z wyjątkiem kontroli negatywnej (pC 1/1 bez genu L1 i L2) wykryto prążek białka L1 o ciężarze cząsteczkowym 50-55 kDa.

Białko L2 HPV 18 wykryto analizą metodą Western blot, stosując kozią surowicę poliklonalną wywołaną przeciwko białku fuzyjnemu trpE-HPV 18 L2, jako przeciwciało pierwotne i sprzęgnięte z HRP, królicze przeciwciało przeciwko kozim IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithesburg, MD). Filtry wywoływano jak opisano wyżej. Białko L2 wykryto jako prążek wielkości 75 kDa w klonie drożdży koekspresjonującym L1+L2 (szczep 1727) ale nie wykryto w kontroli negatywnej ani w klonie ekspresjonującym L1.

PRZYKŁAD 37

Fermentacja L1 HPV 18 (szczep 1725) i L1+AL2 18 (szczep 1727)

Płytkowa hodowla powierzchniowa szczepów 1725 i 1727 została przeniesiona aseptycznie do płynnej pożywki bez leucyny zawierającej (na litr): 8,5 g „Difco yeast nitrogen base”, bez aminokwasów i siarczanu amonowego; 0,2 g adeniny; 0,2 g uracylu; 10 g kwasu sukcynylowego; 5 g siarczanu amonu, 0,25 g L-tyrozyny; 0,1 g L-argininy; 0,3 g L-izoleucyny; 0,05 g L-metioniny; 0,2 g L-tryptofanu; 0,05 g L-histydyny; 0,2 g L-lizyny; 0,3 g L-fenyloalaniny; pH pożywki ustalono przed sterylizacją na 5,0-5,3 przy użyciu NaOH. Po hodowli przez 25 godzin w 28°C, przy 250 obr/min. na wytrząsarce obrotowej, przygotowano probówki do mrożenia kultur przez nalanie sterylnej gliceryny w stężeniu końcowym 17% (wag/obj) przed umieszczeniem w -70°C (po 1 ml na probówkę). W tej samej pożywce przygotowano inokulum do fermentacji (500 ml na butelkę 2 l) i rozpoczęto ją przez przeniesienie rozmrożonej zawartości dwóch probówek do butelek 2 litrowych i inkubację w 28°C, 250 obr/min. na wytrząsarce obrotowej przez 29 godzin. Do fermentacji każdego szczepu wykorzystano fermentator New Brunswick SF-116 o pojemności roboczej 10 l. Zastosowana pożywka zawierała (w litrze): 20 g ekstraktu drożdżowego Difco; 10 g peptonu Sheffieid HySoy; 20 g glukozy; 20 g galaktozy; 0,3 ml środka przeciwpiennego Union Carbide UCON LB-625; pH pożywki przed sterylizacją ustalono na 5,3. Całą zawartość (500 ml) 2-litrowej butelki przeniesiono do fermentatora, który inkubowano w 28°C, 400 obr/min., 5 l powietrza/min., ciśnienie 3,5 psi. Wytrząsanie zwiększono w celu utrzymania poziomu rozpuszczo28

183 781 nego tlenu o saturacji wyższej niż 40%. Proces fermentacji śledzono przez pomiar glukozy (Beckman Glucose 2 Analyzer) i spektrometrii masowej (Perkin-Elmer 1200). Po 66 godzinach inkubacji, osiągnięta została gęstość komórkowa od 9,5 do 9,7 g suchej masy/litr. Hodowlę stężono przez filtrację przez rurkowate włókna (wkład Amicon H5MP01-43 w układzie filtracyjnym Amicon DC-10) do około 2 litrów, diafiltrowano w stosunku do 2 l roztworu soli buforowanego fosforanem i dalej stężano (do około 1 l) przed rozporcjowaniem do butelek wirowniczych pojemności 500 ml. Osad komórkowy zebrano przez odwirowanie przy 8000 obr/min. (rotor Sorvall GS3) przez 20 minut w 4°C. Po zlaniu nadsączu, osad (191 do 208 g wilgotnej masy) przechowywano do momentu użycia w -70°C.

PRZYKŁ AD38

Oczyszczanie rekomblnowtaych białek kapsydu L1 HPV 18

Wszystkie etapy, o ile nie zaznaczono tego specjalnie, wykonywano w 4°C.

Komórki przechowywano w -70°C. Zamrożone komórki (126 g wilgotnej masy) rozmrażano w 20-23°C i zawieszano w 70 ml buforu do lizy (20 mM fosforaa sodu, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do powstałej papki oddawano inhibitorów proteaz PMSF i Pepstatin A w stężeniach, odpowiednio, 2 mM i 1,7 μΜ. Papkę komórkową poddano lizie przez 4-krotne przepuszczenie ich, przy ciśnieniu 16000 psi, przez urządzenie Microfluidizer M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Papkę rozbitych komórek sklarowano odwirowując przy 12000 x g przez 40 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Odzyskano płynny nadsącz zawierający antygen L1.

Płynny nadsącz rozcieńczono 1:5 buforem A (20 mM MOPS, pH 7,0) i wprowadzono do kolumny anioaowymlenaej (9,0 cm (średn. wew.) x 3,9 cm) z żywicy Fractogel® EMD TMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) zrównoważonej buforem A. Po przepłukaniu buforem A, antygen eluowano gradientem 0-1,0 M NaCl w buforze A. W celu określenia, która z frakcji z kolumny zawierała białko L1, zastosowano badanie immuno-dot blot. Frakcje badano na białko całkowite metodą Bradforda a następnie przez SDS-PAGE-i barwienie srebrem oraz metodą Western blot.

Połączono frakcje TMAE wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1. Antygen stężono przez frakcjonowanie siarczanem amonu. Stężenie siarczanu amonu w roztworze doprowadzono do 35%, przez dodawanie suchej substancji delikatnie mieszając, przez 10 minut. Próbkę umieszczono na lodzie i pozostawiono do precypitacji przez 4 godziny. Próbkę odwirowano przy 16000 x g przez 45 minut. Osad zawieszono w 20 ml PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl).

Produkt końcowy badano przez SDS-PAGE z barwieniem koloidalnym błękitem Coomassie. Homogenność białka L1 określono na 50-60%. Tożsamość białka L1 potwierdzono badaniem Western blot. Produkt końcowy porcjowano i przechowywano w -70°C. Proces zaowocował otrzymaniem 12,5 mg białka.

PRZYKŁAD 39

Przygotowanie kompozycji immunogennej

Oczyszczone VLP opracowano znanymi metodami, jak przez domieszanie dopuszczalnych farmaceutycznie nośników, stabilizatorów i adiuwantów szczepionek. Immunogenne VLP według wynalazku mogą być wykonywane do stosowania w szczepionkach, przez połączenie z kompozycją dopuszczalną fizjologicznie, jak np. PBS, roztwór soli czy woda destylowana. Immunogenne VLP podawane są w dawkach zawierających się od około 0,1 do około 100 pg, korzystnie od około 1 do około 20 pg, w celu uzyskania pożądanego efektu immunogenncgo.

Ilość VLP w postaci użytkowej waha się w zależności od wielu czynników, obejmujących choć nie ograniczonych do stanu osobnika, ciężaru, wieku i płci. Podawanie preparatów VLP może odbywać się różnymi drogami, obejmującymi, choć nie ograniczonymi do doust183 781 nej, podskórnej, doocznej, śluzówkowej i domięśniowej. Preparaty farmaceutyczne VLP mogą zawierać jeden rodzaj VLP (np. VLP z HPV 6a) albo mieszaninę VLP (np. VLP z HPV 6a, HPV 11, HPV 16 i HPV 18).

Może ewentualnie być zawarty konserwant przeciwbakteryjny np. tiomersal. Immunogenne antygeny według wynalazku mogą być stosowane, jeżeli to konieczne, w połączeniu ze stabilizatorami szczepionek i adiuwantami szczepionek. Typowymi stabilizatorami są swoiste związki jak: polianiony jak np. heparyna, heksasiarczan inozytolu, siarczanowana betacyklodekstryna, mniej swoiste związki jak: aminokwasy, sorbitol, mannitol, ksylitol, glicerol, dekstroza, sacharoza, trehaloza oraz odmiany warunków panujących w roztworze np. obojętne pH, wysoka siła jonowa (około 0,5-2,0 M sole), kationy diwalentne (Ca2+, Mg2+). Przykłady adiuwantów obejmują Al(OH )3 i Al(PO4). Szczepionka według wynalazku może być przechowywana w postaci liofilizowanej albo zamrożonej.

PRZYKŁAD 40

Przygotowanie przeciwciał przeciwko VLP

Do wywołania przeciwciał zastosowano oczyszczone VLP. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym, oznacza przeciwciała poliklonalne jak i monoklonalne, jak również ich fragmenty jak Fv, Fab i F(ab)2, które są zdolne do wiązania antygenu albo haptenu. Przeciwciała są używane w wielu zastosowaniach, obejmujących, choć nie ograniczonych do oczyszczania rekombinowanych VLP. oczyszczania natywnych białek L1 albo L2 oraz w zestawach. Zestaw zawiera „nośnik z przegródkami, który jest odpowiedni do przetrzymywania w nim w szczelnym zamknięciu co najmniej jednego zbiornika. Nośnik powinien dalej zawierać reagenty jak przeciwciało przeciwko VLP albo VLP odpowiednie do wykrywania HPV albo fragmentów HPV albo przeciwciał przeciwko HPV. Nośnik może również zawierać środki umożliwiające wykrywanie, jak znakowany antygen albo substraty enzymu itp. Przeciwciała albo VLP albo zestawy są pożyteczne w wielu zastosowaniach, włączywszy, choć nie tylko w analizach kryminalistycznych i badaniach epidemiologicznych.

183 781

SDS/PAGE (REDUCING CONDITIONS)

0(ZV!2C2oV£ IlL-P

Purified VLP's

Scheme 2 Scheme 3 , o

StJjewud- 2 rtheiwł ó

200 ·- — 116 ·97 «► _ ► ^{T ΊΙ1}36 ·22

183 781 i WARUNKI

SDS/PAGE (REDUCING CONDfflONS)

CCZSSzawe VLf>

Purified VLP's <$· s CH £WiVr T Scheme 1 /

2?

/ _fr >' af* / J/Ąv $ 5 «?

,<?

/.θ’ «,< ś'

G Cj Φ

183 781

FIGURA 12 - Schemat procesu oczyszczania VLP CRPV: Schematy 2 i 3

Proces oczyszczania VLP-CRPV S liza komórek Φ klarowanie lizatu przez wirowanie z małą prędkością

Φ sedymentacja przez 45% sacharozę Φ zawieszenie osadu i klarowanie przez wirowanie z małą prędkością Φ ekstrakcja CHCI₃ (ten etap został pominięty w schemacie 2)

Ψ chromatografia anionowymienna Φ ultrafiltracja (błona polieterosulfonowa) chromatografia ekskluzyjna ultrafiltracja (błona YM-100)

183 781 j

♦-.· — rr,.

Prpbica </

Lane #	Sample
1	M_r Standards
2	Ciańfied Cellular Lvsate
3	NH4SO4 Supemate Pool 1
4	NH4SO4 Supemate Pool 2
5	Concentraied ΤΜΑέ Pool 1
6	Concentrated TMAE Pool 2
*?	SeDhacryl 5Ó0HR Pool 1
&	SeDhacryl 5Ó0HR Pool 2
9	Finał Concentraied Product
10	M_r Standards or Blank

-? 5Τ*Μ»Α?Ρ M KLAR0WWZ łJZAT Koud«»wy 5UfpeM«TX»»r ArthnSCy ZfYf^{* 1}1, gg f sł&u-rwe, puhr r~ p_ £9 .słytohif TMfłg, puht- ' ^{r _} sephA&Ml 500MC. ptUft 4 stphauul £<χ>-Ηβ poła 2 5łffccUy pyodutn^gjJijoWM -SRNPARp LUB PRÓsŁ,

I 1 3 «f X 4 » X 5 «·

Colloidal Coomassie Stain kou>/p*uiy afc^Ktr Cooy/ssic

I l 3 4 S· t 7 t^U l

Western Blot for LI Protein

Oczyszczanie białka L1 metoda western blot

Western Blot for L2 Protein

Oczyszczanie białka L.2 metodą western blot

Purification of HPV Type 16

Oczyszczanie białka kapsydu HPV typu 16

LI + L2 Capsid Proteins

L1 + L2 ?pu

183 781

Figur 1C

Rekombinowane szczepy drożdży ekspresjonujących białka PV L1 i/lub L2

Table I. Recombinant Yeast Strains which Express PV LI and/or L2 Proteins

Recombinant Strain szczep rekombinowany	PV Codine Seauencefs)	Yeast Host Strain³szczep drożdży goqa<
sekwencja kodująca
1582	CRPVL1	1569
1583	CRPVL2	1538
1603	CRPV LI + L2	1592
	(2-plasmid system) -
1606	CRPV LI + L2	1569
1609	CRPV LI + L2	BJ5462
1644	HPV 6a LI	1558
16-70	HPV5aLl +L2	1558
1678	HPV 16 LI	1558
1679	HPV 16 LI + L2	1558

irza układ

2-plazmidów

183 781

Figura 9

Prototyp oczyszczania VLP ludzkiego wirusa brodawczaków

Zawiesina komórek drożdży

Liza komórek w mikrofluidyzerze

Lizat komórek drożdży

Odwirowanie przy 5,000 xg 4°C, 10 minut. Odzysk nadsączu _1. .

Klarowny lizat

Rozcieńczenie 1:5 mM MOPS, pH 7,2 __

Chromatografia z silną żywicą ΑΕΧ (żywica Fractogel EMD TMAE)

Analiza frakcji metodą srzebrzenia oraz western blotting.Łączenie najlepszych frakcji

Zatężanie pul (wytrącanie 35% siarczanem amonu)

Zawieszanie osadu w RCM8. Wirowanie z małą prędkością.

Usuwanie osadu.

Chromatografia ekskluzyjna (żywica Sephacryl 500HR)

Identyfikacja frakcji zawierających antygen.

Zatężanie.

Oczyszczone VLP

183 781

FIGURA 8

2150-2-3 (MATa, Ieu2, ade1) γ Select ura' on F_OA plates

Selekcja ura na płytkach FOA

U9 (MATa, leu2, ade1, ura3) łTransiorm with his3::URA3 disruption cassette

Transformacja kasetą niszcząca his5::URA3 1524 (Ieu2, ade1, his3) łTransiorm with prb1::HIS3 disruption cassette

Transformacja kasetą niszczącą prb1:HIS3 1537 (Ieu2, prb1, adeT)

Select ura' on FOA plates ’ Selekcja ura na płytkach FOA

1541 (Ieu2, prb1, ade1, ura3)

Transform with pep4::URA3 J disruption cassette

Transformacja kasetą niszczącą pep4::UR.A 1569 (MATa, Ieu2, prb1, pep4, ade1)

Figura 7 ®tf 1&ΙΤ&0Ώ ©©mflaOtralltrasg) fe®2Ga mamm)® ©tratę) EratLoftaMatras Schemat konstruowania szczepu 1558 zawierającego mutacje mnn9 i prbl

2150-2-3 (MATa, Ieu2, adel)

Select ura' on FOA plates * Selekcja ura na płytkach FOA

U9 (MATa, Ieu2, adel, ura3)

ITransform with mnn9::URA3 disruption cassette

Transformacja kasetą niszczącą 1372 (mnn9, Ieu2, ade 1) ™™9: URA3 j Select ura on FOA plates selekcja ura aą płytkach FOA 1372-ura3 (mnn9, leu2, ura3, adel)

ITransform with his3::URA3 disruption cassette

Transformacja kasetą niszczącą his::URA5

1372-his3 (mnn9, Ieu2, his3, adel)

T ransform with prb 1 ::HIS3 1 disruption cassette

Transformacja kasetą niszczącą prb::HIS5 strain 1558 (MATa, leu2, mnn9, prbl, adel)

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków, (HPV), do podawania ludziom, zawierającej cząstki wiroidalne (VLP), znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) transformowania drożdży cząsteczką DNA, kodującą białko L1 HPV albo białka L1+L2 HPV, z wytworzeniem transformowanej komórki drożdży;

b) hodowania transformowanej komórki drożdży w warunkach umożliwiających wytwarzanie białek rekombinowanych i ich spontaniczne łączenie się w VLP;

c) zbierania VLP z transformowanych komórek;

d) oczyszczanie VLP przez przynajmniej jeden etap chromatografii; i

e) wytwarzanie szczepionki.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczepem drożdży jest Saccharomyces cerevisiae.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że HPV wybrany jest z grupy obejmującej HPV typu 6a, HPV typu 6b, HPV typu 11, HPV typu 16 i HPV typu 18.