ES2343255T3

ES2343255T3 - Expresion optimizada del vph 52 l1 en levadura.

Info

Publication number: ES2343255T3
Application number: ES05725933T
Authority: ES
Inventors: Janine T. Bryan; Michelle K. Brownlow; Loren D. Schultz; Kathrin U. Jansen
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2010-07-27
Anticipated expiration: 2025-03-18
Also published as: NL300777I2; BRPI0509079B1; NO338055B1; AU2005230907C1; RU2006137363A; AU2005230907A1; MY148656A; ZA200607575B; DE602005020913D1; US7744892B2; AR048191A1; BRPI0509079A; JP2007530040A; NO20064815L; NL300777I1; FR15C0085I2; CN1934131B; TWI349036B; IL178140A; WO2005097821A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID N:2, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID Nº:1.

Description

Expresión optimizada del VPH 52 L1 en levadura.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del papiloma humano (VPH). De modo más específico, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas VPH 52 L1, y a vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos. Esta invención se refiere también partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose las VLP por expresión recombinante del VPH 52 L1 o L1 + L2 en células de levadura y a su uso en vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar infecciones por VPH.

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Antecedentes de la invención

Existen más de 80 tipos del virus del papiloma humano (VPH), muchos de los cuales se han asociado con una amplia variedad de fenotipos biológicos, desde verrugas benignas proliferativas hasta carcinomas malignos (para una revisión, véase McMurray y col., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). El VPH6 y el VPH11 son los tipos más comúnmente asociados con verrugas benignas, condilomas acuminados no malignos y/o displasia de grado bajo de la mucosa genital o respiratoria. El VPH 16 y el VPH 18 son los tipos de riesgo alto más frecuentemente asociados con carcinomas in situ e invasivos del cuello uterino, vagina, vulva y conducto anal. Más del 90% de los carcinomas del cuello uterino están asociados con infecciones por el VPH16, el VPH18 o por los tipos oncogénicos menos prevalentes VPH31, -33, -45, -52 y -58 (Schiffman y col., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). La observación de que el ADN del VPH se detecta en el 90-100% de los cánceres de cuello uterino proporciona una evidencia epidemiológica sólida de que los VPH causan carcinoma de cuello uterino (véase Bosch y col., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).

Los virus del papiloma son virus pequeños (50-60 nm), sin envoltura, de ADN icosaédrico, que codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Las fases de lectura abierta (ORF) de los genomas víricos se designan E1 a E7, y L1 y L2, donde "E" denota temprano y "L" denota tardío. L1 y L2 codifican proteínas de la cápside vírica, mientras que los genes E están asociados con funciones tales como la replicación vírica y la transformación celular.

La proteína L1 es la proteína principal de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es la proteína secundaria de la cápside. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la proteína L1 en la cápside vírica. Tanto las proteínas L1 como las L2 se mantienen en gran medida entre los diferentes virus del papiloma.

La expresión de la proteína L1 o de una combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de insectos o bacterias conduce al autoensamblaje de partículas similares a virus (VLP) (para una revisión, véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, páginas 101-12 (1996)). Las VLP son similares morfológicamente a viriones auténticos y son capaces de inducir valoraciones altas de neutralización de anticuerpos tras administración en animales o seres humanos. Debido a que las VLP no contienen el genoma vírico potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas del VPH (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Por esta razón, los genes L1 y L2 han sido identificados como dianas inmunológicas para desarrollar vacunas profilácticas y terapéuticas contra la infección y la enfermedad por VPH.

El desarrollo y la comercialización de la vacuna del VPH se han visto obstaculizados por dificultades asociadas con la obtención de niveles de expresión altos de proteínas de la cápside en organismos huéspedes transformados con éxito, limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican proteínas VPH L1 tales como la proteína VPH 52 L1, sería muy deseable desarrollar una fuente de proteína VPH L1 bruta fácilmente renovable que utilice secuencias de nucleótidos que codifiquen la VPH 52 L1 que estén optimizadas para la expresión en la célula huésped deseada. Adicionalmente, sería útil producir grandes cantidades de VLP del VPH 52 L1 que tengan las propiedades que confieren inmunidad de las proteínas nativas para usar en el desarrollo de vacunas.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos para facilitar inmunidad, o potenciarla, en los productos proteicos expresados por genes VPH 52 L1. Específicamente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican proteínas VPH 52 L1, estando los polinucleótidos optimizados con codones para una expresión de nivel elevado en una célula de levadura. En una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos del polinucleótido está modificada para eliminar las señales de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura. La presente invención proporciona, además, partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose dichas VLP por expresión recombinante del VPH 52 L1 o L1 + L2 en células de levadura, y desvela el uso de VLP del VPH 52 en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedad por el VPH y cáncer asociado al VPH.

La presente invención se refiere a moléculas sintéticas de ADN que codifican proteínas VPH 52 L1. Los codones de las moléculas sintéticas están diseñados para usar los codones preferentes de una célula de levadura. En una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos de la molécula sintética está modificada para eliminar las señales de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura. Las moléculas sintéticas pueden usarse como fuente de proteínas VPH 52 L1 que pueden autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una vacuna basada en VLP.

Una realización ejemplar de la presente invención comprende una molécula sintética de ácido nucleico que codifica la proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID Nº:2, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que está optimizada con codones para la expresión a alto nivel en una célula de levadura.

También se proporcionan vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico desveladas a lo largo de la presente memoria descriptiva. En una realización preferente de la presente invención, la célula huésped es una célula de levadura.

La presente invención también comprende un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura; y (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

La presente invención se refiere, además, a un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende una molécula de ácido nucleico en una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura, estando la molécula de ácido nucleico optimizada con codones para la expresión óptima en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

En realizaciones preferentes, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos tal como se exponen en SEC ID Nº:1 (denominada en el presente documento "secuencia 52 L1 R").

La presente invención se refiere también a partículas similares a virus (VLP) del VPH 52 que se producen en células de levadura, a procedimientos para producir VLP del VPH 52 y a procedimiento de uso de VLP del VPH 52.

En una realización preferente de la invención, la levadura se selecciona del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

Otro aspecto de la presente invención es una VLP del VPH 52, en el que la VLP se produce por expresión recombinante del VPH 52 L1 o el VPH 52 L1 + L2 en una célula de levadura.

Otro aspecto más de la presente invención es una VLP del VPH 52 que comprende una proteína VPH 52 L1 producida por un gen VPH 52 L1 optimizado con codones. En una realización ejemplar del presente aspecto de la invención, el ge VPH 52 L1 comprende una secuencia de nucleótidos tal como se expone en la SEC ID Nº:1.

La presente invención proporciona también un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal, que comprende administrar partículas similares a virus del VPH 52 al animal. En una realización preferente, las VLP del VPH 52 están producidas por un gen optimizado con codones.

Otro aspecto más de la presente invención es un procedimiento para prevenir o tratar un cáncer de cuello uterino, que comprende administrar a un mamífero una vacuna que comprende VLP del VPH 52. En una realización preferente del presente aspecto de la invención, las VLP del VPH 52 se producen en levadura.

La presente invención se refiere también a una vacuna que comprende partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose las VLP del VPH 52 en levadura.

En una realización alternativa del presente aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLP de al menos un tipo de VPH adicional. El al menos un tipo del VPH adicional puede ser cualquier tipo de VPH de interés, incluido cualquier tipo descrito en la técnica o los identificados subsecuentemente. En una realización preferente, el tipo del VPH es un tipo que está asociado con un fenotipo clínico tal como verrugas o cáncer de cuello uterino. En una realización preferente adicional, el al menos un tipo del VPH adicional está seleccionado del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68.

La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose las VLP del VPH 52 en levadura. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden VLP del VPH 52 y VLP de al menos un tipo adicional del VPH. En una realización preferente, el al menos un tipo adicional del VPH está seleccionado del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68.

Tal como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

Tal como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las definiciones siguientes y las abreviaturas se aplican:

El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento de una cadena de ADN al que se une la ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con ARN polimerasa para iniciar y controlar la actividad transcripcional. El complejo puede modificarse activando secuencias denominadas "potenciadores" o "secuencias de activación cadena arriba" o inhibiendo secuencias denominadas "silenciadores".

El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Existen varios tipos de vectores que incluyen plásmidos, virus (incluidos adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.

El término "casete" se refiere a una secuencia de nucleótidos o génica que debe expresarse a partir de un vector, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos o génica que codifica la proteína VPH 52 L1. En general, un casete comprende una secuencia génica insertada en un vector que, en algunas realizaciones, proporciona secuencias reguladoras para expresar la secuencia de nucleótidos o génica. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos o génica proporciona las secuencias reguladoras para su expresión. En realizaciones adicionales, el vector proporciona algunas secuencias reguladoras y la secuencia de nucleótidos o génica proporciona otras secuencias reguladoras. Por ejemplo, el vector puede proporcionar un promotor para la transcripción de la secuencia de nucleótidos o génica y la secuencia de nucleótidos o génica proporciona una secuencia de terminación de la transcripción. Las secuencias reguladoras que pueden proporcionarse mediante un vector incluyen, pero no están limitadas a, potenciadores, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias aceptoras y donantes, intrones, secuencias de unión a ribosomas y secuencias de adición de poli(A).

Las expresiones "secuencia 52 L1 de tipo silvestre" y "secuencia 52 L1 wt" se refiere a la secuencia BDPV 52 L1 desvelada en el presente documento como SEC ID Nº:3. Aunque la secuencia del VPH 52 L1 de tipo silvestre se ha descrito previamente, no es extraño encontrar variaciones secundarias en secuencias entre ADN obtenido a partir de aislados clínicos. Por consiguiente, se aisló una secuencia representativa del VPH 52 L1 de tipo silvestre a partir de muestras que se demostró previamente que contenían ADN del VPH 52 (véase el EJEMPLO 1). La secuencia del VPH 52 L1 de tipo silvestre se usó como secuencia referencia para comparar las secuencias del VPH 52 L1 optimizadas con codones desveladas en el presente documento (véase la Figura 1).

Las expresiones "VPH 52 L1 R" y "52 L1 R" se refieren a una secuencia sintética ejemplar de nucleótidos del VPH 52 L1 (SEC BD Nº:1), desvelada en el presente documento, siendo reconstruida la secuencia de tal modo que comprende codones que son preferentes para la expresión de alto nivel usando una célula de levadura.

El término "cantidad eficaz" significa que se introduce suficiente composición de vacuna para producir los niveles adecuados del polipéptido, de tal modo que da como resultado una respuesta inmunitaria. Un experto en la técnica reconoce que este nivel puede variar.

Una "sustitución aminoacídica conservadora" se refiere a la sustitución de un resto aminoacídico por otro, químicamente similar, resto aminoacídico. Ejemplos de dicha sustitución conservadora son: sustitución de un resto hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro, sustitución de un resto polar por otro resto polar de la misma carga (por ejemplo arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico).

El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos los seres humanos.

"VLP" significa partícula(s) similar(es) a virus.

"Sintético" significa que el gen VPH 52 L1 se creó de tal manera que contenía una secuencia de nucleótidos que no es la misma que la secuencia de nucleótidos presente en el gen de origen natural denominado VPH 52 L1 de tipo silvestre (52 L1 wt, SEC ID Nº:3). Tal como se ha indicado anteriormente, en el presente documento se proporcionan moléculas sintéticas que comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende codones que son preferentes para la expresión usando células de levadura. Las moléculas sintéticas que se proporcionan en el presente documento codifican las mismas secuencias de aminoácidos que el gen VPH 52 L1 de tipo silvestre (SEC ID Nº:2).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una alineación de una secuencia que compara nucleótidos que han sido modificados en el gen VPH 52 L1 sintético de la presente invención (SEC ID Nº: 1, denominada como "52 L1 R") (véase el EJEMPLO 2). La secuencia de referencia es la secuencia 52 L1 de tipo silvestre (SEC ID Nº:3, denominada como "52 L1 wt"; véase el EJEMPLO 1). Los nucleótidos modificados están indicados en sus localizaciones correspondientes. El número de nucleótidos se indica entre paréntesis. Los nucleótidos idénticos en la secuencia 52 L1 reconstruida se indican con puntos.

La Figura 2 muestra el ácido nucleico bicatenario VPH 52 L1 reconstruido sintético (SEC ID Nº:1 y 7) y la secuencia de aminoácidos de código único (SEC ID Nº:2). El número de nucleótidos se indica a la izquierda.

La Figura 3 muestra un análisis Northern de tránscritos del VPH 52 L1 wt y del VPH 52 L1 R (véase el EJEMPLO 4). El análisis se realizó con una mezcla de sondas de ADN generadas frente a las secuencias 52 L1 wt y 52 L1 R. La flecha de la derecha indica la posición predicha del tránscrito de cadena completa 52 L1. No se detectaron tránscritos de ningún tipo de longitud en los carriles de 5 y 10 \mug de ARN 52 L1 wt. Los tránscritos de longitud completa son claros en la 52 L1 R, en ambos carriles de 5 y 10 \mug.

La Figura 4 muestra un análisis Western de proteínas VPH 52 L1 wt (52 wt) y 52 L1 R (52R). La VPH 16 L1 se incluye como referencia (16). Se desnaturalizaron, y se aplicaron a un gel de SDS-PAGE al 10%, diez, cinco, dos y un medio de microgramos del extracto total de proteína de levadura. La proteína se transfirió para el Western. La proteína VPH 52 L1 se detectó sobre la mancha resultante usando un antisuero policlonal de cabra anti-trpE VPH 31 L1 absorbido en levadura que reacciona de forma cruzada con VPH 52 L1 y VPH 16 L1. Los indicadores del peso molecular se muestran en kDa en la izquierda. La flecha indica la posición de la proteína VPH 52 L1 de \sim 55 kDa.

La Figura 5 presenta una muestra representativa de VLP del VPH 52 compuesta de moléculas de proteína VPH 52 L1 R, que se describen en el presente documento, tal como se visualizan mediante un microscopio electrónico de transmisión (véase el EJEMPLO 7). El diámetro de las partículas esféricas en esta muestra en bruto varía desde entre 40 y 70 nm, con algunas partículas que presentan una serie regular de capsómeros. La barra representa aproximadamente 0,1 \mum.

Descripción detallada de la invención

La mayor parte de los carcinomas de cuello uterino están asociados con infecciones de tipos oncogénicos específicos del virus del papiloma humano (VPH). La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para facilitar inmunidad, o potenciarla, en los productos proteicos expresados por genes de tipos oncogénicos del VPH. Específicamente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican VPH 52 L1, estando los polinucleótidos optimizados con codones para una expresión de alto nivel en levadura. La presente invención también proporciona partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, que se producen en levadura, y desvela el uso de dichos polinucleótidos y VLP en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o el tratamiento de cáncer asociado al VPH.

Se ha informado de una secuencia de nucleótidos VPH 52 L1 de tipo silvestre (Nº de acceso de Genbank NC 001592). La presente invención se refiere a moléculas sintéticas de ADN que codifican la proteína VPH 52 L1. En un aspecto de la invención, las moléculas sintéticas comprenden una secuencia de codones, habiéndose modificado al menos algunos codones para usar los codones preferentes por una célula de levadura para expresión de alto nivel. En un aspecto alternativo de la invención, la secuencia de nucleótidos de la molécula sintética está modificada para eliminar las señales de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una secuencia de codificación para la expresión de proteínas VPH 52 L1, las cuales pueden autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una vacuna a base de VPL para proporcionar inmunoprofilaxis eficaz contra infecciones por virus del papiloma mediante neutralización de anticuerpos e inmunidad mediada por células. Dichas vacunas a base de VLP también pueden ser útiles para el tratamiento de infecciones por VPH ya existentes.

La expresión de VLP del VPH en células de levadura ofrece las ventajas de ser económica y de adaptarse fácilmente al cultivo a gran escala en fermentadores. Además, el genoma de la levadura puede modificarse fácilmente para asegurar la selección de levadura transformada recombinante con un aumento del crecimiento y del potencial de expresión. Sin embargo, muchas proteínas VPH L1, incluidas las VPH 52 L1 se expresan en niveles en células de levadura que son inferiores a los deseables para una ampliación a escala comercial (véase el EJEMPLO 2).

En consecuencia, la presente invención se refiere a secuencias génicas del VPH 52 L1 que están "optimizadas" para una expresión a alto nivel en un ambiente de células de levadura.

Un codón "triplete" de cuatro bases nucleótidas posibles puede estar presente en más de 60 formas diferentes. Debido a que estos codones proporcionan el mensaje para sólo 20 aminoácidos distintos (así como iniciación y terminación de la transcripción), algunos aminoácidos puede estar codificados por más de un codón, un fenómeno conocido como redundancia de codones. Por razones que no se entienden totalmente, no hay codones alternativos uniformemente presentes en el ADN endógeno de diferentes tipos de células. Efectivamente, parece que existe una jerarquía natural variable o "preferencia" para determinados codones en determinados tipos de células. Como ejemplo, el aminoácido leucina está especificado por cualquiera de los seis codones de ADN que incluyen CTA, CTC, CTG, CTT, TTA y TTG. El análisis exhaustivo de frecuencias de uso de codones del genoma para microorganismos ha revelado que el ADN endógeno de E. coli contiene, generalmente un codón de especificación de leucina CTG, mientras que el ADN de levaduras y de mixomicetos incluye, generalmente, un codón de especificación de leucina TTA. En vista de dicha jerarquía, se cree, en general, que la probabilidad de obtener altos niveles de expresión e un polipéptido rico en leucina mediante un huésped de E. coli dependerá, en alguna medida, de la frecuencia de uso del codón. Por ejemplo, es probable que un gen rico en codones TTA se exprese poco en E. coli, mientras que un gen rico en CTG se exprese, probablemente, de forma elevada en estos huéspedes. De manera similar, un codón preferente para la expresión de un polipéptido rico en leucina en células huésped de levadura sería el TTA.

Las implicaciones de fenómenos de preferencia de codones en técnicas de ADN recombinante son manifiestas, y el fenómeno puede servir para explicar muchos fracasos anteriores a la hora de lograr niveles de expresión altos de genes exógenos en organismos huésped transformados exitosamente (un codón menos "preferente" puede estar presente repetidamente en el gen insertado y la maquinaria de la célula huésped para la expresión puede no actuar eficazmente). Este fenómeno sugiere que los genes sintéticos que se han diseñado para incluir codones preferentes de la célula huésped prevista, proporcionan una forma óptima de material genético extraño para la práctica de la expresión de proteína recombinante. Así, un espectro de la presente invención es un gen VPH 52 L1 que está optimizado con codones para la expresión de alto nivel en una célula de levadura. En una realización preferente de la presente invención, se ha encontrado que el uso de codones alternativos que codifican la misma secuencia proteica puede eliminar las restricciones en la expresión de proteínas VPH 52 L1 en células de levadura.

De acuerdo con la presente invención, los segmentos génicos VPH 52 L1 se convirtieron en secuencias que tenían secuencias traducidas idénticas pero con el uso de codones alternativos tal como se describe por Sharp y Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657:-678 (1991), que se incorpora al presente documento por referencia. La metodología consiste, en general, en la identificación de codones en la secuencia de tipo silvestre que no están asociados, generalmente, con genes de levadura altamente expresados y en el reemplazo de los mismos por codones para la expresión alta en células de levadura. La secuencia génica nueva se analiza después para las secuencias no deseadas generadas por estos reemplazos de codones (por ejemplo, secuencias "ATTTA", creación accidental de sitios de reconocimiento de ayuste de intrones, sitios de restricción enzimáticos no deseados, contenido alto en GC, presencia de señales de terminación de la transcripción que están reconocidas por la levadura, etc.). Las secuencias no deseadas se eliminan sustituyendo los codones existentes por codones diferentes que codifican el mismo aminoácido. Los segmentos génicos sintéticos se analizan, entonces, para mejorar la
expresión.

Los procedimientos descritos anteriormente se usaron para crear segmentos génicos sintéticos para VPH 52 L1, dando como resultado un gen que comprende codones optimizados para la expresión de alto nivel. Mientras que el procedimiento anterior proporciona un resumen de nuestra metodología en el diseño de genes optimizados con codones para usar en vacunas del VPH, un experto en la técnica entiende que la eficacia de una vacuna similar o el aumento en la expresión de genes debe lograrse con pequeñas variaciones en el procedimiento o mediante pequeñas variaciones en la secuencia.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un polinucleótido sintético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VPH 52 L1, o un fragmento o una forma mutante biológicamente activos de una proteína VPH 52 L1, comprendiendo la secuencia de polinucleótidos codones optimizados para la expresión en una célula huésped de levadura. Dichas formas mutantes de la proteína VPH 52 L1 incluyen, pero no están limitadas a: sustituciones conservadoras de aminoácidos, truncaciones en el extremo amino, truncaciones, deleciones o adiciones en el extremo carboxi. Cualquier fragmento y/o mutante de este tipo biológicamente activo codificará o una proteína o un fragmento de proteína, que al menos imite sustancialmente las propiedades de la proteína VPH 52 L1 tal como se expone en SEC ID Nº:2. Los polinucleótidos sintéticos de la presente invención codifican moléculas de ARNm que expresan una proteína funcional VPH 52 L1 para que sea útil en el desarrollo de una vacuna terapéutica o profiláctica del VPH.

Un aspecto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico optimizada con codones que codifica la proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID Nº:2, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que está optimizada con codones para la expresión a alto nivel en una célula de levadura. En una realización preferente del presente aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEC ID Nº:1.

La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico desveladas en la presente memoria descriptiva. En una realización preferente de la presente invención, la célula huésped es una célula de levadura.

El ADN sintético del VPH 52 L1, o equivalentes funcionales del mismo, y fragmentos del mismo, construido mediante los procedimientos descritos en el presente documento, puede expresarse de forma recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de transcripción apropiados. Dicho vector de expresión puede transferirse a células huésped procariotas o eucariotas para producir proteína recombinante VPH 52 L1. En la técnica se describen, completamente, técnicas para dichas manipulaciones (Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, Nueva York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose y col., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1990), que se incorporan el presente documento como referencia en su totalidad).

Así, la presente invención se refiere a un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura; y (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

La presente invención se refiere, además, a un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura, estando la molécula de ácido nucleico optimizada con codones para la expresión óptima en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

La presente invención se refiere, además, a un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico tal como se expone en SEC ID Nº: 1 en una célula huésped de levadura, (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

Los genes sintéticos de la presente invención pueden ensamblarse en un casete de expresión que comprende secuencias diseñadas para proporcionar una expresión eficaz de la proteína VPH 52 L1 en la célula huésped. El casete contiene, preferentemente, el gen sintético, con las secuencias referidas de control de transcripción y traducción unidas operativamente al mismo, tales como un promotor, y secuencias de terminación. En una realización preferente, el promotor es el promotor GAL 1 de S. cerevisiae, aunque los expertos en la técnica reconocerán que puede usarse cualquier promotor de una serie de otros promotores de levadura conocidos tales como los promotores GAL1O, GAL7, ADH1, TDH3 o PGK, u otros promotores de genes eucariotas. Un terminador transcripcional preferente es el terminador ADH1 de S. cerevisiae, aunque también pueden usarse otros terminadores transcripcionales conocidos. La combinación de promotor GAL1 y del terminador ADH1 es particularmente preferente.

Otro aspecto de la presente invención es una partícula similar a virus (VLP) del VPH 52 producida por expresión recombinante de los genes VPH 52 L1 o L1 + L2 en una célula de levadura, procedimientos de producción de VLP VPH 52 y procedimientos de uso de las VLP del VPH 52. Las VLP pueden autoensamblarse cuando L1, la proteína principal de la cápside de virus del papiloma humano y animal, se expresa en levadura, células de insectos, células de mamíferos o bacterias (para una revisión, véase Schiller y Roden, rn Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, páginas 101-12 (1996)). VLP del VPH morfológicamente indistintas pueden producirse también expresando una combinación de las proteínas L1 y L2 de la cápside. Las VLP están compuestas por 72 pentámeros de L1 en una estructura icosaédrica T=7 (Baker y col., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).

Las VLP son similares morfológicamente a viriones auténticos y son capaces de inducir valoraciones de neutralización de anticuerpos altas tras administración en un animal. Se demostró que la inmunización de conejos (Breitburd y col., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)) y perros (Suzich y col., Proc. Natl. Acad. ScL USA 92(25): 11553- 57 (1995)) con VLP, induce la neutralización de anticuerpos y protege contra la infección experimental por virus del papiloma. Adicionalmente, se demostró que la inmunización de mujeres adultas con VLP del VPH 16 protege contra la infección por VPH 16 y neoplasia intraepitelial del cuello uterino por BDPV 16 (Koutsky y col. N. Engl. J. Med. 347: 1645-51 (2002)). Debido a que las VLP no contienen el genoma vírico potencialmente oncogénico y pueden autoensamblarse cuando se expresan a partir de un gen único, representan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de la vacuna del VPH (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. CHn. Virol. 19: 67-74
(2000)).

Así, la presente invención se refiere a partículas similares a virus formadas por proteínas L1 o proteínas recombinantes L1 y L2 del VPH 52, expresándose la proteína recombinante en una célula de levadura.

Como se ha mencionado anteriormente, en una realización preferente de la invención, las VLP del VPH 52 se producen en levadura. En una realización preferente, la levadura está seleccionada del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

Otro aspecto más de la presente invención es una VLP del VPH 52 que comprende una proteína VPH 52 L1 producida por un gen VPH 52 L1 optimizado con codones. En una realización preferente de la presente invención, el gen VPH 52 L1 optimizado con codones comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID Nº:1.

Otro aspecto más de la presente invención es un procedimiento para producir VLP del HPV 52, que comprende: (a) transformar levadura con una molécula de ADN recombinante que codifica a las proteínas VPH 52 L1 o VPH 52 L1 + L2; (b) cultivar la levadura transformada en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ADN recombinante para producir la proteína recombinante VPH 52 (c) aislar la proteína recombinante VPH 52 para producir VLP del VPH 52.

En una realización preferente del presente aspecto de la invención, la levadura se transforma con un gen VPH 52 L1 optimizado con codones para producir VPL del VPH 52. En una realización particularmente preferente, el gen VPH 52 L1 optimizado con codones comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEC ID Nº: 1.

La presente invención proporciona también un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal, que comprende administrar partículas similares a virus del VPH 52 al animal. En una realización preferente, las VLP del VPH 52 se producen expresando de forma recombinante un gen optimizado con codones que codifica VPH 52 L1 o VPH 52 L1 + L2.

Otro aspecto más de la presente invención es un procedimiento para prevenir y/o tratar un cáncer de cuello uterino asociado con el VPH que comprende administrar a un mamífero una vacuna que comprende VLP del VPH 52. En una realización preferente del presente aspecto de la invención, las VLP del VPH 52 se producen en levadura.

La presente invención se refiere también a un vacuna que comprende partículas similares a virus (VLP) del VPH 52.

En una realización alternativa del presente aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLP de al menos un tipo de VPH adicional. En una realización preferente, el al menos un tipo adicional del VPH está seleccionado del grupo constituido por: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 y HPV 68.

En una realización preferente del presente aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLP del VPH 16.

En otra realización preferente más de la invención, la vacuna comprende además VLP del VPH 16 y VLP del VPH 18.

En otra realización preferente más de la invención, la vacuna comprende además VLP del VPH 6, VLP del HPV 11, VLP del VPH 16 y VLP del VPH 18.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden partículas similares a virus del VPH 52. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden VLP del VPH 52 y VLP de al menos un tipo adicional del VPH. En una realización preferente, el al menos un tipo adicional del VPH está seleccionado del grupo constituido por: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59 y HPV 68.

Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden usarse solas en dosificaciones apropiadas que permitan una inhibición óptima de la infección por VPH 52 con una toxicidad potencial mínima. Además, puede ser deseable la coadministración o la administración secuencial de otros agentes.

La cantidad de partículas similares a virus que hay que introducir en un receptor de vacuna dependerá de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, se administra directamente al tejido muscular una dosis inmunológica o profilácticamente eficaz de aproximadamente 10 \mug a 100 \mug, y preferentemente de aproximadamente 20 \mug a 60 \mug de VLP. Se contemplan también la inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel y otras vías de administración tales como intraperitoneal, intravenosa o administración por inhalación. Se contempla también que puedan proporcionarse vacunas de refuerzo. La administración parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutánea u otras vías de administración con coadyuvantes tales como alumbre o coadyuvante de alumbre de Merck, simultáneamente con, o subsecuentemente a, la introducción parenteral de una vacuna de la presente invención se considera también una ventaja.

Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento están incorporadas por referencia con el propósito de describir y desvelar metodologías y materiales que pueden usarse con respecto a la presente invención. No debe interpretarse nada del presente documento como admisión de que la invención no está facultada para preceder en el tiempo tal divulgación en virtud de una invención anterior.

Habiendo descrito las realizaciones preferentes de la invención con referencia a las figuras adjuntas, se debe entender que la invención no está limitada exactamente a las realizaciones, y que un experto en la técnica puede realizar en las mismas varios cambios y modificaciones sin desviarse del ámbito o espíritu de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1

Determinación de una secuencia VPH 52 L1 representativa

La secuencia VPH 52 L1 se ha descrito previamente (Nº de acceso de Genbank NC 001592). No es extraño, sin embargo, encontrar pequeñas variaciones de secuencia entre ADN obtenido a partir de aislados clínicos. Para determinar una secuencia VPH 52 L1 de tipo silvestre representativa, se aisló ADN de tres muestras clínicas que previamente se demostró que contenían ADN de VPH 52. Las secuencias VPH 52 L1 se amplificaron en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando Taq ADN polimerasa y los cebadores siguientes: 5' L1 5' - A T G T C C G T G T G G C G G C C T A G T - 3'(SEC ID Nº:4) y 3'52 Bgl II 5' - G A G A T C T C A A T T A C A C A A A G T G - 3' (SEC ID Nº:5). Los productos amplificados se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Se escindieron las bandas L1 de \sim 1500 pb y se purificó el ADN usando el kit Geneclean Spin (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). El ADN se ligó después al vector de clonación TA, pCR2.1 (Invitrogen). Se transformaron células TOP1OF de E. coli con la mezcla de ligazón y se plaquearon sobre agar LB con canamicina más IPTG y X-gal para la selección de colonias azules/blancas. Las placas se invertieron y se incubaron durante 16 horas a 37ºC.

La PCR de la colonia se realizó sobre cinco colonias blancas que se originaron de cada uno de los tres aislados clínicos amplificados. Los cebadores 5' L1 y 3' 52 Bgl II se usaron en una PCR de dos etapas en la que la primera etapa comprende 10 ciclos de 96ºC durante 15 segundos (desnaturalización), 55ºC durante 30 segundos (alineamiento) y 68ºC durante 2 minutos (extensión), y la segunda etapa comprende 35 ciclos de un programa esencialmente similar, excepto que la etapa de alineamiento se realizó a 50ºC durante 30 segundos. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Varias colonias de cada aislado clínico contenían productos amplificados con bandas de -1500 pb. Las colonias se cultivaron en medio LB con canamicina, agitando a 37ºC durante 16 horas. Los minipreps se realizaron para extraer los ADN plasmídicos, que se digirieron con endonucleasas de restricción para demostrar la presencia del gen L1 en el plásmido. Los fragmentos de restricción resultantes se observaron por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.

La secuenciación de ADN se realizó sobre plásmidos que contenían insertos de L1 clonados de cada uno de los tres aislados clínicos. Las secuencias de ADN y de aminoácidos traducidos se compararon entre ellas y con las secuencias VPH 52 L1 de Genbank publicadas previamente. El análisis de secuencias de los tres aislados clínicos reveló que ninguna secuencia era idéntica a la secuencia de Genbank (Nº de acceso NC 001592). Se eligió el clon Nº 2C de pCR2.1 VPH 52 L1 para ser la secuencia representativa VPH 52 L1 y se denominó en el presente documento como la "secuencia 52 L1 de tipo silvestre" (SEC ID Nº:3, véase la Figura 1). La secuencia elegida como 52 L1 de tipo silvestre (wt) contenía una mutación de punto en comparación con la secuencia de Genbank, que consistía en una mutación silenciosa en el nucleótido 1308 (adenina \rightarrow guanina). La secuencia de aminoácidos de la secuencia VPH 52 L1 wt era idéntica a la secuencia 52 L1 de Genbank.

La secuencia de VPH 52 L1 de tipo silvestre se amplificó usando el cebador 5' L1 Bgl II (5' - G A G A T C T C A C A A A A C A A A A T G T C C G T G T G G C - 3' (SEC ID Nº:6) y el cebador 3' 52 Bgl II para añadir extensiones Bgl II. La PCR se realizó usando Taq polimerasa. El producto de la PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. Se escindió la banda de \sim 1500 pb y se purificó el ADN usando el kit Geneclean Spin (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). El producto de la PCR se ligó después al vector pCER2.1 y las células TOP10F' se transformaron con mezcla de ligazón. Las colonias se cultivaron en medio LB con canamicina, agitando a 37ºC durante 16 horas. Se realizaron minipreps para extraer el ADN plasmídico. Los genes VPH 52 L1 se liberaron a partir de las secuencias de vectores con digestiones con endonucleasa de restricción Bgl II. El ADN digerido se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. La banda L1 se purificó usando el kit Geneclean kit y se ligó a un vector pGAL110 digerido por BamHI desfosforilado. Las células TOP10F' de E. coli se transformaron con la mezcla de ligazón. Para seleccionar el inserto VPH 52 L1 en la orientación correcta, el ADN plasmídico de las colonias se amplifico por PCR. La secuenciación del ADN se realizó para confirmar la secuencia y orientación de los insertos. El clon seleccionado se denominó pGALl 10-VPH 52Ll Nº 5. Se preparó el ADN por maxiprep del clon seleccionado. Se hicieron competentes células de Saccharomyces cerevisiae mediante spheroplasting con glusulasa y transformando con pGALl 10- VPH 52L1 Nº 5. La mezcla de transformación de la levadura se plaqueó en agar blando con Leu-sorbitol sobre placas con Leu-sorbitol y se incubó de forma invertida durante 3-5 días a 30ºC. Los colonias se tomaron y se sembraron en estrías para su aislamiento sobre placas con Leu-sorbitol. Las colonias aisladas se cultivaron subsecuentemente en 5 ml de 5 X Leu- Ade-sorbitol con glucosa al 1,6% y galactosa al 4% en cultivos en tubo giratorio a 30ºC, para inducir la transcripción de VPH 52 L1 y la expresión de la proteína.

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Ejemplo 2

Optimización con codones de levadura

Se han descrito los codones preferentes de levadura (Sharp, Paul M y Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678 (1991)). La expresión de la proteína VPH 52 L1 wt era detectable; sin embargo, el nivel de transcripción era muy bajo y no detectable por análisis de Northern. Se postuló que la terminación de la transcripción prematura puede ser responsable de los bajos niveles de expresión del gen VPH 52 L1. Para aumentar la transcripción de este gen y asegurar que se producirían los tránscritos de cadena completa, el gen VPH 52 L1 se reconstruyó utilizando codones preferentes de levadura. La secuencia se examinó para buscar la presencia de señales de terminación de transcripción de levadura reconocidas por la levadura, y estas secuencias se eliminaron por sustitución con codones alternativos, mientras se conservaba la misma secuencia de aminoácidos. La secuencia reconstruida VPH 52 L1, que comprende secuencias de levadura optimizadas con codones, contenía 379 alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia VPH 52 L1 wt. La secuencia resultante se denomina en el presente documento como "52 L1 R" (R = reconstruida, véase la Figura 1). Las modificaciones de nucleótidos entre las secuencias 52 L1 wt (SEC ID Nº:3) y 52 L1 R (SEC ID Nº: 1) se muestran en la Figura 1. La secuencia de aminoácidos traducida de 58 L1 R no se modificó (SEC ID Nº:2, véase la Figura 2). La secuencia reconstruida proporciona una expresión aumentada de proteína VPH 52 L1, que es un avance significativo sobre el tipo silvestre para usar en el desarrollo de la vacuna.

La estrategia empleada para producir el gen optimizado se realizó para diseñar oligómeros sentido y antisentido de gran solapamiento que abarquen al gen, sustituyendo nucleótidos por secuencias de codones preferentes de levadura y manteniendo mientras la secuencia de aminoácidos. Estos oligómeros se usaron en lugar de ADN molde en una reacción de PCR con Pfu ADN polimerasa. Se diseñaron cebadores de amplificación adicionales y se usaron para amplificar las secuencias reconstruidas a partir de oligómeros molde.

Las condiciones óptimas para la amplificación fueron específicas de las secciones, la mayor parte de las reacciones emplearon un programa semejante a 94ºC durante 5 minutos (desnaturalización) seguido de 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos (desnaturalización), 50-55ºC durante 30 segundos (alineamiento), 72ºC durante 1,5 minutos (extensión), seguido de una extensión final a 72ºC durante 7 minutos y manteniendo a 4ºC. Los productos de la PCR se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se escindieron bandas del tamaño apropiado y el ADN se purificó a partir de la lámina de gel. Los fragmentos amplificados se usaron después como plantillas para ensamblar el gen VPH 52 L1 reconstruido 1512 nt.

Siguiendo a la reconstrucción, la banda 1512 nt se purificó en gel, y se ligó al vector pCR4 Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Siguiendo la ligazón, se transformaron células TOP10 de E. coli con la mezcla de ligazón. Se cultivaron colonias en 4 ml de LB con ampicilina y se extrajo ADN plasmídico de las colonias mediante técnicas miniprep. El ADN plasmídico se secuenció para confirmar la presencia de cambios de reconstrucción deseados en el VPH 52 L1. Para añadir extensiones BamHI a ambos extremos, el 52 Ll R (reconstruido) se volvió a amplificar a partir de pCR4Blunt-52 L1 R. El fragmento amplificado se clonó como anteriormente y el ADN plasmídico resultante se secuenció. El plásmido, pCR4 Blunt-52 L1 R (Bam) se digirió con BaniHL y los insertos de fragmento de ADN resultantes se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa. El fragmento de VPH 52 L1 R (Bam) de \sim1530 pb se purificó en gel y se ligó al pGAL110 digerido con BamHI. Las células TOP10F' de E. coli (Invitrogen) se transformaron con la mezcla de ligazón.

Las colonias resultantes se examinaron mediante PCR para el inserto VPH 52 L1 R en la orientación correcta. La secuencia y la orientación se confirmaron por secuenciación de ADN. Se preparó ADN plasmídico maxiprep. Se hicieron competentes células de S. cerevisiae mediante spheroplasting y se transformaron. La transformación de la levadura se plaqueó en agar blando con Leu-sorbitol sobre placas de agar con Leu-sorbitol. Las colonias se recogieron y se sembraron en estrías para su aislamiento sobre placas de agar con Leu-sorbitol. Las colonias aisladas se cultivaron subsecuentemente en 5 ml de 5 X Leu- Ade-sorbitol con glucosa al 1,6% y galactosa al 4% en cultivos en tubo giratorio a 30ºC, para inducir la transcripción de L1 y la expresión de la proteína. Después de 48 y/o 72 horas, sedimentó en pellas un volumen de cultivo equivalente a un DO_{600}=10, se retiró el sobrenadante y las pellas se congelaron y se almacenaron a -70ºC.

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Ejemplo 3

Preparación de ARN

Las pellas celulares de levadura transformada inducida para expresar VPH 52 L1 mediante inducción con galactosa se descongelaron sobre hielo, se suspendieron en 0,8 ml de reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió al vial un quinto de volumen de cloroformo. Se agitó vigorosamente durante 15 segundos para mezclar y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después de 5 minutos de centrifugación a 13 k rpm, la fase superior se recogió y se transfirió a un vial nuevo. Se añadieron al vial 0,4 ml de isopropanol. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para formar pellas de ARN, se realizó una centrifugación a 13 k rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó, la pella de ARN se lavó con EtOH al 75% y se repitió la etapa de centrifugación. El sobrenadante se decantó y la pella de ARN se dejó secar al aire durante 15 minutos, y a continuación se suspendió en agua exenta de RNasa. Se realizó una espectrofotometría para determinar la concentración de ARN en la muestra usando la presunción de que a una lectura de A_{260} 1 = 40 \mug/ml de ARN, cuando A_{260/280} es 1,7-2,0.

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Ejemplo 4

Análisis de Northern

Se moldeó gel de agarosa con formaldehído al 1,1%. Se combinaron cinco y diez microgramos de ARN con solución tampón de desnaturalización (concentraciones finales: formaldehído al 6%, formamida al 50% y 0,1 x MOPS) y se calentó a 65ºC durante 10 minutos. Se añadió un décimo de volumen de tampón de carga de gel y la muestra se cargó sobre el gel. La electroforesis se realizó a 75 voltios en 1 x tampón MOPS durante \sim 3 horas. El gel se lavó durante 60 minutos en 10 x SSC.

El ARN se transfirió a una membrana de nailon Hybond-N+ (Arnersham Biosciences, Piscataway, NJ) mediante acción capilar durante 16 horas en 10 x SSC. El ARN se fijó después a la membrana de nailon mediante reticulación usando la función de autorreticulación del Stratalinker UV de Stratagene (Stratagene, LA Jolla, CA). Después de la fijación, la membrana de nailon se deja secar al aire.

Se usó el kit I de Roche de detección y etiquetado de ADN con DIG de gran calidad (Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) para etiquetar secuencias de ADN 52 L1 wt y 52 L1 R con DIG para usar como sondas para detectar ARN 52 L1 wt y 52 L1 R sobre la mancha de Northern. La prehibridación, hibridación y desarrollo inmunológico se realizaron usando un anticuerpo conjugado a una fosfatasa alcalina antiDIG siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Brevemente, la mancha se prehibridó a 37ºC durante 30 minutos con agitación vigorosa. La sonda se desnaturalizó calentando a 95ºC durante 5 minutos y subsecuentemente se inactivó sobre hielo. La sonda se añadió a la solución de hibridación y se aplicó a la membrana durante 4 horas a 44,6ºC con agitación vigorosa. Después, la solución de hibridación se retiró y la mancha se lavó 2 x durante 5 minutos en 2 x SSC con SDS al 0,1% a temperatura ambiente, seguido de un lavado adicional a 65ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%. Después, la mancha se bloqueó durante 30 minutos y se aplicó el anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina antiDIG a una dilución de 1:5.000 durante 30 minutos. La mancha se lavó y se determinó la presencia de ARN unido a la sonda por detección en el sustrato NBT/BCIP del anticuerpo unido antiDIG conjugado a fosfatasa alcalina.

El análisis inicial de levadura que expresa VPH 52 L1 wt sugirió que se había expresado la proteína VPH 52 L1; sin embargo, el nivel era bajo. El análisis de Northern de ARN a partir de extractos de levadura de cultivos que inducían a expresar VPH 52 L1 wt no reveló nada de ARN de VPH 52 L1 detectable. Ya que se detectaron algunas proteínas del tamaño apropiado, estaba claro que se generaron algunos tránscritos de ARN de cadena completa. El gen VPH 52 L1 se reconstruyó con secuencias de codones preferentes de levadura y se diseñó para omitir cualquier posible sitio de terminación de la transcripción prematuro para asegurar una transcripción robusta. El análisis de Northern del tránscrito VPH 52 L1 R reveló que los tránscritos de cadena completa se generaron y eran detectables por el análisis de Northern (Figura 3).

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Ejemplo 5

Expresión de proteínas VPH 52 L1

Las pellas celulares de levadura congeladas de cultivos inducidos por galactosa equivalentes a DO_{600} = 10 se descongelaron sobre hielo y se suspendieron en 300 \mul de tampón PC ( Na_{2}HPO_{4} 100 mM y NaCl 0,5 M, pH 7,0) con PMSF 2mM. Se añadieron perlas de vidrio de 0,5 mm lavadas con ácido a una concentración de \sim 0,5 g/tubo. Los tubos se agitaron en vórtex durante 3 ciclos de 5 minutos a 40ºC con 1 minuto de pausa. Se añadieron 7,5 \mul de TritonX100 al 20% y la etapa de vórtex se repitió durante 5 minutos a 4ºC. Los tubos se situaron sobre hielo durante 15 minutos, seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrifugación estéril, el cual se etiquetó como extracto de proteína de levadura total, se fechó y se almacenó a -70ºC.

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Ejemplo 6

Análisis de Western

Se analizó el extracto de proteína de levadura total de veinte colonias aisladas de levadura para cada constructo VPH 52 L1 mediante análisis de Western para confirmar la expresión de proteína VPH 52 L1 después de la inducción por galactosa.

Se combinaron diez, cinco y dos y medio microgramos del extracto de proteína de levadura total con tampón de carga de SDS-PAGE y se calentó a 95ºC durante 10 minutos. La proteína VPH 16 L1, que es aproximadamente de 55 kDa, se incluyó como control positivo, junto con extracto de proteína de levadura total exento de VPH L1 como control negativo (no se muestran los datos). Las proteínas se cargaron sobre un gel de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a electroforesis en tampón de Tris-glicina. Después de la separación de proteínas, las proteínas se transfirieron por Western desde el gel a la nitrocelulosa y la mancha resultante se bloqueó en 1 x tampón diluyente (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación La mancha se lavó tres veces y se aplicó, a temperatura ambiente durante 16 horas, suero de cabra anti-trpE VPH 31 L1 absorbido en levadura, que reaccionó de forma cruzada con las proteínas VPH 16 y VPH 52 L1. La mancha se lavo después tres veces y se incubó con una dilución de 1:2.500 de anticuerpo conjugado a HRP anticabra durante 1 hora. La mancha se lavó de nuevo tres veces y se aplicó la detección de sustrato NBT/BCIP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Las proteínas inmunorreactivas se detectaron como bandas púrpura sobre la mancha.

En todos los casos, la proteína VPH 52 L1 se detectó en forma de una banda distintiva inmunorreactiva sobre la nitrocelulosa, correspondiente a aproximadamente 55 kDa. (Figura 4) La intensidad de la banda VPH 52 L1 R (2,5 \mug carril) parece ser significativamente mayor que la banda VPH 52 L1 wt (10 \mug). Estaba claro que tras la reconstrucción, el nivel de expresión de VPH 52 L1 R optimizada con codones aumentó más de cuatro veces, lo que es el límite de comparación directa del análisis Western.

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Ejemplo 7

Microscopio electrónico de transmisión

Para demostrar que la proteína 52 L1 estaba, de hecho, autoensamblada para formar capsómeros L1 pentaméricos, que a su vez se autoensamblan en partículas similares a virus, un extracto de proteína VPH 52 L1 R parcialmente purificado se sometió al microscopio electrónico de transmisión (TEM).

La levadura se cultivó con fermentación a pequeña escala y se formaron pellas. Las pellas resultantes se sometieron a tratamientos de purificación. La pella y los extractos de levadura aclarados se analizaron por inmunoanálisis para demostrar la expresión de la proteína VPH 52 L1 y la retención a través del procedimiento de purificación. Los extractos de levadura aclarados se sometieron después a centrifugación sobre una almohadilla de sacarosa al 45% y la pella resultante se suspendió en tampón para el análisis de VLP de BDPV 52 L1 por medio del MET.

Una muestra representativa de las VLP de BDPV producidas se muestra en la Figura 5. El diámetro de las partículas esféricas en esta muestra en bruto variaba entre 40 y 70 nm con algunas partículas que presentaban una serie regular de capsómeros.

<110> Merck & Co., Inc.

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<120> EXPRESIÓN OPTIMIZADA DEL VPH 52 L1 EN LEVADURA

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<130> 21571 PCT

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<150> 60/555926

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<151> 24-03-2004

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<160> 7

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1512

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> VPH52L1R

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 503

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<212> PRT

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<213> Virus del papiloma humano tipo 52

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 1512

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<212> ADN

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<213> Virus del papiloma humano tipo 52

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<400> 3

4

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtccgtgt ggcggcctag t

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador PCR

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagatctcaa ttacacaaag tg

\hfill

22

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<210> 6

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador PCR

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<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagatctcac aaaacaaaat gtccgtgtgg c

\hfill

31

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<210> 7

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<211> 1512

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> 52 L1 R antisentido

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<400> 7

7

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID N:2, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID Nº:1.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, siendo la célula huésped una célula de levadura.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, estando seleccionada la célula huésped del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

6. La célula huésped de la reivindicación 4, siendo la célula huésped Saccharomyces cerevisiae.

7. Un procedimiento para producir partículas similares a virus (VLP) del VPH 52 L1, que comprende:

a) transformar la levadura con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;

b) cultivar la levadura transformada en condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico para producir una proteína recombinante de virus del papiloma; y

c) aislar la proteína recombinante de virus del papiloma para producir VLP del VPH 52 L1.

8. Un procedimiento para preparar una vacuna para el tratamiento o la prevención de cáncer de cuello uterino asociado al VPH, comprendiendo dicho procedimiento la producción de VLP de VPH 52 L1 por el procedimiento de la reivindicación 7.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, comprendiendo la vacuna además VLP de al menos un tipo adicional de VPH.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, estando seleccionado el al menos un tipo adicional de VPH del grupo constituido por: VPH6, VPH11, VPH 16, VPH 18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH55, VPH56, VPH58, VPH59 y VPH68.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, comprendiendo el al menos un tipo de VPH VPH 16.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH18.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH6 y VLP del VPH11.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 ó 13, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH31.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH45.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH58.