CN1859923B - Hpv 45 l1在酵母中的优化表达 - Google Patents

Abstract

提供编码HPV45 L1蛋白质的合成DNA分子。具体地，本发明提供编码HPV45 L1蛋白质的多核苷酸，其中已经使所述多核苷酸的密码子优化来用于在酵母细胞中高水平表达。合成的分子可用来产生HPV45病毒-样颗粒(VLPs)，以及生产包括HPV45 VLPs的疫苗和药物组合物。本发明的疫苗通过中和抗体和细胞免疫提供针对***状瘤病毒感染的有效免疫预防。

Description

HPV 45 L1在酵母中的优化表达

发明领域

本发明一般地涉及人***状瘤病毒(HPV)的治疗。更具体地说，本发明涉及编码HPV45 L1蛋白质的合成多核苷酸，和包括所述多核苷酸的重组载体和宿主。本发明也涉及HPV45病毒-样颗粒(VLPs)，其中通过在酵母细胞中表达重组HPV 45L1或L1+L2产生VLPs，也涉及其在疫苗和用于预防和治疗HPV的药物组合物中的用途。

发明背景

存在80种以上类型的人***状瘤病毒(HPV)，其中许多与从良性增生性疣到恶性肿瘤的多种生物表型相关(关于综述，参见McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1)：15-33(2001))。HPV 6和HPV 11是最通常与生殖器或呼吸道粘膜的良性疣和/或非恶性的***相关的类型。HPV 16和HPV 18是最经常与宫颈、***、外阴和肛管的原位和侵袭性恶性肿瘤相关的高风险类型。90％以上的***与HPV16、HPV18或较少流行的致癌型HPV31、-33、-45、-52和-58感染相关(Schiffman等，J.Natl.Cancer Inst.85(12)：958-64(1993))。关于在90％以上的子***中检测到HPV DNA的观察提供了HPVs导致***的流行病学的有力证据(参见Bosch等，J.Natl.Cancer Inst.87(11)：796-802(1995))。

***状瘤病毒是编码最多8个早期和2个晚期基因的小的(50-60nm)、无包膜的、二十面体DNA病毒。病毒基因组的开放阅读框(ORFs)被称为E1至E7，以及L1和L2，其中″E″表示早期而″L″表示晚期。L1和L2编码病毒壳体蛋白质，而E基因与例如病毒复制和细胞转化的功能相关。

L1蛋白质是主要的衣壳蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白质是次要的衣壳蛋白质。免疫数据表明大多数L2蛋白质是在病毒衣壳中的L1蛋白质内部。L1和L2蛋白质在不同的***状瘤病毒当中都是非常保守的。

L1蛋白质或L1和L2蛋白质组合在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中的表达导致病毒-样颗粒(VLPs)的自动组装(参见综述，参见Schiller和Roden，in Papillomavirus Reviews：Current Research onPapillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UK：Leeds Medical Information，pp101-12(1996))。VLPs与真正的病毒体在形态上相似，并且当施用于动物时能够诱导高滴定度的中和抗体。因为VLPs不包含可能致癌的病毒基因组，因此它们在HPV疫苗开发中为使用活病毒提供安全备选(参见综述，参见Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000))。因此，已经确定L1和L2基因为开发用于HPV感染和疾病的预防性和治疗性疫苗的免疫靶。

与在成功转化的宿主生物体中获得外源基因的高表达水平相关的困难已经防碍了HPV疫苗的开发和商品化，限制了纯化蛋白的生产。因此，尽管鉴定了编码HPV L1蛋白质，例如HPV45L1蛋白质的野生型核苷酸序列，开发粗制HPV L1蛋白质的易可再生来源可能是非常合乎需要的，所述来源利用为在预定的宿主细胞中表达而优化的编码HPV45L1的核苷酸序列。另外，生产具有天然蛋白质的免疫性-赋予特性的大量HPV45L1VLPs对疫苗开发是有用的。

发明概述

本发明涉及对由已经与***相关的HPV45L1基因表达的蛋白质产物引发或增加免疫性的组合物和方法。具体地，本发明提供编码HPV45L1蛋白质的多核苷酸，其中已经使该多核苷酸的密码子被优化来用于在酵母细胞中高水平表达。本发明进一步提供HPV45病毒-样颗粒(VLPs)，其中通过在酵母细胞中表达重组HPV45L1或L1+L2生产所述的VLPs，并且公开了HPV45VLPs在用于预防和/或治疗HPV-相关癌的药物组合物和疫苗中的用途。

本发明涉及编码HPV45L1蛋白质的合成DNA分子。合成分子的密码子被设计以使用由酵母细胞偏好的密码子。合成的分子可用作HPV45L1蛋白质的来源，其可自我组装成为VLPs。所述的VLPs可用于以VLP为基础的疫苗。

本发明的例证性实施方案包括编码如SEQ ID NO：2所示的HPV45L1蛋白质的合成核酸分子，所述的核酸分子包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

也提供原核和真核的重组载体和重组宿主细胞，其包含本说明书公开的核酸分子。

本发明也涉及用于在重组宿主细胞中表达HPV45L1蛋白质的方法，包括：(a)将包括编码HPV45L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在容许表达所述的HPV45L1蛋白质的条件下培养该酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及用于在重组宿主细胞中表达HPV45L1蛋白质的方法，包括：(a)将包括编码HPV45L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞；其中使该核酸分子的密码子优化以在酵母宿主细胞中最优表达；以及(b)在容许表达所述的HPV45L1蛋白质的条件下培养该酵母宿主细胞。

在优选的实施方案中，核酸包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(45L1R序列)。

本发明也涉及在酵母细胞中生产的HPV45病毒-样颗粒(VLPs)、生产HPV45VLPs的方法、和使用HPV45VLPs的方法。

在本发明优选的实施方案中，酵母选自：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

本发明的另一个方面是HPV45VLP，其中通过在酵母细胞中重组表达HPV45L1或HPV45L1+L2来生产VLP。

本发明的另一方面是包括由密码子-优化的HPV45L1基因编码的HPV45L1蛋白质的HPV45VLP。在本发明这方面的例证性实施方案中，密码子优化的HPV45L1基因包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明也提供用于在动物中诱导免疫应答的方法，包括将HPV45病毒样颗粒施用于所述动物。在优选的实施方案中，由密码子优化的基因生产HPV45VLPs。

本发明的另一方面是预防或治疗HPV-相关的***的方法，包括将包括HPV45VLPs的疫苗施用于哺乳动物。在本发明这方面的优选实施方案中，在酵母中生产该HPV45VLPs。

本发明也涉及包括HPV45病毒-样颗粒(VLPs)的疫苗。

在本发明这方面备选的实施方案中，疫苗进一步包括至少一个另外的HPV类型的VLPs。所述至少一个另外的HPV类型可以是感兴趣的任何HPV类型，包括本领域中描述的或随后鉴定的任何HPV类型。在优选的实施方案中，HPV类型是与例如疣或***的临床表型相关的类型。在进一步优选的实施方案中，所述至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。

本发明也涉及包括HPV 45病毒样颗粒的药物组合物。进一步地，本发明涉及包括HPV45VLPs和至少一个另外的HPV类型的VLPs的药物组合物。在优选的实施方案中，所述至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。

如本说明书和所附的权利要求书自始至终所使用的，单数形式″a″，″an″，和″该″包括复数引用，除非上下文清楚地另外加以规定。

如本说明书和所附的权利要求书自始至终所使用的，应用下列定义和缩写：

术语″启动子″是指RNA聚合酶结合的DNA链上的识别位点。该启动子与RNA聚合酶形成起始复合物以启动和驱动转录活性。可通过称为″增强子″或″上游活化序列″的活化序列或称为″沉默子″的抑制序列修饰该复合物。

术语″载体″是指可将DNA片段导入宿主生物体或宿主组织的一些方式。存在各种型式的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、细菌噬菌体和粘粒。

名称″45L1野生型序列″是指作为SEQ ID NO：3(45L1wt)在此公开的HPV45L1DNA序列。尽管先前已经描述了HPV 45L1野生型的DNA序列，发现获得自临床分离物的DNAs之间微小的序列的变化是很平常的。因此，从先前显示包含HPV 45DNA的临床样品分离到代表性的45L1野生型DNA序列(参见实施例1)。该45L1野生型序列用作与在此公开的密码子-优化的45L1序列进行比较的参照序列(参见图1)。

名称″HPV 45L1R″或″45L1R″是指在此公开的例证性的合成HPV45L1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中改造该序列以使得其包括为酵母细胞所偏好用于高水平表达的密码子。

术语″有效量″是指导入足够的疫苗组合物以生产足够水平的多肽，因而产生免疫应答。本领域的技术人员将认识到这个水平可以变化。

″保守的氨基酸取代″是指一个氨基酸残基被另一个化学上相似的氨基酸残基替换。这种保守取代的实例是：一个疏水的残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸)取代另一个；一个极性残基取代另一个相同电荷的极性残基(例如，精氨酸取代赖氨酸；谷氨酸取代天冬氨酸)。

术语″哺乳动物″是指任何哺乳动物，包括人。

″VLP″或″VLPs″是指病毒-样颗粒。

″合成的″是指产生HPV45L1基因以使得其包含与存在于指定的天然存在的野生型HPV45L1基因中的核苷酸序列(45L1wt、SEQ IDNO：3)不相同的核苷酸序列的方式被产生。如上所述，在此提供的合成分子包括包含为酵母细胞表达所优选的密码子的核苷酸序列。在此提供的合成分子编码与野生型HPV45L1基因(SEQ ID NO：2)相同的氨基酸序列。

附图简述

图1是显示在本发明的合成HPV45L1基因中发生改变的核苷酸的DNA序列的序列对比(SEQ ID NO：1，标明为″45L1R″)(参见实施例2)。参照序列是45L1野生型序列(SEQ ID NO：3，标明为″45L1wt；参见实施例1)。在其相应位置标明改变的核苷酸。括号内包含有核苷酸编号。用点表示45L1改造序列中的相同核苷酸。

图2显示改造的合成HPV 45L1核苷酸和单代码的氨基酸序列。在左侧标明核苷酸编号。

图3显示在高严谨条件下特异于HPV 45L1RNA的Northern印迹探测(参见实施例4)。泳道(1)包含5μg的HPV45L1R RNA而泳道(2)包含10μg的HPV 45L1R RNA。在印迹上可见单个的全长RNA转录物。左侧箭头标明全长HPV 45L1转录物的预测位置。

图4显示HPV 45L1wt和3个HPV 45L1R分离物的Western印迹。泳道的内容物是：45L1wt(泳道1)、45L1R#4(泳道2)、45L1R#7(泳道3)、45L1R#11(泳道4)、HPV 16L1对照(泳道5)。将15微克的总酵母蛋白提取物加样入10％SDS PAGE凝胶的各个泳道。使用针对TrpE-HPV45L1融合蛋白的山羊多克隆抗-血清特异鉴定HPV 45L1蛋白质。左侧箭头标明55kDa的位置。

图5显示来自ng VLP/μg总蛋白的2个ELISA实验的部分数据(参见实施例7)。显示了45L1wt和45L1R的2个单独克隆之间的比较。改造的HPV 45L1VLP表达是45L1wt的大约2倍高。

图6显示由在此所描述的、如通过透射电子显微术显现的HPV 45L1R蛋白质分子组成的HPV 45VLPs的代表样本(参见实施例8)。横条代表大约100nm。

发明详述

大部分***与感染人***状瘤病毒(HPV)的特定致癌类型相关。本发明涉及对由致癌的HPV类型的基因表达的蛋白质产物引发或增强免疫性的组合物和方法。具体地，本发明提供编码自我组装成为HPV45病毒-样颗粒(VLPs)的HPV45L1蛋白质的多核苷酸，并且公开了所述的多核苷酸和VLPs在用于预防和/或治疗HPV-相关癌的药物组合物中的用途。

已经报道了野生型HPV45L1核苷酸序列(Genbank登记号#NC_001590；也参见Delius和Hofmann，Curr.Top.Microbiol. Immunol.186：13-31(1994))。本发明提供编码HPV45L1蛋白质的合成DNA分子。本发明的合成分子包括密码子序列，其中已经改变至少部分密码子以使用酵母细胞偏好的用于高水平表达的密码子。合成的分子可用作可自我组装成为VLPs的HPV45L1蛋白质的编码序列。所述的VLPs可用于基于VLP的疫苗以通过中和抗体和细胞介导的免疫提供针对***状瘤病毒感染的有效免疫预防。

酵母细胞中HPV VLPs的表达提供了成本经济的和易适合于发酵罐中大规模生长的优点。然而，在酵母细胞中表达的许多HPV L1蛋白质，包括HPV45L1，的水平比商业规模所需要的低。

因此，本发明涉及被″优化″用于在酵母细胞环境中高水平表达的HPV45L1基因序列。

4种可能的核苷酸碱基的″三联体″密码子可以超过60种变体的形式存在。因为这些密码子仅提供20种不同氨基酸的信息(以及转录起始和终止)，一些氨基酸可由一个以上的密码子编码，这个现象被称为密码子冗余。出于尚未完全了解的原因，备选的密码子不均匀地存在于不同类型细胞的内源DNA中。实际上，在某些类型的细胞中似乎存在某些密码子的可变天然等级或″偏爱″。如一个实例，由6个DNA密码子，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、和TTG中的任何一个表示氨基酸亮氨酸。微生物的基因组密码子使用频率的完全分析已经显示大肠杆菌的内源DNA最通常包含表示亮氨酸的CTG密码子，而酵母和粘菌类的DNA最通常包括表示亮氨酸的TTA密码子。鉴于这种等级，普遍认为通过大肠杆菌宿主获得高水平表达的富含亮氨酸的多肽的可能性在某种程度上依赖于密码子使用的频率。例如，很可能富含TTA密码子的基因可能在大肠杆菌中表达很差，而富含CTG的基因可能在这个宿主中高表达。类似地，在酵母宿主细胞中表达富含亮氨酸的多肽的优选密码子是TTA。

重组DNA技术中密码子偏好现象的意义是明显的，并且该现象可用来解释许多先前在成功转化的宿主生物体中获得高表达水平的外源基因方面的失败——在***的基因中可能重复存在″偏好″程度更低的密码子而宿主细胞的表达体系不能有效地运转。这个现象表明已经被设计成包括计划的宿主细胞偏好密码子的合成基因为实现重组蛋白质表达提供了最佳形式的外来遗传物质。因此，本发明的一个方面是为在酵母细胞中高水平表达而使密码子优化的HPV45L1基因。在本发明优选的实施方案中，已经发现使用编码相同的蛋白质序列的备选密码子可移除对酵母细胞表达HPV45L1蛋白质的限制。

根据本发明，将HPV45L1基因节段转变为具有相同翻译序列但具有备选(alternative)密码子使用的序列，如Sharp和Cowe所描述的(Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae.Yeast 7：657-678(1991))，其在此引入作为参考。方法学一般包括鉴定通常不与高表达酵母基因相关的野生型序列中的密码子，并且用在酵母细胞中高表达的最优密码子替换它们。然后检验新的基因序列中由这些密码子替换所产生的不想要的序列(例如，″ATTTA″序列，内含子拼接识别位点的偶然产生，不需要的限制性内切酶位点、高GC含量、由酵母识别的转录终止信号的存在，等等)。通过用编码相同氨基酸的不同密码子取代现有的密码子来淘汰不合需要的序列。然后检验合成基因片段的改进表达。

使用如上所述的方法产生HPV45L1的合成基因节段，结果形成包括用于在酵母细胞环境中高水平表达的优化密码子的基因。虽然上述操作提供了我们用于设计密码子优化基因供HPV疫苗之用的方法学总结，本领域的技术人员将理解可通过方法中的较少变化或通过序列中的较少变化获得相似的疫苗效果或增加表达的基因。

因此，本发明涉及包括编码HPV45L1蛋白质、或HPV45L1蛋白质的生物学活性片段或突变形式的核苷酸序列的合成多核苷酸，该多核苷酸序列包括用于在酵母宿主细胞中表达而优化的密码子。所述突变形式的HPV45L1蛋白质包括但不限于：保守的氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失、或添加。任何这种生物学活性片段和/或突变体将编码基本上模拟如SEQ ID NO：2所示的HPV45L1蛋白质的免疫特性的蛋白质或蛋白质片段。本发明的合成多核苷酸编码表达功能性的HPV45L1蛋白质的mRNA分子，以便用于治疗性或预防性HPV疫苗的开发。

本发明的一个方面是编码如SEQ ID NO：2所示的HPV45L1蛋白质的密码子-优化核酸分子，所述的核酸分子包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明也涉及原核和真核的重组载体和重组宿主细胞，其包含本说明书公开的核酸分子。

通过在此所描述的方法构建的合成的HPV45DNA或其片段可通过分子克隆到包含合适启动子和其他合适转录调控元件的表达载体中，并且将其转移到原核或真核的宿主细胞中以生产重组HPV45L1而重组表达。用于这种操作的技术由Sambrook等人充分描述(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，纽约，(1989)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associates and Wiley-Interscience，纽约(1988)；Yeast Genetics：A Laboratory Course Manual，Rose等人，Cold Spring Harbor laboratory Cold Spring Harbor，NewYork，(1990))，其在此全部引入作为参考。

因此，本发明涉及在重组宿主细胞中表达HPV 45L1蛋白质的方法，包括：(a)将包括编码HPV45L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在容许表达所述HPV45L1蛋白质的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及在重组宿主细胞中表达HPV 45L1蛋白质的方法，包括：(a)将包括编码HPV45L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞，其中使核酸分子密码子优化用于在酵母宿主细胞中最佳表达；和(b)在容许表达所述HPV45L1蛋白质的条件下培养所述酵母宿主细胞。

本发明进一步涉及在重组宿主细胞中表达HPV 45L1蛋白质的方法，包括：(a)将包括如SEQ ID NO：1所示的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在容许表达所述HPV45L1蛋白质的条件下培养所述酵母宿主细胞。

可将本发明的合成基因组装成为包括被设计以提供在宿主细胞中有效表达HPV45L1蛋白质的序列的表达盒。该盒优选含有合成基因，具有与其可操作连接的相关转录和翻译控制序列，例如启动子和终止序列。在优选的实施方案中，启动子是啤酒酵母GAL1启动子，尽管本领域的技术人员将认识到其它已知的许多酵母启动子中的任何一种，例如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK启动子，或其它真核的基因启动子都是可使用的。优选的转录终止子是啤酒酵母ADH1终止子，尽管也可使用其它已知的转录终止子。GAL1启动子-ADH1终止子的组合是特别优选的。

本发明的另一个方面是由在酵母细胞中重组表达HPV45L1或L1+L2基因生产的HPV45病毒-样颗粒(VLP)、生产HPV45VLPs的方法、以及使用HPV45VLPs的方法。当L1，人和动物***状瘤病毒的主要衣壳蛋白质在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中表达时，VLPs可自我组装(参见综述，Schiller和Roden，in PapillomavirusReviews：Current Research on Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UK：Leeds Medical Information，pp 101-12(1996))。也可通过表达L1和L2衣壳蛋白质的组合生产形态上没有差别的(indistinct)HPV VLPs。VLPs由T＝7的二十面体结构中的72个L1的五聚物组成(Baker等人，Biophys .J.60(6)：1445-56(1991))。

VLPs与真正的病毒体在形态上相似，并且当施用于动物时能够诱导高滴定度的中和抗体。用VLPs免疫的兔子(Breitburd等，J.Virol. 69(6)：3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92(25)：11553-57(1995))显示诱导中和抗体并防止实验性的***状瘤病毒感染。然而，因为VLPs不包含潜在致癌的病毒基因组，并且当从单个基因表达时可自我组装，它们在HPV疫苗开发中提供采用活病毒的安全备选(参见综述，Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol. 19：67-74(2000))。

Marais和同事(J.Med.Virol. 60：331-336(2000))公开了在昆虫细胞中从杆状病毒表达的HPV45L1基因生产的HPV 45VLPs。由于附带费用高，昆虫细胞中VLPs的表达对于疫苗开发并不有利。另外，经常难以将HPV L1基因在昆虫细胞培养物中的表达扩大至商品开发所需的大体积。还没有描述在酵母细胞中生产的HPV 45VLPs。酵母细胞中HPV VLPs的表达提供了成本经济的和易适合于发酵罐中大规模生长的优势。此外，可容易地改变酵母基因组以保证选择具有生长增加和表达潜力的重组转化的酵母。

因此，本发明涉及包含HPV45的重组L1蛋白质或重组L1+L2蛋白质的病毒样颗粒，其中在酵母细胞中表达该重组蛋白质。

在本发明优选的实施方案中，通过在酵母中表达HPV 45L1或HPV45L1+L2生产HPV45VLPs，酵母选自：啤酒酵母、多形汉逊氏酵母，巴斯德毕赤氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母、和粟酒裂殖酵母。

本发明的另一方面是包括通过表达密码子-优化的HPV45L1基因生产的HPV45L1蛋白质的HPV45VLP。在本发明这方面优选的实施方案中，密码子优化的HPV45L1基因包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明的另一方面是生产HPV45VLPs的方法，包括：(a)用编码HPV45L1蛋白质或HPV45L1+L2蛋白质的重组DNA分子转化酵母；(b)在容许表达该重组DNA分子的条件下培养转化的酵母以生产重组的HPV45蛋白质；和(c)分离重组的HPV45蛋白质以生产HPV45VLPs。

在本发明这方面的优选实施方案中，用密码子优化的HPV45L1基因转化酵母以生产HPV45VLPs。在特别优选的实施方案中，密码子优化的HPV45L1基因包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明也提供用于在动物中诱导免疫应答的方法，包括将HPV45病毒样颗粒施用于该动物。在优选的实施方案中，由密码子优化的基因生产HPV45VLPs。

本发明的另一方面是预防或治疗HPV-相关的***的方法，包括将包括HPV45VLPs的疫苗施用于哺乳动物。在本发明这方面的优选实施方案中，在酵母中生产HPV45VLPs。

本发明也涉及包括HPV45病毒-样颗粒(VLPs)的疫苗。

在本发明这方面备选的实施方案中，该疫苗进一步包括至少一个另外的HPV类型的VLPs。在优选的实施方案中，所述至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。

在本发明这方面的优选实施方案中，该疫苗进一步包括HPV16VLPs。

在本发明另一优选实施方案中，该疫苗进一步包括HPV16 VLPs和HPV 18VLPs。

在本发明另一优选的实施方案中，该疫苗进一步包括HPV6VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。

本发明也涉及包括HPV 45病毒样颗粒的药物组合物。进一步地，本发明涉及包括HPV45VLPs和至少一个另外的HPV类型的VLPs的药物组合物。在优选的实施方案中，所述至少一个另外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。

本发明的疫苗组合物可以由常规测试限定的合适剂量单独使用以便获得HPV45感染的最优抑制同时使任何潜在毒性最小化。此外，其它试剂的共同给药或顺序给药可能是合乎需要的。

被导入疫苗受体的病毒样颗粒的数量取决于所表达的基因产物的免疫原性。通常，将免疫或预防有效剂量的大约10μg至100μg，优选大约20μg至60μg的VLPs直接施用到肌肉组织中。也预期皮下注射、皮内导入、通过皮肤压入、和其他模式的给药，例如腹膜内、静脉内、或吸入递送。也预期可提供增效疫苗接种。与本发明疫苗的胃肠外给药同时或之后，进行肠胃外给药，例如伴随有佐剂，例如明矾或Merck铝佐剂的静脉内、肌肉内、皮下或其它方式的给药也是有利的。

为了描述和公开可与本发明联系使用的方法和物质，引入在此记载的所有出版物作为参考。在此没有文献被解释为承认本发明不能借助于在先发明而早于该公开的内容。

参考伴有的附图已经描述了本发明的优选实施方案，可理解本发明不限于那些精确的实施方案，而且本领域的技术人员可实行各种改变和修饰而不背离如所附的权利要求所限定的本发明的范围或精神。

下列实施例说明但不限制本发明。

实施例1

代表性的HPV 45L1序列的确定

先前已经描述了HPV 45L1序列(Genbank登记号#NC_001590；参见Delius和Hofmann Curr.Top.Microbiol. Immunol. 186：13-31(1994))。然而发现获得自临床分离物的DNAs之间有微小序列变化是很平常的。为了确定代表性的HPV45L1野生型序列，从4个先前显示包含HPV 45DNA的临床样品分离DNA。在聚合酶链式反应(PCR)中利用Taq DNA聚合酶和下列引物扩增HPV 45L1序列：HPV45L1F5’-CCACCACCACCTATATAGGTATTC-3’(SEQ ID NO：4)和HPV45L1B5’-CAAACATACATATATGTGCTAACA-3’(SEQ ID NO：5)。使扩增的产物在琼脂糖凝胶上电泳并通过溴化乙啶染色显现。切下～1500bp的L1条带并利用QIA quick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化DNA。然后将DNA连接至TA克隆载体(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，用连接混合物转化大肠杆菌(E.Coli)并且接种在具有氨苄青霉素加IPTG和用于蓝/白色菌落筛选的X-gal的LB琼脂上。反转平板并且在37℃培养16小时。

在来源于已经PCR扩增的4个临床分离物中的每一个的8个白色集落上进行集落PCR。利用引物HPV 45L1F和HPV 45L1B PCR-扩增HPV 45L1DNA。具体的PCR方法包括25个循环的98℃15秒(变性)，50℃30秒(退火)和68℃2分钟(延伸)。琼脂糖凝胶电泳后通过溴化乙啶染色显现PCR产物。来自每个分离物的几个集落包含L1条带。在具有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃摇动16小时培养来自各个分离物的第二集落。进行小提以从集落提取质粒DNA。

对包含来自4个临床分离物的扩增的和克隆的HPV 45L1DNA的质粒进行DNA测序。相互比较DNA和翻译的氨基酸序列以及GenbankHPV 45L1序列。4个临床分离物的序列分析显示没有序列与Genbank序列相同。选择来自33#分离物的HPV 45L1质粒代表45L1野生型(wt)序列并且在此称为″45L1野生型序列″(SEQ ID NO：3，参见图1)。这个序列包含9个核苷酸、3个氨基酸缺失，其保持随后序列的阅读框，5个点突变，其导致5个氨基酸变化，和8个另外的沉默点突变。在45L1wt中缺失了Genbank序列中的第495-497位氨基酸。Genbank氨基酸编号23(S-＞N)、55(N-＞S)、303(I-＞T)、357(S-＞N)、和356(Q-＞H)代表5个氨基酸变化(Genbank aa-＞45L1wt aa)。8个沉默突变分布于整个序列。参见图1。

利用引物LS-1125’-CTCAGATCT

CACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC-3’(SEQ ID NO：6)和HPV45L1EAS5’-GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG-3’(SEQ ID NO：7)扩增45L1野生型序列以加入BglII延伸。利用Vent聚合酶进行PCR。通过琼脂糖凝胶的溴化乙啶染色显现PCR产物。切下～1500bp条带并利用QIAEXII凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化DNA。然后用BglII在37℃消化PCR产物2小时并利用QIA quick PCR纯化试剂盒纯化。将BglII-消化的HPV 45L1PCR产物与BamHI-消化的pGAL110连接(在Hofmann等人，Virology 209：506-18(1995)中描述)并且用连接混合物转化大肠杆菌DH5。

通过PCR筛选以正确方向***HPV 45L1的集落。通过DNA测序证实序列和方向。将所选择的克隆命名为pGAL110-HPV 45L1#6。用PstI、EcoRI和HindIII消化这个克隆以确定pGAL110载体内HPV 45L1基因的限制性内切酶酶切片段图谱。DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳。通过溴化乙啶染色显现所得到的限制性内切酶酶切片段图谱并用UV光观察。

制备大提的DNA。通过用蜗牛酶形成原生质球状体制备啤酒酵母细胞感受态并且用pGAL110-HPV 45L1#6转化。将酵母转化混合物接种到在Leu(-)山梨糖醇平板上的Leu(-)山梨糖醇顶层-琼脂中并且在30℃反转培养5-7天。挑取集落并且在Leu(-)山梨糖醇平板上划线用于克隆分离。随后使分离的集落生长在具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中，于30℃在旋转试管中培养以诱导L1转录和蛋白质表达。

实施例2

酵母密码子优化

已经描述了酵母-偏好的密码子(Sharp，Paul M和Cowe，Elizabeth1991Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7：657-678)。HPV 45L1wt蛋白质的表达是可以检测到的；然而，为了获得为商品开发所需的表达增加，利用酵母-偏好的密码子改造HPV 45L1基因。所述的改造序列将提供增加的HPV45L1表达，其比野生型在疫苗开发的使用中具有显著的进步。当利用酵母-优化的密码子序列改造序列时，在392位改变45L1wt的核苷酸序列以产生45L1R(R＝改造)。然而不改变氨基酸序列。HPV 45L1R的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列显示在图2中。

所采用的基因改造的策略是，设计跨越该基因的长的重叠的正义和反义低聚物，用酵母-偏好的密码子序列取代核苷酸同时保持初始氨基酸序列。这些低聚物用于取代PCR反应中的模板DNA。设计另外的扩增引物并用于从模板低聚物扩增改造序列。将Pfu DNA聚合酶用于25个循环的PCR。

用于扩增的最适条件是部分特异的(section-specific)，然而大多数使用与下面的相似的程序：94℃5分钟(变性)，然后是25个循环的95℃30秒(变性)，55-50℃30秒(退火)，以及72℃1.5分钟(延伸)，然后是72℃7分钟的最终延伸并且保持在4℃。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。切下合适大小的条带并凝胶纯化DNA。然后将扩增片段用作模板以组装1533nt的改造的HPV 45L1基因。

改造后，凝胶纯化1533nt的条带，连接至pCR4Blunt(Invitrogen)并且用该连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞。集落生长在具有氨苄青霉素的4ml LB中并且通过标准的小提技术提取质粒DNA。测序质粒DNA以证实存在45LI改造的所需要的变化。从pCR4Blunt-45L1R再扩增45L1R(改造)以向两头加入BamHI延伸加ATG起始密码子上游的酵母5′-非翻译前导序列。如同上述克隆扩增片段并且测序质粒DNA。用BamHI消化质粒，pCR4Blunt-45L1R(Bam)，并在琼脂糖凝胶上电泳DNA片段。凝胶纯化-1550bp的45L1R(Bam)片段，连接至BamHI-消化的pGAL110并转化入TOP10F′大肠杆菌(Invitrogen)。

通过PCR筛选以正确方向***pGAL110的HPV 45L1的集落。通过DNA测序证实序列和方向。制备大提质粒DNA并用于转化已经通过原生质球状体形成感受态的啤酒酵母细胞。将转化的酵母接种到在Leu(-)山梨糖醇平板上的Leu(-)山梨糖醇顶层-琼脂中，其反转培养7天。将集落在Leu(-)山梨糖醇平板上划线用于克隆分离。随后使分离集落生长在具有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5×Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中，于30℃在旋转试管中培养以诱导L1转录和蛋白质表达。48小时后，使相当于OD600＝10的培养体积沉淀，移出上清液，冷冻沉淀颗粒并保存在-70℃。

实施例3

RNA制备

在冰上融化通过半乳糖诱导表达HPV 45L1的转化酵母的细胞沉淀颗粒，悬浮在0.8ml的Trizol试剂(Life Technologies，Gibco BRL)中并在室温下培养5分钟。向小瓶加入五分之一体积的氯仿。然后用力摇动15秒以混合并在室温下孵育3分钟。以13k rpms离心5分钟后，收集上层相并转入新的小瓶。加入0.4ml异丙醇并在室温下孵育10分钟。以13k rpms离心10分钟沉淀RNA。轻轻倒出上清液，用75％EtOH洗涤RNA沉淀颗粒并重复离心。倒出上清液，容许RNA沉淀颗粒空气干燥15分钟，然后悬浮在无RNase的水中。进行分光光度法以确定样品中RNA的浓度，其中当A260/280是1.7-2.0时，假定A260读数的1＝40μg/ml RNA。

实施例4

Northern印迹分析

浇制1.1％的琼脂糖甲醛凝胶。使5和10微克的RNA与变性缓冲液(终浓度：6％甲醛，50％甲酰胺和0.1×MOPS)结合，并且加热至65℃10分钟。加入十分之一体积的凝胶加样缓冲液并且将样品加载到凝胶上。以75伏在1×MOPS缓冲液中电泳～3小时。在10×SSC中洗涤凝胶60分钟。

通过在10×SSC中毛细管作用超过16小时将RNA转移至Hybond-N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后利用Stratagene UV Stratalinker(Stratagene，La Jolla，CA)自交联功能通过交联将RNA固定到尼龙膜上。固定后，容许尼龙膜空气干燥。

使用Roche DIG High Prime DNA标记和检测试剂盒I(F.Hoffmann-La RocheLtd.，Basel，瑞士)标记45L1R DNA序列，其中将DIG用作探针来检测Northern印迹上的45L1R RNA。利用抗-DIG碱性磷酸酶的共轭抗体按制造商的建议进行预杂交、杂交和免疫显影。简而言之，伴随有温和的摇动在37℃预杂交印迹30分钟。通过加热至95℃5分钟并在冰上淬火使探针变性。将探针加入杂交溶液并在44.6℃伴随有温和的摇动施加到膜上4小时。然后移出杂交溶液并在具有0.1％SDS的2×SSC中在室温下洗涤印迹两次5分钟，然后再用0.5×SSC和0.1％SDS 65℃另外洗涤。然后封闭印迹30分钟，应用1∶5000稀释度的抗-DIG碱性磷酸酶的共轭抗体30分钟。洗涤印迹并且通过碱性磷酸酶共轭的抗-DIG结合抗体的NBT/BCIP底物检测来确定结合探针的RNA的存在。

表达45L1wt的酵母的初始分析表明存在功能性的HPV 45L1转录和翻译；然而，用酵母-偏好的密码子序列改造序列获得增加的表达水平，以用于疫苗开发。设计改造的45L1序列使任何可能的转录提前终止位点缺失以保证强大的转录。45L1R转录物的Northern印迹分析显示产生了全长的转录物(图3)。

实施例5

HPV 45L1蛋白质表达

使半乳糖诱导培养的相当于OD600＝10的冷冻酵母细胞沉淀颗粒在冰上融化，悬浮在具有2mM PMSF的300μl的PC缓冲液(100mMNa₂HPO₄和0.5M NaCl，pH 7.0)中。加入酸洗的0.5mm玻璃珠，～0.5g/试管。涡旋试管3个循环的4℃5分钟，间断1分钟。加入7.5μl的20％TritonX100并在4℃重复涡旋5分钟。将试管置于冰上15分钟，然后在4℃离心10分钟。将上清液转入无菌的微离心试管，标记为总的酵母蛋白质提取物，记录时间并保存在-70℃。

实施例6

Western印迹分析

通过Western印迹分析来自各个45L1构建体的20个分离酵母集落的总酵母蛋白质提取物以证实半乳糖诱导后45L1蛋白质的表达。

使10微克的总酵母蛋白质提取物与SDS-PAGE加样缓冲液结合并且加热至95℃10分钟。将蛋白质加载到10％SDS PAGE凝胶上并且在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳。蛋白质分离后，将蛋白质从凝胶Western转移到硝化纤维素，并且于室温下在1×稀释缓冲液(Kirkegaard和Perry Laboratories)中摇动封闭印迹1小时。洗涤印迹3次，然后用1∶2500稀释度的山羊抗-trpE-HPV 45L1血清在室温下孵育16小时。然后洗涤印迹3次并且用1∶2500稀释度的抗-山羊-HRP共轭抗体孵育1hr。再次洗涤印迹3次并且施加NBT/BCIP检测底物(Kirkegaard andPerry Laboratories)。检测免疫活性的蛋白质为印迹上的紫色条带。

结果表明在所有情况中，45L1蛋白质检测为硝化纤维素上相应于大约57kDa的清晰的免疫活性条带(图4)。包括大约55kDa的16L1蛋白质作为阳性对照，连同无HPVL1的总酵母蛋白质提取物作为阴性对照(数据未显示)。

实施例7

ELISA测定

通过多种方法使表达HPV 45L1的酵母细胞生长，包括旋转试管培养、摇瓶和发酵罐。裂解酵母，制备蛋白质提取物以确定每微克总蛋白生产的HPV 45L1病毒-样颗粒(VLPs)的数量。设计夹层ELISA以证明HPV 45L1VLP的表达。

使用识别HPV类型18和45L1VLPs的H18R.5单克隆抗体(mAb)来结合酵母蛋白质提取物中发现的45L1 VLPs。洗涤除去未结合的蛋白质，使用H45.10B 11.A5，一种HPV 45L1VLP类型和构象特异的mAb作为检测抗体。真正的、构象正确的45L1VLPs被结合，通过利用抗-小鼠IgG1 HRP-共轭抗体和TMB底物帮助检测。

具体地，使用H18R.5涂覆Immulon 4HBX 96孔平板的底部，在4℃过夜。用PBS和0.05％Tween 20洗涤平板3次，然后用封闭溶液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA)封闭。洗涤平板3次，将抗原(在封闭溶液中稀释至100μg/ml的总酵母细胞裂解物)，一式二份施加到第A行。将纯化的HPV 45L1 VLPs的参照标准以100μg/ml总酵母蛋白质中3300ng/ml施加到第1和2列的第A行。然后沿各列依次稀释对照和试验样品两倍。室温下3小时后，通过抽吸除去多余的抗原，洗涤平板3次。将包含HPV 45L1VLP构象特异的mAb H45.l0B 11.A5的细胞上清液在封闭溶液中稀释1∶80，并在室温下施加到各个孔1小时。洗涤平板3次，将在封闭溶液中稀释1∶8000的抗-小鼠IgG1 HRP共轭抗体在室温下施用1小时。洗涤平板，施加TMB(Pierce)5分钟以检测HRP共轭抗体复合物。加入2M H₂SO₄终止检测反应。在450nm波长读取平板，与参照标准相比以ng VLP/μg总蛋白确定HPV 45L1VLP的浓度。

图5显示了45L1wt和45L1R的2个单独克隆之间的比较，所有的测定一式二份。改造的HPV 45L1VLP的表达是45L1wt观察到的结果的大约2倍(图6)。

实施例8

透射电子显微术

为了表明45L1蛋白质实际上自我组装形成随后又自我组装成为病毒-样颗粒的五聚-L1衣壳体，通过透射式电子显微镜分析部分纯化的45L1R蛋白质提取物。

在小规模发酵条件下生长酵母细胞，沉淀，使沉淀颗粒经受纯化处理。通过免疫印迹分析沉淀和澄清的酵母提取物以通过纯化方法证明L1蛋白质表达和存留。然后使澄清的酵母提取物经受45％-蔗糖缓冲层(cushion)离心，通过透射电子显微术(EM)分析悬浮在缓冲液中的所得到沉淀颗粒。

生产的45L1R VLPs的代表样品显示在图6中。这些粗制样品中球状颗粒的直径在40和60nm范围之间，其中一些颗粒显示规则排列的衣壳体。

Claims (9)

1.一种编码HPV45L1蛋白质的核酸分子，其中所述核酸分子的核酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.包括权利要求1的核酸分子的载体。

3.包括权利要求2的载体的宿主细胞。

4.权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

5.权利要求4的宿主细胞，其中宿主细胞是啤酒酵母。

6.包含HPV45的重组L1蛋白质的病毒-样颗粒，其中，所述的重组L1蛋白质是在酵母中表达权利要求1所述的核酸分子产生的。

7.一种生产HPV45病毒样颗粒的方法，包括：

(a)用权利要求1的核酸分子转化酵母细胞；

(b)在容许所述核酸分子表达产生重组***瘤病毒蛋白质的条件下培养所述转化的酵母细胞；以及

(c)分离所述重组的***瘤病毒蛋白质以产生HPV 45病毒-样颗粒。

8.权利要求7的方法，其中所述酵母细胞选自：啤酒酵母、多形汉逊氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳酸克鲁维氏酵母、粟酒裂殖酵母。

9.权利要求8的方法，其中所述酵母细胞是啤酒酵母。

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