CN106282278B - 一种人***瘤病毒l1蛋白的发酵方法 - Google Patents

一种人***瘤病毒l1蛋白的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法。本发明通过使用KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，其中诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料，有效降低了毕赤酵母表达人***瘤病毒L1蛋白过程中目标蛋白的降解。

Description

一种人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及为一种适合人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法。
背景技术
人***瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。***是全球最致命但也是最容易预防的女性癌症类型，HPV感染是罪魁祸首，导致了99％的***病例。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性***和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。
在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此大多数外源蛋白均面临着被降解的问题。另外，HPV疫苗L1蛋白的分子量较大(56KDa)且结构复杂，在表达修饰的过程中容易出现结构不稳定的情况，这加剧了L1蛋白降解的程度。目前，发酵培养过程中HPV L1蛋白的降解是行业难点，通常降解率为40％～60％。降解不仅引起目的蛋白的产率下降，而且其降解形成的片断还能造成分离纯化极大困难。另外，大量的实验表明L1蛋白的降解还对后期病毒样颗粒(VLP)的组装有较大影响。为避免蛋白酶的降解，不同的策略已经得到应用，如蛋白酶缺陷株、添加蛋白酶抑制剂、蛋白胨等。对于HPV疫苗，很难确定引起L1蛋白降解的相关蛋白酶，甚至可能是多种蛋白酶；另外，L1蛋白结构的稳定性也是引起其降解的重要原因。现有方法对于避免HPV疫苗L1蛋白降解的效果不明显。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种能减少人***瘤病毒L1蛋白降解的发酵方法，所述方法使用KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料。
在一些实施方案中，甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料的质量比为1:0.85-3。所述山梨醇溶液为质量浓度为50％的水溶液。
在一些实施方案中，诱导阶段甲醇溶液中含有一定体积的PTM1溶液，优选地，每升甲醇溶液中含12ml PTM1溶液。
在一些实施方案中，诱导阶段的温度控制在25℃-30℃。
在一些实施方案中，发酵时间为60-80h。
在一些实施方案中，诱导阶段的OD600控制在250-350。
在一些实施方案中，发酵时的底物培养基为L-GJY发酵培养基，其组份为：甘油15～25g/L，酵母粉3～7g/L，尿素2～5g/L，CaSO4·2H2O 0.4～0.6g/L，MgSO43～5g/L，KOH 8～10g/L，H3PO48～12ml/L，PTM1溶液2～6ml/L，消泡剂1～3ml/L。在发酵中，底物培养基可以是本发明使用的L-GJY发酵培养基，也可以是本领域常用的BMGY培养基、BSM培养基，其作用是提供必要的营养物质和缓冲环境。
本发明提供的人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法，有效降低了L1蛋白降解的问题，为***疫苗的生产降低了成本，也为使用酵母表达体系表达L1蛋白提供一套行之有效的办法。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在以下实施例中，所用到的培养基组成为：
BMGY种子培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，无氨基酵母氮源(YNB)13.4g/L，甘油20g/L，溶于0.1mol/L(pH 7.0)的磷酸缓冲液中。
L-GJY发酵培养基：甘油15～25g/L，酵母粉3～7g/L，尿素2～5g/L，CaSO4·2H2O0.4～0.6g/L，MgSO43～5g/L，KOH 8～10g/L，H3PO48～12ml/L，PTM1溶液2～6ml/L，消泡剂1～3ml/L。
PTM1溶液：CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.08g/L，MnSO4·H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.02g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，H2SO45ml/L，Biotin 0.2g/L。
实施例1
(1)菌种培养：取2ml KM71/A11-20的甘油保藏液接入含100ml BMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200ml BMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养18h。
(2)接种：向50L发酵罐中注入20L L-GJY发酵培养基，然后按体积比2.5％的接种量接入上述培养好的二级种子液。
(3)发酵：①基础生长阶段：初始转速为100r/min，温度控制在30℃，通气量为1vvm，溶氧控制在50％以上，pH无需控制。②甘油补加阶段：待溶氧反弹至80％时开始以20g/L/h的速率补加甘油溶液(50％，w/v，含12ml/L PTM1溶液)，温度控制在30℃，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30％以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段：当OD600＝250时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80％时开始诱导，以1:0.85的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12ml PTM1溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50％的水溶液。温度控制在25℃，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20％以上，用氨水控制pH在5.0。培养至60h左右时结束。
(4)菌体收集：收集放罐时的发酵样品，经处理后测得L1蛋白的表达量为289mg/L(±5mg/L)，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为8％(±2％)。
实施例2
(1)菌种培养：取2ml KM71/A11-20的甘油保藏液接入含100ml BMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200ml BMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养18h。
(2)接种：向50L发酵罐中注入20L L-GJY发酵培养基，然后按体积比2.5％的接种量接入上述培养好的二级种子液。
(3)发酵：①基础生长阶段：初始转速为100r/min，温度控制在30℃，通气量为1vvm，溶氧控制在50％以上，pH无需控制。②甘油补加阶段：待溶氧反弹至80％时开始以20g/L/h的速率补加甘油溶液(50％，w/v，含12ml/L PTM1溶液)，温度控制在30℃，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30％以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段：当OD600＝350时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80％时开始诱导，以1:3的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12ml PTM1溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50％的水溶液。温度控制在30℃，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20％以上，用氨水控制pH在5.0。培养至80h左右时结束。
(4)菌体收集：收集放罐时的发酵样品，经处理后测得L1蛋白的表达量为295mg/L(±5mg/L)，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为6％(±2％)。
实施例3
(1)菌种培养：取2ml KM71/A11-20的甘油保藏液接入含100ml BMGY种子液培养基的250ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养12h。然后分别取2ml上述培养好种子液转接于三个含200ml BMGY二级种子液培养基的500ml摇瓶中，于30℃、220r/min培养18h。
(2)接种：向50L发酵罐中注入20LL-GJY发酵培养基，然后按体积比2.5％的接种量接入上述培养好的二级种子液。
(3)发酵：①基础生长阶段：初始转速为100r/min，温度控制在30℃，通气量为1vvm，溶氧控制在50％以上，pH无需控制。②甘油补加阶段：待溶氧反弹至80％时开始以20g/L/h的速率补加甘油溶液(50％，w/v，含12ml/L PTM1溶液)，温度控制在30℃，通气量为1.3vvm，溶氧控制在30％以上，用氨水控制pH在5.0左右。③诱导阶段：当OD600＝300时，停止补加甘油，待溶氧反弹至80％时开始诱导，以1:1.2的质量比补加甲醇溶液和山梨醇溶液，其中，每升甲醇溶液中含12ml PTM1溶液，山梨醇溶液为质量浓度为50％的水溶液。温度控制在28℃，通气量为1.5vvm，溶氧控制在20％以上，用氨水控制pH在5.0。培养至70h左右时结束。
(4)菌体收集：收集放罐时的发酵样品，经处理后测得L1蛋白的表达量为310mg/L(±5mg/L)，SDS-PAGE分析并计算出其降解率为5％(±2％)。

Claims (4)

1.一种人***瘤病毒L1蛋白的发酵方法，其特征在于，KM71型毕赤酵母为表达体系，包括基础生长阶段、甘油补加阶段及诱导阶段，其中诱导阶段采用甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料；所述甲醇溶液和山梨醇溶液混合补料的质量比为1:0.85-3；所述诱导阶段的温度控制在25℃-30℃；发酵时间为60-80 h；所述诱导阶段的OD600控制在250-350。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，每升所述甲醇溶液中含12 ml PTM1溶液。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述山梨醇溶液为质量浓度为50%的水溶液。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，发酵时的底物培养基为L-GJY发酵培养基，其组份为：甘油 15~25 g/L，酵母粉 3~7 g/L，尿素 2~5 g/L，CaSO4·2H2O 0.4~0.6g/L，MgSO4 3~5 g/L，KOH 8~10 g/L，H3PO4 8~12 ml/L，PTM1溶液 2~6 ml/L，消泡剂 1~3ml/L。
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