ES2304208B2 - Extractos de planta estimulante del has2. - Google Patents
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Abstract
Extractos de planta estimulante del HAS2.
La invención se relaciona con extractos
vegetales estimuladores de la síntesis de Hialuronano Sintasa, y en
particular la síntesis de Hialuronano Sintasa 2 (HAS2). La invención
se relaciona, en particular, con la utilización de una cantidad
eficaz de al menos un extracto de un vegetal seleccionado entre
Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum
hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo
(Phaseolus aureus), Grosella (Ribes
uva-crispa L.), Brusco (Ruscus
aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Guisante (Pisum
sativum), Altramuz (Lupinus angustifolius), Efedra
(Ephedra sinica), Atanasia (Tanacetum vulgare),
Galanga (Alpinia galanga), Morera (Morus alba),
"Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de
cualquiera de éstos.
La invención tiene como fin, en particular,
aumentar la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los
tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a aumentar
el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la
angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos y/o a mejorar
la cicatrización y/o la proliferación, la migración o la
diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o
destinada a luchar contra los efectos del
envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de
firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las
cicatrices atrofiadas.
Description
Extractos de planta estimulante del HAS2.
La invención se relaciona con composiciones
cosméticas y farmacéuticas que contienen extractos vegetales para
obtener, en particular, un efecto reafirmante de la piel y
especialmente de la dermis, como consecuencia de la estimulación de
la proteína HAS.
La matriz extracelular está constituida por una
red compleja de moléculas variadas de origen proteico o glucídico
responsables del ambiente favorable al buen funcionamiento
celular.
Como consecuencia de sucesos celulares como la
proliferación, la migración o la diferenciación, la matriz
extracelular se modifica y adapta. En la familia de los
polisacáridos, los glicosaminoglicanos (GAG), y entre ellos el
ácido hialurónico (AH), son componentes estructurales clave de esta
matriz extracelular. De pesos moleculares muy altos, estos GAG
poseen numerosas funciones fisiológicas, como la hidratación de los
tejidos, el aumento del efecto barrera cutáneo y la promoción del
poder de recuperación y de la elasticidad de los tejidos gracias a
su capacidad de captación del agua. Además, han sido descritos en
la modulación de la angiogénesis o neocreación de capilares
sanguíneos, de la cicatrización, de la proliferación, de la
migración y de la diferenciación celular por medio de receptores de
membrana, tales como el CD44 y los RHAMM (Receptor for Hyaluronan
Mediated Motility), situados en la superficie de las células (Lesley
J. y col., J. Exp. Med., 175, 257-266 (1992); Peck
D. y col., Journal of Cell Science, 111, 1595-1601
(1998); Assmann V. y col., Journal of Cell Science, 111,
1685-1694 (1998)).
Además, la presencia del ácido hialurónico en
la interfase dermis-epidermis permitiría facilitar
los intercambios metabólicos entre los dos tejidos. Finalmente, el
ácido hialurónico permite también asociaciones con otras moléculas,
como el versicano, el fibrinógeno y los colágenos de tipo I y VI
(Mc Devitt y col., FEBS Lett., 3, 294, 167-170
(1991); Le Baron y col., J. Biol. Chem., 14, 267,
10003-10010 (1992)).
Más estudiado que los otros GAG, el ácido
hialurónico se presenta como un polisacárido lineal compuesto de
unidades disacarídicas repetitivas: ácido
N-acetil-D-glucosamina-\beta(1\rightarrow4)-D-glucurónico
\beta(1\rightarrow3); se sintetiza en el lado interno de
la membrana plasmática por adiciones sucesivas de
UDP-N-acetilglucosamina y ácido
UDP-D-glucurónico combinadas por
uniones \beta(1\rightarrow4) y
\beta(1\rightarrow3) y se segrega después directamente al
espacio extracelular (Weigel y col., J. Biol. Chem., 272,
13997-14000 (1997)). Esta síntesis es realizada por
enzimas de membrana monoméricas llamadas Hialuronano Sintasas
(HAS), identificadas bajo tres isoformas en vertebrados: HAS1,
HAS2 y HAS3 (Weigel y col., J. Biol. Chem., 272,
13997-14000 (1997)), transcritas a partir de 3 genes
distintos localizados en diferentes cromosomas. Más en particular,
el gen codificante de la proteína HAS2 se sitúa en el cromosoma 8 y
es sensible a la presencia de diferentes factores de crecimiento,
como PDGF-BB, TGF-\beta1, EGF o
también FGF y KGF.
Los GAG se encuentran en aproximadamente todos
los tejidos y sus cantidades en la matriz extracelular se modifican
mucho en ciertas condiciones, como la atrofia cutánea, la edad, las
cicatrices atrofiadas y probablemente la osteoporosis. La piel, y
más particularmente la dermis, contiene aproximadamente un 50% de la
cantidad total de ácido hialurónico presente en el organismo
(Laurent y col., FASEB J., 6, 2397-2404 (1992)) y
estudios han mostrado una fuerte relación
causa-efecto de la edad, con una ausencia total de
ácido hialurónico sintetizado a partir de los 60 años (Ghersetich y
col., Int. J. Dermatol., 33, 119-122 (1994)). Este
ácido hialurónico es sintetizado por las HAS de los fibroblastos de
la dermis.
A nivel de la epidermis, el ácido hialurónico
es sintetizado por las HAS de los queratinocitos y juega un papel
en la migración, la proliferación y la diferenciación de éstos. La
disminución de ácido hialurónico conlleva un afinamiento de la
epidermis atribuible a la aceleración de la diferenciación terminal
de los queratinocitos.
Para aplicaciones cosméticas o
dermofarmacéuticas, se ha estudiado un cierto número de compuestos
por sus capacidades para estimular, en queratinocitos, la
producción de glicosaminoglicanos en general y de ácido hialurónico
en particular.
Después de haber demostrado que HAS2 era
inducible por diferentes substancias, tales como TNF alfa,
Interferon gamma e Interleukina 1 beta (Ijuin y col., 2001, Arch.
Oral Biol., 46(8): 767-72), diferentes
equipos intentaron estimular la producción de HAS2 con substancias
tales como el ácido retinoico en un modelo de queratinocitos en
cultivo con el fin de evaluar los efectos sobre la calidad y la
estructura de la epidermis de pieles de voluntarios sanos así
tratados. La conclusión de estos estudios es que todas las
citokinas proinflamatorias estimulan la producción de HAS2 y, por lo
tanto, de hialuronano en las células en cultivo (Jacobson A.,
Brinck J., Briskin M.J., Spicer A.P. y Heldin P., 2000, Expression
of human hyaluronan synthases in response to external stimuli,
Biochem. J., 348(Pt 1): 29-35). Al igual que
substancias tales como el ácido retinoico, recientemente se ha
descrito la substancia K (ó
20-O-betaD-glucopiranosil-20-S-protopanaxadiol)
del ginseng como capaz de estimular la síntesis de HAS2 en células
HaCat de tipo queratinocitos transformadas o en fibroblastos
humanos en cultivo (Kim y col., IFSCC Magazine 7(3),
189-196 (2004)).
La invención tiene como fin principal resolver
el problema técnico consistente en disponer de compuestos extraídos
de vegetales utilizables por vía tópica sobre la piel y
especialmente utilizables en composiciones cosméticas o
dermofarmacéuticas, es decir, que no presenten significativamente
reacción inflamatoria a nivel de la piel, pero que sean capaces de
aumentar la firmeza de la piel.
En particular, la invención tiene por objeto
proporcionar compuestos utilizables por vía tópica que permitan
estimular la expresión y/o la actividad de HAS2 con el fin de
aumentar la cantidad de glicosaminoglicanos y de ácido hialurónico
en la piel, en particular en la dermis, y de aumentar así la
firmeza de la piel.
La invención tiene especialmente como fin
proporcionar compuestos antes mencionados para mejorar a nivel
cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los
tejidos y/o aumentar el efecto de barrera cutánea y/o aumentar el
poder de recuperación de los tejidos y/o modular la angiogénesis o
la neocreación de capilares sanguíneos y/o mejorar la cicatrización,
la proliferación, la migración o la diferenciación celular.
En particular, la invención tiene por objeto
proporcionar compuestos antes mencionados para luchar contra la
atrofia cutánea, en particular contra la atrofia de la dermis, los
efectos del envejecimiento sobre la piel, las cicatrices atrofiadas
o la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del
envejecimiento.
Así, la presente invención describe, según un
primer aspecto, la utilización de una cantidad eficaz de al menos
un extracto vegetal como principio activo estimulador de la
expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa, y en
particular estimulador de la expresión y/o la actividad de la
hialuronano sintasa 2 (HAS2), en una composición cosmética.
La invención describe, según un segundo aspecto,
la utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto
vegetal como principio activo estimulador de la expresión y/o la
actividad de la hialuronano sintasa, y en particular estimulador de
la expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa 2 (HAS2),
para la fabricación de una composición farmacéutica, y en particular
dermofarmacéutica.
Los inventores entienden por "estimulador de
la expresión de la hialuronano sintasa (HAS, en particular de
HAS2)", en particular, la estimulación de la síntesis de
hialuronano sintasa (HAS, en particular HAS2).
En particular, los principios activos según la
presente invención permiten obtener una estimulación de la
expresión del gen codificante de la proteína HAS2 en los
fibroblastos, en particular en los fibroblastos humanos y
especialmente a nivel de los tejidos cutáneos humanos, tales como
la dermis.
Ventajosamente, los principios activos permiten
aumentar la firmeza y/o elasticidad de los tejidos cutáneos, en
particular de la dermis.
Ventajosamente, los principios activos permiten
aumentar la producción y/o la cantidad de glicosaminoglicanos en
general y de ácido hialurónico en particular, especialmente a nivel
dérmico.
Ventajosamente, los principios activos según la
presente invención no inducen sensiblemente reacción inflamatoria a
nivel cutáneo y son, pues, compatibles con aplicaciones cosméticas
o dermofarmacéuticas.
Ventajosamente, la composición está destinada a
mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la
hidratación de los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera
cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a
modular la angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos
y/o a aumentar la cicatrización y/o la proliferación, la migración o
la diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o destinada a
luchar contra los efectos del envejecimiento sobre la piel, y en
particular contra la pérdida de firmeza cutánea observada en el
curso del envejecimiento, y/o las cicatrices atrofiadas y/o la
atrofia de los tejidos cutáneos observada en el curso del
envejecimiento, en particular contra la atrofia de la dermis.
Ventajosamente, los compuestos según la presente
invención son utilizados para luchar contra el afinamiento de los
tejidos cutáneos y en particular de la piel.
Ventajosamente, los compuestos utilizados según
la presente invención son extraídos de vegetales. En particular, el
principio activo es un extracto de un vegetal seleccionado entre
Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum
hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo
(Phaseolus aureus), Grosella (Ribes
uva-crispa L.), Brusco (Ruscus
aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Guisante (Pisum
sativum), Altramuz (Lupinus angustifolius), Efedra
(Ephedra sinica), Atanasia (Tanacetum vulgare),
Galanga (Alpinia galanga), Morera (Morus alba),
"Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de
cualquiera de éstos.
Preferiblemente, el principio activo es un
extracto vegetal seleccionado entre un extracto de morera (Morus
alba), un extracto de efedra (Ephedra sinica), un
extracto de guaraná (Paullinia cupana), un extracto de
atanasia (Tanacetum vulgare), un extracto de galanga
(Alpinia galanga), un extracto de "brazzéine"
(Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla cualquiera de
éstos.
Ventajosamente, los compuestos según la presente
invención son utilizados para aumentar la firmeza y/o la
elasticidad de los tejidos cutáneos, en particular de la
dermis.
Se utiliza ventajosamente un solvente polar o
una mezcla de solventes polares para obtener dicho extracto. Entre
los solventes habituales de extracción, se puede utilizar un
solvente prótico seleccionado entre el grupo consistente en: agua,
metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, ciclohexanol,
dietilenglicol, HO-(CH_{2})_{2}-OH y una
de sus mezclas. También se puede utilizar un solvente aprótico
polar, especialmente seleccionado entre el grupo consistente en:
piridina, butanona, acetona, Ac_{2}O, (Me_{2}N)_{2}CO,
PhCN, CH_{3}CH_{2}CN, HMPA, PhNO_{2}, MeNO_{2}, DMF, MeCN,
sulfolano, DMSO, HCONH_{2}, HCONHMe, CH_{3}CONHMe y una de sus
mezclas. Se utiliza preferiblemente agua, un alcohol como etanol,
propanol, isopropanol o butanol, un poliol, tal como butilenglicol,
o un éster, como el acetato de etilo, o una mezcla de estos
solventes. Las proporciones de las mezclas de los solventes antes
mencionados varían generalmente entre 1:1 y 1:100 y preferiblemente
entre 1:1 y 1:10; se utiliza, por ejemplo, una mezcla 25/75.
Se puede efectuar la extracción con agitación
y/o calentamiento, como, por ejemplo, a entre 30 y 60ºC, o a
reflujo del solvente utilizado. Se hace la extracción habitualmente
a presión atmosférica, pero se puede utilizar una extracción bajo
presión. El tiempo de extracción es apreciado por el experto en la
técnica y depende especialmente de las condiciones de
extracción.
Ventajosamente, se procede a varias
extracciones. Se pueden reunir especialmente las fracciones
obtenidas si se desea.
Ventajosamente, los extractos obtenidos son
filtrados y luego eventualmente concentrados y/o evaporados hasta
obtener la calidad de productos secos deseada.
Los compuestos según la presente invención son
preparados en forma de composiciones tópicas, especialmente de
composiciones cosméticas, dermofarmacéuticas o farmacéuticas. Por
ello, para estas composiciones, el excipiente contiene, por
ejemplo, al menos un compuesto seleccionado entre el grupo
consistente en conservantes, emolientes, emulsores, tensioactivos,
hidratantes, espesantes, acondicionadores, agentes matificantes,
estabilizadores, antioxidantes, agentes de textura, agentes de
brillo, agentes filmógenos, solubilizantes, pigmentos, colorantes,
perfumes y filtros solares. Estos excipientes son preferiblemente
seleccionados entre el grupo consistente en aminoácidos y sus
derivados, poligliceroles, ésteres, polímeros y derivados de
celulosa, derivados de lanolina, fosfolípidos, lactoferrinas,
lactoperoxidasas, estabilizadores a base de sacarosa, vitaminas E y
sus derivados, ceras naturales y sintéticas, aceites vegetales,
triglicéridos, insaponificables, fitosteroles, ésteres vegetales,
siliconas y sus derivados, hidrolizados de proteínas, aceite de
jojoba y sus derivados, ésteres Tipo/hidrosolubles, betaínas,
aminóxidos, extractos de plantas, ésteres de sacarosa, dióxidos de
titanio, glicinas y parabenes, y también preferiblemente entre el
grupo consistente en butilenglicol, esteareth-2,
esteareth-21, glicol-15 estearil
éter, alcohol cetearílico, fenoxietanol, metilparabén, etilparabén,
propilparabén, butilparabén, butilenglicol, tocoferoles naturales,
glicerina, éter isopropilhidroxicetílico de dihidroxicetilo sodio,
estearato de glicol, triisononaoína, cocoato de octilo,
poliacrilamida, isoparafina, laureth-7, un
carbómero, propilenglicol, glicerol, bisabolol, una dimeticona,
hidróxido de sodio, dipolihidroxiestearato de PEG 30, triglicéridos
cáprico/caprílico, octanoato de cetearilo, adipato de dibutilo,
aceite de pepita de uva, aceite de jojoba, sulfato de magnesio,
EDTA, una ciclometicona, goma xantano, ácido cítrico, laurilsulfato
de sodio, ceras y aceites minerales, isoestearato de isoestearilo,
dipelargonato de propilenglicol, isoestearato de propilenglicol, PEG
8 Cera de abejas, glicéridos del aceite de corazón de palma
hidrogenado, glicéridos de aceite de palma hidrogenado, aceite de
lanolina, aceite de sésamo, lactato de cetilo, alcohol de lanolina,
aceite de ricino, dióxido de titanio, lactosa, sacarosa, polietileno
de baja densidad o una solución isotónica salada.
Ventajosamente, las composiciones antes citadas
son formuladas en una forma seleccionada entre el grupo consistente
en una solución, acuosa u oleosa; una crema o un gel acuoso o un
gel oleoso, especialmente en tarro o en tubo, especialmente un gel
de ducha; un champú; una leche; una emulsión, una microemulsión o
una nanoemulsión, especialmente de
aceite-en-agua o de
agua-en-aceite o múltiple o
siliconada; una loción, especialmente en frasco de vidrio o de
plástico o en frasco dosificador o en aerosol; una ampolla; un
suero; un jabón líquido; un pan dermatológico; una pomada, una
espuma; un producto anhidro, preferentemente líquido, pastoso o
sólido, por ejemplo en forma de bastoncillo, especialmente en forma
de rojo de labios.
Las cantidades de dicho principio activo
habitualmente utilizadas varían entre el 0,001% y el 20% en peso de
la composición total, preferiblemente entre el 0,001% y el 10% en
peso, y se utiliza aún más preferiblemente entre un 0,01% y un 10%
en peso de la composición total.
Se pueden combinar eventualmente los compuestos
antes descritos con otro principio activo para obtener un mejor
efecto.
La invención se relaciona, según otro aspecto,
con un procedimiento de cuidados cosméticos que consiste en la
utilización de las composiciones antes mencionadas.
\newpage
La invención se relaciona, según otro aspecto,
con un procedimiento de tratamiento farmacéutico, en particular de
tratamiento dermofarmacéutico, que consiste en la utilización de
las composiciones antes mencionadas y que consiste especialmente en
la administración de una cantidad eficaz de al menos un principio
activo antes mencionado a un sujeto que tenga necesidad de
ello.
La aplicación mencionada anteriormente puede
ser efectuada en una o varias veces al día, especialmente por
aplicación tópica.
En cuanto a las figuras:
- La figura 1 representa la estimulación de
HAS2 por un extracto de morera.
- La figura 2 representa la estimulación de
HAS2 por un extracto de efedra.
- La figura 3 representa la estimulación de
HAS2 por un extracto de guaraná.
- La figura 4 representa la estimulación de
HAS2 por un extracto de atanasia.
- La figura 5 representa la estimulación de
HAS2 por un extracto de galanga.
- La figura 6 representa la evolución de la
firmeza de la piel después de un mes de utilización de una crema
que contiene un extracto de galanga y un extracto de atanasia.
- La figura 7 representa la evolución de la
firmeza de la piel después de un mes de utilización de un suero que
contiene un extracto de galanga y un extracto de atanasia.
Otros fines, características y ventajas de la
invención se le aparecerán claramente al experto en la técnica tras
la lectura de la descripción explicativa que hace referencia a
ejemplos que son dados solamente a titulo ilustrativo y que no
sabrían en modo alguno limitar el alcance de la invención.
Los ejemplos forman parte integrante de la
presente invención y cualquier característica que aparezca como
nueva con respecto a un estado de la técnica anterior cualquiera a
partir de la descripción tomada en su conjunto, incluyendo los
ejemplos, forma parte integrante de la invención en su función y en
su generalidad.
Así, cada ejemplo tiene un alcance general.
Por otra parte, en los ejemplos, todos los
porcentajes son dados en peso, salvo indicación en contrario, y la
temperatura es expresada en grados Celsius, salvo indicación en
contrario, y la presión es la presión atmosférica, salvo indicación
en contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
A) Se obtienen los fibroblastos humanos normales
tras extracción con colagenasa a partir de biopsias abdominales
procedentes de resección quirúrgica.
Se amplifican los fibroblastos en Medio de
Cultivo de Fibroblastos ("FCM"), compuesto por Medio de Eagle
Modificado de Dulbecco ("DMEM" glutamina estabilizado,
Invitrogen) suplementado con un 10% de suero de ternera (Hyclone),
25 mg/l de gentamicina, 100.000 UI/l de penicilina, 1 mg/l de
anfotericina B y 50 mg/l de ascorbato de sodio (Sigma). Se
distribuyen 1,5 ml de FCM por pocillos y se realiza el cultivo a
37ºC bajo un 5% de CO_{2}. Se renueva el medio tres veces por
semana. Se siembran entonces los fibroblastos a 10.000 células por
cm^{2} en placas de 24 pocillos bajo 1 ml de Medio Basal de
Fibroblastos (Promocell) y se amplifican hasta la confluencia.
B) Se diluyen los principios activos (estudiados
por el método de cribado a una concentración del 1%) en el medio de
cultivo sin antibióticos, antimicóticos y factores de crecimiento.
Se realiza la detección de la expresión del gen por
RT-PCR a tiempo real midiendo la expresión de cada
gen con respecto a la actina (housekeeping gene) y expresándola en %
del control negativo no tratado. Se añaden 10 \mul de ARN totales
a 5 ng/\mul a 40 \mul de mezcla de PCR (compuesta por 25 \mul
de SYBR Green Buffer Mix 2X, 0,5 \mul de mezcla enzimática,
0,5 \muM final de cebador sentido y 0,5 \muM final de cebador
antisentido, agua csp 40 \mul). La RT-PCR se
desarrolla en diferentes etapas, entre ellas retrotranscripción a
50ºC, 30 min., activación de la polimerasa a 95ºC, 15 min.,
realización de los ciclos de PCR (95ºC, 15 s; temperatura de
hibridación específica para cada gen/30 s; 72ºC/30 s) x 50 ciclos.
Los oligonucleótidos sentido y antisentido son, respectivamente,
CGAGTTTACTTCCCGCCAAGA y CTTCCGCCTGCCACACTTATTGAT y la temperatura de
hibridación es de 56ºC.
Sobre el conjunto de los productos evaluados,
los productos siguientes dan resultados satisfactorios, ya que
estimulan la producción de ARNm codificante de HAS2. Estos
productos pueden ser, pues, utilizados en cosmética para estimular
la síntesis de HAS2 en la dermis e inducir una firmeza cutánea.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefiere así realizar una extracción
preferiblemente con un solvente polar o una mezcla de solventes
polares, eventualmente a reflujo, preferiblemente de la parte de la
planta mencionada en la tabla 1. Una vez realizada la extracción,
se filtra la solución y se resolubiliza eventualmente en un
solvente polar o una mezcla de solventes polares.
Previamente a la extracción, se puede
ventajosamente realizar la trituración de la o de las partes de la
planta utilizada.
Es ventajoso obtener un extracto de los
vegetales utilizados como materia prima a partir de un solvente
preferiblemente polar y preferiblemente agua, una mezcla de
agua/alcohol o poliol, como una mezcla de agua/glicol o de
agua/etanol, o un poliol, o un alcohol como el etanol. El extracto
es preferiblemente filtrado y luego secado. Es igualmente posible
efectuar la extracción con un calentamiento moderado, como, por
ejemplo, a 45ºC o a reflujo. Se efectúa la extracción
preferiblemente bajo agitación. Los procedimientos de extracciones
son bien conocidos por el experto en la técnica. La parte de los
vegetales utilizada puede variar en función del extracto que se ha
de obtener.
Preferiblemente, se realiza un extracto a
partir de una parte de la planta cortada al 10% (p/p) en agua, o en
etanol, eventualmente a reflujo. Se realiza la extracción durante 1
hora y luego se filtra la solución, se elimina el etanol y se
solubiliza el producto obtenido al 5% (p/p) en una mezcla de
agua/glicol y se ultrafiltra después sobre filtro cerámico a
diferentes umbrales de corte y finalmente se filtra a 0,45 \mum.
También se puede utilizar como solvente el etanol, el acetato de
etilo, el DMSO, la acetona o una mezcla de un 75% de agua y un 25%
de butilenglicol, en lugar de agua. Los tipos de extracciones
preferidos son los indicados en la tabla 1.
Se realizan cultivos de fibroblastos como se
indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades
crecientes del extracto seleccionado. Tras la extracción de los
ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2
utilizando la Q-RT-PCR tal como se
ha descrito en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de
activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado
como control del estudio, y se presentan en la Figura 1. Se constata
un efecto-dosis significativo de este principio
activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente
específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una
estimulación de más del 900% del ARNm de HAS2, lo que representa un
resultado muy positivo y muy significativo.
Se realizan cultivos de fibroblastos como se
indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades
crecientes del extracto seleccionado (extracto de efedra). Tras la
extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm
codificante de HAS2 utilizando la
Q-RT-PCR tal como se ha descrito en
el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en
función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del
estudio, y se presentan en la Figura 2. Se constata un
efecto-dosis significativo de este principio activo,
lo que significa que su actividad debe ser relativamente
específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una
estimulación del 155% del ARNm de HAS2, lo que representa un
resultado muy positivo.
Se realizan cultivos de fibroblastos como se
indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades
crecientes del extracto seleccionado (extracto de guaraná).
Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm
codificante de HAS2 utilizando la
Q-RT-PCR tal como se describe en el
ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en
función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del
estudio, y se presentan en la Figura 3. Se constata un
efecto-dosis significativo de este principio activo,
lo que significa que su actividad debe ser relativamente
específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una
estimulación del 500% del ARNm de HAS2, lo que representa un
resultado muy positivo.
Se realizan cultivos de fibroblastos como se
indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades
crecientes del extracto seleccionado (extracto de atanasia).
Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm
codificante de HAS2 utilizando la
Q-RT-PCR tal como se describe en el
ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en
función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del
estudio, y se presentan en la Figura 4. Se constata un
efecto-dosis significativo de este principio activo,
lo que significa que su actividad debe ser relativamente
específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una
estimulación del 260% del ARNm de HAS2, lo que repre senta un
resultado muy positivo.
Se realizan cultivos de fibroblastos como se
indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades
crecientes del extracto seleccionado (extracto de galanga).
Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm
codificante de HAS2 utilizando la
Q-RT-PCR tal como se describe en el
ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en
función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del
estudio, y se presentan en la Figura 5. Se constata un
efecto-dosis significativo de este principio activo,
lo que significa que su actividad debe ser relativamente
específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una
estimulación del 180% del ARNm de HAS2, lo que representa un
resultado muy positivo.
Se evalúan los productos de la invención
Extracto de Pentadiplandra brazzeana (JVEG 060A), Extracto
de Galanga (JVEG 203A), Extracto de Atanasia (JVEG 681A) y Extracto
de Morera (JVEG 022A) en cuanto a su capacidad para estimular la
neosíntesis de glicosaminoglicanos (GAG, especialmente el ácido
hialurónico). Los modelos biológicos seleccionados son el
equivalente de dermis (DE, mallas libres de colágeno retractado que
contienen fibroblastos) y el cultivo de fibroblastos dérmicos
humanos normales en cultivo en monocapa (NHDF).
Se realizó la evaluación de estos efectos
cuantificando la incorporación de glucosamina tritiada a la
fracción GAG neosintetizada por los fibroblastos de los modelos
seleccionados. La incorporación de glucosamina a la fracción GAG
purificada rinde cuentas de la neosíntesis de la mayor parte de los
GAG, incluyendo el ácido hialurónico (mayoritario). Se realizó el
análisis por separado sobre las fracciones segregadas/solubles (GAG
segregados) y sobre las fracciones integradas en los DE (GAG
almacenados en la matriz) o sobre el conjunto de un cultivo de
fibroblastos (NHDF).
Se prepararon los equivalentes de dermis, se
pusieron luego en medio DMEM (Invitrogen) al 2% de SVF y se
pusieron a retractarse durante 7 días con cambio de medio cada 3
días. Se incubaron los DE entonces en ausencia (control) o en
presencia de los compuestos de ensayo o del compuesto de referencia
(TGF beta, 10 ng/ml) durante 48 horas ó 72 horas a 37ºC y un 5% de
CO_{2}, con adición de glucosamina tritiada 24 horas antes del
final de la incubación. Se realizó cada condición por
triplicado.
Se sembraron los fibroblastos dérmicos normales
humanos en medio DMEM completo y se preincubaron durante 24 horas a
37ºC y un 5% de CO_{2} y se reemplazó luego el medio de cultivo
por medio DMEM con un 2% de suero que contenía o no (control) los
compuestos de ensayo o el producto de referencia (TGF beta, 10
ng/ml). Se realizó cada condición experimental por triplicado.
Se incubaron entonces las células a 37ºC durante
72 horas con adición de glucosamina tritiada 24 horas antes del
final de la incubación.
Veinticuatro horas antes de finalizar la
incubación, se añade glucosamina tritiada
(D-[6-^{3}H]-glucosamina, 1,37
Tbq/mmol, 37 Ci/mmol, 33 \muCi/ml) al cultivo. Se realiza la
extracción de los glicosaminoglicanos sobre los mismos sobrenadantes
de cultivo de los DE (fracción segregada/soluble), en el propio
seno de los DE por trituración (fracción extraída) o en el seno del
cultivo de fibroblastos, con ayuda de un tampón caotrópico
(Tris/HCl 50 mM, guanidina 4 M, EDTA 5 mM, pH 8,0). Se realiza la
purificación por cromatografía de intercambio de iones: adsorción
de las moléculas aniónicas sobre perlas de
Q-Sepharose en condiciones altamente estrictas,
desorción de las moléculas poco y medianamente aniónicas con urea 6
M más NaCl 0,2 M y lavados. Se realiza el recuento de la
radiactividad incorporada a las moléculas muy catiónicas que
permanecen sobre el soporte (mayoritariamente GAG, eluidas con NaCl
2 M) por centelleo líquido. Se expresan los resultados en porcentaje
de variación de la síntesis de los glicosaminoglicanos con respecto
al control. Se realizaron las comparaciones entre grupos por
análisis de varianza (ANOVA) con ayuda de la prueba de comparación
múltiple de Dunnett.
El producto de referencia TGF beta (10 ng/ml)
estimuló fuertemente la incorporación de glucosamina a la fracción
GAG (estimulación en un factor 4 con respecto al control). Este
resultado valida el ensayo.
En las condiciones experimentales de este
ensayo, el extracto de galanga (JVEG203A) y el extracto de atanasia
(JVEG681A), estudiados al 1%, estimularon la incorporación de
glucosamina a la fracción de GAG sintetizados por los fibroblastos
(respectivamente, 154% y 143% del control no tratado,
p<0,01).
\vskip1.000000\baselineskip
Incorporación de glucosamina -
fibroblastos
- \quad
- Sd: tipo de desviación; n: número de ensayos;
- \quad
- Cpm: número de desintegraciones por minuto (golpes por minuto);
- \quad
- p: significación evaluada por prueba estadística.
El producto de referencia TGF beta estimuló
fuertemente la incorporación de glucosamina a la fracción GAG
soluble y segregada de los equivalentes dérmicos (estimulación en un
factor de 3 con respecto al control). Este resultado valida el
ensayo.
En las condiciones experimentales de este
ensayo, los productos extracto de atanasia (JVEG681A) y extracto de
morera (JVEG022A), estudiados al 1%, estimularon significativamente
la incorporación de glucosamina a la fracción soluble y segregada
de los equivalentes dérmicos (respectivamente, 210%, p<0,01 y
149%, p<0,05). El extracto de galanga (JVEG203A) permitió
igualmente aumentar la incorporación de glucosamina a la fracción
GAG soluble de los DE (140% del control).
El TGF beta estimuló la incorporación de
glucosamina a la fracción GAG extraída de los equivalentes
dérmicos, pero de forma más moderada que en la fracción soluble
(estimulación en un factor de 1,6 con respecto al control). Este
resultado valida el ensayo.
En las condiciones experimentales de este
ensayo, el producto extracto de atanasia (JVEG681A), estudiado al
1%, estimuló significativamente la incorporación de glucosamina a
la fracción extraída de los equivalentes dérmicos (150% del
control, p<0,01). Como para el TGF beta, esta estimulación es más
débil que en la fracción soluble.
\vskip1.000000\baselineskip
Incorporación de glucosamina -
DE/fracción
soluble
\vskip1.000000\baselineskip
Incorporación de glucosamina -
DE/fracción
extraída
\newpage
Esta prueba tiene por objeto evaluar los
efectos de los productos de la invención sobre la firmeza y la
elasticidad 30 minutos después de una aplicación aislada, así como
después de 1 mes de utilización bicotidiana. Se evalúan los efectos
sobre las propiedades biomecánicas de la piel con ayuda del
balistómetro, técnica que se basa en el registro dinámico del
rebote de un objeto pesado sobre la superficie de la piel.
Se traducen entonces los rebotes inducidos,
registrados durante 3 segundos, en señales eléctricas que pueden
ser cuantificadas y evaluadas en términos de amplitud.
Los parámetros medidos son:
- -
- La indentación (penetración de la sonda en la piel por el primer impacto), que mide la firmeza de la piel: si la indentación disminuye, hay reafirmamiento.
- -
- El área bajo la curva mide la energía restituida. Esta última resulta afectada a la vez por la elasticidad y por la firmeza de la piel: una disminución del área corresponde a un reafirmamiento.
- -
- Alfa, la razón de amortiguación de los rebotes, que indica la velocidad a la cual desaparecen los rebotes, ligada a la elasticidad: si alfa aumenta, la elasticidad disminuye.
Se evaluaron dos formulaciones (una crema y un
suero) por aplicación bicotidiana sobre el conjunto de la cara
durante un mes, en condiciones normales de utilización, siendo
estudiada cada formulación sobre 20 voluntarios de sexo femenino de
45 a 75 años de edad. La crema era una emulsión Ac/Ag que contenía
un 1% de extracto de galanga y un 1% de extracto de atanasia y el
suero era un gel emulsionado que contenía un 1,5% de extracto de
galanga y un 1,5% de extracto de atanasia.
El análisis de las propiedades biomecánicas de
la piel mostró, como media sobre el conjunto de los voluntarios,
después de un mes de utilización bicotidiana de la crema o del
suero, una disminución significativa de la indentación (penetración
de la sonda en la piel por el primer impacto) del 12% y del 7%,
respectivamente. Esta observación pone en evidencia una mejora
significativa de la firmeza de la piel tras aplicación tópica de
los productos de la invención. Con más precisión, para la crema,
se constata:
- \bullet
- una mejora de la indentación, medida en el 86% de los voluntarios, mejora del 16% en estos últimos (valor máximo: -37%);
- \bullet
- el coeficiente alfa aumenta significativamente en un 62% y el área bajo la curva disminuye significativamente en un 32%: estos dos parámetros están ligados a la indentación y confirman, pues, el efecto reafirmante.
Después de un mes de utilización bicotidiana de
la crema, la piel se reafirma significativamente en un 12%, como se
ilustra en la Figura 6.
Con más precisión, para el suero, se
constata:
- \bullet
- una mejora de la indentación, medida en un 71% de los voluntarios, mejora del 13% en estos últimos (valor máximo: -31%);
- \bullet
- el coeficiente alfa aumenta significativamente en un 8% y el área bajo la curva disminuye significativamente en un 18%, confirmando igualmente un reafirmamiento de la piel.
Después de un mes de utilización bicotidiana
del suero, la piel se reafirma significativamente en un 7%, como se
ilustra en la Figura 7.
Contrariamente al ácido retinoico, al TNF alfa y
a la IL1, las moléculas seleccionadas para estimular la síntesis de
HAS2 no pasan por un mecanismo proinflamatorio, incompatible con
aplicaciones cosméticas.
Así, la utilización de un extracto de galanga
en las condiciones del ejemplo 6 sobre cultivos de fibroblastos
permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre
sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 h después del contacto)
la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por estimular
HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo del ejemplo
6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Así, la utilización de un extracto de atanasia
en las condiciones del ejemplo 5 sobre cultivos de fibroblastos
permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre
sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 horas después del
contacto) la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por
estimular HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo
del ejemplo 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Así, la utilización de une extracto de altramuz
en las condiciones del ejemplo 1 sobre cultivos de fibroblastos
permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre
sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 horas después del
contacto) la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por
estimular HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo de
los ejemplos 1 a 7).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
a
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
b
Formulación
c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Utilización de una cantidad eficaz de al
menos un extracto vegetal como principio activo en una composición
cosmética destinada a estimular la expresión y/o la actividad de la
Hialuronano Sintasa, y en particular la expresión y/o la actividad
de la Hialuronano Sintasa 2 (HAS2), siendo dicho principio activo
un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia
cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú
(Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus),
Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina),
Altramuz (Lupinus angustifolius), Atanasia (Tanacetum
vulgare), Galanga (Alpinia galanga), "Brazzéine"
(Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de
éstos.
2. Utilización de una cantidad eficaz de al
menos un extracto vegetal como principio activo en una composición
dermofarmacéutica destinada a estimular la expresión y/o la
actividad de la Hialuronano Sintasa, y en particular la expresión
y/o la actividad de la Hialuronano Sintasa 2 (HAS2), siendo dicho
principio activo un extracto de un vegetal seleccionado entre
Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum
hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo
(Phaseolus aureus), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba
(Vicia faba equina), Altramuz (Lupinus
angustifolius), Atanasia (Tanacetum vulgare), Galanga
(Alpinia galanga), "Brazzéine" (Pentadiplandra
brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada por ser el principio activo un extracto vegetal
seleccionado entre un extracto de guaraná (Paullinia
cupana), un extracto de atanasia (Tanacetum vulgare),
un extracto de galanga (Alpinia galanga), un extracto de
"brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla
cualquiera de éstos.
4. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada por estar
destinada la composición a mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o
la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o a aumentar el
efecto de barrera cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación
de los tejidos y/o a modular la angiogénesis o la neocreación de
capilares sanguíneos y/o a mejorar la cicatrización y/o la
proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o la
atrofia cutánea, y/o destinada a luchar contra los efectos del
envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de
firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las
cicatrices atrofiadas y/o la atrofia de los tejidos cutáneos
observada en el curso del envejecimiento, y en particular contra la
atrofia de la dermis.
5. Utilización de una cantidad eficaz de al
menos un extracto vegetal como principio activo para obtener una
composición cosmética o dermofarmacéutica destinada a mejorar a
nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de
los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a
aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la
angiogénesis o la neocreación de
capilares-sanguíneos y/o a mejorar la cicatrización
y/o la proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o
la atrofia cutánea, y/o destinada a luchar contra los efectos del
envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de
firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las
cicatrices atrofiadas y/o la atrofia de los tejidos cutáneos
observada en el curso del envejecimiento, y en particular contra la
atrofia de la dermis, siendo dicho principio activo un extracto de
un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana),
Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa
vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Brusco
(Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Altramuz
(Lupinus angustifolius), Galanga (Alpinia galanga),
"Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de
cualquiera de éstos.
6. Utilización según la reivindicación 5,
caracterizada por ser el principio activo un extracto
vegetal seleccionado entre un extracto de guaraná (Paullinia
cupana), un extracto de atanasia (Tanacetum vulgare), un
extracto de galanga (Alpinia galanga), un extracto de
"brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla
cualquiera de éstos.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada por ser el principio
activo un extracto vegetal obtenido mediante un solvente de
extracción seleccionado entre agua, un alcohol, un poliol, un éster
y una mezcla de los mismos.
8. Utilización según la reivindicación 7,
caracterizada porque el alcohol es seleccionado entre
etanol, propanol, isopropanol y butanol; el poliol es
butilenglicol, y el éster es acetato de etilo.
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, caracterizada porque dicho extracto
vegetal es seleccionado entre semilla entera de guaraná
(Paullinia cupana), una fracción acuosa de flores de
Atanasia (Tanacetum vulgare), una fracción acuosa de raíces
u hojas de galanga (Alpinia galanga), una fracción acuosa de
raíz de Pentadriplandra brazzeana, o una mezcla de los
mismos.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en una composición cosmética o
dermofarmaceútica destinada a aumentar la firmeza y/o la
elasticidad de los tejidos cutáneos, en particular de la
dermis.
11. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en una composición cosmética o
dermofarmaceútica destinada a aumentar la producción y/o la cantidad
de glicosaminoglicanos en general y de ácido hialurónico en
particular, especialmente a nivel dérmico.
12. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones l a 3, ó 5 a 9 para luchar contra el afinamiento
de los tejidos cutáneos.
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