ES2304208B2

ES2304208B2 - Extractos de planta estimulante del has2.

Info

Publication number: ES2304208B2
Application number: ES200602894A
Authority: ES
Inventors: Corinne Reymermier; Anne Guezennec; Joelle Guesnet; Eric Perrier
Original assignee: YSL Beaute; Engelhard Lyon SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS; YSL Beaute
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2009-07-28
Anticipated expiration: 2026-11-15
Also published as: FR2893252A1; US10675313B2; JP2007137884A; JP6054858B2; ES2304208A1; JP5837729B2; US20070184012A1; KR20140029507A; JP2014094949A; KR20140119669A; GB2432313A; GB0622032D0; GB2432313B; KR20070052676A; DE102006054621A1; KR20160014753A; DE102006062929B3; FR2893252B1

Abstract

Extractos de planta estimulante del HAS2.

La invención se relaciona con extractos vegetales estimuladores de la síntesis de Hialuronano Sintasa, y en particular la síntesis de Hialuronano Sintasa 2 (HAS2). La invención se relaciona, en particular, con la utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Grosella (Ribes uva-crispa L.), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Guisante (Pisum sativum), Altramuz (Lupinus angustifolius), Efedra (Ephedra sinica), Atanasia (Tanacetum vulgare), Galanga (Alpinia galanga), Morera (Morus alba), "Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.

La invención tiene como fin, en particular, aumentar la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos y/o a mejorar la cicatrización y/o la proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o

destinada a luchar contra los efectos del envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las cicatrices atrofiadas.

Description

Extractos de planta estimulante del HAS2.

La invención se relaciona con composiciones cosméticas y farmacéuticas que contienen extractos vegetales para obtener, en particular, un efecto reafirmante de la piel y especialmente de la dermis, como consecuencia de la estimulación de la proteína HAS.

Estado de la técnica

La matriz extracelular está constituida por una red compleja de moléculas variadas de origen proteico o glucídico responsables del ambiente favorable al buen funcionamiento celular.

Como consecuencia de sucesos celulares como la proliferación, la migración o la diferenciación, la matriz extracelular se modifica y adapta. En la familia de los polisacáridos, los glicosaminoglicanos (GAG), y entre ellos el ácido hialurónico (AH), son componentes estructurales clave de esta matriz extracelular. De pesos moleculares muy altos, estos GAG poseen numerosas funciones fisiológicas, como la hidratación de los tejidos, el aumento del efecto barrera cutáneo y la promoción del poder de recuperación y de la elasticidad de los tejidos gracias a su capacidad de captación del agua. Además, han sido descritos en la modulación de la angiogénesis o neocreación de capilares sanguíneos, de la cicatrización, de la proliferación, de la migración y de la diferenciación celular por medio de receptores de membrana, tales como el CD44 y los RHAMM (Receptor for Hyaluronan Mediated Motility), situados en la superficie de las células (Lesley J. y col., J. Exp. Med., 175, 257-266 (1992); Peck D. y col., Journal of Cell Science, 111, 1595-1601 (1998); Assmann V. y col., Journal of Cell Science, 111, 1685-1694 (1998)).

Además, la presencia del ácido hialurónico en la interfase dermis-epidermis permitiría facilitar los intercambios metabólicos entre los dos tejidos. Finalmente, el ácido hialurónico permite también asociaciones con otras moléculas, como el versicano, el fibrinógeno y los colágenos de tipo I y VI (Mc Devitt y col., FEBS Lett., 3, 294, 167-170 (1991); Le Baron y col., J. Biol. Chem., 14, 267, 10003-10010 (1992)).

Más estudiado que los otros GAG, el ácido hialurónico se presenta como un polisacárido lineal compuesto de unidades disacarídicas repetitivas: ácido N-acetil-D-glucosamina-\beta(1\rightarrow4)-D-glucurónico \beta(1\rightarrow3); se sintetiza en el lado interno de la membrana plasmática por adiciones sucesivas de UDP-N-acetilglucosamina y ácido UDP-D-glucurónico combinadas por uniones \beta(1\rightarrow4) y \beta(1\rightarrow3) y se segrega después directamente al espacio extracelular (Weigel y col., J. Biol. Chem., 272, 13997-14000 (1997)). Esta síntesis es realizada por enzimas de membrana monoméricas llamadas Hialuronano Sintasas (HAS), identificadas bajo tres isoformas en vertebrados: HAS1, HAS2 y HAS3 (Weigel y col., J. Biol. Chem., 272, 13997-14000 (1997)), transcritas a partir de 3 genes distintos localizados en diferentes cromosomas. Más en particular, el gen codificante de la proteína HAS2 se sitúa en el cromosoma 8 y es sensible a la presencia de diferentes factores de crecimiento, como PDGF-BB, TGF-\beta1, EGF o también FGF y KGF.

Los GAG se encuentran en aproximadamente todos los tejidos y sus cantidades en la matriz extracelular se modifican mucho en ciertas condiciones, como la atrofia cutánea, la edad, las cicatrices atrofiadas y probablemente la osteoporosis. La piel, y más particularmente la dermis, contiene aproximadamente un 50% de la cantidad total de ácido hialurónico presente en el organismo (Laurent y col., FASEB J., 6, 2397-2404 (1992)) y estudios han mostrado una fuerte relación causa-efecto de la edad, con una ausencia total de ácido hialurónico sintetizado a partir de los 60 años (Ghersetich y col., Int. J. Dermatol., 33, 119-122 (1994)). Este ácido hialurónico es sintetizado por las HAS de los fibroblastos de la dermis.

A nivel de la epidermis, el ácido hialurónico es sintetizado por las HAS de los queratinocitos y juega un papel en la migración, la proliferación y la diferenciación de éstos. La disminución de ácido hialurónico conlleva un afinamiento de la epidermis atribuible a la aceleración de la diferenciación terminal de los queratinocitos.

Para aplicaciones cosméticas o dermofarmacéuticas, se ha estudiado un cierto número de compuestos por sus capacidades para estimular, en queratinocitos, la producción de glicosaminoglicanos en general y de ácido hialurónico en particular.

Después de haber demostrado que HAS2 era inducible por diferentes substancias, tales como TNF alfa, Interferon gamma e Interleukina 1 beta (Ijuin y col., 2001, Arch. Oral Biol., 46(8): 767-72), diferentes equipos intentaron estimular la producción de HAS2 con substancias tales como el ácido retinoico en un modelo de queratinocitos en cultivo con el fin de evaluar los efectos sobre la calidad y la estructura de la epidermis de pieles de voluntarios sanos así tratados. La conclusión de estos estudios es que todas las citokinas proinflamatorias estimulan la producción de HAS2 y, por lo tanto, de hialuronano en las células en cultivo (Jacobson A., Brinck J., Briskin M.J., Spicer A.P. y Heldin P., 2000, Expression of human hyaluronan synthases in response to external stimuli, Biochem. J., 348(Pt 1): 29-35). Al igual que substancias tales como el ácido retinoico, recientemente se ha descrito la substancia K (ó 20-O-betaD-glucopiranosil-20-S-protopanaxadiol) del ginseng como capaz de estimular la síntesis de HAS2 en células HaCat de tipo queratinocitos transformadas o en fibroblastos humanos en cultivo (Kim y col., IFSCC Magazine 7(3), 189-196 (2004)).

Fines de la invención

La invención tiene como fin principal resolver el problema técnico consistente en disponer de compuestos extraídos de vegetales utilizables por vía tópica sobre la piel y especialmente utilizables en composiciones cosméticas o dermofarmacéuticas, es decir, que no presenten significativamente reacción inflamatoria a nivel de la piel, pero que sean capaces de aumentar la firmeza de la piel.

En particular, la invención tiene por objeto proporcionar compuestos utilizables por vía tópica que permitan estimular la expresión y/o la actividad de HAS2 con el fin de aumentar la cantidad de glicosaminoglicanos y de ácido hialurónico en la piel, en particular en la dermis, y de aumentar así la firmeza de la piel.

La invención tiene especialmente como fin proporcionar compuestos antes mencionados para mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o aumentar el efecto de barrera cutánea y/o aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o modular la angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos y/o mejorar la cicatrización, la proliferación, la migración o la diferenciación celular.

En particular, la invención tiene por objeto proporcionar compuestos antes mencionados para luchar contra la atrofia cutánea, en particular contra la atrofia de la dermis, los efectos del envejecimiento sobre la piel, las cicatrices atrofiadas o la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento.

Descripción de la invención

Así, la presente invención describe, según un primer aspecto, la utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto vegetal como principio activo estimulador de la expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa, y en particular estimulador de la expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa 2 (HAS2), en una composición cosmética.

La invención describe, según un segundo aspecto, la utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto vegetal como principio activo estimulador de la expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa, y en particular estimulador de la expresión y/o la actividad de la hialuronano sintasa 2 (HAS2), para la fabricación de una composición farmacéutica, y en particular dermofarmacéutica.

Los inventores entienden por "estimulador de la expresión de la hialuronano sintasa (HAS, en particular de HAS2)", en particular, la estimulación de la síntesis de hialuronano sintasa (HAS, en particular HAS2).

En particular, los principios activos según la presente invención permiten obtener una estimulación de la expresión del gen codificante de la proteína HAS2 en los fibroblastos, en particular en los fibroblastos humanos y especialmente a nivel de los tejidos cutáneos humanos, tales como la dermis.

Ventajosamente, los principios activos permiten aumentar la firmeza y/o elasticidad de los tejidos cutáneos, en particular de la dermis.

Ventajosamente, los principios activos permiten aumentar la producción y/o la cantidad de glicosaminoglicanos en general y de ácido hialurónico en particular, especialmente a nivel dérmico.

Ventajosamente, los principios activos según la presente invención no inducen sensiblemente reacción inflamatoria a nivel cutáneo y son, pues, compatibles con aplicaciones cosméticas o dermofarmacéuticas.

Ventajosamente, la composición está destinada a mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos y/o a aumentar la cicatrización y/o la proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o destinada a luchar contra los efectos del envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento, y/o las cicatrices atrofiadas y/o la atrofia de los tejidos cutáneos observada en el curso del envejecimiento, en particular contra la atrofia de la dermis.

Ventajosamente, los compuestos según la presente invención son utilizados para luchar contra el afinamiento de los tejidos cutáneos y en particular de la piel.

Ventajosamente, los compuestos utilizados según la presente invención son extraídos de vegetales. En particular, el principio activo es un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Grosella (Ribes uva-crispa L.), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Guisante (Pisum sativum), Altramuz (Lupinus angustifolius), Efedra (Ephedra sinica), Atanasia (Tanacetum vulgare), Galanga (Alpinia galanga), Morera (Morus alba), "Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.

Preferiblemente, el principio activo es un extracto vegetal seleccionado entre un extracto de morera (Morus alba), un extracto de efedra (Ephedra sinica), un extracto de guaraná (Paullinia cupana), un extracto de atanasia (Tanacetum vulgare), un extracto de galanga (Alpinia galanga), un extracto de "brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla cualquiera de éstos.

Ventajosamente, los compuestos según la presente invención son utilizados para aumentar la firmeza y/o la elasticidad de los tejidos cutáneos, en particular de la dermis.

Se utiliza ventajosamente un solvente polar o una mezcla de solventes polares para obtener dicho extracto. Entre los solventes habituales de extracción, se puede utilizar un solvente prótico seleccionado entre el grupo consistente en: agua, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, ciclohexanol, dietilenglicol, HO-(CH_{2})_{2}-OH y una de sus mezclas. También se puede utilizar un solvente aprótico polar, especialmente seleccionado entre el grupo consistente en: piridina, butanona, acetona, Ac_{2}O, (Me_{2}N)_{2}CO, PhCN, CH_{3}CH_{2}CN, HMPA, PhNO_{2}, MeNO_{2}, DMF, MeCN, sulfolano, DMSO, HCONH_{2}, HCONHMe, CH_{3}CONHMe y una de sus mezclas. Se utiliza preferiblemente agua, un alcohol como etanol, propanol, isopropanol o butanol, un poliol, tal como butilenglicol, o un éster, como el acetato de etilo, o una mezcla de estos solventes. Las proporciones de las mezclas de los solventes antes mencionados varían generalmente entre 1:1 y 1:100 y preferiblemente entre 1:1 y 1:10; se utiliza, por ejemplo, una mezcla 25/75.

Se puede efectuar la extracción con agitación y/o calentamiento, como, por ejemplo, a entre 30 y 60ºC, o a reflujo del solvente utilizado. Se hace la extracción habitualmente a presión atmosférica, pero se puede utilizar una extracción bajo presión. El tiempo de extracción es apreciado por el experto en la técnica y depende especialmente de las condiciones de extracción.

Ventajosamente, se procede a varias extracciones. Se pueden reunir especialmente las fracciones obtenidas si se desea.

Ventajosamente, los extractos obtenidos son filtrados y luego eventualmente concentrados y/o evaporados hasta obtener la calidad de productos secos deseada.

Los compuestos según la presente invención son preparados en forma de composiciones tópicas, especialmente de composiciones cosméticas, dermofarmacéuticas o farmacéuticas. Por ello, para estas composiciones, el excipiente contiene, por ejemplo, al menos un compuesto seleccionado entre el grupo consistente en conservantes, emolientes, emulsores, tensioactivos, hidratantes, espesantes, acondicionadores, agentes matificantes, estabilizadores, antioxidantes, agentes de textura, agentes de brillo, agentes filmógenos, solubilizantes, pigmentos, colorantes, perfumes y filtros solares. Estos excipientes son preferiblemente seleccionados entre el grupo consistente en aminoácidos y sus derivados, poligliceroles, ésteres, polímeros y derivados de celulosa, derivados de lanolina, fosfolípidos, lactoferrinas, lactoperoxidasas, estabilizadores a base de sacarosa, vitaminas E y sus derivados, ceras naturales y sintéticas, aceites vegetales, triglicéridos, insaponificables, fitosteroles, ésteres vegetales, siliconas y sus derivados, hidrolizados de proteínas, aceite de jojoba y sus derivados, ésteres Tipo/hidrosolubles, betaínas, aminóxidos, extractos de plantas, ésteres de sacarosa, dióxidos de titanio, glicinas y parabenes, y también preferiblemente entre el grupo consistente en butilenglicol, esteareth-2, esteareth-21, glicol-15 estearil éter, alcohol cetearílico, fenoxietanol, metilparabén, etilparabén, propilparabén, butilparabén, butilenglicol, tocoferoles naturales, glicerina, éter isopropilhidroxicetílico de dihidroxicetilo sodio, estearato de glicol, triisononaoína, cocoato de octilo, poliacrilamida, isoparafina, laureth-7, un carbómero, propilenglicol, glicerol, bisabolol, una dimeticona, hidróxido de sodio, dipolihidroxiestearato de PEG 30, triglicéridos cáprico/caprílico, octanoato de cetearilo, adipato de dibutilo, aceite de pepita de uva, aceite de jojoba, sulfato de magnesio, EDTA, una ciclometicona, goma xantano, ácido cítrico, laurilsulfato de sodio, ceras y aceites minerales, isoestearato de isoestearilo, dipelargonato de propilenglicol, isoestearato de propilenglicol, PEG 8 Cera de abejas, glicéridos del aceite de corazón de palma hidrogenado, glicéridos de aceite de palma hidrogenado, aceite de lanolina, aceite de sésamo, lactato de cetilo, alcohol de lanolina, aceite de ricino, dióxido de titanio, lactosa, sacarosa, polietileno de baja densidad o una solución isotónica salada.

Ventajosamente, las composiciones antes citadas son formuladas en una forma seleccionada entre el grupo consistente en una solución, acuosa u oleosa; una crema o un gel acuoso o un gel oleoso, especialmente en tarro o en tubo, especialmente un gel de ducha; un champú; una leche; una emulsión, una microemulsión o una nanoemulsión, especialmente de aceite-en-agua o de agua-en-aceite o múltiple o siliconada; una loción, especialmente en frasco de vidrio o de plástico o en frasco dosificador o en aerosol; una ampolla; un suero; un jabón líquido; un pan dermatológico; una pomada, una espuma; un producto anhidro, preferentemente líquido, pastoso o sólido, por ejemplo en forma de bastoncillo, especialmente en forma de rojo de labios.

Las cantidades de dicho principio activo habitualmente utilizadas varían entre el 0,001% y el 20% en peso de la composición total, preferiblemente entre el 0,001% y el 10% en peso, y se utiliza aún más preferiblemente entre un 0,01% y un 10% en peso de la composición total.

Se pueden combinar eventualmente los compuestos antes descritos con otro principio activo para obtener un mejor efecto.

La invención se relaciona, según otro aspecto, con un procedimiento de cuidados cosméticos que consiste en la utilización de las composiciones antes mencionadas.

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La invención se relaciona, según otro aspecto, con un procedimiento de tratamiento farmacéutico, en particular de tratamiento dermofarmacéutico, que consiste en la utilización de las composiciones antes mencionadas y que consiste especialmente en la administración de una cantidad eficaz de al menos un principio activo antes mencionado a un sujeto que tenga necesidad de ello.

La aplicación mencionada anteriormente puede ser efectuada en una o varias veces al día, especialmente por aplicación tópica.

En cuanto a las figuras:

- La figura 1 representa la estimulación de HAS2 por un extracto de morera.

- La figura 2 representa la estimulación de HAS2 por un extracto de efedra.

- La figura 3 representa la estimulación de HAS2 por un extracto de guaraná.

- La figura 4 representa la estimulación de HAS2 por un extracto de atanasia.

- La figura 5 representa la estimulación de HAS2 por un extracto de galanga.

- La figura 6 representa la evolución de la firmeza de la piel después de un mes de utilización de una crema que contiene un extracto de galanga y un extracto de atanasia.

- La figura 7 representa la evolución de la firmeza de la piel después de un mes de utilización de un suero que contiene un extracto de galanga y un extracto de atanasia.

Otros fines, características y ventajas de la invención se le aparecerán claramente al experto en la técnica tras la lectura de la descripción explicativa que hace referencia a ejemplos que son dados solamente a titulo ilustrativo y que no sabrían en modo alguno limitar el alcance de la invención.

Los ejemplos forman parte integrante de la presente invención y cualquier característica que aparezca como nueva con respecto a un estado de la técnica anterior cualquiera a partir de la descripción tomada en su conjunto, incluyendo los ejemplos, forma parte integrante de la invención en su función y en su generalidad.

Así, cada ejemplo tiene un alcance general.

Por otra parte, en los ejemplos, todos los porcentajes son dados en peso, salvo indicación en contrario, y la temperatura es expresada en grados Celsius, salvo indicación en contrario, y la presión es la presión atmosférica, salvo indicación en contrario.

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Ejemplos Ejemplo 1 Estimulación de la expresión del gen codificante de la proteína HAS2

A) Se obtienen los fibroblastos humanos normales tras extracción con colagenasa a partir de biopsias abdominales procedentes de resección quirúrgica.

Se amplifican los fibroblastos en Medio de Cultivo de Fibroblastos ("FCM"), compuesto por Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ("DMEM" glutamina estabilizado, Invitrogen) suplementado con un 10% de suero de ternera (Hyclone), 25 mg/l de gentamicina, 100.000 UI/l de penicilina, 1 mg/l de anfotericina B y 50 mg/l de ascorbato de sodio (Sigma). Se distribuyen 1,5 ml de FCM por pocillos y se realiza el cultivo a 37ºC bajo un 5% de CO_{2}. Se renueva el medio tres veces por semana. Se siembran entonces los fibroblastos a 10.000 células por cm^{2} en placas de 24 pocillos bajo 1 ml de Medio Basal de Fibroblastos (Promocell) y se amplifican hasta la confluencia.

B) Se diluyen los principios activos (estudiados por el método de cribado a una concentración del 1%) en el medio de cultivo sin antibióticos, antimicóticos y factores de crecimiento. Se realiza la detección de la expresión del gen por RT-PCR a tiempo real midiendo la expresión de cada gen con respecto a la actina (housekeeping gene) y expresándola en % del control negativo no tratado. Se añaden 10 \mul de ARN totales a 5 ng/\mul a 40 \mul de mezcla de PCR (compuesta por 25 \mul de SYBR Green Buffer Mix 2X, 0,5 \mul de mezcla enzimática, 0,5 \muM final de cebador sentido y 0,5 \muM final de cebador antisentido, agua csp 40 \mul). La RT-PCR se desarrolla en diferentes etapas, entre ellas retrotranscripción a 50ºC, 30 min., activación de la polimerasa a 95ºC, 15 min., realización de los ciclos de PCR (95ºC, 15 s; temperatura de hibridación específica para cada gen/30 s; 72ºC/30 s) x 50 ciclos. Los oligonucleótidos sentido y antisentido son, respectivamente, CGAGTTTACTTCCCGCCAAGA y CTTCCGCCTGCCACACTTATTGAT y la temperatura de hibridación es de 56ºC.

Sobre el conjunto de los productos evaluados, los productos siguientes dan resultados satisfactorios, ya que estimulan la producción de ARNm codificante de HAS2. Estos productos pueden ser, pues, utilizados en cosmética para estimular la síntesis de HAS2 en la dermis e inducir una firmeza cutánea.

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TABLA 1

1

2

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Se prefiere así realizar una extracción preferiblemente con un solvente polar o una mezcla de solventes polares, eventualmente a reflujo, preferiblemente de la parte de la planta mencionada en la tabla 1. Una vez realizada la extracción, se filtra la solución y se resolubiliza eventualmente en un solvente polar o una mezcla de solventes polares.

Previamente a la extracción, se puede ventajosamente realizar la trituración de la o de las partes de la planta utilizada.

Es ventajoso obtener un extracto de los vegetales utilizados como materia prima a partir de un solvente preferiblemente polar y preferiblemente agua, una mezcla de agua/alcohol o poliol, como una mezcla de agua/glicol o de agua/etanol, o un poliol, o un alcohol como el etanol. El extracto es preferiblemente filtrado y luego secado. Es igualmente posible efectuar la extracción con un calentamiento moderado, como, por ejemplo, a 45ºC o a reflujo. Se efectúa la extracción preferiblemente bajo agitación. Los procedimientos de extracciones son bien conocidos por el experto en la técnica. La parte de los vegetales utilizada puede variar en función del extracto que se ha de obtener.

Preferiblemente, se realiza un extracto a partir de una parte de la planta cortada al 10% (p/p) en agua, o en etanol, eventualmente a reflujo. Se realiza la extracción durante 1 hora y luego se filtra la solución, se elimina el etanol y se solubiliza el producto obtenido al 5% (p/p) en una mezcla de agua/glicol y se ultrafiltra después sobre filtro cerámico a diferentes umbrales de corte y finalmente se filtra a 0,45 \mum. También se puede utilizar como solvente el etanol, el acetato de etilo, el DMSO, la acetona o una mezcla de un 75% de agua y un 25% de butilenglicol, en lugar de agua. Los tipos de extracciones preferidos son los indicados en la tabla 1.

Ejemplo 2 Validación por efecto-dosis de los efectos obtenidos por uno de los ingredientes seleccionados (Extracto de morera - JVEG022A)

Se realizan cultivos de fibroblastos como se indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades crecientes del extracto seleccionado. Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2 utilizando la Q-RT-PCR tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del estudio, y se presentan en la Figura 1. Se constata un efecto-dosis significativo de este principio activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una estimulación de más del 900% del ARNm de HAS2, lo que representa un resultado muy positivo y muy significativo.

Ejemplo 3 Validación por efecto-dosis de los efectos obtenidos por uno de los ingredientes seleccionados (Extracto de efedra - JVEG166A)

Se realizan cultivos de fibroblastos como se indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades crecientes del extracto seleccionado (extracto de efedra). Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2 utilizando la Q-RT-PCR tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del estudio, y se presentan en la Figura 2. Se constata un efecto-dosis significativo de este principio activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una estimulación del 155% del ARNm de HAS2, lo que representa un resultado muy positivo.

Ejemplo 4 Validación por efecto-dosis de los efectos obtenidos por uno de los ingredientes seleccionados (Extracto de guaraná - JVEG056A)

Se realizan cultivos de fibroblastos como se indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades crecientes del extracto seleccionado (extracto de guaraná). Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2 utilizando la Q-RT-PCR tal como se describe en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del estudio, y se presentan en la Figura 3. Se constata un efecto-dosis significativo de este principio activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una estimulación del 500% del ARNm de HAS2, lo que representa un resultado muy positivo.

Ejemplo 5 Validación por efecto-dosis de los efectos obtenidos por uno de los ingredientes seleccionados (Extracto de atanasia - JVEG681A)

Se realizan cultivos de fibroblastos como se indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades crecientes del extracto seleccionado (extracto de atanasia). Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2 utilizando la Q-RT-PCR tal como se describe en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del estudio, y se presentan en la Figura 4. Se constata un efecto-dosis significativo de este principio activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una estimulación del 260% del ARNm de HAS2, lo que repre senta un resultado muy positivo.

Ejemplo 6 Validación por efecto-dosis de los efectos obtenidos por uno de los ingredientes seleccionados (Extracto de galanga - JVEG2304A)

Se realizan cultivos de fibroblastos como se indica en el ejemplo 1 y se incuban en presencia de cantidades crecientes del extracto seleccionado (extracto de galanga). Tras la extracción de los ARNm, se detectan las cantidades de ARNm codificante de HAS2 utilizando la Q-RT-PCR tal como se describe en el ejemplo 1. Se dan los resultados en porcentaje de activación en función del cultivo celular no tratado, utilizado como control del estudio, y se presentan en la Figura 5. Se constata un efecto-dosis significativo de este principio activo, lo que significa que su actividad debe ser relativamente específica. Utilizado al 1%, este extracto permite obtener una estimulación del 180% del ARNm de HAS2, lo que representa un resultado muy positivo.

Ejemplo 7 Pruebas en cultivo celular

Se evalúan los productos de la invención Extracto de Pentadiplandra brazzeana (JVEG 060A), Extracto de Galanga (JVEG 203A), Extracto de Atanasia (JVEG 681A) y Extracto de Morera (JVEG 022A) en cuanto a su capacidad para estimular la neosíntesis de glicosaminoglicanos (GAG, especialmente el ácido hialurónico). Los modelos biológicos seleccionados son el equivalente de dermis (DE, mallas libres de colágeno retractado que contienen fibroblastos) y el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos normales en cultivo en monocapa (NHDF).

Se realizó la evaluación de estos efectos cuantificando la incorporación de glucosamina tritiada a la fracción GAG neosintetizada por los fibroblastos de los modelos seleccionados. La incorporación de glucosamina a la fracción GAG purificada rinde cuentas de la neosíntesis de la mayor parte de los GAG, incluyendo el ácido hialurónico (mayoritario). Se realizó el análisis por separado sobre las fracciones segregadas/solubles (GAG segregados) y sobre las fracciones integradas en los DE (GAG almacenados en la matriz) o sobre el conjunto de un cultivo de fibroblastos (NHDF).

Equivalentes de dermis

Se prepararon los equivalentes de dermis, se pusieron luego en medio DMEM (Invitrogen) al 2% de SVF y se pusieron a retractarse durante 7 días con cambio de medio cada 3 días. Se incubaron los DE entonces en ausencia (control) o en presencia de los compuestos de ensayo o del compuesto de referencia (TGF beta, 10 ng/ml) durante 48 horas ó 72 horas a 37ºC y un 5% de CO_{2}, con adición de glucosamina tritiada 24 horas antes del final de la incubación. Se realizó cada condición por triplicado.

Fibroblastos

Se sembraron los fibroblastos dérmicos normales humanos en medio DMEM completo y se preincubaron durante 24 horas a 37ºC y un 5% de CO_{2} y se reemplazó luego el medio de cultivo por medio DMEM con un 2% de suero que contenía o no (control) los compuestos de ensayo o el producto de referencia (TGF beta, 10 ng/ml). Se realizó cada condición experimental por triplicado.

Se incubaron entonces las células a 37ºC durante 72 horas con adición de glucosamina tritiada 24 horas antes del final de la incubación.

Análisis de la radiactividad incorporada

Veinticuatro horas antes de finalizar la incubación, se añade glucosamina tritiada (D-[6-^{3}H]-glucosamina, 1,37 Tbq/mmol, 37 Ci/mmol, 33 \muCi/ml) al cultivo. Se realiza la extracción de los glicosaminoglicanos sobre los mismos sobrenadantes de cultivo de los DE (fracción segregada/soluble), en el propio seno de los DE por trituración (fracción extraída) o en el seno del cultivo de fibroblastos, con ayuda de un tampón caotrópico (Tris/HCl 50 mM, guanidina 4 M, EDTA 5 mM, pH 8,0). Se realiza la purificación por cromatografía de intercambio de iones: adsorción de las moléculas aniónicas sobre perlas de Q-Sepharose en condiciones altamente estrictas, desorción de las moléculas poco y medianamente aniónicas con urea 6 M más NaCl 0,2 M y lavados. Se realiza el recuento de la radiactividad incorporada a las moléculas muy catiónicas que permanecen sobre el soporte (mayoritariamente GAG, eluidas con NaCl 2 M) por centelleo líquido. Se expresan los resultados en porcentaje de variación de la síntesis de los glicosaminoglicanos con respecto al control. Se realizaron las comparaciones entre grupos por análisis de varianza (ANOVA) con ayuda de la prueba de comparación múltiple de Dunnett.

El producto de referencia TGF beta (10 ng/ml) estimuló fuertemente la incorporación de glucosamina a la fracción GAG (estimulación en un factor 4 con respecto al control). Este resultado valida el ensayo.

En las condiciones experimentales de este ensayo, el extracto de galanga (JVEG203A) y el extracto de atanasia (JVEG681A), estudiados al 1%, estimularon la incorporación de glucosamina a la fracción de GAG sintetizados por los fibroblastos (respectivamente, 154% y 143% del control no tratado, p<0,01).

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TABLA 2 Efectos de los diferentes tratamientos sobre la incorporación de ^{3}H-glucosamina a la fracción de los GAG sintetizados por fibroblastos dérmicos humanos en cultivo in vitro

Incorporación de glucosamina - fibroblastos

3

\quad: Sd: tipo de desviación; n: número de ensayos;

\quad: Cpm: número de desintegraciones por minuto (golpes por minuto);

\quad: p: significación evaluada por prueba estadística.

Fracción soluble

El producto de referencia TGF beta estimuló fuertemente la incorporación de glucosamina a la fracción GAG soluble y segregada de los equivalentes dérmicos (estimulación en un factor de 3 con respecto al control). Este resultado valida el ensayo.

En las condiciones experimentales de este ensayo, los productos extracto de atanasia (JVEG681A) y extracto de morera (JVEG022A), estudiados al 1%, estimularon significativamente la incorporación de glucosamina a la fracción soluble y segregada de los equivalentes dérmicos (respectivamente, 210%, p<0,01 y 149%, p<0,05). El extracto de galanga (JVEG203A) permitió igualmente aumentar la incorporación de glucosamina a la fracción GAG soluble de los DE (140% del control).

Fracción extraída

El TGF beta estimuló la incorporación de glucosamina a la fracción GAG extraída de los equivalentes dérmicos, pero de forma más moderada que en la fracción soluble (estimulación en un factor de 1,6 con respecto al control). Este resultado valida el ensayo.

En las condiciones experimentales de este ensayo, el producto extracto de atanasia (JVEG681A), estudiado al 1%, estimuló significativamente la incorporación de glucosamina a la fracción extraída de los equivalentes dérmicos (150% del control, p<0,01). Como para el TGF beta, esta estimulación es más débil que en la fracción soluble.

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TABLAS 3 y 4 Efectos de los diferentes tratamientos sobre la incorporación de glucosamina a la fracción de los GAG sintetizados por los fibroblastos de los equivalentes dérmicos (fracciones solubles, tabla 3, y extraídas, tabla 4)

Incorporación de glucosamina - DE/fracción soluble

4

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Incorporación de glucosamina - DE/fracción extraída

5

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Ejemplo 8 Pruebas in vivo

Esta prueba tiene por objeto evaluar los efectos de los productos de la invención sobre la firmeza y la elasticidad 30 minutos después de una aplicación aislada, así como después de 1 mes de utilización bicotidiana. Se evalúan los efectos sobre las propiedades biomecánicas de la piel con ayuda del balistómetro, técnica que se basa en el registro dinámico del rebote de un objeto pesado sobre la superficie de la piel.

Se traducen entonces los rebotes inducidos, registrados durante 3 segundos, en señales eléctricas que pueden ser cuantificadas y evaluadas en términos de amplitud.

Los parámetros medidos son:

-: La indentación (penetración de la sonda en la piel por el primer impacto), que mide la firmeza de la piel: si la indentación disminuye, hay reafirmamiento.

-: El área bajo la curva mide la energía restituida. Esta última resulta afectada a la vez por la elasticidad y por la firmeza de la piel: una disminución del área corresponde a un reafirmamiento.

-: Alfa, la razón de amortiguación de los rebotes, que indica la velocidad a la cual desaparecen los rebotes, ligada a la elasticidad: si alfa aumenta, la elasticidad disminuye.

Se evaluaron dos formulaciones (una crema y un suero) por aplicación bicotidiana sobre el conjunto de la cara durante un mes, en condiciones normales de utilización, siendo estudiada cada formulación sobre 20 voluntarios de sexo femenino de 45 a 75 años de edad. La crema era una emulsión Ac/Ag que contenía un 1% de extracto de galanga y un 1% de extracto de atanasia y el suero era un gel emulsionado que contenía un 1,5% de extracto de galanga y un 1,5% de extracto de atanasia.

El análisis de las propiedades biomecánicas de la piel mostró, como media sobre el conjunto de los voluntarios, después de un mes de utilización bicotidiana de la crema o del suero, una disminución significativa de la indentación (penetración de la sonda en la piel por el primer impacto) del 12% y del 7%, respectivamente. Esta observación pone en evidencia una mejora significativa de la firmeza de la piel tras aplicación tópica de los productos de la invención. Con más precisión, para la crema, se constata:

\bullet: una mejora de la indentación, medida en el 86% de los voluntarios, mejora del 16% en estos últimos (valor máximo: -37%);

\bullet: el coeficiente alfa aumenta significativamente en un 62% y el área bajo la curva disminuye significativamente en un 32%: estos dos parámetros están ligados a la indentación y confirman, pues, el efecto reafirmante.

Después de un mes de utilización bicotidiana de la crema, la piel se reafirma significativamente en un 12%, como se ilustra en la Figura 6.

Con más precisión, para el suero, se constata:

\bullet: una mejora de la indentación, medida en un 71% de los voluntarios, mejora del 13% en estos últimos (valor máximo: -31%);

\bullet: el coeficiente alfa aumenta significativamente en un 8% y el área bajo la curva disminuye significativamente en un 18%, confirmando igualmente un reafirmamiento de la piel.

Después de un mes de utilización bicotidiana del suero, la piel se reafirma significativamente en un 7%, como se ilustra en la Figura 7.

Ejemplo 9 Evaluación de la ausencia de potencial inflamatorio de las moléculas seleccionadas para la estimulación de la síntesis de HAS2

Contrariamente al ácido retinoico, al TNF alfa y a la IL1, las moléculas seleccionadas para estimular la síntesis de HAS2 no pasan por un mecanismo proinflamatorio, incompatible con aplicaciones cosméticas.

Así, la utilización de un extracto de galanga en las condiciones del ejemplo 6 sobre cultivos de fibroblastos permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 h después del contacto) la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por estimular HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo del ejemplo 6).

TABLA 5

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6

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Así, la utilización de un extracto de atanasia en las condiciones del ejemplo 5 sobre cultivos de fibroblastos permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 horas después del contacto) la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por estimular HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo del ejemplo 5).

TABLA 6

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7

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Así, la utilización de une extracto de altramuz en las condiciones del ejemplo 1 sobre cultivos de fibroblastos permite la estimulación de HAS2 sin estimular (dosificación sobre sobrenadante de cultivos de fibroblastos, 48 horas después del contacto) la síntesis de citokinas proinflamatorias conocidas por estimular HAS2, tales como IL1, TNFa o TGFb (el control positivo de los ejemplos 1 a 7).

TABLA 7

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8

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Ejemplo 10 Utilización de los productos de la invención en formulaciones cosméticas o farmacéuticas de tipo emulsión de aceite en agua

Formulación a

Emulsión Ac/Ag

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100

101

Formulación b

Emulsión Ac/Ag

102

Formulación c

Emulsión Ac/Ag

103

104

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Ejemplo 11 Utilización de los productos de la invención en una formulación de tipo agua en aceite

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Ejemplo 12 Utilización de los productos de la invención en una formulación de tipo champú o gel de ducha

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Ejemplo 13 Utilización de los productos de la invención en una formulación de tipo rojo de labios y otros productos anhidros

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Ejemplo 14 Utilización de los productos de la invención en una formulación de geles acuosos (contornos de ojo, adelgazantes, etc.)

108

Claims

1. Utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto vegetal como principio activo en una composición cosmética destinada a estimular la expresión y/o la actividad de la Hialuronano Sintasa, y en particular la expresión y/o la actividad de la Hialuronano Sintasa 2 (HAS2), siendo dicho principio activo un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Altramuz (Lupinus angustifolius), Atanasia (Tanacetum vulgare), Galanga (Alpinia galanga), "Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.

2. Utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto vegetal como principio activo en una composición dermofarmacéutica destinada a estimular la expresión y/o la actividad de la Hialuronano Sintasa, y en particular la expresión y/o la actividad de la Hialuronano Sintasa 2 (HAS2), siendo dicho principio activo un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Altramuz (Lupinus angustifolius), Atanasia (Tanacetum vulgare), Galanga (Alpinia galanga), "Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por ser el principio activo un extracto vegetal seleccionado entre un extracto de guaraná (Paullinia cupana), un extracto de atanasia (Tanacetum vulgare), un extracto de galanga (Alpinia galanga), un extracto de "brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla cualquiera de éstos.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por estar destinada la composición a mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la angiogénesis o la neocreación de capilares sanguíneos y/o a mejorar la cicatrización y/o la proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o destinada a luchar contra los efectos del envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las cicatrices atrofiadas y/o la atrofia de los tejidos cutáneos observada en el curso del envejecimiento, y en particular contra la atrofia de la dermis.

5. Utilización de una cantidad eficaz de al menos un extracto vegetal como principio activo para obtener una composición cosmética o dermofarmacéutica destinada a mejorar a nivel cutáneo la firmeza y/o la elasticidad y/o la hidratación de los tejidos y/o a aumentar el efecto de barrera cutánea y/o a aumentar el poder de recuperación de los tejidos y/o a modular la angiogénesis o la neocreación de capilares-sanguíneos y/o a mejorar la cicatrización y/o la proliferación, la migración o la diferenciación celular y/o la atrofia cutánea, y/o destinada a luchar contra los efectos del envejecimiento sobre la piel, y en particular contra la pérdida de firmeza cutánea observada en el curso del envejecimiento y/o las cicatrices atrofiadas y/o la atrofia de los tejidos cutáneos observada en el curso del envejecimiento, y en particular contra la atrofia de la dermis, siendo dicho principio activo un extracto de un vegetal seleccionado entre Guaraná (Paullinia cupana), Corazoncillo (Hypericum hircinum), Bambú (Bambusa vulgaris), Judía mungo (Phaseolus aureus), Brusco (Ruscus aculeatus), Haba (Vicia faba equina), Altramuz (Lupinus angustifolius), Galanga (Alpinia galanga), "Brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla de cualquiera de éstos.

6. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada por ser el principio activo un extracto vegetal seleccionado entre un extracto de guaraná (Paullinia cupana), un extracto de atanasia (Tanacetum vulgare), un extracto de galanga (Alpinia galanga), un extracto de "brazzéine" (Pentadiplandra brazzeana) y una mezcla cualquiera de éstos.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada por ser el principio activo un extracto vegetal obtenido mediante un solvente de extracción seleccionado entre agua, un alcohol, un poliol, un éster y una mezcla de los mismos.

8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque el alcohol es seleccionado entre etanol, propanol, isopropanol y butanol; el poliol es butilenglicol, y el éster es acetato de etilo.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizada porque dicho extracto vegetal es seleccionado entre semilla entera de guaraná (Paullinia cupana), una fracción acuosa de flores de Atanasia (Tanacetum vulgare), una fracción acuosa de raíces u hojas de galanga (Alpinia galanga), una fracción acuosa de raíz de Pentadriplandra brazzeana, o una mezcla de los mismos.

10. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una composición cosmética o dermofarmaceútica destinada a aumentar la firmeza y/o la elasticidad de los tejidos cutáneos, en particular de la dermis.

11. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una composición cosmética o dermofarmaceútica destinada a aumentar la producción y/o la cantidad de glicosaminoglicanos en general y de ácido hialurónico en particular, especialmente a nivel dérmico.

12. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones l a 3, ó 5 a 9 para luchar contra el afinamiento de los tejidos cutáneos.