ES2270456T3 - Recombinacion dirigida de adn mediada por cambio de clase. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE ZONAS VARIABLES DERIVADAS DE UN GEN DE INMUNOGLOBULINA (IG), PARA DIRIGIR LA RECOMBINACION ENTRE (1) UNA ESTRUCTURA DIRECCIONADORA QUE CONTIENE UN PROMOTOR Y UNA REGION VARIABLE (S1), Y (2) UN LOCUS DIANA QUE CONTIENE COMO MINIMO UN PROMOTOR, UNA REGION VARIABLE (S2) Y UNA SECUENCIA DIANA.
Description
Recombinación dirigida de ADN mediada por cambio
de clase.
La presente invención se refiere de manera
general a procedimientos y composiciones para la utilización en
tecnología de ADN recombinante, particularmente en procedimientos
para la manipulación de secuencias de ADN que codifican anticuerpos,
proteínas o partes de los mismos.
La unidad estructural de inmunoglobulina (Ig)
básica en los sistemas vertebrados está compuesta de dos cadenas de
polipéptidos "ligeros" idénticos (de aproximadamente 23 kDa) y
de dos cadenas "pesadas" idénticas (de aproximadamente 53 a 70
kDa). Las cuatro cadenas se unen mediante enlaces disulfuro en una
configuración "en Y", y las partes "de cola" de las dos
cadenas pesadas se unen mediante enlaces disulfuro covalentes cuando
las inmunoglobulinas se producen con hibridomas de células B o con
otros tipos celulares.
En la figura 1 se muestra un esquema de la
estructura general de anticuerpo. Las cadenas ligera y pesada están
compuestas cada una de una región variable en el extremo
N-terminal, y una región constante en el extremo
C-terminal. En la cadena ligera, la región variable
(denominada "V_{L}J_{L}") está compuesta de una región
variable (V_{L}) conectada mediante la región de unión (J_{L}) a
la región constante (C_{L}). En la cadena pesada, la región
variable (V_{H}D_{H}J_{H}) está compuesta de una región
variable (V_{H}) unida mediante una combinación de la región de
diversidad (D_{H}) y la región de unión (J_{H}) a la región
constante (C_{H}). Las regiones V_{L}J_{L} y
V_{H}D_{H}J_{H} de las cadenas ligera y pesada,
respectivamente, se encuentran asociadas a las puntas de la Y
formando la parte de unión a antígeno del anticuerpo y determinan
la especificidad de unión a antígeno.
La región (C_{H}) define el isotipo de
anticuerpo, es decir, su clase o subclase. Los anticuerpos de
diferentes isotipos difieren significativamente en sus funciones
efectoras, tales como la capacidad de activar el complemento, de
unirse a receptores específicos (por ejemplo receptores de Fc)
presentes en una amplia diversidad de tipos celulares, de cruzar
barreras mucosales y placentarias, y de formar polímeros de la
molécula de IgG básica de cuatro cadenas.
Los anticuerpos se clasifican en "clases"
de acuerdo con el tipo de C_{H} utilizado en la molécula de
inmunoglobulina (IgM, IgG, IgD, IgE o IgA). Existen por lo menos
cinco tipos de genes C_{H} (C\mu, C\gamma, C\delta,
C\varepsilon y C\alpha), y algunas especies (incluido el ser
humano), presentan múltiples subtipos de C_{H} (por ejemplo
C_{\gamma 1}, C_{\gamma 2}, C_{\gamma 3} y C_{\gamma 4} en
el ser humano). Existe un total de nueve genes C_{H} en el genoma
haploide del ser humano, ocho en el ratón y en la rata, y algunos
menos en muchas otras especies. Por el contrario, normalmente
existen sólo dos tipos de regiones constantes de cadena ligera
(C_{L}), kappa (\kappa) y lambda (\lambda), y sólo una de
estas regiones constantes se encuentra presentes en una proteína de
una sola cadena ligera (es decir, sólo existe una posible región
constante de cadena ligera por cada V_{L}J_{L} producido). Cada
clase de cadena pesada puede encontrarse asociada a cualquiera de
las clases de cadena ligera (por ejemplo, una región C_{H}\gamma
puede encontrarse presente en el mismo anticuerpo como cadena ligera
\kappa o \lambda), aunque las regiones constantes de las cadenas
pesada y ligera dentro de una clase particular no varían con la
especificidad de antígeno (por ejemplo, un anticuerpo IgG siempre
presenta una región constante de cadena pesada C\gamma con
independencia de la especificidad de antígeno del anticuerpo).
Cada una de las regiones V, D, J y C de las
cadenas pesada y ligera se encuentran codificada por secuencias
genómicas diferentes. La diversidad de anticuerpos se genera
mediante recombinación entre los diferentes segmentos génicos de
V_{H}, D_{H} y J_{H} en la cadena pesada, y los segmentos
génicos de V_{L} y J_{L} en la cadena ligera. La recombinación
de los diferentes genes de V_{H}, D_{H} y J_{H} se consigue
mediante recombinación de ADN durante la diferenciación de las
células B. Brevemente, la secuencia de la cadena pesada se
recombina en primer lugar para generar un complejo D_{H}J_{H}, y
después un segundo suceso de recombinación produce un complejo
V_{H}D_{H}J_{H}. Se produce una cadena pesada funcional al
transcribirse y después cortarse y empalmarse el transcrito de ARN.
La producción de una cadena pesada funcional desencadena la
recombinación en las secuencias de la cadena ligera, produciendo una
región V_{L}J_{L} reorganizada que, a su vez, forma una región
V_{L}J_{L}C_{L} funcional, es decir, la cadena ligera
funcional.
Durante el curso de la diferenciación de las
células B, la progenie de una sola célula B puede cambiar el isotipo
de la inmunoglobulina expresada de IgM a IgG u otras clases de
inmunoglobulina, sin cambiar la especificidad de antígeno
determinada por la región variable. Este fenómeno, conocido como
cambio de clase de inmunoglobulina, se ve acompañado por una
reorganización del ADN, que tiene lugar entre las regiones de cambio
(S) situadas en dirección 5' respecto a cada gen CH (excepto
C\gamma) (revisado en Honjo, Annu. Rev. Immunol.
1:499-528, 1983, y en Shimizu y Honjo, Cell
36:801-803, 1984). La recombinación
S-S traslada el exón V_{H}P_{H}J_{H} cerca del
gen C_{H}, que se expresará por deleción de los genes de C_{H}
intermedios situados en el mismo cromosoma. El mecanismo de cambio
de clase está dirigido por citoquinas (Mills et al., J.
Immunol. 155:3021-3036, 1995). Las regiones de
cambio pueden variar de tamaño entre 1 kb (S\varepsilon) y 10 kb
(S_{\gamma 1}) y están compuestas de repeticiones en tándem que
varían tanto en longitud como en secuencia (Gritzmacher, Crit. Rev.
Immunol. 9:173-200, 1989). Se han caracterizado
varias regiones de cambio, incluyendo las regiones murinas de cambio
S\mu, S\varepsilon, S\alpha, S\gamma3, S\gamma1,
S\gamma2b y S\gamma2a y la región de cambio S\mu humana (Mills
et al., supra, 1995; Nikaido et al., Nature
292:845-8, 1981; Marcu et al., Nature
298:87-89, 1982; Takahashi et al., Cell
29:671-9, 1982; Mills et al., Nucleic Acids
Res. 18:7305-16, 1990; Nikaido et al., J.
Biol. Chem. 257:7322-29, 1982; Stanton et
al., Nucleic Acids Res. 10:5993-6006, 1982;
Gritzmacher, supra, 1989; Davis et al., Science
209:1360, 1980; Obata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
78:2437-41, 1981; Kataoka et al., Cell
23:357, 1981; Mowatt et al., J. Immunol.
136:2674-83, 1986; Szurek et al., J. Immunol.
135:620-6, 1985; y Wu et al., EMBO J.
3:2033-40, 1984).
Las observaciones de que una sola célula B puede
expresar más de un isotipo simultáneamente sobre su superficie no se
explica por el mecanismo de cambio de clase debido a que la
recombinación S-S se encuentra limitada a la
recombinación intracromosómica y resulta en la deleción del gen de
C_{H} intercambiado. Un segundo mecanismo, denominado
"trans-splicing", ha sido descrito en el que
dos transcritos generados a partir de diferentes cromosomas se unen
formando un solo transcrito continuo (Shimizu et al., J. Exp.
Med. 173:1385-1393, 1991). Los ratones transgénicos
que portan un gen expresable reorganizado de cadena pesada \mu
V_{H}D_{H}J_{H} integrado fuera del locus IgG de ratón se
descubrió que producían ARNm que presentaba la región
V_{H}D_{H}T_{H} del transgén correctamente empalmada a la
región C_{H} endógena. Al igual que con la recombinación
S-S, la frecuencia de trans-splicing
es reducida, y los factores que regulan ambos mecanismos no se
conocen bien.
El valor y el potencial de los anticuerpos como
reactivos diagnósticos y terapéuticos ha sido reconocido desde hace
mucho tiempo en la técnica. Por desgracia, el campo se ha visto
obstaculizado por los lentos y tediosos procedimientos necesarios
para producir grandes cantidades de un anticuerpo de una
especificidad deseada. Las técnicas clásicas de fusión celular
permiten la producción eficiente de anticuerpos monoclonales
mediante la fusión de células B que producen el anticuerpo con una
línea celular inmortalizada. La línea celular resultante se
denomina línea celular de hibridoma. Sin embargo, la mayoría de
estos anticuerpos monoclonales se producen en sistemas murinos y son
reconocidos como proteínas "foráneas" por el sistema
inmunológico humano. De esta manera, el sistema inmunológico del
paciente induce una respuesta contra los anticuerpos, que resulta en
la neutralización y eliminación de los anticuerpos, y/o de los
efectos secundarios potencialmente graves asociados a la respuesta
inmunológica anti-anticuerpo.
Un enfoque de este problema ha sido desarrollar
anticuerpos monoclonales humanos o "humanizados", que no
resultan fácilmente "reconocidos" como epítopos foráneos, y
evitan una respuesta inmunológica anti-anticuerpo en
el paciente.
Las aplicaciones de anticuerpos monoclonales
producidos por hibridomas de células B humanas presentan un
potencial prometedor en el tratamiento del cáncer, de infecciones
microbianas y víricas, de inmunodeficiencias de células B asociadas
a una producción de anticuerpos anormalmente reducida, enfermedades
autoinmunológicas, inflamación, rechazo del trasplante y otros
trastornos del sistema inmunológico, y otras enfermedades. Sin
embargo, siguen existiendo diversos obstáculos al desarrollo de
estos anticuerpos monoclonales humanos. Por ejemplo, muchos
antígenos tumorales humanos pueden no ser inmunogénicos en el ser
humano y de esta manera puede resultar difícil aislar células B
humanas que produzcan anticuerpos contra antígenos humanos.
Los intentos para resolver los problemas
asociados a los anticuerpos en la terapia humana han aplicado
técnicas de ADN recombinante. La mayoría de estos esfuerzos se han
centrado en la producción de anticuerpos quiméricos con una región
C_{H} humana y con regiones (variables) no humanas (por ejemplo
murinas) de unión a antígeno. Estos anticuerpos quiméricos
generalmente se producen mediante clonación de la región variable
y/o región constante del anticuerpo deseado, combinando las
secuencias clonadas en un solo constructo codificante de la
totalidad o de parte de un anticuerpo quimérico funcional con las
regiones variable y constante deseadas, introduciendo el constructo
en una célula capaz de expresar anticuerpos, y seleccionar las
células que expresan establemente el anticuerpo quimérico.
Alternativamente, el anticuerpo quimérico se produce mediante la
clonación de la región variable o región constante deseada,
introduciendo el constructo en una célula productora de anticuerpos,
y seleccionando las células quiméricas productoras de anticuerpos
que resultan de la recombinación homóloga entre la región variable
deseada y la región variable endógena, o la región constante deseada
y la región constante endógena. Son ejemplos de técnicas que se
basan en técnicas de ADN recombinante tales como las descritas
anteriormente para producir anticuerpos quiméricos se describen en
la publicación de patente PCT nº WO 86/1533 (Neuberger et
al.) y en las patentes US nº 4.816.567 (Cabilly et
al.) y nº 5.202.238 (Fell et al.). Estos
procedimientos requieren transferir ADN de una célula a otra,
separándolo de esta manera de su locus natural, por lo que requieren
una manipulación in vitro cuidadosa del ADN que garantice que
el constructo final codificante de anticuerpo sea funcional (por
ejemplo que sea capaz de transcribirse y de traducirse en el
producto génico deseado).
Existe una clara necesidad en la técnica de un
procedimiento para producir una proteína o anticuerpo deseado que no
requiera múltiples etapas de clonación, mediante una recombinación
homóloga más eficiente que la convencional, y que pueda llevarse a
cabo en células de hibridoma.
La presente invención proporciona un
procedimiento de sustituir una secuencia de ADN por otra utilizando
regiones de cambio de clase (S) derivadas de un gen de
inmunoglobulina (Ig). El procedimiento de la invención permite que
dos trozos cualesquiera de ADN se "cambien de clase", o
insertar un trozo de ADN exógeno en un sitio que contiene una región
S natural o artificial. De esta manera, el procedimiento de la
invención permite que se produzca la recombinación directa y elimina
muchas etapas de clonación requeridas por los procedimientos
actuales de ADN recombinante.
En el procedimiento de la invención, se produce
la recombinación dirigida entre un constructo de reconocimiento y un
locus diana. El constructo de ácidos nucleicos de reconocimiento
comprende:
- a)
- una sola región de cambio;
- b)
- un promotor heterólogo respecto a la región de cambio, en el que el promotor se encuentra ligado operablemente y en dirección 5' respecto a la región de cambio; y
- c)
- una secuencia modificante heteróloga operablemente ligada y en dirección 3' respecto a la región de cambio, en la que la secuencia modificante codifica una región constante de una cadena pesada de anticuerpo humano en la que la región constante se selecciona de entre C\gamma, C\mu, C\alpha, C\delta y C\varepsilon.
Por ejemplo, un ADN exógeno codificante de la
región constante o variable de una cadena ligera o pesada de
anticuerpo puede intercambiarse con la región constante o variable
de una secuencia endógena para crear una secuencia que codifique un
anticuerpo con una región constante o variable diferente. En un
sentido más amplio, el procedimiento de la invención resulta
ampliamente aplicable para manipular secuencias de ADN para la
producción de una proteína o componente de proteína deseados,
incluyendo la producción de anticuerpos quiméricos con una región
variable deseada ligada a un polipéptido no anticuerpo (por ejemplo
un marcaje polipéptido detectable, o un polipéptido con una
actividad deseada).
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la recombinación dirigida mediada por cambio de
clase, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- a)
- introducir un constructo de reconocimiento en una célula B o en un hibridoma de célula B, en el que el constructo de reconocimiento comprende una región de cambio de clase del constructo de reconocimiento, y un promotor (P_{1}) operablemente ligado y en dirección 5' respecto a la región de clase del constructo de reconocimiento, y
- en la que la célula comprende un locus diana que comprende una región de cambio de locus diana, una secuencia diana contigua y en dirección 3' respecto a la región de cambio del locus diana, y un promotor (P2) operablemente situado dentro del locus diana para proporcionar la transcripción de la región de cambio del locus diana y la secuencia diana; y
- b)
- cultivar la célula para permitir la transcripción del locus diana y del constructo de reconocimiento, promoviendo de esta manera la recombinación entre la región de cambio del locus diana y la región de cambio del constructo de reconocimiento; y
- c)
- seleccionar una célula que comprende un locus diana modificado que comprende el promotor constructo de reconocimiento P_{1}, una región de cambio, y la secuencia diana,
en la que P_{1}, la región de cambio, y la
secuencia diana se encuentran operablemente ligados y en la que la
secuencia diana se encuentra bajo el control de P_{1}.
En otra realización, el constructo de
reconocimiento (P_{1}-S_{1}-M)
está compuesto de un promotor (P_{1}), una región de cambio
(S_{1}), y una secuencia modificante (M), y el locus diana
(P_{2}-S_{2}-T) está compuesto
de un promotor (P_{2}), una región de cambio de origen natural o
insertada artificialmente (S), y una secuencia diana (T). La
recombinación S-S dirigida entre las regiones
S-S resulta en dos posibles secuencias de producto
de recombinación, una región de cambio que contiene secuencias de
ADN de una o ambas regiones S1 y S_{2}, y la secuencia T
(P_{1}-S_{1}/S_{2}-T), y una
segunda secuencia con un promotor P_{2}, una región de cambio que
contiene secuencias de ADN de una o ambas regiones S_{1} y
S_{2}, y la secuencia M
(P_{1}-S_{1}/S_{2}-M). En la
presente realización, las células que expresan la secuencia M se
seleccionan mediante procedimiento conocidos de la técnica,
incluyendo análisis de transferencia southern y
northern.
northern.
En una tercera realización, el constructo de
reconocimiento
(P_{1}-Z-S_{1}-M)
está compuesto de un promotor (P_{1}), secuencias de ADN en
dirección 5' respecto a la región de cambio (Z), la región de cambio
(S_{1}) y una secuencia modificante (M). El locus diana
(P_{2}-S_{2}-T) está compuesto
de un promotor (P_{2}), una región de cambio de origen natural o
insertada artificialmente (S_{2}), y una secuencia diana (T). La
recombinación S-S dirigida entre las regiones de
cambio resulta en una secuencia de ADN con el promotor P_{1} del
constructo de reconocimiento, las secuencias de ADN de Z, una región
de cambio que contiene secuencias de ADN de una o ambas regiones de
cambio, y la secuencia T o M
(P_{1}-Z-S_{1}/S_{2}-T
o
P_{1}-Z-S_{1}/S_{2}-M).
El locus diana es una secuencia de ADN con una
región de cambio, y puede ser una secuencia nativa, de origen
natural (por ejemplo un locus de Ig o una célula productora de
anticuerpos), un locus de Ig reorganizado, o una secuencia de ADN
producida recombinantemente insertada artificialmente en un sitio
deseado. El locus diana puede ser un elemento extracromosómico o un
elemento cromosómico integrado establemente. Preferentemente, el
locus diana codifica un gen de cadena pesada de anticuerpo. El
constructo de reconocimiento es un elemento extracromosómico o un
elemento cromosómico establemente integrado. En el caso de que el
locus diana es un gen de cadena pesada de anticuerpo, la secuencia
modificante del constructo de reconocimiento preferentemente
codifica una región constante de cadena pesada diferente o
modificada o una secuencia de interés no de anticuerpo (por ejemplo
un marcaje polipéptido detectable, un enzima, una toxina, o un
factor de crecimiento).
La invención proporciona un procedimiento para
modificar una secuencia de ADN mediante recombinación
S-S dirigida. La invención permite dirigir la
recombinación de ADN a cualquier sitio que contenga una región de
cambio de origen natural o una región de cambio sintética,
incluyendo un sitio en el que se ha insertado artificialmente una
región S.
La invención proporciona un procedimiento para
sustituir o modificar una primera secuencia de ADN (una secuencia
diana) con una segunda secuencia de ADN (una secuencia modificante)
sin la necesidad de aislar la secuencia de nucleótidos que contiene
la secuencia diana, extraer la secuencia diana, y ligar la secuencia
modificante en lugar de la secuencia diana. La invención también
proporciona un procedimiento para sustituir partes de una secuencia
codificante de polipéptido con una secuencia de aminoácidos
heteróloga, en la que el polipéptido está compuesto de dos
componentes diferentes (por ejemplo un componente
N-terminal y un componente
C-terminal) que, por ejemplo, proporcionan
características funcionales o estructurales diferentes al
polipéptido (por ejemplo unión a ligandos o unión a células). Por
ejemplo, la invención permite la sustitución de la parte
N-terminal con una secuencia codificante de
aminoácidos heteróloga diferente, o la parte
C-terminal, con una secuencia codificante de
aminoácidos heteróloga diferente.
La recombinación dirigida mediada por una región
de cambio permite que se produzca la recombinación en una región
preseleccionada específica con una eficiencia incrementada respecto
al mecanismo natural, que se limita a la cadena pesada de la
inmunoglobulina. El procedimiento de la invención separa la
recombinación mediada por cambio de clase de las limitaciones de su
ambiente regulador normal, permitiendo controlar la recombinación
según resulte necesario mediante, por ejemplo, la utilización de
promotores constitutivos o inducibles.
La capacidad de conseguir la recombinación
dirigida in vitro mediada por S evita la manipulación tediosa
y laboriosa del ADN mediante técnicas de ADN recombinante
convencionales, proporcionando simultáneamente un procedimiento
altamente eficiente de inserción de una secuencia de ADN. Por
ejemplo, el procedimiento permite intercambiar fácilmente la parte
de marcaje detectable de las proteínas de fusión (por ejemplo la
\beta-galactosidasa) por una secuencia de
aminoácidos diferente (por ejemplo la fosfatasa alcalina).
En una aplicación específica del procedimiento
de la invención, se utiliza la recombinación S-S
dirigida para sustituir la región constante de un gen de cadena
pesada de anticuerpo por una región constante modificada o diferente
sin necesidad de manipulación extensiva del gen de cadena pesada del
anticuerpo. Además, el procedimiento de la invención permite
mantener el gen de anticuerpo en su locus nativo.
Éste y otros objetivos, ventajas y
características de la presente invención resultarán evidentes a los
expertos en la materia tras la lectura de los detalles de las
composiciones, componentes de las composiciones, procedimientos y
etapas de los procedimientos de la invención, tal como se
proporcionan posteriormente.
La fig. 1 es un esquema que muestra la
estructura básica de inmunoglobulina.
La fig. 3B es un esquema que muestra los
componentes básicos de un constructo de reconocimiento consistente
de secuencias de promotor (P_{1}), de región de cambio (S_{1}) y
modificantes.
La fig. 3D es un esquema que muestra los
componentes básicos de un constructo de reconocimiento consistente
de un promotor (P_{1}), secuencias de ADN situadas en dirección 3'
respecto al promotor y 5' respecto a la región de cambio (Z), a la
región de cambio (S_{1}) y a las secuencias modificantes, que
puede incluir componentes adicionales, tales como un gen marcador
seleccionable y/o un gen de amplificación.
La fig. 4B es un esquema que ilustra la
recombinación mediada por cambio de clase entre el constructo de
reconocimiento P_{1}-S_{1}-M y
el locus diana
P_{2}-S_{2}-T.
La fig. 5 es un esquema de un constructo de
reconocimiento dirigido de la invención (pTSW-1.4)
con el locus \gamma2_{ }humano de 23 kb completo (elementos de
control 5', exón I, regiones de cambio, secuencias codificantes,
exones de membrana y secretorios, pplyA), secuencia intensificadora
3' de ratón, casete de promotor/intensificador del CMV, y marcador
seleccionable SV2 para higromicina.
La fig. 6 es un esquema de un constructo de
reconocimiento de la invención (pTSW-1.9) con los
elementos que se describen en la leyenda de la fig. 5, con el casete
de promotor/intensificador del CMV en la orientación contraria a la
presente en pTSW-1.4.
La fig. 7 es un esquema de un constructo de
reconocimiento de la invención (pTSW-2) con un
fragmento BamHI de 12 kb clonado a partir del clon de línea germinal
\gamma2 humano de 23 kb (que incluye regiones de cambio y el marco
de lectura abierto \gamma2 humano; el exón I y los elementos de
control 5' no se encuentran incluidos), el casete de
promotor/intensificador del CMV proporciona el sitio donador de
empalme, y el marcador seleccionable SV2 para higromicina; el
intensificador 3' de ratón no se encuentra incluido.
La fig. 8 es un esquema de un constructo de
reconocimiento de la invención (pTSW-3.1) con 10 kb
de fragmento de región de cambio genómico \gamma1 de ratón
HindIII-EcoRI clonado (elementos de control 5', exón
I, y secuencias de cambio \gamma1 de ratón), casete de promotor
del CMV (casete promotor SFFV en la serie de
pTSW-3.2), un clon genómico del marco de lectura
abierto de \gamma2 humano y aceptor de empalme, marcador
seleccionable SV2 para higromicina, y opcionalmente la secuencia
intensificadora 3' de ratón.
La fig. 9 es un esquema de un constructo de
reconocimiento de la invención (pTSW-3.1BgIII) con
un fragmento de cambio genómico \gamma1 de ratón
BgIII-EcoRI de 7,9 kb (secuencias de exón I y de
cambio \gamma1 de ratón; los elementos de control 5' no se
encuentran incluidos), casete promotor del CMV (casete promotor del
SFFV en la serie de pTSW-3.2), clon genómico del
marco de lectura abierto \gamma2 humano y aceptor de empalme,
marcador seleccionable SV2 para higromicina, y opcionalmente la
secuencia intensificadora 3' de ratón.
Debe indicarse que, tal como se utiliza en la
presente especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las
formas singulares "un", "una", "el" y "la"
incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique
claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia
a "una secuencia de ADN" incluye una pluralidad de secuencias
de ADN y diferentes tipos de secuencias de ADN.
A menos que se define de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos en la presente memoria presentan el
mismo significado que el entendido habitualmente por un experto
ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención.
Aunque puede utilizarse cualquier material o procedimiento similar o
equivalente a aquellos indicados en la presente memoria, en la
práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se
describen los procedimientos y materiales preferentes. Las
publicaciones comentadas anteriormente se proporcionan únicamente
para su exposición previamente a la fecha de presentación de la
presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse
como un reconocimiento de que el inventor no está capacitado para
anticipar dicha descripción en virtud de una invención anterior.
El término "artificial" tal como se
utiliza en "constructo artificial" o "región de cambio
artificial" y similares, se refiere a un material aislado natural
o de origen natural, por ejemplo una secuencia de nucleótidos
preparada mediante la intervención humana, por ejemplo mediante la
fusión de secuencias naturales o la síntesis química de secuencias
naturales aisladas.
La expresión "región de cambio" se
refiere a una secuencia de nucleótidos compuesta de secuencias de
repetición en tándem que se encuentran naturalmente en dirección 5'
respecto a la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y
que funcionan en el cambio de clases intracromosómico, es decir, la
recombinación de secuencias de ADN codificantes de partes
específicas de regiones constantes de cadena pesada de
inmunoglobulina. Se dan a conocer ejemplos de secuencias específicas
de región de cambio en Mills et al., J. Immunol.
155:3021-3036, 1995, incorporadas específicamente
en la presente memoria como referencia. Entre las "regiones de
cambio" se incluyen tanto las secuencias de cambio de longitud
completa de secuencias de inmunoglobulina nativa, así como las
secuencias de nucleótidos recombinantes y sintéticas que se
encuentran modificadas (por ejemplo que contienen sustituciones,
adiciones, mutaciones y/o otras modificaciones de nucleótidos)
respecto a la región de cambio de la inmunoglobulina nativa, con la
condición de que la región de cambio conserva su función en la
facilitación de la recombinación cuando se transcribe.
La expresión "recombinación mediada por una
región de cambio" o "recombinación S-S
dirigida" se utilizan intercambiablemente para referirse a la
recombinación de ADN intercromosómica, intracromosómica o
extracromosómica facilitada por una región de cambio. Por ejemplo,
la recombinación S-S resulta de la interacción entre
1) una primera región de cambio situada 3' respecto a un promotor
(constructo de reconocimiento) y 2) una segunda región de cambio
situada 3' respecto a un promotor y 5' respecto a una secuencia de
ADN (locus diana). Tras la activación de la transcripción de la
primera y segunda regiones de cambio, se produce la recombinación
entre las regiones de cambio, resultando en una alteración de la
secuencia de ADN del locus diana. La recombinación
S-S dirigida de la invención resulta en la
interacción entre secuencias de ADN en dos cromosomas diferentes, en
el mismo cromosoma, entre un cromosoma y un elemento
extracromosómico, o entre dos elementos extracromosó-
micos.
micos.
La expresión "constructo de reconocimiento"
se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que se introduce en
una célula para causar la recombinación S-S en una
región de cambio natural o artificial. Un constructo de
reconocimiento como mínimo comprende: 1) una región de cambio, y 2)
un promotor operablemente ligado y en dirección 5' respecto a la
región de cambio. Opcionalmente, el constructo de reconocimiento
comprende además: 3) una secuencia modificante operablemente ligada
y en dirección 3' respecto a la región de cambio. El constructo de
reconocimiento también puede comprender: 4) una o más secuencias de
ADN entre la región de cambio y el promotor. Dependiendo del
constructo de reconocimiento utilizado, el ARNm resultante
codificará la región de cambio, o la región de cambio y la secuencia
modificante, o las secuencias de la región de cambio y de ADN entre
la región de cambio y/o una secuencia modificante.
La expresión "locus diana" se refiere a una
secuencia de ácidos nucleicos que comprende como mínimo: 1) una
región de cambio, 2) una secuencia diana contigua y en dirección 3'
respecto a la región de cambio, y 3) un promotor operablemente
situado en el locus diana para proporcionar la transcripción de la
región de cambio y la secuencia diana como uno o más ARNm
traducibles. El locus diana además puede contener una secuencia de
ADN adicional situada contiguamente y en dirección 5' respecto a la
región de cambio; en estos constructos, el promotor permite la
transcripción de la secuencia de ADN adicional, la región de cambio,
y la secuencia diana en forma de uno o más ARNm traducibles. Los
"loci diana" pueden ser de origen natural (por ejemplo un gen
de inmunoglobulina compuesto de una región VDJ reorganizada situada
5' respecto a una región de cambio y un gen CH) o producida
recombinante o sintéticamente, y puede encontrarse situada
cromosómica o extracromosómicamente. Un ejemplo de secuencia diana
comprende una secuencia de promotor situada operativamente 5'
respecto a una región de cambio situada operativamente 5' respecto a
una secuencia codificante que preferentemente es una secuencia
codificante de una región constante de un anticuerpo humano.
La expresión "secuencia diana" se refiere a
la secuencia de ácidos nucleicos contigua a una región de cambio en
la que tiene lugar la recombinación S-S dirigida. En
una realización del procedimiento de la invención, se sustituye una
secuencia diana por la secuencia modificante tras la recombinación
mediada por una región de cambio. Las "secuencias diana"
pueden ser secuencias de origen natural endógenas a una secuencia
cromosómica o secuencias recombinantes (es decir, una secuencia
producida utilizando manipulación genética recombinante) presentes
en forma de elemento extracromosómico (por ejemplo un vector) o en
forma de elemento establemente integrado dentro de una secuencia
cromosómica. Las secuencias diana son contiguas a una región de
cambio que puede ser una región de cambio de origen natural o puede
ser una región de cambio insertada en dirección 5' respecto a una
secuencia diana deseada mediante tecnología de ADN recombinante. Las
secuencias diana ejemplares son diferentes de la secuencia
modificante e incluyen secuencias codificantes de una región
constante de cadena pesada de inmunoglobulina de un isotipo, subtipo
y/o origen particulares.
La expresión "locus de inmunoglobulina
(Ig)" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la
totalidad o parte de la región constante y/o región variable de una
molécula de anticuerpo, incluyendo la totalidad o partes de las
secuencias reguladoras que controla la expresión de una molécula de
anticuerpo a partir del locus o sus procesos. Entre los genes de
cadena pesada en los locis Ig se incluyen, aunque sin limitarse a
ellos, la totalidad o una parte de V_{H}, D_{H}, J_{H} y las
regiones constantes, así como las regiones de cambio, las secuencias
intrónicas, y las secuencias flanqueantes asociadas o contiguas al
gen de cadena pesada. Entre los locis de Ig para las cadenas ligeras
se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, V_{L}, J_{L} y las
regiones constantes de los alelos tanto kappa como lambda,
secuencias intrónicas, y secuencias flanqueantes asociadas o
contiguas al gen de cadena ligera.
La expresión "locus diana modificado" se
refiere a una secuencia de ácidos nucleicos modificada mediante
recombinación de ADN mediada por cambio de clase de manera que la
secuencia diana modificada se encuentra compuesta como mínimo de una
región de cambio compuesta de secuencias de cambio derivadas de la
región de cambio del locus diana no modificada, o tanto del locus
diana no modificado como del constructo de reconocimiento. En una
realización del a invención, el locus diana modificado también está
compuesto del promotor de la secuencia diana no modificada (cuando
se encuentra presente en el locus diana original) y de la secuencia
modificante del constructo de reconocimiento. La activación de la
transcripción por parte del promotor resulta en la transcripción de
la primera secuencia de ADN, de la región de cambio, y de la
secuencia modificante en uno o más ARNm traducibles.
El término "promotor" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que, cuando se encuentra operablemente
ligada a una secuencia de ADN de interés, promueve la transcripción
de esa secuencia de ADN.
La expresión "marcaje de polipéptido
detectable" se refiere a una secuencia de aminoácidos que, cuando
se encuentra unida covalentemente a otra secuencia de aminoácidos,
proporciona una secuencia heteróloga que puede detectarse con
facilidad. Por ejemplo, el polipéptido puede detectarse mediante la
unión de un anticuerpo específico de polipéptido, en virtud de una
actividad enzimática del polipéptido, o mediante la reacción del
polipéptido con un reactivo químico. Entre los marcajes polipéptido
detectables ejemplares se incluyen
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina,
peroxidasa de rábano picante, partes enzimáticamente activas de
estos enzimas, o cualquier secuencia de aminoácidos que resulte
inmunodetectable y sea heteróloga respecto a la secuencia de
aminoácidos con la que se encuentra asociada.
El procedimiento de recombinación dirigida
mediada por una región de cambio utiliza regiones de cambio (por
ejemplo aquéllas aisladas y derivadas a partir de un locus de
inmunoglobulina) para facilitar la recombinación en una secuencia de
ácidos nucleicos específica. La secuencia de ácidos nucleicos a la
que se dirige la recombinación S-S contiene una
región S y se denomina "locus diana", mientras que la secuencia
de ácidos nucleicos introducida que contiene una secuencia de región
S se denomina "constructo de reconocimiento". La transcripción
de cada región S permite que se produzca la recombinación
S-S entre las dos regiones de ADN preseleccionadas.
La presencia de un promotor seleccionado proporciona una
transcripción constitutiva o inducible, incrementando de esta manera
la frecuencia de las incidencias de recombinación
S-S.
Los componentes básicos de un locus diana
ejemplares adecuado para la utilización en la invención se ilustran
en la fig. 2A. Los componentes mínimos del locus diana son (de 5' a
3'): 1) un promotor (P2; en el que la flecha indica la dirección de
transcripción), 2) una región de cambio (S2), y 3) una secuencia
diana (T). Alternativamente, el locus diana puede contener además
una secuencia de AND adicional situada 3' respecto al promotor y 5'
respecto a la región de cambio (Y) (fig. 2B). Con independencia de
su composición, los componentes del locus diana se sitúan de manera
que el promotor activa la transcripción de la secuencia de ADN 5'
(opcional), la región de cambio, y la secuencia diana (opcional). El
locus diana puede ser una secuencia cromosómica natural endógena
(por ejemplo un locus de cadena pesada de Ig en el que la secuencia
de ADN 5' es un gen V_{H}D_{H}J_{H} y la secuencia diana es un
gen C_{H}) o una secuencia construida artificialmente (es decir,
una secuencia producida por recombinación o una secuencia sintética)
que se encuentra presente en forma de elemento extracromosómico (por
ejemplo un vector o un plásmido) o de integrante cromosómico
estable.
Los componentes básicos de un constructo de
reconocimiento ejemplar para la utilización en la invención se
ilustran en las figs. 3A-3D. Los componentes mínimos
del constructo de reconocimiento son (de 5' a 3'): 1) un promotor
(P1; en el que la flecha indica la dirección de transcripción), y 2)
una región de cambio (S) (fig. 3A). El constructo de reconocimiento
adicionalmente puede contener: 3) una secuencia modificante 3'
respecto a S (fig. 3B), y/o 4) una o más secuencias de ADN 5'
respecto a S (fig. 3C). Además, el constructo de reconocimiento
puede incluir un marcador seleccionable (fig. 3D). Los componentes
del constructo de reconocimiento se sitúan de manera que el promotor
activa la transcripción de las regiones de cambio y la secuencia
modificante. El constructo de reconocimiento normalmente es una
secuencia de ácidos nucleicos producida por recombinación o
sintéticamente, y puede utilizarse en el procedimiento de la
invención en forma de un elemento extracromosómico (por ejemplo un
plásmido o un vector) o en forma de un integrante cromosómico
estable. Entre las secuencias modificantes ejemplares se incluye el
gen C_{H} para la utilización en el cambio de isotipo (es decir,
la sustitución del gen C_{H} del locus diana por un gen C_{H} de
un isotipo o subtipo diferente).
El mecanismo exacto por el que se produce la
recombinación intracromosómica mediada por S (también denominada
recombinación S-S) en el fenómeno del cambio de
clase no se entiende por completo (para una revisión de este tema,
ver Coffman et al., Adv. Immunol. 54:229-71,
1993). Sin restringirse a ninguna teoría específica, la
recombinación natural mediada por S se ve desencadenada por la
transcripción simultánea de dos regiones de cambio intracromosómicas
(Xu y Stavnezer, Develop. Immunol. 1:11-17, 1990;
Rothman et al., Mol. Cell Biol.
10:1672-1679, 1990; Jung et al., Science
159:984-987, 1993). Por ejemplo, en una célula que
produzca el anticuerpo IgM, el gen de cadena pesada de IgM (que
incluye una región V_{H}D_{H}J_{H}, una región de cambio
(S\mu) y un gen C\mu) se transcribe y traduce
constitutivamente. El cambio de clase (por ejemplo a la producción
de IgG) se produce al transcribirse una segunda región de cambio
(por ejemplo S\gamma). La transcripción de una segunda región de
cambio se cree que se encuentra regulada por elementos de control
asociados a cada una de las regiones de cambio del locus CH. Cada
uno de estos elementos de control resulta activado por una
combinación diferente de señales celulares (es decir, una o más
señales celulares) normalmente asociadas a citoquinas que pueden
activarse, por ejemplo en una infección microbiana o inflamación
(por ejemplo citoquinas, tales como interleuquinas, interferones y
factor de necrosis tumoral). A su vez, la producción de señales
celulares se asocia a tipos específicos de infecciones e
inflamación. De esta manera, un tipo específico de infección o de
inflamación resulta en: 1) la producción de una combinación
específica de señales celulares, que a su vez determina: 2) cuál de
los elementos de control de región de cambio se activa y, como
resultado, 3) qué región de cambio se transcribe para estimular la
recombinación de su región CH asociada con las regiones S\mu y
C\mu constitutivamente transcritas, produciendo un isotipo de
anticuerpo específico diferente (Coffman et al.,
supra, 1993).
La presente invención utiliza regiones de cambio
para proporcionar un procedimiento para dirigir la recombinación a
sitios preseleccionados de interés de una manera que no se encuentra
controlada por los mecanismos reguladores celulares normales
descritos anteriormente. Tal como se ilustra en las figs.
4A-4C, la recombinación S-S dirigida
de la presente invención utiliza un constructo de reconocimiento que
contiene como mínimo una región de cambio (S_{1}) y un promotor
(P_{1}), y un locus diana que contiene una región de cambio
(S_{2}) y una secuencia diana (T) bajo el control de un promotor
(P_{2}), para facilitar la recombinación específica de sitio de
cambio mediada por las dos regiones de cambio transcripcionalmente
activadas. El producto de recombinación resultante como mínimo
contiene una región de cambio con secuencias de una o ambas regiones
de cambio, por ejemplo de S_{1} o de S_{1}/S_{2}. Cuando el
constructo de reconocimiento contiene un promotor P_{1} y S_{1},
el producto de recombinación deseado consiste del promotor P_{1},
la región de cambio, y la secuencia diana, ahora bajo el control de
P_{1} en lugar de P_{2} (fig. 4A). El producto de recombinación
deseado resulta reconocido de varias maneras conocidas por la
técnica, incluyendo PCR. Cuando P_{1} es un promotor inducible,
una célula que contiene el producto de recombinación deseado puede
resultar reconocida mediante la inducción de la transcripción.
Cuando el constructo de reconocimiento consiste de P_{1}, S_{1},
y una secuencia modificante, el producto de recombinación deseado
consiste del promotor P_{2}, la región de cambio, y la secuencia
modificante que sustituye la secuencia diana (fig. 4B). La región de
cambio puede contener secuencias de una o ambas regiones de cambio,
por ejemplo S_{1} o S_{1}/S_{2}. Cuando la secuencia
modificante codifica una proteína o un péptido, el producto de
recombinación deseado puede ser reconocido por la síntesis del
producto deseado. Cuando el constructo de reconocimiento consiste de
P1, secuencias de ADN 5' respecto a S1, y S1, el producto de
recombinación deseado contiene P1 y las secuencias de ADN 5'
respecto a la región S1 insertadas en el locus diana (fig. 4C). El
producto de recombinación deseado puede identificarse mediante una
diversidad de maneras, incluyendo la detección por PCR de la
presencia de la secuencias de ADN 5' y/o P1, o mediante tecnologías
de inmunodetección.
\newpage
Además, el constructo de reconocimiento puede
utilizarse para insertar un trozo de ADN 3' respecto a un locus
diana contenido en un cromosoma específico. En la presente
realización, el constructo de reconocimiento porta secuencias
homólogas que permiten la inserción en el cromosoma seleccionado
mediante recombinación homóloga. El cromosoma modificado resultante
contiene un ADN del constructo de reconocimiento en un sitio en
dirección 3' respecto al locus diana. La presente realización
resulta útil para la inducción de la recombinación intracromosómica
mediada por S.
El cambio de clase (o cambio de isotipo) resulta
cuando los linfocitos B que inicialmente expresaban IgM, cambian su
isotipo de cadena pesada de IgG, IgA o IgE al madurar. El cambio de
isotipo resulta de un suceso de recombinación de ADN por deleción en
el que la región constante C\mu de la cadena pesada, inicialmente
situada más abajo de la región V_{H}D_{H}J_{H}, se sustituye
por una región constante C\gamma, C\alpha o C\varepsilon
(Rabbitts et al., Nature 283:351, 1980; Davis et al.,
supra, 1980; Kataoka et al., supra, 1981).
Se han caracterizado varias regiones de cambio,
incluyendo las regiones de cambio murinas S\mu, S\varepsilon,
S\alpha, S\gamma_{3}, S\gamma_{1}, S\gamma_{2b} y
S\gamma_{2a} y la región de cambio S\mu humana, tales como
S\mu y S\gamma_{4} (Mills et al., J. Immunol.
155:3021-3036, 1995, incorporada específicamente en
la presente memoria como referencia). La región S\mu murina es de
aproximadamente 3 kb y puede dividirse en una región 3' con
secuencias [(GAGCT)nGGGGT]_{m}, en la que n=1 a 7 y
m=150 (Nikaido et al., supra, 1981) y una región 5' en
la que estos dos pentámeros se encuentran separados por la secuencia
de pentámero (C/T)AGGTTG (Marcu et al., supra,
1982). El locus S\mu humano es ligeramente diferente, en el
aspecto de que la secuencia de heptámero se encuentra distribuida
por toda la región (Takahashi et al., supra,
1982; Mills et al., supra, 1990). Aunque otras
regiones de cambio contienen mas patrones complejos de secuencia
repetida, todas las secuencias de cambio contienen múltiples copias
de las secuencias pentaméricas GAGCT y GGGGT (Nikaido et al.,
supra, 1982; Stanton et al., supra, 1982). Los
pentámeros ACCAG, GCAGC y TGAGC también se encuentran comúnmente en
regiones de cambio (Gritzmacher, supra, 1989). Además, la
repetición heptamérica (C/T)AGGTTG se encuentra presente en
abundancia en las secuencias de región de cambio y se encuentran
cerca de muchos, aunque no todos, los sitios de recombinación
mediados por región de cambio que se han caracterizado en
plasmacitomas e hibridomas (Marcu et al.,
supra, 1982).
Los loci murinos S\varepsilon y S\alpha
contienen secuencias de 40 pb y de 80 pb, respectivamente, que se
encuentran repetidas en tándem. Estas secuencias son homólogas a
S\mu, especialmente en áreas de las repeticiones que contienen el
pentámero GAGCT. Las regiones S\gamma tanto humanas como murinos
son mucho menos homólogas a S\mu que las regiones S\varepsilon
y S\alpha. La homología de las regiones murinas S\gamma a S\mu
se reduce con la distancia creciente 3' respecto a la región
variable
(S\gamma_{3}>S\gamma_{1}>S\gamma_{2b}>S\gamma_{2a}).
Las regiones S\gamma murinas están compuestas de repeticiones en
tándem de 49 pb o de 52 pb (S\gamma_{2a}) dentro de las cuales
se encuentran habitualmente las secuencias pentaméricas TGGGG, GCAGC
y ACCAG (Kataoka et al., supra, 1981; Mowatt et
al., supra, 1986; Nikaido et al., supra,
1982; Nikaido et al., supra, 1981; Stanton et
al., supra, 1982; Szurek et al., supra,
1985; Wu et al., supra, 1984).
Las regiones de cambio adecuadas para la
utilización en la invención pueden ser secuencias naturales, por
ejemplo una región de cambio clonada directamente a partir de un
locus Ig, preferentemente a partir de un locus de Ig murino o
humano. Alternativamente, la región de cambio puede ser una
secuencia producida sintética o recombinantemente. Las regiones de
cambio recombinantes pueden presentar la misma secuencia que una
región de cambio nativa de origen natural, o puede encontrarse
modificada (por ejemplo puede contener sustituciones, adiciones,
mutaciones y/o otras modificaciones de nucleótidos) respecto a una
región de cambio nativa, con la condición de que la región de cambio
conserve su función en la facilitación de la recombinación. Las
regiones de cambio recombinantes pueden diseñarse para que presentan
una secuencia de nucleótidos mínima necesaria para la recombinación
mediante por región de cambio al mismo nivel (o a un nivel inferior
pero aceptable) que una región de cambio nativa, o a un nivel
incrementado respecto a la recombinación promovida por una región de
cambio de tipo salvaje.
La recombinación mediada por una región de
cambio de la presente invención proporciona una eficiencia mejorada
de la recombinación S-S respecto al mecanismo
natural, así como un procedimiento ampliamente aplicable para
producir una proteína deseada. Esto se consigue, en parte, mediante
la utilización de promotores que proporcionan la transcripción
constitutiva o inducible del constructo de reconocimiento, del locus
diana, o de ambos el constructo de reconocimiento y el locus diana.
La eficiencia mejorada del procedimiento de recombinación mediada
por una región de cambio de la invención proporciona una frecuencia
de recombinación a un nivel superior al de la recombinación que se
produce naturalmente, es decir, una eficiencia mejorada entre 1% y
100%, más preferentemente, una mejora de 20% a 100%, y más
preferentemente una mejora de 50% a 100%.
Tal como se ha comentado anteriormente, los
constructos de reconocimiento de la invención se componen como
mínimo de: 1) una región de cambio, y 2) un promotor operablemente
ligado y en dirección 5' respecto a la región de cambio. Entre los
componentes opcionales adicionales del constructo de reconocimiento
se incluyen: 3) una secuencia modificante operablemente ligada y en
dirección 3' respecto a la región de cambio, incluyendo proteínas,
marcadores seleccionables, y/o elementos de control, y/o 4)
secuencias de ADN en dirección 3' respecto al promotor y 5' respecto
a la región de cambio. La activación transcripcional del promotor
resulta en la producción de uno o más ARNm traducibles.
El promotor del constructo de reconocimiento se
selecciona de acuerdo con el tipo celular en el que debe realizarse
la recombinación S-S dirigida (por ejemplo una
célula eucariótica o procariótica, normalmente una célula
eucariótica).
Debido a que la recombinación
S-S dirigida depende de la transcripción de las
regiones de cambio del constructo de reconocimiento y del locus
diana, el promotor del constructo de reconocimiento puede ser un
promotor constitutivo o inducible. Son bien conocidos de la técnica
promotores constitutivos y constitutivos fuertes adecuados para la
expresión del ADN en células procarióticas o eucarióticas. En el
caso de que la célula en la que debe tener lugar la recombinación
S-S dirigida sea una célula eucariótica, el promotor
puede ser el promotor de Ig de cadena pesada o un promotor vírico,
tal como de CMV, SV40, del virus del sarcoma de Moloney murino
(MMLV) y el promotor del virus formador de focos en el bazo (SFFV),
o un promotor inducible, tal como de MMTV y la
\alpha-inhibina.
La secuencia modificante puede ser cualquier
secuencia de ácidos nucleicos que resulte adecuada para sustituir
una secuencia diana en un locus diana. Por ejemplo, la secuencia
modificante puede estar compuesta de una secuencia de nucleótidos
que codifique un producto de traducción para sustituir la totalidad
o una parte de la secuencia diana. Por ejemplo, en el caso de que la
secuencia diana sea un gen C_{H}, la secuencia modificante puede
ser un gen C_{H} nativo diferente, un gen C_{H} modificado (por
ejemplo codificante de una función efectora alterada respecto al gen
C_{H} de tipo salvaje), o una región constante de cadena ligera
nativa o modificada. Alternativamente, la secuencia modificante
puede codificar un polipéptido no derivado de anticuerpo que
proporcione una función al polipéptido codificado por la secuencia
diana modificada. Por ejemplo, la secuencia modificante puede
codificar una toxina, hormona, factor de crecimiento o partes de los
mismos. La secuencia modificante también puede codificar un línker,
que proporciona enlaces covalentes o no covalentes entre otros
productos génicos de cadena pesada (por ejemplo modificados de
manera similar) o polipéptidos no anticuerpos (por ejemplo toxinas,
factores de crecimiento, hormonas u otro polipéptido biológicamente
importante u otra molécula). Todavía otro ejemplo de una secuencia
modificante es una secuencia de nucleótidos codificante de un
marcaje o etiqueta polipéptido detectable, por ejemplo,
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina,
peroxidasa de rábano picante o un polipéptido inmunodetectable al
que pueda unirse un anticuerpo para facilitar la detección y/o
aislamiento del polipéptido (por ejemplo mediante cromatografía de
inmunoafinidad).
Alternativamente, o adicionalmente, la secuencia
modificante puede contener secuencias reguladoras (por ejemplo un
promotor, elemento intensificador, un intrón, o un sitio de unión a
ribosoma) que pueda utilizarse para introducir secuencias
reguladoras en una posición 3' respecto a una región de cambio, o
para sustituir secuencias reguladoras ya presentes en la secuencia
diana. Por ejemplo, puede utilizarse la recombinación mediada por
una región de cambio para sustituir un promotor débil con un
promotor fuerte en un locus diana, en el que el promotor débil se
sitúa 3' o 5' respecto a la región de cambio del locus diana. Entre
las secuencias reguladoras ejemplares de interés particular en la
modificación de un locus de Ig se incluyen una secuencia
intensificadora de cadena pesada, una secuencia intensificadora de
cadena kappa, o un promotor derivado del MMLV, del virus del sarcoma
de Rous (RSV) o de SFFV.
El constructo de reconocimiento también puede
contener un gen de amplificación que permite amplificar el locus
diana modificado para proporcionar producto mediado por una región
de cambio. Existen varios genes de amplificación adecuados conocidos
de la técnica y que resultan útiles en la invención, por ejemplo el
gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR).
La secuencia modificante se selecciona de
acuerdo a una diversidad de factores, incluyendo la secuencia diana
que debe modificarse y/o la utilización diagnóstica o terapéutica
pretendida para el producto de recombinación resultante.
El constructo de reconocimiento puede contener
una secuencia de ADN adicional transcribible y traducible situada
operablemente entre el promotor y la región de cambio del locus
diana. Esta secuencia adicional puede codificar una parte
N-terminal del polipéptido codificado por el locus
diana. Por ejemplo, el constructo de reconocimiento puede codificar
un polipéptido V_{H}D_{H}J_{H} deseado. Tras la recombinación
dirigida con región de cambio con un locus diana codificante de un
locus de cadena pesada de Ig con un gen C_{H} deseado en la
secuencia diana, el producto de recombinación contiene la región
V_{H}D_{H}J_{H} deseada y la región codificante de C_{H}
deseada, con la región de cambio situada entre ellas.
El constructo de reconocimiento puede basarse en
cualquiera de entre una diversidad de vectores que son bien
conocidos de la técnica y que se encuentran disponibles
comercialmente (por ejemplo vectores pBR322, pACYC, plásmidos y
vectores víricos). El término "vectores" incluye cualquier
molécula de ADN o de ARN (autoreplicante o no) que puede utilizarse
para transformar o para transfectar una célula deseada. El
constructo de reconocimiento puede incluir otros componentes, tales
como un marcador seleccionable para facilitar el cribado y la
selección de células que contengan el constructo de reconocimiento
en forma de elemento extracromosómico o cromosómicamente integrado,
y/o para seleccionar las células que han experimentado con éxito
recombinación S-S dirigida, por ejemplo un marcador
seleccionable asociado a la secuencia modificante que se recombina
en el locus diana además de la secuencia modificante. Entre los
genes marcadores seleccionables adecuados se incluyen los genes
codificantes de un marcador detectable (por ejemplo la
\beta-galactosidasa) o genes de resistencia a
fármacos, por ejemplo resistencia a la higromicina (hyg),
guanosínfosforiltransferasa (gpf), resistencia a la neomicina (neo),
dihidrofolato reductasa (DHFR), resistencia a la puromicina (spf) y
a la ampicilina (Amp). El constructo también puede incluir un origen
de replicación para la replicación estable del constructo en una
célula bacteriana (preferentemente un origen de replicación de
elevado número de copia), una señal de localización nuclear, u otros
elementos que faciliten la producción del constructo de ADN, de la
proteína codifica en el mismo, o ambos. Para la expresión en
eucariotas, el constructo también puede incluir un gen de
amplificación, que puede incrementar los niveles de expresión del
ADN de interés, particularmente en el caso de que el ADN de interés
sea un ADNc (por ejemplo que no contenga intrones de la secuencia
de origen natural). Puede utilizarse cualquiera de entre una
diversidad de genes de amplificación conocidos de la técnica,
incluyendo DHFR.
Tal como se ha comentado anteriormente, un locus
diana adecuado para la utilización en el procedimiento de la
invención está compuesto como mínimo de: 1) una región de cambio, 2)
una secuencia de ADN diana contigua y en dirección 3' respecto a la
región de cambio, y 3) un promotor situado operablemente en el
constructo para proporcionar la transcripción de la región de cambio
y de la secuencia diana en forma de molécula de ARNm. El locus diana
puede contener además una secuencia de ADN adicional situada
contiguamente y en dirección 5' respecto a la región de cambio; en
estos constructos, el promotor proporciona la transcripción de la
secuencia de ADN adicional, la región de cambio, y la secuencia
diana en forma de uno o más ARNm traducibles.
En general, los loci diana adecuados para la
utilización con los constructos de reconocimiento de la invención
pueden ser cualquier secuencia que contenga región de cambio en la
que ésta se transcriba y pueda facilitar la recombinación mediada
por la región de cambio. El locus diana puede ser cualquier
secuencia cromosómica endógena nativa que contenga una región de
cambio (por ejemplo un locus de cadena pesada de Ig).
Alternativamente, el locus diana puede ser una secuencia producida
artificialmente por recombinación, presente en forma de elemento
extracromosómico (por ejemplo de vector o de plásmido) o de elemento
integrado cromosómicamente. En una realización específica de la
invención, en el caso de que resulte deseable insertar una parte de
un constructo de reconocimiento en dirección 3' respecto a un locus
diana en el mismo cromosoma, el constructo de reconocimiento porta
secuencias homólogas que dirigen la recombinación a un sitio 3'
respecto al locus diana. Seguidamente, tiene lugar
intracromosómicamente la recombinación mediada por S, permitiendo de
esta manera la inducción controlada de la recombinación
intracromosómica.
El promotor del locus diana (P2) puede ser el
promotor presente en la secuencia nativa del locus diana de origen
natural, y/o la secuencia diana, o un promotor heterólogo respecto a
la secuencia del locus diana y/o respecto a la secuencia diana.
Debido a que la recombinación
S-S se encuentra asociada a la transcripción de la
región de cambio, el promotor del locus diana preferentemente
proporciona una expresión por lo menos de nivel bajo, más
preferentemente la expresión constitutiva, y todavía más
preferentemente, proporciona niveles elevados de expresión
constitutiva del locus diana, específicamente del ADN codificante de
la región de cambio. En el caso de que el promotor asociado al locus
diana proporcione niveles inadecuados o niveles indeseablemente
reducidos de transcripción de la región de cambio, el promotor del
locus diana nativo puede modificarse o sustituirse por un promotor
diferente utilizando la recombinación mediada por S u otros
procedimientos de recombinación bien conocidos de la técnica, por
ejemplo la clonación y la recombinación homóloga).
Tal como se ha comentado anteriormente, el locus
diana puede contener una secuencia de ADN adicional transcribible y
traducible situada operablemente entre el promotor y la región de
cambio del locus diana. Por ejemplo, la secuencias adicionales
pueden codificar una parte N-terminal del
polipéptido y el locus diana contiene una secuencia diana
codificante de la parte C-terminal de un
polipéptido. Tras la recombinación dirigida mediada por una región
de cambio, el locus diana modificado contiene las partes tanto
N-terminal como C-terminal del
polipéptido.
El locus diana puede incluir componentes
adicionales para facilitar la replicación en las células
procarióticas y/o eucarióticas, la integración del constructo en un
cromosoma eucariótico, y marcadoras para ayudar en la selección y/o
el cribado de células que contengan el constructo (por ejemplo
marcadores detectables y genes de resistencia a fármacos comentados
anteriormente para el constructo de reconocimiento). Para la
expresión en eucariotas, el constructo preferentemente además debe
contener una secuencia de poliadenilación situada 3' respecto al gen
que debe expresarse. La secuencia de señal de poliadenilación puede
seleccionarse de entre cualquiera de una diversidad de secuencias de
señal de poliadenilación conocidas en la técnica. Preferentemente,
la secuencia de señal de poliadenilación es la secuencia de señal de
poliadenilación temprana de SV40. La expresión del locus diana
también puede intensificarse mediante la inclusión de secuencias
intrónicas, tal como se ha comentado anteriormente para el
constructo de reconocimiento.
Un locus diana recombinante ejemplar de la
invención está compuesto de (de 5' a 3'): 1) un promotor, 2) un
primer sitio de clonación múltiple para la inserción de una
secuencia de ADN 5' respecto a la región de cambio, 3) una región de
cambio, y 4) un segundo sitio de clonación múltiple para la
inserción de una secuencia diana de ADN. Por ejemplo, en el caso de
que el locus diana sea un gen de cadena pesad de Ig recombinante, se
inserta una secuencia de ADN de V_{H}D_{H}J_{H} 5' respecto a
la región de cambio en el primer sitio de clonación múltiple, y la
secuencia diana es una región C_{H} insertada en el segundo sitio
de clonación.
Cualquier línea celular de mamífero capaz de
expresar el locus diana de interés resulta adecuada para la
utilización en la presente invención. Por ejemplo, en el caso de que
el locus diana sea un gen de cadena pesada de Ig, la línea celular
es cualquier célula de mamífero capaz de expresar un anticuerpo
funcional. De particular interés resulta la utilización del
procedimiento de recombinación mediado por una región de cambio de
la invención para facilitar el cambio de clase en las células
productoras de anticuerpo o en las células con potencial de
producción de anticuerpos (por ejemplo las células madre). Por
ejemplo, la línea celular puede ser una línea celular de hibridoma
que exprese anticuerpos humanos, una célula madre embrionaria (por
ejemplo una célula madre embrionaria murina), una línea celular de
hibridoma producida a partir de células B de un animal transgénico
(por ejemplo un ratón transgénico), o cualquier otra célula
(normalmente una célula de mamífero) capaz de expresar por lo menos
una parte funcional de un locus de cadena pesada de Ig o por lo
menos una parte funcional de un locus de cadena ligera de Ig. Un
ejemplo de una línea celular útil en el procedimiento de la
invención es una línea celular de hibridoma que expresa anticuerpos
humanos derivados de células B del xenomouse (Green et al.,
Nature Genetics 7:13, 1994, y la publicación de patente PCT nº WO
94/02602, ambas incorporadas específicamente en la presente memoria
como referencia). El xenomouse porta segmentos grandes de loci de
cadena pesada humana y cadena \kappa integrados en su línea
germinal, y además contiene alelos de cadena ligera kappa y de
cadena pesada de ratón funcionalmente inactivados. El xenomouse
produce células B que expresan la cadena pesada humana (h\mu) y la
cadena ligera K humana (mK) o la cadena ligera h\mu y la cadena
lambda de ratón (m\lambda). No se produce la coexpresión de
h\kappa y de m\lambda debido a que la expresión de una cadena
ligera excluye por completo la expresión del otro (Green et
al., supra, 1994). Tras la inmunización, el xenomouse
produce un amplio repertorio similar al del adulto de Ig humanos y
da lugar a anticuerpos monoclonales humanos
antígeno-específicos. El xenomouse permite la
generación de hibridomas de ratón que producen anticuerpos
monoclonales humanos específicos de antígeno. Los procedimientos
para la producción de líneas celulares de hibridoma son bien
conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, editores,
1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Los procedimientos para
producir líneas celulares que expresan anticuerpos humanos o
"humanizados" también son bien conocidos en la técnica (ver,
por ejemplo, las publicaciones de patente PCT nº WO 94/02602 y nº WO
91/10741).
En el caso de que la línea celular sea una línea
celular linfoide productora de anticuerpos, la línea celular puede
expresar el anticuerpo a partir de una secuencia genómica, de una
secuencia modificada, de una secuencia heteróloga modificada, o de
una secuencia quimérica (por ejemplo compuesta de secuencias de Ig
murino y humano). De esta manera, la línea celular puede ser, por
ejemplo, una línea celular de hibridoma murino que produce un
anticuerpo murino, humano o quimérico. La línea celular de hibridoma
puede producir anticuerpos humanos mediante, por ejemplo, la
expresión de genes de Ig humanos. En una realización, la célula es
una célula linfoide humana que produce un anticuerpo humano mediante
la expresión de genes de Ig humanos. En una variación de la
realización, el gen de región constante de la secuencia genómica es
un gen de región constante humana (hC_{H}), por ejemplo un gen
hC_{H} de la clase mu (hC_{H}\mu) y la secuencia modificante
es una región constante humana de la clase gamma
(hC_{H}\gamma).
La recombinación mediada por cambio de clase
utilizando el constructo o constructos de la invención puede
conseguirse de una diversidad de maneras. Por ejemplo: 1) el locus
diana puede ser de origen natural (localizado en un cromosoma) y el
constructo de reconocimiento puede utilizarse como elemento
extracromosómico o como elemento integrado cromosómicamente; o 2) el
locus diana puede ser una secuencia natural o producida
recombinantemente que se encuentra presente en forma de elemento
extracromosómico o integrado cromosómicamente, y el constructo de
reconocimiento puede utilizarse como elemento extracromosómico o
como elemento integrado cromosómicamente. Cuando el constructo de
reconocimiento y el locus diana se encuentran ambos integrados
cromosómicamente, se integran en el mismo cromosoma o en cromosomas
diferentes.
En la presente realización, la línea celular
utilizada para conseguir la recombinación dirigida mediada por
cambio de clase: 1) contiene un locus diana natural endógeno, o 2)
contiene un locus diana recombinante cromosómicamente integrado. Los
procedimientos de introducción de ADN en una célula huésped y la
selección de integrantes cromosómicos estables que contienen una
secuencia específica de ADN de interés son bien conocidos en la
técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; incorporada en la presente
memoria como referencia con respecto a los procedimientos y
composiciones para técnicas de ADN recombinante para proporcionar
una célula transformada que contenga un ADN de interés establemente
integrado, y la expresión del ADN de interés).
El constructo de reconocimiento puede
linearizarse, por ejemplo, mediante digestión con una o más
endonucleasas de restricción, y el ADN lineal introducirse en la
célula huésped utilizando cualquiera de entre una diversidad de
procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo electroporación,
microinyección, fusión de liposomas, fusiones de fantasmas de
glóbulos rojos, fusión de protoplasto, fusión de célula de levadura,
o cualquier otro procedimiento conocido de la técnica (ver, por
ejemplo, Sambrook et al., supra)). A continuación, el
vector lineal se integra en el genoma de la célula aleatoriamente o
específicamente mediante recombinación homóloga dirigida, y se
seleccionan los integrantes estables mediante, por ejemplo, la
expresión de un marcador seleccionable asociado con el constructo de
reconocimiento, o mediante la expresión de la secuencia modificante
en el constructo de recono-
cimiento.
cimiento.
La recombinación dirigida mediada por cambio de
clase se consigue mediante la transcripción simultánea de las
regiones de cambio en el locus diana y el vector de reconocimiento.
Las células que contienen el producto de recombinación, por ejemplo
el locus diana modificado, se identifican y se seleccionan mediante
la expresión del producto génico del locus diana modificado (por
ejemplo mediante reactividad de ELISA o separación celular activada
por fluorescencia (FACS)).
En la presente realización del procedimiento de
la invención, el constructo de reconocimiento se introduce en la
célula que contiene un locus diana integrado cromosómicamente
mediante procedimientos bien conocidos de la técnica (ver, por
ejemplo, Sambrook et al., supra, 1989). En contraste
con el procedimiento descrito inmediatamente antes, el constructo de
reconocimiento se mantiene como elemento extracromosómico durante un
tiempo suficiente para la transcripción de la región de cambio del
constructo de reconocimiento y la recombinación con la región de
cambio transcripcionalmente activa del locus diana. Las células que
contienen el producto de recombinación deseado, por ejemplo un locus
diana modificado, pueden identificarse y seleccionarse tal como se
ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante la selección para
la expresión de un marcador seleccionable asociado con la secuencia
diana integrada, o la detección de células que expresan el producto
génico deseado del locus diana
modificado.
modificado.
La detección de secuencias apropiadamente
recombinadas puede conseguirse de una diversidad de maneras,
dependiendo de la naturaleza del producto de recombinación deseado.
Por ejemplo, en el caso de que la secuencia modificante asociada con
un marcador seleccionable se recombine en el locus diana con la
secuencia modificante, un cribado inicial seleccionará aquellas
células que expresan el marcador. Puede utilizarse un segundo
cribado para determinar si las células resistentes a fármaco
expresan el locus diana apropiadamente modificado.
El procedimiento utilizado para el segundo
cribado varía según la naturaleza de la secuencia modificante
insertada en el locus diana. La secuencia modificante puede
detectarse utilizando como sonda una transferencia southern una
parte de la secuencia modificante, o la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando cebadores de amplificación derivados de
las regiones modificante y modificada. Las células con una secuencia
modificante apropiadamente integrada también pueden identificarse
detectando la expresión de un producto funcional del locus diana
modificado, por ejemplo mediante inmunodetección de la nueva región
C_{H} en un locus modificado de cadena pesada de anticuerpo.
Alternativamente, el producto de expresión del locus diana
modificado puede detectarse utilizando un bioensayo para detectar
una función efectora particular proporcionada por la secuencia
modificante. Por ejemplo, se analiza la expresión de la secuencia
modificante que codifica una molécula biológicamente activa, tal
como un enzima, una toxina, un factor de crecimiento, u otros
péptidos, para esa actividad biológica particular.
En el caso de que el locus diana sea un gen de
Ig, el producto del locus diana modificado también puede someterse a
ensayo para el reconocimiento del antígeno o ligando apropiado a
través de cualquier procedimiento convencional de cribado
inmunológico conocido en la técnica, por ejemplo ELISA, FACS,
ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, o
ensayos de inmunoprecipitación (ver, por ejemplo, Harlow y Lane,
supra).
Los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de
proporcionar a los expertos ordinarios en la materia una exposición
y descripción completas de cómo preparar y utilizar diversos
constructos y de cómo llevar a cabo los diversos procedimientos de
la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que
los inventores consideran su invención. A menos que se indique lo
contrario, las partes son en peso, la temperatura se expresa en
grados centígrados, y la presión es exacta o aproximadamente la
presión atmosférica. Se han realizado esfuerzos para garantizar la
exactitud de los números utilizados (por ejemplo la longitud de las
secuencias de ADN, los pesos moleculares, las cantidades, los
componentes particulares, etc.), aunque deberían justificarse
algunas desviaciones.
\newpage
Ejemplo
1
Todos los vectores generados se basaban en un
plásmido pACYC17 de número de copia reducido (NEB). El vector
pTSW-1.4 se generó a partir del plásmido
p1bYAC\deltaNot que contenía un fragmento genómico EcoRI de 23 kb
de la región de cambio \gamma2 humana entera, aislada de una
biblioteca genómica de placenta humana. Este fragmento contenía 2 kb
de secuencias codificantes, 12 kb de secuencias situadas más arriba,
incluyendo el exón I y la región de cambio \gamma2, y 9 kb de
secuencias situadas más abajo (Flanagan y Rabbitts, Nature
300:709-713, 1982). Este plásmido también contenía
el intensificador 3' de ratón (Dariavach et al., Eur. J.
Immunol. 21:1499-1504, 1991). El vector se modificó
para que contuviese un marcador seleccionable con higromicina y un
casete de promotor-intensificador del CMV humano,
que incluía en su extremo 3', secuencias de terminador procariótico
(indicado posteriormente). Las secuencias de terminador procariótico
se utilizaron para impedir que los transcritos procarióticos
fortuitos activasen las secuencias de cambio, y de esta manera las
desestabilizasen durante la clonación en bacterias (Mowatt y
Dunnick, J. Immunology 136:2674-2683, 1986). Se
confirmó que estas secuencias presentaban muy poco efecto sobre la
transcripción eucariótica.
El gen de la higromicina, controlado por el
promotor de SV40 (Giordano y McAllister, Gene
88:285-288, 1990) se clonó como fragmento
HindIII-BamHI de 1,7 kb a partir del plásmido
pUC219.TG76 y se insertó en sitios HindIII y BamHI en pACYC177,
generando el plásmido pACYC.hyg.
El terminador se sintetizó como
GCAT-GCCCGCGG-
GAATAGGCGGGCTTTTTTNNNGCCGCGGCTCGA
(SEC ID nº 1), con sitios SphI flanqueantes, y un sitio XhoI interno en el extremo 3', para fines de clonación. Esta secuencia se clonó en el sitio SphI del plásmido plK1.1Cat, más abajo de las secuencias de promotor-intensificador de CMV humano.
(SEC ID nº 1), con sitios SphI flanqueantes, y un sitio XhoI interno en el extremo 3', para fines de clonación. Esta secuencia se clonó en el sitio SphI del plásmido plK1.1Cat, más abajo de las secuencias de promotor-intensificador de CMV humano.
El casete de expresión del CMV, junto con las
secuencias de terminador, se clonaron como fragmento
HindIII-XhoI de 900 pb, que se introdujo en los
sitios HindIII y XhoI del plásmido pACYC.hyg indicado anteriormente,
generando pACYC.hyg.CMVt, en el que la orientación de transcripción
de CMV es opuesta a la del gen de resistencia a la higromicina.
El fragmento de 2,6 kb, que contenía casetes
tanto de resistencia a higromicina como de terminador de CMV, se
extrajo de pACYC.hyg.CMVt mediante digestión con BamHI y con XhoI.
Se convirtieron ambos extremos de este fragmento en sitios NotI
utilizando línkers, y el fragmento se clonó en el sitio único NotI
del plásmido p1bYAC\deltaNot que contenía 23 kb de secuencias de
\gamma2 humano e intensificador 3' de ratón. Se generó el plásmido
pTSW-1.4 (fig. 5), en el que la orientación de
transcripción de CMV era la misma que la de las secuencias
codificantes de \gamma2 humano. Se generó el plásmido
pTSW-1.9 (fig. 6) con orientación de transcripción
de CMV opuesta a la de las secuencias codificantes de \gamma2.
Se muestra en la fig. 5 un constructo de
reconocimiento ejemplar de la invención, denominado
pTSW-1.4. Se construyó pTSW-1.4 para
la utilización en la sustitución mediada por cambio de clase de un
gen constante de cadena pesada de Ig con un gen constante de cadena
pesada IgG2 humana (hCH\gamma2). El constructo
pTSW-1.4 contiene un promotor de CMV operablemente
ligado, en orientación 5' a 3', a la región de cadena pesada de IgG2
humana (aproximadamente 23 kb), que incluye el exón I de cadena
pesada IgG2 y sus secuencias 5' flanqueantes, la región de cambio de
IgG2 humana, el gen hCH\gamma2 humano completo, y las secuencias
flanqueantes de la región de cadena pesada IgG2. La región
hCH\gamma2 se une a un intensificador murino situado contiguamente
y en dirección 3' respecto al gen hCH\gamma2. El promotor de CMV
es un promotor constitutivo fuerte. Pueden utilizarse otros
promotores constitutivos en lugar del promotor de CMV (por ejemplo
SSFV, MMLV, MCV, RSV, SV40, etc.). Ambas regiones hCH\gamma2 han
sido clonadas y secuenciadas (Mills et al., supra,
1995). El intensificador 3' murino también es bien conocido de la
técnica (Dariavach et al., supra, 1991).
Ejemplo
2
Para generar el plásmido pTSW-2,
se clonó un fragmento BamHI de 13 kb a partir del fragmento genómico
EcoRI de \gamma2 humano en el plásmido p1bYAC\deltaNot, tal como
se describe en el Ejemplo 1, seguido de la reacción de relleno
parcial con Klenow para generar extremos de fragmento compatibles
con XhoI. Este clon se insertó en el sitio XhoI único del plásmido
pACYC.hyg.CMVt, que también se rellenó parcialmente con Klenow para
que el sitio fuese compatible con BamHI. Se seleccionó la
orientación correcta del clon, en el que la orientación de
transcripción de las secuencias codificantes de \gamma2 humano es
la misma que la del promotor de CMV.
En la fig. 7 se muestra otro constructo de
reconocimiento ejemplar de la invención, denominado
pTSW-2. Al igual que pTSW-1.4,
pTSW-2 se construye para la utilización en la
sustitución mediada por cambio de clase de un gen constante de
cadena pesada de Ig con un gen constante de cadena pesada IgG2
humana (hCH\gamma2). El constructo pTSW-2 se
preparó utilizando un promotor de CMV ligado operablemente, y en
orientación 5' a 3', a la región de cadena pesada IgG2 humana (de
aproximadamente 13 kb), incluyendo la región de cambio de IgG2
humana y 200 pb de secuencias 5' flanqueantes de la región de cambio
y el marco de lectura abierto de \gamma2 humana. Algunas de las
secuencias flanqueantes presentes en pTSW-1.4 no se
encuentran presentes en pTSW-2. El constructo
pTSW-2 también contiene el marcador seleccionable
SV2hyg y un terminador de transcripción procariótico (para
estabilizar la región de cambio). El constructo
pTSW-2 puede prepararse con o sin un intensificador
murino 3' respecto al gen hCH \gamma2.
Ejemplo
3
Para generar el plásmido
pTSW-3.1 (fig. 8), se clonaron 2 kb de las
secuencias codificantes de la \gamma2 humana mediante PCR a partir
de p1bYAC\deltaNot en forma de fragmento XhoI-SalI
(Ejemplo 1). Este fragmento se clonó en el sitio único XhoI en el
plásmido pACYC.hyg.CMVt, 3' respecto a las secuencias de terminador.
Se extrajeron secuencias de cambio \gamma1 de ratón en forma de
fragmento HindIII-EcoRI de 10 kb del plásmido
p-gamma-1/EH10.0 (Mowatt y Dunnick,
supra, 1986) y los extremos se convirtieron en XhoI y SalI,
respectivamente. El plásmido modificado se clonó 5' respecto a la
región \gamma2 humana a través del sitio XhoI único en
pACYC.hyg.CMVt. Se generó el plásmido pTSW-3.1dBGIII
(fig. 9) de manera similar a pTSW-3.1, excepto en
que se incluyeron secuencias de cambio \gamma1 de ratón
BgIII-EcoRI de 7,9 kb.
Se construyó pTSW-3.2 tal como
se ha descrito para pTSW-3.1, excepto en que se
sustituyó el casete promotor-intensificador de CMV
por el promotor del virus formador de focos en el bazo (SSFV).
Los plásmidos pTSW-3 contenían
sitios NotI y MluI únicos (convertidos con un línker a partir del
sitio BamHI único). Se utilizó HindIII para la linearización y para
la clonación del intensificador 3'.
En la fig. 8 se muestra un constructo de
reconocimiento ejemplar adicional de la invención, denominado
pTSW-3.1. Al igual que pTSW-1.4 y
TSW-2, se construyó pTSW-3.1 para la
utilización en la sustitución mediada por cambio de clase de un gen
constante de cadena pesada de Ig por un gen constante de cadena
pesada IgG2 humana (hCH_{\gamma 2}). Se preparó el constructo
pTSW-3.1 utilizando un promotor de CMV operablemente
ligado, y en orientación 5' a 3', a una región de cambio \gamma1
murina que puede contener también el exón I de \gamma2 de ratón y
secuencias flanqueantes, y una secuencia codificante de región
genómica constante hCH_{\gamma 1}, hCH_{\gamma 2} o hCH_{\gamma
4}, que incluye el punto de ramificación flanqueante 5' y el
aceptor de empalme. El constructo pTSW-3.1
opcionalmente puede contener además un elemento de control \gamma1
murino (mI\gamma1) situado contiguamente y en dirección 5'
respecto a la secuencia mS\gamma1. Alternativamente, la región de
cambio humana del gen \gamma1 (hS\gamma1) y sus secuencias 5'
flanqueantes, tales como el exón I (hI\gamma1) pueden utilizarse
en lugar de mI\gamma1 y mS\gamma1. En los constructos que no
contienen el exón I, se proporciona un sitio donador de empalme en
dirección 3' respecto a las secuencias del promotor. El constructo
pTSW-3.1 opcionalmente puede contener además un
intensificador 3' murino situado contiguamente y más abajo del gen
hCH \gamma y/o un terminador de transcripción eucariótico 3'
situado 3' y contiguamente al gen hCH \gamma. Cada uno de los
elementos del constructo pTSW-3 son bien conocidos
de la técnica (S_{\gamma 4}, S_{\mu} de ratón, Mills et
al., supra, 1991; S\gamma humana, Mills et al.,
supra, 1995; intensificador 3' de ratón, Dariavach et
al., supra, 1991). El constructo pTSW-3.1
también contiene el marcador seleccionable SV2\gamma2hyg y un
sitio de linearización HindIII. Pueden utilizarse otros marcadores
seleccionables, por ejemplo la resistencia a la piromicina.
Ejemplo
4
Tal como se ha comentado anteriormente, uno de
los problemas asociados a la producción de anticuerpos monoclonales
humanos es que la línea celular inmortal fusionada a las células B
humanas es de origen murino. Esto puede resultar en un suceso de
recombinación en el que el anticuerpo resultante presenta una región
variable humana (región variable de cadenas ligera y pesada humanas
(hV_{H}D_{H}J_{H})), pero presenta una región constante de
cadena pesada murina (mC_{H}\gamma) (ver la fig. 8). Se utiliza
la recombinación mediada por cambio de clase para sustituir el gen
mC_{H}\gamma por un gen de región constante de cadena pesada
humana (hC_{H}\gamma).
Se produjo una línea celular de hibridoma que
expresaba un anticuerpo IgG monoclonal contra antígenos, incluyendo
antígenos humanos, con una región variable de cadena pesada humana
(hV_{H}D_{H}J_{H}) y una región constante de cadena pesada
murina (mC_{H}\gamma), utilizando procedimientos bien conocidos
de la técnica (por ejemplo ver Green et al., supra,
1994). Se construyó un constructo de reconocimiento que contenía un
promotor operablemente ligado a una región de cambio y el gen
hC_{H}\gamma, tal como se ha descrito anteriormente. Cualquiera
de los vectores ejemplares indicados en los ejemplos anteriormente
(pTSW-1.4, pTSW-2 o
pTSW-3.1) resulta adecuado para la utilización en el
presente procedimiento. El constructo se linearizó, y el constructo
lineal se introdujo en la célula de hibridoma mediante, por ejemplo,
electroporación, lipofección u otros procedimientos conocidos de la
técnica. Las células de hibridoma transfectadas, que contenían
integrantes estables del constructo, se seleccionaron por su
capacidad para crecer en higromicina. A continuación, las células
resistentes a higromicina se cultivaron adicionalmente para permitir
la transcripción del constructo diana desde el promotor de CMV y el
suceso resultante de recombinación mediado por región de cambio.
Seguidamente se cribaron los cultivos de célula individual de
hibridoma para la expresión de hC_{H}\gamma2 mediante
amplificación del mensaje de anticuerpo recombinado o mediante la
utilización de un anticuerpo IgG2 antihumano en un ensayo ELISA de
tipo sándwich, o se aislaron mediante separación FACS.
Ejemplo
5
La recombinación mediada por cambio de clase
puede conseguirse en un ratón transgénico in vivode la manera
siguiente. El vector de reconocimiento se introduce como transgén en
un ratón productor de anticuerpos humanos y los anticuerpos
recombinados, producidos por células B de ratón o sus hibridomas
derivados, se criban tal como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Abgenix, Inc.
\hskip1cmJapan Tobacco, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Recombinación dirigida de ADN
mediada por cambio de clase
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB/FP5726534
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1996-03-20
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<160> 1
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<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a o g o c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgcccgc gggaataggc gggctttttt nnngccgcgg ctcga
\hfill45
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Claims (18)
1. Constructo artificial de reconocimiento de
ácidos nucleicos, que comprende:
- a)
- una sola región de cambio;
- b)
- un promotor heterólogo respecto a la región de cambio, en la que el promotor se encuentra ligado operablemente y en dirección 5' respecto a la región de cambio; y
- c)
- una secuencia modificante heteróloga operablemente ligada y en dirección 3' respecto a la región de cambio, en la que la secuencia modificante codifica una región constante de una cadena pesada de anticuerpo humano, en la que la región constante se selecciona de entre C\gamma, C\mu, C\alpha, C\delta y C\varepsilon.
2. Constructo de reconocimiento según la
reivindicación 1, que comprende además una secuencia de ADN
adicional situada 5' respecto a la región de cambio y 3' respecto al
promotor.
3. Constructo de reconocimiento según la
reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor
constitutivo.
4. Constructo de reconocimiento según la
reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor
inducible.
5. Constructo de reconocimiento según la
reivindicación 1, en el que el promotor se selecciona de entre un
promotor de citomegalovirus, un promotor de virus formador de focos
en el bazo (SFFV), un promotor de virus de sarcoma de Rous, un
promotor de SV40, y un promotor del virus Moloney murino.
6. Procedimiento para la recombinación dirigida
mediada por cambio de clase, comprendiendo el procedimiento las
etapas de:
- a)
- introducir un constructo de reconocimiento en una célula B o en un hibridoma de célula B, en el que el constructo de reconocimiento comprende una región de cambio de constructo de reconocimiento, y un promotor (P_{1}) operablemente ligados y en dirección 5' respecto a la región de cambio del constructo de reconocimiento, y
- en el que la célula comprende un locus diana que comprende una región de cambio del locus diana, una secuencia diana contigua y en dirección 3' respecto a la región de cambio del locus diana, y un promotor (P_{2}) operablemente situado dentro del locus diana para proporcionar la transcripción de la región de cambio del locus diana y de la secuencia diana; y
- b)
- cultivar la célula para permitir la transcripción del locus diana y del constructo de reconocimiento, promoviendo de esta manera la recombinación entre la región de cambio del locus diana y la región de cambio del constructo de reconocimiento; y
- c)
- seleccionar una célula que comprende un locus diana modificada que comprende el promotor P_{1} del constructo de reconocimiento, una región de cambio y la secuencia diana.
en el que P_{1}, la región de cambio, y la
secuencia diana se encuentran operablemente ligados y en el que la
secuencia diana se encuentra bajo el control de P_{1}.
7. Procedimiento para la recombinación dirigida
mediada por cambio de clase, comprendiendo el procedimiento las
etapas de:
- a)
- introducir un constructo de reconocimiento en una célula B o en un hibridoma de célula B, en el que el constructo de reconocimiento comprende una región de cambio de constructo de reconocimiento, y un promotor (P_{1}) operablemente ligados y en dirección 5' respecto a la región de cambio del constructo de reconocimiento, y una secuencia modificante operablemente ligada y en dirección 3' respecto a la región de cambio del constructo de reconocimiento,
- en el que la célula comprende un locus diana que comprende una región de cambio de locus diana, una secuencia diana contigua y en dirección 3' respecto a la región de cambio del locus diana, y un promotor (P_{2}) situado operablemente dentro del locus diana para proporcionar la transcripción de la región de cambio del locus diana y de la secuencia diana; y
- b)
- cultivar la célula para permitir la transcripción del locus diana y del constructo de reconocimiento, promoviendo de esta manera la recombinación entre la región de cambio del locus diana y la región de cambio del constructo de reconocimiento; y
- c)
- seleccionar una célula que comprende un locus diana modificado que comprende el promotor P_{2} del constructo de reconocimiento, una región de cambio, y la secuencia modificante,
en el que P_{2}, la región de cambio, y la
secuencia modificante se encuentran operablemente ligados.
8. Procedimiento para producir un anticuerpo
mediante recombinación mediada por cambio de clase, comprendiendo el
procedimiento las etapas de:
- a)
- introducir un constructo de reconocimiento en una célula B o en un hibridoma de célula B, en el que el constructo de reconocimiento comprende una región de cambio del constructo de reconocimiento (S_{1}), un promotor de constructo de reconocimiento operablemente ligados y en dirección 5' respecto a la región de cambio del constructo de reconocimiento, y una secuencia modificante operablemente ligada y en dirección 3' respecto a la región de cambio del constructo de reconocimiento, y
- en el que la célula expresa una cadena pesada de anticuerpo, y en el que la cadena pesada de anticuerpo expresada por la célula se encuentra codificada por un locus de cadena pesada de anticuerpo que comprende un promotor de locus de cadena pesada, una región variable de cadena pesada de anticuerpo operablemente ligados y en dirección 3' respecto al promotor, una región de cambio (S_{2}) contigua y en dirección 3' respecto a la región variable, y una región constante de cadena pesada de anticuerpo contigua y en dirección 3' respecto a la región de cambio,
- b)
- cultivar la célula para permitir la expresión de anticuerpo y la transcripción del constructo de reconocimiento, en el que la recombinación mediada por cambio de clase entre dichos S_{1} y S_{2} se encuentra promovida y en el que dicha región constante de cadena pesada de anticuerpo se sustituye con la secuencia modificante del constructo de reconocimiento; y
- c)
- seleccionar una célula que comprende un locus de cadena pesada modificada, comprendiendo el locus de cadena pesada modificada el promotor del locus de cadena pesada, la región variable de cadena pesada de anticuerpo, una región de cambio, y la secuencia modificante del constructo de reconocimiento, en el que el promotor de locus de cadena pesada, la región variable de cadena pesada, la región de cambio, y la secuencia modificante se encuentran operablemente ligadas.
9. Procedimiento para producir una cadena pesada
de anticuerpo modificada mediante recombinación mediada por cambio
de clase, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- a)
- introducir un constructo de reconocimiento en una célula B o hibridoma de célula B aislada que facilita la recombinación mediada por cambio de clase, en el que el constructo de reconocimiento comprende, en orden de 5' a 3' y operablemente ligados, un promotor de constructo de reconocimiento, una secuencia de región variable de cadena pesada de anticuerpo de constructo de reconocimiento, y una región de cambio (S_{1}), y en el que una cadena pesada de anticuerpo expresada por la célula se encuentra codificada por un locus diana de cadena pesada de anticuerpo, comprendiendo, en orden de 5' a 3' y operablemente ligados, un promotor de locus diana, una región variable de cadena pesada de anticuerpo del locus diana, una región de cambio (S_{2}), y una región constante de cadena pesada de anticuerpo;
- b)
- cultivar la célula para permitir la transcripción del constructo de reconocimiento, en el que la recombinación mediada por cambio de clase entre dichos S_{1} y S_{2} se encuentra promovida; y
- c)
- seleccionar una célula que comprende un locus diana modificado que comprende, en orden de 5' a 3' y en ligamiento operable, el promotor de constructo de reconocimiento, la región variable de cadena pesada de constructo de reconocimiento, una región de cambio, y la región constante de cadena pesada de anticuerpo del locus diana; en el que se produce una cadena pesada de anticuerpo modificado.
10. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el constructo de reconocimiento y el locus diana se
encuentran integrados cromosómicamente.
11. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el locus diana codifica una cadena pesada de
anticuerpo.
12. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el locus diana comprende además una secuencia no diana
situada entre el promotor del locus diana y la región de cambio del
locus diana.
13. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el constructo de reconocimiento se lineariza previamente a
dicha introducción, y una célula que contiene un integrante estable
del constructo de reconocimiento se selecciona previamente a dicho
cultivo para permitir la transcripción del locus diana.
14. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el constructo de reconocimiento es extracromo-
sómico.
sómico.
\newpage
15. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la recombinación entre la primera región de cambio y la
segunda región de cambio se asocia a la deleción de los ácidos
nucleicos situados entre dicha primera y segunda regiones de
cambio.
16. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la secuencia no diana codifica una región variable de cadena
pesada de anticuerpo humano, y la secuencia diana codifica una
región constante de cadena pesada de anticuerpo murino.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que la secuencia modificante del constructo de reconocimiento
codifica una región constante de cadena pesada de anticuerpo
humano.
18. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el locus diana codifica una cadena pesada de anticuerpo
murino y la secuencia modificante del constructo de reconocimiento
codifica una región constante de cadena pesada de anticuerpo
humano.
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