DE102016123847B3 - Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen tumorassoziierte Antigene (MAGEA1). Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf T-Zellrezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für das in Tumoren exprimierte erfindungsgemäße Antigen sind, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen TCR und von ihnen abgeleitete TAA-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von TAA-exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigen-erkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen das Peptid MAGEA1-003, welches aus dem tumorassoziierten Antigen (TAA) abgeleitet ist. Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf T-Zellrezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für das TAA der Erfindung sind, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen ICR und von ihnen abgeleitete TAA-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von TAA-exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigenerkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.
  • BESCHREIBUNG
  • Es wurde festgestellt, dass die Melanomantigen-Gene (MAGE-A) in einer Vielzahl von Tumoren unterschiedlichen histologischen Ursprungs exprimiert werden. Proteine, die von den MAGE-Genen kodiert werden, sind Tumorabstoßungsantigene, die spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren können, die Krebszellen erkennen und abtöten können. MAGE-Gene und -Proteine sind daher ein bevorzugtes Ziel für die Entwicklung neuer Arzneimittel zur Bekämpfung von Krebs durch Immuntherapie. MAGE-A-Proteine bilden eine Unterfamilie von Tumor-Hoden-Antigenen, die hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, in der Keimbahn exprimiert werden. Sie werden jedoch auch in verschiedenen menschlichen Krebsarten exprimiert, wo sie mit Bösartigkeit assoziiert sind und diese antreiben können. Diese spezifische Expression von MAGE-Antigenen in Tumoren und nicht in dem normalen umgebenden gesunden Gewebe macht diese Familie von Antigenen für einen gezielten adoptiven Transfer von T-Zellen sehr interessant. Bis heute ist jedoch aufgrund des Fehlens spezifischer und hoch-avider Antikörper oder T-Zell-Rezeptoren, die auf das MAGE-Antigen zielen, keine zufriedenstellende Immuntherapie bekannt.
  • Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie repräsentieren Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Diese tumorassoziierten Antigenen (TAA) können Peptide aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor gewöhnlich hochreguliert sind.
  • Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen selektiv zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
  • Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II. Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-II-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Da beide Arten der Antwort, CD8- und CD4-abhängig, gemeinsam und synergistisch zu dem anti-Tumoreffekt beitragen, ist die Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen und korrespondierender T-Zellrezeptoren für die Entwicklung von Krebsimmuntherapien so wie Tumorvakzinen und Zelltherapien wichtig.
  • In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) tragen, erkannt werden. TAAs stellen somit ein Ausgangspunkt für die Entwicklung einer T-Zell-basierten Immuntherapie, umfassend aber nicht limitiert auf Tumorvakzinen und Zelltherapien, dar.
  • Ungefähr 90 Prozent der T-Zellen des peripheren Blutes exprimieren ein TCR, das aus einem α-Polypeptid und einem β-Polypeptid besteht. Neben αβ den T-Zellen wurde gezeigt, dass ein kleiner Prozentsatz der T-Zellen (etwa 5% der gesamten T-Zellen) einen TCR exprimiert, der aus einem γ-Polypeptid und einem δ-Polypeptid besteht. Die größte Anzahl an γδ T-Zellen findet sich in der Darmschleimhaut, innerhalb einer Population von Lymphozyten, die als intraepitheliale Lymphozyten bekannt sind (IELs). Die antigenen Moleküle, die γδ T-Zellen aktivieren, sind größtenteils unbekannt. Allerdings sind γδ T-Zellen nicht auf MHC eingeschränkt und scheinen in der Lage zu sein, ganze Proteine zu erkennen, anstatt dass Peptide von MHC-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden müssen, obwohl einige MHC-Klasse-IB-Moleküle erkennen. Humane Vγ9/Vδ2 T-Zellen, die die Haupt-γδ-T-Zellpopulation im peripheren Blut darstellen, sind dadurch einzigartig, dass sie spezifisch und schnell auf einen kleinen nicht-peptidischen mikrobiellen Metaboliten, HMB-PP, einen Isopentenylpyrophosphatvorläufer, reagieren.
  • Die Ketten des T-Zell-Antigen-Rezeptors eines T-Zellklons bestehen jeweils aus einer einzigartigen Kombination von Domänen, die als Variable (V), [Diversitäts-(D),] Verbindungs-(J(joining)) und konstant (C) bezeichnet werden. In jedem T-Zellklon beteiligt sich die Kombination von V-, D- und J-Domänen sowohl der alpha- als auch der beta-Kette oder der Delta- und Gamma-Ketten an der Antigenerkennung in einer für diesen T-Zellklon eindeutig charakteristischen Weise und definiert eine einzigartige Bindungsstelle, auch bekannt als der Idiotyp des T-Zellklons. Im Gegensatz dazu nimmt die C-Domäne nicht an der Antigenbindung teil.
  • Ein TCR ist ein heterodimeres Zelloberflächenprotein der Superfamilie der Immunglobuline, die mit den invariablen Proteinen des CD3-Komplexes, der in Vermittlung der Signaltransduktion involviert ist, assoziiert. TCRs existieren in αβ- und γδ-Formen, die strukturell ähnlich sind, aber ziemlich unterschiedliche anatomische Positionen und – vermutlich – Funktionen haben. Der extrazelluläre Anteil der nativen heterodimerischen αβTCR und γδTCR besteht aus je zwei Polypeptiden, von welchen beide eine membranproximale konstante Domäne und eine membrandistale variable Domäne besitzen. Alle konstanten und variablen Domänen enthalten eine Intraketten-Disulfidbindung. Die variablen Domänen enthalten hochgradig polymorphe Schleifen, analog zu den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörpern. Die Verwendung der TCR-Gentherapie überwindet eine Reihe von aktuellen Hürden. Es erlaubt, die eigenen T-Zellen des Patienten mit den erwünschten Spezifitäten auszustatten und eine ausreichende Anzahl von T-Zellen in einer kurzen Zeit, was deren Erschöpfung vermeidet, zu generieren. Der TCR wird in zentrale T-Gedächtniszellen oder T-Zellen mit Stammzelleigenschaften transduziert, was eine bessere Persistenz und Funktion nach dem Transfer sicherstellt. TCR-modifizierte T-Zellen werden Krebspatienten, die durch Chemotherapie oder Bestrahlung lymphopenisch geworden sind, per Infusion verabreicht, was eine effiziente Transplantation erlaubt, jedoch eine Immunsuppression inhibiert.
  • Obwohl in der Entwicklung von molekularen-zielgerichteten Arzneimitteln für die Krebstherapie Fortschritte gemacht wurden, besteht die Notwendigkeit, neue Krebsmittel, die spezifisch gegen Moleküle, die hochspezifisch für Krebszellen sind, gerichtet sind, zu entwickeln. Die vorliegende Beschreibung spricht diese Notwendigkeit an, indem neue MAGEA1 TCRs, entsprechende rekombinante TCR-Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen, die spezifisch an TAA-Epitop(e) binden, wie offenbart, und Verfahren zur Verwendung solcher Moleküle bei der Krebsbehandlung zur Verfügung gestellt werden. Der Begriff TAA im Kontext der Erfindung betrifft insbesondere die folgenden bevorzugten Proteine, nämlich MAGEA1-Proteine, Fragmente davon, insbesondere antigene Peptide, die von HLA präsentiert werden und vorzugsweise mit einer proliferativen Störung assoziiert sind. Das bevorzugte antigene Peptid der Erfindung ist das Peptid MAGEA1-003, welches die Aminosäuresequenz aufweist, die in irgendeiner der SEQ ID NO: 133 bis 142 in Tabelle 2 unten dargelegt ist. Ein TAA-Peptid ist bevorzugt ein Peptid, welches in irgendeiner der SEQ ID NO: 133 bis 142 dargelegt ist.
  • Antigen-erkennende Konstrukte
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Antigen-erkennendes Konstrukt, welches zumindest eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) 3 mit einer Sequenzidentität von zumindest 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117, umfasst, gelöst.
  • In einigen Ausführungsformen bindet das Antigen-erkennende Konstrukt der Erfindung spezifisch an einen TAA-Peptid-HLA-Molekülkomplex, wobei das TAA-Peptid eine Variante des TAAs umfasst oder alternativ daraus besteht, die mindestens 66%, vorzugsweise mindestens 77% und besonders bevorzugt mindestens 88% homolog (vorzugsweise mindestens 77% oder mindestens 88% identisch) zu der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen TAA, wobei diese Variante an ein HLA-Klasse-I oder Klasse-II-Molekül bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit dem Peptid kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei das Peptid nicht das zugrunde liegende Polypeptid voller Länge ist.
  • Im vorliegenden Kontext beziehen sich die Begriffe ”identisch” oder prozentuale ”Identität”, wenn sie hier im Zusammenhang mit zwei oder mehr Nukleinsäure- oder Protein-/Polypeptid-Sequenzen verwendet werden, auf zwei oder mehr Sequenzen oder Teilsequenzen, die gleich sind oder einen bestimmten Prozentsatz an Aminosäureresten oder Nukleotiden, die gleich sind, aufweisen (oder mindestens aufweisen) (d. h. von oder mindestens etwa 60% Identität, vorzugsweise von oder mindestens 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% Identität und besonders bevorzugt von oder mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder höherer Identität über einen spezifizierten Bereich – vorzugsweise über ihre Volllängensequenzen –, verglichen und ausgerichtet für eine maximale Korrespondenz über das Vergleichsfenster oder den designierten Bereich), gemessen unter Verwendung von Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuelle Ausrichtung und visuelle Kontrolle (siehe z. B. NCBI-Website). In einer besonderen Ausführungsform, beispielsweise beim Vergleich der Protein- oder Nukleinsäuresequenz eines Antigen-erkennenden Konstrukts der Erfindung mit einem anderen Protein/Gen, kann die prozentuale Identität durch die Blastsuche bestimmt werden, die vom Human Olfactory Data Explorer unterstützt wird (z. B., https://genome.weizmann.ac.il/cgi-bin/horde/blastHorde.pl); insbesondere für Aminosäureidentität, welche BLASTP 2.2.28+ mit den folgenden Parametern verwenden: Matrix: BLOSUM62; Gap Penalties: Existence: 11, Extension: 1; Neighboring words threshold: 11; Window for multiple hits: 40.)
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung versteht es sich, dass jegliche Ausführungsformen, die mit „umfassend” bestimmte Merkmale der Erfindung bezeichnet werden, so verstanden werden, dass sie in einigen mehr bevorzugten Ausführungsformen die stärker beschränkte Beschreibung von ”bestehend aus” oder ”im Wesentlichen bestehend aus” die gleichen Merkmale der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • In einer weiteren oder einer alternativen Ausführungsform kann das Antigen-erkennende Konstrukt zusätzlich eine CDR1 und/oder eine CDR2-Domänsequenz umfassen. Innerhalb der variablen Domäne befinden sich CDR1 und CDR2 in der variablen (V) Region einer Polypeptidkette und CDR3 schließt etwas von V-Segment, die gesamten D(diversity)- und J(joining)-Segmente ein. CDR3 ist die variabelste und die Haupt-CDR, welche für die spezifische und selektive Erkennung eines Antigens verantwortlich ist. CDR1- und CDR2-Sequenzen können von einer CDR-Sequenz einer humanen variablen Kette des Allels ausgewählt werden.
  • Native alpha-beta heterodimere TCRs besitzen eine alpha-Kette und eine beta-Kette. Jede Kette umfasst variable, verbindende und konstante Segmente und die beta-Kette umfasst normalerweise auch ein kurzes Diversitätssegment zwischen dem variablen und verbindenden Segment, aber das Diversitätssegment wird oft als Teil des J-Segments gesehen. Jedes variable Segment umfasst drei CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen), die in eine Gerüstsequenz eingebettet sind, eine davon ist die hypervariable Region, genannt CDR3. Es gibt verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vα) der alpha-Kette und verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vβ) der beta-Kette, die sich durch ihr Gerüst, CDR1- und CDR2-Sequenzen, und durch eine teilweise definierte CDR3-Sequenz auszeichnen. Die Vα-Arten werden in der IMGT-Nomenklatur durch eine einzigartige TRAV-Nummer gekennzeichnet, Vβ-Arten werden durch eine einzigartige TRBV-Nummer gekennzeichnet. Für weitere Informationen über Immunglobulin-Antikörper und TCR-Gene siehe die International ImMunoGeneTics Information System®, Lefranc M-P et al (Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43 (Database issue): D413–22; and http://www.imgt.org/).
  • Daher umfasst das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt in einer zusätzlichen oder alternativen Ausführungsform CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen in einer Kombination wie in der Tabelle 1 unterhalb gezeigt, welche das entsprechende Allel der variablen Kette zusammen mit der CDR3-Sequenz zeigen. Daher sind die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte bevorzugt, die zumindest eine, bevorzugt alle drei CDR-Sequenzen: CDR1, CDR2 und CDR3, umfassen. Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt die entsprechenden CDR1 bis CDR3 eines individuellen hier offenbarten variablen TCR-Segmente der vorliegenden Erfindung (siehe Tabelle 1 unten und die Beispiele).
  • Der Begriff ”Spezifizität” oder ”Antigenspezifizität” oder ”spezifisch für” ein gegebenes Antigen, wie hier verwendet, bedeutet, dass das Antigen-erkennende Konstrukt spezifisch an das Antigen binden kann, bevorzugt ein TAA-Antigen, weiter bevorzugt mit einer hohen Avidität, wenn das Antigen durch HLA, bevorzugt HLA A2, präsentiert wird. Beispielsweise kann ein TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt angesehen werden, das eine ”Antigenspezifizität” für ein TAA besitzt, wenn T-Zellen, die den TCR exprimieren, mindestens 200 pg/ml oder mehr (z. B., 250 pg/ml oder mehr, 300 pg/ml oder mehr, 400 pg/ml oder mehr, 500 pg/ml oder mehr, 600 pg/ml oder mehr, 700 pg/ml oder mehr, 1000 pg ml oder mehr, 2000 pg/ml oder mehr, 2500 pg/ml oder mehr, 5000 pg/ml oder mehr) Interferon γ (IFN-γ) nach Ko-Kultivierung mit HLA A2-positiven Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen eines TAA-Antigens, wie zum Beispiel den TAA-Epitopen und den Antigenen, die hier zur Verengung gestellt werden, gepulst wurden (z. B., etwa 10–11 mol/l, 10–10 mol/l, 10–9 mol/l, 10–8 mol/l, 10–7 mol/l, 10–6 mol/l, 10–5 mol/l) sekretieren. Alternativ oder zusätzlich kann ein TCR als eine ”Antigenspezifizität” für TAA besitzend angesehen werden, wenn die T-Zellen, die den TCR exprimieren, mindestens doppelt so viel IFN-γ sekretieren, wie der nicht transduzierte Hintergrund von IFN-γ nach Ko-Kultivierung mit den Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen der TAA-Antigene gepulst wurden. Eine solche ”Spezifizität”, wie oben beschrieben, kann – beispielsweise – mit einem ELISA analysiert werden.
  • In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung bindet das Antigen-erkennende Konstrukt selektiv an ein TAA abgeleitetes antigenes Peptid; wobei das TAA antigene Peptid bevorzugt ein Proteinepitop oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in der SEQ ID NO: 133, oder eine Variante davon ist, wobei die Variante eine Aminosäuredeletion, -addition, -insertion oder -substitution von nicht mehr als drei, bevorzugt zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als eine Aminosäureposition ist. In einigen Ausführungsformen bindet das Antigen-erkennende Konstrukt der Erfindung selektiv an ein beliebiges der modifizierten MAGEA1-003-Peptide, die in SEQ ID NO: 132 bis 142 dargelegt sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen bindet das Antigen-erkennende Konstrukt der Erfindung nicht selektiv an ein beliebiges der modifizierten MAGEA1-003 Peptide, die in SEQ ID NO: 143 bis 152 dargelegt sind.
  • Der Begriff ”Selektivität” oder ”selektive Erkennung/Bindung” wird so verstanden, dass auf eine Eigenschaft des Antigen-erkennenden Konstrukts, so wie einen TCR oder Antikörper, bevorzugt nur ein spezifisches Epitop selektiv zu erkennen oder zu binden und bevorzugt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu einem anderen Epitop zu zeigen, referenziert wird. Bevorzugt bedeutet der Begriff ”Selektivität” oder ”selektive Erkennung/Bindung”, dass das Antigen-erkennende Konstrukt (z. B. ein TCR) ein spezifisches Epitop selektiv erkennt oder bindet und bevorzugterweise keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop zeigt, wobei das Epitop einzigartig für ein Protein ist, so dass das Antigen-erkennende Konstrukt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop und einem anderen Protein zeigt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt wird bevorzugt aus einem Antikörper oder einem Derivat oder einem Fragment davon, oder einem T-Zellrezeptor (TCR) oder einem Derivat oder einem Fragment davon ausgewählt. Ein Derivat oder Fragment eines Antikörpers oder eines TCRs gemäß der Erfindung sollte bevorzugt die Fähigkeit des Stammmoleküls an ein Antigen zu binden oder es zu erkennen, im Besonderen seine Spezifizität und/oder Selektivität, wie oben erklärt, behalten. Eine solche Bindungsfunktionalität kann durch das Vorhandensein einer CDR3-Region, wie hier beschrieben, erhalten werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen TCRs in der Lage, TAA-Antigene in einer Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I-abhängigen Weise zu erkennen. ”MHC Klasse I-abhängige Weise”, wie im vorliegenden Kontext verwendet, bedeutet, dass der TCR eine Immunreaktion nach der Bindung an ein TAA-Antigen im Zusammenhang mit einem MHC-Klasse-I-Molekül auslöst. Das MHC-Klasse-I-Molekül kann jedes in der Technik bekannte MHC-Klasse-I-Molekül sein, z. B. HLA-A-Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das MHC-Klasse-I-Molekül ein HLA-A2-Molekül.
  • Die Erfindung stellt sowohl einzelkettige Antigen-erkennende Konstrukte als auch doppelkettige Antigen-erkennende Konstrukte zur Verfügung.
  • In einer Ausführungsform weist die TCR-alpha-variablen Domäne mindestens eine Mutation im Vergleich zu einer in Tabelle 1 gezeigten TCR-alpha-Domäne auf; und/oder die TCR-beta-variable Domäne weist mindestens eine Mutation im Vergleich zu einer in Tabelle 1 gezeigten TCR-alpha-Domäne auf. In einer Ausführungsform weist ein TCR, der mindestens eine Mutation in der variablen Domäne von TCR-alpha umfasst und/oder die variable Domäne TCR-beta weist eine Bindungsaffinität für und/oder eine Bindungshalbwertszeit für einen TAA-Peptid-HLA-Molekülkomplex auf, die mindestens das Doppelte derer eines TCRs, der die nicht mutierte TCR-alpha-Domäne und/oder die nicht mutierte TCR-beta-variable Domäne umfasst, ist.
  • Die TCR-alpha-Ketten der vorliegenden Beschreibung können ferner eine TCR-alpha-Transmembrandomäne und/oder eine TCR-alpha-intrazelluläre Domäne umfassen. Die TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung können ferner eine TCR-beta-Transmembrandomäne und/oder eine TCR-beta-intrazelluläre Domäne umfassen.
  • Die Erfindung stellt im Besonderen ein TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt oder ein Fragment oder Derivat davon zur Verfügung. Der TCR ist bevorzugt menschlich, was so verstanden werden soll, dass er von einem menschlichen TCR-Lokus generiert wurde, und daher menschliche TCR-Sequenzen umfasst. Des Weiteren kann der TCR dadurch charakterisiert werden, dass er menschlicher Herkunft ist und spezifisch das erfindungsgemäße TAA-Antigen erkennt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt zusätzlichen oder alternativ ein Antigen-erkennendes Konstrukt, wie oben beschrieben, zur Verfügung, welches eine Immunantwort auslöst, bevorzugt wenn die Immunantwort dabei durch einen Anstieg des Interferon (IFN) γ-Niveaus charakterisiert wird.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können als Einzelkette α oder β, oder γ und δ, Moleküle oder alternativ als Doppelkettenkonstrukte zusammengesetzt aus sowohl dem α- und β-Strang, als auch dem γ- und δ-Strang, zur Verfügung gestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt kann eine TCRα- oder γ-Kette; und/oder eine TCRβ- oder δ-Kette umfassen; wobei die TCRα- oder γ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 15 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 und 111 umfasst, und/oder wobei die TCRβ- oder δ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 und 117 umfasst.
  • Am meisten bevorzugt ist, in einigen zusätzlichen Ausführungsformen, in welchen die Offenbarung sich auf Antigen-erkennende Konstrukte, die eine beliebige, zwei oder alle CDR1- bis CDR3-Regionen der hier offenbarten TCR-Ketten umfassen (siehe Tabelle 1) beziehen, diejenigen Antigen-erkennenden Konstrukte bevorzugt sind, die die jeweilige CDR-Sequenz der Erfindung mit nicht mehr als drei, zwei oder bevorzugt nur einem modifizierten Aminosäurerest umfassen. Ein modifizierter Aminosäurerest kann aus einer Aminosäureninsertion, -deletion oder -substitution ausgewählt werden. Am meisten bevorzugt ist, dass die drei, zwei und bevorzugt nur ein modifizierter Aminosäurerest der erste oder letzte Aminosäurerest der jeweiligen CDR-Sequenz ist. Wenn die Modifikation eine Substitution ist, dann ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, dass die Substitution eine konservative Aminosäuresubstitution ist.
  • Wenn das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt aus zumindest zwei Aminosäureketten besteht, wie ein doppelkettiger TCR, oder Antigen-bindendes Fragment davon, kann das Antigen-erkennende Konstrukt in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 9; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 27 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 33; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 39 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 45; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 51 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 57; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 63 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 69; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 75 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 81; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 87 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 93; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 99 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 105; oder in einer ersten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 111 und in einer zweiten Polypeptidkette die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 117 umfasst. Jeder beliebige der zuvor genannten doppelkettigen-TCRs oder Antigen-bindende Fragmente davon sind bevorzugte TCRs der vorliegenden Erfindung. In einigen Ausführungsformen kann der CDR3 des erfindungsgemäßen doppelkettigen TCRs mutiert sein. Mutationen der CDR3-Sequenzen gemäß SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117, wie oben zur Verfügung gestellt, enthalten bevorzugt eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von nicht mehr als drei, bevorzugt nicht mehr als zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als einen Aminosäurerest. In einigen Ausführungsformen kann die erste Polypeptidkette eine TCRα- oder γ-Kette und die zweite Polypeptidkette kann eine TCRβ- oder δ-Kette sein. Bevorzugt ist die Kombination eines αβ oder γδ TCR.
  • Der TCR oder das Antigen-bindende Fragment davon ist in einigen Ausführungsformen aus einer TCRα- und einer TCRβ-Kette oder γ- und δ-Kette zusammengesetzt. Ein solcher doppelkettige TCR umfasst innerhalb jeder Kette variable Regionen und diese variablen Regionen umfassen jeweils eine CDR1-, eine CDR2- und eine CDR3-Sequenz. Die TCRs umfassen die CDR1- bis CDR3-Sequenzen wie in der Aminosäuresequenz der variablen Kette von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 10 (R26P1A9) oder SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 22 (R26P2A6); oder SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34 (R26P3H1) oder SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 46 (R35P3A4), oder SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 58 (R37P1C9), oder SEQ ID NO: 64 und SEQ ID NO: 70 (R37P1H1), oder SEQ ID NO: 76 und SEQ ID NO: 82 (R42P3A9), oder SEQ ID NO: 88 und SEQ ID NO: 94 (R43P3F2), oder SEQ ID NO: 100 und SEQ ID NO: 106 (R43P3G5), oder SEQ ID NO: 112 und SEQ ID NO: 118 (R59P2E7) umfasst.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen einen TCR oder ein Fragment davon, bestehend aus einer TCRα- und einer TCRβ-Kette, wobei der TCR Sequenzen der variablen Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den α- und β-Ketten gemäß SEQ ID NO: 4 bzw. 10 oder 16 bzw. 22; oder 28 bzw. 34, oder 40 bzw. 46, oder 52 bzw. 58, oder 64 bzw. 70, oder 76 bzw. 82, oder 88 bzw. 94, oder 100 bzw. 106, oder 112 bzw. 118 umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können des Weiteren eine konstante Region, die von einer beliebigen geeigneten Spezies, so wie einem Säugetier, z. B. Mensch, Ratte, Affe, Kaninchen, Esel oder Maus stammt, umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der erfindungsgemäße TCR des Weiteren eine menschliche konstante Region. In einigen bevorzugten Ausführungsformen kann die konstante Region des erfindungsgemäßen TCRs geringfügig modifiziert sein, beispielsweise durch die Einführung von heterologen Sequenzen, bevorzugt Maussequenzen, welche die TCR-Expression und -Stabilität erhöhen können.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen einen TCR oder ein Fragment davon, bestehend aus einer TCRα- und einer TCRβ-Kette, wobei der TCR die konstante Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder bevorzugt 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den α- und β-Ketten gemäß SEQ ID NO: 5 bzw. 11 oder 17 bzw. 23; oder 29 bzw. 35, oder 41 bzw. 47, oder 53 bzw. 59, oder 65 bzw. 71, oder 77 bzw. 83, oder 89 bzw. 95, oder 101 bzw. 107, oder 113 bzw. 119 umfasst.
  • Die erfindungsgemäße TCRα- oder γ-Kette kann weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 und 109; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98, und 110 umfassen.
  • Entsprechend der Erfindung kann die TCRβ- oder δ- Kette weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 und 115; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 und 116 umfassen.
  • Das Antigen-erkennende Konstrukt kann in einer weiteren Ausführungsform ein Bindungsfragment eines TCRs umfassen, und wobei das Bindungsfragment CDR1 bis CDR3 optional ausgewählt aus den CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nos. 1, 2, 3 oder 7, 8, 9 oder 13, 14, 15 oder 19, 20, 21 oder 25, 26, 27 oder 31, 32, 33 oder 37, 38, 39 oder 43, 44, 45 oder 49, 50, 51 oder 55, 56, 57 oder 61, 62, 63 oder 67, 68, 69 oder 73, 74, 75 oder 79, 80, 81 oder 85, 86, 87 oder 91, 92, 93 oder 97, 98, 99 oder 103, 104, 105 oder 109, 110, 111 oder 115, 116, 117 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie an anderer Stelle des vorliegenden Dokumentes beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, der aus zumindest einer TCRα- und einer TCRβ-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCR α-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 3 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 7 bis 9 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13 bis 15 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 19 bis 21 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 25 bis 27 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 31 bis 33 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 37 bis 39 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 43 bis 45 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 49 bis 51 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 55 bis 57 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 61 bis 63 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 67 bis 69 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 73 bis 75 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 79 bis 81 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 85 bis 87 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 91 bis 93 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 97 bis 99 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 103 bis 105 umfasst; oder wobei die TCR α-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 109 bis 111 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 115 bis 117 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie hier beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, der aus zumindest einer TCRα- und einer TCRβ-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 10 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No: 16 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 22 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 28 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 34 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 40 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 46 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 52 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 58 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 64 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 70 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 76 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 82 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 88 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 94 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 100 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 106 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 112 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 118 umfasst.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt, wie hier beschrieben, ein TCR oder ein Fragment davon, des Weiteren umfassend eine konstante Region von TCR mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 und 119, bevorzugt ist, dass der TCR aus mindestens einer TCRα- und einer TCRβ-Kettensequenz besteht, wobei die TCRα-Kettensequenz eine konstante Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 und 113 umfasst.
  • Offenbart werden auch Antigen-erkennende Konstrukte, wie hier beschrieben, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 6 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 12. Die Erfindung stellt auch einen TCR umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 18, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 24 zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 30 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 36 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 42 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 48 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 54 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 60 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 66 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 72 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 78 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 84 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 90 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 96 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 102 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 108 umfassen, zur Verfügung. In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antigen-erkennende Konstrukte, die ein TCR sind, und eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 114 und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 120 umfassen, zur Verfügung.
  • Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet der Begriff ”murin” oder ”menschlich (human)”, wenn er auf ein Antigen-erkennendes Konstrukt oder eine beliebige Komponente der hier beschriebenen TCRs (z. B. komplementaritätsbestimmende Region (CDR), variable Region, konstante Region, α-Kette, und/oder β-Kette) bezogen wird, einen TCR (oder eine Komponente davon), der von einem nicht veränderten TCR-Lokus der Maus bzw. des Menschen abgeleitet ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden chimerische TCRs zur Verfügung gestellt, wobei die TCR-Ketten Sequenzen von mehreren Spezies umfassen. Es ist bevorzugt, dass ein erfindungsgemäßer TCR eine α-Kette umfassend eine menschliche variable Region einer α-Kette und zum Beispiel eine murine konstante Region einer murinen TCRα-Kette umfasst.
  • In einer Ausfühungsform ist der erfindungsgemäße TCR ein menschlicher TCR umfassend menschliche variable Regionen entsprechend den obigen Ausführungsformen und menschliche konstante Regionen.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Antigen-erkennende Konstrukt murinisiert oder humanisiert. Diese Begriffe werden verwendet, wenn Aminosäuresequenzen von einer fremden Spezies in ein Konstrukt der Erfindung eingeführt werden.
  • Der erfindungsgemäße TCR kann auch als einzelkettiger TCR (single chain; scTCR) zur Verfügung gestellt werden. Ein scTCR kann ein Polypeptid einer variablen Region einer ersten TCR-Kette (z. B., eine alpha-Kette) und ein Polypeptid einer kompletten (voller Länge) zweiter TCR-Kette (z. B., einer beta-Kette), oder vice versa sein. Des Weiteren kann der scTCR optional einen oder mehrere Linker enthalten, welche die beiden oder mehreren Polypeptide verbinden. Der Linker kann zum Beispiel ein Peptid sein, welches die zwei Einzelketten verlinkt, wie hier beschrieben. Auch wird ein erfindungsgemäßer scTCR, der an ein menschliches Zytokine, wie IL-2, IL-7 oder IL-15, gekoppelt ist, bereitgestellt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-bindende Konstrukt kann auch in der Form eines multimerischen Komplexes zur Verfügung gestellt werden, welcher zumindest 2 scTCR-Moleküle umfasst, wobei die scTCR-Moleküle alle an zumindest eine Biotineinheit oder andere verbindende Moleküle/Linker gekoppelt sind, und wobei die scTCRs durch die Wechselwirkungen zwischen Biotin und Streptavidin untereinander verbunden sind, um die Bildung des multimeren Komplexes zu ermöglichen. Ähnliche, im Stand der Technik bekannte, Herangehensweisen für die Erzeugung von multimeren TCRs sind auch möglich und in dieser Offenbarung enthalten. Auch werden multimere Komplexe höherer Ordnung, umfassend mehr als zwei erfindungsgemäße scTCR bereit gestellt.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein TCR eine Einheit, die zumindest eine TCR alpha oder gamma und/oder TCR beta oder delta variable Domäne besitzt. Im Allgemeinen umfassen sie sowohl eine TCR-alpha-variable Domäne als auch eine TCR-beta-variable Domäne, alternativ sowohl eine TCR-gamma-variable Domäne, als auch eine TCR-delta-variable Domäne. Sie können αβ/γδ Heterodimere oder im Einzelkettenformat vorliegen. Für die Verwendung in der adoptiven Therapie kann ein αβ oder γδ heterodimerischer TCR zum Beispiel transfiziert sein, denn Ketten voller Länge sowohl zytoplasmatische als auch transmembrane Domänen besitzen. Wenn es gewünscht ist, kann eine Disulfidbindung zwischen den Resten der entsprechenden konstanten Domänen vorhanden sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen-erkennende Konstrukt ein humaner TCR oder ein Fragment oder Derivat davon. Ein humaner TCR oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist ein TCR, welcher mehr als 50% der korrespondierenden humanen TCR-Sequenz umfasst. Es ist bevorzugt, dass nur ein kleiner Teil der TCR-Sequenz künstlich ist oder von anderen Spezies abgeleitet ist. Es ist jedoch bekannt, dass chimerische TCRs, z. B. abgeleitet von menschlicher Herkunft mit murinen Sequenzen in den konstanten Domänen, vorteilhaft sind. Deshalb sind TCRs gemäß der vorliegenden Erfindung, welche murine Sequenzen in dem extrazellulären Teil ihrer konstanten Domänen enthalten, besonders bevorzugt.
  • Somit ist es auch bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt in der Lage ist, sein Antigen in einer humanen Leukozyten-Antigen(HLA)-abhängigen Weise, bevorzugt in einer HLA-A02-abhängigen Weise, zu erkennen. Der Begriff ”HLA-abhängige Weise” bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass das Antigen-erkennende Konstrukt nur an das Antigen bindet, wenn das antigenische Peptid durch das HLA präsentiert wird.
  • Das Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung induziert in einer Ausf+hrungsform vorzugsweise eine Immunantwort, wobei vorzugsweise die Immunantwort durch den Anstieg des Interferon-(IFN)γ-Spiegels charakterisiert ist.
  • Ebenfalls wird ein Polypeptid durch die Erfindung bereitgestellt, das einen funktionellen Teil eines beliebigen der im Kontext der Erfindung beschriebenen TCRs (oder funktioneller Varianten davon) umfasst, beispielsweise eines der aus R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 und R59P2E7 ausgewählten TCRs, wie in den Beispielen und Tabelle 1 angegeben. Der Begriff ”Polypeptid”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt Oligopeptide ein und bezieht sich auf eine einzelne Kette von Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden sind. In Bezug auf die erfindungsgemäßen Polypeptide kann der funktionelle Teil ein beliebiger Teil sein, der zusammenhängende Aminosäuren des TCRs (oder einer funktionellen Variante davon) umfasst, von denen er ein Teil ist, vorausgesetzt, dass der funktionelle Teil spezifisch an ein TAA-Antigen bindet, vorzugsweise wie hier in Tabelle 2 offenbart, sowie an die Peptide A1 bis A9 (SEQ ID NOs: 134–142). Der Begriff „funktioneller Teil”, wenn er in Bezug auf einen TCR (oder eine funktionelle Variante davon) verwendet wird, bezieht sich auf einen beliebigen Teil oder ein Fragment des TCR (oder einer funktionellen Variante davon) der Erfindung, wobei dieses Teil oder Fragment die biologische Aktivität des TCRs (oder funktionellen Variante davon), von denen es sich um einen Teil handelt (der übergeordnete TCR oder die übergeordnete funktionelle Variante davon), beibehält. Funktionelle Abschnitte umfassen beispielsweise jene Teile eines TCR (oder eine funktionelle Variante davon), die die Fähigkeit beibehalten, spezifisch an das TAA-Antigen (in einer HLA-abhängigen Weise) zu binden oder Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern, dies in einem ähnlichen Ausmaß, im gleichen Ausmaß oder in einem höheren Ausmaß, als das übergeordnete TCR (oder funktionelle Variante davon). In Bezug auf das übergeordnete TCR (oder eine funktionelle Variante davon) kann der funktionelle Teil beispielsweise etwa 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% oder mehr der variablen Sequenzen des übergeordneten TCRs (oder funktionelle Variante davon) umfassen.
  • Der funktionelle Abschnitt kann zusätzliche Aminosäuren am Amino- oder Carboxyterminus des Abschnitts oder an beiden Enden umfassen; wobei in der Aminosäuresequenz des übergeordneten TCR oder der funktionellen Variante keine zusätzlichen Aminosäuren gefunden werden. Wünschenswerterweise stören die zusätzlichen Aminosäuren nicht die biologische Funktion des funktionellen Abschnitts, z. B. spezifisch das TAA-Antigene zu binden; und/oder die Fähigkeit, Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern usw. Noch wünschenswerter ist es, wenn die zusätzlichen Aminosäuren die biologische Aktivität im Vergleich zu der biologischen Aktivität des übergeordneten TCRs oder der funktionellen Variante davon erhöhen.
  • Das Polypeptid kann einen funktionellen Abschnitt von einer oder beiden der α- und β-Ketten der erfindungsgemäßen TCRs oder funktionellen Varianten davon umfassen, wie einen funktionellen Abschnitt, der eines von mehreren von CDR1, CDR2 und (vorzugsweise) CDR3 der variablen Region(en) der α-Kette und/oder β-Kette eines erfindungsgemäßen TCRs oder einer funktionellen Variante umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Polypeptid einen funktionellen Abschnitt umfassen, der die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117 (CDR3 der variablen Regionen des TCRs der Erfindung) oder eine Kombination davon umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Polypeptid beispielsweise die variable Region des erfindungsgemäßen TCRs oder einer funktionellen Variante davon umfassen, die eine Kombination der oben dargelegten CDR-Bereiche umfasst. In dieser Hinsicht kann das Polypeptid die Aminosäuresequenz von einer beliebigen Sequenz mit SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 und 118 (die variablen Regionen einer α- oder β-Kette des erfindungsgemäßen TCRs) umfassen.
  • In einigen Fällen kann das erfindungsgemäße Konstrukt eine oder zwei Polypeptidketten umfassen, die eine Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis 120 (CDR-Sequenzen, konstante und variable Regionen und Volllängensequenzen) oder funktionelle Fragmente davon umfassen, und ferner andere Aminosäuresequenzen, z. B. eine Aminosäuresequenz, die für ein Immunglobulin oder einen Teil davon kodiert umfassen, dann kann das erfindungsgemäße Protein ein Fusionsprotein sein. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung auch ein Fusionsprotein bereit, das mindestens eines der im Kontext der Erfindung beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide zusammen mit mindestens einem anderen Polypeptid umfasst. Das andere Polypeptid kann als separates Polypeptid des Fusionsproteins vorliegen oder kann als Polypeptid vorliegen, das im Rahmen (im Tandem) mit einem der im Kontext der Erfindung beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert wird. Das andere Polypeptid kann jedes peptidische oder proteinhaltige Molekül oder einen Teil davon einschließen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Immunglobulin, CD3, CD4, CD8, ein MHC-Molekül, ein CD1-Molekül, z. B. CD1a, CD1b, CD1c, CD1d usw.
  • Das Fusionsprotein kann eine oder mehrere Kopien des erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder eine oder mehrere Kopien des anderen Polypeptids umfassen. Beispielsweise kann das Fusionsprotein 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Kopien des erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder des anderen Polypeptids umfassen. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen sind in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise rekombinante Verfahren. In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die TCRs (und funktionelle Abschnitte und funktionelle Varianten davon), Polypeptide und Proteine der Erfindung als ein einzelnes Protein exprimiert werden, das ein Linkerpeptid umfasst, das die α-Kette und die β-Kette sowie die γ-Kette und die δ-Kette verbindet. In dieser Hinsicht können die TCRs (und funktionelle Varianten und funktionelle Abschnitte davon), Polypeptide und Proteine der Erfindung, die die Aminosäuresequenzen der variablen Regionen des erfindungsgemäßen TCRs umfassen und können ferner ein Linkerpeptid umfassen. Das Linkerpeptid kann vorteilhafterweise die Expression eines rekombinanten TCRs (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktioneller Varianten davon), eines Polypeptids und/oder eines Proteins in einer Wirtszelle erleichtern. Das Linkerpeptid kann jede geeignete Aminosäuresequenz umfassen. Linker-Sequenzen für einzelkettige TCR-Konstrukte sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein solches Einzelkettenkonstrukt kann außerdem eine, oder zwei konstante Domänsequenzen umfassen. Bei der Expression des Konstrukts einschließlich des Linkerpeptids durch eine Wirtszelle kann das Linkerpeptid auch gespalten werden, was zu getrennten α- und β-Ketten und getrennten γ- und δ-Ketten führt.
  • Der TCR der Erfindung kann modifiziert werden, um eine Fehlpaarung der TCR-Ketten zu vermeiden. Der Begriff ”Fehlpaarung” bezieht sich auf die fehlerhafte Paarung zwischen einer TCR-Kette eines TCRα/γ oder β/δ-Transgens der Erfindung und einer endogenen TCRα/γ bzw. β/δ-Kette und führt zu einer verdünnten Zelloberflächenexpression des transgenen TCRαβ/γδ-Heterodimers, das die funktionelle Avidität der modifizierten T-Zellen reduziert. Vorzugsweise wird Q an der Position 44 in der variablen Domäne des TCR gemäß der IMGT-Nummerierung durch eine andere Aminosäure in einer oder beiden Ketten des erfindungsgemäßen TCR substituiert. Die Substitution ist vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus R, D, E, K, I, W und V ausgewählt.
  • Wie bereits oben erwähnt, kann die Bindungsfunktionalität des erfindungsgemäßen TCRs im Rahmen eines Antikörpers bereitgestellt werden. Beispielsweise können CDR-Sequenzen des erfindungsgemäßen TCR, die möglicherweise zusätzliche 3, 2 oder 1N- und/oder C-terminale Gerüstreste einschließen, direkt in eine variable schwere/leichte Kettensequenz eines Antikörpers verpflanzt werden. Der Begriff „Antikörper” in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird im Kontext der Erfindung verwendet, um sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen zu beziehen, d. h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle oder ein Paratop enthalten. Solche Moleküle werden auch als ”Antigen-bindende Fragmente” von Immunglobulinmolekülen bezeichnet. Die Erfindung stellt ferner einen Antikörper oder einen Antigen-bindende Abschnitt davon bereit, der spezifisch an die hier beschriebenen Antigene bindet. Der Antikörper kann in jeder Form von Immunglobulin vorliegen, welche in der Technik bekannt ist. Beispielsweise kann der Antikörper beliebiger Klasse z. B., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM usw. angehören. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommender Antikörper sein, z. B. ein Antikörper, der aus einem Säugetier, wie z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, Huhn, Hamster, Mensch usw., isoliert und/oder gereinigt wird. Alternativ kann der Antikörper ein gentechnisch veränderter Antikörper sein, z. B. ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper. Der Antikörper kann in Form eines Monomers oder Polymers vorliegen.
  • Der Begriff „Antikörper” umfasst gentechnisch hergestellte oder anderweitig modifizierte Formen von Immunglobulinen, wie beispielsweise Intrakörper, chimäre Antikörper, vollständig humane Antikörper, humanisierte Antikörper (z. B. erzeugt durch „CDR-Transplantation”), Antikörperfragmente und heterokonjugierte Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper, Diakörper, Triakörper, Tetrakörper usw.). Der Begriff „Antikörper” umfasst Cys-Diakörper und Minikörper. Somit wird jede Ausführungsform, die im Kontext dieser Beschreibung in Bezug auf „Antikörper” oder „Antikörper-ähnliche Konstrukte” angegeben wird, auch als bispezifische Antikörper, Diakörper, scFv-Fragmente, chimäre Antikörperrezeptor-(CAR)-Konstrukte, Diakörper- und/oder Minikörper-Ausführungsformen angesehen, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Der Begriff „Antikörper” umfasst ein Polypeptid der Immunglobulinfamilie oder ein Polypeptid, umfassend Fragmente eines Immunglobulins, das in der Lage ist, nicht-kovalent, reversibel und in einer spezifischen Weise ein entsprechendes Antigen, vorzugsweise das TAA der Erfindung, zu binden, wie im vorliegenden Kontext offenbart. Eine beispielhafte Antikörper-Struktureinheit umfasst ein Tetramer. In einigen Ausführungsformen kann ein Volllängen-Antikörper aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten bestehen, wobei jedes Paar eine „leichte” und eine „schwere” Kette (verbunden durch eine Disulfidbindung) aufweist. Antikörperstruktur und Isotypen sind dem Fachmann gut bekannt (zum Beispiel aus Janeway's Immunobiology, 9th edition, 2016).
  • Die bekannten Immunglobulingene von Säugetieren enthalten die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und My-Gene für die konstante Region sowie unzählige Immunoglobulingene für die variable Region (Für weitere Informationen über Immunglobulin-Gene siehe die internationale Im-MunoGeneTics Information System®, Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res. 2015 Jan; 43 (Database issue): D413–22; und http://www.imgt.org/). Für Ketten voller Länge werden die leichten Ketten entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Für Ketten voller Länge werden die schweren Ketten als Gamma, My, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD und IgE definieren. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die primär für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (VL) und variable schwere Kette (VH) beziehen sich auf diese Bereiche von leichten und schweren Ketten. Wie in dieser Erfindung verwendet, umfasst ein „Antikörper” alle Variationen von Antikörpern und Fragmenten davon. Somit sind Antikörper voller Länge, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Einzelketten-Antikörper (scFv), Fab, Fab' und multimere Versionen dieser Fragmente (z. B. F(ab')2) mit gleicher, im Wesentlichen gleichen oder ähnlicher Bindungsspezifität im Umfang dieses Konzepts. In einigen Ausführungsformen bindet der Antikörper spezifisch an ein erfindungsgemäßes Peptid-TAA. Bevorzugte Antigen-erkennende Konstrukte gemäß der Erfindung enthalten eine schwere Antikörperkette, vorzugsweise deren variable Domäne oder ein Antigen-bindendes Fragment davon und/oder eine leichte Kette des Antikörpers, vorzugsweise deren variable Domäne oder ein Antigen-bindendes Fragment davon. In ähnlicher Weise können Disulfid-stabilisierte Fragmente (dsFv) der variablen Region durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, die Antikörperfragmente der Erfindung sind jedoch nicht auf diese beispielhaften Typen von Antikörperfragmenten beschränkt. Auch kann der Antikörper oder der Antigen-bindende Abschnitt davon so modifiziert werden, um einen detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z. B. Goldpartikel) zu enthalten. In einigen Fällen kann die TCR-CDR3-Sequenz leicht modifiziert sein, vorzugsweise jedoch nicht in mehr als 3 Aminosäureresten, vorzugsweise nur in zwei und am meisten bevorzugt nur in einer Aminosäureposition, verglichen mit den in SEQ ID Nos: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117 bereitgestellten CDR3-Sequenzen. Vorzugsweise umfassen die Antikörper die CDR3, vorzugsweise alle CDR1 bis CDR3-Regionen in der Kombination, wie für den TCR der Erfindung in Tabelle 1 angegeben, jeweils unabhängig voneinander, gegebenenfalls mit nicht mehr als drei oder zwei, vorzugsweise einer Aminosäure-Substitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) im Vergleich zu diesen Sequenzen.
  • Geeignete Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel werden Standardverfahren der Hybridomtechnik- in z. B. Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 511–519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), und C. A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)) beschrieben. Alternativ sind andere Verfahren, so wie EBV-Hybridomtechniken (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361–67 (1984), und Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140–67 (1986)), und Bakteriophagen Vektorexpressionssysteme (siehe, z. B., Huse et al., Science, 246, 1275–81 (1989)) im Stand der Technik bekannt. Des Weiteren sind Verfahren zur Produktion von Antikörpern in nicht menschlichen Tieren z. B. in den US-Patenten 5 545 806 , 5 569 825 und 5 714 352 , und in der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0197266 beschrieben.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auch auf TCRs oder funktionelle Fragmente und Polypeptide davon, die lösliche TCRs sind. Im Kontext der Erfindung bezieht sich der Begriff „löslicher T-Zellrezeptor” auf heterodimere trunkierte Varianten von nativen TCRs, die extrazelluläre Anteile der TCRα-Kette und β-Kette umfassen, die zum Beispiel durch eine Disulfidbindung verbunden sind, aber denen die transmembranen und zytosolischen Domänen des nativen Proteins fehlen. Die Begriffe „α-Kettensequenz des löslichen T-Zell-Rezeptors- und β-Kettensequenz des löslichen T-Zell-Rezeptors-” beziehen sich auf TCR α-Ketten- und β-Kettensequenzen, denen die transmembranen und zytosolischen Domänen fehlen. Die Sequenz (Aminosäure oder Nukleinsäure) der löslichen TCRα-Ketten und β-Ketten kann mit den entsprechenden Sequenzen in einem nativen TCR identisch sein oder können α-Ketten und β-Ketten-Variantsequenzen des löslichen TCRs im Vergleich zu entsprechenden nativen TCR-Sequenzen umfassen. Der Begriff „löslicher T-Zellrezeptor”, wie er hier verwendet wird, umfasst lösliche TCRs mit variablen oder nicht-variablen löslichen TCRα-Ketten- und β-Kettensequenzen. Die Variationen können in den variablen oder konstanten Regionen der löslichen TCR-α-Ketten- und β-Kettensequenzen vorliegen und können Aminosäuremutationen in Form von Deletion, Insertion, Substitution sowie Änderungen an der Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz nicht verändern, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche erfindungsgemäße TCRs behalten auf alle Fälle die Bindungsfunktionalität ihrer Elternmoleküle.
  • Das obige Problem wird ferner durch eine Nukleinsäure gelöst, die für ein Antigen-erkennendes Konstrukt der Erfindung oder irgendeines der vorgenannten Protein- oder Polypeptid-Konstrukte kodiert. Die Nukleinsäure hat vorzugsweise (a) einen Strang, der für ein erfindungsgemäßes Antigen-erkennendes Konstrukt kodiert; (b) einen Strang, der komplementär zum Strang in (a) ist; oder (c) einen Strang, der unter stringenten Bedingungen mit einem Molekül hybridisiert, wie in (a) oder (b) beschrieben. Strenge Bedingungen sind dem Fachmann insbesondere aus Sambrook et al, ”Molecular Cloning” bekannt. Darüber hinaus weist die Nukleinsäure gegebenenfalls weitere Sequenzen auf, die zur Expression der dem Protein entsprechenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere zur Expression in einer Säugetier-/menschlichen Zelle, notwendig sind. Die verwendete Nukleinsäure kann in einem Vektor enthalten sein, der geeignet ist, die Expression der Nukleinsäuresequenz, die dem Peptid entspricht, in einer Zelle zu ermöglichen. Jedoch können die Nukleinsäuren auch verwendet werden, um eine antigenpräsentierende Zelle zu transformieren, die nicht auf klassische antigenpräsentierende Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, beschränkt sein kann, so dass sie selbst die entsprechenden Proteine auf ihrer Zelloberfläche produzieren.
  • In einigen Ausführungsformen können die Polypeptide der Antigen-erkennenden Konstrukte durch Nukleinsäuren kodiert und in vivo oder in vitro exprimiert werden. Somit wird in einigen Ausführungsformen eine Nukleinsäure bereitgestellt, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt kodiert. In einigen Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäure einen Teil oder ein Monomer eines Antigen-erkennenden Konstrukts der Erfindung (z. B. eine von zwei Ketten eines erfindungsgemäßen TCR) und/oder eine andere Nukleinsäure kodiert einen anderen Teil oder ein Monomer eines Antigen-erkennenden Konstrukts der Erfindung (zum Beispiel die andere von zwei Ketten des TCR). In einigen Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäure zwei oder mehr Polypeptidketten des Antigen-erkennenden Konstrukts-, beispielsweise mindestens 2 TCR-Ketten. Nukleinsäuren, die für mehrere Ketten des Antigen-erkennenden Konstrukts kodieren, können Nukleinsäure-Spaltstellen zwischen mindestens zwei Kettensequenzen beinhalten, können Transkriptions- oder Translationsstartstellen zwischen zwei oder mehr Kettensequenzen kodieren und/oder können proteolytische Zielstellen zwischen zwei oder mehr Ketten des Antigen-erkennenden Konstrukts kodieren.
  • Der Begriff „Nukleinsäure”, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt „Polynukleotid”, „Oligonukleotid” und „Nukleinsäuremolekül” ein und bedeutet im Allgemeinen ein Polymer von DNA oder RNA, das einzelsträngig oder doppelsträngig, synthetisiert oder aus natürlichen Quellen (z. B. isoliert und/oder gereinigt) erhalten werden kann, die natürliche, nicht natürliche oder veränderte Nukleotide enthalten können und eine natürliche, nicht natürliche oder veränderte Intemukleotidbindung enthalten können, wie eine Phosphoramidatbindung oder eine Phosphorothioatbindung anstelle der Phosphodiester zwischen den Nukleotiden eines unmodifizierten Oligonuldeotids.
  • Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren rekombinant sind. Wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bezieht sich der Begriff „rekombinant” auf (i) Moleküle, die außerhalb lebender Zellen konstruiert werden, indem sie natürliche oder synthetische Nukleinsäuresegmente zu Nukleinsäuremolekülen verbinden, die sich in einer lebenden Zelle replizieren können, oder (ii) Moleküle, die aus der wie oben in (i) beschriebenen Replikation entstehen. Für die Zwecke der Erfindung kann die Replikation eine in vitro-Replikation oder eine in vivo-Replikation sein. Die Nukleinsäure kann jede Nukleotidsequenz umfassen, die für beliebige der TCRs, Polypeptide oder Proteine oder funktionelle Abschnitte oder funktionelle Varianten davon, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, kodiert.
  • Weiterhin stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, umfasst. Wünschenswerterweise ist der Vektor ein Expressionsvektor oder ein rekombinanter Expressionsvektor. Der Begriff ”rekombinanter Expressionsvektor” bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression einer mRNA, eines Proteins oder Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann jeder geeignete rekombinante Expressionsvektor sein und kann verwendet werden, um jeden geeigneten Wirt zu transformieren oder zu transfizieren. Geeignete Vektoren umfassen diejenigen, die für die Vermehrung und Expansion oder für die Expression oder für Beides, wie Plasmide und Viren, entwickelt sind. Beispiele von tierischen Expressionsvektoren enthalten pEUK-Cl, pMAM und pMAMneo. Es ist bevorzugt, dass der rekombinante Expressionsvektor ein viraler Vektor, z. B. ein retroviraler Vektor, ist. Der rekombinante Expressionsvektor umfasst regulatorische Sequenzen, wie Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationscodons, die spezifisch für den Typ der Wirtszelle (z. B. Bakterium, Pilz, Pflanze oder Tier) sind, in die der Vektor eingeführt werden soll und in der die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durchgeführt werden kann. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Vektor ein oder mehrere Markergene enthalten, die die Selektion von transformierten oder transfizierten Wirten ermöglichen. Der rekombinante Expressionsvektor kann einen nativen oder normativen Promotor umfassen, der operativ mit der Nukleotidsequenz verknüpft ist, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte oder die Nukleotidsequenz kodiert, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist oder mit dieser hybridisiert, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte kodiert. Die Selektionen von Promotoren umfassen z. B. starke, schwache, induzierbare, gewebespezifische und entwicklungsspezifische Promotoren. Der Promoter kann ein nicht viraler Promoter oder ein viraler Promoter sein. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können entweder für transiente Expression, für eine stabile Expression oder für beide konzipiert sein. Auch können die rekombinanten Expressionsvektoren für die konstitutive Expression oder für die induzierbare Expression hergestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß der Erfindung umfasst. Im Speziellen umfasst die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben. Die Wirtszelle kann eine eukaryotische Zelle, z. B. Pflanze, Tier, Pilze oder Algen oder sie kann eine prokaryotische Zelle z. B. Bakterien oder Protozoen sein. Die Wirtszelle kann eine kultivierte Zelle oder eine primäre Zelle sein, d. h. direkt aus einem Organismus, z. B. einem Menschen, isoliert werden. Die Wirtszelle kann eine adhärente Zelle oder eine suspendierte Zelle sein, d. h. eine Zelle, die in Suspension wächst. Zur Herstellung eines rekombinanten TCRs, Polypeptids oder Proteins ist die Wirtszelle vorzugsweise eine Säugetierzelle. Am meisten bevorzugt ist, dass die Wirtszelle eine menschliche Zelle ist. Während die Wirtszelle von einem beliebigen Zelltyp, kann aus irgendeiner Art von Gewebe stammen und von irgendeiner Entwicklungsstufe sein kann, ist die Wirtszelle vorzugsweise ein peripherer Blutleukozyt (PBL) oder eine periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC). Es ist weiter bevorzugt, dass die Wirtszelle eine T-Zelle ist. Die T-Zelle kann jede T-Zelle sein, wie eine kultivierte T-Zelle, z. B. eine primäre T-Zelle oder eine T-Zelle aus einer kultivierten T-Zelllinie, z. B. Jurkat, SupT1 usw., oder eine T-Zelle, die aus einem Säugetier erhalten wird, vorzugsweise eine T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem menschlichen Patienten. Wenn sie von einem Säugetier erhalten wird, kann die T-Zelle aus zahlreichen Quellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus oder anderen Geweben oder Flüssigkeiten erhalten werden. T-Zellen können auch angereichert oder aufgereinigt sein. Bevorzugt ist die T-Zelle eine menschliche T-Zelle. Es ist weiter bevorzugter, dass die T-Zelle eine T-Zelle ist, die aus einem Menschen isoliert wurde. Die T-Zelle kann jede beliebige Art von T-Zelle und in jeder Entwicklungsstufe sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CD4-positive und/oder CD8-positive, CD4-positive T-Helfer-Zellen, z. B. Th1- und Th2-Zellen, CD8- positive T-Zellen (z. B. zytotoxische T-Zellen), Tumor-infiltrierende Zellen (TILs), T-Gedächtnis-Zellen, naive T-Zellen und dergleichen. Bevorzugt ist die T-Zelle eine CD8-positive T Zelle oder eine CD4-positive T-Zelle.
  • Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Wirtszelle ein Lymphozyt, vorzugsweise ein T-Lymphozyt, wie eine CD4-positive oder CD8-positive T-Zelle. Die Wirtszelle ist weiterhin vorzugsweise eine tumorreaktive T-Zelle, die für TAA-exprimierende Tumorzellen spezifisch ist.
  • Die Aufgabe der Erfindung wird auch durch ein Verfahren zur Herstellung eines TAA-spezifischen Antigen-erkennenden Konstruktes oder einer Expressionszelllinie des TAA-spezifischen Antigen-erkennenden Konstruktes gelöst, das Verfahren umfassend
    • a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
    • b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die ein Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der hier offenbarten Erfindung kodiert,
    • c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle, und
    • d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  • Das Verfahren kann ferner einen Schritt der Zelloberflächenpräsentation des Antigenerkennenden Konstrukts auf der geeigneten Wirtszelle umfassen.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das genetische Konstrukt ein Expressionskonstrukt, das eine Promotorsequenz umfasst, die operativ mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
  • Vorzugsweise ist das Antigen-erkennende Konstrukt des Säugetier-Ursprungs, vorzugsweise des menschlichen Ursprungs. Die bevorzugte geeignete Wirtszelle zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung ist eine Säugetierzelle, wie eine menschliche Zelle, insbesondere ein menschlicher T-Lymphozyt. T-Zellen für die Verwendung in der Erfindung sind oben ausführlich beschrieben.
  • Ebenfalls sind von der Erfindung Ausführungsformen umfasst, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein modifiziertes TCR ist, wobei die Modifikation die Zugabe von funktionellen Domänen ist, wie beispielsweise eine Markierung oder eine therapeutisch wirksame Substanz. Weiterhin sind TCRs mit alternativen Domänen wie einer alternativen Membran-Anker-Domäne anstelle der endogenen Transmembranregion umfasst.
  • Wünschenswerterweise ist das Transfektionssystem zum Einführen des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle ein retrovirales Vektorsystem. Solche Systeme sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in einer Ausführungsform der zusätzliche Verfahrensschritt der Isolierung und Reinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der Zelle und gegebenenfalls der Rekonstitution der translatierten Fragmente des Antigenerkennenden Konstrukts in einer T-Zelle.
  • In einem alternativen Aspekt der Erfindung wird eine T-Zelle bereitgestellt, die durch ein Verfahren zur Herstellung eines T-Zellrezeptors (TCR) erhalten wird, der für Tumorzellen spezifisch ist und eine hohe Avidität aufweist, wie oben beschrieben. Eine solche T-Zelle hängt von der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Wirtszelle ab, beispielsweise einer menschlichen oder nicht-menschlichen T-Zelle, vorzugsweise einem humanen TCR.
  • Der Begriff „isoliert”, wie er im vorliegenden Dokument im Zusammenhang mit einem Polypeptid, wie einem Antigen-erkennenden Konstrukt (ein Beispiel davon könnte ein Antikörper sein) verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid, das aus Proteinen oder Polypeptiden oder anderen Verunreinigungen, die seine therapeutische, diagnostische, prophylaktische, mit Forschung verbundene oder andere Verwendung stören würden, aufgereinigt wird. Ein erfindungsgemäßes Antigen-erkennendes Konstrukt kann ein rekombinantes, synthetisches oder modifiziertes (nicht natürliches) Antigen-bindendes Konstrukt sein. Der Begriff „isoliert”, wie er im vorliegenden Dokument im Zusammenhang mit einer Nukleinsäure oder Zellen verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäure oder Zellen, die von DNA, RNA, Proteinen oder Polypeptiden oder anderen Verunreinigungen (wie anderen Zellen) aufgereinigt wird/werden, die ihre therapeutische, diagnostische, prophylaktische, mit Forschung verbundene oder andere Verwendung stören würden, oder er bezieht sich auf eine rekombinante, synthetische oder modifizierte (nicht natürliche) Nukleinsäure. In diesem Zusammenhang wird ein „rekombinantes” Protein/Polypeptid oder eine Nukleinsäure unter Verwendung von rekombinanten Techniken hergestellt. Verfahren und Techniken zur Herstellung von rekombinanten Nukleinsäuren und Proteinen sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Behandlungsmethoden und Erkrankungen
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die im Kontext der Erfindung offenbarten Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen zur Verwendung in der Medizin. Die Verwendung in der Medizin umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung bei der Diagnose, Prävention und/oder Behandlung einer Tumorerkrankung, wie einer malignen oder gutartigen Tumorerkrankung. Die Tumorerkrankung ist beispielsweise eine durch die Expression des TAA charakterisierte Tumorerkrankung in einer Krebs- oder Tumorzelle der Tumorerkrankung.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen der Antigen-erkennenden Konstrukte und anderer daraus abgeleiteter Materialien, die sich darauf beziehen oder entsprechend kodieren, können die zu behandelnden und/oder zu diagnostizierenden Krankheiten gemäß der vorliegenden Offenbarung jede proliferative Störung sein, die vorzugsweise durch die Expression der TAA- oder TAA-Epitopsequenz der Erfindung gekennzeichnet ist, kann zum Beispiel jegliche Krebsart sein, einschließlich akuten lymphatischen Krebses, akuten myeloischen Leukämie, alveolären Rhabdomyosarkoms, Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanals oder Anorektums, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, der Gallenblase oder des Pleuras, Krebses der Nase, des Nasenhohlraums oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebses, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebs des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, des bösartigen Mesothelioms, Melanoms, multiplen Myeoms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, des Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein TAA-positiver Krebs, umfassend vorzugsweise Melanom, gastrointestinalen Krebs und Darmkrebs.
  • Die Konstrukte, Proteine, TCR-Antikörper, Polypeptide und Nukleinsäuren der Erfindung sind insbesondere zur Verwendung in der Immuntherapie, vorzugsweise in der Adoptiv-T-Zelltherapie geeignet. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann beispielsweise die Infusion von erfindungsgemäßen T-Zellen in den Patienten einbeziehen. Vorzugsweise sind solche T-Zellen autologe T-Zellen des Patienten, die in vitro mit einem Nukleinsäure- oder Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Erfindung transduziert wurden.
  • Die erfindungsgemäßen Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine (einschließlich funktioneller Varianten davon), Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-Bindungsabschnitten davon), von denen alle gemeinsam im Folgenden als „erfindungsgemäße TCR-Materialien” bezeichnet werden, können in einer Zusammensetzung, wie einer pharmazeutische Zusammensetzung, formuliert werden. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die jegliches der Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine, funktionelle Abschnitte, funktionelle Varianten, Nukleinsäuren, Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-bindende Abschnitte davon umfasst), die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Stabilisator. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein beliebiges der erfindungsgemäßen TCR-Materialien enthalten, können mehr als ein erfindungsgemäßes TCR-Material umfassen, z. B. ein Polypeptid und eine Nukleinsäure oder zwei oder mehr verschiedener TCRs (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktionelle Varianten davon). Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein erfindungsgemäßes TCR-Material in Kombination mit anderem(n) pharmazeutischen Wirkstoff(en) oder Arzneimitteln) wie chemotherapeutischen Mitteln, z. B. Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Cisplatin, Daunorubicin, Doxorubicin, Fluorouracil, Gemcitabin, Hydroxyharnstoff, Methotrexat, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastin, Vincristin usw. umfassen. Bevorzugt ist der Träger ein pharmazeutisch akzeptabler Träger. In Bezug auf pharmazeutische Zusammensetzungen kann der Träger irgendeiner von denen sein, die üblicherweise für das jeweilige erfindungsgemäße TCR-Material verwendet werden. Solche pharmazeutisch akzeptablen Träger sind dem Fachmann gut bekannt und stehen der Öffentlichkeit leicht zur Verfügung. Es ist bevorzugt, dass der pharmazeutisch akzeptable Träger einer ist, der unter den Verwendungsbedingungen keine nachteiligen Nebenwirkungen oder Toxizität aufweist.
  • So wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die jedes der im Kontext beschriebenen Produkte der Erfindung und TCR-Materialien der Erfindung umfasst, insbesondere alle Proteine, Nukleinsäuren oder Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die Immuntherapie, vorzugsweise Adoptivzelltherapie vorgesehen.
  • Es ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße TCR-Material durch Injektion, z. B. intravenös, verabreicht wird. Wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine Wirtszelle ist, die das erfindungsgemäße TCR (oder eine funktionelle Variante davon) exprimiert, kann der pharmazeutisch akzeptable Träger für die Zellen zur Injektion jeden isotonischen Träger, wie z. B. normale Kochsalzlösung (etwa 0,90% w/v, NaCl in Wasser, etwa 300 mOsm/l NaCl in Wasser oder etwa 9,0 g NaCl pro Liter Wasser), NORMOSOL R-Elektrolytlösung (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), etwa 5% Dextrose im Wasser oder Ringer-Laktat enthalten. In einer Ausführungsform wird der pharmazeutisch akzeptable Träger mit humanem Serumalbumin ergänzt.
  • Für die Zwecke der Erfindung kann die Menge oder Dosis (z. B. Anzahl von Zellen, wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine oder mehrere Zellen ist) des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um z. B. eine therapeutische oder prophylaktische Antwort in dem Subjekt oder Tier über einen angemessenen Zeitrahmen zu beeinflussen. Beispielsweise sollte die Dosis des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um an ein Krebsantigen zu binden oder Krebs in einer Zeitspanne von etwa 2 Stunden oder länger, z. B. 12 bis 24 oder mehr Stunden, von der Zeit an, an der es verabreicht wurde, zu detektieren, zu behandeln oder zu verhindern. In bestimmten Ausführungsformen kann der Zeitraum noch länger sein. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit des speziellen erfindungsgemäßen TCR-Materials und den Zustand des Tieres (z. B. Menschen) sowie des Körpergewichtes des zu behandelnden Tieres (z. B. Menschen) bestimmt.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, Antigen-erkennende Konstrukte, TCRs (einschließlich funktioneller Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen oder Populationen von Zellen in Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs oder TAA-positiver Krankheitsvorstufe verwendet werden können Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen TCRs (und funktionelle Varianten davon) spezifisch an das TAA der Erfindung binden, so dass das TCR (oder verwandte erfindungsgemäße Polypeptid oder Protein und funktionelle Varianten davon), wenn es durch eine Zelle oder auf einer Zelle, so wie einer T-Zelle, exprimiert wird, in der Lage ist, eine Immunantwort gegen eine Zielzelle zu vermitteln, die das TAA der Erfindung exprimiert, bevorzugt präsentierend von TAA-Peptiden über MHC I oder MHC II auf der Oberfläche der Zielzelle. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung eines Zustands, insbesondere Krebses, bei einem Säugetier bereit, umfassend die Verabreichung an das Säugetier einer der pharmazeutischen Zusammensetzungen, Antigen-erkennende Konstrukte, insbesondere TCRs (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide oder Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, einer beliebigen Nukleinsäure oder einen beliebigen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen beliebigen der TCRs (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide, Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, oder eine beliebige Wirtszelle oder Population von Zellen, die eine Nukleinsäure oder einen rekombinanten Vektor umfassen, der ein beliebiges der im Kontext beschriebenen Konstrukte der Erfindung (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide oder Proteine in einer Menge, die wirksam ist, um den Zustand in dem Säugetier zu behandeln oder zu verhindern, wobei der Zustand bevorzugt Krebs, der die TAA der Erfindung exprimiert, ist.
  • Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Stabilisatoren wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Glukose, Dextran), Proteine wie Albumin oder Casein, Protein enthaltende Mittel, wie Rinderserum oder Magermilch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer).
  • Die Begriffe „behandeln” und „verhindern” sowie Wörter, die daraus stammen, wie sie im Kontext der Erfindung verwendet werden, bedeuten nicht notwendigerweise 100%-ige oder vollständige Behandlung oder Prävention. Vielmehr gibt es unterschiedliche Behandlungs- oder Vorbeugungsgrade, von denen der durchschnittliche Fachmann den potentiellen Nutzen oder therapeutischen Effekt erkennt. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Verfahren jede beliebige Menge jeder beliebigen Behandlungs- oder Vorbeugungsstufe eines Zustandes bei einem Säugetier bereitstellen. Weiterhin kann die Behandlung oder Vorbeugung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt wird, die Behandlung oder Vorbeugung einer oder mehrerer Zustände oder Symptome des zu behandelnden oder vorzubeugenden Zustands, z. B. Krebs, einschließen. Zum Beispiel kann die Behandlung oder Vorbeugung die Förderung der Regression eines Tumors einschließen. Auch kann die ”Vorbeugung” für die Zwecke der Erfindung die Verzögerung des Beginns des Zustandes oder eines Symptoms oder eines Zustandes davon umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, umfassend die Verabreichung eines TCR, einer Nukleinsäure oder einer Wirtszelle der vorliegenden Beschreibung in Kombination mit mindestens einem chemotherapeutischen Mittel und/oder einer Strahlentherapie.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis eines TAA-Proteins oder eines Komplexes aus MHC und dem TAA-Protein (Proteinepitop der TAA) in einer (biologischen) Probe, wie sie von einem Subjekt oder Patienten erhalten wird, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Antigen-erkennenden Konstrukt, das spezifisch an das TAA-Peptid oder an den TAA-Peptid/MHC-Komplex bindet, und der Nachweis der Bindung zwischen dem Antigen-erkennenden Konstrukt und dem TAA-Peptid oder dem TAA-Peptid/MHC-Komplex. In einigen Ausführungsformen ist das Antigen-erkennende Konstrukt ein TCR oder ein Antikörper oder ähnliche Konstrukte oder vorzugsweise das Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der im vorliegenden Dokument beschriebenen Erfindung. In einigen Ausführungsformen ist die (biologische) Probe eine Probe eines Tumors oder eines Krebserkrankung (wie einer der im vorliegenden Kontext anderswo beschriebenen), beispielsweise einer Probe, die Tumor- oder Krebszellen umfasst.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    • a) Isolierung einer Zelle aus dem Subjekt;
    • b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    • c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    • d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    • a) Isolierung einer Zelle von einem gesundem Spender
    • b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    • c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    • d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls wird ein Verfahren zum Nachweis von Krebs in einer biologischen Probe bereitgestellt, das Verfahren umfassend:
    • a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Beschreibung;
    • b) Nachweisen der Bindung des Antigen-erkennenden Konstrukts mit der biologischen Probe.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Verfahren zum Nachweis von Krebs in vitro, in vivo oder in situ durchgeführt.
  • Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Zustandes bei einem Säugetier. Das Verfahren umfasst (i) Inkontaktbringen einer Probe, die eine oder mehrere Zellen aus dem Säugetier umfasst, mit einem beliebigen der erfindungsgemäßen TCRs (und funktionellen Varianten davon), Polypeptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, rekombinanten Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen, Antikörpern oder Antigen-bindenden Abschnitten davon oder mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, wodurch ein Komplex gebildet wird und der Komplex nachgewiesen wird, wobei der Nachweis des Komplexes das Vorhandensein des Zustandes in dem Säugetier anzeigt, wobei der Zustand Krebs ist, so wie eine TAA-exprimierende bösartige Erkrankung.
  • In Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Zustandes bei einem Säugetier kann die Probe von Zellen eine Probe sein, die ganze Zellen, Lysate davon oder einen Anteil der gesamten Zelllysate, z. B. eine nukleare oder zytoplasmatische Fraktion, eine ganze Proteinfraktion oder eine Nukleinsäurefraktion umfasst.
  • Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens kann das Inkontaktbringen in vitro oder in vivo in Bezug auf das Säugetier erfolgen. Bevorzugt ist das Inkontaktbringen in vitro.
  • Auch kann der Nachweis des Komplexes durch eine beliebige Anzahl von in der Technik bekannten Möglichkeiten erfolgen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antigenerkennenden Konstrukte (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen oder Antikörpern oder TCRs oder Antigen-bindende Abschnitte davon, die im Kontext beschrieben sind, mit einem detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z. B. Goldpartikel) markiert werden.
  • Für die Zwecke der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen Wirtszellen oder Populationen von Zellen verabreicht werden, können die Zellen Zellen sein, die in Bezug auf Säugetier allogen oder autolog sind. Es ist bevorzugt, dass die Zellen zu dem Säugetier autolog sind.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen des TCR-Materials kann der zu behandelnde und/oder zu diagnostizierende Krebs jegliche Krebsart sein, einschließlich eines akuten lymphatischen Krebses, einer akuten myeloischen Leukämie, eines alveolären Rhabdomyosarkoms, eines Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanal oder Anorektum, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, Gallenblase oder Pleura, Krebses der Nase, Nasenhohlraum oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebs, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, bösartigen Mesotheliomes, Melanoms, multiplen Myeoms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein TAA-positiver Krebs, so wie Hautkrebs, wie – vorzugsweise – Melanom, gastrointestinaler Krebs oder Magenkrebs.
  • Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts bereit, das an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, umfassend die Verabreichung der Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen, wie durch die vorliegende Erfindung offenbart. Vorzugsweise ist das Subjekt ein Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt. Der Gegenstand in bevorzugten Ausführungsformen ist ein Säugetier-Subjekt, vorzugsweise ein menschlicher Patient, der an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, welche TAA-positiv ist.
  • Angesichts der vorliegenden Offenbarung ist zu erkennen, dass die Erfindung weiterhin die folgenden Punkte betrifft:
    Gegenstand 1: Ein Antigen-erkennendes Konstrukt, umfassend zumindest eine komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) 3 mit einer Sequenzidentität von zumindest 50% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117.
  • Gegenstand 2: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Gegenstand 1, wobei das Antigen-erkennendes Konstrukt in der Lage ist, spezifisch und/oder selektiv an ein erfindungsgemäßes TAA Antigenpeptid zu binden.
  • Gegenstand 3: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Gegenstand 1 oder 2, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein Antikörper oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist, oder ein T-Zellrezeptor (TCR) oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist.
  • Gegenstand 4: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt an ein durch das menschliche Leukozyten-Antigen (HLA) präsentierte TAA-Antigenpeptid bindet, wobei das HLA gegebenenfalls Typ A2 ist.
  • Gegenstand 5: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei das Konstrukt spezifisch und/oder selektiv an ein Epitop bindet, das die aus den SEQ ID NOs: 133 bis 142 ausgewählte Aminosäuresequenz, bevorzugt SEQ ID NO: 133 aufweist.
  • Gegenstand 6: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei das Konstrukt ein α/β-TCR oder ein Fragment oder Derivat davon ist oder das Konstrukt ein γ/δ-TCR oder ein Fragment oder Derivat davon ist.
  • Gegenstand 7: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt menschlichen Ursprungs ist und spezifisch und/oder selektiv ein TAA-Antigenpeptid erkennt.
  • Gegenstand 8: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 7, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Subjekt zu induzieren, wobei die Immunantwort optional durch eine Erhöhung der Interferon(IFN)γ-Spiegel charakterisiert ist.
  • Gegenstand 9: Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 8, umfassend eine TCRα- oder γ-Kette; und/oder eine TCRβ- oder δ-Kette umfassen; wobei die TCRα- oder γ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 und 111 umfasst, und/oder wobei die TCRβ- oder δ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 und 117 umfasst.
  • Gegenstand 10: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Gegenstand 9, wobei TCRα-oder γ-Kette weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 und 109; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98 und 110 umfasst.
  • Gegenstand 11: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach Gegenstand 9 oder 10, wobei die TCRβ- oder δ-Kette weiterhin einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 und 115; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 und 116 umfasst.
  • Gegenstand 12: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 11, umfassend eine variable Kettenregion des TCRs mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 und 118.
  • Gegenstand 13: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 11, wobei das Konstrukt humanisiert, chimärisiert und/oder murinisiert ist.
  • Gegenstand 14: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend ein Bindungsfragment eines TCRs, und wobei das Bindungsfragment CDR1 bis CDR3, optional ausgewählt aus den CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nos. 1, 2, 3 oder 7, 8, 9 oder 13, 14, 15 oder 19, 20, 21 oder 25, 26, 27 oder 31, 32, 33 oder 43, 44, 45 oder 49, 50, 51 oder 55, 56, 57 oder 61, 62, 63 oder 67, 68, 69 oder 73, 74, 75 oder 79, 80, 81 oder 85, 86, 87 oder 91, 92, 93 oder 97, 98, 99 oder 103, 104, 105 oder 109, 110, 111 oder 115, 116, 117 umfasst.
  • Gegenstand 15: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 14, wobei das Konstrukt ein TCR oder ein Fragment davon ist, der aus zumindest einer TCR α- und einer TCRβ-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis 3 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 7 bis 9 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13 bis 15 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 19 bis 21 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 25 bis 27 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 31 bis 33 umfasst, oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 37 bis 39 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 43 bis 45 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 49 bis 51 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 55 bis 57 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 61 bis 63 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 67 bis 69 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 73 bis 75 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 79 bis 81 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 85 bis 87 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 91 bis 93 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 97 bis 99 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 103 bis 105 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 109 bis 111 umfasst, und die TCRβ-Kettensequenz die CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 115 bis 117 umfasst.
  • Gegenstand 16: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 15, wobei das Konstrukt ein TCR oder ein Fragment davon ist, der aus zumindest einer TCR α- und einer TCRβ-Kettensequenz gebildet ist, wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 4 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 10 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 16 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 22 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 28 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 34 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 40 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 46 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 52 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 58 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 64 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 70 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 76 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 82 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 88 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 94 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 100 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 106 umfasst; oder wobei die TCRα-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 112 umfasst, und wobei die TCRβ-Kettensequenz eine Sequenz der variablen Region mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 118 umfasst.
  • Gegenstand 17: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 16, wobei das Konstrukt ein TCR oder ein Fragment davon ist, des Weiteren umfassend eine konstante Region von TCR mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 und 119, bevorzugt ist, dass der TCR aus mindestens einer TCRα- und einer TCRβ-Kettensequenz besteht, wobei die TCRα-Kettensequenz eine konstante Region mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 und 113 umfasst.
  • Gegenstand 18: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 6, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 12.
  • Gegenstand 19: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 18, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 24.
  • Gegenstand 20: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 30, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 36.
  • Gegenstand 21: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 42, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 48.
  • Gegenstand 22: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 54, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 60.
  • Gegenstand 23: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 66, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 72.
  • Gegenstand 24: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 78, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 84.
  • Gegenstand 25: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 90, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 96.
  • Gegenstand 26: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 102, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 108.
  • Gegenstand 27: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 17, umfassend eine erste TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 114, und eine zweite TCR-Kette mit einer Sequenzidentität von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% oder 100% zu der Aminosäuresequenz mit SEQ ID No. 120.
  • Gegenstand 28: Nukleinsäure, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 27 kodiert.
  • Gegenstand 29: Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach Gegenstand 28.
  • Gegenstand 30: Wirtszelle umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 27, eine Nukleinsäure nach Gegenstand 28 oder einen Vektor nach Gegenstand 29.
  • Gegenstand 31: Die Wirtszelle gemäß Gegenstand 30, wobei die Zelle ein Lymphozyt ist, vorzugsweise ein T-Lymphozyt oder T-Lymphozyten-Vorläufer, bevorzugter eine CD4- oder CD8-positive T-Zelle.
  • Gegenstand 32: Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 27 oder die Nukleinsäure nach Gegenstand 28 oder den Vektor nach Anspruch 29 oder die Wirtszelle nach Gegenstand 30 oder 31 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Stabilisator und/oder Hilfsstoff.
  • Gegenstand 33: Das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 27 oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 28 oder ein Vektor nach Gegenstand 29 oder eine Wirtszelle nach Gegenstand 30 oder 31 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Gegenstand 32 zur Verwendung in der Medizin.
  • Gegenstand 34: Das Antigen-erkennende Konstrukt oder die Nukleinsäure oder der Vektor oder die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach Gegenstand 33 zur Verwendung bei der Diagnose, Prävention und/oder Behandlung einer proliferativen Erkrankung, wobei die Krankheit bösartige oder gutartige Tumorerkrankung umfasst.
  • Gegenstand 35: Das Antigen-erkennende Konstrukt oder die Nukleinsäure oder der Vektor oder die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach Gegenstand 34, wobei die Tumorerkrankung durch die Expression von TAA in einer Tumorzelle der Tumorerkrankung gekennzeichnet ist.
  • Gegenstand 36: Das Antigen-erkennende Konstrukt oder die Nukleinsäure oder der Vektor oder die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Gegenstände 33 bis 35, wobei die Verwendung in der Medizin eine Verwendung in der Immuntherapie ist, die optional einen Adoptivzelltransfer umfasst, wobei die Immuntherapie eine autologe oder heterologe adoptive T-Zelltherapie umfasst.
  • Gegenstand 37: Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die das TAA-spezifische Antigen-erkennende Konstrukt exprimiert, umfassend
    • a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
    • b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Gegenstände 1 bis 27 kodiert,
    • c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle,
    • d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  • Gegenstand 38: Das Verfahren nach Gegenstand 37 weiterhin umfassend die Zelloberflächenpräsentation des Antigen-erkennenden Konstrukts.
  • Gegenstand 39: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 oder 38, wobei das genetische Konstrukt ein Expressionskonstrukt ist, das eine Promotorsequenz umfasst, die operativ mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
  • Gegenstand 40: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 bis 39, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt des Säugetierursprungs, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, ist.
  • Gegenstand 41: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 bis 40, wobei die geeignete Wirtszelle eine Säugetierzelle, optional ausgewählt aus einer menschlichen Zelle oder einem menschlichen T-Lymphozyten ist.
  • Gegenstand 42: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 bis 41, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein modifizierter TCR ist, wobei die Modifikation die Addition einer funktionellen Domäne umfasst, die eine Markierung umfasst, oder eine alternative Domäne, die eine Membran-Anker-Domäne umfasst.
  • Gegenstand 43: Das Verfahren nach Gegenstand 42, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein alpha/beta TCR, gamma/delta TCR oder ein Einzelketten-TCR (scTCR) ist.
  • Gegenstand 44: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 bis 43, wobei das genetische Konstrukt durch retrovirale Transfektion in die geeignete Wirtszelle eingeführt wird.
  • Gegenstand 45: Das Verfahren nach einem der Gegenstände 37 bis 44, weiterhin umfassend die Isolierung und Aufreinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der geeigneten Wirtszelle und, optional, Rekonstitution des Antigen-erkennenden Konstrukts in eine T-Zelle.
  • Gegenstand 46: Ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen aberrant ein TAA exprimieren, das Verfahren umfassend Verabreichung einer effektiven Anzahl von T-Zellen, die einen TCR einer der vorhergehenden Gegenstände, die Nukleinsäure, den Expressionsvektor, die Wirtszelle und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung der zuvor genannten Gegenstände exprimieren, an den Patienten.
  • Gegenstand 47: Der TCR nach einem der zuvor genannten Gegenstände, wobei die alpha-Kette eine TCR-alpha-variable Domäne umfasst, die mindestens 95% der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 identisch ist; und die Beta-Kette eine TCR-beta-variablen Domäne umfasst, die mindestens 95% der SEQ ID NO: 10 identisch ist, und wobei der TCR spezifisch an einen Komplex aus TAA-Peptid und MHC-Molekül bindet.
  • Gegenstand 48: Der TCR nach einem der zuvor genannten Gegenstände mit mindestens einer Mutation in der alpha-Kette im Vergleich zu SEQ ID NO: 4 und/oder mit mindestens einer Mutation in der Beta-Kette im Vergleich zu SEQ ID NO: 10 ist, und wobei der TCR eine Bindungsaffinität für und/oder eine Bindungshalbwertszeit für einen Komplex aus dem TAA-Peptid und HLA-Molekül aufweist, der mindestens das Doppelte des nicht mutierten TCRs für das gleiche Peptid ist.
  • Gegenstand 49: Der TCR nach einem der zuvor genannten Gegenstände mit mindestens einer Mutation in der alpha-Kette im Vergleich zu SEQ ID NO: 4 und/oder mit mindestens einer Mutation in der Beta-Kette im Vergleich zu SEQ ID NO: 10 ist, und wobei der TCR eine modifizierte Glycosylierung im Vergleich zu dem nicht mutierten TCR aufweist.
  • Gegenstand 50: Das Verfahren nach einem der zuvor genannten Gegenstände, wobei der TCR, die Nukleinsäure, der Expressionsvektor, die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung in mindestens zwei Verabreichungen mit einem Abstand von mindestens 24 Stunden verabreicht wird.
  • Gegenstand 51: Das Verfahren nach Gegenstand 50, wobei der TCR, die Nukleinsäure, der Expressionsvektor, die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung dem Subjekt über einen Zeitraum von Tagen, Wochen oder Monaten verabreicht wird, beispielsweise durch lokale Infusion, wie durch eine Infusionspumpe und/oder ein Kathetersystem.
  • Gegenstand 52: Das Verfahren nach Gegenstand 51, wobei die lokale Infusion in einen festen Tumor, ein Blutgefäß, das einen festen Tumor fördert, und/oder den Bereich, der einen festen Tumor umgibt, erfolgt.
  • Gegenstand 52: Behandlungsverfahren nach einem der zuvor genannten Gegenständen, wobei der TCR, die Nukleinsäure, der Expressionsvektor, die Wirtszelle oder die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Dosis von etwa 104 bis etwa 1010 Zellen pro Dosis verabreicht werden.
  • Gegenstand 53: Ein TCR umfassend mindestens eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) der alpha-Kette, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer alpha-Kette CDR1, CDR2 und CDR3 von SEQ ID NO: 4 und/oder mindestens eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) der beta-Kette, ausgewählt aus die Gruppe bestehend aus einer beta-Kette CDR1, CDR2 und CDR3 von SEQ ID NO: 10, und wobei der TCR spezifisch an einen Komplex aus dem TAA-Peptid und MHC-Molekül bindet.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen mit Referenz zu den begleitenden Abbildungen und Sequenzen beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen. In den Abbildungen und den Sequenzen:
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R26P1A9 (SEQ ID NO: 1-12) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R26P2A6 (SEQ ID NO: 13–24) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spendern gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R26P3H1 (SEQ ID NO: 25–36) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spendern gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R35P3A4 (SEQ ID NO: 37–48) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R37P1C9 (SEQ ID NO: 49–60) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R37P1H1 (SEQ ID NO: 61–72) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spendern gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R42P3A9 (SEQ ID NO: 73–84) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spendern gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R43P3F2 (SEQ ID NO: 85–96) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R43P3G5 (SEQ ID NO: 97–108) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCR R59P2E7 (SEQ ID NO: 109–120) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder verschiedenen MAGEA1-003 Substitutionsvarianten von Alanin an den Positionen 1–9 von SEQ ID NO.: 1 (SEQ ID NO: 134–142) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spendern gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R26P1A9 (SEQ ID NO: 1–12) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R26P2A6 (SEQ ID NO: 13–24) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSDI-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R26P3H1 (SEQ ID NO: 25–36) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R35P3A4 (SEQ ID NO: 37–48) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R37P1C9 (SEQ ID NO: 49–60) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R37P1H1 (SEQ ID NO: 61–72) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R42P3A9 (SEQ ID NO: 73–84) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R43P3F2 (SEQ ID NO: 85–96) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R43P3G5 (SEQ ID NO: 97–108) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : IFNγ-Freisetzung durch CD8+ T-Zellen, welche mit alpha- und beta-Ketten-RNA von TCRs R59P2E7 (SEQ ID NO: 109–120) elektroporiert wurden, nach Ko-Inkubation mit T2 Zielzellen, beladen mit dem Peptid MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) oder homologen, aber nicht verwandten Peptiden TMEM175-001 (SEQ ID NO: 143), EPAS-001 (SEQ ID NO: 144), PTRF-001 (SEQ ID NO: 145), GALNTL4-001 (SEQ ID NO: 146), PSME2-001 (SEQ ID NO: 147), KIAA103-002 (SEQ ID NO: 148), NSD1-001 (SEQ ID NO: 149), TBC1D9-002 (SEQ ID NO: 150), TMTC4-001 (SEQ ID NO: 151) oder RASAL2-002 (SEQ ID NO: 152) oder dem Kontrollpeptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 153). IFNγ Freisetzungsdaten wurden mit CD8+ T-Zellen erhalten, die von zwei verschiedenen Spender gewonnen wurden. RNA-elektroporierte CD8+ T-Zellen dienten allein oder in Ko-Inkubation mit unbeladenen Zielzellen als Kontrollen. Spender 1 (TCRA-0004) ist auf der linken Y-Achse dargestellt, Spender 2 (TCRA-0005) ist auf der rechten Y-Achse dargestellt.
  • : HLA-A*02/MAGEA1-003-Tetramer bzw. HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramerfärbung von CD8+ T-Zellen, die mit einer alpha- und beta-Ketten-RNA der TCRs R26P2A6 und R26P3H1 elektroporiert wurden. CD8+ T-Zellen, die mit einer RNA von 1G4 TCR elektroporiert wurden, die spezifisch an HLA-A*02/NYESO1-001-Komplex binden, und die Mock-elektroporierte CD8+-T-Zellen dienten als Kontrollen. Tabelle 1: Erfindungsgemäße TCR-Sequenzen
    Figure DE102016123847B3_0002
    Figure DE102016123847B3_0003
    Figure DE102016123847B3_0004
    Figure DE102016123847B3_0005
    Figure DE102016123847B3_0006
    Figure DE102016123847B3_0007
    Figure DE102016123847B3_0008
    Figure DE102016123847B3_0009
    Figure DE102016123847B3_0010
    Figure DE102016123847B3_0011
    Figure DE102016123847B3_0012
    Figure DE102016123847B3_0013
    Figure DE102016123847B3_0014
    Figure DE102016123847B3_0015
    Tabelle 2: Erfindungsgemäße Peptidsequenzen
    Figure DE102016123847B3_0016
    Figure DE102016123847B3_0017
  • BEISPIELE
  • Zehn MAGEA1-003-spezifische TCRs (R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 und R59P2E7, siehe Tabelle 1), jede kodierende tumorspezifische TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten wurden aus T-Zellen von gesunden Spender isoliert und amplifiziert. Zellen von gesunden Spender wurden in vitro nach einem zuvor beschriebenen Verfahren stimuliert (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15; 171(10): 4974–8) und zielspezifische Zellen wurden mit HLA-A*02-Multimeren einzelzellig sortiert und dann für die anschließende TCR-Isolierung verwendet. TCR-Sequenzen wurden über 5'-RACE durch Standardverfahren, wie z. B. in Molecular Cloning a laboratory manual fourth edition by Green and Sambrook beschrieben, isoliert. Die alpha- und beta-variablen Regionen der TCRs R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1 R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5, R59P2E7 35P3A4, R37P1C9 und R37P1H1 wurden sequenziert und für eine weitere funktionelle Charakterisierung kloniert.
  • R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5 und R59P2E7 wurden von einem HLA-A*02-negativen Spender (alloreaktive Setting) abgeleitet, und R35P3A4, R37P1C9 und R37P1H1 wurden von einem HLA-A*02-positiven Spender abgeleitet.
  • Beispiel 1: T-Zellrezeptor R26P1A9
  • Die TCR R26P1A9 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 1–12) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R26P1A9 ist auf das HLA-A*02-präsentiertes MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (Siehe ).
  • R26P1A9 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 2: T-Zellrezeptor R26P2A6
  • Die TCR R26P2A6 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 13–24) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R26P2A6 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R26P2A6 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 3: T-Zellrezeptor R26P3H1
  • Die TCR R26P3H1 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 25–36) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R26P3H1 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R26P3H1 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 4: T-Zellrezeptor R35P3A4
  • Die TCR R35P3A4 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 37–48) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R35P3A4 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R35P3A4 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 5: T-Zellrezeptor R37P1C9
  • Die TCR R37P1C9 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 49–60) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R37P1C9 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R37P1C9 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R37P1C9 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/MAGEA1-001-Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in menschlichen primären CD8+ T-Zellen ( ). Die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression werden als Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 6: T-Zellrezeptor R37P1H1
  • Die TCR R37P1H1 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 61–72) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R37P1H1 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R37P1H1 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R37P1H1 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/MAGEA1-003-Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in menschlichen primären CD8+ T-Zellen ( ). Die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression werden als Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 7: T-Zellrezeptor R42P3A9
  • Die TCR R42P3A9 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 73–84) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R42P3A9 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R42P3A9 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 8: T-Zellrezeptor R43P3F2
  • Die TCR R42P3F2 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 85–96) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R42P3F2 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe oben).
  • R42P3F2 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 9: T-Zellrezeptor R43P3G5
  • Die TCR R43P3G5 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 97–108) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R43P3G5 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO:133) beschränkt (siehe oben).
  • R43P3G5 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R43P3G5 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/MAGEA1-003 Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in menschlichen primären CD8+ T-Zellen ( ). Die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression werden als Kontrolle verwendet.
  • Beispiel 10: T-Zellrezeptor R59P2E7
  • Die TCR R59P2E7 alpha- und beta-Ketten (SEQ ID NO: 109–120) wurden, wie es zuvor, beispielsweise im US-Patent 8 519 100 beschrieben ist, kloniert, das hiermit durch Referenz in seiner Gesamtheit in Bezug auf die Verfahren aufgenommen wird.
  • TCR R59P2E7 ist auf das HLA-A*02-präsentierte MAGEA1-003 (SEQ ID NO: 133) beschränkt (siehe ).
  • R59P2E7 erkennt spezifisch MAGEA1-003, weil menschliche primäre CD8+ T-Zellen, welche diesen TCR erneut exprimieren, nach der Ko-Inkubation mit HLA-A*02+ Zielzellen IFNγ freisetzen bzw. HLA-A*02-Tetramere binden, sie sind entweder mit MAGEA1-003-Peptid oder Alanin-Substitutionsvarianten von MAGEA1-003 ( ) oder verschiedenen Peptiden, die einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit zu MAGEA1-003 zeigen ( ), beladen. Das NYESO1-001 Peptid wird als negative Kontrolle verwendet.
  • Die Re-Expression von R59P2E7 führt zu einer selektiven Bindung von HLA-A*02/MAGEA1-003-Tetrameren, aber nicht von HLA-A*02/NYESO1-001-Tetrameren in menschlichen primären CD8+ T-Zellen ( ). Die Re-Expression des NYESO1-001-spezifischen TCR 1G4 und die Mock-Expression werden als Kontrolle verwendet.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (19)

  1. Ein Antigen-erkennendes Konstrukt, umfassend zumindest eine komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) 3 mit einer Sequenzidentität von zumindest 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 und 117.
  2. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Antigen-erkennendes Konstrukt in der Lage ist, spezifisch und/oder selektiv an ein MAGEA1 Antigenpeptid, bevorzugt ein Peptid der SEQ ID NO: 133 bis 142, am meisten bevorzugt SEQ ID NO: 133, zu binden.
  3. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein Antikörper oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist, oder ein T-Zellrezeptor (TCR) oder ein Derivat oder ein Fragment davon ist.
  4. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine TCRα- oder γ-Kette; und/oder eine TCRβ- oder δ-Kette; wobei die TCRα- oder γ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 und 111 umfasst, und/oder wobei die TCRβ- oder δ-Kette einen CDR3 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 und 117 umfasst.
  5. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 4, wobei die TCRα- oder γ-Kette zusätzlich einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 und 109; und/oder eine CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98 und 110 umfasst.
  6. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 4 oder 5, wobei die TCRβ- oder δ-Kette zusätzlich einen CDR1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 und 115; und/oder einen CDR2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 und 116 umfasst.
  7. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend eine variable Kettenregion des TCRs mit einer Sequenzidentität von mindestens 95% zu einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den SEQ ID Nos. 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 und 118.
  8. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend ein Bindungsfragment eines TCRs, und wobei das Bindungsfragment CDR1 bis CDR3 optional ausgewählt aus den CDR1- bis CDR3-Sequenzen mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nos. 1, 2, 3 oder 7, 8, 9 oder 13, 14, 15 oder 19, 20, 21 oder 25, 26, 27 oder 31, 32, 33 oder 37, 38, 39 oder 43, 44, 45 oder 49, 50, 51 oder 55, 56, 57 oder 61, 62, 63 oder 67, 68, 69 oder 73, 74, 75 oder 79, 80, 81 oder 85, 86, 87 oder 91, 92, 93 oder 97, 98, 99 oder 103, 104, 105 oder 109, 110, 111 oder 115, 116, 117 umfasst.
  9. Nukleinsäure, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
  10. Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 9.
  11. Wirtszelle umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder einen Vektor nach Anspruch 10, optional ist die Wirtszelle ein Lymphozyt, bevorzugt ein T-Lymphozyt oder T-Lymphozytvorläufer, weiter bevorzugt eine CD4 oder CD8 positive T-Zelle.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 10 oder die Wirtszelle nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Stabilisator und/oder Hilfsstoff.
  13. Immuntherapeutische Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit, wobei die immuntherapeutische Verbindung das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder der Vektor nach Anspruch 10 ist oder die Wirtszelle nach Anspruch 11 oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 ist.
  14. Immuntherapeutische Verbindung nach Anspruch 13 zur Verwendung bei der Diagnose, Vorbeugung und/oder Behandlung einer proliferativen Erkrankung, vorzugsweise Krebs, so wie nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Nierenzellkrebs, Hirntumor, Magenkrebs, Darmkrebs, Leberzellkarzinom, Kopf- und Halskarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Brustkrebs, Merkelzellkarzinom, Melanom, Eierstockkrebs, Harnblasenkrebs, Gebärmutterkrebs, Gallenblasen- und Gallengangkrebs, Speiseröhrenkrebs oder einer Kombination davon.
  15. Immuntherapeutische Verbindung nach Anspruch 14, wobei die Behandlung einen adoptiven Immunzelltransfer an den Patienten umfasst, der die Behandlung benötigt, wie zum Beispiel eine heterologe oder autologen T-Zelltransfer.
  16. Verfahren zur Herstellung eines MAGEA1-spezifischen Antigen-erkennenden Konstrukts, umfassend a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle, b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle, d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, weiterhin umfassend die Isolierung und Aufreinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der geeigneten Wirtszelle und, optional, Rekonstitution des Antigen-erkennenden Konstrukts in eine T-Zelle.
  18. Ein in-vitro Verfahren zum Nachweis von Krebs in einer biologischen Probe umfassend: a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen-erkennenden Konstrukt nach Ansprüchen 1 bis 8, und b) Nachweisen der Bindung des Antigen-erkennenden Konstrukts mit der biologischen Probe.
  19. TCR nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei der TCR ein löslicher TCR ist.
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