DE102017125888A1 - Neue konstruierte T-Zell-Rezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen COL6A3-Antigene. Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf konstruierten T-Zell-Rezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für Tumoren sind, die das Antigen COL6A3 exprimieren, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen TCR und von ihnen abgeleitete COL6A3 Antigen-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von COL6A3 exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigen-erkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-erkennende Konstrukte gegen COL6A3-Antigene. Die Erfindung stellt in Besonderem neue auf konstruierten T-Zell-Rezeptoren (TCR) basierte Moleküle, die selektiv und spezifisch für Tumoren sind, die das Antigen COL6A3 exprimieren, zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen TCR und von ihnen abgeleitete COL6A3 Antigen-bindende Fragmente sind in der Diagnose, der Behandlung und der Vorbeugung von COL6A3 exprimierenden Krebserkrankungen von Nutzen. Weiterhin werden Nukleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Antigen-erkennende Konstrukte kodieren, Vektoren, die diese Nukleinsäuren umfassen, rekombinante Zellen, die die Antigen-erkennenden Konstrukte exprimieren, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, zur Verfügung gestellt.
  • BESCHREIBUNG
  • Kollagene sind eine Superfamilie von Proteinen, die eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität von verschiedenen Geweben spielen. Kollagene sind extrazelluläre Matrixproteine und haben eine dreifach helikale Domäne als ihr gemeinsames strukturelles Element. Kollagen VI ist eine strukturelle Hauptkomponente der Mikrofibrillen. Die grundlegende Struktureinheit von Kollagen VI ist ein Heterotrimer der alpha 1(VI), alpha 2(VI) und alpha 3(VI) Kollagenketten. Die alpha 1(VI)- und alpha 2(VI)-Ketten werden durch die Gene COL6A1 und COL6A2 kodiert. Das Protein, das von dem Gen COL6A3 kodiert wird, ist die alpha 3 Untereinheit des Typ VI Kollagens (alpha 3(VI)-Kollagenkette) (Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neurol 6:193-8). Es wurde zuvor gezeigt, dass die Expression des Gens COL6A3 mit der Progression von Brustkrebs assoziiert ist und in Darmkrebs erhöht ist (Smith MJ, et al. „Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification" British journal of cancer. 2009;100:1452-1464; Tilman G et al „Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells" Mol Cancer. 2007;6:80) und als prognostischer Marker des kolorektalen Karzinoms (Qiao J et al. „Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics" Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929-29946). Das Gen COL6A3 ist auf 2q37 im menschlichen Genom lokalisiert und enthält 44 Exons. Das Protein COL6A3 hat 3177 Aminosäuren und enthält 12 Domänen des Von-Willebrand-Faktors Typ A (vWA), eine Fibronektin Typ 3-Domäne und eine Domäne der BPTI/Kunitz-Familie der Serinproteaseinhibitoren (KU) .
  • Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie repräsentieren Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Diese tumorassoziierten Antigenen (TAA) können Peptide aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor gewöhnlich hochreguliert sind.
  • Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen selektiv zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von Tumor-antigenspezifischen T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
  • Ein TCR ist ein heterodimeres Zelloberflächenprotein der Superfamilie der Immunglobuline , die mit den invariablen Proteinen des CD3-Komplexes, der in Vermittlung der Signaltransduktion involviert ist, assoziiert. TCRs existieren als aß- und γδ-Heterodimere, die strukturell ähnlich sind, aber ziemlich unterschiedliche anatomische Positionen und - vermutlich - Funktionen haben. Der extrazelluläre Anteil der nativen heterodimerischen αβTCR besteht aus zwei Polypeptidketten, von welchen beide eine membranproximale konstante Domäne und eine membrandistale variable Domäne besitzen. Alle konstanten und variablen Domänen enthalten eine Intraketten-Disulfidbindung. Die variablen Domänen enthalten hochgradig polymorphe Schleifen, analog zu den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) von Antikörpern. Die Verwendung der TCR-Gentherapie überwindet eine Reihe von aktuellen Hürden. Es erlaubt, die eigenen T-Zellen des Patienten mit den erwünschten Spezifitäten auszustatten und eine ausreichende Anzahl von T-Zellen in einer kurzen Zeit, was deren Erschöpfung vermeidet, zu generieren. Der TCR wird in zentrale T-Gedächtniszellen oder T-Zellen mit Stammzelleigenschaften transduziert, was eine bessere Persistenz und Funktion nach dem Transfer sicherstellt. TCR-modifizierte T-Zellen werden Krebspatienten, die durch Chemotherapie oder Bestrahlung lymphopenisch geworden sind, per Infusion verabreicht, was eine effiziente Transplantation erlaubt, jedoch eine Immunsuppression inhibiert.
  • Obwohl in der Entwicklung von molekularen-zielgerichteten Arzneimitteln für die Krebstherapie Fortschritte gemacht wurden, besteht die Notwendigkeit, neue Krebsmittel, die spezifisch gegen Moleküle, die hochspezifisch für Krebszellen sind, gerichtet sind, zu entwickeln. Die vorliegende Beschreibung spricht diese Notwendigkeit an, indem neue konstruierte COL6A3 TCRs, entsprechende rekombinante TCR-Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen, die spezifisch an COL6A3-Epitop(e), wie offenbart, und Verfahren zur Verwendung solcher Moleküle bei der Krebsbehandlung zur Verfügung gestellt werden.
  • In einem ersten Aspekt wird das Objekt der Erfindung durch ein Antigen-erkennendes Konstrukt gelöst, das eine erste Domäne umfasst, die drei komplementaritätsbestimmenden Regione (CDRs) gemäß SEQ ID NOs: 5 (CDRal), 6 (CDRa2) und 7 (CDRa3) umfasst, und eine zweite Domäne, die drei komplementaritätsbestimmenden Regione (CDRs) gemäß SEQ ID NOs: 13 (CDRbl), 14 (CDRb2) und 15 (CDRb3) umfasst, wobei mindestens einer der komplementaritätsbestimmenden Regione durch mindestens eine Sequenz ersetzt ist, die aus der Gruppe von: a) SEQ ID NO: 26 (CDRal-mutl) und SEQ ID NOs: 37 bis 49 (CDRbl-mutl bis CDRb1-mut13), vorzugsweise SEQ ID NO: 40, und b) mutierte Sequenzen von SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 37 bis 49, vorzugsweise SEQ ID NO: 40, umfassend konservative Aminosäureaustausch, ausgewählt ist.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRal eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRa2 eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRa3 eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRbl eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRb2 eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt kann die CDRb3 eines Antigen-erkennenden Konstrukts mindestens etwa 25%, mindestens etwa 30%, mindestens etwa 35%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 40%, mindestens etwa 45%, mindestens etwa 50%, mindestens etwa 55%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 65% aufweisen, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 85%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 96%, mindestens etwa 97%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 aufweisen.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder verbesserte konstruierte Versionen des COL6A3 TCR R4P3F9 identifiziert, die mutierte CDR1-Sequenzen in der Alpha- und Beta-Kette(n) umfassen, die die Stabilität, Erkennung und Selektivität des elterlichen R4P3F9 verbessern. Diese gereiften TCR-Varianten wurden in einem zweistufigen Verfahren ausgewählt, wobei ein Schritt in Bezug auf die Stabilität und der zweite in Bezug auf die Affinität der Varianten selektiert (siehe Beispiele). Während die erfinderischen TCRs mutierte CDR1-Regionen umfassen, ist es wahrscheinlich, dass CDR2 und/oder CDR3 auch mutiert werden können, um die Bindungsaffinität/Spezifität und/oder Selektivität zu erhöhen, und solche mutierten CDRs könnten idealerweise in die bestehenden Konstrukte aufgenommen werden.
  • Die Affinitätsreifung identifizierte Varianten mit deutlich stärkerer Bindungsaktivität gegenüber HLA-A*02/COL6A3-Peptid, wobei die Spezifität erhalten oder sogar verbessert wurde. Im Vergleich zum elterlichen TCR C-1 (R4P3F9 TCR bestehend aus Wildtyp-CDRs, siehe Tabelle 5) verbesserten alle Varianten der Erfindung die IFN-Gamma-Freisetzung mit höheren Werten, die bereits bei niedrigeren Peptidladekonzentrationen erreicht wurden.
  • Innerhalb der variablen Domäne befinden sich CDR1 und CDR2 in der variablen (V) Region einer Polypeptidkette und CDR3 schließt etwas von V-Segment, die gesamten D (diversity)- und J (joining)- Segmente ein. Es wird davon ausgegangen, dass CDR3 die variabelste und die Haupt-CDR ist, welche für die spezifische und selektive Erkennung eines Antigens verantwortlich ist. Überraschenderweise scheint die CDR1 bei einigen TCRs auch Kontakte zum Peptid herzustellen und ist somit auch für die selektive Erkennung verantwortlich. Im vorliegenden Fall scheint das mutierte CDR1b, ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, mit der Position 8 des COL6A3-Peptids zu interagieren.
  • Native alpha-beta heterodimere TCRs besitzen eine alpha-Kette und eine beta-Kette. Jede alpha-Kette umfasst variable, verbindende und konstante Segmente und die beta-Kette umfasst normalerweise auch ein kurzes Diversitätssegment zwischen dem variablen und verbindenden Segment, aber das Diversitätssegment wird oft als Teil des J-Segments gesehen. Jede variable Region umfasst drei CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen), die in eine Gerüstsequenz eingebettet sind, eine davon ist die hypervariable Region, genannt CDR3. Es gibt verschiedene Arten von variablen Segmenten (Va) der alpha-Kette und verschiedene Arten von variablen Segmenten (Vß) der beta-Kette, die sich durch ihr Gerüst, CDR1- und CDR2-Sequenzen, und durch eine teilweise definierte CDR3-Sequenz auszeichnen. Die Va-Arten werden in der IMGT-Nomenklatur durch eine einzigartige TRAV-Nummer gekennzeichnet, Vß -Arten werden durch eine einzigartige TRBV-Nummer gekennzeichnet.
  • Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt die entsprechenden CDR1 bis CDR3 einer individuellen hier offenbarten konstruierten variablen TCR-Region der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt sind Antigen-erkennende Konstrukte (z.B. αβ und γδ TCRs) der Erfindung, die mindestens eine, vorzugsweise zwei, gereifte CDR1-Sequenzen umfassen.
  • Die hierin offenbarten CDR-Varianten - insbesondere die CDR1-Varianten - können durch Substitution einer oder mehrerer Resten an verschiedenen, möglicherweise selektiven Stellen innerhalb der Peptidkette modifiziert werden, solange es nicht anderweitig beschrieben ist. Solche Substitutionen sind konservativer Natur, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Struktur und Eigenschaften ersetzt wird, so wie eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure ersetzt wird. Noch konservativer wäre eine Ersetzung von Aminosäuren mit derselben oder ähnlichen Größe und chemischen Natur, wie beispielsweise wenn Leucin durch Isoleucin ersetzt wird. In Studien zu Sequenzvariationen in Familien von natürlich vorkommenden homologen Proteinen werden bestimmte Aminosäuresubstitutionen öfter als andere toleriert, und diese zeigen oftmals eine Korrelation mit Ähnlichkeiten in Größe, Ladung, Polarität und Hydrophobizität zwischen den originalen Aminosäuren und deren Ersetzungen, und dies ist die Basis für die Definition von „konservativen Substitutionen“. Bevorzugte konservative Substitutionen werden hier als Austausch innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen definiert: Gruppe 1 - kleine aliphatische, nicht polare oder leicht polare Reste (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Gruppe 2 - polare, negativ geladene Reste und deren Amide (Asp, Asn, Glu, Gln); Gruppe 3 - polare, positiv geladene Reste (His, Arg, Lys); Gruppe 4 - große, aliphatische, unpolare Reste (Met, Leu, Ile, Val, Cys); und Gruppe 5 - große, aromatische Reste (Phe, Tyr, Trp).
  • Weniger konservative Substitutionen können die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere, die ähnliche Eigenschaften, aber gewisse Unterschiede in der Größe hat, beinhalten, solche wie eine Ersetzung eines Alaninrestes durch einen Isoleucinrest.
  • Der Begriff „Spezifizität“ oder „Antigenspezifizität“ oder „spezifisch für“ ein gegebenes Antigen, wie hier verwendet, bedeutet, dass das Antigen-erkennende Konstrukt spezifisch an das Antigen binden kann, bevorzugt ein COL6A3-Antigen, weiter bevorzugt mit einer hohen Avidität, wenn das Antigen durch HLA, bevorzugt HLA A2 präsentiert wird. Beispielsweise kann ein TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt angesehen werden, das eine „Antigenspezifizität“ für ein COL6A3-Antigene besitzt, wenn T-Zellen, die den TCR als Antwort auf einen COL6A3-präsentierenden HLA exprimieren, mindestens etwa 200 pg/ml oder mehr (z.B., 250 pg/ml oder mehr, 300 pg/ml oder mehr, 400 pg/ml oder mehr, 500 pg/ml oder mehr, 600 pg/ml oder mehr, 700 pg/ml oder mehr, 1000 pg ml oder mehr, 2000 pg/ml oder mehr, 2500 pg/ml oder mehr, 5000 pg/ml oder mehr) Interferon γ (IFN-γ) nach Ko-Kultivierung mit HLA-A2 Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen eines COL6A3-Antigens, wie zum Beispiel den COL6A3-Epitopen und den Antigenen, die hier zur Verfügung gestellt werden, gepulst wurden (z.B., etwa 10-11 mol/l, 10-10 mol/l, 10-9 mol/l, 10-8 mol/l, 10-7 mol/l, 10-6 mol/l, 10-5 mol/l) sekretieren. Alternativ oder zusätzlich kann ein TCR als eine „Antigenspezifizität“ für COL6A3 besitzend angesehen werden, wenn die T-Zellen, die den TCR exprimieren, mindestens doppelt so viel IFN-γ sekretieren, wie der nicht transduzierte Hintergrund von IFN-γ nach Ko-Kultivierung mit den Zielzellen, die mit niedrigen Konzentrationen eines COL6A3-Antigens gepulst wurden. Eine solche „Spezifizität“, wie oben beschrieben, kann - beispielsweise - mit einem ELISA analysiert werden.
  • In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung ist das Antigen-erkennende Konstrukt stabil und in der Lage, spezifisch und/oder selektiv an ein COL6A3-Antigen zu binden; wobei das COL6A3 Antigen bevorzugt ein Proteinepitop oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in den SEQ ID NO: 1, oder eine Variante davon ist, wobei die Variante eine Aminosäuredeletion, Addition, Insertion oder Substitution von nicht mehr als drei, bevorzugt zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als eine Aminosäureposition ist.
  • Der Begriff „Selektivität“ oder „selektive Erkennung/Bindung“ wird so verstanden, dass auf eine Eigenschaft des Antigen-erkennenden Konstrukts, so wie einen TCR oder Antikörper, bevorzugt nur ein spezifisches Epitop selektiv zu erkennen oder zu binden und bevorzugt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu einem anderen Epitop zu zeigen, referenziert wird. Bevorzugt bedeutet der Begriff „Selektivität“ oder „selektive Erkennung/Bindung“, dass das Antigen-erkennende Konstrukt (z.B. ein TCR) ein spezifisches Epitop selektiv erkennt oder bindet und bevorzugterweise keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop zeigt, wobei das Epitop einzigartig für ein Protein ist, so dass das Antigen-erkennende Konstrukt keine oder im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Epitop und einem anderen Protein zeigt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt wird bevorzugt aus einem Antikörper oder einem Derivat oder einem Fragment davon, einem bispezifischen Molekül, oder einem T-Zellrezeptor (TCR) oder einem Derivat oder einem Fragment davon ausgewählt. Ein Derivat oder Fragment eines Antikörpers oder eines TCRs gemäß der Erfindung sollte bevorzugt die Fähigkeit des Stammmoleküls an ein Antigen zu binden oder es zu erkennen, im Besonderen seine Spezifizität und/oder Selektivität, wie oben erklärt, behalten.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen konstruierten TCRs in der Lage, COL6A3-Antigene in einer Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I-abhängigen Weise zu erkennen. „MHC Klasse I-abhängige Weise,“ wie hier verwendet, bedeutet, dass der TCR eine Immunreaktion nach der Bindung an ein COL6A3-Peptidantigen im Zusammenhang mit einem MHC-Klasse-I-Molekül auslöst. Das MHC-Klasse-I-Molekül kann jedes in der Technik bekannte MHC-Klasse-I-Molekül sein, z.B. HLA-A-Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das MHC-Klasse-I-Molekül ein HLA-A2-Molekül.
  • Die Erfindung stellt sowohl einzelkettige Antigen-erkennende Konstrukte als auch doppelkettige Antigen-erkennende Konstrukte, sowie andere Molekülvarianten zur Verfügung. Die Erfindung stellt im Besonderen einen konstruierten TCR als Antigen-erkennendes Konstrukt oder ein Fragment oder Derivat davon zur Verfügung. Der konstruierte TCR ist bevorzugt menschlicher Herkunft, was so verstanden werden soll, dass er von einem menschlichen TCR-Lokus generiert wurde, und daher menschliche TCR-Sequenzen umfasst. Darüber hinaus wird der TCR der Erfindung als affinitätsgereifter TCR charakterisiert, der in der Lage ist, das COL6A3-Peptidantigen spezifisch und selektiv zu erkennen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt zusätzlichen oder alternativ ein Antigen-erkennendes Konstrukt, wie oben beschrieben, zur Verfügung, welches eine Immunantwort auslöst, bevorzugt wenn die Immunantwort dabei durch einen Anstieg des Interferon (IFN)-γ-Niveaus charakterisiert wird.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können als Einzelkette α oder β, oder γ und δ, Moleküle oder alternativ als Doppelkettenkonstrukte zusammengesetzt aus sowohl dem α- und β-Strang, als auch dem γ- und δ-Strang, zur Verfügung gestellt werden.
  • Am meisten bevorzugt ist, dass in einigen zusätzlichen Ausführungsformen, wobei sich die Offenbarung auf Antigen-erkennende Konstrukte bezieht, die einen, zwei oder alle CDR1- bis CDR3-Regionen der im vorliegenden Dokument offenbarten, konstruierten TCR-Ketten umfassen (siehe Tabelle 1). Es können Antigen-erkennende Konstrukte bevorzugt sein, die die natürliche oder die konstruierte CDR-Sequenz mit drei, zwei und vorzugsweise nur einem modifizierten Aminosäurerest umfassen. Ein modifizierter Aminosäurerest kann aus einer Aminosäureninsertion, -deletion oder -substitution ausgewählt werden. Am meisten bevorzugt ist, dass die drei, zwei und bevorzugt ein modifizierter Aminosäurerest der erste oder letzte Aminosäurerest der jeweiligen CDR-Sequenz ist. Wenn die Modifikation eine Substitution ist, dann ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, dass die Substitution eine konservative Aminosäuresubstitution ist.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs können des Weiteren eine konstante Region, die von einer beliebigen geeigneten Spezies, so wie einem Säugetier, z. B. Mensch, Ratte, Affe, Kaninchen, Esel oder Maus stammt, umfassen. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der erfindungsgemäße TCR des Weiteren eine menschliche konstante Region. In einigen bevorzugten Ausführungsformen kann die konstante Region des erfindungsgemäßen TCRs geringfügig modifiziert sein, beispielsweise durch die Einführung von heterologen Sequenzen, bevorzugt Maussequenzen, welche die TCR-Expression und -Stabilität erhöhen können. Darüber hinaus können weitere stabilisierende Mutationen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind (z.B. DE 10 2016 123 893.7 ), eingeführt werden, wie z. B. der Austausch ungünstiger Aminosäuren in den V-Regionen und/oder die Einführung einer Disulfidbrücke zwischen den TCR-C-Domänen und die Entfernung von ungepaartem Cystein.
  • Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet der Begriff „murin“ oder „menschlich (human)“, wenn er auf ein Antigen-erkennendes Konstrukt oder eine beliebige Komponente der hier beschriebenen TCRs (z. B. komplementaritätsbestimmende Region (CDR), variable Region, konstante Region, α-Kette, und/oder β-Kette) bezogen wird, einen TCR (oder eine Komponente davon), der von einem nicht veränderten TCR-Lokus der Maus bzw. des Menschen abgeleitet ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden chimerische TCRs zur Verfügung gestellt, wobei die TCR-Ketten Sequenzen von mehreren Spezies umfassen. Es ist bevorzugt, dass ein erfindungsgemäßer TCR eine α-Kette umfassend eine menschliche variable Region einer α-Kette und zum Beispiel eine murine konstante Region einer murinen TCR α-Kette umfasst.
  • In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße TCR ein menschlicher TCR umfassend menschliche variable Regionen entsprechend den obigen Ausführungsformen und menschliche konstante Regionen.
  • Der erfindungsgemäße TCR kann auch als Einzelketten-TCR (single chain; scTCR) zur Verfügung gestellt werden. Ein scTCR kann ein Polypeptid einer variablen Region einer ersten TCR-Kette (z.B., eine alpha-Kette) und ein Polypeptid einer kompletten (voller Länge) zweiter TCR-Kette (z.B., einer beta-Kette), oder vice versa sein. Des Weiteren kann der scTCR optional einen oder mehrere Linker enthalten, welche die beiden oder mehreren Polypeptide verbinden. Der Linker kann zum Beispiel ein Peptid sein, welches die zwei Einzelketten verlinkt, wie hier beschrieben. Auch wird ein erfindungsgemäßer scTCR, der an ein menschliches Zytokin, wie IL-2, IL-7 oder IL-15, gekoppelt ist, bereitgestellt.
  • Das erfindungsgemäße Antigen-bindende Konstrukt kann auch in der Form eines multimerischen Komplexes zur Verfügung gestellt werden, welcher zumindest 2 scTCR-Moleküle umfasst, wobei die scTCR-Moleküle alle an zumindest eine Biotineinheit gekoppelt sind, und wobei die scTCRs durch die Wechselwirkungen zwischen Biotin und Streptavidin untereinander verbunden sind, um die Bildung des multimeren Komplexes zu ermöglichen. Ähnliche Herangehensweisen für die Erzeugung von multimeren TCRs sind auch möglich und in dieser Offenbarung enthalten. Auch werden multimere Komplexe höherer Ordnung, umfassend mehr als zwei erfindungsgemäße scTCR bereitgestellt.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein TCR eine Einheit, die zumindest eine TCR alpha oder gamma und/oder TCR beta oder delta variable Domäne besitzt. Generell umfassen sie sowohl eine TCR alpha variable Domäne als auch eine TCR beta variable Domäne. Sie können aß Heterodimere oder im Einzelkettenformat vorliegen. Für die Verwendung in der adoptiven Therapie kann ein αβ heterodimerischer TCR zum Beispiel transfiziert sein, denn Ketten voller Länge sowohl zytoplasmatische als auch transmembrane Domänen besitzen. Wenn es gewünscht ist, kann eine Disulfidbindung zwischen den Resten der entsprechenden konstanten Domänen vorhanden sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen-erkennende Konstrukt ein humaner TCR oder ein Fragment oder Derivat davon. Ein humaner TCR oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist ein TCR, welcher mehr als 50% der korrespondierenden humanen TCR-Sequenz umfasst. Es ist bevorzugt, dass nur ein kleiner Teil der TCR-Sequenz künstlich ist oder von anderen Spezies abgeleitet ist. Es ist jedoch bekannt, dass chimerische TCRs, z. B. abgeleitet von menschlicher Herkunft mit murinen Sequenzen in den konstanten Domänen, vorteilhaft sind. Deshalb sind TCRs gemäß der vorliegenden Erfindung, welche murine Sequenzen in dem extrazellulären Teil ihrer konstanten Domänen enthalten, besonders bevorzugt.
  • Somit ist es auch bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Antigen-erkennende Konstrukt in der Lage ist, sein Peptidantigen in einer humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-abhängigen Weise, bevorzugt in einer HLA-A02-abhängigen Weise, zu erkennen. Der Begriff „HLA-abhängige Weise“ bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass das Antigen-erkennende Konstrukt nur an das Antigen bindet, wenn das antigene Peptid durch das HLA präsentiert wird.
  • Das Antigen-erkennende Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung induziert in einer Ausführungsform vorzugsweise eine Immunantwort, wobei vorzugsweise die Immunantwort durch den Anstieg des Interferon-(IFN) γ-Spiegels charakterisiert ist.
  • Der Begriff „Polypeptid“, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt Oligopeptide ein und bezieht sich auf eine einzelne Kette von Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden sind. In Bezug auf die erfindungsgemäßen Polypeptide kann der funktionelle Teil ein beliebiger Teil sein, der zusammenhängende Aminosäuren des TCRs (oder einer funktionellen Variante davon) umfasst, von denen er ein Teil ist, vorausgesetzt, dass der funktionelle Teil spezifisch an ein COL6A3-Antigen bindet, vorzugsweise wie hier in Tabelle 1 offenbart. Der Begriff „funktioneller Teil“, wenn er in Bezug auf einen TCR (oder eine funktionelle Variante davon) verwendet wird, bezieht sich auf einen beliebigen Teil oder ein Fragment des TCR (oder einer funktionellen Variante davon) der Erfindung, wobei dieses Teil oder Fragment die biologische Aktivität des TCRs (oder funktionellen Variante davon), von denen es sich um einen Teil handelt (der übergeordnete TCR oder die übergeordnete funktionelle Variante davon), beibehält. Funktionelle Abschnitte umfassen beispielsweise jene Teile eines TCR (oder eine funktionelle Variante davon), die die Fähigkeit beibehalten, spezifisch an ein COL6A3-Antigen (in einer HLA-A2-abhängigen Weise) zu binden oder Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern, dies in einem ähnlichen Ausmaß, im gleichen Ausmaß oder in einem höheren Ausmaß, als das übergeordnete TCR (oder funktionelle Variante davon).
  • Der funktionelle Abschnitt kann zusätzliche Aminosäuren am Amino- oder Carboxyterminus des Abschnitts oder an beiden Enden umfassen, wobei in der Aminosäuresequenz des übergeordneten TCR oder der funktionellen Variante keine zusätzlichen Aminosäuren gefunden werden. Wünschenswerterweise stören die zusätzlichen Aminosäuren nicht die biologische Funktion des funktionellen Abschnitts, z. B. spezifisch an COL6A3-Antigene zu binden; und/oder die Fähigkeit, Krebs zu erkennen, zu behandeln oder zu verhindern usw. Noch wünschenswerter ist es, wenn die zusätzlichen Aminosäuren die biologische Aktivität im Vergleich zu der biologischen Aktivität des übergeordneten TCRs oder der funktionellen Variante davon erhöhen.
  • Wie bereits oben erwähnt, kann die Bindungsfunktionalität des erfindungsgemäßen TCRs im Rahmen eines Antikörpers bereitgestellt werden. Der Begriff „Antikörper“ in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird im Kontext der Erfindung verwendet, um sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen zu beziehen, d. h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle oder ein Paratop enthalten. Solche Moleküle werden auch als „Antigen-bindende Fragmente“ von Immunglobulinmolekülen bezeichnet. Die Erfindung stellt ferner einen Antikörper oder einen Antigen-bindende Abschnitt davon bereit, der spezifisch an die hier beschriebenen Antigene bindet. Der Antikörper kann in jeder Form von Immunglobulin vorliegen, welche in der Technik bekannt ist. Beispielsweise kann der Antikörper beliebiger Klasse z. B. IgA, IgD, IgE, IgG, IgM usw. angehören. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommender Antikörper sein, z. B. ein Antikörper, der aus einem Säugetier, wie z.B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, Huhn, Hamster, Mensch usw., isoliert und/oder gereinigt wird. Alternativ kann der Antikörper ein gentechnisch veränderter Antikörper sein, z. B. ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper. Der Antikörper kann in Form eines Monomers oder Polymers vorliegen.
  • Die Erfindung stellt auch Antigen-bindende Abschnitte von einem beliebigen der im Kontext der Erfindung beschriebenen Antikörper bereit. Der Antigen-bindende Abschnitt kann jeder Abschnitt sein, der mindestens eine Antigen-bindende Stelle wie Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, Diabodies und Triabodies aufweist. Ein einzelkettiges Antikörperfragment des Fragments (scFv) der variablen Region, das aus einem verkürzten Fab-Fragment, das die variable (V)-Domäne einer schweren Antikörperkette umfasst, die mit einer V-Domäne einer leichten Antikörperkette über ein synthetisches Peptid verbunden ist, kann mit routinemäßigen rekombinanten DNA-Technologieverfahren erzeugt werden. In ähnlicher Weise können Disulfid-stabilisierte Fragmente (dsFv) der variablen Region durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, die Antikörperfragmente der Erfindung sind jedoch nicht auf diese beispielhaften Typen von Antikörperfragmenten beschränkt. Auch kann der Antikörper oder der Antigen-bindende Abschnitt davon so modifiziert werden, um einen detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z.B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z.B. Goldpartikel) zu enthalten.
  • Geeignete Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel werden Standardverfahren der Hybridomtechnik- in z.B. Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), und C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1)) beschrieben. Alternativ sind andere Verfahren, so wie EBV-Hybridomtechniken (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), und Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)), und Bakteriophagen Vektorexpressionssysteme (siehe, z.B., Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) im Stand der Technik bekannt. Des Weiteren sind Verfahren zur Produktion von Antikörpern in nicht menschlichen Tieren z. B. in den US-Patenten 5 545 806, 5 569 825 und 5 714 352 , und in der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0197266 beschrieben.
  • Einige Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auch auf TCRs oder funktionelle Fragmente und Polypeptide davon, die lösliche TCRs sind. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „löslicher T-Zell-Rezeptor“ auf einkettige oder heterodimere verkürzte Varianten nativer TCRs, die mindestens die variablen Domänen der TCR α-Kette und β-Kette umfassen, die durch einen Polypeptidlinker verbunden sind (SEQ ID NOs: 22, 24, 25 und 27). Löslichen Varianten von TCRs fehlen in der Regel mindestens die Transmembran- und Zytosoldomänen des nativen Proteins; manchmal umfassen solche löslichen Konstrukte vorzugsweise keine konstanten Domänensequenzen. Die erfindungsgemäßen löslichen T-Zell-Rezeptor-Konstrukte umfassen in bevorzugten Ausführungsformen Konstrukte, die aus variablen Domänensequenzen der α- und β-Ketten-- bestehen, wie hierin bereitgestellt, die durch eine geeignete Linkersequenz verbunden sind. Die Sequenz der variablen Domäne (Aminosäure oder Nukleinsäure) der löslichen TCR α-Ketten und β-Ketten kann mit den entsprechenden Sequenzen in einem nativen TCR identisch sein oder können Varianten der α-Ketten und β-Ketten-Sequenzen der variablen Domäne des löslichen TCRs im Vergleich zu entsprechenden nativen TCR-Sequenzen umfassen. Der Begriff „löslicher T-Zellrezeptor“, wie er hier verwendet wird, umfasst lösliche TCRs mit variablen oder nicht-variablen löslichen TCR α-Ketten- und β-Kettensequenzen der variablen Domäne. Die Variationen können in der Gerüstregion und/oder der CDR-Regionen der löslichen TCR-α-Ketten- und β-Kettensequenzen der variablen Domäne vorliegen und können Aminosäuremutationen in Form von Deletion, Insertion, Substitution sowie Änderungen an der Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz nicht verändern, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche erfindungsgemäße TCRs behalten oder bevorzugt verbessern in allen Fällen die Bindungsfunktionalität ihrer elterlichen TCR-Moleküle.
  • Das obige Problem wird ferner durch eine Nukleinsäure gelöst, die für ein Antigen-erkennendes Konstrukt der Erfindung oder irgendeines der vorgenannten Protein- oder Polypeptid-Konstrukte kodiert. Die Nukleinsäure hat vorzugsweise (a) einen Strang, der für ein erfindungsgemäßes Antigen-erkennendes Konstrukt kodiert; (b) einen Strang, der komplementär zum Strang in (a) ist; oder (c) einen Strang, der unter stringenten Bedingungen mit einem Molekül hybridisiert, wie in (a) oder (b) beschrieben. Strenge Bedingungen sind dem Fachmann insbesondere aus Sambrook et al, „Molecular Cloning“ bekannt. Darüber hinaus weist die Nukleinsäure gegebenenfalls weitere Sequenzen auf, die zur Expression der dem Protein entsprechenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere zur Expression in einer Säugetier-/menschlichen Zelle, notwendig sind. Die verwendete Nukleinsäure kann in einem Vektor enthalten sein, der geeignet ist, die Expression der Nukleinsäuresequenz, die dem Polypeptid entspricht, in einer Zelle zu ermöglichen. Jedoch können die Nukleinsäuren auch verwendet werden, um eine antigenpräsentierende Zelle zu transformieren, die nicht auf klassische antigenpräsentierende Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, beschränkt sein kann, so dass sie selbst die entsprechenden Proteine auf ihrer Zelloberfläche produzieren.
  • Der Begriff „Nukleinsäure“, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, schließt „Polynukleotid“, „Oligonukleotid“ und „Nukleinsäuremolekül“ ein und bedeutet im Allgemeinen ein Polymer von DNA oder RNA, das einzelsträngig oder doppelsträngig, synthetisiert oder aus natürlichen Quellen (z.B. isoliert und/oder gereinigt) erhalten werden kann, die natürliche, nicht natürliche oder veränderte Nukleotide enthalten können und eine natürliche, nicht natürliche oder veränderte Internukleotidbindung enthalten können, wie eine Phosphoramidatbindung oder eine Phosphorothioatbindung anstelle der Phosphodiester zwischen den Nukleotiden eines unmodifizierten Oligonukleotids.
  • Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren rekombinant sind. Wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bezieht sich der Begriff „rekombinant“ auf (i) Moleküle, die außerhalb lebender Zellen konstruiert werden, indem sie natürliche oder synthetische Nukleinsäuresegmente zu Nukleinsäuremolekülen verbinden, die sich in einer lebenden Zelle replizieren können, oder (ii) Moleküle, die aus der wie oben in (i) beschriebenen Replikation entstehen. Für die Zwecke der Erfindung kann die Replikation eine in vitro-Replikation oder eine in vivo-Replikation sein. Die Nukleinsäure kann jede Nukleotidsequenz umfassen, die für beliebige der TCRs, Polypeptide oder Proteine oder funktionelle Abschnitte oder funktionelle Varianten davon, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, kodiert.
  • Weiterhin stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, umfasst. Wünschenswerterweise ist der Vektor ein Expressionsvektor oder ein rekombinanter Expressionsvektor. Der Begriff „rekombinanter Expressionsvektor“ bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression einer mRNA, eines Proteins oder Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann jeder geeignete rekombinante Expressionsvektor sein und kann verwendet werden, um jeden geeigneten Wirt zu transformieren oder zu transfizieren. Geeignete Vektoren umfassen diejenigen, die für die Vermehrung und Expansion oder für die Expression oder für Beides, wie Plasmide und Viren, entwickelt sind. Beispiele von tierischen Expressionsvektoren enthalten pEUK-Cl, pMAM und pMAMneo. Es ist bevorzugt, dass der rekombinante Expressionsvektor ein viraler Vektor, z. B. ein retroviraler Vektor, ist. Der rekombinante Expressionsvektor umfasst regulatorische Sequenzen, wie Transkriptions- und Translationsinitiations- und Terminationscodons, die spezifisch für den Typ der Wirtszelle (z. B. Bakterium, Pilz, Pflanze oder Tier) sind, in die der Vektor eingeführt werden soll und in der die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durchgeführt werden kann. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Vektor ein oder mehrere Markergene enthalten, die die Selektion von transformierten oder transfizierten Wirten ermöglichen. Der rekombinante Expressionsvektor kann einen nativen oder normativen Promotor umfassen, der operativ mit der Nukleotidsequenz verknüpft ist, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte oder die Nukleotidsequenz kodiert, die komplementär zu der Nukleotidsequenz ist oder mit dieser hybridisiert, die für die erfindungsgemäßen Konstrukte kodiert. Die Selektionen von Promotoren umfassen z. B. starke, schwache, induzierbare, gewebespezifische und entwicklungsspezifische Promotoren. Der Promoter kann ein nicht viraler Promoter oder ein viraler Promoter sein. Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können entweder für transiente Expression, für eine stabile Expression oder für beide konzipiert sein. Auch können die rekombinanten Expressionsvektoren für die konstitutive Expression oder für die induzierbare Expression hergestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß der Erfindung umfasst. Im Speziellen umfasst die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Nukleinsäure oder einen Vektor, wie oben beschrieben. Die Wirtszelle kann eine eukaryotische Zelle, z. B. Pflanze, Tier, Pilze oder Algen oder sie kann eine prokaryotische Zelle z. B. Bakterien oder Protozoen sein. Die Wirtszelle kann eine kultivierte Zelle oder eine primäre Zelle sein, d.h. direkt aus einem Organismus, z. B. einem Menschen, isoliert werden. Die Wirtszelle kann eine adhärente Zelle oder eine suspendierte Zelle sein, d.h. eine Zelle, die in Suspension wächst. Zur Herstellung eines rekombinanten TCRs, Polypeptids oder Proteins ist die Wirtszelle vorzugsweise eine Säugetierzelle, z. B. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Am meisten bevorzugt ist, dass die Wirtszelle eine menschliche Zelle ist. Während die Wirtszelle von einem beliebigen Zelltyp, kann aus irgendeiner Art von Gewebe stammen und von irgendeiner Entwicklungsstufe sein kann, ist die Wirtszelle vorzugsweise ein peripherer Blutleukozyt (PBL) oder eine periphere mononukleäre Blutzelle (PBMC). Es ist weiter bevorzugt, dass die Wirtszelle eine T-Zelle ist. Die T-Zelle kann jede T-Zelle sein, wie eine kultivierte T-Zelle, z. B. eine primäre T-Zelle oder eine T-Zelle aus einer kultivierten T-Zelllinie, z. B. Jurkat, SupTl usw., oder eine T-Zelle, die aus einem Säugetier erhalten wird, vorzugsweise eine T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem menschlichen Patienten. Wenn sie von einem Säugetier erhalten wird, kann die T-Zelle aus zahlreichen Quellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus oder anderen Geweben oder Flüssigkeiten erhalten werden. T-Zellen können auch angereichert oder aufgereinigt sein. Bevorzugt ist die T-Zelle eine menschliche T-Zelle. Es ist weiter bevorzugter, dass die T-Zelle eine T-Zelle ist, die aus einem Menschen isoliert wurde. Die T-Zelle kann jede beliebige Art von T-Zelle und in jeder Entwicklungsstufe sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CD4-positive und/oder CD8-positive, CD4-positive T-Helfer-Zellen, z. B. Th1- und Th2-Zellen, CD8- positive T-Zellen (z. B. zytotoxische T-Zellen), Tumor-infiltrierende Zellen (TILs), T-Gedächtnis-Zellen, naive T-Zellen und dergleichen. Bevorzugt ist die T-Zelle eine CD8-positive T Zelle oder eine CD4-positive T-Zelle.
  • Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Wirtszelle ein Lymphozyt, vorzugsweise ein T-Lymphozyt, wie eine CD4-positive oder CD8-positive T-Zelle. Die Wirtszelle ist weiterhin vorzugsweise eine tumorreaktive T-Zelle, die für COL6A3-exprimierende Tumorzellen spezifisch ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die im Kontext der Erfindung offenbarten Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen zur Verwendung in der Medizin. Die Verwendung in der Medizin umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung bei der Diagnose, Prävention und/oder Behandlung einer Tumorerkrankung, wie einer malignen oder gutartigen Tumorerkrankung. Die Tumorerkrankung ist beispielsweise eine durch die Expression von COL6A3 charakterisierte Tumorerkrankung in einer Krebs- oder Tumorzelle der Tumorerkrankung.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen der Antigen-erkennenden Konstrukte und anderer daraus abgeleiteter Materialien kann der zu behandelnde und/oder zu diagnostizierende Krebs jegliche Krebsart sein, einschließlich eines akuten lymphatischen Krebses, einer akuten myeloischen Leukämie, eines alveolären Rhabdomyosarkoms, eines Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanals oder Anorektums, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, der Gallenblase oder des Pleuras, Krebses der Nase, des Nasenhohlraums oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebses, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebs des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, des bösartigen Mesothelioms, Melanoms, multiplen Myeloms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, des Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein COL6A3-positiver Krebs, umfassend gastrointestinalen und Magenkrebs.
  • Die Konstrukte, Proteine, TCR-Antikörper, Polypeptide und Nukleinsäuren der Erfindung sind insbesondere zur Verwendung in der Immuntherapie, vorzugsweise in der Adoptiv-T-Zelltherapie geeignet. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann beispielsweise die Infusion von erfindungsgemäßen T-Zellen in den Patienten einbeziehen. Vorzugsweise sind solche T-Zellen autologe T-Zellen des Patienten, die in vitro mit einem Nukleinsäure- oder Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Erfindung transduziert wurden.
  • WO 2016/011210 offenbart konstruierte Zellen für die adoptive Therapie, einschließlich NK-Zellen und T-Zellen, und Zusammensetzungen, die die Zellen enthalten, sowie Verfahren zu ihrer Verabreichung an Probanden. Die Zellen können gentechnisch veränderte Antigenrezeptoren enthalten, die spezifisch an Antigene binden, wie chimäre Antigenrezeptoren (CARs) und kostimulatorische Rezeptoren.
  • Die Aufgabe der Erfindung wird auch durch ein Verfahren zur Herstellung einer Expressionszelllinie des COL6A3-spezifischen Antigen-erkennenden Konstruktes gelöst, das Verfahren umfassend
    1. a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle,
    2. b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert,
    3. c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle und
    4. d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  • Das Verfahren kann ferner einen Schritt der Zelloberflächenpräsentation des Antigen-erkennenden Konstrukts auf der geeigneten Wirtszelle umfassen.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das genetische Konstrukt ein Expressionskonstrukt, das eine Promotorsequenz umfasst, die operativ mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
  • Vorzugsweise ist das Antigen-erkennende Konstrukt des Säugetier-Ursprungs, vorzugsweise des menschlichen Ursprungs. Die bevorzugte geeignete Wirtszelle zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung ist eine Säugetierzelle, wie eine menschliche Zelle, insbesondere ein menschlicher T-Lymphozyt. T-Zellen für die Verwendung in der Erfindung sind oben ausführlich beschrieben.
  • Ebenfalls sind von der Erfindung Ausführungsformen umfasst, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein modifiziertes TCR ist, wobei die Modifikation die Zugabe von funktionellen Domänen ist, wie beispielsweise eine Markierung oder eine therapeutisch wirksame Substanz. Weiterhin sind TCRs mit alternativen Domänen wie einer alternativen Membran-Anker-Domäne anstelle der endogenen Transmembranregion umfasst.
  • Wünschenswerterweise ist das Transfektionssystem zum Einführen des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle ein retrovirales Vektorsystem. Solche Systeme sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in einer Ausführungsform der zusätzliche Verfahrensschritt der Isolierung und Reinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der Zelle und gegebenenfalls der Rekonstitution der translatierten Fragmente des Antigen-erkennenden Konstrukts in einer T-Zelle.
  • In einem alternativen Aspekt der Erfindung wird eine T-Zelle bereitgestellt, die durch ein Verfahren zur Herstellung eines T-Zellrezeptors (TCR) erhalten wird, der für Tumorzellen spezifisch ist und eine hohe Avidität aufweist, wie oben beschrieben. Eine solche T-Zelle hängt von der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Wirtszelle ab, beispielsweise einer menschlichen oder nicht-menschlichen T-Zelle, vorzugsweise einem humanen TCR.
  • Die erfindungsgemäßen TCRs, Polypeptide, Proteine (einschließlich funktioneller Varianten davon), Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigenbindungsabschnitte davon) können isoliert und/oder aufgereinigt werden. Der Begriff „isoliert“, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bedeutet „aus der natürlichen Umgebung entfernt“. Der Begriff „aufgereinigt“, wie er im Kontext der Erfindung verwendet wird, bedeutet in eine höhere Reinheit überführt, wobei „Reinheit“ ein relativer Begriff ist und nicht notwendigerweise als absolute Reinheit aufgefasst werden soll. Die Reinheit kann beispielsweise etwa 50% sein, kann größer als 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder kann 100% sein.
  • Die erfindungsgemäßen Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine (einschließlich funktioneller Varianten davon), Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-Bindungsabschnitten davon), von denen alle gemeinsam im Folgenden als „erfindungsgemäße TCR-Materialien“ bezeichnet werden, können in einer Zusammensetzung, wie einer pharmazeutische Zusammensetzung, formuliert werden. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die jegliches der Antigen-erkennenden Konstrukte, TCRs, Polypeptide, Proteine, funktionelle Abschnitte, funktionelle Varianten, Nukleinsäuren, Expressionsvektoren, Wirtszellen (einschließlich Populationen davon) und Antikörper (einschließlich Antigen-bindende Abschnitte davon umfasst), die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Stabilisator. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein beliebiges der erfindungsgemäßen TCR-Materialien enthalten, können mehr als ein erfindungsgemäßes TCR-Material umfassen, z. B. ein Polypeptid und eine Nukleinsäure oder zwei oder mehr verschiedener TCRs (einschließlich funktioneller Abschnitte und funktionelle Varianten davon). Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein erfindungsgemäßes TCR-Material in Kombination mit anderem(n) pharmazeutischen Wirkstoff(en) oder Arzneimittel(n) wie chemotherapeutischen Mitteln, z. B. Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Cisplatin, Daunorubicin, Doxorubicin, Fluorouracil, Gemcitabin, Hydroxyharnstoff, Methotrexat, Paclitaxel, Rituximab, Vinblastin, Vincristin usw. umfassen. Bevorzugt ist der Träger ein pharmazeutisch akzeptabler Träger. In Bezug auf pharmazeutische Zusammensetzungen kann der Träger irgendeiner von denen sein, die üblicherweise für das jeweilige erfindungsgemäße TCR-Material verwendet werden. Solche pharmazeutisch akzeptablen Träger sind dem Fachmann gut bekannt und stehen der Öffentlichkeit leicht zur Verfügung. Es ist bevorzugt, dass der pharmazeutisch akzeptable Träger einer ist, der unter den Verwendungsbedingungen keine nachteiligen Nebenwirkungen oder Toxizität aufweist.
  • So wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die jedes der im Kontext beschriebenen Produkte der Erfindung und TCR-Materialien der Erfindung umfasst, insbesondere alle Proteine, Nukleinsäuren oder Wirtszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung für die Immuntherapie, vorzugsweise Adoptivzelltherapie vorgesehen.
  • Es ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße TCR-Material durch Injektion, z. B. intravenös, verabreicht wird. Wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine Wirtszelle ist, die das erfindungsgemäße TCR (oder eine funktionelle Variante davon) exprimiert, kann der pharmazeutisch akzeptable Träger für die Zellen zur Injektion jeden isotonischen Träger, wie z. B. normale Kochsalzlösung (etwa 0,90% w/v, NaCl in Wasser, etwa 300 mOsm/l NaCl in Wasser oder etwa 9,0 g NaCl pro Liter Wasser), NORMOSOL R-Elektrolytlösung (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), etwa 5 % Dextrose im Wasser oder Ringer-Laktat enthalten. In einer Ausführungsform wird der pharmazeutisch akzeptable Träger mit humanem Serumalbumin ergänzt.
  • Für die Zwecke der Erfindung kann die Menge oder Dosis (z. B. Anzahl von Zellen, wenn das erfindungsgemäße TCR-Material eine oder mehrere Zellen ist) des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um z. B. eine therapeutische oder prophylaktische Antwort in dem Subjekt oder Tier über einen angemessenen Zeitrahmen zu beeinflussen. Beispielsweise sollte die Dosis des erfindungsgemäßen TCR-Materials ausreichend sein, um an ein Krebsantigen zu binden oder Krebs in einer Zeitspanne von etwa 2 Stunden oder länger, z. B. 12 bis 24 oder mehr Stunden, von der Zeit an, an der es verabreicht wurde, zu detektieren, zu behandeln oder zu verhindern. In bestimmten Ausführungsformen kann der Zeitraum noch länger sein. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit des speziellen erfindungsgemäßen TCR-Materials und den Zustand des Tieres (z. B. Menschen) sowie des Körpergewichtes des zu behandelnden Tieres (z. B. Menschen) bestimmt.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, TCRs (einschließlich funktioneller Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen oder Populationen von Zellen in Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs oder COL6A3-positiver Krankheitsvorstufe verwendet werden können Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen TCRs (und funktionelle Varianten davon) spezifisch an das COL6A3-Antigen binden, so dass das TCR (oder verwandte erfindungsgemäße Polypeptid oder Protein und funktionelle Varianten davon), wenn es durch eine Zelle exprimiert wird, in der Lage ist, eine Immunantwort gegen eine Zielzelle zu vermitteln, die die COL6A3-Antigene der Erfindung exprimiert. In dieser Hinsicht stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung eines Zustands, insbesondere Krebses, bei einem Säugetier bereit, umfassend die Verabreichung an das Säugetier einer der pharmazeutischen Zusammensetzungen, Antigen-erkennende Konstrukte, insbesondere TCRs (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide oder Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, einer beliebigen Nukleinsäure oder einen beliebigen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen beliebigen der TCRs (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide, Proteine, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, oder eine beliebige Wirtszelle oder Population von Zellen, die einen rekombinanten Vektor umfassen, der ein beliebiges der im Kontext beschriebenen Konstrukte der Erfindung (und funktionelle Varianten davon) kodiert, Polypeptide oder Proteine in einer Menge, die wirksam ist, um den Zustand in dem Säugetier zu behandeln oder zu verhindern, wobei der Zustand Krebs, vorzugsweise COL6A3-positiver Krebs ist.
  • Beispiele für pharmazeutisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Stabilisatoren wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Glukose, Dextran), Proteine wie Albumin oder Casein, Protein enthaltende Mittel, wie Rinderserum oder Magermilch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer).
  • Die Begriffe „behandeln“ und „verhindern“ sowie Wörter, die daraus stammen, wie sie im Kontext der Erfindung verwendet werden, bedeuten nicht notwendigerweise 100%-ige oder vollständige Behandlung oder Prävention. Vielmehr gibt es unterschiedliche Behandlungs- oder Vorbeugungsgrade, von denen der durchschnittliche Fachmann den potentiellen Nutzen oder therapeutischen Effekt erkennt. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Verfahren jede beliebige Menge jeder beliebigen Behandlungs- oder Vorbeugungsstufe eines Zustandes bei einem Säugetier bereitstellen. Weiterhin kann die Behandlung oder Vorbeugung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt wird, die Behandlung oder Vorbeugung einer oder mehrerer Zustände oder Symptome des zu behandelnden oder vorzubeugenden Zustands, z. B. Krebs, einschließen. Zum Beispiel kann die Behandlung oder Vorbeugung die Förderung der Regression eines Tumors einschließen. Auch kann die „Vorbeugung“ für die Zwecke der Erfindung die Verzögerung des Beginns des Zustandes oder eines Symptoms oder eines Zustandes davon umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, umfassend die Verabreichung eines TCR, einer Nukleinsäure oder einer Wirtszelle der vorliegenden Beschreibung in Kombination mit mindestens einem chemotherapeutischen Mittel und/oder einer Strahlentherapie.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    1. a) Isolierung einer Zelle aus dem Subjekt;
    2. b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    3. c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    4. d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einem Subjekt, der diese benötigt, umfassend:
    1. a) Isolierung einer Zelle eines gesunden Spenders
    2. b) Transformieren der Zelle mit mindestens einem Vektor, der ein Antigen-erkennendes Konstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine transformierte Zelle zu erzeugen;
    3. c) Vermehrung der transformierten Zelle, um eine Vielzahl von transformierten Zellen zu erzeugen; und
    4. d) Verabreichen der Vielzahl von transformierten Zellen an das Subjekt.
  • Ebenfalls wird ein Verfahren zum Nachweis von Krebs in einer biologischen Probe bereitgestellt, das Verfahren umfassend:
    1. a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Antigen-erkennenden Konstrukt der vorliegenden Beschreibung;
    2. b) Nachweisen der Bindung des Antigen-erkennenden Konstrukts mit der biologischen Probe.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Verfahren zum Nachweis von Krebs in vitro, in vivo oder in situ durchgeführt.
  • Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Zustandes bei einem Säugetier. Das Verfahren umfasst (i) Inkontaktbringen einer Probe, die eine oder mehrere Zellen aus dem Säugetier umfasst, mit einem beliebigen der erfindungsgemäßen TCRs (und funktionellen Varianten davon), Polypeptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, rekombinanten Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen, Antikörpern oder Antigen-bindenden Abschnitten davon oder mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die im Kontext der Erfindung beschrieben sind, wodurch ein Komplex gebildet wird und (ii) Nachweis des Komplexes, wobei der Nachweis des Komplexes das Vorhandensein des Zustandes in dem Säugetier anzeigt, wobei der Zustand Krebs ist, so wie eine COL6A3-positive bösartige Erkrankung.
  • In Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Zustandes bei einem Säugetier kann die Probe von Zellen eine Probe sein, die ganze Zellen, Lysate davon oder einen Anteil der gesamten Zelllysate, z. B. eine nukleare oder zytoplasmatische Fraktion, eine ganze Proteinfraktion oder eine Nukleinsäurefraktion umfasst.
  • Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens kann das Inkontaktbringen in vitro oder in vivo in Bezug auf das Säugetier erfolgen. Bevorzugt ist das Inkontaktbringen in vitro.
  • Auch kann der Nachweis des Komplexes durch eine beliebige Anzahl von in der Technik bekannten Möglichkeiten erfolgen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antigen-erkennenden Konstrukte (und funktionelle Varianten davon), Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, rekombinante Expressionsvektoren, Wirtszellen, Populationen von Zellen oder Antikörpern oder TCRs oder Antigen-bindende Abschnitte davon, die im Kontext beschrieben sind, mit einem detektierbaren Marker wie z. B. einem Radioisotop, einem Fluorophor (z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE)), einem Enzym (z.B. alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase) und Elementpartikeln (z.B. Goldpartikel) markiert werden.
  • Für die Zwecke der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen Wirtszellen oder Populationen von Zellen verabreicht werden, können die Zellen Zellen sein, die in Bezug auf Säugetier allogen oder autolog sind. Es ist bevorzugt, dass die Zellen zu dem Säugetier autolog sind.
  • In Bezug auf die oben erwähnten medizinischen Anwendungen des TCR-Materials kann der zu behandelnde und/oder zu diagnostizierende Krebs jegliche Krebsart sein, einschließlich eines akuten lymphatischen Krebses, einer akuten myeloischen Leukämie, eines alveolären Rhabdomyosarkoms, eines Knochenkrebses, Hirntumors, Brustkrebses, Krebses des Anus, Analkanal oder Anorektum, Krebses des Auges, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, Gallenblase oder Pleura, Krebses der Nase, Nasenhohlraum oder des Mittelohres, Krebses der Mundhöhle, Krebses der Vagina, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischen Leukämie, chronischer myeloischen Krebs, Darmkrebses, Speiseröhrenkrebses, Gebärmutterhalskrebses, gastrointestinalen Karzinoidtumors, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Hypopharynx, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, bösartigen Mesotheliomes, Melanoms, multiplen Myeloms, Krebses des Nasopharynx, Non-Hodgkin-Lymphoms, Krebses des Oropharynx, Eierstockkrebses, Krebses des Penis, Bauchspeicheldrüsenkrebses, Peritoneums, Omentums und Mesenterialkrebses, Pharynxkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Dünndarmkrebses, Weichgewebskrebses, Magenkrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Krebses des Uterus, Harnleiterkrebses und Harnblasenkrebses. Eine bevorzugte Krebsart ist Krebs ist Krebs des Gebärmutterhalses, Oropharynx, Anus, Analkanal, Anorektum, Vagina, Vulva oder Penis. Eine besonders bevorzugte Krebsart ist ein COL6A3-positiver Krebs, so wie gastrointestinaler Krebs und Darmkrebs.
  • Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts bereit, das an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, umfassend die Verabreichung der Antigen-erkennenden Konstrukte, Nukleinsäuren, Vektoren, pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Wirtszellen, wie durch die vorliegende Erfindung offenbart. Vorzugsweise ist das Subjekt ein Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt. Der Gegenstand in bevorzugten Ausführungsformen ist ein Säugetier-Subjekt, vorzugsweise ein menschlicher Patient, der an einem Tumor oder einer Tumorerkrankung leidet, die COL6A3-positiv ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen mit Referenz zu den begleitenden Abbildungen und Sequenzen beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen. In den Abbildungen und den Sequenzen:
    • zeigt die Umwandlung eines TCR in einen stabilisierten Vα/Vβ einkettigen TCR (scTv) über die Präsentation auf der Oberfläche von Hefe. ScTv-Moleküle, die auf der Oberfläche von transformierten Saccharomyces cerevisiae EBY100 gezeigt wurden, wurden mit FITC-markiertem Anti-Vbetal-Antikörper und PE-markiertem HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer gefärbt. Das unveränderte scTv R4P3F9 (linkes Schaubild, SEQ ID NO: 22) wird mit einem scTv-Klon verglichen, der Einzelpunktmutationen trägt, um das scTv-Gerüst (rechtes Schaubild) zu stabilisieren, das aus der Auswahl einer scTv-Bibliothek zufälliger Mutation abgeleitet wurde.
    • zeigt die ScTv-Affinitätsreifung über die Präsentation auf der Oberfläche von Hefe. Stabilisierte scTv-Moleküle mit und ohne affinitätsgereiften CDR1beta wurden mit HLA-A*02 -Tetrameren enthaltend COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1) gefärbt und mit einer Mischung von HLA-A*02-Tetrameren enthaltend 9 Peptide (SEQ ID NO: 28 bis 36) mit einer hohen Sequenzähnlichkeit zu COL6A3-002 gegengefärbt. Stabilisiertes scTv (SEQ ID NO 27) mit nicht-gereifter Beta-Ketten-CDR1-Sequenz RSGDLS (SEQ ID NO: 13) wird mit scTv-Klonen mit den affinitätsgereiften Beta-Ketten-CDRl-Sequenzen AMDHPY (SEQ ID NO: 40) und ARWHRN (SEQ ID NO: 39) verglichen.
    • zeigt Größenausschlusschromatographie-Elutionsprofile von Anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S Fusionsvarianten 75-1 bis 75-25.
    • zeigt die HLA-A*02/COL6A3-002 Bindungskinetik der Anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S Fusionsvarianten 75-1 bis 75-25, gemessen mittels Biolayer-Interferometrie. Analysierte Konzentrationen von HLA-A*02/COL6A3-002 werden angezeigt.
    • zeigt die Bindungsanalyse der Anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S Fusionsvarianten 75-1 bis 75-25, gemessen mittels Biolayer-Interferometrie (BLI). 1 µM von HLA-A*02 in Komplex mit den angegebenen ähnlichen Peptiden wurde analysiert.
    • zeigt einen Vergleich von HLA-A*02/COL6A3-002 und HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30) Bindungskinetik verschiedener Anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S Fusionsvarianten. Analysierte Konzentrationen von Fab-scTv-Molekülen sind angegeben.
    • zeigt die Färbung der gereiften R4P3F9 TCR-Variante, die menschliche CD8+ T-Zellen exprimiert, mit PE-markierten HLA-A*02/COL6A3-002-Tetrameren. Zu Kontrollzwecken wurde kein TCR (Mock) oder das für NYESO1-001 spezifische 1G4 TCR exprimiert und die Färbung mit PE-markierten HLA-A*02/NYESCO1-001-Tetrameren verwendet.
    • zeigt die IFN-Gamma-Freisetzung der gereiften R4P3F9 TCR-Variante, die menschliche CD8+ T-Zellen als Reaktion auf COL6A3-002 exprimiert. Zu Kontrollzwecken wurde kein TCR (Mock) oder der für NYESO1-001 spezifische 1G4 TCR exprimiert. Die IFN-Gamma-Freisetzung wurde durch ELISA nach Co-Kultur von elektroporierten CD8+ T-Zellen mit T2-Zellen bestimmt, die mit einer seriellen Verdünnung von COL6A3-002 beladen waren.
    • zeigt die IFN-Gamma-Freisetzung der gereiften R4P3F9 TCR-Variante, die menschliche CD8+ T-Zellen als Reaktion auf COL6A3-002 und verschiedene ähnliche Peptide exprimiert. Zu Kontrollzwecken wurde kein TCR (Mock) oder der für NYESO1-001 spezifische 1G4 TCR exprimiert. Die IFN-Gamma-Freisetzung wurde durch ELISA nach Co-Kultur von elektroporierten CD8+ T-Zellen mit T2-Zellen bestimmt, die mit 10 µM COL6A3-002 oder ähnlichen Peptiden beladen waren.
  • Tabelle 1: Erfindungsgemäße Peptidsequenzen (Positionen entsprechend der IMGT-Nummerierung:
    (François Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: human (Homo sapiens) TRAV; IMGT Repertoire. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Created: 16/03/2011. Version: 03/06/2016; François Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: human (Homo sapiens) TRBV; IMGT Repertoire. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Created: 16/03/2011. Version: 03/06/2016.)
    SEQ ID No. Bezeichnung Beschreibung Sequenz
    1 COL6A3-002 FLLDGSANV
    2 R4P3F9 alpha R4P3F9 TCR alpha Kette - volle Länge MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIA SLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDG RFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQ LTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD FDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETD TNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
    3 R4P3F9 alpha Leader R4P3F9 TCR alpha chain - Leitpeptid MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ
    4 R4P3F9 alpha variable R4P3F9 TCR alpha Kette - variable Domäne QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYS GKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQ PSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP
    5 R4P3F9 CDRal R4P3F9 TCR alpha- Kette - CDR1 DRGSQS
    6 R4P3F9 CDRa2 R4P3F9 TCR alpha- Kette - CDR2 IYSNGD
    7 R4P3F9 CDRa3 R4P3F9 TCR alpha- Kette - CDR3 CAAYSGAGSYQLT
    8 R4P3F9 - alpha konstante R4P3F9 TCR alpha- Kette - konstante Domäne NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGF RILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
    9 R4P3F9 - alpha konstante Start R4P3F9 TCR alpha- Kette - Start der konstanten Domäne NIQN
    10 R4P3F9 beta R4P3F9 TCR beta-Kette - volle Länge MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTL RCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNIL ERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGY TFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEW TQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILY EILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
    11 R4P3F9 beta Leader R4P3F9 TCR beta-Kette - Leitpeptid MGFRLLCCVAFCLLGAGPV
    12 R4P3F9 beta variable R4P3F9 TCR beta-Kette - variable Domäne DSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLD QGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSS LELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVV
    13 R4P3F9 CDRbl R4P3F9 TCR beta-Kette - CDR1 RSGDLS
    14 R4P3F9 CDRb2 R4P3F9 TCR beta-Kette - CDR2 YYNGEE
    15 R4P3F9 CDRb3 R4P3F9 TCR beta-Kette - CDR3 CASSVESSYGYT
    16 R4P3F9 beta konstante R4P3F9 TCR beta-Kette konstante Domäne EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRL RVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQI VSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF
    17 R4P3F9 beta konstante Start 1 R4P3F9 TCR beta-Kette - Start 1 der konstanten Domäne EDLNK
    18 R4P3F9 beta konstante Start 2 R4P3F9 TCR beta-Kette - Start 2 der konstanten Domäne EDLKN
    19 Aga2p - R4P3F9 Aga2p Fusionspro tein mit scTv R4P3F9 und Tags MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSL STTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSP INTQYVFGGGGSDYKDDDDKGGGASQKEVEQNSGPLSVPE GAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGD KEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGA GSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQ GLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSL ELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKAAAG GSGGEQKLISEEDL
    20 Aga2p Leitsequen z und Aga2p MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSL STTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSP INTQYVF
    21 FLAG tag FLAG Tag plus Linker GGGGSDYKDDDDKGGGAS
    22 scTv R4P3F9 Einkettige variable Domänen von R4P3F9 mit Linker; aF55S in der alphavariablen Domäne QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYS GKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQ PSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPR SGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSA QQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSG TRLTVVEDLNK
    23 Myc tag Linker und Myc Tag AAAGGSGGEQKLISEEDL
    24 scTv R4P3F9 - bQ43K scTv R4P3F9 mit stabilisie render Mutation bQ43K in der Betavariablen-Domäne QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYS GKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQ PSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPR SGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSA QQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSG TRLTVVEDLNK
    25 scTv R4P3F9 - bL72S scTv R4P3F9 mit stabilisie render Mutation bL72S in der Betavariablen-Domäne QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYS GKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQ PSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPR SGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSA QQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSG TRLTVVEDLNK
    26 CDRa1 mutant1 aG29R Mutation DRRSQS
    27 scTv R4P3F9S Stabilisie rte Version vom scTv R4P3F9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYS GKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQ PSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSP RSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFS AQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGS GTRLTVV
    28 AGRN-001 Ähnliche Peptide ALLDGRVQL
    29 CLASP1-001 Ähnliche Peptide RLLDGAFKL
    30 COL6A1-001 Ähnliche Peptide ILLDGSASV
    31 COL6A2-001 Ähnliche Peptide FLLDGSERL
    32 COL6A3-006 Ähnliche Peptide FLFDGSANLV
    33 COL6A3-008 Ähnliche Peptide FLFDGSANL
    34 COL6A3-014 Ähnliche Peptide FLLDGSEGV
    35 VWA2-001 Ähnliche Peptide FLLDGSNSV
    36 VWF-001 Ähnliche Peptide FLLDGSSRL
    37 CDRbl Mutante 1 Beta-Kette - CDR1 Variante 1 ARWHNN
    38 CDRbl Mutante 2 Beta-Kette - CDR1 Variante 2 AKDHLN
    39 CDRbl Mutante 3 Beta-Kette - CDR1 Variante 3 ARWHRN
    40 CDRbl Mutante 4 Beta-Kette - CDR1 Variante 4 AMDHPY
    41 CDRbl Mutante 5 Beta-Kette - CDR1 Variante 5 ATDHYN
    42 CDRb1 Mutante 6 Beta-Kette - CDR1 Variante 6 ARYHTN
    43 CDRb1 Mutante 7 Beta-Kette - CDR1 Variante 7 APYHLN
    44 CDRb1 Mutante 8 Beta-Kette - CDR1 Variante 8 AKDHTN
    45 CDRb1 Mutante 9 Beta-Kette - CDR1 Variante 9 ARYHRN
    46 CDRb1 Mutante 10 Beta-Kette - CDR1 Variante 10 ARWHSN
    47 CDRb1 Mutante 11 Beta-Kette - CDR1 Variante 11 ATDHYN
    48 CDRb1 Mutante 12 Beta-Kette - CDR1 Variante 12 RWGDLN
    49 CDRb1 Mutante 13 Beta-Kette - CDR1 Variante 13 ARDHLN
    50 75 (-1) Fab schwere Kette mit stabilisie rtem scTv R4P3F9S MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQ KFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASL NCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRF TAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLT FGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQG LQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLE LGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
    51 75- Fab schwere Kette Fab schwere Kette MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQ KFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTSPPSPAPPVAG
    52 75- Fab light chain Fab leichte Kette MKWVTFISLLFLFSSAYSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    53 1G4 alpha 1G4 TCR alpha- Kette - volle Länge METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVL NCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGR LNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD FDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETD TNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
    54 1G4 alpha Leader 1G4 TCR alpha- Kette - Leitpeptid METLLGLLILWLQLQWVSSK
    55 1G4 alpha variable 1G4 TCR alpha- Kette - variable Domäne QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPG KGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQ PGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHP
    56 1G4 alpha konstante 1G4 TCR alpha- Kette - konstante Domain YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNS IIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGF RILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
    57 1G4 beta 1G4 TCR beta-Kette - volle Länge MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTL QCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVP NGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGE LFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPA LNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDE WTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATIL YEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
    58 1G4 beta Leader 1G4 TCR beta-Kette Leitpeptid MSIGLLCCAALSLLWAGPVNA
    59 1G4 beta variable 1G4 TCR beta-Kette - variable Domäne GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMG LRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAA PSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL
    60 1G4 beta konstante Beta-Kette konstante Domäne EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRL RVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQI VSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG
    61 NYESO1-001 Kontrollpe ptid SLLMWITQV
    62 C-14 beta; C-5 beta C-14; C-5 TCR Volllängen betakette mit CDRbl Mutante 4 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTL RCSPAMDHPYVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNIL ERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGY TFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEW TQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILY EILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
    63 C-14 alpha C-14 TCR Volllängen alphakette mit CDRal Mutante 1 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIA SLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDG RFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQ LTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD FDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETD TNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
    64 75(-5) Fab schwere Kette mit stabilisie rtem scTv R4P3F9S und CDRbl Mutante 4 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQ KFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASL NCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRF TAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLT FGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQG LQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLE LGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
    65 75(-14) Fab schwere Kette mit stabilisie rtem scTv R4P3F9S, CDRal Mutante 1 und CDRbl Mutante 4 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQ KFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASL NCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRF TAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLT FGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQG LQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLE LGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
    66 75(-25) Fab schwere Kette mit stabilisie rtem scTv R4P3F9S in beta/alpha Orientieru ng, CDRal Mutante 1 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQ KFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTSPPSPAPPVAGGVTQTPKHLITATGQRVTLRC SPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISER FSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTF GSGTRLTVVEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQ KEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSG KSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQP SDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQN
  • BEISPIELE
  • Native T-Zell-Rezeptoren (TCRs) gegen Krebsantigene sind im Vergleich zu TCRs, die auf virale Antigene abzielen, oft von geringerer Affinität, und dies kann eine mögliche Erklärung für den Immun-Escape des Tumors sein (Aleksic et al. 2012). Daher ist es wünschenswert, dass TCR-Varianten mit höherer Affinität für den Einsatz als Antigen-erkennende Konstrukte in einer adoptiven Zelltherapie oder als Erkennungsmodul eines löslichen Ansatzes, d. h. unter Verwendung von bispezifischen Molekülen, konzipiert sind (Hickman et al. 2016). Diese Erfindung bezieht sich somit auf die Modifikation und Optimierung des natürlich vorkommenden T-Zell-Rezeptors R4P3F9 (SEQ ID NOs: 2 und 10), der auf das tumorassoziierte Peptid COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1) mit einer Affinität von etwa 60 µM ( DE102016115246 ) gerichtet ist.
  • Beispiel 1: Erzeugung stabiler scTvs
  • Für die vorliegende Erfindung wurde der zuvor untersuchte TCR R4P3F9 (SEQ ID NOs: 2 und 10) in ein einkettiges TCR-Konstrukt (scTv, SEQ ID NO: 22) zur Reifung über die Hefe-Oberflächenpräsentation durch Kombination der variablen Alpha- (SEQ ID NO: 4) und Beta- (SEQ ID NO: 12) Domäne mit Anhängen der jeweiligen Konstantdomäne (SEQ ID NOs: 9 und 17) und einer entsprechenden Glycin-Serin-Linkersequenz umgewandelt. Die DNA der entsprechenden Sequenz wurde synthetisiert und in Saccharomyces cerevisiae EBY100 (MATa AGA1::GAL1AGA1::URA3 ura352 trpl leu2delta200 his3delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R canl GAL) (ATCC® MYA 4941™) zusammen mit einem Hefedisplay-Vektor, der eine Leader-Sequenz und das Hefeplatzgleichungsprotein Aga2p (SEQ ID NO: 20) enthält, basierend auf pCT302, umgewandelt (Boder et al. 2000). Das resultierende Fusionsprotein enthält nach homologer Rekombination in der Hefe (SEQ ID NO: 19) ein Leitpeptid am N-Terminus des Aga2p-Proteins, das für die Präsentation des interessierenden Proteins verantwortlich ist (Boder et al. 1997), kurze Peptid-Tags mit Linkersequenzen (SEQ ID NO: 21 und 23) für Expressionskontrollen und das interessierende Protein, nämlich das scTv R4P3F9 (SEQ ID NO: 22) oder seine Varianten. Die Transformation wurde wie in DE102016121899 beschrieben durchgeführt und führte zu bis zu 109 Hefeklonen pro Bibliothek. Die Bibliotheken wurden über einen zufälligen Mutations-PCR-Ansatz generiert, der die gesamte Gensequenz des scTv R4P3F9 umfasst.
  • Der Auswahlprozess für die Hefeklone mit dem am besten exprimierenden scTv, der selektiv an COL6A3-002 im Kontext von HLA-A*02 bindet, wurde im Wesentlichen wie in Smith et al 2015 beschrieben durchgeführt. Um eine hohe Expression und korrekte Konformität der scTv R4P3F9-Variante, die auf der Hefeoberfläche präsentiert wird, zu gewährleisten, wurde ein Anti-Vbetal (Beckman Coulter, Klon BL37.2) Antikörper zusammen mit HLA-A*02/COL6A3-002 Tetramer verwendet ( ). Die scTv-Umwandlung durch das Hefe-Oberflächendisplay zeigte zwei entscheidende stabilisierende Mutationen im Gerüstbereich zusammen mit den ursprünglichen CDR-Sequenzen für die korrekte Präsentation des scTv auf der Zelloberfläche, nämlich bQ43K (SEQ ID NO: 24) und bL72S (SEQ ID NO: 25), beide in der Beta-Kette. Darüber hinaus wurde während der Stabilitätsreifung die Position 29 im CDR1 der Alpha-Kette (SEQ ID NO: 5) von Glycin in Arginin (CDRal-Mutante 1, SEQ ID NO: 26) umgewandelt, was zu einer verbesserten Tetramerbindung führte.
  • Beispiel 2: Affinitätsreifung von stabilisiertem scTv
  • Um scTv-Moleküle mit höherer Bindungsaffinität zu HLA-A*02/COL6A3-002 zu erzeugen, wurde das CDRbl (SEQ ID NO: 13) mit dem zuvor identifizierten stabilisierten scTv R4P3F9S-Gerüst (SEQ ID NO: 27) degeneriert, das die stabilisierenden Mutationen aG29R, bQ43K und bL72S exprimiert. Die CDRbl-Reste wurden randomisiert, indem degenerierte DNA-Oligoprimer, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben, verwendet wurden (Smith et al. 2015). Die resultierende DNA-Bibliothek wurde wie in Beispiel 1 beschrieben transformiert. Um die ScTv-Bindungsselektivität zu erhalten, wurde die Negativselektion gegen HLA-A*02-Tetramere eingesetzt, die Peptide umfassen, die von normalen Geweben abgeleitet sind (SEQ ID NOs: 28 bis 36), die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit COL6A3-002-Peptid aufweisen.
  • Für die Auswahl der affinitätsverstärkten und selektiven scTv R4P3F9S-Varianten wurde für jede Sortierrunde eine abnehmende Konzentration von HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramer verwendet. Nach drei Selektionsrunden wurden einzelne scTv-Klone isoliert und sequenziert, was zu einer Vielzahl von affinitätsgesättigten CDRbl-Sequenzen führte (SEQ ID NOs: 37 bis 49). Für scTv mit gesättigten CDRbl-Sequenzen konnte eine starke Verbesserung der COL6A3-002-Bindung nachgewiesen werden, während die Selektivität der COL6A3-002-Bindung beibehalten wurde, da keine Bindung von 9 ähnlichen Peptiden beobachtet wurde ( ).
  • Beispiel 3: Herstellung von bispezifischen Antikörper-scTv Fusionsproteinen
  • Das stabilisierte und affinitätsgereifte scTv gegen HLA-A*02/COL6A3-002 kann in Fusion mit einem gegen CD3 gerichteten Antikörperteil exprimiert werden, der eine tumorspezifische Retargeting und Aktivierung von T-Zellen unabhängig von ihrer natürlichen Spezifität ermöglicht. Die Erfinder erzeugten bispezifische Antikörper-TCR-Fusionsproteine, umfassend eine Anti-CD3 Fab (UCHT1) schwere Kette (SEQ ID NO: 51), die mit den scTv R4P3F9S-Varianten (SEQ ID NO: 50, 64, 65 und 66) fusioniert ist, und eine Anti-CD3 Fab (UCHT1) Leichtkette (SEQ ID NO: 52). Die resultierenden Fab-scTv-Fusionsproteine haben eine Molekularmasse von ca. 75 kDa. Basierend auf verschiedenen CDR1-Sequenzen der scTv R4P3F9S alpha (SEQ ID NOs: 5 und 26) und beta-Kette (SEQ ID NOs: 13 und 37 bis 49) wurden verschiedene Fab-scTv-Fusionsvarianten (75-1 bis 75-25, Tabelle 2) in transient transfizierten ExpiCHO-Zellen exprimiert, wie vom Hersteller empfohlen. Proteine wurden durch Protein L und Größenausschlusschromatographie gereinigt. Alle Fusionsvarianten konnten mit Ausbeuten von 80 µg bis 1 mg (Tabelle 2) und homogen geformten Heterodimeren in der erwarteten Größe hergestellt werden, wie sie mittels Größenausschlusschromatographie analysiert wurden ( ).
  • Tabelle 2: Nomenklatur und Ausbeute der bispezifischen Fab-scTv Fusionsproteine. Die Moleküle basieren auf den SEQ ID NOs 50 und 52 und den angegebenen CDRal und CDRb1 -Varianten.
    Variante CDRal/SEQ CDRbl/SEQ Ausbeute [µg]
    75-1 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267,9
    75-2 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 78,4
    75-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 646,7
    75-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 704,3
    75-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 397,2
    75-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 268,1
    75-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 83,2
    75-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 765,7
    75-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 1067,2
    75-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 389,6
    75-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 270,4
    75-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 943,6
    75-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 560,3
    75-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 360,7
    75-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 541,5
    75-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 403,6
    75-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 195,5
    75-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 731,3
    75-19 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHRN (SEQ ID NO. 45) 794
    75-20 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHSN (SEQ ID NO. 46) 85,5
    75-21 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 47) 276
    75-22 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RWGDLN (SEQ ID NO. 48) 255
    75-23 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARDHLN (SEQ ID NO. 49) 217
    75-24a DRGSQS (SEQ ID NO: 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 166,6
    75-25a DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267
    a beta-alpha Orientierung des scTvs
  • Beispiel 4: Bindung des Fab-scTv Fusionsproteins an COL6A3-002 und ähnliche Peptide
  • Die Bindungsaffinität von Anti-CD3-scTv R4P3F9S Fusionsproteinen gegenüber HLA-A*02-Monomeren mit COL6A3-002 oder verschiedenen ähnlichen Peptiden wurde mittels Biolayer-Interferometrie gemessen. Die Messungen wurden auf einem Octet RED384-System unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Einstellungen durchgeführt. Zusammenfassend, gereinigte Fab-scTv-Moleküle wurden auf Biosensoren (FAB2G) geladen, bevor serielle Verdünnungen von HLA-A*02/COL6A3-002 analysiert wurden. Im Vergleich zu den Varianten 75-1 und 75-24, die Wildtyp-CDRal und Wildtyp-CDRbl umfassen, wurden bei Fab-scTv-Varianten mit gereiften CDRal- und/oder CDRbl-Sequenzen erhöhte Bindungsaffinitäten von bis zu 40-fach beobachtet (Tabelle 3, ). Um die Selektivität der Bindung an HLA-A*02/COL6A3-002 zu bewerten, wurden gereinigte Fab-scTv-Moleküle, die auf FAB2G-Biosensoren geladen wurden, auf Bindung an 1 µM ähnliche Peptide (SEQ ID NOs: 28 bis 36), jeweils in Kombination mit HLA-A*02, untersucht. Mit Ausnahme von HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30), das an die meisten Fab-scTv-Varianten mit gereiftem CDRal (SEQ ID NO: 26) gebunden war, zeigten Fab-scTv-Varianten keine Bindung an ähnliche Peptide ( ), die für eine hohe Bindungsselektivität sprechen. Für einige Fab-scTv-Varianten wurde das therapeutische Fenster zwischen HLA-A*02/COL6A3-002 und HLA-A*02/COL6A1-001-Bindung untersucht, indem biotinylierte Peptid-HLA-Komplexe auf Biosensoren (SA) geladen und Verdünnungsreihen von Fab-scTv-Varianten analysiert wurden. Während die Variante 75-10, die gereiftes CDRal (SEQ ID NO: 26) und Wildtyp CDRbl (SEQ ID NO: 13)-Sequenz umfasst, eine 8-fach erhöhte Bindungsaffinität zu HLA-A*02/COL6A3-002 über HLA-A*02/COL6A1-001 zeigte, wurde eine bis zu 57-fach erhöhte Bindungsaffinität für die Fab-scTv-Variante 75-13 nachgewiesen, die ein gereiftes CDRbl (SEQ ID NO: 39) umfasst, das für eine Verbesserung des Therapiefensters spricht (Tabelle 4, 6). Tabelle 3: Bindende Affinität von Fab-scTv Fusionsproteinen an HLA-A*02/COL6A3-002.
    Variante KD (M) kon (1/Ms) koff (1/s)
    75-1 8,06E-06 1,01E+05 8,17E-01
    75-2 3,69E-06 1,59E+05 5,86E-01
    75-3 4,92E-06 9,71E+04 4,78E-01
    75-4 5,76E-06 9,78E+04 5,63E-01
    75-5 4,32E-04 2,21E+03 9,55E-01
    75-6 1,13E-06 2,06E+05 2,32E-01
    75-7 1,79E-06 1,93E+05 3,44E-01
    75-8 3,45E-06 1,36E+05 4,69E-01
    75-9 1,41E-05 6,02E+04 8,51E-01
    75-10 1,78E-06 1,69E+05 3,01E-01
    75-11 2,82E-07 4,16E+05 1,18E-01
    75-12 3,74E-07 2,67E+05 1,00E-01
    75-13 4,05E-07 3,28E+05 1,33E-01
    75-14 3,10E-06 8,41E+04 2,61E-01
    75-15 7,78E-07 2,33E+05 1,81E-01
    75-16 5,87E-07 3,37E+05 1,98E-01
    75-17 2,27E-07 3,62E+05 8,20E-02
    75-18 1,93E-06 1,51E+05 2,91E-01
    75-19 6,00E-07 2,96E+05 1,78E-01
    75-20 5,31E-07 6,08E+05 3,23E-01
    75-21 5,52E-07 2,72E+05 1,50E-01
    75-22 8,22E-07 2,48E+05 2,04E-01
    75-23 3,24E-07 3,18E+05 1,03E-01
    75-24 5,20E-06 1,08E+05 5,62E-01
    75-25 8,33E-06 6,23E+04 5,19E-01
    Tabelle 4: Vergleichende Bindungsaffinität von Fab-scTv Fusionsproteinen an HLA-A*02/COL6A3-002 und HLA-A*02/COL6A1-001.
    Variante pHLA-A*02 KD (M) KDCOL6A1-001/K-DCOL6A3-002
    75-10 COL6A3-002 1,37E-05 8
    COL6A1-001 1,08E-04
    75-11 COL6A3-002 8,50E-07 8
    COL6A1-001 6,46E-06
    75-12 COL6A3-002 7,24E-07 12
    COL6A1-001 8,98E-06
    75-13 COL6A3-002 7,39E-07 57
    COL6A1-001 4,23E-05
    75-17 COL6A3-002 8,25E-07 9
    COL6A1-001 7,10E-06
    75-23 COL6A3-002 1,15E-06 22
    COL6A1-001 2,55E-05
  • Beispiel 5: Verwendung von affinitätsgereiften TCRs zur zellulären Expression
  • Die Modifikation von T-Zellen zur Expression von TCRs, die einen tumorspezifischen Komplex Peptid-HLA erkennen, ist eine vielversprechende Alternative zur Neuausrichtung von T-Zellen auf Krebszellen. Da die Verwendung von gereiften CDR1-Sequenzen zellgebundene TCRs gegen HLA-A*02/COL6A3-002 verbessern könnte, wurden die identifizierten CDRal- und CDRbl-Mutantensequenzen auf den elterlichen TCR R4P3F9 (SEQ ID NOs: 2 und 10) transplantiert. Die resultierenden mutierten TCR-Varianten (C-1 bis C-18, Tabelle 5) wurden in humanen CD8+ T-Zellen nach der Elektroporation der jeweiligen mRNA exprimiert, die durch in vitro-Transkription von PCR-amplifizierten DNA-Konstrukten erzeugt wurde. Zu Kontrollzwecken wurde der 1G4 TCR (SEQ ID NOs: 53 und 57) gegen das Peptid NYESO1-001 (SEQ ID NO: 61) exprimiert. Nach der nächtlichen Inkubation von RNA-elektroporierten CD8+ T-Zellen wurde die Expression der eingeführten TCR-Varianten durch Färbung mit PE-markierten HLA-A*02/COL6A3-002-Tetramern oder HLA-A*02/NYESO1-001-Tetramern analysiert. Während die elterliche TCR R4P3F9-Variante C-1 nur eine minimale Färbung mit HLA-A*02/COL6A3-002-Tetrameren zeigte, zeigten die R4P3F9 TCR-Varianten C-2 bis C-18 mit gereiften CDRal und/oder CDRbl eine erhöhte Tetramer-Färbung ( ). Die funktionelle Aktivierung von CD8+ T-Zellen (20.000 Zellen/Well), die verschiedene gereifte R4P3F9 TCR-Varianten exprimieren, wurde untersucht, indem der Gehalt an freigesetztem IFN-Gamma bei Co-Kultur mit T2-Zellen (20.000 Zellen/Well) bestimmt wurde, die entweder mit einer Verdünnungsreihe von COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1) oder 10 µM von COL6A3-002 und ähnlichen Peptiden (SEQ ID NO: 28 bis 36) beladen waren. Im Vergleich zur elterlichen R4P3F9 TCR-Variante C-1 zeigten die gereiften TCR-Varianten C-2 bis C-18 eine erhöhte IFN-Gamma-Freisetzung mit Maximalwerten, die bereits bei niedrigeren Peptidkonzentrationen erreicht wurden ( ). Wie erwartet, wurde keine IFN-Gamma-Freisetzung mit T-Zellen beobachtet, die kein TCR exprimieren, oder die 1G4-Steuerung TCR, die für NYESO1-001 spezifisch ist. Um die Selektivität der COL6A3-002-Erkennung der gereiften R4P3F9 TCR-Varianten zu analysieren, wurde die IFN-Gamma-Freisetzung als Reaktion auf T2-Zellen, die mit verschiedenen ähnlichen Peptiden (SEQ ID NOs: 28 bis 36) beladen sind, analysiert und verschiedene Selektivitätsprofile für die gereiften R4P3F9 TCR-Varianten offenbart. Interessanterweise zeigten die TCR-Varianten C-5 (SEQ ID Nr. 62 und 2) und C-14 (SEQ ID Nr. 62 und 63), die dasselbe gereifte CDRbl (SEQ ID Nr. 40) enthielten, keine Kreuzreaktivität gegenüber COL6A1-001 oder anderen ähnlichen Peptiden ( ), die die affinitätsgereiften R4P3F9 TCR-Varianten C-5 und C14 zu den am meisten versprechenden Kandidaten für zelluläres TCR-basiertes Tumor-Targeting machten. Tabelle 5: Nomenklatur der zellulären TCR-Varianten. Die Moleküle basieren auf den SEQ ID NOs 2 und 10 und den angegebenen CDRal und CDRbl-Varianten.
    Variant e CDRa1 CDRb1
    C-1 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13)
    C-2 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
    C-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
    C-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
    C-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
    C-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
    C-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
    C-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
    C-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
    C-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13)
    C-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
    C-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
    C-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
    C-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
    C-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
    C-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
    C-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
    C-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
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Claims (18)

  1. Antigen-erkennendes Konstrukt, umfassend eine erste Domäne umfassend drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 5 (CDRal), 6 (CDRa2) und 7 (CDRa3) umfassen, und eine zweite Domäne umfassend drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 13 (CDRbl), 14 (CDRb2) und 15 (CDRb3) umfassen, wobei mindestens eine der komplementaritätsbestimmenden Regionen durch mindestens eine Aminosäuresequenz ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe von: a) SEQ ID NO: 26 (CDRal Mutante 1) und SEQ ID NO: 37 bis 49 (CDRblmut1 bis CDRb1-mut13) und b) eine mutierte Sequenz, die mindestens eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 37 bis 49 ausgewählt ist, wobei die mindestens eine Aminosäuresequenz eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen enthält.
  2. Antigen- erkennendes Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt stabil ist und in der Lage ist, spezifisch und/oder selektiv an ein COL6A3-Antigenpeptid zu binden, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, insbesondere im Zusammenhang mit MHC.
  3. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen-erkennende Konstrukt ein Antikörper oder ein Derivat, wie ein bispezifisches Molekül, oder ein Fragment davon ist, oder ein T-Zell-Rezeptor (TCR) oder ein Derivat, wie ein bispezifisches Molekül oder ein Fragment davon ist.
  4. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Domäne Teil einer TCR α- oder γ-Kette ist; und/oder wobei die zweite Domäne Teil einer TCR β- oder δ-Kette ist.
  5. Nukleinsäure, die ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, oder ein Nukleinsäure-Vektor umfassend die Nukleinsäure.
  6. Rekombinante Wirtszelle, umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine Nukleinsäure oder einen Vektor nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle vorzugsweise a) ein Lymphozyt, wie beispielsweise eine T-Lymphozyt oder T-Lymphozyten-Vorläuferzelle, wie beispielsweise eine CD4 oder CD8-positive T-Zelle, oder b) ein Nicht-Lymphozyt, wie eine Zelle aus Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) ist.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure oder den Vektor nach Anspruch 5 oder die Wirtszelle nach Anspruch 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel Stabilisator und/oder Hilfsstoff.
  8. Verfahren zur Herstellung des COL6A3-spezifischen Antigen-erkennenden Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend a. Bereitstellung einer geeigneten Wirtszelle, b. Bereitstellung eines genetischen Konstrukts umfassend eine kodierende Sequenz, die das Antigen-erkennende Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert, c. Einführung des genetischen Konstrukts in die geeignete Wirtszelle und d. Expression des genetischen Konstrukts durch die geeignete Wirtszelle.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin umfassend die Isolierung und Aufreinigung des Antigen-erkennenden Konstrukts aus der geeigneten Wirtszelle und, optional, Rekonstitution des Antigen-erkennenden Konstrukts in eine T-Zelle.
  10. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure oder der Vektor nach Anspruch 5, die Wirtszelle nach Anspruch 6 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung in der Medizin.
  11. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure oder ein Vektor nach Anspruch 5, die Wirtszelle nach Anspruch 6 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung in der Diagnose, Vorbeugung und/oder der Behandlung einer proliferativen Erkrankung, wie Krebs.
  12. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure oder der Vektor nach Anspruch 5, die Wirtszelle nach Anspruch 6 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Krebs aus einem Krebs ausgewählt ist, bei dem COL6A3 überexprimiert, mutiert und/oder ein vom COL6A3 stammendes tumorassoziiertes Antigen präsentiert wird, wie beispielsweise kolorektales Karzinom, Darmkrebs, Leberkrebs, Eierstockkrebs und Magenkrebs.
  13. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die mutierte Sequenz eine Kombination aus einer ersten und einer zweiten Aminosäuresequenz ist, so dass die mutierte Sequenz bereitgestellt wird, indem eine, zwei oder drei Aminosäuren in der ersten Sequenz durch die entsprechenden eine, zwei oder drei Aminosäuren der zweiten Sequenz ersetzt werden.
  14. Antigen-erkennendes Konstrukt nach Anspruch 13, wobei die mutierte Sequenz eine Kombination aus einer ersten und einer zweiten Aminosäuresequenz ist, so dass die mutierte Sequenz bereitgestellt wird, indem eine, zwei oder drei aufeinander folgende Aminosäuren in der ersten Sequenz durch die entsprechenden eine, zwei oder drei aufeinander folgenden Aminosäuren der zweiten Sequenz ersetzt werden.
  15. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4 und 13-14, wobei die mutierte Sequenz von (b) mindestens eine konservative Aminosäuresubstitution im Vergleich zu der mindestens einen Aminosäuresequenz von (a) enthält.
  16. Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die mindestens eine der komplementaritätsbestimmenden Regionen durch SEQ ID NO: 40 ersetzt ist und wobei SEQ ID NO: 40 eine, zwei oder drei Aminosäuresubstitutionen enthält.
  17. Antigen-erkennendes Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die mindestens eine der komplementaritätsbestimmenden Regionen durch SEQ ID NO: 40 ersetzt ist.
  18. Antigen-erkennendes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend eine Variante, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 75-1 - 75-25 aus der Tabelle 2 und C-1 - C-18 aus der Tabelle 5.
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