ES2264143T3

ES2264143T3 - Plantas que sintetizan un almidon modificado, procedimiento para su preparacion asi como almidones modificados.

Info

Publication number: ES2264143T3
Application number: ES96932575T
Authority: ES
Inventors: Jens Kossmann; Ruth Lorberth
Original assignee: Bayer Bioscience GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2016-09-19
Also published as: WO1997011188A1; US8586722B2; PT851934E; EP1435205B1; US6815581B2; ATE332382T1; US7569744B2; US20070067874A1; EP0851934A1; CA2231774A1; US20060168691A1; EP0851934B1; AU715944B2; JP2008173128A; EP1728441A3; HUP9900510A3; US7897760B2; DK1435205T3; DE59611501D1; EP1702518A1

Abstract

SE DESCRIBEN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO, QUE CODIFICAN UNA PROTEINA UNIDA A UN GRANO DE ALMIDON, ASI COMO PROCESOS Y MOLECULAS DNA RECOMBINANTES PARA LA PRODUCCION DE CELULAS VEGETALES Y PLANTAS TRANSGENICAS, QUE SINTETIZAN UN ALMIDON MODIFICADO DE VISCOSIDAD Y CONTENIDO DE FOSFATO DIFERENTES. POR OTRA PARTE SE DESCRIBEN LAS CELULAS VEGETALES Y LAS PLANTAS RESULTANTES DEL PROCESO Y EL ALMIDON OBTENIDO A PARTIR DE ELLAS.

Description

Plantas que sintetizan un almidón modificado, procedimiento para su preparación así como almidones modificados.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína unida a granos de almidón, así como a procedimientos y moléculas de ADN recombinantes para la producción de células de plantas transgénicas y de tales plantas, que sintetizan un almidón modificado con propiedades modificadas de viscosidad y con un contenido modificado de fosfatos. El invento se refiere asimismo a las células de plantas transgénicas y a tales plantas, que resultan del procedimiento y describe el almidón obtenible a partir de las células de plantas transgénicas y de tales plantas.

El polisacárido almidón, que constituye una de las sustancias almacenadas más importantes en el reino vegetal, encuentran también, junto a la utilización en el sector de los alimentos, una amplia utilización como materia prima renovable para la producción de productos industriales. Con el fin de hacer posible la utilización de esta materia prima en el mayor número posible de sectores de empleo, es necesario conseguir una gran diversidad de sustancias y una adaptación a los requisitos respectivos de la industria que las ha de elaborar.

Aún cuando un almidón está constituido por un eslabón fundamental químicamente uniforme, la glucosa, este almidón no constituye ninguna materia prima uniforme. Se trata en tal caso más bien de una compleja mezcla de diferentes formas de moléculas, que se diferencian en lo que se refiere a su grado de ramificación y a la aparición de ramificaciones de las cadenas de glucosa. Se establece diferencia en particular entre el almidón de amilosa, que es un polímero en lo esencial sin ramificar a base de moléculas de glucosa enlazadas en \alpha-1,4, y el almidón de amilopectina, que constituye una mezcla de diferentes cadenas de glucosa fuertemente ramificadas de un modo diverso, realizándose las ramificaciones mediante la aparición de enlaces \alpha-1,6-glicosídicos.

La estructura molecular del almidón, que es determinada en una gran parte por el grado de ramificación, la relación de amilosa a amilopectina, la longitud media de cadena así como la presencia de grupos fosfatos, es decisiva para importantes propiedades funcionales del almidón o bien de sus soluciones acuosas. Como importantes propiedades funcionales se han de mencionar en este caso, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de retrogradación, las propiedades de formación de películas, la viscosidad, la estabilidad del color, las propiedades de engrudamiento, es decir las propiedades de aglutinación y de adhesión, así como la estabilidad en frío. También el tamaño de los granos de almidón puede ser importante para diferentes utilizaciones. Presenta un interés especial, en particular, la producción de almidones con un alto contenido de amilosa. Además, un almidón modificado, contenido en células de plantas, puede modificar de una manera ventajosa en determinadas condiciones el comportamiento de las célula de plantas. Se puede concebir por ejemplo una disminución de la descomposición del almidón durante el almacenamiento de órganos que contienen almidón, tales como p.ej. semillas o tubérculos, antes de su elaboración ulterior, p.ej. para la extracción del almidón. Asimismo, presenta interés producir almidones modificados, que conducen a que las células de plantas o los órganos vegetales, que contienen este almidón, sean adecuen mejor para la elaboración ulterior, por ejemplo en la producción de "popcorn" (maíz reventón de tostar) o "corn flakes" (copos de maíz), a base de maíz, o de "pommes frites" (patatas fritas a la francesa), "chips" (patatas fritas a la inglesa) o polvos de patata, a base de patatas. Presenta un interés especial en este caso el mejoramiento de los almidones, en el aspecto de que tengan una "cold sweetening" (dulcificación en frío) disminuida, es decir una liberación disminuida de azúcares reductores (en particular de glucosa) en el caso de un prolongado almacenamiento a bajas temperaturas. Precisamente las patatas se almacenan frecuentemente a unas temperaturas de 4-8ºC con el fin de reducir al mínimo la descomposición del almidón durante el almacenamiento. Los azúcares reductores, en particular glucosa, que se liberan en este caso conducen, por ejemplo en el caso de la producción de "pommes frites" o "chips", a indeseadas reacciones de caramelización (las denominadas reacciones de Maillard).

La adaptación de los almidones, aislables a partir de plantas, a determinadas finalidades de utilizaciones industriales se efectúa frecuentemente con ayuda de modificaciones químicas, que por regla general exigen una intensa dedicación de tiempo y gastos. Se manifiesta, por lo tanto, como deseable encontrar posibilidades de producir plantas, que sinteticen un almidón, que corresponda en cuanto a sus propiedades ya a los requisitos de la industria
elaboradora.

Vías habituales para la producción de tales plantas consisten en procedimientos clásicos de cultivación y en la producción de mutantes. Así, por ejemplo en el caso del maíz se produjo un mutante que sintetiza un almidón con propiedades modificadas de viscosidad (documento de patente de los EE.UU. US 5.331.108), así como que establece por cultivación una especie de maíz (waxy maize = maíz ceroso), cuyo almidón consiste casi en un 100% en amilopectina (Akasuka y Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Además, en el caso del maíz y de los guisantes se han descrito unos mutantes que sintetizan almidones con un alto contenido de amilosa (70% en el maíz o bien hasta 50% en guisantes). Estos mutantes no han sido caracterizados hasta ahora en el plano molecular y no permiten por consiguiente tampoco la producción de correspondientes mutantes en otras plantas que almacenan almidón.

Alternativamente, se pueden producir plantas que sintetizan un almidón con propiedades modificadas, con ayuda de procedimientos de tecnología genética. Se describió por ejemplo en múltiples casos la modificación por tecnología genética de plantas de patata o de plantas de maíz, con la meta de modificar el almidón sintetizado en las plantas (véanse p.ej. los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 92/11376; WO 92/14827; WO 92/11375; WO 94/09144; WO 95/07355; WO 95/26407). Una premisa para la aplicación de procedimientos de tecnología genética es, sin embargo, la disponibilidad de secuencias de ADN, cuyos productos génicos tengan una cierta influencia sobre la síntesis del almidón, la modificación del almidón o la descomposición del almidón.

El presente invento se basa por lo tanto en la misión de poner a disposición moléculas de ácidos nucleicos y procedimientos, que hagan posible modificar plantas en el sentido de que éstas sinteticen un almidón, que se diferencie en lo que se refiere a sus propiedades físicas y/o químicas con respecto de un almidón sintetizado de una manera natural en las plantas, en particular de que tengan un almidón con alto contenido de amilosa y que sea por consiguiente mejor apropiado para finalidades generales y/o especiales de utilización.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones de esta patente.

El presente invento se refiere, por consiguiente, a moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada en Seq ID No. 2. Tales proteínas se presentan en los plástidos de células de plantas, tanto unidas a granos de almidón, como también fuera de los granos de almidón en una forma libre, es decir soluble. La actividad enzimática de tales proteínas conduce, al realizarse una expresión en el seno de E.coli, a una fosforilación aumentada del glicógeno sintetizado en las células. El peso molecular de estas proteínas se encuentra situado en el intervalo de 140-160 kd (kiloDalton), cuando se determina con ayuda de una electroforesis en SDS-gel [SDS = dodecilsulfato de sodio].

Además, el presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden una secuencia con la sucesión de nucleótidos que se indica en Seq No. 1, en particular la región codificadora indicada en Seq. No. 1.

Son objeto del invento asimismo moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína que se presenta unida en parte a granos de almidón en los plástidos de células de plantas, y que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, antes mencionadas. El concepto de "hibridación" significa en este contexto una hibridación en condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente en condiciones rigurosas, tal como se han descrito por ejemplo en la cita de Sambrook y colaboradores (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, pueden proceder en principio de cualquier organismo arbitrario (es decir, procariotas o eucariotas, en particular de bacterias, hongos, algas, plantas u organismos animales), que posee una de tales moléculas de ácidos nucleicos. Ellas proceden preferiblemente de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, en particular de plantas útiles, y de modo especialmente preferido de plantas que almacenan almidón.

Las moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas conformes al invento, se pueden aislar p.ej. a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc (cromosomal) de diferentes organismos. La identificación y el aislamiento de tales moléculas de ácidos nucleicos, a partir de plantas o de otros organismos, se puede efectuar en este caso mediando utilización de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento o de partes de estas moléculas o de los complementos inversos de estas moléculas, p.ej. mediante hibridación de acuerdo con procedimientos clásicos (véase p.ej. también la cita de Sambrook y colaboradores (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como sonda de hibridación se pueden utilizar p.ej. moléculas de ácidos nucleicos que tienen exactamente, o en lo esencial, la secuencia indicada en Seq ID No. 1, o partes de esta secuencia. En el caso de los fragmentos de ADN utilizados como sonda de hibridación, puede tratarse también de fragmentos de ADN sintéticos, que se habían producido con ayuda de las técnicas corrientes de síntesis de ADN, y cuya secuencia coincide en lo esencial con las de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento. Si se han identificado y aislado unos genes, que se hibridan con las secuencias conformes al invento, se necesitan una determinación de la secuencia y un análisis de las propiedades de las proteínas codificadas por esta secuencia.

Son objeto del invento asimismo fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos que antes se han descrito, que codifican la proteína antes descrita. Por el concepto de fragmentos se entienden en tal contexto partes de las moléculas de ácidos nucleicos, que son lo suficientemente largas como para codificar la proteína descrita. La expresión "derivado" significa en este contexto que las secuencias de estas moléculas se diferencian de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas en una o varias posiciones, y presentan un alto grado de homología con las secuencias de estas moléculas. Una "homología" significa en este contexto una identidad entre secuencias de como mínimo 40%, en particular una identidad de como mínimo 60%, situada de modo preferido por encima de 80% y de modo especialmente preferido por encima de 90%. Las desviaciones con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas pueden haberse formado por deleción (supresión), sustitución, inserción (introducción) o recombinación.

El concepto de "homología" significa además que existe una equivalencia funcional y/o estructural entre las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos o las proteínas codificadas por ellas. En los casos de las moléculas de ácidos nucleicos, que son homólogas con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas y constituyen derivados de estas moléculas, se trata por regla general de variaciones de estas moléculas de ácidos nucleicos, que constituyen unas modificaciones que ejercen la misma función biológica. En tal caso se puede tratar de variaciones que aparecen de un modo natural, por ejemplo de secuencias procedentes de otros organismos, o de mutaciones, pudiendo haber aparecido estas mutaciones de un modo natural o habiendo sido introducidas mediante una mutagénesis planificada. Además, en el caso de las variaciones puede tratarse de secuencias producidas de una manera sintética.

En los casos de las variantes alélicas puede tratarse tanto de variantes que aparecen de un modo natural como también de variantes producidas sintéticamente o generadas por técnicas de ADN recombinantes.

Las proteínas codificadas por las diferentes variantes de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, tienen determinadas características en común. A éstas pertenecen p.ej. la actividad enzimática, el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas tales como p.ej. el comportamiento de desplazamiento en las electroforesis en gel, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, la estabilidad, el valor óptimo del pH, el valor óptimo de la temperatura, etc.

Las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento pueden proceder en principio de cualquier organismo, que exprese las proteínas descritas, preferiblemente de plantas, en particular de plantas que sintetizan almidones o bien que almacenan almidones. Se prefieren especialmente en tal contexto p.ej. especies de cereales (tales como cebada, centeno, avena, trigo, etc.), maíz, arroz, guisantes, mandioca, patatas, etc. Además se pueden preparar mediante técnicas de síntesis que son habituales para un experto en la especialidad.

En los casos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento puede tratarse de moléculas tanto de ADN, por ejemplo de un ADNc o de un ADN genómico como también de moléculas de ARN.

Además, el invento se refiere a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores corrientes en la tecnología genética, que contienen las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que antes se han descrito.

En una forma preferida de realización, las moléculas de ácidos nucleicos contenidas en los vectores están unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células procarióticas o eucarióticas.

En otra forma adicional de realización, el invento se refiere a células anfitrionas, en particular a células procarióticas o eucarióticas que han sido transformadas y/o manipuladas genéticamente con una molécula de ácido nucleico conforme al invento o un vector, como antes se han descrito, así como a células que proceden de tales células y que contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento o un vector. En tal caso se trata preferiblemente de células de bacterias o células de plantas.

Se encontró por fin que la proteína codificada mediante las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento tienen una cierta influencia sobre la síntesis y respectivamente la modificación de almidones, y que una modificación de la cantidad de la proteína en células de plantas conduce a modificaciones en el metabolismo del almidón de las plantas, en particular a la síntesis de almidones con propiedades físicas y químicas modificadas.

Mediante la puesta a disposición de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento es por consiguiente posible, con ayuda de procedimientos de tecnología genética, producir plantas que sinteticen un almidón modificado, que se diferencie en cuanto a su estructura y sus propiedades físicas y químicas con respecto de un almidón sintetizado en plantas de tipo salvaje. Para esto, las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se unen con elementos reguladores, que garantizan la transcripción y la traducción en células de plantas, y que se incorporan en células de plantas.

El presente invento se refiere por consiguiente también a células de plantas transgénicas, que contienen una molécula de ácido nucleico conforme al invento, estando unida ésta con elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas. Los elementos reguladores son preferiblemente heterólogos en relación con la molécula de ácido nucleico.

Las células de plantas transgénicas se pueden regenerar, de acuerdo con técnicas conocidas por un experto en la especialidad, para dar plantas enteras. Las plantas obtenibles por regeneración de las células de plantas transgénicas conformes al invento son asimismo objeto del presente invento. Además, son objeto del invento las plantas que contienen las células de plantas transgénicas antes descritas. En el caso de las plantas transgénicas se puede tratar en principio de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, es decir de plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas. Preferiblemente, se trata en tal caso de plantas útiles, en particular plantas útiles que almacenan almidón, tal como p.ej. especies de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisantes, mandioca y patatas.

Las células de plantas transgénicas y las correspondientes plantas conformes al invento sintetizan, como consecuencia de la expresión o respectivamente expresión adicional de una molécula de ácido nucleico conforme al invento, un almidón que está modificado en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje, es decir plantas no transformadas, en particular en lo que se refiere a la viscosidad de soluciones acuosas de este almidón y/o al contenido de fosfatos. Éste se ha aumentado por regla general en el caso de un almidón procedente de células de plantas transgénicas o bien las correspondientes plantas, con lo que se modifican las propiedades físicas del almidón.

El presente invento describe también el almidón obtenible a partir de las células de plantas transgénicas y las correspondientes plantas conformes al invento.

Es objeto del invento asimismo un procedimiento para la producción de una proteína, que en células de plantas tanto se une a granos de almidón como también se presenta en una forma soluble, en la que las células anfitrionas conformes al invento se cultivan en unas condiciones, que permiten la expresión de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células y/o del medio de cultivo.

Además, el invento se refiere a las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, así como a las proteínas, que son obtenibles mediante el procedimiento antes descrito. Se trata en este caso preferiblemente de proteínas vegetales codificadas en el núcleo, que están localizadas en los plástidos. En los plástidos, estas enzimas se presentan tanto unidas a los granos de almidón como también en estado libre. Las correspondientes proteínas procedentes de Solanum tuberosum tienen en una electroforesis en SDS-gel un peso molecular de 140-160 kd, y al realizar la expresión en el seno de E.coli conducen a una fosforilación aumentada del glicógeno sintetizado en las células.

Son objeto del invento asimismo anticuerpos, que reconocen específicamente a una proteína conforme al invento. Puede tratarse en este caso tanto de anticuerpos monoclonales como también de anticuerpos policlonales.

Se encontró, además, que es posible influir sobre las propiedades del almidón sintetizado en células de plantas de tal manera que se disminuya la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, en las células. Esta disminución puede efectuarse por ejemplo mediante una expresión antisentido de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, por expresión de apropiadas ribozimas o mediante una cosupresión.

Son objeto del presente invento, por consiguiente, también moléculas de ADN, que codifican un ARN antisentido, que es complementario con relación a transcritos de una molécula de ADN conforme al invento. El concepto de "complementario" significa, en este caso, que el ARN codificado no debe ser complementario en un 100%, sino que también es suficiente un menor grado de complementariedad, siempre y cuando que éste sea lo suficientemente alto como para inhibir la expresión de una proteína conforme al invento, al realizar una expresión en células de plantas. El ARN transcrito es complementario preferiblemente por lo menos en un 90% y de modo especialmente preferido en un 95% con respecto a un transcrito de una molécula de ácido nucleico conforme al invento. Con el fin de producir un efecto antisentido, al realizar una transcripción en células de plantas, tales moléculas de ADN tienen una longitud de por lo menos 15 pb (pares de bases), preferiblemente mayor que 100 pb y de manera especialmente preferida mayor que 500 pb, pero por regla general son más cortas que 5.000 pb, preferiblemente más cortas que 2.500 pb.

Además, la solicitud se refiere también a moléculas de ADN, que al realizar una expresión en células de plantas conducen a la síntesis de un ARN, que en las células de plantas, a causa de un efecto de cosupresión (inhibición conjunta), provoca una disminución de la expresión de moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, que codifican la proteína descrita. El principio de la cosupresión, así como la producción de correspondientes secuencias de ADN, se describen detalladamente por ejemplo en el documento WO 90/12084. Tales moléculas de ADN codifican un ARN, que tiene un alto grado de homología con transcritos de las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento. En tal caso, no obstante, no es indispensablemente necesario que el ARN codificado sea traducible en una proteína.

En otra forma de realización adicional, el presente invento se refiere a moléculas de ADN, que codifican una molécula de ARN con una actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN conforme al invento.

Las ribozimas son moléculas de ARN activas catalíticamente, que están en situación de disociar moléculas de ARN y secuencias dianas específicas. Con ayuda de métodos de tecnología genética es posible modificar la especificidad de ribozimas. Existen diferentes clases de ribozimas. Para la utilización en la práctica, con la meta de disociar deliberadamente el transcrito de un gen determinado, se utilizan preferiblemente representantes de dos diferentes grupos de ribozimas. Uno de los grupos es formado por ribozimas, que han de asignarse al tipo de las ribozimas con intrones del grupo I. El segundo grupo es formado por ribozimas, que como particularidad estructural característica tienen un denominado motivo de "hammerhead" [= cabeza de martillo]. El reconocimiento específico de la molécula de ARN diana se puede modificar por alteración de las secuencias, que flanquean a este motivo. Estas secuencias determinan, a través de un apareamiento de bases con secuencias en la molécula diana, el sitio junto al que se efectúa la reacción catalítica y por consiguiente el desdoblamiento de la molécula diana. Puesto que los requisitos de las secuencias para un desdoblamiento eficiente son extremadamente pequeños, en principio es posible desarrollar ribozimas específicas prácticamente para cualquier molécula arbitraria de ARN.

Con el fin de producir moléculas de ADN, que codifican una ribozima, que disocia específicamente transcritos de una molécula de ADN conforme al invento, por ejemplo una secuencia de ADN, que codifica un dominio catalítico de una ribozima, es unida por ambos lados con secuencias de ADN, que son homólogas con respecto a secuencias de la enzima diana. Como secuencias, que codifican los dominios catalíticos, entran en cuestión por ejemplo los dominios catalíticos del ADN satélite del virus SCMo (Davies y colaboradores, Virology 177 (1990), 216-224) o la de los ADN satélites del virus TobR (Steinecke y colaboradores, EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff y Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Las secuencias de ADN que flanquean a los dominios catalíticos proceden preferentemente de las moléculas de ADN conformes al invento, arriba descritas.

En una forma de realización adicional, el presente invento se refiere a vectores que contienen las moléculas de ADN arriba descritas, en particular aquellas en las que las moléculas de ADN descritas están unidas con elementos reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas.

Además, el presente invento se refiere a células anfitrionas, que contienen las moléculas de ADN o los vectores, que se han descrito. La célula anfitriona puede ser una célula procariótica, por ejemplo de bacteria, o eucariótica. En el caso de las células anfitrionas eucarióticas se trata preferiblemente de células de plantas.

Además, el invento se refiere a células de plantas transgénicas, que contienen una molécula de ADN arriba descrita, que codifica un ARN antisentido, una ribozima o un ARN, que conduce a un efecto de cosupresión, estando unida esta molécula de ADN con elementos de ADN, que garantizan la transcripción en células de plantas. Estas células de plantas transgénicas se pueden regenerar de acuerdo con técnicas corrientes para dar plantas enteras. El invento se refiere por consiguiente también a plantas, que son obtenibles por regeneración a partir de las células de plantas transgénicas que se han descrito, así como a plantas, que contienen las células de plantas transgénicas que se han descrito. En el caso de las plantas transgénicas se puede tratar de nuevo de plantas de cualquier especie arbitraria de plantas, preferiblemente de plantas útiles, en particular de las que almacenan almidón, tal como antes se ha indicado.

Mediante la expresión de las moléculas de ADN que se han descrito, que codifican un ARN antisentido, una ribozima o un "ARN de cosupresión", en las células de plantas transgénicas se llega a una disminución de la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, que se presentan en una forma endógena en las células. Esta disminución tiene sorprendentemente como consecuencia una modificación drástica de las propiedades físicas y químicas del almidón sintetizado en las células de plantas, en particular de las propiedades de viscosidad de soluciones acuosas de este almidón, del contenido de fosfatos, así como también de la liberación de azúcares reductores al almacenar las células de plantas o las partes de plantas a bajas temperaturas. Las propiedades del almidón sintetizado en las células de plantas transgénicas se describen detalladamente más adelante.

El presente invento describe por consiguiente también el almidón obtenible a partir de las células de plantas transgénicas y las correspondientes plantas, que se han descrito.

Además, el invento se refiere a las moléculas de ARN antisentido codificadas por las moléculas de ADN descritas, así como a las moléculas de ARN con actividad de ribozimas y a las moléculas de ARN, que provocan un efecto de cosupresión, que son obtenibles mediante transcripción.

Un objeto adicional del presente invento es un procedimiento para la producción de células de plantas transgénicas, que, en comparación con células no transformadas, sintetizan un almidón modificado, en cuyo caso en las células de plantas se disminuye la cantidad de proteínas, que son codificadas por moléculas de ADN conformes al invento, las cuales se presentan en forma endógena en las células.

En una forma preferida de realización, esta disminución se efectúa con ayuda de un efecto antisentido. Para esto, moléculas de ADN conformes al invento, o partes de las mismas, se unen en una orientación antisentido con un promotor, que garantiza la transcripción en células de plantas, así como eventualmente con una señal de terminación, que garantiza la terminación de la transcripción así como la poliadenilación del transcrito. Con el fin de garantizar un eficiente efecto antisentido en las células de plantas, el ARN antisentido sintetizado debería tener una longitud mínima de 15 nucleótidos, de modo preferido de por lo menos 100 nucleótidos y de modo especialmente preferido de por encima de 500 nucleótidos. Además, la secuencia de ADN, que codifica el ARN antisentido, debería ser homóloga en relación con la especie de planta que se ha de transformar. Sin embargo, se pueden utilizar también secuencias de ADN que presentan un alto grado de homología con secuencias de ADN presentes en forma endógena en las células, de modo preferido presentan una homología de más que 90%, de modo especialmente preferido de más
que 95%.

En otra forma preferida de realización, la disminución de la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, se efectúa mediante un efecto de ribozimas. El modo de adición en principio de ribozimas, así como la construcción de moléculas de ADN, que codifican tales moléculas de ARN, ya se describieron más arriba. Con el fin de expresar en células transgénicas un ARN con actividad de ribozima, las moléculas de ADN arriba descritas, que codifican una ribozima, se unen con elementos de ADN, que garantizan la transcripción en células de plantas, en particular con un promotor y una señal de terminación. Las ribozimas sintetizadas en las células de plantas conducen a la disociación de transcritos de moléculas de ADN conformes al invento, que se presentan en forma endógena en las células.

Una posibilidad adicional de la disminución de la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento, es la cosupresión. Son objeto del invento en este caso también las células de plantas obtenibles mediante el procedimiento conforme al invento, las cuales están caracterizadas por el hecho de que en ellas se ha disminuido la cantidad de proteínas, que son codificadas por las moléculas de ADN conformes al invento, y que, en comparación con células de tipo salvaje, sintetizan un almidón modificado.

Además, el invento se refiere a plantas, que son obtenibles por regeneración de las células de plantas descritas, así como a plantas que contienen las células conformes al invento, que se han descrito.

El almidón obtenible a partir de las células de plantas y de las plantas descritas es descrito también en el presente invento. Éste tiene propiedades físicas y químicas alteradas, en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje. Por ejemplo, este almidón, en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje, posee un contenido reducido de fosfatos. Además, las soluciones acuosas de este almidón muestran propiedades alteradas de viscosidad.

En una forma preferida de realización, el contenido de fosfatos del almidón descrito se ha disminuido en por lo menos 50%, de modo preferido en por lo menos 75% y de modo especialmente preferido en más de 80%, en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje.

La ventaja especial del almidón descrito está situada en las propiedades alteradas de viscosidad de soluciones acuosas de este almidón.

Un ensayo corriente, que se utiliza, con el fin de determinar las propiedades de viscosidad, es el denominado ensayo de Brabender. Este ensayo se lleva a cabo mediando la utilización de un aparato, que es conocido por ejemplo como Viscografo E. Este instrumento se fabrica y vende, entre otras, por la entidad Brabender OHG Duisburg (Alemania).

El ensayo consiste en lo esencial en que un almidón se calienta primeramente en presencia de agua con el fin de determinar cuándo se inician la hidratación y el hinchamiento de los granos de almidón. Este proceso, que es designado también como gelatinización o bien engrudamiento, se basa en la disolución de enlaces de puentes de hidrógeno y va acompañada con un aumento medible de la viscosidad de la suspensión de almidón. Mientras que un calentamiento adicional después de la gelatinización conduce a la total disolución de las partículas de almidón y a una disminución de la viscosidad, al realizar un enfriamiento inmediatamente después de la gelatinización se llega típicamente a un aumento de la viscosidad (véase la Figura 3). El resultado de un ensayo de Brabender es una curva, que indica la viscosidad en función del tiempo, efectuándose primeramente un aumento de la temperatura hasta por encima de la temperatura de gelatinización y a continuación un enfriamiento.

El análisis de una curva de Brabender tiene como meta, por regla general, la determinación de la temperatura de engrudamiento, de la viscosidad máxima al calentar, del aumento de viscosidad al enfriar así como de la viscosidad después del enfriamiento. Estos parámetros son características importantes, que determinan la calidad de un almidón así como su posibilidad de utilización para diferentes aplicaciones.

El almidón, que se puede aislar, por ejemplo, a partir de plantas de patata, en las que mediante un efecto antisentido se había reducido la cantidad de proteínas conformes al invento en las células, muestra unas características, que se desvían en gran manera de las que muestra el almidón, que es aislable a partir de plantas de tipo salvaje. En comparación con éstas, él muestra solamente un pequeño aumento de viscosidad al calentar, una menor viscosidad máxima, así como un mayor aumento de la viscosidad al enfriar (véanse las Figuras 3, 4 y 5).

El invento describe por consiguiente un almidón, cuyas soluciones acuosas poseen las propiedades de viscosidad características que se representan en la Figura 4 ó 5. El almidón modificado tiene, en particular en las condiciones mencionadas en el Ejemplo 8 a para la determinación de la viscosidad con ayuda de un viscosímetro de Brabender, la característica de que durante la ebullición se efectúa, en comparación con un almidón de tipo salvaje, solamente un pequeño aumento de la viscosidad. Esto ofrece la posibilidad de utilizar el almidón conforme al invento para la preparación de engrudos de mayor concentración.

Además, el almidón modificado tiene la propiedad de que, después de haberse alcanzado la viscosidad máxima, sólo se llega a una pequeña disminución de la viscosidad. Por el contrario, al realizar un enfriamiento se llega a un fuerte aumento de la viscosidad, por lo que la viscosidad es más alta que la de un almidón procedente de plantas de tipo salvaje.

Por lo demás es posible, mediante disminución de la cantidad de proteínas conformes al invento en células de plantas transgénicas, producir un almidón que, al almacenar partes de plantas, que contienen este almidón, conduzca, a unas bajas temperaturas, en particular a 4-8ºC a una liberación disminuida de azúcares reductores, en comparación con un almidón procedente de células no transformadas. Esta propiedad es por ejemplo especialmente ventajosa para poner disposición patatas que, al almacenarse a bajas temperaturas, presentan una liberación disminuida de azúcares reductores, es decir una "dulcificación en frío" disminuida. Tales patatas son especialmente bien apropiadas para la producción de patatas fritas francesas, patatas fritas a la inglesa o similares, puesto que en el caso de su utilización no se presentan indeseadas reacciones de caramelización (reacciones de Maillard) o por lo menos se disminuyen en gran manera.

En una forma de realización especialmente preferida del presente invento, se reduce en las células de plantas transformadas no solamente la síntesis de una proteína conforme al invento, sino además de ello también la síntesis de por lo menos otra enzima adicional que participa en la síntesis y/o la modificación del almidón. Se prefieren en tal caso sintasas de almidones unidas a granos de almidón o a enzimas de ramificación. Se encontró, de manera sorprendente, que las plantas de patata, en las que la síntesis de la proteína conforme al invento, así como también de la enzima de ramificación, se ha reducido como consecuencia de un efecto antisentido, sintetizan un almidón que se desvía grandemente en sus propiedades con respecto de un almidón procedente de plantas de tipo salvaje.

En comparación con un almidón de tipo salvaje, la soluciones acuosas de este almidón modificado no muestran prácticamente ningún aumento de la viscosidad al calentar o al enfriar (compárese la Figura 6).

Por lo demás, un análisis en microscopio de los granos de almidón antes y después del calentamiento muestra claramente que, al contrario que un almidón de tipo salvaje, los granos de almidón procedentes de plantas modificadas de tal manera no están disgregados, sino que conservan aproximadamente su estructura original. Se trata por consiguiente de un almidón resistente frente al proceso de cocción. Si se determina el contenido de amilosa de este almidón mediante la metodología descrita en la parte de los Ejemplos, se establecen para este almidón unos contenidos de amilosa por encima de 50%, de manera preferida por encima de 60% y de manera especialmente preferida por encima de 70%. Las soluciones acuosas de los almidones aislables a partir de estas plantas muestran preferiblemente las propiedades características de viscosidad que se representan en la Figura 6.

Un almidón con alto contenido de amilosa, de este tipo, tiene con respecto a un almidón de tipo salvaje una serie de ventajas para diferentes utilizaciones. Así, los almidones con un alto contenido de amilosa poseen un alto potencial para usarse en láminas y películas. Las láminas y películas producidas sobre la base de almidones con alto contenido de amilosa, que se pueden emplear en los más amplios sectores de la industria del envasado, poseen la manifiesta ventaja de que son biodegradables. Junto a esta utilización, que es cubierta en lo esencial por polímeros que se basan de un modo clásico en la química del petróleo, la amilosa posee todavía otros campos singulares de utilización, que están condicionados por la propiedad de la amilosa, de formar una hélice. La hélice formada por la amilosa es hidrófoba en el interior e hidrófila en el exterior. A causa de esto, una amilosa se puede emplear para la formación de complejos y la encapsulación molecular de sustancias de bajo peso molecular o incluso de peso molecular más alto. Ejemplos de esto son:

-: la encapsulación molecular de vitaminas y sustancias activas con la meta de proteger con respecto a la oxidación, la volatilización, la descomposición térmica o también la transformación en un medio acuoso;

-: la encapsulación molecular de sustancias aromatizantes con el fin de aumentar la solubilidad;

-: la encapsulación molecular de agentes fertilizantes y plaguicidas para la estabilización y la liberación controlada;

-: la encapsulación molecular de medicamentos para la estabilización de la dosificabilidad y la liberación controlada de formulaciones con acción retardada.

Otra importante propiedad de una amilosa es el hecho de que se trata de una molécula quiral. A causa de la quiralidad, ésta se puede emplear de manera preferente después de inmovilización, por ejemplo, en una columna destinada a la separación de enantiómeros.

Por lo demás, se encontró sorprendentemente que un almidón, que se puede aislar a partir de plantas de patata, en las que mediante un efecto antisentido se ha reducido la cantidad de proteínas conformes al invento en las células, en combinación con una reducción de las proteínas, que presentan la actividad enzimática de una sintasa de almidón de la isoforma I (GBSSI) unida a granos de almidón, muestra unas características que se desvían en gran manera de las que muestra un almidón, que es aislable a partir de plantas de tipo salvaje. En comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje, tales soluciones acosas de este almidón muestran solamente un pequeño aumento de la viscosidad al calentar, una menor viscosidad máxima así como prácticamente ningún aumento de la viscosidad al enfriar (compárese la Figura 7). Cuando se determina la relación de amilosa a amilopectina de este almidón, dicho almidón se caracteriza por el hecho de que ya no es detectable casi nada de amilosa. El contenido de amilosa de este almidón está situado de modo preferido por debajo de 5%, de modo especialmente preferido por debajo de 2%. El almidón conforme al invento se diferencia además del almidón conocido, que se puede producir por inhibición del gen de GBSSI a solas mediante procedimientos de tecnología genética en plantas de patatas transgénicas. Así, este almidón presenta un fuerte aumento de la viscosidad al calentar. Las soluciones acuosas del almidón conforme al invento muestran preferiblemente las propiedades de viscosidad características, que se representan en la Figura 7. En particular, en las condiciones mencionadas en el Ejemplo 13 para la determinación de la viscosidad con ayuda de un analizador Rapid Visco, el almidón modificado presenta la característica de que, durante la ebullición, en comparación con un almidón de tipo salvaje, pero también en comparación con un almidón ceroso, se efectúa solamente un pequeño aumento de la viscosidad. Esto ofrece la posibilidad de utilizar el almidón conforme al invento para la preparación de engrudos de más alta concentración. Además, el almidón modificado presenta la propiedad de que, después de haberse alcanzado la máxima viscosidad, sólo se llega a una menor disminución de la viscosidad así como prácticamente a ningún aumento de la viscosidad al enfriar.

Las posibilidades para la disminución de la actividad de una enzima de ramificación en células de plantas ya se describieron, por ejemplo, en los documentos WO 92/14827 y WO 95/26407. La disminución de la actividad de una sintasa de almidón de la isoforma I (GBSSI), unida a granos de almidón, se puede efectuar mediando la utilización de métodos conocidos por un experto en la especialidad, por ejemplo mediante un efecto antisentido. Las secuencias de ADN, que codifican un GBSSI procedente de patatas, son conocidas por ejemplo de las citas de Hergersberg (tesis doctoral (1988) Universidad de Colonia, Visser y colaboradores (Plant. Sci. 64 (1989) 185-192, o de van der Leiy y colaboradores (Mol. Gen. Genet. 228 (1991), 240-248).

El procedimiento descrito se puede aplicar en principio a todas las especies de plantas. Son interesantes plantas tanto monocotiledóneas como también dicotiledóneas, en particular plantas útiles y entre estas preferiblemente plantas que almacenan almidón, tales como p.ej. plantas de cereales (centeno, cebada, avena, trigo, etc.), arroz, maíz, guisantes, mandioca y patatas.

Por el concepto de "elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas" se entienden en el marco del presente invento segmentos de ADN que hacen posible la iniciación o respectivamente la terminación de la transcripción en células de plantas. Entre los segmentos de ADN, que garantizan la iniciación de la transcripción, se cuentan en particular promotores.

Para la expresión en plantas de las diferentes moléculas de ADN conformes al invento, arriba descritas, entra en consideración en principio cualquier promotor que sea funcional en células de plantas. El promotor puede ser homólogo o heterólogo con relación a la especie utilizada de plantas. Es apropiado, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (Cauliflower-Mosaik) (Odell y colaboradores, Nature 313 (1985), 810-812), que garantiza una expresión constitutiva en todos los tejidos de una planta y la construcción artificial de promotor que se describe en el documento WO/9401571. Sin embargo, se pueden utilizar también promotores, que conducen, solamente en un momento determinado por influencias externas (véase por ejemplo el documento WO/9307279) o en un tejido determinado de la planta, a una expresión de subsiguientes secuencias (véase p.ej. la cita de Stockhaus y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Preferentemente, se emplean unos promotores que son activos en los órganos almacenadores de almidón de las plantas que se han de transformar. Estos son, en el caso del maíz, los granos de maíz, mientras que, en el caso de la patata, son los tubérculos. Para la transformación de las patatas se puede utilizar en particular, pero no exclusivamente, el promotor B33 específico para tubérculos (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Junto a promotores, los segmentos de ADN pueden contener, para la iniciación de la transcripción, también secuencias de ADN, que garantizan un aumento adicional de la transcripción, por ejemplo los denominados elementos intensificadores (en inglés, enhancer).

Además, el concepto de "elementos de ADN reguladores" puede abarcar también señales de terminación, que sirven para la terminación correcta de la transcripción así como para la adición de una cola poli-A al transcrito, a la que se atribuye una función en la estabilización de los transcritos. Tales elementos están descritos en la bibliografía y son intercambiables arbitrariamente. Ejemplos de tales secuencias de terminación son las regiones no traducidas en 3', que abarcan la señal de poliadenilación del gen de nopalina-sintasa (gen de NOS) o el gen de octopina-sintasa (Gielen y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) procedentes de agrobacterias, o las regiones no traducidas en 3' de los genes de las proteínas almacenadoras procedentes de soja, así como la de los genes de la pequeña subunidad de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa (ssRUBISCO).

La introducción de moléculas de ADN conformes al invento en células de plantas se efectúa preferiblemente mediando utilización de plásmidos. Preferiblemente, se utilizan para esto unos plásmidos, que garantizan una integración estable del ADN introducido en el genoma de la planta.

En los ejemplos del presente invento se utiliza el vector binario pBinAr (Höfgen y Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230). En el caso de este vector se trata de un derivado del vector binario pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721), que es obtenible comercialmente (de Clontech Laboratories, Inc., EE.UU.).

Sin embargo, también es apropiado cualquier otro vector para transformación de plantas, en el que se pueda insertar una casilla (cassette) de expresión, y que garantice la integración de la casilla de expresión en el genoma vegetal.

Con el fin de preparar la introducción de genes ajenos en plantas superiores, está a disposición un gran número de vectores de clonación, que contienen una señal de replicación para E.coli y un gen marcador para la selección de células bacterianas transformadas. Ejemplos de tales vectores son pBR322, series de pUC, series de M13mp, pACY184, etc. La secuencia deseada se puede introducir en cualquier sitio adecuado de corte por restricción en el vector. El plásmido obtenido se utiliza para la transformación de células de E.coli. Las células transformadas de E.coli son cultivadas en un medio apropiado, a continuación cosechadas y lisadas. El plásmido es recuperado de acuerdo con métodos clásicos. Como método de análisis para la caracterización del ADN de plásmido obtenido, se emplean por lo general análisis por restricción y análisis de secuencias. Después de cualquier manipulación el ADN de plásmido puede ser disociado y los resultantes fragmentos de ADN se pueden unir con otras secuencias de ADN.

Para la introducción de un ADN en una célula anfitriona vegetal están a disposición un gran número de técnicas. Estas técnicas comprenden la transformación de células de plantas con un ADN T mediando utilización de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como material para transformación, la fusión de protoplastos, la inyección, la electroporación de un ADN, la incorporación de un ADN mediante el método biolístico, así como otras posibilidades.

Al realizar la inyección y la electroporación de un ADN en células de plantas no se plantea en sí ningún requisito especial a los plásmidos utilizados. Se pueden utilizar plásmidos sencillos, tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, si a partir de células transformadas de esta manera se deben regenerar plantas enteras, es necesaria la presencia de un gen marcador seleccionable.

Dependiendo del método de introducción de genes deseados en las células de plantas pueden ser necesarias otras secuencias de ADN adicionales. Si p.ej. para la transformación de las células de plantas se utiliza el plásmido Ti o Ri, entonces por lo menos el límite derecho, pero con frecuencia los límites derecho e izquierdo de los plásmidos Ti y Ri de ADN T se debe unir como zona de flanco con los genes que se han de introducir.

Si para la transformación se utilizan agrobacterias, el ADN que se ha de introducir se debe clonar en plásmidos especiales, y concretamente o bien en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar por causa de secuencias que son homólogas con respecto a secuencias en el ADN T, mediante recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias. Éste contiene además la región vir necesaria para la transferencia del ADN T. Vectores intermedios no se pueden replicar en agrobacterias. Mediante un plásmido cooperante, el vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens (conjugación). Vectores binarios se pueden replicar tanto en E.coli como también en agrobacterias. Ellos contienen un gen marcador de selección y un engarzador (linker) o poliengarzador (polylinker), que son enmarcados por la región límite de ADN T derecho y la izquierda. Ellos pueden ser transformados directamente dentro de las agrobacterias (Holsters y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 163 (1987), 181-187). Los plásmidos utilizados para la transformación de las agrobacterias contienen además un gen marcador de selección, por ejemplo el gen NPT II, que permite la selección de bacterias transformadas. La Agrobacterium que, sirve como célula anfitriona, debe contener un plásmido que sea portador de una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T en la célula de plantas. Puede estar presente un ADN T adicional. La Agrobacterium transformada de tal manera se utiliza para la transformación de células de plantas.

La utilización de un ADN T para la transformación de células de plantas ha sido intensamente investigada y suficientemente descrita en el documento EP 120516; y en las citas de: Hoekema, en: The Binary Plant Vector System [El sistema de vector binario de plantas] Ofssetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y colaboradores, Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 y An y colaboradores, EMBO J. 4 (1985), 277-287. Ciertos vectores binarios son obtenibles ya en parte a escala comercial, p.ej. el pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., EE.UU.).

Para la transferencia del ADN en la célula de plantas, se pueden cultivar conjuntamente explantes de plantas convenientemente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material infectado de plantas (p.ej. trozos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión) entonces, en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas, se pueden regenerar de nuevo plantas enteras. Las plantas obtenidas de esta manera se pueden investigar entonces para determinar la presencia del ADN introducido.

Si el ADN introducido ha sido integrado ya por primera vez en el genoma de las células de plantas, entonces éste es allí por regla general estable y permanece conservado también en la descendencia de las células transformadas originalmente. Éste contiene normalmente un marcador de selección, que confiere a las células de plantas transformadas una resistencia frente a un biocida o un antibiótico tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc.. El marcador seleccionado individual debería permitir por lo tanto la selección de células transformadas frente a células, a las que les falta el ADN introducido.

Las células transformadas crecen dentro de la planta del modo usual (véase también la cita de McCormick y colaboradores, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Las plantas resultantes se pueden cultivar de modo normal y cruzar con plantas que posean el mismo idiotipo transformado u otros idiotipos. Los individuos híbridos, resultantes a partir de esto, tienen las correspondientes propiedades fenotípicas.

Se deberían cultivar dos o más generaciones con el fin de asegurar que la característica fenotípica se conserve y herede de una manera estable. También, se deberían cosechar semillas con el fin de garantizar que permanezcan conservado/as el correspondiente fenotipo u otras propiedades características.

El almidón, obtenible a partir de las células de plantas conformes al invento y respectivamente las correspondientes plantas, es apropiado a causa de sus propiedades, junto a la utilización especial arriba reseñada, para diferentes utilizaciones industriales. Fundamentalmente, un almidón se puede subdividir en dos grandes categorías, los productos de hidrólisis del almidón y los denominados almidones naturales. Entre los productos de hidrólisis se cuentan en lo esencial la glucosa obtenida a través de procedimientos enzimáticos o químicos, así como eslabones componentes de glucosa, que se pueden emplear para otros procesos, tales como fermentación, o también otras modificaciones químicas. En este sector pueden ser importantes la sencillez y la realización barata de un procedimiento de hidrólisis, como transcurre actualmente en lo esencial por vía enzimática, mediando utilización de amilo-glucosidasa. Dentro de este contexto se puede concebir que un menor empleo de enzimas empleadas para la hidrólisis por modificación de la estructura del almidón, p.ej. una mayor superficie del grano, una digestibilidad más fácil por un menor grado de ramificación o una estructura estérea, que limita la accesibilidad para las enzimas empleadas, puede conducir a un ahorro de costos. Las utilizaciones de los denominados almidones naturales, que se emplean a causa de su estructura polimérica, se pueden subdividir en dos grandes sectores:

(a) Utilización en el sector alimentario

El almidón es un material aditivo clásico para muchos alimentos, en los que toma a su cargo esencialmente la función de la fijación de materiales aditivos acuosos, o bien provoca un aumento de la viscosidad o sino una aumentada formación de gel. Importantes características de propiedades son el comportamiento de fluidez y sorción, la temperatura de hinchamiento y engrudado, la viscosidad y el rendimiento de espesamiento, la solubilidad del almidón, la transparencia y la estructura del engrudo, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la capacidad para la formación de películas, la estabilidad frente a congelaciones y descongelaciones, la digestibilidad así como la capacidad para la formación de complejos, p.ej., con iones inorgánicos u orgánicos.

(b) Empleo en el sector no alimentario

El otro gran sector de empleo se encuentra situado en la utilización del almidón como sustancia auxiliar en diferentes procesos de preparación o como un material aditivo en productos técnicos. El esencial sector de empleo para la utilización de un almidón como sustancia auxiliar es, por una parte, la industria del papel y del cartón. El almidón es empleado en este caso en primer término para la retardación (retención de materiales sólidos), la fijación y el fraguado de partículas de materiales de carga y materiales finos, como material de consolidación y para la deshidratación. Además de esto, se aprovechan las favorables propiedades del almidón en lo que se refiere a la rigidez, la dureza, el sonido, el tacto, el brillo, la lisura, la resistencia a la disociación así como las superficies.

Dentro del proceso de producción de papel hay que diferenciar entre cuatro sectores de aplicación, a saber la superficie, el estucado, la masa y la rociada.

Los requisitos establecidos en cuanto al almidón en lo que se refiere al tratamiento de superficies, son en lo esencial un alto grado de blancura, una viscosidad apropiada, una alta estabilidad de la viscosidad, una buena formación de películas así como una pequeña formación de polvos finos. En el caso de la utilización en el estucado son importantes el contenido de materiales sólidos, una viscosidad apropiada, una alta capacidad de fijación así como una alta afinidad con los pigmentos. Como adición a la masa, presentan importancia una distribución rápida, uniforme y exenta de pérdidas, una alta estabilidad mecánica y una completa retención en el flujo de papel. En el caso de emplearse el almidón en el sector de la rociada son asimismo apropiados un contenido ajustado de materiales sólidos, una alta viscosidad así como una alta capacidad de fijación.

Un gran sector de empleo consiste por ejemplo en la industria de los pegamentos, en donde las posibilidades de empleo se clasifican en cuatro sectores parciales: La utilización como una pura cola de almidón, la utilización en colas de almidón tratadas con productos químicos especiales, la utilización de un almidón como adición a resinas sintéticas y a dispersiones de polímeros, así como la utilización de almidones como agentes extendedores para pegamentos sintéticos. El 90% de los pegamentos a base de almidón se emplea en los sectores de la producción de sacos, bolsas o cucuruchos de papel, la producción de materiales compuestos para papel y aluminio, la producción de cartonajes y una cola de humedecimiento renovado para sobres de cartas, sellos de correo, etc.

Otra posible utilización como agente auxiliar y como material aditivo consiste en la producción de géneros textiles y agentes para el cuidado de géneros textiles. Dentro de la industria textil hay que diferenciar entre los siguientes cuatro sectores de empleo: El empleo del almidón como agente de apresto y encolado, es decir como sustancia auxiliar para el alisamiento y la consolidación del comportamiento de trepa para la protección contra las fuerzas de tracción que actúan al tejer en telar, así como para aumentar la resistencia a la abrasión al tejer, como agente para el apresto de materiales textiles sobre todo después de tratamientos previos que empeoran la calidad, tales como los de blanqueo, tinción, etc., como agente espesante en la producción de pastas de tinción con el fin de evitar difusiones de colorantes, así como adición para agentes de urdidura para hilos de costura.

Además, el almidón se puede utilizar como aditivo en materiales de construcción. Un ejemplo es la producción de placas de cartón yeso, en las que el almidón mezclado en la papilla de yeso se engruda con el agua, se difunde junto a la superficie de la placa de yeso y allí fija el cartón a la placa. Otros sectores de empleo son la adición a fibras de limpieza y minerales. En el caso de un hormigón transportable, el almidón se puede emplear con el fin de retrasar el fraguado.

Además, el almidón se recomienda para la producción de agentes destinados a la estabilización de los suelos, que se emplean en el caso de movimientos artificiales de tierras para proteger provisionalmente las partículas del suelo frente al agua. Los productos combinados a base de un almidón y emulsiones de polímeros han de ser equiparados de acuerdo con los conocimientos actuales, en cuanto a su efecto de disminución de la erosión y el encostramiento, a los productos empleados hasta ahora, pero en cuanto al precio se encuentran manifiestamente por debajo de éstos. Además, el almidón se puede utilizar en agentes protectores de las plantas, con el fin de modificar las propiedades físicas de las formulaciones. Así, se emplean almidones por ejemplo con el fin de mejorar la mojadura de los agentes protectores de las plantas y fertilizantes, para la liberación dosificada de las sustancias activas, para la transformación de sustancias activas líquidas, volátiles y/o malolientes en sustancias moldeables, estables y microcristalinas, con el fin de mezclar
compuestos incompatibles, y para la prolongación de la duración de la acción por disminución de la descomposición.

Un importante sector de empleo consiste además en los sector de los fármacos, de la medicina y de la industria cosmética. En la industria farmacéutica, el almidón se puede emplear como agente aglutinante para tabletas o para la dilución de agentes aglutinantes en cápsulas. Además, el almidón es apropiado como agente disgregante de tabletas, puesto que después de la deglución absorbe líquido y después de breve tiempo se hincha, en tal grado que se libera la sustancia activa. Los polvos para espolvorear lubricantes y vulnerarios medicinales son otras posibilidades de utilización. En el sector de la industria cosmética, el almidón se puede emplear por ejemplo como soporte para sustancias aditivas a polvos para espolvorear, tales como perfumes y ácido salicílico. Un sector de utilización relativamente grande para el almidón se encuentra en las pastas dentífricas.

También se puede concebir la utilización del almidón como material aditivo a carbón y briquetas. El carbón se puede aglomerar o bien briquetear de modo muy valioso cuantitativamente con una adición de almidón, con lo que se impide una desintegración prematura de las briquetas. La adición de almidón se encuentra en el caso de carbón para parrillas entre 4 y 6%, en el caso de carbón con poder calorífico aumentado se encuentra entre 0,1 y 0,5%. Por lo demás, el almidón se adecua como agente aglutinante, puesto que mediante su adición al carbón y las briquetas se puede disminuir de manera manifiesta la expulsión de sustancias nocivas.

El almidón se puede emplear además en el tratamiento de lodos de minerales y carbón como agente de floculación.

Otro sector de empleo consiste en utilizarse como adición a sustancias auxiliares de fundición. En el caso de diferentes procedimientos de moldeo por colada, se necesitan machos que se producen a partir de arenas mezcladas con agentes aglutinantes. Como agente aglutinante se emplea hoy en día predominantemente una bentonita, que se ha mezclado con almidones modificados, en la mayor parte de los casos almidones hinchables.

La finalidad en la adición de un almidón es el aumento de la resistencia a la fluidez así como el mejoramiento de la resistencia de aglutinación. Además de ello los almidones hinchables pueden presentar otros requisitos técnicos de producción, tales como los de ser dispersables en agua fría, rehidratables, bien miscibles en arena y una alta capacidad de fijación de agua.

En la industria de los cauchos, el almidón se puede emplear para mejorar las calidades técnicas y ópticas. Son razones de ello en este caso el mejoramiento del brillo de las superficies, así como el mejoramiento del tacto y del aspecto. Para esto, un almidón, antes de la vulcanización en frío se esparce sobre las superficies engomadas y pegajosas de materiales de caucho. Asimismo se puede emplear para el mejoramiento de la aptitud del caucho para la impresión.

Otra posibilidad adicional de empleo de los almidones modificados consiste en la producción de materiales sustitutivos del cuero.

En el sector de los materiales sintéticos se manifiestan los siguientes sectores de empleo: La incorporación y aglutinación de productos secuenciales del almidón en el proceso de elaboración (el almidón es solamente un material de carga, no existe ninguna fijación directa entre un polímero sintético y un almidón) o alternativamente, la incorporación de productos secuenciales del almidón en la producción de polímeros (un almidón y un polímero pasan a formar una fijación firme).

La utilización de los almidones como material de carga puro no es competitiva en comparación con la de otras sustancias u otros materiales tales como el talco. Se observa un cuadro distinto cuando pasan a ser importantes las propiedades específicas de los almidones y con ello se modifica manifiestamente el perfil de propiedades de los productos finales. Un ejemplo de esto es la utilización de productos del almidón en la elaboración de materiales termoplásticos, tales como los de polietileno. En este caso el almidón y el polímero sintético se combinan mediante expresión conjunta en la relación de 1 : 1 para formar una "master batch" (tanda patrón), a partir de la cual se pueden producir diversos productos con un polietileno granulado mediando utilización de técnicas habituales de procesos. Mediante la incorporación y aglutinación del almidón en láminas de polietileno se puede conseguir una permeabilidad aumentada a sustancias en el caso de cuerpos huecos, una permeabilidad mejorada al vapor de agua, un comportamiento antiestático mejorado, un comportamiento antiapelmazante mejorado, así como una aptitud mejorada para la impresión con tintas acuosas.

Otra posibilidad es la utilización del almidón en espumas de poliuretanos. Con la adaptación de los derivados de almidones, así por medio de la optimización técnica de procesos, es posible controlar deliberadamente la reacción entre polímeros sintéticos y los grupos hidroxi del almidón. El resultado de esto son láminas de poliuretanos, que mediante la utilización del almidón adquieren los siguientes perfiles de propiedades: Una disminución del coeficiente de dilatación térmica, una disminución del comportamiento de contracción, un mejoramiento del comportamiento frente a compresión y esfuerzos, un aumento de la permeabilidad al vapor de agua sin modificación de la absorción de agua, una disminución de la inflamabilidad y de la densidad de hendiduras, ningún escurrimiento de partes combustibles, ausencia de halógenos y envejecimiento disminuido. Las desventajas, que actualmente todavía están presentes, son una disminuida resistencia a la compresión así como una disminuida resistencia a los golpes.

Es posible no solamente el desarrollo de productos de láminas. También se pueden producir productos de materiales sintéticos, tales como macetas, placas y cubetas con un contenido de almidón situado por encima de 50%. Además, las mezclas de almidones y polímeros tienen la ventaja de que presentan una degradabilidad biológica muchísimo más alta.

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Los polímeros de injerto con almidón tienen una extraordinaria importancia además, a causa de su extremada capacidad de fijación de agua. Éstos son productos con una cadena principal a base de un almidón y de un retículo lateral de un monómero sintético, injertado de acuerdo con el principio del mecanismo de encadenamiento de radicales. Los polímeros de injerto con almidón, hoy en día disponibles, se distinguen por una mejor capacidad de fijación y retención de hasta 1.000 g de agua por g de almidón junto con una alta viscosidad. Estos superabsorbentes se utilizan principalmente en el sector de la higiene, p.ej. en el caso de productos tales como pañales y colchones, así como en el sector agrícola, p.ej. en el caso de granulaciones de semillas.

Son determinantes para el empleo de los nuevos almidones modificados por tecnología genética, por una parte, la estructura, el contenido de agua, el contenido de proteínas, el contenido de lípidos, el contenido de fibras, el contenido de cenizas y fosfatos, la relación entre amilosa y amilopectina, la distribución de masas moleculares, el grado de ramificación, el tamaño y la forma de los granos, así como la cristalización, por otra parte también las propiedades que desembocan en las siguientes características: El comportamiento de fluidez y sorción, la temperatura de engrudamiento, el rendimiento de espesamiento, la solubilidad, la estructura de los engrudos, la transparencia, la estabilidad frente al calor, a la cizalladura y a los ácidos, la tendencia a la retrogradación, la formación de geles, la estabilidad frente a congelaciones y descongelaciones, la formación de complejos, la fijación de yodo, la formación de películas, la fuerza adhesiva, la estabilidad frente a las enzimas, la digestibilidad y la reactividad. Se ha de resaltar especialmente además la viscosidad.

Además, el almidón modificado obtenible a partir de las células de plantas y respectivamente de las plantas conformes al invento se puede someter a otras modificaciones químicas adicionales, lo cual conduce a mejoras adicionales de la calidad para determinados sectores de empleo que antes se han descrito, o a nuevos sectores de empleo. Estas modificaciones químicas son fundamentalmente conocidas para un experto en la especialidad. En particular, se trata en tal caso de modificaciones por

-: tratamiento con ácidos

-: oxidación

-: esterificación (formación de almidones esterificados con fosfatos, nitratos, sulfatos, xantatos, acetatos y citratos). Otros ácidos orgánicos se pueden emplear asimismo para la esterificación)

-: producción de éteres de almidones (alquil-éteres, O-alil-éteres, hidroxialquil-éteres y O-carboxil-metil-éteres, de almidones, éteres de almidones que contienen N, éteres de almidones que contienen S)

-: producción de almidones reticulados

-: producción de polímeros de injerto con almidones.

Es objeto del invento también un material de reproducción para las plantas conformes al invento, tales como p.ej. semillas, frutas, plantones, tubérculos o cepellones de raíces, conteniendo este material células de plantas conformes al invento.

Depósitos

Los siguientes plásmidos producidos y/o utilizados dentro del marco del presente invento se depositaron en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM = Colección alemana de microorganismos) con sede en Braunschweig, República Federal Alemana, que está reconocida como centro internacional de depósito, de modo correspondiente a los requisitos del convenio de Budapest para el reconocimiento internacional de los depósitos de microorganismos con finalidades de obtención de patentes.

(Número de depósito; fecha de depósito):

Plásmido	pBinAR Hyg	(DSM 9505)	(20.10.1994)
Plásmido	p33-anti-BE	(DSM 6146)	(20.08.1990)
Plásmido	pRL2	(DSM 10225)	(04.09.1995)

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Medios y soluciones que se utilizan

Tampón para elución: 25 mM de Tris, pH 8,3

\quad: 250 mM de glicina

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Tampón para diálisis: 50 mM de Tris-HCl, pH 7,0

\quad: 50 mM de NaCl

\quad: 2 mM de EDTA

\quad: 14,7 mM de \beta-mercaptoetanol

\quad: 0,5 mM de PMSF

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Tampón para proteínas: 50 mM de un tampón de fosfato de sodio de pH 7,2

\quad: 10 mM de EDTA

\quad: 0,5 mM de PMSG

\quad: 14,7 mM de \beta-mercaptoetanol

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Solución del Lugol: 12 g de KI

\quad: 6 g de I_{2}

\quad: hasta 1,8 l con ddH_{2}O (agua doblemente destilada)

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20 x SSC: 175,3 g de NaCl

\quad: 88,2 g de citrato de sodio

\quad: hasta 1.000 ml con ddH_{2}O

\quad: pH 7,0 con 10 N de NaOH

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10 x MEN: 200 mM de MOPS

\quad: 50 mM de acetato de sodio

\quad: 10 mM de EDTA

\quad: pH 7,0

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Tampón NSEB: 0,25 M de un tampón de fosfato de sodio de pH 7,2

\quad: 7% de SDS

\quad: 1 mM de EDTA

\quad: 1% de BSA (p/v = peso/volumen)

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el plásmido p35S-anti-RL

\quad: Constitución del plásmido:

A =: Fragmento A: Promotor CaMV 35S, nt (nucleótidos) 6909-7437 (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294)

B =: Fragmento B: Fragmento para Asp718 con una longitud de aproximadamente 1.949 pb a partir de pRL1

\quad: Orientación hacia el promotor: antisentido

\quad: La flecha indica la dirección del cuadro de lectura abierto.

C =: Fragmento C: nt 11748-11939 del ADN T del plásmido pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984), 835-846)

La Figura 2 muestra el plásmido pB33-anti-RL

\quad: Constitución del plásmido:

A =: Fragmento A: Promotor B33 del gen de patatina B33 procedente de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29)

\quad: Orientación hacia el promotor: antisentido

\quad: La flecha indica la dirección del cuadro de lectura abierto.

La Figura 3 muestra una curva de Brabender, dibujada con un viscógrafo de Brabender del tipo del viscógrafo E, de una solución de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata no transformadas de la variedad Désirée (véase el Ejemplo 8).

En este caso significan:

mom.rot.: Momento de rotación

[BE]: Unidad de Brabender

Temp.: Temperatura

A: Comienzo del engrudamiento

B: Viscosidad máxima

C: Comienzo del período de tiempo de retención

D: Comienzo del período de tiempo de enfriamiento

E: Final del período de tiempo de enfriamiento

F: Final del período de tiempo de retención final.

La línea azul indica la viscosidad; la roja indica la evolución de las temperaturas.

La Figura 4 muestra una curva de Brabender dibujada con un viscógrafo de Brabender del tipo del viscógrafo E de una solución acuosa de un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL (véase el Ejemplo 8). Acerca del significado de las abreviaturas véase la Figura 3.

La Figura 5 muestra una curva de Brabender dibujada con un viscógrafo de Brabender del tipo del viscógrafo E de una solución acuosa de un almidón procedente de patatas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL (véase el Ejemplo 8). Acerca del significado de las abreviaturas véase la Figura 3.

La Figura 6 muestra curvas dibujadas con un analizador Rapid Visco Analyser de soluciones acuosas de almidones, que se habían aislado a partir de plantas de patata (véase el Ejemplo 12). La línea roja indica la evolución de las temperaturas, las líneas azules 1, 2, 3 y 4 indican las viscosidades de las siguientes soluciones de almidones.

Línea 1:: Un almidón, que se ha aislado a partir de plantas de tipo salvaje,

Línea 2:: Un almidón, que se ha aislado a partir de plantas, en las que se había inhibido solamente la enzima de ramificación (compárese el Ejemplo 1 de la solicitud de patente WO 92/14827),

Línea 3:: Un almidón, que se ha aislado a partir de plantas en las cuales se habían disminuido en cuanto a su concentración solamente las proteínas conformes al invento (compárese el Ejemplo 6),

Línea 4:: Un almidón, que se ha aislado a partir de plantas, que han sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL en combinación con el plásmido p35SH-anti-BE (compárese el Ejemplo 12).

La Figura 7 muestra las curvas dibujadas con un analizador Rapid Visco Analyser de soluciones acuosas de almidones, que se habían aislado a partir de plantas de patata (véase el Ejemplo 13). La línea roja indica la evolución de las temperaturas y las líneas azules 1, 2, 3 y 4 indican las viscosidades de las siguientes soluciones de almidones.

Línea 2:: Un almidón, que se ha aislado a partir de plantas, que se había aislado solamente con el plásmido pB33-anti-GBSSI (la denominado patata cerosa),

Línea 3:: Un almidón que se ha aislado a partir de plantas que se habían transformado solamente con el plásmido p35S-anti-RL (compárese el Ejemplo 6),

Línea 4:: Un almidón que se ha aislado a partir de plantas que han sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI (compárese el Ejemplo 13).

Los Ejemplos explican el invento.

En los Ejemplos se utilizaron las siguientes técnicas clásicas:

1. Procedimiento de clonación

Para la clonación en E. coli se utilizó el vector pBluescriptSK.

Para la transformación de plantas, las construcciones artificiales de genes se clonaron en el vector binario pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant. Sci. 66 (1990), 221-230) y B33-Hyg.

2. Cepas de bacterias

Para el vector pBluescript y para las construcciones artificiales pBinAR y B33-Hyg se utilizó la cepa DH5\alpha de E. coli (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EE.UU.).

La transformación de los plásmidos en las plantas de patata se llevó a cabo con ayuda de la cepa C58C1 pGV2260 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere y colaboradores, Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777:4788).

3. Transformación de Agrobacterium tumefaciens

La transferencia del ADN se efectuó por transformación directa de acuerdo con el método de Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). La bacteria Agrobacterium transformada con un ADN de plásmido se aisló con el método de Birnboim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) y se analizó por electroforesis en gel después de una adecuada disociación por restricción.

4. Transformación de patatas

Diez pequeñas hojas lesionadas con el escalpelo, de un cultivo estéril de patata (Solanum tuberosum variedad L. cv. Désirée) se colocaron en 10 ml de un medio MS (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) con 2% de sacarosa, que contenía 50 \mul de un cultivo durante una noche de Agrobacterium tumefaciens que había crecido mediando selección. Después de un ligero sacudimiento durante 3-5 minutos, se efectuó una incubación adicional durante 2 días en la oscuridad. Después de esto, las hojas se colocaron, para la inducción de callos, sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 5 mg/l de ácido naftilacético, 0,2 mg/l de bencilaminopurina, 250 mg/l de claforano, 50 mg/l de kanamicina o bien 1 mg/l de higromicina B, y 0,80% de bacto agar. Después de una incubación durante una semana a 25ºC y 3000 Lux, las hojas se colocaron, para la inducción de retoños, sobre un medio MS con 1,6% de glucosa, 1,4 mg/l de zeatina-ribosa, 20 mg/l de ácido naftilacético, 20 mg/l de ácido giberélico, 250 mg/l de claforano, 50 mg/l de kanamicina o bien 3 mg/l de higromicina B, y 0,80% de bacto agar.

5. Marcación radiactiva de fragmentos de ADN

La marcación radiactiva de fragmentos de ADN se llevó a cabo con ayuda de un estuche de marcación con cebadores aleatorios de ADN (DNA-Random Primer Labelling Kits) de la entidad Boehringer (Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.

6. Análisis por transferencia de borrones Northern

El ARN se aisló de acuerdo con protocolos clásicos a partir de un tejido de hojas de plantas. 50 \mug del ARN fueron separados sobre un gel de agarosa (1,5% de agarosa, 1 x tampón MEN, 16,6% de formaldehído). El gel, después de la marcha del gel se lavó brevemente en agua. El ARN se transfirió con 20 x SSC mediante una transferencia de borrón capilar sobre una membrana de nylon de tipo Hybond N (Amersham, Reino Unido). La membrana se coció a continuación a 80ºC bajo vacío durante dos horas.

La membrana se hibridó previamente durante 2 h a 68ºC en un tampón NSEB y a continuación se hibridó en el tampón NSEB durante una noche a 68ºC en presencia de la sonda marcada radiactivamente.

7. Cría de plantas

Las plantas de patata se cultivaron en un invernadero en las siguientes condiciones:

Período de luz	16 h a 25000 lux y 22ºC
Período de oscuridad	8 h a 15ºC
Humedad del aire º	60%

8. Determinación de la relación de amilosa a amilopectina en un almidón procedente de plantas de patata

El almidón se aisló de acuerdo con métodos clásicos a partir de plantas de patata y la relación de amilosa a amilopectina se determinó de acuerdo con el método descrito por von Hovenkamp-Hermelink y colaboradores (Potato Research 31 (1988) 241-246).

9. Determinación de glucosa, fructosa y sacarosa

Para la determinación de los contenidos de glucosa, fructosa y respectivamente sacarosa, se congelan pequeños trozos (con un diámetro de aproximadamente 10 mm) de tubérculos de patata en nitrógeno líquido y a continuación se extraen durante 30 min a 80ºC en 0,5 ml de HEPES 10 mm, de pH 7,5; 80% (vol/vol) de etanol. El material sobrenadante, que contiene los componentes solubles, se retira y se determina el volumen. El material sobrenadante se utiliza para la determinación de la cantidad de azúcares solubles. La determinación cuantitativa de glucosa, fructosa y sacarosa solubles se lleva a cabo en una tanda que tiene la siguiente composición:

100,0: mM de imidazol/HCl, de pH 6,9

1,5 mM: de MgCl_{2}

0,5 mM: de NADP^{\pm}

1,3: mM de ATP

10-50: \mul de una muestra

1,0: U de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa procedente de levadura

La tanda se incuba a la temperatura ambiente durante 5 min. La determinación de los azúcares se efectúa a continuación mediante métodos fotométricos corrientes por medición de la absorción a 340 nm después de la adición consecutiva de

1,0 unidades: de una hexocinasa procedente de levadura (para la determinación de glucosa)

1,0 unidades: de una fosfoglucoisomerasa procedente de levadura (para la determinación de fructosa) y

1,0 unidades: de una invertasa procedente de levadura (para la determinación de sacarosa).

Ejemplo 1 Aislamiento de proteínas unidas a granos de almidón, procedentes de almidón de patata

El aislamiento de proteínas unidas a granos de almidón procedentes de almidón de patata se efectuó mediante electroelución en un dispositivo para elución que se había construido de una manera análoga al electroelutor "Modelo 422 Electro-Eluter" (BIORAD Laboratories Inc., EE.UU.), pero tenía un volumen esencialmente mayor (aproximadamente 200 ml). Se recogieron 25 g de un almidón secado en un tampón para elución (volumen final 80 ml). El almidón procedía de patatas, que producen un almidón casi exento de amilosa, a causa de la expresión antisentido de una secuencia de ADN que codifica la sintasa I de almidón, unida a granos de almidón (GBSS I) procedente de patata. La suspensión se calentó a 70-80ºC en un baño de agua. A continuación, se añadieron 72,07 g de urea (concentración final 8 M) y el volumen se completó hasta 180 ml con un tampón para elución. El almidón se disolvía mediando constante agitación y adquirió una consistencia a modo de engrudo. Las proteínas fueron electroeluidas a partir de la solución con ayuda del dispositivo para elución durante una noche (100 V; 50-60 mA). Las proteínas eluidas se sacaron cuidadosamente desde el equipo. Las sustancias en suspensión se eliminaron mediante una breve centrifugación. El material sobrenadante se dializó 2-3 veces, cada vez durante una hora, a 4ºC frente a un tampón para diálisis. A continuación, se determinó el volumen de la solución de proteínas. Las proteínas se precipitaron por adición de sulfato de amonio (concentración final 90%). La adición se efectuó mediando agitación constante a 0ºC. Las proteínas precipitadas se sedimentaron por centrifugación y se recogieron en un tampón para proteínas.

Ejemplo 2 Identificación y aislamiento de secuencias de ADNc, que codifican proteínas unidas a granos de almidón

Las proteínas aisladas de acuerdo con el Ejemplo 1 se utilizaron para la producción de anticuerpos policlonales de conejo, que reconocen específicamente a proteínas unidas a granos de almidón.

Con ayuda de tales anticuerpos se escrutó a continuación de acuerdo con métodos clásicos una biblioteca de expresión de ADNc para encontrar secuencias que codifican proteínas unidas a granos de almidón.

La biblioteca de expresión se produjo de la siguiente manera:

A partir de tubérculos de patata de la variedad de patata "Berolina" se aisló de acuerdo con métodos clásicos un ARNm (mensajero) de poli(A*). Partiendo del ARNm poli(A^{\pm}) se produjo un ADNc de acuerdo con el método de Gubler y Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) mediando utilización de un cebador de Xho I-Oligo d(t)_{18}. Este se cortó posteriormente con Xho I después de la adición de un engarzador de EcoR I y se ligó de una manera orientada en un vector lambda ZAP II (de Stratagene) cortado con EcoR I y Xho I. Aproximadamente 500.000 placas de una biblioteca de ADNc construido de esta manera, se escrutaron para descubrir secuencias que eran reconocidas por anticuerpos policlonales, que están dirigidos contra proteínas unidas a granos de almidón.

Para el análisis de las placas de fagos, éstas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, que previamente se habían incubado durante 30-60 min en una solución 10 mM de IPTG, y a continuación se habían secado sobre un papel de filtro. La transferencia se efectuó durante 3 h a 37ºC. A continuación, los filtros se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente en un reactivo de bloqueo y se lavaron dos veces durante 5-10 min en un tampón de TBST. Los filtros se agitaron con los anticuerpos policlonales dirigidos contra proteínas unidas a granos de almidón, en una dilución apropiada, durante 1 h a la temperatura ambiente o durante 16 h a 4ºC. La identificación de placas, expresaban una proteína, que había sido reconocido por los anticuerpos policlonales se efectuó con ayuda del "Blotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23" [Estuche para detección por transferencia de borrones para anticuerpos de conejo RPN 23] (Amersham UK) de acuerdo con los datos del fabricante. Los clones de fagos de la biblioteca de ADNc, que expresaron una proteína que era reconocida por los anticuerpos policlonales se purificaron adicionalmente mediando utilización de procedimientos clásicos.

Con ayuda del método de excisión in vivo de clones de fagos positivos para E. coli, que contienen un plásmido pBluescript bicatenario con la respectiva inserción de ADNc. Después de una comprobación del tamaño y del modelo de restricción de las inserciones, se realizó ulteriormente un clon apropiado, el pRL1.

Ejemplo 3 Análisis de secuencias de la inserción de ADNc del plásmido pRL1

A partir de un clon de E. coli, obtenido correspondientemente al Ejemplo 2, se aisló el plásmido pRL1 y se determinó una parte de la secuencia de su inserción de ADNc mediante procedimientos clásicos por medio del método de los didesoxi-nucleótidos (Sanger y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). La inserción tiene una longitud de aproximadamente 2.450 pb. Una parte de la secuencia de nucleótidos, así como la secuencia de aminoácidos derivada a partir de ella, se indica bajo Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

Un análisis de las secuencias y una comparación de las secuencias con secuencias conocidas de ADN mostraron que es nueva la secuencia representada bajo Seq ID No. 3 y no presenta ninguna homología significativa con secuencias de ADN hasta ahora conocidas. El análisis de las secuencias mostró además que en el caso de la inserción de ADNc se trata solamente de un ADNc parcial, en el que falta una parte de la región codificadora junto al extremo 5'.

Ejemplo 4 Identificación y aislamiento de un ADNc completo, que codifica una proteína unida a granos de almidón, procedente de Solanum tuberosum

Para el aislamiento de un ADNc completo que corresponde a la inserción parcial de ADNc del plásmido pRL1, se produjo una biblioteca de ADNc adicional. En este caso se trataba de una biblioteca de ADNc procedente de Solanum tuberosum específica para células de cierre, que se había construido de la siguiente manera:

Primeramente, se produjeron fragmentos de epidermis de hojas de plantas de patata de la variedad Désirée en lo esencial de acuerdo con el método de Hedrich y colaboradores (Plant Physiol. 89 (1989), 148), cosechando aproximadamente 60 hojas de plantas de patata con una edad de aproximadamente seis semanas, que habían sido mantenidas en un invernadero. A partir de las hojas se retiró el nervio central. A continuación, las hojas se desmenuzaron cuatro veces durante 15 segundos aproximadamente a la etapa más alta en un aparato "Waring blender" [mezclador Waring] grande (con un volumen de 1 litro) en H_{2}O destilada y enfriada. La suspensión se filtró a través de un tamiz de nylon con un tamaño de poros de 220 \mum (Nybolt, Zürich, Suiza) y se lavó varias veces con agua destilada fría. La suspensión se filtró de nuevo a través de un tamiz de nylon de 220 \mum y se lavó ampliamente con agua destilada fría. El residuo (fragmento de epidermis) se añadió a un mezclador "Waring blender" de menor tamaño (volumen 250 ml) y se desmenuzó cuatro veces, cada vez durante 15 segundos, a la etapa pequeña en agua destilada y en hielo. La suspensión se filtró a través de un tamiz de nylon de 220 \mum y se lavó ampliamente con agua destilada fría. Los fragmentos de epidermis (= residuo) se investigaron por microscopio para detectar una contaminación por células mesófilas. Cuando este era el caso, se repitió la etapa de desmenuzamiento en un pequeño mezclador "Waring blender".

La disgregación de las células de cierre de los fragmentos de epidermis se efectuó por trituración en mortero con nitrógeno líquido en un mortero enfriado, durante aproximadamente 2 h. Para la comprobación de la disgregación de las células de cierre, se tomaron regularmente muestras y se comprobaron con un microscopio. Después de 2 h, o cuando se hubo disgregado un número suficientemente grande de células de cierre, el polvo resultante se transfirió a un recipiente de reacción (con un volumen de 50 ml) y se recogió en un volumen de tampón para GTC (Chirgwin y colaboradores, Biochem. 18 (1979), 5294-5299). La suspensión se centrifugó y el material sobrenadante se filtró a través de una tela Miracloth (Calbiochem, La Jolla, California). El material filtrado se sometió durante 16 h a una centrifugación tal como se indica en las citas de Glisin y colaboradores (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) y de Mornex y colaboradores (J. Clin. Invest. 77 (1986), 1952-1961). Después de la centrifugación, el precipitado de ARN se recogió en 250 \mul de un tampón para GTC. El ARN se precipitó por adición de 0,05 volúmenes de ácido acético 1 M y 0,7 volúmenes de etanol. El ARN se separó por centrifugación y el precipitado se lavó con acetato de sodio 3 M (de pH 4,8) y etanol al 70%. El ARN se secó brevemente y se disolvió en agua tratada con DEPC. A partir del ARN aislado se aisló de acuerdo con un procedimiento clásico el ARN poli(A^{\pm}). Partiendo del ARNm poli(A^{\pm}) se produjo, de acuerdo con el método de Gübler y Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269), un ADNc mediando utilización de un cebador para Xho I-Oligo d(t)_{18}. Éste se cortó posteriormente con Xho I después de la adición de un engarzador para EcoR I y se ligó de una manera orientada en un vector lambda ZAP II (de Stratagene, GmbH, Heidelberg, Alemania) cortado con EcoR I y Xho I. El empaquetamiento en cabezas de fagos se efectuó mediando utilización del estuche.

Gigapack II Gold kit (Stratagene, GmbH, Heidelberg, Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.

A partir de una biblioteca de ADNc de este tipo se aislaron y purificaron, de acuerdo con procedimientos clásicos, clones de fagos, que se hibridan con la inserción de ADNc procedentes del plásmido pRL1. Con ayuda del método de excisión in vivo se obtuvieron, a partir de clones de fagos positivos, clones de E. coli que contienen un plásmido pBluescript bicatenario con la respectiva inserción de ADN. Después de una comprobación del tamaño y del modelo de restricción de las inserciones, unos clones apropiados se sometieron a un cartografiado por restricción y a un análisis de las secuencias. A partir de un clon apropiado, se aisló el plásmido pRL2 (DSM 10225), que contiene un ADNc completo, que codifica una proteína unida a granos de almidón procedente de patata.

Ejemplo 5 Análisis de la secuencia de la inserción de ADNc del plásmido pRL2

La secuencia de nucleótidos de la inserción de ADNc del plásmido pRL2 se determinó, tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La inserción tiene una longitud de 4.856 pb. La secuencia de nucleótidos, así como la secuencia de aminoácidos derivada a partir de ella, se indican en Seq ID No. 1 y respectivamente Seq ID No. 2. El correspondiente gen es denominado en lo sucesivo gen de RL.

Ejemplo 6 Construcción del plásmido p35S-anti-RL e introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pRL1 se aisló, con ayuda de la endonucleasa de restricción Asp718, un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1.800 pb. Este corresponde a la secuencia de ADN representada en Seq ID No. 3 y contiene una parte del cuadro abierto de lectura. El fragmento se ligó en el vector binario pBinAR, cortado con Asp718 (Höfgen y Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230). En el caso de éste, se trata de un derivado del vector binario pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). El pBinAR se construyó de la siguiente manera:

Un fragmento con una longitud de 529 pb, que comprende los nucleótidos 6909-7437 del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294), se aisló como fragmento para EcoR I/Kpn I a partir del plásmido pDH51 (Pietrzak y colaboradores, Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) y se ligó entre los sitios de corte con EcoR I y Kpn I del poliengarzador de pBin19. En tal caso resultó el plásmido pBin19-A.

A partir del plásmido pAGV40 (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 303, 209-213) se aisló, con ayuda de las endonucleasas de restricción Pvu II y Hind III, un fragmento con una longitud de 192 pb, que comprende la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3, 835-846) (nucleótidos 11749-11939). Después de la adición de engarzadores para Sph I al sitio de corte con Pvu I el fragmento se ligó entre los sitios de corte con Sph I y Hind III de pBin19-A. De este modo, se formó el pBinAR.

Con ayuda de análisis por restricción y de secuencias, se identificaron vectores recombinantes, en los cuales el fragmento de ADN está insertado en el vector de tal manera, que una parte de la región codificadora de la inserción de ADNc procedente de pRL1 está unida en orientación antisentido con el promotor 35S. El resultante plásmido, p35S-anti-RL, está representado en la Figura 1.

Mediante la inserción del fragmento de ADNc resulta una casilla de expresión, que está constituida de la siguiente manera a base de los fragmentos A, B y C:

El fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). El fragmento comprende los nucleótidos 6909 hasta 7437 del CaMV (Franck y colaboradores, Cell 21 (1980), 285-294).

El fragmento B contiene, junto a zonas flanqueadoras, una parte de la región codificadora de proteínas de la inserción de ADNc procedente del plásmido pRL1. Ésta se aisló a partir de pRL1 como fragmento Asp718 tal como arriba se ha descrito, y se fusionó en una orientación antisentido con el promotor 35S en pBinAR.

El fragmento C (192 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN T del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, EMBO J. 3 (1984) 835-846).

El tamaño del plásmido p35S-anti-RL es de aproximadamente 12,8 kb.

El plásmido se transfirió a plantas de patata con ayuda de una transformación mediada por agrobacterias, tal como antes se ha descrito. A partir de las células transformadas, se regeneraron plantas enteras. Las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero.

La comprobación del éxito de la modificación genética de las plantas se efectuó mediante análisis del ARN total en un análisis por transferencia de borrón Northern en lo que se refiere a la desaparición de los transcritos complementarios con el ADN T. Para esto, el ARN total procedente de hojas de plantas transformadas se aisló de acuerdo con métodos clásicos, se separó por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa, se transfirió a una membrana de nylon, y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia representada bajo Seq ID No. 1 o una parte de esta secuencia. En aproximadamente 5-10% de las plantas transformadas faltaba en el análisis por transferencia de borrón Northern la banda que representa el transcrito específico de la secuencia representada bajo Seq ID No. 1. Estas plantas se utilizaron para el análisis de la calidad del almidón.

Ejemplo 7 Construcción del plásmido pB33-anti-RL e introducción del plásmido en el genoma de plantas de patata

A partir del plásmido pRL1 se aisló, con ayuda de la endonucleasa de restricción Asp718, un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1.800 pb, que comprende una parte del cuadro de lectura abierto de la inserción de ADNc y se ligó en el vector B33-Hyg cortado con Asp718. Este vector se produjo de la siguiente mane-
ra:

A partir del vector pBinAR Hyg (DSM 9505) se eliminó, con ayuda de las endonucleasas de restricción EcoR I y Asp718, el promotor 35S. A partir del plásmido p33-anti-BE (DSM 6146) se aisló con ayuda de EcoR I y Asp718 un fragmento con una longitud de aproximadamente 1.526 pb, que comprende el promotor B33 y se insertó en el vector pBinAR Hyg (DSM 9505) cortado con EcoR I y Asp718.

Mediante la inserción del fragmento de ADNc en el sitio de corte con Asp718 del plásmido B33-Hyg resulta una casilla de expresión, que está constituida de la siguiente manera a base de los fragmentos A, B y C (Figura 4):

El fragmento A contiene el promotor B33 procedente de Solanum tuberosum (documento EP 3775092; Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

El fragmento B contiene, junto a zonas flanqueadoras, una parte de la región codificadora de proteína de la inserción de ADNc procedente del plásmido pRL1. Ésta se aisló a partir de pRL1 como antes se ha descrito como fragmento Asp718 y se fusionó en una orientación antisentido con el promotor B33 en B33-Hyg.

El tamaño del plásmido pB33-anti-RL es de aproximadamente 12,8 kb.

La comprobación del éxito de la modificación genética de las plantas se efectuó mediante análisis del ARN total en un análisis por transferencia de borrón Northern, en lo que se refiere a la desaparición del transcrito complementario con el ADN T. Para esto, se aisló un ARN total procedente de tubérculos de plantas transformadas de acuerdo con métodos clásicos, se separó por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia representada bajo Seq ID No. 1, o una parte de esta secuencia. En aproximadamente un 5-10% de las plantas transformadas faltaba en el análisis por transferencia de borrón Northern la banda que representa a los transcritos, que se hibridan con el ADNc conforme al invento. A partir de estas plantas se aisló el almidón a partir de tubérculos, y se analizó tal como se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8 Análisis de las plantas de patata transformadas

Las plantas de patata, transformadas de acuerdo con el Ejemplo 6 y el Ejemplo 7, se investigaron en lo que se refería a las propiedades del almidón sintetizado. Los análisis se llevaron a cabo en diferentes linajes de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL o bien con el plásmido pB33-anti-RL, y que en el análisis por transferencia de borrón Northern ya no tenían la banda, que representa a transcritos que se hibridan con la secuencias de ADN conformes al invento.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Para la determinación de la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló almidón a partir de tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL o bien con el plásmido pB33-anti-RL, de acuerdo con procedimientos clásicos. Se recogieron en cada caso 30 g de almidón en 450 ml de H_{2}O y se utilizaron para el análisis es un viscógrafo E ((Brabender OHG Duisburg (Alemania)). El funcionamiento del aparato se efectuó de acuerdo con los datos del fabricante. Para la determinación de la viscosidad de la solución acuosa del almidón, la suspensión de almidón se calentó primeramente desde 50ºC hasta 96ºC con una velocidad de 3ºC por minuto. A continuación se mantuvo la temperatura en 96ºC durante 30 min. Después de ello, la solución se enfrió desde 96ºC hasta 50ºC con una velocidad de 3ºC por min. Durante todo el período de tiempo, se determinó la viscosidad. Resultados representativos de tales mediciones se reproducen en la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5, en forma de curvas, en las que se representa la viscosidad en función del tiempo. La Figura 3 muestra una típica curva de Brabender para un almidón, que se había aislado a partir de plantas de tipo salvaje de la variedad de patata Désirée. Las Figuras 4 y 5 muestran una típica curva de Brabender para un almidón, que se había aislado a partir de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL o bien pB33-anti-RL. A partir de las curvas se pueden deducir diferentes valores característicos.

Para plantas de tipo salvaje resultan en tal caso los siguientes valores característicos:

TABLA 1

Valor	Tiempo	Momento de rotación	Temperatura
	[min : s]	[BE]	[ºC]

A	6 : 30	60,5 \pm 17,7	69,9 \pm 0,57
B	11 : 30	1.838,0 \pm 161,2	86,0 \pm 2,1
C	15 : 15	1.412,0 \pm 18,4	96,0
D	45 : 15	526,0 \pm 17,0	96,0
E	60 : 30	812,0 \pm 8,5	50,0
F	70 : 45	853,0 \pm 5,7	50,0

Los valores reproducen valores medios procedentes de dos diferentes mediciones.

En la Tabla 1 y en las siguientes Tablas 2 y 3, significan:

A:: Comienzo del engrudamiento

B:: Viscosidad máxima

C:: Comienzo del período de tiempo de retención

D:: Comienzo del período de tiempo de enfriamiento

E:: Final del período de tiempo de enfriamiento

F:: Final del período de tiempo de retención final.

Para plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL (linaje P2), se establecen en tal caso los siguientes valores característicos:

TABLA 2

Valor	Tiempo	Momento de rotación	Temperatura
	[min : s]	[BE]	[ºC]

A	6 : 00	50,0	69,0
B	14 : 00	820,0	93,0
C	15 : 15	815,0	96,0
D	45 : 15	680,0	96,0
E	60 : 30	1.150,0	50,0
F	70 : 45	1.200,0	50,0

Para plantas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL (linaje P3), se establecen en tal caso los siguientes valores:

TABLA 3

Valor	Tiempo	Momento de rotación	Temperatura
	[min : s]	[BE]	[ºC]

A	7 : 0	31,0	71,0
B	12 : 45	671,0	88,3
C	15 : 15	662,0	96,0
D	45 : 15	607,0	96,0
E	60 : 30	1.063,0	50,0
F	70 : 45	1.021,0	50,0

A partir de las Figuras 3, 4 y 5 se desprende con claridad que el almidón procedente de plantas transformadas se diferencia del obtenido a partir de plantas de tipo salvaje, en particular, por el hecho de que al hervir se efectúa solamente un muy pequeño aumento de la viscosidad. Así, la viscosidad máxima en el almidón modificado procedente de plantas transformadas al hervir está situado en más de un 50% por debajo del valor del almidón de tipo salvaje.

Por otra parte, la viscosidad del almidón aislado a partir de plantas transformadas aumenta después del enfriamiento en mayor grado que en el caso del almidón de tipo salvaje.

b) Determinación del contenido de fosfatos del almidón

Se determinó el contenido de fosfato del almidón, midiendo la cantidad de fosfato, que se había fijado a la posición C-6 de radicales de glucosa. Para esto, un almidón fue desdoblado primeramente mediante hidrólisis con un ácido y a continuación se determinó el contenido de glucosa-6-fosfato mediante un ensayo con enzimas, tal como se describe a continuación.

100 mg de almidón se incubaron a 100ºC durante 4 en 500 \mul de HCl 0,7 N. Después de la hidrólisis con un ácido, 10 \mul de la tanda se añadieron a 600 \mul de un tampón de imidazol (100 mM de imidazol, 5 mM de MgCl_{2}, de pH 6,9, 0,4 mM de NAD^{+}). La determinación de la cantidad de glucosa-6-fosfato en la tanda se efectuó mediante reacción con la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Para esto, a la tanda se le añadió 1 U (unidad) de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (procedente de Leuconostoc mesenteroides (de Boehringer Mannheim)) y se determinó la cantidad de NADH formada mediante medición de la absorción a 340 nm.

El contenido de glucosa-6-fosfato/miligramo de almidón se indica en la siguiente Tabla para plantas de patata no transformadas de la variedad Désirée así como para dos linajes (P1 (35S-anti-RL; P2 (35S-anti-RL)) de plantas de patata transgénicas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL.

TABLA 4

Plantas	nmol de glucosa-6-fosfato/	%
	mg de almidón

Tipo salvaje	12,89 \pm 1,34	100
P1 (35S-anti-RL)	2,25 \pm 0,41	17,4
P2 (35S-anti-RL)	1,25 \pm 0	9,7

La siguiente Tabla muestra el contenido de glucosa-6-fosfato por miligramo de almidón en el caso de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL, en comparación con un almidón procedente de plantas no transformadas (S. tuberosum c.v. Désirée).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

Plantas	nmol de glucosa-6-fosfato/	%
	mg de almidón

Tipo salvaje	9,80 \pm 0,68	100
7	4,50 \pm 0,73	45,9
37	2,64 \pm 0,99	26,9
45	1,14 \pm 0,44	11,6
31	1,25 \pm 0,49	12,8

Las plantas 7, 37, 45 y 31 constituyen transformantes independientes, que habían sido transformados con el plásmido pB33-anti-RL. La planta 37 representa al linaje P3, para el que se representa una curva de Brabender en la
Figura 5.

Los valores muestran que el contenido de fosfato del almidón modificado procedente de plantas de patata transgénicas se ha disminuido en por lo menos aproximadamente un 50% en comparación con un almidón procedente de plantas de tipo salvaje.

c) Determinación de los contenidos de glucosa, fructosa y sacarosa de tubérculos después de un almacenamiento a 4ºC

Tubérculos de plantas de diferentes linajes transgénicos, que habían sido transformados con la construcción artificial antisentido p35S-anti-RL, y de plantas de tipo salvaje, se almacenaron durante 2 meses a 4ºC y respectivamente a 20ºC en la oscuridad. A continuación, se determinaron, tal como antes se ha descrito, las cantidades de glucosa, fructosa y sacarosa. En tal caso resultaron los siguientes valores representativos para dos linajes transgénicos:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6

	Glucosa	Fructosa	Sacarosa
	20ºC	4ºC	20ºC	4ºC	20ºC	4ºC

Tipo salvaje	0,84	55,4	0,62	52,8	8,5	13,1
c.v. Désirée
Transgén linaje 15	1,12	6,7	0,75	7,8	7,5	10,1
Transgén linaje 11	1,00	6,4	0,75	7,5	6,9	6,9

Los valores presentados en la tabla se indican en \mumol de hexosa y respectivamente sacarosa/g de peso fresco.

A partir de los valores presentados en la Tabla 6 queda claro que en el caso de las plantas transgénicas con un almacenamiento a 4ºC tiene lugar una acumulación de azúcares reductores en los tubérculos esencialmente menor que en el caso de plantas de tipo salvaje.

En total, el almidón modificado que se ha aislado a partir de plantas de patata transgénicas se asemeja al almidón procedente de plantas de maíz de tipo salvaje. En comparación con éste, aquél posee la ventaja de que es de sabor neutro y de ésta manera es mejor apropiado para diferentes posibilidades de utilización en el sector alimentario.

Ejemplo 9 Expresión de la inserción de ADNc del plásmido pRL2 en E. coli (a) Transformación de células de bacterias

Para la expresión de la inserción de ADNc del plásmido pRL2, células de la cepa DH5\alpha de E. coli se transformaron primeramente con el plásmido pACAC. Este plásmido contiene un fragmento de ADN, que codifica la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) procedente de E. coli, bajo el control del promotor lac Z. El fragmento había sido aislado como un fragmento para DraI/HaeII con un tamaño de aproximadamente 1,7 kb a partir del vector pEcA-15 (véase B. Müller-Röber (1992), tesis doctoral, Universidad Libre FU Berlín) y después del alisamiento de los extremos había sido clonado en un vector pACAC184 linealizado con HindIII. La expresión de la AGPasa debe producir un aumento de la síntesis de glicógeno en células de E. coli transformadas. Las células transformadas de tal manera se designan en lo sucesivo como células K1 de E. coli.

Para la determinación de la actividad enzimática de la proteína codificada por el ADNc del plásmido, células K1 de E. coli se transformaron con el plásmido pRL2. Las células de E. coli transformadas, que contienen tanto el plásmido pACAC como también el plásmido pRL2, se designan en lo sucesivo como células K2 de E. coli.

La transferencia del ADN de plásmido a las células de bacterias se efectuó en cada caso de acuerdo con el método de Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). Las células de E. coli transformadas se extendieron sobre cubetas de cultivo en agar, con la siguiente composición:

Medio YT con

1,5%	de bacto-agar
50 mM	de un tampón de fosfato de sodio, de pH 7,2
1%	de glucosa
10 \mug/ml	de cloramfenicol, en el caso de células K1 de E. coli

o bien

10 \mug/ml	de cloramfenicol y
10 \mug/ml	de ampicilina, en el caso de células K2 de E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

Las células de la cepa DH5_ de Escherichia coli que habían sido transformadas con el plásmido pRL2 +
pACAC (células K2 de E. coli) así como, en calidad de testigo, solamente con el plásmido pACAC (células K1 de E. coli), se cultivaron sobre placas de agar. El glicógeno formado de los diferentes cultivos se investigó en lo que se refiere a su grado de fosforilación (en la posición C-6 de la molécula de glucosa), tal como se describe a continua-
ción.

(b) Aislamiento de un glicógeno bacteriano

Para el aislamiento de un glicógeno bacteriano, el césped de bacterias que había crecido después de la transformación en cada caso de 6 placas de agar (\varnothing 135 mm) se anegó con 5 ml de medio YT/placa. La suspensión de bacterias se centrifugó a 4.500 xg durante 5 minutos. El precipitado de bacterias se volvió a suspender en 10 ml de un medio YT. La disgregación de las bacterias se efectuó por adición de 2 volúmenes de un medio de disgregación (0,2 N de NaOH; 1% de SDS) e incubación durante 5 minutos a la TA. Por adición de 3 volúmenes de EtOH absoluto, incubación durante 30 minutos a 4ºC y subsiguiente centrifugación durante 15 minutos a 8.000 xg, se sedimentó el glicógeno. A continuación, el precipitado se lavó con 100 ml de EtOH al 70% y se sedimentó de nuevo por medio de una etapa de centrifugación (durante 10 minutos a 8.000 xg). El proceso de lavado se repitió 4 veces.

(c) Determinación del contenido total de glicógeno

El glicógeno aislado y sedimentado se desdobló primeramente mediante una hidrólisis en condiciones ácidas (disolución del precipitado en 2 ml de HCl 0,7 N; incubación durante 4 horas a 100ºC) en las moléculas individuales de glucosa. El contenido de glucosa de la solución se determinó mediante una reacción enzimática acoplada de un ensayo de almidón de acuerdo con los datos del fabricante (Boehringer Mannheim) en un fotómetro (de la entidad Kontron) con una longitud de onda de 340 nm. El tampón de reacción contiene:

100 mM	de MOPS, de pH 7,5
10 mM	de MgCl_{2}
2 mM	de EDTA
0,25 mM	de NADP
1 mM	de ATP
1 U/ml	de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
2 U/ml	de hexocinasa

La medición se efectuó a 25ºC con 10 \mul de una solución de glucosa.

(d) Determinación del contenido de glucosa-6-fosfato

Para la determinación del contenido de las moléculas de glucosa fosforiladas en la posición C-6, se emplearon iguales cantidades de sustancia de glucosa, en cada caso de los diferentes cultivos de bacterias. Por adición de volúmenes iguales de KOH 0,7 N al glicógeno desdoblado en sus moléculas de glucosa mediante una hidrólisis en condiciones ácidas (véase más arriba), se neutralizó la solución.

El tampón para reacción contiene:

100 mM	de MOPS, pH 7,5
10 mM	de MgCl_{2}
2 mM	de EDTA
0,25 mM	de NADP
2 U/ml	de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa

La medición se efectuó a 25ºC con 100-150 \mul de una solución de glucosa.

(e) Detección de una actividad de enzima que fosforila a un glicógeno bacteriano

Los resultados de la determinación del contenido de fosfato del glicógeno sintetizado en las células de bacterias, muestran que el glicógeno de las células de E. coli que habían sido transformadas con los plásmidos pACAC + pRL2, tiene una fosforilación aumentada hasta en 290 \pm 25% en la posición C-6 de la glucosa, en comparación con la tanda testigo (células de E. coli transformadas con el plásmido pACYC) (véase la siguiente Tabla).

Células de E. coli: Glucosa-6-fosfato : glucosa en el glicógeno

K1 de E. coli: 1:(4.600 \pm 1.150)

K2 de E. coli: 1:(1.570 \pm 390)

Los grados de fosforilación aquí representados son los valores medios en cada caso de 6 mediciones partiendo de 6 transformaciones y aislamientos independientes de glicógeno.

Ejemplo 10 Introducción del plásmido p35S-anti-RL en combinación con el plásmido p35SH-anti-BE en el genoma de plantas de patata

El plásmido p35S-anti-RL fue construido tal como se ha descrito en el Ejemplo 6. El plásmido p35SH-anti-BE fue construido tal como se ha descrito en la solicitud de patente internacional WO 95/07355, Ejemplo 3. Ambos plásmidos fueron transferidos secuencialmente a plantas de patata, con ayuda de la transformación mediada por agrobacterias, tal como antes se ha descrito. Para esto, en primer lugar, el plásmido p35SH-anti-BE fue transformado en plantas de patata. Se regeneraron plantas enteras y se seleccionaron en cuanto a una expresión disminuida del gen de la enzima branching (de ramificación). A continuación, el plásmido p35S-anti-RL fue transformado en las plantas transgénicas que tienen una expresión ya reducida de la enzima de ramificación. A partir de las células transformadas se regeneraron de nuevo plantas transgénicas, y las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero. La comprobación del éxito de la modificación genética de las plantas, en lo que se refiere a una expresión muy reducida tanto del gen de la enzima de ramificación así como también en lo que se refiere a una expresión grandemente reducida del gen de RL, se efectuó mediante análisis del ARN total en un análisis por transferencia de borrón del ARN en lo que se refiere a la desaparición del ADNc de la enzima de ramificación o del ADNc de RL de transcritos complementarios. Para esto, el ARN total se aisló a partir de hojas de plantas transformadas de acuerdo con métodos que se han descrito, se separó por electroforesis en gel, se transfirió a una membrana y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia representada bajo Seq ID No. 1 o una parte de esta secuencia, y a continuación se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia del ADNc de enzima de ramificación (compárese el documento WO 92/14827, Ejemplo 1) o una parte de la misma. En aproximadamente un 5% - 10% de las plantas transformadas faltaba, en el análisis por transferencia de borrón de ARN, tanto la banda que representa al transcrito específico de la secuencia representada bajo Seq ID No. 1 como también la banda que representa al transcrito específico del ADNc de la enzima de ramificación (compárese el documento WO 92/14827, Ejemplo 1). Estas plantas, que se designaron como plantas R4, se emplearon para el análisis de la calidad del almidón contenido en los tubérculos.

Ejemplo 11 Introducción del plásmido p33-anti-RL en combinación con el plásmido p33-anti-GBSSI en el genoma de plantas de patata

El plásmido p353-anti-RL fue construido tal como se ha descrito en el Ejemplo 7. El plásmido p33-anti-GBSSI fue construido de la siguiente manera:

El fragmento para DraI/DraI procedente de la región de promotor del gen B33 de la clase I de patatina de Solanum tuberosum, que comprende los nucleótidos -1.512 hasta +14 (Rocha-Sosa y colaboradores, EMBO J. 8 (1989), 23-29) fue ligado en el sitio de corte con SmaI del plásmido pUC19. A partir del plásmido resultante se ligó el fragmento de promotor como fragmento para EcoRI/HindIII en la región de poliengarzador del plásmido pBin19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-8721). A continuación, el fragmento para 3' EcoRI de 1.181 a 2.511 del gen de GBSSI de Solanum tuberosum (Hergersberg, tesis doctoral (1988) Universidad de Colonia) se ligó en el sitio de corte con EcoRI del plásmido resultante.

Ambos plásmidos fueron transferidos secuencialmente a plantas de patata con ayuda de una transformación mediada por agrobacterias, tal como se describe en el Ejemplo 10. A partir de las células transformadas, se regeneraron plantas enteras, y las plantas transformadas se cultivaron en condiciones de invernadero. La comprobación del éxito de las modificaciones genéticas de las plantas se efectuó mediante análisis del ARN total en un análisis por transferencia de borrón de ARN en lo que se refiere a la desaparición de los transcritos complementarios con los dos ADNc. Para esto, el ARN total procedente de tubérculos de plantas transformadas, se aisló de acuerdo con métodos clásicos, se separó por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa, se transfirió a una membrana y se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia representada bajo Seq ID No. 1 o una parte de la secuencia. Después de esto, la misma membrana se hibridó con una sonda marcada radiactivamente, que tiene la secuencia del gen de GBSSI o una parte de esta secuencia (Hergersberg, tesis doctoral (1988) Universidad de Colonia). En aproximadamente un 5% hasta 10% de las plantas transformadas faltaba, en el análisis por transferencia de borrón de ARN, la banda que constituye los transcritos, que se hibridaban con el ADNc conforme al invento o bien con el ADNc de GBSSI. A partir de los tubérculos de estas plantas, que se designaron como plantas R3, se aisló el almidón y se analizó.

Ejemplo 12 Análisis del almidón de las plantas R4

Las plantas de patata transformadas de acuerdo con el Ejemplo 10 se investigaron en lo que se refiere a las propiedades del almidón sintetizado. Los análisis se llevaron a cabo en diferentes linajes de plantas de patata, que habían sido transformadas con los dos plásmidos p35S-anti-RL y p35SH-anti-BE, y que ya no tenían, o las tenían de manera grandemente reducida, en el análisis por transferencia de borrón de ARN, las bandas que constituyen transcritos, que se hibridan con las secuencias de ADN conformes al invento o bien con la secuencia del ADNc de ramificación.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Para la determinación de la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló, de acuerdo con procedimientos clásicos, almidón a partir de tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35S-anti-RL y con el plásmido p35SH-anti-BE. Se recogieron en cada caso 2 g de almidón en 25 ml de H_{2}O y se utilizaron para el análisis en un analizador Rapid Visco Analysers (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia). El funcionamiento del aparato se efectuó de acuerdo con los datos del fabricante. Para la determinación de la viscosidad de la solución acuosa del almidón, la suspensión de almidón se calentó primeramente desde 50ºC hasta 95ºC con una velocidad de 12ºC por min. A continuación, se mantuvo la temperatura en 95ºC durante 2,5 min. Después de esto, la solución se enfrió desde 95ºC hasta 50ºC con una velocidad de 12ºC por min. Durante todo el período de tiempo, se determinó la viscosidad. Resultados representativos de tales mediciones se reproducen en forma de unas curvas, en las que se representa la viscosidad en función del tiempo. La Figura 6 muestra bajo 1 una típica curva de RVA para un almidón que había sido aislado a partir de plantas de tipo salvaje de la variedad de patata Désirée. Las líneas 2 y respectivamente 3 muestran típicas curvas de RVA para almidones que se habían aislado a partir de plantas de patata, que habían sido transformadas con el plásmido p35SH-anti-BE o bien p35S-anti-RL. La línea 4 muestra una típica curva de RVA para un almidón que ha sido aislado a partir de los tubérculos de plantas, que habían sido transformadas con el plásmido p35SH-anti-BE en combinación con el plásmido p35S-anti-RL. La línea 4 se distingue por la falta de cualquier aumento de la viscosidad en función de la temperatura.

(b) Determinación de la relación de amilosa a amilopectina

El almidón aislado a partir de los tubérculos de plantas de patata transformadas, se investigó en cuanto a la relación de amilosa a amilopectina. En tal caso se estableció para el linaje R4-1 de plantas (representada en la línea 4 de la Figura 6) un contenido de amilosa de más de 70%. Para el linaje R4-3 de plantas se estableció un valor de amilosa de 27%, mientras que el contenido de amilosa en un almidón de tipo salvaje de la variedad Désirée está situado entre 19 y 22%.

Ejemplo 13 Análisis del almidón de las plantas R3

Las plantas de patata transformadas de acuerdo con el Ejemplo 11, se investigaron en lo que se refiere a las propiedades de los almidones sintetizados. Los análisis se llevaron a cabo en diferentes linajes de plantas de patata, que habían sido transformadas con los dos plásmidos pB33-anti-RL y pB33-anti-GBSS,I y que ya no tenían o las tenían de manera grandemente reducida, en el análisis de transferencia de borrón de ARN, las bandas que constituyen transcritos, que se hibridan con las secuencias de ADN conformes al invento y respectivamente con la secuencia del ADNc de GBSSI.

a) Determinación de la viscosidad de soluciones acuosas del almidón

Para la determinación de la viscosidad de las soluciones acuosas del almidón sintetizado en plantas de patata transformadas, se aisló un almidón de acuerdo con procedimientos clásicos, a partir de tubérculos de plantas que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI. La determinación de la viscosidad mediante un analizador Rapid Visco Analysers se efectuó de acuerdo con el método que se ha descrito en el Ejemplo 12, parte a. Los resultados están representados en la Figura 7. La Figura 7 muestra en la línea 1 una típica de RVA para un almidón que había sido aislado a partir de plantas de tipo salvaje de la variedad de patata Désirée. Las líneas 2 y respectivamente 3 muestran típicas curvas de RVA para almidones, que habían sido aislados a partir de plantas de patata que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-GBSSI o bien p35S-anti-RL. La línea 4 muestra una típica curva de RVA para un almidón, que había sido aislado a partir de las plantas de patata que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-GBSSI en combinación con el plásmido pB33-anti-RL. Esta curva se distingue por la falta del máximo de viscosidad así como por la falta del aumento de la viscosidad a 50ºC. Por lo demás, este almidón se distingue por el hecho de que el engrudo obtenido después de un tratamiento con RVA no tiene prácticamente ninguna retrogradación después de una incubación durante varios días a la temperatura ambiente.

b) Determinación de la relación de amilosa a amilopectina

El almidón aislado a partir de los tubérculos de plantas de patata transformadas, se investigó en cuanto a la relación de amilosa a amilopectina. En tal caso se estableció para el linaje R3-5 de plantas (representado en la línea 4 de la Figura 7) un contenido de amilosa de menos que 4%, para el linaje R3-6 de plantas un contenido de amilosa de menos que 3%. El contenido de amilosa en un almidón de tipo salvaje de la variedad Désirée está situado entre 19 y 22%.

c) Determinación del contenido de fosfato del almidón

El contenido de fosfato del almidón se determinó midiendo la cantidad de fosfato, que se había fijado a la posición C-6 de radicales de glucosa. Para esto, el almidón fue desdoblado primeramente por hidrólisis con un ácido y a continuación se determinó el contenido de glucosa-6-fosfato mediante un ensayo con una enzima, tal como se describe a continuación.

100 mg de un almidón se incubaron a 100ºC durante 4 h en 500 \mul de HCl 0,7 N. Después de la hidrólisis con un ácido se añadieron 10 \mul de la tanda a 600 \mul de un tampón de imidazol (100 mM de imidazol, 5 mM de MgCl_{2}, de pH 6,9, 0,4 mM de NAD^{+}). La determinación de la cantidad de glucosa-6-fosfato en la tanda se efectuó mediante reacción con la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Para esto, a la tanda se le añadió 1 U de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (procedente de Leuconostoc mesenteroides (de Boehringer Mannheim)) y se determinó la cantidad de NADH formado mediante medición de la absorción a 340 nm.

El contenido de glucosa-6-fosfato/miligramo de almidón se indica en la siguiente tabla para plantas de patata de la variedad Désirée no transformadas así como para dos linajes R3-5 y R3-6 de plantas de patata transgénicas, que habían sido transformadas con el plásmido pB33-anti-RL en combinación con el plásmido pB33-anti-GBSSI. Como comparación, se indica conjuntamente el valor para el almidón procedente de la denominada patata cerosa (US2-10), que había sido transformada con el plásmido pB33-anti-GBSSI.

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TABLA 7

Plantas	nmol de glucosa-6-fosfato/	%
	mg de almidón

Tipo salvaje	9,80 \pm 0,68	100
R3-5	1,32 \pm 0,10	13
R3-6	1,37 \pm 0,15	14
US2-10	10,82 \pm 0,42	110

(1) DATOS GENERALES:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Jens Kossmann

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(B): CALLE: Golmer Fichten 9

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(C): LOCALIDAD: Golm

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(E): PAIS: Alemania

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(F): NUMERO DE CÓDIGO POSTAL: 14476

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(ii): DENOMINACION DEL INVENTO: Plantas, que sintetizan un almidón modificado, procedimiento para su producción así como el almidón modificado

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(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 4

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(iv): REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A): SOPORTE DE DATOS: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release N1 1.0, Versión N1 1.30 (EPA)

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(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID N: 1

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 4856 pares de bases

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(B): TIPO: Nucleótido

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(C): FORMA DE CADENA: Cadena única

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(D): TOPOLOGIA: Lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

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(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Solanum tuberosum

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(B): CEPA: C.V. Berolina

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): SITUACION: 105 ... 4497

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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1

2

3

4

5

6

7

8

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(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1464 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

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(C): TOPOLOGIA: Lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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9

10

11

12

13

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(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1.918 pares de bases

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(B): TIPO: Nucleótido

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(C): FORMA DE CADENA: Cadena única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Solanum tuberosum

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(B): CEPA: C.V. Désirée

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): SITUACION: 1 ... 1555

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(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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14

15

16

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(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 518 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: Lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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17

18

19

Claims

1. Molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células, seleccionado entre el conjunto que consiste en:

(a): moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos indicada bajo Seq ID No: 2;

(b): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo Seq ID No: 1;

(c): moléculas de ácidos nucleicos, que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico mencionadas bajo (a) o (b);

(d): moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con (c), efectuándose la hibridación en condiciones rigurosas;

(e): moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia es idéntica en por lo menos un 60% con la región codificadora de la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO: 1; y

(f): fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas bajo (a) hasta (d), poseyendo los fragmentos una longitud suficiente como para codificar una proteína que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, y cuya disminución en células de plantas conduce a la síntesis de un almidón con un contenido reducido de fosfato, o que al realizar una expresión en E. coli conduce a una fosforilación del glicógeno sintetizado en las células.

2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1(e), siendo la identidad entre secuencias por lo menos de un 80%.

3. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, siendo la identidad entre secuencias superior a un 90%.

4. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector de acuerdo con la reivindicación 4, estando la molécula de ácido nucleico unida con elementos reguladores que garantizan la transcripción en células eucarióticas o procarióticas.

6. Célula anfitriona, que ha sido modificada genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.

7. Célula de planta transgénica transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que está unida con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas.

8. Planta transgénica que contiene células de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Material de reproducción de plantas de acuerdo con la reivindicación 8, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 7.

10. Procedimiento para la preparación de una proteína, que se presenta en células de plantas tanto unida a granos de almidón como también en forma soluble, en el que una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 se cultiva en unas condiciones que permiten la expresión de la proteína, y la proteína se aísla a partir de las células y/o del medio de cultivo.

11. Proteína, que es codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, o que es obtenible mediante expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Anticuerpo, que reconoce específicamente a una proteína de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Molécula de ADN que codifica

(a): un ARN antisentido, que es complementario con transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3; o

(b): un ARN con actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3; o

(c): un ARN, que al realizar una expresión en una célula de planta, a causa de un efecto de cosupresión, conduce a la disminución de la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 y que tiene un alto grado de homología con transcritos de esta molécula de ácido nucleico, con la condición, de que la molécula de ADN no ha de ser la molécula ggctcagggg ggttattctg ctttacctag (los últimos 30 nucleótidos del octavo intrón del gen Hnf-1 procedente de una rata) o la molécula gccttgtgggaacacttgttagagttgggcaaa (región V rearreglada de la cadena TCR-gamma de un ser humano).

14. Vector que contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Vector de acuerdo con la reivindicación 14, realizándose que la molécula de ADN está combinada con elementos de ADN reguladores que garantizan la transcripción en células de plantas.

16. Célula anfitriona, que contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 13 o un vector de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15.

17. Célula de planta transgénica que contiene

(a): una molécula de ADN, que codifica un ARN antisentido, que es complementario con respecto a transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 y que inhibe en la célula la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3; o

(b): una molécula de ADN, que codifica un ARN con actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3; o

(c): una molécula de ADN, que codifica un ARN, que al realizar la expresión en una célula de planta, a causa de un efecto de cosupresión, conduce a la disminución de la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 y que tiene un alto grado de homología con transcritos de esta molécula de ácido nucleico,

: en combinación con elementos de ADN reguladores, que garantizan la transcripción en células de plantas.

18. Planta transgénica obtenible por regeneración de una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 17 y que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 17.

19. Molécula de ARN obtenible por transcripción de una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 13.

20. Material de reproducción de plantas de acuerdo con la reivindicación 18, que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 17.

21. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una planta de patata.

22. Tubérculo de una planta de patata de acuerdo con la reivindicación 21.

23. Tubérculo de acuerdo con la reivindicación 22, que en comparación con tubérculos de plantas de tipo salvaje presenta un endulzamiento en frío disminuido.

24. Utilización de un tubérculo de patata de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 para la producción de patatas fritas a la francesa o patatas fritas a la inglesa.

25. Utilización de una molécula de ADN que codifica un ARN antisentido, que es complementario con respecto al transcrito de una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 18.

26. Utilización de una molécula de ADN que codifica un ARN con actividad de ribozima, que disocia específicamente a transcritos de una molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 18.

27. Utilización de una molécula de ADN que codifica un ARN, que en el caso de la expresión en una célula de planta, a causa de un efecto de cosupresión, conduce a la disminución de la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, y que tiene un alto grado de homología con transcritos de esta molécula de ácido nucleico, para la producción de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 18.