ES2628436T3 - ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibición del gen de sacaropina deshidrogenasa - Google Patents

ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibición del gen de sacaropina deshidrogenasa Download PDF

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Abstract

Una molécula de ARNdc que comprende i) una primera cadena que comprende una secuencia idéntica a por lo menos 18 nucleótidos contiguos del gen de sacaropina deshidrogenasa de un hongo u oomiceto y ii) una segunda cadena que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a la primera cadena, en la que el gen de hongo u oomiceto se selecciona del grupo consistente en: a) un polinucleótido que comprende una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44; c) un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 90 %, todavía más preferentemente de al menos el 95 %, con un polinucleótido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 90 %, todavía más preferentemente de al menos el 95 %, con un polipéptido que tiene una secuencia como define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44; e) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43; y f) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con un polipéptido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.

Description

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DESCRIPCION
ARNi para el control de hongos y oomicetos por la inhibicion del gen de sacaropina deshidrogenasa
La presente invencion se refiere al control de patogenos y plagas de plantas, en particular hongos u oomicetos, mediante la inhibicion de una o multiples funciones biologicas, particularmente inhibiendo el gen fungico de sacaropina deshidrogenasa que interviene en la ruta de a-aminoadipato para la smtesis de lisina, y sus homologos de oomicetos, usando la interferencia de ARN.
La invencion proporciona procedimientos y composiciones que utilizan la interferencia de ARN de genes diana de hongos u oomicetos para lograr dicho control. La invencion tambien se dirige a procedimientos para convertir las plantas transgenicas en tolerantes a dichos hongos u oomicetos, asf como a plantas transgenicas y semillas generadas a partir de las mismas.
La tecnologfa usada en el contexto de la presente invencion es el ARN de interferencia o ARNi.
La expresion en un organismo de una secuencia homologa a un gen diana, capaz de inducir la formacion de un pequeno ARN de doble cadena (ARNdc) hace posible, de manera muy espedfica, extinguir este gen y observar el fenotipo resultante (Xiao y col., 2003).
El ARNdc desencadena la degradacion espedfica de un ARN homologo solamente en la region de identidad con el ARNdc (Zamore y col., 2000; Tang y col., 2003). El ARNdc es una molecula de ARN que contiene una secuencia bicatenaria, habitualmente de al menos 19 pares de bases (pb), que incluye una cadena con sentido y una cadena antisentido. Las moleculas de ARNdc se caracterizan tambien por un muy alto grado de complementariedad entre las dos cadenas complementarias de ARN. El ARNdc se degrada en fragmentos de ARN de, por lo general, 18 a 25 nucleotidos (ARN de interferencia pequeno [ARNip]) y los sitios de escision del ARN diana estan separados uniformemente por 18 a 25 nucleotidos. Los pequenos ARNip resultantes exhiben un grado de identidad muy alto con respecto al ARN diana; sin embargo, desajustes de 3 a 4 nucleotidos entre el ARNip y la porcion correspondiente del ARN diana hacen posible el funcionamiento del sistema (Tang y col., 2003). Por lo tanto, se ha sugerido que estos fragmentos de 18 a 25 nucleotidos constituyen grnas de ARN para el reconocimiento de la diana (Zamore y col., 2000). Estos ARN pequenos tambien se han detectado en extractos preparados a partir de celulas Schneider 2 de Drosophila melanogaster que habfan sido transfectadas con ARNdc antes de la lisis celular (Hammond y col., 2000). La funcion de grna de los fragmentos de 18 a 25 nucleotidos en la escision del ARNm viene avalada por la observacion de que estos fragmentos de 19 a 25 nucleotidos aislados de ARNdc pueden participar en la degradacion del ARNm (Zamore y col., 2000). Tambien se acumulan considerables moleculas homologas de ARN en los tejidos vegetales que estan sometidos al fenomeno PTGS (siglas en ingles de Silenciamiento Genico Postranscripcional, Hamilton y Baulcome, 1999). Estos pequenos ARN pueden regular la expresion genica a tres niveles diferentes:
- transcripcion (Silenciamiento Genico Transcripcional [TGS]),
- degradacion del ARN mensajero (Silenciamiento Genico Postranscripcional [PTGS]),
- ruta de miARN
- traduccion.
La regulacion que implica la degradacion del ARN mensajero parece existir en todos los eucariotas, si bien la regulacion a nivel transcripcional solo se ha descrito en mairnferos, plantas, drosofila y C. elegans. En lo que respecta a la regulacion de la traduccion, se ha caracterizado en C. elegans y drosofila y parece existir tambien en el marnffero (Hannon, 2002) y plantas (Ruiz Ferrer y Voinnet, 2009). En la bibliograffa, se hace referencia al ARNi, a PTGS, a la co-supresion o a la extincion (reservada para los hongos) cuando se trata este fenomeno, dependiendo de los organismos en los que se estudia.
De manera particular, el ARNi ha demostrado ser eficaz cuando se inyecta ARN de doble cadena (ARNdc) en el nematodo Caenorhabditis elegans (Fire y col. 1998; Montgomery y col., 1998; documento WO 99/32619). Tambien se ha observado inhibicion de la expresion de un gen diana de insecto cuando dicho insecto se alimenta con bacterias que expresan ARN pequenos de doble cadena, correspondientes al gen diana de dicho insecto (documento WO 01/37654).
Mas recientemente, se han dado a conocer composiciones farmaceuticas que comprenden ARNdc, que es sustancialmente complementario con al menos una parte de un gen del que se sospecha que este implicado en la infeccion por el virus del papiloma humano (HPV), junto con un vehnculo farmaceuticamente aceptable, para el tratamiento de dicha infeccion de HPV (documento WO 2009/0247607).
La introduccion del ARNdc se ha llevado a cabo en plantas, con el fin de inducir el silenciamiento de un gen diana endogeno (Hamilton y col., 1998, documento WO 99/15682), para inducir resistencia a virus de ARN a traves del uso de un transgen que expresa un ARNdc que posee una identidad sustancial con respecto a los genes vmcos (Waterhouse y col., 1998; Pandolfini y col., 2003, documentos WO 98/36083, WO 99/15682, US 5.175.102), pero tambien para inducir resistencia contra nematodos (Chuang y Meyerowitz, 2000, documento WO 01/96584) o, de manera alternativa, a la bacteria Agrobacterium (documento WO 00/26346, Escobar y col., 2001). Houmard Nancy M y col. (Plant Biotechnology Journal, 2007, 5, pag. 605-614) han desvelado maiz transformado con un constructo
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que codifica un ARNdc que se dirige a la lisina-cetoglutarato reductasa/sacaropina deshidrogenasa endogena bifuncional. Mas recientemente, se ha demostrado que las plantas que expresan ARNdc con una identidad sustancial frente a un gen fungico esencial para el crecimiento del hongo, o para su patogenicidad, puede inducir tambien resistencia contra ese hongo (documento WO 05/071091).
Sin embargo, desde esa epoca solo se dispone de unos pocos resultados preliminares y no existe ningun ejemplo comercial de la resistencia o tolerancia mediada por ARNi frente a los hongos fitopatogenos, en los que se expresan moleculas de ARN de doble cadena (ARNdc) o de ARN de interferencia pequeno (ARNip) en la planta, o que se apliquen como parte de una composicion externa a la semilla, la planta o al fruto de la planta, al suelo o a un sustrato inerte en el que crece o se desea que crezca la planta.
Entre otras, una dificultad es encontrar un gen diana apropiado, cuya inhibicion mediante ARNdc o ARNip induzca un buen grado de tolerancia a los hongos, hasta alcanzar un nivel adecuado para el uso comercial, sin que se produzcan efectos perjudiciales en la planta que expresa dicho ARNdc o ARNip, o sobre la que se aplique una composicion que comprenda dichos ARNdc o ARNip.
En su tesis doctoral, C. Starkel [“Host induced gene silencing - strategies for the improvement of resistance against Cercospora beticola in sugar beet (B. vulgaris L.) and against Fusarium graminearum in wheat (T. aestivum L.) and maize (Z. mays L.)”, defendida en junio de 2011], intento inhibir el crecimiento de Fusarium graminearum mediante la transformacion del trigo con construcciones silenciadoras que tienen como diana el gen de la homoaconitasa, un gen esencial en la ruta de la biosmtesis de lisina. No obstante, no fue posible generar plantas de trigo transgenico. Ademas, tambien fracaso el intento de eliminar o silenciar el gen de la homoaconitasa en Fusarium graminearum por la transformacion del hongo con una construccion disenada para el silenciamiento inducible del gen de la homoaconitasa.
Los presentes inventores han demostrado sorprendentemente que la inhibicion del gen de la sacaropina deshidrogenasa de hongos u oomicetos, que participa en la ruta del a-aminoadipato (AAA), mediante la metodologfa ARNi, provoca el cese de infeccion, crecimiento, desarrollo, reproduccion y/o patogenicidad y termina finalmente en la muerte del organismo.
Esta nueva diana para la tecnologfa ARNi es particularmente apropiada, considerando que la ruta AAA se encuentra de forma espedfica en algunos patogenos vegetales que incluyen hongos superiores, y no en plantas, humanos y animales.
Entre los 20 aminoacidos proteinogenicos comunes, la L-lisina es el unico del que se sabe que posee una ruta biosintetica que difiere en plantas y en hongos superiores. En plantas y bacterias, la L-lisina se obtiene a traves de la ruta del diaminopimelato (DAP). En hongos superiores y euglenoides, la L-lisina se obtiene a traves de la ruta del a- aminoadipato (AAA). La Sacaropina deshidrogenasa, la homocitrato sintasa, la homoaconitasa, la homoisocitrato deshidrogenasa, la a-aminoadipato aminotransferasa, la a-aminoadipato reductasa y la sacaropina reductasa son enzimas que intervienen en la ruta del a-aminoadipato para la biosmtesis de L-lisina.
Ninguna de las enzimas implicadas en estas dos rutas diferentes (rutas DAP y AAA) es comun (Xu y col., 2006, Bhattacharjee, J. K., 1985; Bhattacharjee, J. K., 1992; Vogel, H. J., 1965). Por ejemplo, la sacaropina deshidrogenasa fungica esta implicada en la biosmtesis de lisina, cuando la lisina-cetoglutarato de la planta, denominada en ocasiones tambien sacaropina deshidrogenasa, es responsable del catabolismo de la lisina (Houmard y col., 2007). En el ser humano y en animales, la L-lisina es un aminoacido esencial que solo se puede obtener a partir de protemas de la dieta. Adicionalmente, las enzimas que intervienen en la ruta AAA fungica son exclusivas para la smtesis de lisina (Umbargar, H. E., 1978; Bhattacharjee, J. K., 1992).
La presencia de una ruta espedfica de a-aminoadipato (AAA) en hongos superiores, que no se encuentra presente en plantas, humanos ni animales, conduce a considerar que las enzimas que participan en dicha ruta AAA constituyen dianas especialmente atractivas para el control de los patogenos vegetales, en particular de los patogenos fungicos.
De manera interesante, aunque se ha informado de que la lisina se sintetiza en oomicetos a traves de la ruta diaminopimelica (Born y Blanchard, 1999), se han hallado en oomicetos genes homologos a los genes de hongos de la ruta AAA, lo que podna indicar que ambas rutas podnan encontrarse presentes en los oomicetos. Los inventores han demostrado que el ARNdc contra el gen de la sacaropina deshidrogenasa del oomiceto reduce sustancialmente el crecimiento de dicho oomiceto, y que las plantas que expresan ARNdc contra los genes de sacaropina deshidrogenasa de oomiceto podnan ser menos susceptibles a la infeccion por dichos oomicetos.
La presencia de la ruta AAA para la biosmtesis de lisina se ha demostrado y estudiado, por ejemplo, en Saccharomyces cerevisiae (Broquist, H. P., 1971, Bhattacharjee, J. K., 1992), en el hongo patogeno para humanos Candida albicans (Garrad, R. C. y Bhattacharjee, J. K., 1992), y en el patogeno vegetal Magnaporthe grisea (Umbargar, H. E., 1978). Las enzimas sacaropina deshidrogenasa implicadas en la ruta AAA se han estudiado ampliamente y se han comparado en diferentes organismos, y el experto en la materia conoce bien sus caractensticas tecnicas, incluidas sus secuencias de nucleotidos y aminoacidos, la cinetica, especificidad de sustrato, funcion, estructura 3D, asf como la forma de purificarlas y caracterizarlas (vease Xu y col., 2001, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia). En bases de datos de acceso publico tales como genBank se describen y estan disponibles numerosos genes de diferentes hongos u oomicetos, asf como sus datos de secuencia.
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Randall, T.A. y col. (2005) informan de una lista de genes de la ruta AAA del oomiceto Phytophthora infestans, identificado por sus numeros de acceso y los datos de secuencia de los mismos, que se incorporan en el presente documento como referencia, y que se encuentran disponibles en base o bases de datos de acceso publico (Randall, T.A., 2005, MPMI, 18, 229-243; vease, en especial, la tabla 8, pag. 239).
En una realizacion, la presente invencion proporciona una molecula de ARNdc que comprende 1) una primera cadena, que comprende una secuencia sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos de un gen de hongo u oomiceto, y 2) una segunda cadena que comprende una secuencia sustancialmente complementaria con la primera cadena, en donde dicho gen de hongo u oomiceto es un gen de sacaropina deshidrogenasa.
Como se usa en el presente documento, "ARNi" o "ARN de interferencia" hace referencia al procedimiento de silenciamiento genico espedfico para secuencias, mediado por ARN de doble cadena (ARNdc). Como se usa en el presente documento, "ARNdc” o “molecula de ARNdc” hace referencia a ARN que muestra parcial o totalmente una doble cadena. El ARN de doble cadena tambien se designa ARN de interferencia pequeno o corto (ARNip), acido nucleico de interferencia corto (ANic), ARN de interferencia corto, micro-ARN (miARN), ARN de interferencia circular (ARNic), ARN "en horquilla" corto (ARNhc) y similares.
Como se usa en el presente documento, y teniendo en consideracion la sustitucion de timina por uracilo durante la comparacion de secuencias de ARN y ADN, la expresion "sustancialmente identico" o “esencialmente homologo” aplicado al ARNdc significa que la secuencia de nucleotidos de una cadena del ARNdc es identica en al menos aproximadamente el 80 %, al menos el 85 %, a 18 o mas nucleotidos contiguos del gen diana, mas preferentemente identica en al menos aproximadamente el 90 % a 18 o mas nucleotidos contiguos del gen diana y, de forma especialmente preferida, identica en al menos aproximadamente el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % o absolutamente identica a 18 o mas nucleotidos contiguos del gen diana. 18 o mas nucleotidos significa una porcion que tiene al menos aproximadamente 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, o 2000 bases consecutivas, o hasta la longitud total del gen diana.
Como se usa en el presente documento, polinucleotidos "complementarios" son aquellos que son capaces de un apareamiento de bases segun las reglas convencionales de complementariedad de Watson-Crick. De manera espedfica, las purinas se aparearan con bases de pirimidina para formar una combinacion de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T), en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleotidos pueden hibridar entre sf aun cuando no sean totalmente complementarios, con la condicion de que cada uno de ellos tenga al menos una region que sea sustancialmente complementaria con la otra. Como se usa en el presente documento, la expresion "sustancialmente complementario" significa que dos secuencias de acidos nucleicos son complementarias a lo largo de al menos 80 % de sus nucleotidos. Preferentemente, las dos secuencias de acidos nucleicos son complementarias a lo largo de al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de todos sus nucleotidos. De forma alternativa, "sustancialmente complementario" significa que dos secuencias de acidos nucleicos pueden hibridar bajo condiciones muy rigurosas. Como se usa en el presente documento, la expresion "sustancialmente identico" o "correspondiente a" significa que dos secuencias de acidos nucleicos tienen una identidad de secuencia de al menos 80 %. Preferentemente, las dos secuencias de acidos nucleicos tienen una identidad de secuencia de al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
Tambien como se usa en el presente documento, las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" hacen referencia a ARN o ADN que es lineal o ramificado, de cadena sencilla o doble, o a un dbrido de los mismos. La expresion abarca tambien fnbridos de ARN/ADN. Cuando se produce ARNdc de forma sintetica, se pueden usar tambien bases menos frecuentes tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras para el apareamiento antisentido de ARNdc y el apareamiento de ribozima. Por ejemplo, se ha demostrado que los polinucleotidos que contienen analogos C-5 propina de uridina y citidina se unen al ARN con mayor afinidad, y son potentes inhibidores del antisentido de la expresion genica. Asimismo, se pueden efectuar otras modificaciones del esqueleto de enlaces fosfodiester, acido nucleico bloqueado, o el resto 2'-hidroxi en el grupo de azucar ribosa del ARN.
De acuerdo con la invencion, la primera y la segunda cadenas pueden tener tamanos identicos. De manera alternativa, el tamano de la primera cadena puede ser mayor que el de la segunda cadena. Por ejemplo, el tamano de la primera cadena puede ser aproximadamente 200 nucleotidos mayor que el tamano de la segunda cadena. En otro aspecto de la invencion, el tamano de la segunda cadena es mayor que el de la primera cadena.
De acuerdo con la invencion, la molecula de ARNdc comprende una primera cadena que comprende una secuencia sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos de un gen de sacaropina deshidrogenasa de un hongo u oomiceto.
En una realizacion particular, la invencion proporciona una molecula de ARNdc que comprende 1) una primera cadena, que comprende una secuencia sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos de un gen de hongo u oomiceto, y ii) una segunda cadena que comprende una secuencia sustancialmente complementaria con la primera cadena, en donde dicho gen de hongo u oomiceto se selecciona de una lista
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consistente en.
a) un polinucleotido que comprende una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43;
b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
c) un polinucleotido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, mas preferentemente de al menos 90%, todavfa mas preferentemente de al menos un 95 %, con un polinucleotido que tiene una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43;
d) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, preferentemente de al menos 80%, mas preferentemente de al menos 90%, todavfa mas preferentemente de al menos 95%, con un polipeptido que tiene una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
e) un polinucleotido que hibrida bajo condiciones rigurosas con un polinucleotido que tiene una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43;
y
f) un polinucleotido que hibrida bajo condiciones rigurosas con un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con un polipeptido que tiene una secuencia como la que se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.
De acuerdo con la presente invencion, el termino "identidad" debe entenderse que significa el numero de aminoacidos/nucleotidos que se corresponden con los aminoacidos/nucleotidos de otra protema u otro acido nucleico, expresado en porcentaje. La identidad se determina, preferentemente, comparando la SEC ID descrita en el presente documento con otra protema/acido nucleico, con ayuda de programas informaticos. Si las secuencias que se comparan entre sf tienen longitudes diferentes, la identidad se determina de manera que el numero de aminoacidos, que tienen la secuencia mas corta en comun con la secuencia mas larga, determina el cociente del porcentaje de la identidad. Preferentemente, la identidad se determina por medio del programa informatico ClustalW, que es bien conocido y esta disponible para uso publico (Thompson y col., 1994). ClustalW se encuentra disponible para el uso publico en

http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalW2/index.html.
Preferentemente, se utiliza la Version 2.1 del programa informatico ClustalW para determinar la identidad entre protemas segun la invencion y otras protemas. Para llevar esto a cabo, deben ajustarse los parametros siguientes: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0,05,
GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
Preferentemente, se utiliza la Version 2.1 del programa informatico ClustalW para determinar la identidad entre la secuencia de nucleotidos de las moleculas de acido nucleico segun la invencion, por ejemplo, y la secuencia de nucleotidos de otras moleculas de acidos nucleicos. Para llevar esto a cabo, deben ajustarse los parametros siguientes:
KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: sin ponderar.
De acuerdo con la presente invencion, la expresion “hibridar en condiciones rigurosas” hace referencia a secuencias de polinucleotidos o acidos nucleicos que hibridan con una secuencia de acidos nucleicos de referencia a un nivel significativamente mayor que el ruido de fondo. El ruido de fondo puede relacionarse con la hibridacion de otras secuencias de ADN presentes, en particular de otros ADNc presentes en un banco de ADNc. El nivel de la senal generada por la interaccion entre la secuencia capaz de hibridar de forma selectiva y las secuencias definidas por las SEC ID anteriores segun la invencion es generalmente 10 veces, preferentemente 100 veces mas intensa que aquella de la interaccion de las otras secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. El nivel de interaccion puede medirse, por ejemplo, marcando la sonda con elementos radioactivos, tal como 32P. La hibridacion selectiva se obtiene generalmente usando condiciones del medio muy rigurosas (por ejemplo NaCl 0,03 M y citrato sodico 0,03 M a aproximadamente 50 °C-60 °C). La hibridacion puede llevarse a cabo, por supuesto, segun los procedimientos normales del estado de la tecnica (en particular Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion)
En una realizacion particular de la invencion, la molecula de ARNdc se aplica sobre el patogeno vegetal, en especial hongos u oomicetos, y/o sobre la planta o cosecha que se desea proteger. Por lo tanto, la presente invencion se refiere tambien a una composicion que comprende una cantidad efectiva y no fitotoxica de una molecula de ARNdc, segun se define en el presente documento.
Las moleculas de ARNdc segun la invencion pueden producirse por smtesis qmmica clasica, por medio de una transcripcion in vitro, o se pueden producir en organismos tales como celulas animales, bacterias, levaduras, o plantas por expresion heterologa (Aalto A.P. y col, 2007 RNA, 13(3):422-9.)
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un microorganismo que produce una molecula de ARNdc segun se define en el presente documento.
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La presente invencion se refiere tambien a una construccion genetica que comprende al menos una secuencia de ADN, asf como elemento o elementos heterologos de regulacion en las posiciones 5' y, opcionalmente, 3', caracterizada por que la secuencia de ADN es capaz de formar una molecula de ARNdc, segun se define en el presente documento. La presente invencion tambien se refiere a un vector de clonacion y/o expresion, caracterizado por que contiene al menos una construccion genetica segun se define en el presente documento.
La expresion “cantidad eficaz y no fitotoxica” se refiere a una cantidad de composicion de acuerdo con la invencion que es suficiente para luchar contra, o destruir el patogeno presente o que puede aparecer en los cultivos, y que no comporta ningun smtoma apreciable de fitotoxicidad para dichos cultivos. Dicha cantidad puede variar dentro de un amplio intervalo, dependiendo del patogeno que se va a controlar, del tipo de cultivo, de las condiciones climaticas y de los compuestos incluidos en la composicion segun la invencion. Esta cantidad se puede determinar por ensayos de campo sistematicos, que estan dentro de las capacidades de un experto en la materia.
Asf, de acuerdo la presente invencion, se proporciona una composicion que comprende, como ingrediente activo, una cantidad efectiva de una molecula de ARNdc, como se define en el presente documento, y un soporte, vehuculo, carga y/o tensioactivo aceptable desde el punto de vista agncola.
Segun la invencion, el termino “soporte” se refiere a un compuesto organico o inorganico, natural o sintetico, con el que se combina o asocia el compuesto activo de formula (I) para hacerlo mas facilmente aplicable, en particular a las partes de la planta. Asf, este soporte es generalmente inerte y debena ser aceptable desde el punto de vista agncola. El soporte puede ser un solido o un lfquido. Ejemplos de soportes adecuados incluyen arcillas, silicatos naturales o sinteticos, sflice, resinas, ceras, fertilizantes solidos, agua, alcoholes, en particular butanol, disolventes organicos, aceites minerales y vegetales y derivados de los mismos. Tambien se pueden utilizar mezclas de tales soportes.
La composicion de acuerdo con la invencion puede comprender tambien componentes adicionales tales como tensioactivos, coloides protectores, adhesivos, espesantes, agentes tixotropicos, agentes de penetracion, estabilizadores, agentes secuestrantes, pero sin estar limitados a ellos. Mas en general, los compuestos activos se pueden combinar con cualquier aditivo solido o lfquido que se adapte a las tecnicas convencionales de formulacion.
En general, la composicion de acuerdo con la invencion puede contener del 0,05 al 99 % en peso de compuesto activo, preferentemente, del 10 al 70 % en peso.
Las composiciones de acuerdo con la invencion se pueden utilizar en diversas formas, tales como: dispensador de aerosol, suspension en capsulas, concentrado para fumigacion en fno, polvo de espolvoreo, concentrado emulsionable, emulsion de aceite en agua, emulsion de agua en aceite, granulados encapsulados, granulados finos, concentrado fluido para el tratamiento de semillas, gas (a presion), producto generador de gas, granulados, concentrado para fumigacion en caliente, macrogranulados, microgranulados, polvo dispersable en aceite, concentrado fluido miscible en aceite, lfquido miscible en aceite, pasta, bastoncillos vegetales, polvo para tratamiento de semillas en seco, semillas recubiertas de pesticida, concentrado soluble, polvo soluble, disolucion para el tratamiento de semillas, concentrado en suspension (concentrado fluido), liquido en volumen ultrabajo (VUB), suspension en volumen ultrabajo (VUB), granulado o comprimidos dispersables en agua, polvo dispersable en agua para tratamiento en suspension, granulados o comprimidos solubles en agua, polvo soluble en agua para el tratamiento de semillas y polvo humectable. Estas composiciones incluyen no solo las composiciones que estan listas para ser aplicadas a la planta o semilla que se va a tratar por medio de un dispositivo adecuado, tal como un dispositivo de atomizacion o de pulverizacion, sino tambien las composiciones comerciales concentradas que deben diluirse antes de la aplicacion al cultivo.
Los compuestos de acuerdo con la invencion pueden estar tambien mezclados con uno o multiples compuestos fitofarmaceuticos o promotores del crecimiento vegetal tales como un fungicida, herbicida, insecticida, nematicida, acaricida, molusquicida, inductor de resistencia, protectores, compuestos senalizadores, sustancias biologicas, sustancia activa de feromonas u otros compuestos con actividad biologica. Las mezclas asf obtenidas tienen un espectro de actividad mas amplio. Las mezclas con otros compuestos fungicidas son particularmente ventajosas.
En una realizacion particular de la invencion, el ARNdc se introduce o se produce en el interior de la planta que se desea proteger. Despues de la introduccion o produccion dentro de la planta, el ARNdc puede someterse a procesamiento ulterior para formar fragmentos relativamente pequenos (ARNip) y, subsiguientemente, pueden distribuirse por toda la planta. De forma alternativa, el ARNdc se introduce o produce en la planta usando un elemento regulador o promotor que da como resultado la expresion del ARNdc en un tejido, de manera temporal, espacial o inducible, y adicionalmente puede ser procesado por una celula vegetal que contiene los elementos de procesamiento de ARNi para formar fragmentos relativamente pequenos.
Por lo tanto, la invencion se refiere a una construccion genetica o gen quimerico que es capaz de producir el ARNdc de la invencion en el interior de una celula vegetal. Dicha construccion genetica o gen quimerico comprende al menos una secuencia de ADN, asf como elemento o elementos heterologos de regulacion en las posiciones 5' y, opcionalmente, 3', que tienen la capacidad de funcionar en una planta, caracterizado por que la secuencia o secuencias de ADN son capaces de formar una molecula de ARNdc como se define en el presente documento
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cuando se expresan en la planta.
En una realizacion particular, la construccion genetica o gen quimerico comprende:
- una secuencia reguladora promotora que es funcional en celulas vegetales, que esta unida operativamente a
- una secuencia de ADN que, cuando se transcribe, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia con sentido y una secuencia antisentido, que son al menos parcialmente complementarias, en donde dicha secuencia con sentido comprende una secuencia sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos de un gen diana (es decir, en el contexto de la invencion, un gen de sacaropina deshidrogenasa), y dicha secuencia antisentido comprende una secuencia sustancialmente complementaria con la secuencia con sentido, y
- opcionalmente, una secuencia reguladora terminadora.
En dicha realizacion, la secuencia de ADN segun la invencion puede tener mas de un aspecto, en particular, dos; en el primero, comprende dos secuencias de nucleotidos, que son con sentido y antisentido, separadas por una secuencia de nucleotido espaciador o un intron que no muestra ninguna homologfa con el gen diana. La secuencia clonada en la orientacion con sentido y antisentido es aquella cuya expresion se intenta inhibir en el patogeno. De esta forma, la transcripcion de esta secuencia de ADN proporciona un ARN de cadena sencilla y gran tamano, correspondiente a la construccion con sentido/espaciador-intron/antisentido. Este largo transcripto de ARN se puede detectar por RT-PCR. Puesto que las secuencias con sentido y antisentido son homologas, se aparearan y el espaciador o intron que las separa desempenara la funcion de asa para el pliegue. Se obtiene, entonces, un ARNdc sobre la totalidad de las regiones homologas. Subsiguientemente, el ARNdc se degrada de manera espedfica mediante un complejo enzimatico denominado “DICER”. La degradacion del ARNdc forma entonces ARNip (“siRNA” en la figura), es decir, ARN de doble cadena y pequeno tamano de entre 19 y 25 bases. Entonces, estos son los ARNip que, mediante apareamiento con los aRn transcritos, derivados del gen diana, conduciran a su degradacion a traves del sistema enzimatico de silenciamiento del ARN.
En el segundo aspecto, la secuencia de ADN comprende dos secuencias de nucleotidos, que son con sentido y antisentido, de diferentes tamanos, en donde la estructura de asa corresponde a la parte de la secuencia de nucleotidos que no exhibe ninguna homologfa con la otra secuencia de nucleotidos. La secuencia de nucleotidos clonada en orientacion con sentido es esencialmente homologa con la secuencia del gen diana cuya expresion se intenta inhibir. La secuencia de nucleotidos antisentido es esencialmente homologa con la cadena complementaria de la secuencia de dicho gen diana. De esta forma, la transcripcion de esta secuencia de ADN proporciona un ARN de cadena sencilla y gran tamano, correspondiente a la construccion con sentido/antisentido. Este largo transcripto de ARN se puede detectar por RT-PCR. Las secuencias con sentido/antisentido homologas se aparean. Se obtiene, entonces, un ARNdc sobre la totalidad de las regiones homologas. Subsiguientemente, el ARNdc se degrada de manera espedfica mediante un complejo enzimatico denominado “DICER”. La degradacion del ARNdc forma entonces ARNip (“siRNA” en la figura), es decir, ARN de doble cadena y pequeno tamano de entre 18 y 25 bases. Entonces, estos son los ARNip que, mediante apareamiento con los ARn diana conduciran a su degradacion a traves del sistema enzimatico de silenciamiento del ARN de la planta.
En otra realizacion particular, la construccion genetica comprende:
- dos secuencias reguladoras promotoras que son funcionales en las celulas vegetales, en las que la primera
secuencia reguladora promotora esta unida operativamente con una secuencia de ADN que, cuando se
transcribe, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia con sentido, y la segunda
secuencia reguladora promotora esta unida operativamente con una secuencia de ADN que, cuando se
transcribe, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia antisentido, parcialmente
complementaria con la secuencia con sentido, y en donde dicha secuencia con sentido comprende una secuencia sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos del gen diana, y
- opcionalmente, secuencia o secuencias reguladoras de terminacion.
En esta realizacion particular, la construccion genetica puede estar formada como dos genes quimericos, en la que uno de ellos comprende la primera secuencia reguladora promotora, unida operativamente a la primera secuencia de ADN que, cuando se transcribe, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia con sentido sustancialmente identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos del gen diana, y opcionalmente una secuencia reguladora de terminacion, y el segundo gen quimerico comprende la segunda secuencia reguladora promotora, unida operativamente a la segunda secuencia de ADN que, cuando se transcribe, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia antisentido parcialmente complementaria con la secuencia con sentido, y opcionalmente una secuencia reguladora de terminacion.
Estos dos genes quimericos se introducen preferentemente en la celula vegetal de manera conjunta, aunque no necesariamente, con el fin de favorecer la hibridacion de las dos cadenas sencillas de ARN para formar el ARNdc.
De manera alternativa, la construccion genetica puede estar formada como una construccion que comprende:
- un primer promotor, unido operativamente a
- una secuencia de ADN de doble cadena, en donde una cadena, cuando se transcribe bajo el control del primer promotor, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia con sentido, sustancialmente
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identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos del gen diana y, opcionalmente, una secuencia reguladora de terminacion, y en donde la segunda cadena, cuando se transcribe bajo el control del segundo promotor, genera una molecula de ARN que comprende al menos una secuencia antisentido, parcialmente complementaria a la secuencia con sentido y, opcionalmente, una secuencia reguladora de terminacion, y - un segundo promotor, en direccion opuesta al primero.
La primera y segunda secuencias reguladoras promotoras pueden ser diferentes o identicas, preferentemente diferentes.
La invencion se refiere ademas a un vector de clonacion y/o expresion para transformar una planta, caracterizado por que contiene al menos un gen quimerico o construccion genetica segun se ha definido en el presente documento.
La presente invencion se refiere, ademas, a una celula vegetal transgenica que contiene la molecula de ARNdc de la invencion y como se ha definido en el presente documento.
La presente invencion se refiere, por lo tanto, a una celula vegetal transgenica que contiene la construccion genetica o gen quimerico de la invencion, que se ha definido en el presente documento.
En una realizacion particular de la invencion, la celula vegetal transgenica es una celula vegetal de soja, oleaginosa, arroz o patata.
La presente invencion se refiere, adicionalmente, a una planta, semilla transgenica, o a una parte de la misma, que comprende una celula vegetal transgenica segun la invencion.
En una realizacion particular de la invencion, la planta o semilla transgenica, o parte de las mismas, es una planta o semilla de soja, oleaginosa, arroz o patata, o una parte de las mismas.
De acuerdo con la invencion, la expresion “gen quimerico” o “casete de expresion” se entiende que significa una secuencia de nucleotidos que comprende, funcionalmente enlazadas entre sf en la direccion de transcripcion, una secuencia reguladora promotora que es funcional en las plantas, una secuencia que codifica una protema o una cadena de ARN y, opcionalmente, un terminador que es funcional en las celulas vegetales. La expresion “gen quimerico” o “casete de expresion” se entiende que significa, en general, un gen para el que ciertos elementos no estan presentes en el gen natural, pero han sido sustituidos por elementos presentes en el gen natural o han sido anadidos.
De acuerdo con la invencion, las expresiones “gen quimerico” o “casete de expresion” pueden corresponder tambien al caso en el que todos los elementos del gen estan presentes en el gen natural y, alternativamente, el termino “gen” puede corresponder a un gen quimerico.
La expresion “gen quimerico” o “casete de expresion” puede corresponder, tambien, al caso en el que la secuencia que codifica una protema o una cadena de ARN no esta directamente ligada a un promotor, sino que forma parte, por ejemplo, de una estructura policistronica que comprende varias secuencias codificadoras bajo el control del mismo promotor. En ese caso, cada una de las secuencias codificadoras bajo el control del activador es designada como un “gen quimerico” o una “casete de expresion”.
De acuerdo con la invencion, la expresion "funcionalmente ligados entre sP' significa que dichos elementos del gen quimerico elemental estan ligados entre sf de tal manera que su funcion es coordinada y permite la expresion de la secuencia codificadora. A modo de ejemplo, un activador se liga funcionalmente a una secuencia codificadora cuando es capaz de asegurar la expresion de dicha secuencia codificadora. La estructura del gen quimerico de acuerdo con la invencion y el montaje de sus diversos elementos puede realizarse usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica, en particular las descritas en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edicion), Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La eleccion de los elementos reguladores que constituyen el gen quimerico depende esencialmente de la planta y del tipo de celula en el que debe funcionar, y los expertos en la tecnica pueden seleccionar elementos reguladores que sean funcionales en una planta determinada.
De acuerdo con la invencion, la expresion “secuencia reguladora promotora” se entiende que significa cualquier secuencia reguladora promotora de un gen que se expresa de forma natural en plantas, en particular un promotor que se expresa especialmente en las hojas de las plantas, por ejemplo, promotores designados como constitutivos de origen bacteriano, viral o vegetal, o tambien promotores designados como dependientes de la luz tales como los de un gen de una pequena subunidad de ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) de la planta, o cualquier promotor conocido apropiado que se pueda utilizar. Entre los promotores de origen vegetal, se mencionaran los promotores de histona tal como se describen en la solicitud EP 0 507 698, o el promotor de actina del arroz (documento US 5.641.876). Entre los promotores de un gen vmco de plantas, se mencionara el del virus del mosaico de la coliflor (CAMV 19S o 35S), o del virus del mosaico de la vena de la cassava (CsVMV: documento WO 97/48819) o el promotor del circovirus (documento AU 689 311). Tambien puede hacerse uso de una secuencia reguladora promotora espedfica para regiones o tejidos particulares de plantas y, de manera mas particular, promotores espedficos de semillas (Datla, R. y col., 1997, Biotechnology Ann. Rev., 3, 269-296), en especial, los promotores de napina (documento EP 255 378), faseolina, glutenina, heliantinina (documento WO 92/17580),
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albumina (documento WO 98/45460) y oleosina (documento WO 98/45461). Tambien se puede usar un promotor inducible, que se puede seleccionar convenientemente de los promotores de fenilalanina amonio liasa (PAL), de HMG-CoA reductasa (HMG), de quitinasas, de glucanasas, de inhibidores de proteinasa (PI), de genes de la familia PR1, de nopalina sintasa (nos) o del gen vspB (documento US 5.670.349), el promotor HMG2 (documento US 5.670.349), el promotor de beta-galactosidasa de manzana (ABG1) o el promotor de amino ciclopropano carboxilato sintasa de manzana (ACC sintasa) (documento WO 98/45445).
La expresion “secuencia reguladora de terminacion” pretende significar cualquier secuencia que sea funcional en celulas vegetales o plantas, y comprende tambien secuencias de poliadenilacion, tanto si son de origen bacteriano, por ejemplo los terminadores nos u ocs de Agrobacterium tumefaciens, de origen vmco, por ejemplo el terminador CaMV 35S, o de origen vegetal, por ejemplo un terminador histona tal como se describe en la solicitud EP 0 633 317.
La etapa de seleccion para identificar las celulas y/o plantas transformadas que tienen integrada la construccion de acuerdo con la invencion se puede llevar a cabo en virtud de la presencia de un gen de seleccion presente en la construccion segun la invencion, o en el plasmido utilizado para la transformacion de las celulas o de las plantas y que comprenden dicha construccion. El gen de seleccion puede estar en forma de un gen quimerico que comprende los elementos siguientes, unidos funcionalmente en la direccion de transcripcion: una secuencia reguladora promotora, que es funcional en celulas vegetales, una secuencia que codifica un marcador de seleccion, y una secuencia reguladora de terminacion que es funcional en celulas vegetales.
Entre los marcadores de seleccion que se pueden usar, cabe mencionar los marcadores que contienen genes de resistencia a los antibioticos tales como, por ejemplo, el gen de higromicina fosfotransferasa (Gritz y col., 1983, Gene 25: 179-188), el gen de neomicina fosfotransferasa II, que induce resistencia a la kanamicina (Wirtz y col., 1987, DNA, 6(3): 245-253), o el gen de aminoglucosido 3”- adeniltransferasa, pero tambien los marcadores que contienen genes para la tolerancia a herbicidas tales como el gen bar (White y col., NAR 18: 1062, 1990) para la tolerancia a bialafos, el gen EPSPS (documento US 5.188.642) para la tolerancia a glifosato, o el gen HPPD (documento WO 96/38567) para la tolerancia a los isoxazoles. Puede hacerse mencion tambien a genes que codifican enzimas facilmente identificables tales como la enzima GUS, la protema GFP o genes que codifican pigmentos o enzimas que regulan la produccion de pigmentos en las celulas transformadas. Dichos genes de marcador de seleccion se describen en particular en las solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 y WO 97/04103.
La presente invencion se refiere, ademas, a un procedimiento para producir una celula vegetal o una planta transgenica, capaces de expresar un ARNdc que inhibe un gen de sacaropina deshidrogenasa de hongo u oomiceto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de transformar una celula vegetal con un gen quimerico o una construccion genetica segun la invencion.
Adicionalmente, el procedimiento puede comprender la etapa de seleccionar la celula vegetal que se ha transformado.
En una realizacion particular de la invencion, la invencion se refiere a un procedimiento para producir una celula vegetal o una planta transgenica, capaces de expresar un ARNdc que inhibe el gen de sacaropina deshidrogenasa de hongo u oomiceto, en la que dicho procedimiento comprende las etapas de transformar una celula vegetal con un gen quimerico o una construccion genetica de acuerdo con la invencion, y en la que dicha celula vegetal es una celula de una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata, o dicha planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
La presente invencion tambien se refiere a las plantas transformadas o a parte de las mismas y a plantas o a partes de las mismas que se obtienen por cultivo y/o cruzamiento de las plantas regeneradas antedichas, y a las semillas de las plantas transformadas.
La presente invencion se refiere tambien a los productos finales tales como la harina, aceite o fibra que se obtienen de las plantas, partes de las mismas, o semillas de la invencion.
Para obtener las celulas o plantas transformadas de acuerdo con la invencion, los expertos en la materia pueden usar uno de los muchos procedimientos conocidos de transformacion.
Uno de estos procedimientos consiste en poner las celulas o tejidos de los organismos hospedadores a transformar en contacto con polietilenglicol (PEG) y los vectores de la invencion (Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier y Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). La electroporacion es otro procedimiento, que consiste en someter a las celulas o tejidos vegetales a transformar y los vectores de la invencion a un campo electrico (Andreason y Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa y Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Otro procedimiento consiste en inyectar directamente los vectores en las celulas vegetales o los tejidos vegetales por microinyeccion (Gordon y Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). Ventajosamente, puede usarse el procedimiento "biolfstico". Consiste en bombardear con partfculas las celulas o tejidos sobre los que se van a adsorber los vectores de la invencion (Bruce y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein y col., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; patente de EE.UU. Num. 4.945.050). Preferentemente, la transformacion de las celulas o tejidos vegetales pueden llevarse a cabo usando bacterias del genero Agrobacterium, preferentemente por infeccion de las celulas o tejidos de dichas plantas con A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173;
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Shaw y col, 1983 Gene 198323(3): 315-330) o A. rhizogenes (Bevan and Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357384; Tepfer y Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). Preferentemente, la transformacion de celulas o tejidos vegetales con Agrobacterium tumefaciens se lleva a cabo segun el protocolo descrito por Hiei y col., (1994, Plant J. 6(2): 271-282). Los expertos en la materia elegiran el procedimiento apropiado de acuerdo con la naturaleza de los organismos hospedadores a transformar.
Las plantas de acuerdo con la invencion contienen celulas vegetales transformadas tal como se ha definido anteriormente. De manera particular, las plantas transformadas pueden obtenerse por regeneracion de las celulas vegetales transformadas, descritas anteriormente. La regeneracion se obtiene por cualquier procedimiento apropiado, en funcion de la naturaleza de la especie.
La invencion comprende tambien partes de estas plantas y los descendientes de estas plantas. La expresion "parte de estas plantas" pretende indicar cualquier organo de estas plantas, aereos o subterraneos. Los organos aereos son los tallos, las hojas y las flores que comprenden los organos reproductores masculino y femenino. Los organos subterraneos son principalmente las rafces, pero tambien pueden ser tuberculos. El termino "descendientes" pretende indicar principalmente las semillas que contienen los embriones derivados de la reproduccion de estas plantas entre sf. Por extension, el termino "descendiente" se aplica a todas las semillas formadas en cada nueva generacion derivada de cruzamientos entre las plantas transformadas segun la invencion. Los descendientes y las semillas pueden obtenerse tambien por amplificacion vegetativa de dichas plantas transformadas. Las semillas segun la invencion pueden ser revestidas con una composicion agroqmmica que comprende al menos un producto activo que tiene una actividad seleccionada de entre las actividades fungicida, herbicida, insecticida, nematicida, bactericida o virucida.
La invencion se refiere, adicionalmente, a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, que comprende proporcionar a dicho patogeno una molecula de ARNdc segun la invencion y como se ha definido en el presente documento.
En una realizacion particular de la invencion, el procedimiento hace referencia a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, y comprende proporcionar a dicho patogeno un ARNdc de acuerdo con la invencion, tal como se define en el presente documento, o una composicion que comprenda dicho ARNdc, en la que dicho patogeno vegetal es Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Sclerotinia sclerotiorum o Phakopsora pachyrhizi.
En una realizacion particular de la invencion, el procedimiento hace referencia a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, y comprende proporcionar a dicho patogeno una molecula de ARNdc segun la invencion y como se ha definido en el presente documento, o una composicion que comprenda dicho ARNdc, en la que dicha planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
La invencion se refiere, ademas, a un procedimiento para controlar un patogeno de planta, cosecha o semilla, en particular un hongo o un oomiceto, caracterizado por que se aplica una cantidad agronomicamente eficaz y sustancialmente no fitotoxica de la molecula de ARNdc segun la invencion, o de una composicion segun la invencion, como tratamiento de semillas, aplicacion foliar, aplicacion en el tallo, aplicacion por empapamiento o goteo (quimigacion) a la semilla, la planta o al fruto de la planta, o al suelo o a un sustrato inerte (por ejemplo, sustratos inorganicos tales como arena, lana de roca, lana de vidrio; minerales expandidos como perlita, vermiculita, zeolita o arcilla expandida), piedra pomez, materiales piroclasticos o toba volcanica, sustratos organicos sinteticos (por ejemplo, poliuretano), sustratos organicos (por ejemplo, turba, compost, productos arboreos de desecho como fibra de coco, fibra de madera o astillas, tronco de arbol) o a un sustrato lfquido (por ejemplo, sistemas hidroponicos flotantes, tecnica de la pelfcula nutriente (NFT), aeroponicos) en el que la planta esta creciendo o en el que se desea que crezca.
Por consiguiente, la invencion se refiere a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, caracterizado por que se aplica una cantidad efectiva de una molecula de ARNdc segun la invencion, o una composicion segun la invencion al suelo donde crece o puede crecer la planta, a las hojas y/o a los frutos de plantas, o a las semillas de las plantas.
En una realizacion particular de la invencion, la invencion se refiere a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo u oomiceto, caracterizado por que se aplica una cantidad efectiva de una molecula de ARNdc segun la invencion, o una composicion segun la invencion al suelo donde crecen o pueden crecer las plantas, a las hojas y/o frutos de las plantas o a las semillas de las plantas, en donde dicho patogeno vegetal es Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Sclerotinia sclerotinium o Phakopsora pachyrhizi.
En una realizacion particular de la invencion, esta se refiere a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo u oomiceto, caracterizado por que se aplica una cantidad efectiva de una molecula de ARNdc segun la invencion, o una composicion segun la invencion al suelo donde crecen o pueden crecer las plantas, a las hojas y/o frutos de las plantas o a las semillas de las plantas, en donde dicha planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
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La expresion "se aplican a las plantas que se van a tratar" se comprende que quiere dedr, para los fines de la presente invencion, que la composicion plaguicida que es el objeto de la invencion puede aplicarse por medio de diversos procedimientos de tratamiento tales como:
• pulverizacion de las partes aereas de dichas plantas con un Kquido que comprende una de dichas composiciones,
• espolvoreado, incorporacion de granulos o polvos en el suelo, pulverizacion, alrededor de dichas plantas, y en el caso de los arboles, inyeccion o embadurnado,
• recubrimiento o recubrimiento pelicular de las semillas de dichas plantas con ayuda de una mezcla fitoprotectora que comprende una de dichas composiciones.
El procedimiento de acuerdo con la invencion puede ser un procedimiento de curacion, de prevencion o de erradicacion.
En este procedimiento, una composicion usada puede prepararse previamente mezclando dos o mas compuestos activos segun la invencion.
Segun una alternativa de tal procedimiento, tambien es posible aplicar de forma simultanea, sucesiva o por separado los compuestos (A) y (B) de manera que se tengan los efectos (A)/(B) conjugados de las distintas composiciones que contienen cada una uno de los dos o tres principios activos (A) o (B).
La dosis del compuesto activo de ARNdc aplicada habitualmente en el procedimiento de tratamiento segun la invencion es en general y ventajosamente
• para tratamiento de las hojas: de 0,0001 a 10.000 g/ha, preferentemente de 0,0001 a 1.000 g/ha, mas preferentemente de 0,001 a 300 g/ha; en caso de aplicacion por mojado o por goteo, la dosis puede incluso reducirse, especialmente mientras se usen sustratos inertes como lana mineral o perlita;
• para tratamiento de semillas: de 0,0001 a 200 g por 100 kilogramos de semillas, preferentemente de 0,001 a 150 g por 100 kilogramos de semillas;
• para tratamiento del suelo: de 0,0001 a 10.000 g/ha, preferentemente de 0,001 a 5.000 g/ha.
Cuando se mezcla el ARNdc de la invencion con otro compuesto fitofarmaceutico activo o un compuesto promotor del crecimiento vegetal, dicho compuesto fitofarmaceutico o promotor del crecimiento vegetal se utiliza en la dosis aplicada habitualmente. Dicho compuesto fitofarmaceutico o promotor del crecimiento vegetal puede ser un fungicida, herbicida, insecticida, nematicida, acaricida, molusquicida, inductor de resistencia, protectores, o compuestos senalizadores. La dosis de compuesto fitofarmaceutico activo aplicada normalmente en el procedimiento de tratamiento de acuerdo con la invencion esta general y ventajosamente entre 10 y 800 g/ha, preferentemente, entre 50 y 300 g/ha para aplicaciones en el tratamiento de las hojas. La dosis de sustancia activa aplicada esta general y ventajosamente entre 2 y 200 g por 100 kg de semillas, preferentemente entre 3 y 150 g por 100 kg de semillas en el caso del tratamiento de semillas.
Las dosis indicadas en la presente invencion se proporcionan como Ejemplos ilustrativos del procedimiento segun la invencion. Un experto en la materia sabra como adaptar la dosis de aplicacion, en particular segun la naturaleza de la planta o del cultivo a tratar. En condiciones espedficas, por ejemplo segun la naturaleza del patogeno, hongo fitopatogeno u oomiceto que se debe tratar o controlar, una dosis menor puede ofrecer una proteccion adecuada. Ciertas condiciones climaticas, resistencia u otros factores como la naturaleza del patogeno o el grado de infestacion, por ejemplo, de las plantas con estos patogenos, pueden requerir dosis mayores de ingredientes activos combinados. La dosis optima depende habitualmente de varios factores, por ejemplo, del tipo de patogeno que se ha de tratar, del tipo o nivel de desarrollo de la planta o material de la planta infestado, de la densidad de vegetacion o, alternativamente, del procedimiento de aplicacion.
Sin que sea una limitacion, el cultivo tratado con la composicion o combinacion plaguicida segun la invencion es, por ejemplo, la vid, cereales, verduras, alfalfa, soja, cultivos hortfcolas, cesped, madera, plantas arboreas u hortfcolas.
El procedimiento de tratamiento segun la invencion puede servir tambien para tratar material de propagacion tal como tuberculos o rizomas, asf como semillas, plantulas o siembras de plantulas y plantas o siembras de plantas. Este procedimiento de tratamiento tambien puede ser util para tratar rafces. El procedimiento de tratamiento segun la invencion puede ser util tambien para tratar las partes aereas de la planta tales como troncos, tallos, hojas, flores y frutos de la planta de referencia y, en general, cualquier material susceptible de sufrir una infeccion por hongos (por ejemplo, debido al almacenamiento, como en el caso del heno).
La invencion se refiere adicionalmente a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, que comprende proporcionar a la planta hospedadora de dicho patogeno vegetal una celula vegetal transformada segun la invencion.
La invencion se refiere adicionalmente a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, que comprende proporcionar a la planta hospedadora de dicho patogeno vegetal una celula vegetal transformada que contiene un ARNdc segun se ha definido en el presente documento.
La invencion se refiere adicionalmente a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, que comprende transformar la planta con una construccion genetica segun la invencion.
Adicionalmente, la invencion se refiere a un procedimiento para controlar un patogeno vegetal, en particular un hongo o un oomiceto, que comprende las etapas siguientes:
i) transformar una celula vegetal con un gen quimerico segun la invencion;
ii) situar las celulas transformadas de este modo bajo condiciones que permitan la transcripcion de dicha
5 construccion,
iii) hacer que las celulas entren en contacto con el patogeno.
En una realizacion particular de la invencion, los procedimientos segun la invencion controlan un patogeno vegetal seleccionado de Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Sderotinia sclerotinium o Phakopsora pachyrhizi.
En una realizacion particular de la invencion, los procedimientos segun la invencion controlan un patogeno vegetal, 10 en donde la planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
La invencion se refiere, adicionalmente, a un procedimiento para inhibir la expresion del gen de sacaropina deshidrogenasa de un patogeno vegetal, en particular un hongo u oomiceto, que comprende las etapas siguientes:
i) transformar una celula vegetal con un gen quimerico segun la invencion;
ii) situar las celulas transformadas de este modo en condiciones que permitan la transcripcion de dicha
15 construccion,
iii) hacer que las celulas entren en contacto con el patogeno.
En una realizacion particular de la invencion, el procedimiento segun la invencion consiste en inhibir un gen de sacaropina deshidrogenasa de hongo u oomiceto, en la que el hongo u oomiceto es Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Sderotinia sclerotinium o Phakopsora pachyrhizi.
20 En una realizacion particular de la invencion, el procedimiento segun la invencion inhibe un gen de sacaropina deshidrogenasa de hongo u oomiceto, en la que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:
i) transformar una celula vegetal con un gen quimerico segun la invencion;
ii) situar las celulas transformadas de este modo en condiciones que permitan la transcripcion de dicha construccion,
25 iii) hacer que las celulas entren en contacto con el patogeno;
en la que la planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
Segun la invencion, se pueden tratar todas las plantas y las partes de las plantas. Por plantas se entiende todas las plantas y poblaciones de plantas tales como plantas salvajes deseadas o no deseadas, plantas cultivadas y variedades de plantas (se puedan o no proteger por los derechos de variedades de plantas o del cultivador de 30 plantas). Las plantas cultivadas y las variedades de plantas pueden ser plantas obtenidas por propagacion convencional y procedimientos de cultivo que pueden ayudarse o estar complementados por uno o mas procedimientos biotecnologicos, tales como el uso de haploides dobles, fusion de protoplastos, mutagenesis aleatoria y dirigida, marcadores moleculares o geneticos o por procedimientos de bioingeniena e ingeniena genetica. Por partes de las plantas se entiende todas las partes y organos de las plantas por encima del suelo y por debajo del 35 suelo, tales como brotes, hojas, flores y rafces, de modo que tambien estan listados por ejemplo, las hojas, agujas, tallos, ramas, flores, esporoforos, frutos y semillas, asf como rafces, bulbos y rizomas. Los cultivos y el material de propagacion vegetativo y generativo, por ejemplo, esquejes, bulbos, rizomas, trepadoras y semillas, tambien pertenecen a las partes de las plantas.
Entre las plantas que se pueden proteger por el procedimiento segun la invencion, se pueden mencionar los cultivos 40 extensivos principales como el mafz, soja, algodon, semillas oleaginosas de Brassica tal como Brassica napus (p. ej. canola), Brassica rapa, B. juncea (por ejemplo, mostaza) y Brassica carinata, arroz, trigo, remolacha azucarera, cana de azucar, avena, centeno, cebada, mijo, triticale, lino, vid y diferentes frutas y verduras de diferentes taxones botanicos tales como Rosaceae sp. (por ejemplo, frutas de pepitas tales como manzanas y peras, pero tambien frutas con hueso tales como albaricoques, cerezas, almendras y melocotones, bayas tales como fresas), Ribesioidae 45 sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp., Actinidaceae
sp., Lauraceae sp.,
Musaceae sp. (por ejemplo, bananeros y plantaciones de bananas), Rubiaceae sp. (por ejemplo, cafe), Theaceae sp., Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (por ejemplo, limones, naranjas y pomelos); Solanaceae sp. (por ejemplo, tomates, patatas, pimientos, berenjenas), Liliaceae sp., Compositiae sp. (por ejemplo, lechuga, alcachofa y achicoria 50 - incluyendo escarola, endivia o achicoria comun), Umbelliferae sp. (por ejemplo, zanahoria, perejil, apio y bulbo de
apio), Cucurbitaceae sp. (por ejemplo, pepino - incluyendo pepinillo, chayote, sandfa, calabazas y melones), Alliaceae sp. (por ejemplo, cebollas y puerros), Cruciferae sp. (por ejemplo, repollo, lombarda, brocoli, coliflor, coles de bruselas, pak choi, colirrabano, rabano, rabano picante, berro, col china), Leguminosae sp. (por ejemplo, cacahuetes, guisantes y judfas - tales como judfas trepadoras y habas), Chenopodiaceae sp. (por ejemplo, acelga, 55 espinaca remolacha, espinaca, remolacha), Malvaceae (por ejemplo, quimbombo), Asparagaceae (por ejemplo, esparrago); cultivos hortfcolas y arboreos; plantas ornamentales; asf como los homologos geneticamente modificados de estos cultivos.
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El procedimiento de tratamiento de acuerdo con la invencion puede utilizarse en el tratamiento de organismos modificados geneticamente (OMG), por ejemplo, plantas o semillas. Las plantas modificadas geneticamente (o plantas transgenicas) son plantas en las que se ha integrado de manera estable un gen heterologo en el genoma. La expresion “gen heterologo” significa esencialmente un gen que se proporciona o construye fuera de la planta y que cuando se introduce en el genoma nuclear, cloroplastico o mitocondrial, proporciona a la planta transformada nuevas o mejoradas propiedades agronomicas u otras propiedades mediante la expresion de una protema o polipeptido de interes, o disminuyendo o silenciando otro gen o genes que estan presentes en la planta (usando, por ejemplo, tecnologfa antisentido, tecnologfa de co-supresion o tecnologfa de interferencia de ARN - ARNi). Un gen heterologo que esta localizado en el genoma tambien se denomina un transgen. Un transgen que esta definido por su particular localizacion en el genoma de la planta se denomina un evento de transformacion o transgenico.
Dependiendo de la especie vegetal o de la variedad de la planta cultivada, su localizacion y sus condiciones de crecimiento (suelos, clima, periodo de vegetacion, dieta), el tratamiento de acuerdo con la invencion tambien puede producir efectos superaditivos (“sinergicos”). Asf, por ejemplo, son posibles relaciones de aplicacion reducidas y/o una ampliacion del espectro de actividad y/o un incremento de la actividad de los compuestos y composiciones activos que pueden utilizarse segun la invencion, mejor crecimiento de la planta, tolerancia aumentada a temperaturas altas o bajas, tolerancia aumentada a la seqrna o al agua o al contenido en sal del suelo, floracion aumentada, recoleccion mas facil, maduracion acelerada, rendimientos de cosecha mayores, frutos mas grandes, mayor altura de la planta, color de la hoja mas verde, floracion temprana, mayor calidad y/o valor nutricional mas alto de los productos cosechados, mayor concentracion de azucar en los frutos, mejor estabilidad en el almacenamiento y/o procesabilidad de los productos cosechados, lo que supera los efectos que eran de esperar.
Con determinadas relaciones de aplicacion, las combinaciones del compuesto activo de acuerdo con la invencion tambien pueden tener un efecto reforzador en las plantas. Por consiguiente, tambien pueden ser adecuadas para movilizar el sistema de defensas de la planta frente al ataque de microorganismos indeseados. Esta puede ser, si resulta apropiado, una de las razones de la actividad aumentada de las combinaciones segun la invencion, por ejemplo, frente a hongos. Las sustancias fortificantes de plantas (que inducen resistencia) se entiende que, en el presente contexto, son aquellas sustancias o combinaciones de sustancias que son capaces de estimular el sistema de defensas de dichas plantas de forma que cuando, posteriormente, se inoculan microorganismos no deseados, las plantas tratadas presentan un grado de resistencia sustancial a esos microorganismos. En el presente caso, los microorganismos no deseados se entiende que son hongos fitopatogenos, bacterias y virus. Asf, las sustancias de acuerdo con la invencion pueden emplearse para proteger a las plantas frente al ataque de los patogenos mencionados anteriormente en un periodo de tiempo determinado despues del tratamiento. El periodo de tiempo en el que se produce la proteccion se extiende generalmente de 1 a 10 dfas, preferentemente de 1 a 7 dfas, despues del tratamiento de las plantas con los compuestos activos.
Como se ha mencionado ya anteriormente, es posible tratar todas las plantas y sus partes segun la invencion. En una realizacion preferida, se tratan las especies salvajes de plantas y las variedades de plantas cultivadas, o aquellas obtenidas mediante procedimientos de reproduccion biologica convencionales, tales como cruce o fusion de protoplastos, y tambien sus partes. En una realizacion adicional preferida, se tratan las plantas transgenicas y las variedades de plantas obtenidas por procedimientos de ingeniena genetica, si es apropiado en combinacion con procedimientos convencionales (organismos geneticamente modificados) y sus partes. Los terminos "partes", "partes de plantas" y "partes de planta" se han explicado anteriormente. De manera mas preferida, las plantas de los cultivos de plantas que estan en cada caso disponibles en el comercio o que se usan, se tratan segun la invencion. Debe entenderse que la expresion “cultivos de plantas” significa plantas que tienen propiedades nuevas (“rasgos”) y que se han obtenido por reproduccion convencional, por mutagenesis o por tecnicas de ADN recombinante. Pueden ser plantas cultivadas, variedades, bio- o genotipos.
El procedimiento de tratamiento de acuerdo con la invencion puede utilizarse en el tratamiento de organismos modificados geneticamente (OMG), por ejemplo, plantas o semillas. Las plantas modificadas geneticamente (o plantas transgenicas) son plantas en las que se ha integrado de manera estable un gen heterologo en el genoma. La expresion “gen heterologo” significa esencialmente un gen que se proporciona o construye fuera de la planta y que cuando se introduce en el genoma nuclear, cloroplastico o mitocondrial, proporciona a la planta transformada nuevas o mejoradas propiedades agronomicas u otras propiedades mediante la expresion de una protema o polipeptido de interes o disminuyendo o silenciando otro gen o genes que estan presentes en la planta (usando, por ejemplo, tecnologfa antisentido, tecnologfa de co-supresion, tecnologfa de interferencia de ARN - tecnologfa ARNi - o tecnologfa micro ARN - miARN). Un gen heterologo que esta localizado en el genoma tambien se denomina un transgen. Un transgen que esta definido por su particular localizacion en el genoma de la planta se denomina un evento de transformacion o transgenico.
Dependiendo de la especie de planta o de la variedad de la planta cultivada, su localizacion y sus condiciones de crecimiento (suelos, clima, periodo de vegetacion, dieta), el tratamiento de acuerdo con la invencion tambien puede producir efectos superaditivos (“sinergicos”). Asf, por ejemplo, son posibles relaciones de aplicacion reducidas y/o una ampliacion del espectro de actividad y/o un incremento de la actividad de los compuestos y composiciones activos que pueden utilizarse segun la invencion, mejor crecimiento de la planta, tolerancia aumentada a temperaturas altas o bajas, tolerancia aumentada a la seqrna o al agua o al contenido en sal del suelo, floracion aumentada, recoleccion mas facil, maduracion acelerada, rendimientos de cosecha mayores, frutos mas grandes, mayor altura de la planta, color de la hoja mas verde, floracion mas temprana, mayor calidad y/o valor nutricional
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Con determinadas relaciones de aplicacion, las combinaciones del compuesto activo de acuerdo con la invencion tambien pueden tener un efecto reforzador en las plantas. Por consiguiente, tambien pueden ser adecuadas para movilizar el sistema de defensas de la planta frente al ataque de microorganismos indeseados. Esta puede ser, si resulta apropiado, una de las razones de la actividad aumentada de las combinaciones de acuerdo con la invencion, por ejemplo, frente a hongos. Las sustancias fortificantes de plantas (que inducen resistencia) se entiende que, en el presente contexto, son aquellas sustancias o combinaciones de sustancias que son capaces de estimular el sistema de defensas de dichas plantas de forma que cuando posteriormente se inoculan microorganismos no deseados, las plantas tratadas presentan un grado de resistencia sustancial a esos microorganismos. En el presente caso, los microorganismos no deseados se entiende que son hongos, bacterias y virus fitopatogenos. Asf, las sustancias de acuerdo con la invencion pueden emplearse para proteger a las plantas frente al ataque de los patogenos mencionados anteriormente en un periodo de tiempo determinado despues del tratamiento. El periodo de tiempo en el que se produce la proteccion se extiende generalmente de 1 a 10 dfas, preferentemente de 1 a 7 dfas, despues del tratamiento de las plantas con los compuestos activos.
Las plantas y las variedades de plantas cultivadas que se tratan preferentemente de acuerdo con la invencion incluyen todas las plantas que tienen material genetico que proporciona caractensticas utiles particularmente ventajosas a estas plantas (ya sean obtenidas por reproduccion y/o por medios biotecnologicos).
Las plantas y las variedades de plantas cultivadas que preferentemente tambien se tratan de acuerdo con la invencion son resistentes frente a uno o mas estreses bioticos, es decir, dichas plantas muestran una mejor defensa frente a plagas animales y microbianas, tales como frente a nematodos, insectos, acaros, hongos, bacterias virus y/o viroides fitopatogenos.
Las plantas y las variedades de plantas cultivadas que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion son aquellas plantas que son resistentes a uno o mas estreses abioticos. Las condiciones de estres abiotico pueden incluir, por ejemplo, seqrna, exposicion a bajas temperaturas, exposicion al calor, estres osmotico, inundacion, aumento de la salinidad del suelo, de la exposicion a minerales, exposicion a ozono, exposicion a mucha luz, disponibilidad limitada de nutrientes nitrogenados, disponibilidad limitada de nutrientes de fosforo, falta de sombra.
Las plantas y las variedades de plantas cultivadas que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion, son aquellas plantas que se distinguen por unas caractensticas de rendimiento aumentadas. El rendimiento incrementado en dichas plantas puede ser el resultado, por ejemplo, de una mejora de la fisiologfa, crecimiento y desarrollo de la planta, tal como eficacia en el uso del agua, eficacia en la retencion del agua, utilizacion mejorada del nitrogeno, asimilacion aumentada del carbono, fotosmtesis mejorada, eficacia aumentada de la germinacion y maduracion acelerada. El rendimiento puede verse afectado ademas por una arquitectura mejorada de la planta (en condiciones de estres y sin estres), incluyendo, pero sin limitarse a floracion temprana, control de la floracion para la produccion de semillas tubridas, vigor de la siembra, tamano de la planta, numero y distancia de los entrenudos, crecimiento de la rafz, tamano de la semilla, tamano del fruto, tamano de la vaina, numero de vainas o espigas, numero de semillas por vaina o espiga, masa de semillas, relleno incrementado de las semillas, dispersion reducida de las semillas, dehiscencia reducida de la vaina y resistencia a la cafda. Las caractensticas de rendimiento adicionales incluyen composicion de las semillas, tales como contenido en carbohidratos, contenido en protemas, contenido en aceite y composicion del aceite, valor nutricional, reduccion de compuestos anti-nutricionales, procesabilidad mejorada y mejor estabilidad en el almacenamiento.
Las plantas que pueden tratarse segun la invencion son plantas tubridas que ya expresan la caractenstica de heterosis o vigor hfbrido que generalmente da como resultado un mayor rendimiento, vigor, salud y resistencia frente al estres biotico y abiotico. Dichas plantas se obtienen tfpicamente cruzando una lmea parental macho esteril endogamica (la hembra parental) con otra lmea parental macho fertil endogamica (el macho parental). La semilla hfbrida se cosecha tfpicamente a partir de las plantas macho esteriles y se vende a los cultivadores. Las plantas macho esteriles pueden producirse a veces (por ejemplo, en el mafz) por castracion, es decir, por la eliminacion mecanica de los organos reproductores masculinos (o flores macho) pero, tfpicamente, la esterilidad de los machos es el resultado de determinantes geneticos en el genoma de la planta. En este caso, y especialmente cuando la semilla es el producto deseado para cosecharse de las plantas hfbridas es tfpicamente util asegurarse de que se ha restaurado completamente la fertilidad de los machos en las plantas hfbridas. Esto puede conseguirse asegurando que los machos parentales tienen los genes de restauracion de la fertilidad apropiados que son capaces de restaurar la fertilidad de los machos en las plantas hfbridas que contienen los determinantes geneticos responsables de la esterilidad de los machos. Los determinantes geneticos para la esterilidad de los machos pueden estar localizados en el citoplasma. Los ejemplos de esterilidad citoplasmica de los machos (CMS) se describieron, por ejemplo, en especies de Brassica (documentos WO 92/05251, WO 95/09910, WO 98/27806, WO 05/002324, WO 06/021972 y US 6.229.072). Sin embargo, los determinantes geneticos para la esterilidad de los machos tambien pueden estar localizados en el genoma nuclear. Las plantas machos esteriles tambien pueden obtenerse mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica. Un medio particularmente util para obtener plantas machos esteriles se describe en el documento WO 89/10396 en el que, por ejemplo, una ribonucleasa tal como barnasa se expresa selectivamente en las celulas del tapetum en los estambres. La fertilidad puede restaurarse
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entonces mediante la expresion en las celulas del tapetum de un inhibidor de ribonucleasa tal como barstar (por ejemplo, documento WO 91/02069).
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (obtenidas mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que pueden tratarse de acuerdo con la invencion son plantas tolerantes a los herbicidas, es decir, plantas que se han hecho tolerantes a uno o mas herbicidas dados. Dichas plantas pueden obtenerse mediante transformacion genetica, o mediante seleccion de plantas que contienen una mutacion que proporciona dicha tolerancia a herbicidas.
Las plantas resistentes a herbicidas son, por ejemplo, plantas tolerantes a glifosato, es decir, plantas que se han hecho tolerantes al herbicida glifosato o a las sales del mismo. Las plantas pueden hacerse tolerantes a glifosato mediante diferentes medios. Por ejemplo, las plantas tolerantes a glifosato pueden obtenerse mediante la transformacion de la planta con un gen que codifica la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Los ejemplos de dichos genes de EPSPS son el gen AroA (mutante CT7) de la bacteria Salmonella typhimurium (Comai y col., Science 1983, 221, 370-371), el gen CP4 de la bacteria Agrobacterium sp. (Barry y col., Curr. Topics Plant Physiol. 1992, 7, 139-145), los genes que codifican una EPSPS de petunia (Shah y col., Science 1986, 233, 478481), una EPSPS de tomate (Gasser y col., J. Biol. Chem. 1988,263, 4280-4289), o una EPSPS de eleusina (documento WO 2001/66704). Tambien puede ser una EPSPS mutada como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0837944, wO 00/66746, WO 00/66747 o WO 02/26995. Las plantas tolerantes a glifosato tambien pueden obtenerse mediante la expresion de un gen que codifica una enzima glifosato oxido-reductasa como se describe en los documentos US 5.776.760 y US 5.463.175. Las plantas tolerantes a glifosato tambien pueden obtenerse mediante la expresion de un gen que codifica una enzima glifosato acetil transferasa como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 02/036782, WO 03/092360, WO 2005/012515 y WO 2007/024782. Las plantas tolerantes a glifosato tambien pueden obtenerse mediante la seleccion de plantas que contienen mutaciones naturales de los genes mencionados anteriormente, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 01/024615 o WO 03/013226.
Otras plantas resistentes a herbicidas son, por ejemplo, las plantas que se hacen tolerantes a herbicidas mediante la inhibicion de la enzima glutamina sintasa, tal como bialafos, fosfinotricina o glufosinato. Tales plantas se pueden obtener mediante expresion de una enzima que detoxifica el herbicida o una enzima glutamina sintasa mutante que es resistente a la inhibicion, descrita por ejemplo en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 11/760.602. Una de dichas enzimas detoxificantes eficaces es una enzima que codifica una fosfinotricin acetiltransferasa (tal como la protema bar o pat de especies de Streptomyces). Se describen plantas que expresan un fosfinotricin acetiltransferasa, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 5.273.894; 5.637.489; 5.276.268; 5.739.082; 5.908.810 y 7.112.665.
Las plantas tolerantes a herbicidas adicionales tambien son plantas que se hacen tolerantes a los herbicidas mediante la inhibicion de la enzima hidroxifenilpiruvato-dioxigenasa (HPPD). Las hidroxifenilpiruvato-dioxigenasas (HPPD) son enzimas que catalizan la reaccion en la que el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. Las plantas tolerantes a los inhibidores de HPPD se pueden transformar con un gen que codifica una enzima HPPD resistente natural, o un gen que codifica una enzima mutada o quimerica como se describe en los documentos de patente WO 96/38567, WO 99/24585, WO 99/24586, WO 09/144079, WO 02/046387, o US 6,768,044. La tolerancia a inhibidores de HPPD tambien puede obtenerse mediante la transformacion de plantas con genes que codifican determinadas enzimas que permiten la formacion de homogentisato a pesar de la inhibicion de la enzima HPPD nativa por el inhibidor de HPPd. Dichas plantas y genes se describen en los documentos WO 99/34008 y WO 02/36787. La tolerancia de las plantas a los inhibidores de HPPD tambien se puede mejorar transformando las plantas con un gen que codifica una enzima que tiene actividad prefenato deshidrogenasa (PDH) ademas de un gen que codifica una enzima tolerante a HPPD, como se describe en el documento de patente WO 04/024928. Ademas, las plantas se pueden hacer mas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD mediante adicion a su genoma de un gen que codifica una enzima capaz de metabolizar o degradar inhibidores de HPPD, tales como las enzimas CYP450 mostradas en los documentos de patente WO 2007/103567 y WO 2008/150473.
Aun mas, las plantas tolerantes a herbicidas son plantas que se hacen tolerantes a inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS). Los inhibidores de ALS conocidos incluyen, por ejemplo, los herbicidas de tipo sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidinas, pirimidiniloxi(tio)benzoatos, y/o sulfonilaminocarboniltriazolinona. Se sabe que diferentes mutaciones en la enzima ALS (tambien conocida como acetohidroxiacido sintasa, AHAS) confieren tolerancia a diferentes herbicidas y grupos de herbicidas, como se describe, por ejemplo, en Tranel y Wright, (Weed Science 2002, 50: 700-712), y tambien en las patentes estadounidenses Num. 5.605.011, 5.378.824, 5.141.870, y 5.013.659. La produccion de plantas tolerantes a la sulfonilurea y de plantas tolerantes a la imidazolinona se describe en las patentes de EE.UU. n.° 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937; y 5.378.824; y WO 96 /33270. Se describen tambien otras plantas tolerantes a la imidazolinona, por ejemplo, en los documentos WO 2004/040012, WO 2004/106529, Wo 2005/020673, WO 2005/093093, WO 2006/007373, WO 2006/015376, WO 2006/024351 y WO 2006/060634. Otras plantas tolerantes a sulfonilurea e imidazolinona se describen tambien, por ejemplo, en el documento WO 2007/024782 y la solicitud de patente de EE.UU. 61/288958.
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Otras plantas tolerantes a imidazolinona y/o sulfonilurea pueden obtenerse mediante mutagenesis inducida, seleccion en cultivos celulares en presencia del herbicida, o seleccion por mutacion como se describe, por ejemplo para sojas en el documento US 5.084.082, para arroz en el documento WO 97/41218, para remolacha en los documentos US 5.773.702 y WO 99/057965, para lechuga en el documento US 5.198.599, o para girasol en el documento WO 01/065922.
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (obtenidas mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion son plantas transgenicas resistentes a insectos, es decir, plantas que se han hecho resistentes al ataque de determinados insectos diana. Dichas plantas pueden obtenerse mediante transformacion genetica, o mediante seleccion de plantas que contienen una mutacion que proporciona dicha resistencia a insectos.
Una “planta transgenica resistente a insectos”, tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye cualquier planta que contenga al menos un transgen que comprende una secuencia codificadora que codifica:
1) una protema cristalina insecticida de Bacillus turingiensis o una parte insecticida de la misma, tal como las protemas cristalinas insecticidas listadas por Crickmore y col. (1998, Microbiology y Molecular Biology Reviews, 62: 807-813), (actualizado por Crickmore y col. (2005) en la nomenclatura de toxinas Bacillus turingiensis, en internet en:
http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/), o sus partes insecticidas, por ejemplo, protemas de las clases de protemas Cry, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1F, Cry2Ab, Cry3Aa, o Cry3Bb o sus partes insecticidas (por ejemplo, documentos de patente EP-A 1 999 141 y WO 2007/107302), o tales protemas codificadas por genes sinteticos como, por ejemplo, las descritas en la solicitud de patente de EE.UU. 12/249.016; o
2) una protema cristal de Bacillus thuringiensis o una parte de esta que es insecticida en presencia de una segunda protema cristal de Bacillus thuringiensis o una parte de esta, tal como la toxina binaria constituida por las protemas cristal Cry34 y Cry35 (Moellenbeck y col. , Nat. Biotechnol. 2001, 19668-72: Schnepf y col. 2006, Applied Environm. Microbiol. 71, 1765-1774) o la toxina binaria compuesta por las protemas Cry1A o Cry1F y las protemas Cry2Aa o Cry2Ab o Cry2Ae (solicitud de patente estadounidense num. 12/214.022 y documento EP -A 2.300.618); o
3) una protema hnbrida insecticida que comprende partes de diferentes protemas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis, tal como un hnbrido de las protemas de 1) anterior o un hnbrido de las protemas de 2) anterior, por ejemplo, la protema Cry1A.105, producida por el mafz transgenico MON98034 (documento WO 2007/027777); o
4) una protema de uno cualquiera de 1) a 3) anteriores en la que algunos aminoacidos, particularmente de 1 a 10, se han sustituido por otro aminoacido para obtener una mayor actividad insecticida frente a especies de insecto diana, y/o para expandir la gama de especies de insectos diana afectadas, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificador durante la clonacion o transformacion, tal como la protema Cry3Bb1 en los mames transgenicos MON863 o MON88017, o la protema Cry3A en el mafz transgenico MIR604; o
5) una protema insecticida secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus, o una parte insecticida de esta,
tal como las protemas vegetativas insecticidas (VIP) listadas en:

http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, por ejemplo, protemas de la clase de protemas VIP3Aa; o
6) una protema secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus que es insecticida en presencia de una segunda protema secretada de Bacillus thuringiensis o B. cereus, tal como la toxina binaria constituida por las protemas VIP1A y VIP2A (documento WO 94/21795); o
7) una protema insecticida tnbrida que comprende partes de diferentes protemas secretadas de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus, tal como un hnbrido de las protemas de 1) anterior o un hnbrido de las protemas de 2) anterior; o
8) una protema de uno cualquiera de 5) a 7) anteriores en la que algunos aminoacidos, particularmente de 1 a 10, se han sustituido por otros aminoacidos para obtener una mayor actividad insecticida frente a especies de insecto diana, y/o para expandir la variedad de especies de insectos diana afectadas, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN codificador durante la clonacion o transformacion (aunque todavfa codifica una protema insecticida), tal como la protema VIP3Aa en el algodon transgenico COT102; o
9) una protema secretada de Bacillus thuringiensis o Bacillus cereus que es insecticida en presencia de una protema cristalina de Bacillus thuringiensis, tal como la toxina binaria constituida por VIP3 y Cry1A o Cry1F o la toxina binaria constituida por la protema VIP3 y las protemas Cry2Aa o Cry2Ab o Cry2Ae (EP-A 2 300 618).
10) una protema de 9) anterior en la que algunos aminoacidos, en particular de 1 a 10, se han sustituido por otros aminoacidos para obtener una mayor actividad insecticida frente a una especie de insecto diana, y/o para expandir la gama de especies de insecto diana afectadas, y/o debido a los cambios introducidos en el ADN
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Por supuesto, una planta transgenica resistente a insectos, tal y como se utiliza en la presente memoria, tambien incluye cualquier planta que comprende una combinacion de los genes que codifican las protemas de una cualquiera de las clases anteriores 1 a 10. En una realizacion, una planta resistente a insectos contiene mas de un transgen que codifica una protema de una cualquiera de las clases anteriores 1 a 10, para expandir la variedad de especies de insectos diana afectadas cuando se utilizan diferentes protemas dirigidas a diferentes especies de insectos diana, o para retrasar el desarrollo de la resistencia a insectos en las plantas usando diferentes protemas insecticidas para las mismas especies de insectos diana, pero que tienen un modo de accion diferente, tal como la fijacion a diferentes sitios de union del receptor en el insecto.
Una “planta transgenica resistente a insectos”, como se usa en la presente memoria, incluye ademas cualquier planta que contiene al menos un transgen que comprende una secuencia que tras expresion produce un ARN bicatenario que, tras ingestion por una plaga de insectos de plantas, inhibe el crecimiento de esta plaga de insectos, como se describe, por ejemplo, en los documentos de patente WO 2007/080126, WO 2006/129204, WO 2007/074405, WO 2007/080127 y WO 2007/035650.
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (obtenidas mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tal como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse segun la invencion son tolerantes a estreses abioticos. Dichas plantas pueden obtenerse mediante transformacion genetica, o mediante seleccion de plantas que contienen una mutacion que proporciona dicha resistencia al estres. Las plantas tolerantes al estres particularmente utiles incluyen:
1) plantas que contienen un transgen capaz de reducir la expresion y/o la actividad del gen de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en las celulas de la planta o plantas, como se describe en los documentos WO 00/04173, WO/2006045633/, EP-A 1 807 519 o EP-A 2 018 431.
2) plantas que contienen un transgen que potencia la tolerancia al estres, capaz de reducir la expresion y/o la actividad de los genes que codifican PARG de las plantas o de las celulas de las plantas, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2004/090140.
3) plantas que contienen un transgen que incrementa la tolerancia al estres que codifica una enzima funcional de la planta de la via de smtesis del dinucleotido de nicotinamida y adenina incluyendo nicotinamidasa, nicotinato fosforribosiltransferasa, acido nicotmico mononucleotido adeniltransferasa, dinucleotido de nicotinamida y adenina sintetasa o nicotina amida fosforribosiltransferasa como se describe, por ejemplo, en los documentos EP-A 1.794.306, WO 2006/133827, WO 2007/107326, EP-A 1.999.263 o WO 2007/107326.
Las plantas o variedades de plantas cultivadas (obtenidas mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion, muestran una cantidad, calidad y/o estabilidad al almacenamiento alteradas del producto cosechado y/o propiedades alteradas de los ingredientes espedficos del producto cosechado tales como:
1) plantas transgenicas que sintetizan un almidon modificado, que presenta cambios en sus caractensticas fisicoqmmicas, en particular en el contenido en amilosa o en la relacion amilosa/amilopectina, el grado de ramificacion, la longitud media de la cadena, la distribucion de la cadena lateral, el comportamiento viscoso, la fuerza de gelificacion, el tamano del grano del almidon y/o la morfologfa del grano del almidon, en comparacion con el almidon sintetizado en celulas de plantas o plantas de tipo silvestre, de manera que es mas adecuado para aplicaciones especiales. Dichas plantas transgenicas que sintetizan un almidon modificado se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0.571.427, WO 95/04826, EP 0.719.338, WO 96/15248, WO 96/19581, WO 96/27674, WO 97/11188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/405039958688, WO 08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/101059, WO 03/071860, WO 04/056999, WO 05/030942, WO 2005/030941, WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, WO 2008/017518, WO 2008/080630, WO 2008/080631, EP 07090007.12008090008, EP , EP 9958690, EP 995865400, EP , WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, US 6,734,341, WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, US 5,824,790, US 6,013,861, WO 94/04693, WO 94/09144, WO 94/11520, WO 95/35026, WO 97/20936, WO 2010/012796, WO 2010/003701,
2) plantas transgenicas que sintetizan polfmeros de carbohidratos distintos del almidon o que sintetizan polfmeros de carbohidratos distintos del almidon, con propiedades alteradas en comparacion con plantas de tipo silvestre sin modificacion genetica. Los ejemplos son plantas que producen polifructosa, en especial del tipo inulina y levano, como se describe en los documentos EP-A 0.663.956, wO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460 y WO 99/24593, plantas que producen alfa-1,4-glucanos como se describe en los documentos WO 95/31553, US 2002/031826, US 6.284.479, US 5.712.107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 y WO 00/14249, plantas que producen alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados, como se describe en el documento WO 00/73422, plantas que producen alternano, como se describe en los documentos, por ejemplo WO 00/47727, WO
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3) plantas transgenicas que producen hialuronano, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP-A 2006/-304779, y WO 2005/012529.
4) plantas transgenicas o plantas fubridas, tales como cebollas con caractensticas tales como "alto contenido en solidos solubles", "baja amargura" (LP) y/o "conservacion larga" (LS).
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (que pueden obtenerse mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion son plantas, tales como plantas de algodon, con caractensticas alteradas de la fibra. Dichas plantas pueden obtenerse mediante transformacion genetica, o mediante seleccion de plantas que contienen una mutacion que proporciona dichas caractensticas alteradas de la fibra e incluyen:
a) Plantas, tales como plantas de algodon, que contienen una forma alterada de los genes de la celulosa sintasa, como se describe en el documento WO 98/00549.
b) Plantas, tales como plantas de algodon, que contienen una forma alterada de los acidos nucleicos homologos de rsw2 o rsw3, como se describe en el documento WO 2004/053219.
c) Plantas, tales como plantas de algodon, que tienen una expresion aumentada de la sacarosa fosfato sintasa, como se describe en el documento WO 01/17333.
d) Plantas, tales como plantas de algodon, que tienen una expresion aumentada de la sacarosa sintasa, como se describe en el documento WO 02/45485.
e) Plantas, tales como plantas de algodon, en las que esta alterado el tiempo apertura de los plasmodesmos en la base de las celulas de fibras, por ejemplo mediante la regulacion negativa de la p-1,3-glucanasa selectiva de fibra, como se describe en el documento WO 2005/017157, o como se describe en el documento WO 2009/ 143995.
f) Plantas, tales como plantas de algodon, que tienen fibras con una reactividad alterada, por ejemplo, a traves de la expresion del gen de la N-acetilglucosamina transferasa incluyendo los genes nodC y quitina sintasa, como se describe en el documento WO 2006/136351
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (que pueden obtenerse mediante procedimientos de biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion son plantas, tales como colza oleaginosa o plantas Brassica relacionadas, con unas caractensticas alteradas del perfil oleaginoso. Dichas plantas pueden obtenerse mediante transformacion genetica, o mediante seleccion de plantas que contienen una mutacion que proporciona dichas caractensticas de perfil oleoso alteradas e incluyen:
a) Plantas, tales como plantas de colza oleaginosa, que producen aceite con un alto contenido en acido oleico, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.969.169, US 5.840.946, US 6.323.392 o US 6.063.947
b) Plantas, tales como plantas de colza oleaginosa, que producen aceite que tiene un contenido bajo en acido linolenico, tal como se describe en los documentos US 6.270.828, US 6.169.190 o US 5.965.755
c) Plantas, tales como plantas de colza oleaginosa, que producen aceite que tiene un nivel bajo de acidos grasos saturados, tal como se describe por ejemplo en la patente de EE.UU. No. 5.434.283 o en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 12/668303.
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (que pueden obtenerse mediante procedimientos de
biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse segun la invencion son plantas, tales como colza oleaginosa o plantas Brassica relacionadas, con unas caractensticas alteradas de rotura de las semillas. Dichas plantas se pueden obtener por transformacion genetica o por seleccion de plantas que contienen una mutacion que imparte dichas caractensticas alteradas de rotura de las semillas, e incluyen plantas tales como plantas de colza oleaginosa con rotura de las semillas retrasada o reducida, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n.° 61/135.230 y en los documentos WO 2009/068313 y WO 2010/006732.
Las plantas o las variedades de plantas cultivadas (que pueden obtenerse mediante procedimientos de
biotecnologfa de plantas tales como ingeniena genetica) que tambien pueden tratarse de acuerdo con la invencion son plantas, tales como plantas de tabaco, con patrones de modificacion de protemas post-translacionales alterados, por ejemplo como se describe en los documentos WO 2010/121818 y WO 2010/145846.
Las plantas transgenicas particularmente utiles que se pueden tratar segun la invencion, son plantas que contienen transformaciones transgenicas o combinaciones de transformaciones transgenicas, que son objeto de demanda para el estado no regulado, en los Estados Unidos de America, al Servicio de inspeccion de Salud de Animales y Plantas (APHIS) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA), si dichas demandas se han concedido o estan
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todavfa pendientes. Esta informacion esta disponible en APHIS (4700 River Road Riverdale, MD 20737, EE.UU), por ejemplo, en su sitio de internet (URL
http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html). En la fecha de presentacion de esta solicitud, las solicitudes de no regulacion que estaban en tramitacion ante APHIS o que habfan sido concedidas por APHIS eran las que contienen la informacion siguiente:
- Peticion: el numero de identificacion de la peticion. Las descripciones tecnicas de los sucesos e transformacion se pueden encontrar en los documentos de solicitud individual que se pueden obtener de APHIS, por ejemplo en la pagina web de APHIS, con referencia a este numero de peticion. Estas descripciones se incorporan al presente documento por referencia.
- Extension de peticion: referencia a una peticion previa para la que se ha pedido una ampliacion.
- Institucion: el nombre de la entidad a la que se envfa la peticion.
- Artfculo regulado: la especie de planta implicada.
- Fenotipo transgenico: la caractenstica conferida a las plantas por el suceso de transformacion.
- Lmea o suceso de transformacion: el nombre del suceso o sucesos (a veces tambien designado como lmea o lmeas) para las que se solicita una no regulacion.
- Documentos APHIS: diversos documentos publicados por APHIS con relacion a la Solicitud y que pueden ser solicitados a APHIS.
Las plantas adicionales particularmente utiles que contienen una transformacion transgenica o combinaciones de transformaciones transgenicas estan listadas, por ejemplo, en la base de datos de diferentes agencias reguladoras nacionales o regionales (vease por ejemplo
http://GMOinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx y
http://www.agbios.com/ dbase.php).
Las plantas transgenicas particularmente utiles que se pueden tratar segun la invencion son plantas que contienen sucesos de transformacion, o una combinacion de sucesos de transformacion, y que se listan, por ejemplo, en las bases de datos de diversas agencias de regulacion nacionales o regionales que incluyen el Suceso 1143-14A (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2006/128569); Suceso 1143-51B (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2006/128570); Suceso 1445 (algodon, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos US-A 2002-120964 o WO 02/034946); Suceso 17053 (arroz, tolerancia a herbicida, depositado como PTA-9843, descrito en el documento WO 2010/117737); Suceso 17314 (arroz, tolerancia a herbicida, depositado como PTA-9844, descrito en el documento WO 2010/117735); Suceso 281-24-236 (algodon, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como PTA- 6233, descrito en los documentos WO 2005/103266 o US-A 2005-216969); Suceso 3006-210-23 (algodon, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como PTA-6233, descrito en los documentos US-A 2007-143876 o WO 2005/103266); Suceso 3272 (mafz, caractenstica de calidad, depositado como PTA-9972, descrito en los documentos WO 2006/098952 o Us-A 2006-230473); Suceso 40416 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-11508, descrito en el documento WO 2011/075593); Suceso 43A47 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-11509, descrito en el documento WO 2011/075595); Suceso 5307 (mafz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito en el documento WO 2010/077816); Suceso ASR-368 (Agrostide, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-4816, descrito en los documentos US-A 2006-162007 o WO 2004/053062); Suceso B16 (mafz, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en el documento US-A 2003-126634); Suceso BPS-CV127-9 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como NCIMB No. 41603, descrito en el documento WO 2010/080829); Suceso CE43-67B (algodon, control de insectos, depositado como DSM ACC2724, descrito en los documentos US-A 2009-217423 o WO2006/128573); Suceso CE44-69D (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento US-A 2010-0024077); Suceso CE44-69D (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2006/128571); Suceso CE46-02A (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2006/128572); Suceso COT102 (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2006-130175 o WO 2004/039986); Suceso COT202 (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2007-067868 o WO 2005/054479); Suceso COT203 (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2005/054480); Suceso DAS40278 (mafz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-10244, descrito en el documento WO 2011/022469); Suceso DAS-59122-7 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA 11384 , descrito en el documento US-A 2006-070139); Suceso DAS-59132 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en el documento WO 2009/100188); Suceso DAS68416 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-10442, descrito en los documentos WO 2011/066384 o WO 2011/066360); Suceso DP-098140-6 (mafz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-8296, descrito en los documentos US-A 2009-137395 o Wo 2008/112019); Suceso DP-305423-1 (soja, caractenstica de calidad, no depositado, descrito en los documentos US-A 2008-312082 o WO 2008/054747); Suceso DP-32138-1 (mafz, sistema de hibridacion, depositado como ATCC PTA-9158, descrito en los documentos US-A 2009-0210970 o WO 2009/103049); Suceso DP-356043-5 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-8287, descrito en los documentos US-A 2010-0184079 o WO 2008/002872); Suceso eE-1 (berenjena, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2007/091277); Suceso FI117 (mafz, tolerancia a
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herbicida, depositado como ATCC 209031, descrito en los documentos US-A 2006-059581 o WO 98/044140); Suceso GA21 (ir^z, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC 209033, descrito en los documentos US-A 2005-086719 o WO 98/044140); Suceso GG25 (mafz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC 209032, descrito en los documentos US-A 2005-188434 o WO 98/044140); Suceso GHB119 (algodon, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-8398, descrito en el documento WO 2008/151780); Suceso GHB614 (algodon, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-6878, descrito en los documentos US-A 2010-050282 o WO 2007/017186); Suceso GJ11 (mafz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC 209030, descrito en los documentos US-A 2005-188434 o WO 98/044140); Suceso GM RZ13 (remolacha azucarera, resistencia a virus, depositado como NCIMB-41601, descrito en el documento WO 2010/076212); Suceso H7-1 (remolacha azucarera, tolerancia a herbicida, depositado como NCIMB 41158 o NCIMB 41159, descrito en los documentos US-A 2004-172669 o WO 2004/074492); Suceso JOPLIN1 (trigo, tolerancia a enfermedades, no depositado, descrito en el documento US-A 2008-064032); Suceso LL27 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como NCIMB41658, descrito en los documentos WO 2006/108674 o uS-A 2008-320616); Suceso LL55 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como NCIMB 41660, descrito en los documentos WO 2006/108675 o US-A 2008196127); Suceso LLcotton25 (algodon, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-3343, descrito en WO 03/013224 o US-A 2003-097687); Suceso LLarroz06 (arroz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC-23352, descrito en los documentos US 6,468,747 o WO 00/026345); Suceso LLarroz601 (arroz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-2600, descrito en los documentos US-A 2008-2289060 o WO 00/026356); Suceso LY038 (mafz, caractenstica de calidad, depositado como ATCC PTA-5623, descrito en los documentos US-A 2007028322 o WO 2005/061720); Suceso MIR162 (mafz, control de insectos, depositado como PTA-8166, descrito en los documentos US-A 2009-300784 o WO 2007/142840); Suceso MIR604 (mafz, control de insectos, no depositado, descrito en los documentos US-A 2008-167456 o Wo 2005/103301); Suceso MON15985 (algodon, control de insectos, depositado como ATCC PTA-2516, descrito en los documentos US-A 2004-250317 o WO 02/100163); Suceso MON810 (mafz, control de insectos, no depositado, descrito en el documento US-A 2002-102582); Suceso MON863 (mafz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-2605, descrito en los documentos WO 2004/011601 o US-A 2006-095986); Suceso MON87427 (mafz, control de polinizacion, depositado como ATCC PTA-7899, descrito en el documento WO 2011/062904); Suceso MON87460 (mafz, tolerancia al estres, depositado como ATCC PTA-8910, descrito en los documentos WO 2009/111263 o US-A 2011-0138504); Suceso MON87701 (soja, control de insectos, depositado como ATCC PTA-8194, descrito en los documentos US-A 2009-130071 o WO 2009/064652); Suceso MON87705 (soja, caractenstica de calidad - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-9241, descrito en los documentos US-A 2010-0080887 o WO 2010/037016); Suceso MON87708 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA9670, descrito en el documento WO 2011/034704); Suceso MON87754 (soja, caractenstica de calidad, depositado como ATCC PTA-9385, descrito en el documento WO 2010/024976); Suceso MON87769 (soja, caractenstica de calidad, depositado como ATCC PTA-8911, descrito en los documentos US-A 2011-0067141 o WO 2009/102873); Suceso MON88017 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-5582, descrito en los documentos US-A 2008-028482 o WO 2005/059103); Suceso MON88913 (algodon, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-4854, descrito en los documentos WO 2004/072235 o US-A 2006-059590); Suceso MON89034 (mafz, control de insectos, depositado como ATCC PTA-7455, descrito en los documentos WO 2007/140256 o US-A 2008-260932); Suceso MON89788 (soja, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-6708, descrito en los documentos US-A 2006-282915 o WO 2006/130436); Suceso MS11 (colza oleaginosa, control de polinizacion - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-850 o PTA-2485, descrito en el documento WO 01/031042); Suceso MS8 (colza oleaginosa, control de polinizacion - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-730, descrito en los documentos WO 01/041558 o US-A 2003-188347); Suceso NK603 (mafz, tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-2478, descrito en el documento US-A 2007-292854); Suceso PE-7 (arroz, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2008/114282); Suceso RF3 (colza oleaginosa, control de polinizacion - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-730, descrito en los documentos WO 01/041558 o US-A 2003-188347); Suceso RT73 (colza oleaginosa, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos WO 02/036831 o US-A 2008070260); Suceso T227-1 (remolacha azucarera, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos WO 02/44407 o US-A 2009-265817); Suceso T25 (mafz, tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos US-A 2001-029014 o WO 01/051654); Suceso T304-40 (algodon, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-8171, descrito en los documentos US-A 2010-077501 o WO 2008/122406); Suceso T342-142 (algodon, control de insectos, no depositado, descrito en el documento WO 2006/128568); Suceso TC1507 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, no depositado, descrito en los documentos US-A 2005039226 o WO 2004/099447); Suceso VIP1034 (mafz, control de insectos - tolerancia a herbicida, depositado como ATCC PTA-3925, descrito en el documento wO 03/052073), Suceso 32316 (mafz, control de insectos-tolerancia a herbicida, depositado como PTA-11507, descrito en el documento WO 2011/084632), Suceso 4114 (mafz, control de insectos-tolerancia a herbicida, depositado como PTA-11506, descrito en el documento WO 2011/084621).
La composicion de acuerdo con la invencion tambien puede usarse contra enfermedades fungicas susceptibles de desarrollarse sobre madera o en el interior de la misma. El termino “madera” significa todos los tipos de especies de madera y todos los tipos de labores de esta madera destinados a la construccion, por ejemplo, madera maciza, madera de alta densidad, madera laminada y contrachapado. El procedimiento para tratar la madera de acuerdo con la invencion consiste fundamentalmente en ponerla en contacto con uno o mas compuestos segun la invencion, o con una composicion segun la invencion; este incluye, por ejemplo, la aplicacion directa, la pulverizacion, la inmersion, la inyeccion o cualquier otro medio adecuado.
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Entre las enfermedades de plantas o cultivos que se pueden proteger por los procedimientos segun la invencion, puede hacerse mencion a:
Enfermedades por mildius tales como:
Enfermedades por Blumeria, producidas por ejemplo por Blumeria graminis;
Enfermedades por Podosfaera, producidas por ejemplo por Podosfaera leucotricha;
Enfermedades por Sfaerotheca, producidas por ejemplo por Sfaerotheca fuliginaa;
Enfermedades por Undnula, producidas por ejemplo por Uncinula necator,
Enfermedades por roya, tales como:
Enfermedades por Gymnosporangium, producidas por ejemplo por Gymnosporangium sabinae;
Enfermedades por Hemileia, producidas por ejemplo por Hemileia vastatrix;
Enfermedades por fakopsora, producidas por ejemplo por Fakopsora pachyrhizi o Fakopsora meibomiae; Enfermedades por Puccinia, producidas por ejemplo por Puccinia recondita, Puccinia graminis o Puccinia striiformis;
Enfermedades por Uromyces, producidas por ejemplo por Uromyces appendiculatus;
Enfermedades por oomicetos tales como:
Enfermedades por Albugo, producidas por ejemplo por Albugo candida;
Enfermedades por Bremia, producidas por ejemplo por Bremia lactucae;
Enfermedades por Peronospora, producidas por ejemplo por Peronospora pisi o P. brassicae;
Enfermedades por Fytofthora, producidas por ejemplo por Fytofthora infestans;
Enfermedades por Plasmopara, producidas por ejemplo por Plasmopara viticola;
Enfermedades por Pseudoperonospora, producidas por ejemplo por Pseudoperonospora humuli o
Pseudoperonospora cubensis;
Enfermedades por Pythium, producidas por ejemplo por Pythium ultimum;
Enfermedades por manchas foliares, enrojecimiento foliar y tizon foliar, tales como:
Enfermedades por Alternaria, producidas por ejemplo por Alternaria solani;
Enfermedades por Cercospora, producidas por ejemplo por Cercospora beticola;
Enfermedades por Cladiosporium, producidas por ejemplo por Cladiosporium cucumerinum;
Enfermedades por Cochliobolus, causadas por ejemplo por Cochliobolus sativus (en forma de conidio:
Conidiaform: Drechslera, Sin: Helminthosporium) o Cochliobolus miyabeanus;
Enfermedades por Colletotrichum, producidas por ejemplo por Colletotrichum lindemuthanium; Enfermedades por Cicloconium, producidas por ejemplo por Cicloconium oleaginum;
Enfermedades por Diaporthe, producidas por ejemplo por Diaporthe citri;
Enfermedades por Elsinoe, producidas por ejemplo por Elsinoe fawcettii;
Enfermedades por Gloeosporium, producidas por ejemplo por Gloeosporium laeticolor;
Enfermedades por Glomerella, producidas por ejemplo por Glomerella cingulata;
Enfermedades por Guignardia, producidas por ejemplo por Guignardia bidwelli;
Enfermedades por Leptosphaeria, producidas por ejemplo por Leptosphaeria maculans; Leptosfaeria nodorum;
Enfermedades por Magnaporthe, producidas por ejemplo por Magnaporthe grisea;
Enfermedades por Mycosfaerella, producidas por ejemplo por Mycosfaerella graminicola; Mycosphaerella arachidicola; Mycosfaerella fijiensis;
Enfermedades por Faeosfaeria, producidas por ejemplo por Faeosfaeria nodorum;
Enfermedades por Pyrenophora, causadas por ejemplo por Pyrenophora teres o Pyrenophora tritici repentis;
Enfermedades por Ramularia, causadas por ejemplo por Ramularia collo-cygni o Ramularia areola; Enfermedades por Rhynchosporium, producidas por ejemplo por Rhynchosporium secalis;
Enfermedades por Septoria, producidas por ejemplo por Septoria apii o Septoria lycopercisi;
Enfermedades por Tyfula, producidas por ejemplo por Tyfula incarnata;
Enfermedades por Venturia, producidas por ejemplo por Venturia inaequalis;
Enfermedades de rafz, vaina y tallo, tales como
Enfermedades por Corticium, producidas por ejemplo por Corticium graminaarum;
Enfermedades por Fusarium, producidas por ejemplo por Fusarium oxisporum;
Enfermedades por Gaeumannomyces, producidas por ejemplo por Gaeumannomyces graminis;
Enfermedades por Rhizoctonia, producidas por ejemplo por Rhizoctonia solani;
Enfermedades por Sarocladium, producidas por ejemplo por Sarocladium oryzae;
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Enfermedades por Sclerotium, producidas por ejemplo por Sclerotium oryzae; Enfermedades por Tapesia, producidas por ejemplo por Tapesia acuformis; Enfermedades por Thielaviopsis, producidas por ejemplo por Thielaviopsis basicola;
Enfermedades de la mazorca y de la pamcula, tales como:
Enfermedades por Alternaria, producidas por ejemplo por Alternaria spp; Enfermedades por Aspergillus, producidas por ejemplo por Aspergillus flavus; Enfermedades por Cladosporium, producidas por ejemplo por Cladosporium spp.; Enfermedades por Claviceps, producidas por ejemplo por Claviceps purpurea; Enfermedades por Fusarium, producidas por ejemplo por Fusarium culmorum; Enfermedades por Gibberella, producidas por ejemplo por Gibberella zeae; Enfermedades por Monografella, producidas por ejemplo por Monografella nivalis;
Enfermedades por carbon y tizon, tales como:
Enfermedades por Sphacelotheca, producidas por ejemplo por Sphacelotheca reiliana; Enfermedades por Tilletia, producidas por ejemplo por Tilletia caries;
Enfermedades por Urocystis, producidas por ejemplo por Urocystis occulta; Enfermedades por Ustilago, producidas por ejemplo por Ustilago nuda;
Enfermedades por podredumbre y moho de la fruta tales como:
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por Aspergillus, producidas por ejemplo por Aspergillus flavus; por Botrytis, producidas por ejemplo por Botrytis cinerea; por Penicillium, producidas por ejemplo por Penicillium expansum por Rhizopus, producidas por ejemplo por Rhizopus stolonifer por Sclerotinia, producidas por ejemplo por Sclerotinia sclerotiorum; por Verticilium, producidas por ejemplo por Verticilium alboatrum;
Enfermedades por podredumbre de las semillas y del suelo, moho, marchitez, rona y cafda:
Enfermedades por Alternaria, producidas por ejemplo Alternaria brassicicola Enfermedades por Afanomyces, producidas por ejemplo por Afanomyces euteiches Enfermedades por Ascochyta, producidas por ejemplo por Ascochyta lentis Enfermedades por Aspergillus, producidas por ejemplo por Aspergillus flavus Enfermedades por Cladosporium, producidas por ejemplo por Cladosporium herbarum Enfermedades por Cochliobolus, producidas por ejemplo por Cochliobolus sativus (En forma de conidio: Drechslera, Bipolaris Sinonimo: Helminthosporium); Enfermedades por Colletotrichum, producidas por ejemplo por Colletotrichum coccodes; Enfermedades por Fusarium, producidas por ejemplo por Fusarium culmorum; Enfermedades por Gibberella, producidas por ejemplo por Gibberella zeae; Enfermedades por Macrofomina, producidas por ejemplo por Macrofomina faseolina Enfermedades por Monografella, producidas por ejemplo por Monografella nivalis; Enfermedades por Penicillium, producidas por ejemplo por Penicillium expansum Enfermedades por Phoma, producidas por ejemplo por Phoma lingam Enfermedades por Phomopsis, producidas por ejemplo por Phomopsis sojae; Enfermedades por Phytofthora, producidas por ejemplo por Phytofthora cactorum; Enfermedades por Pyrenofora, producidas por ejemplo por Pyrenofora graminaa Enfermedades por Pyricularia, producidas por ejemplo por Pyricularia oryzae; Enfermedades por Pythium, producidas por ejemplo por Pythium ultimum; Enfermedades por Rhizoctonia, producidas por ejemplo por Rhizoctonia solani; Enfermedades por Rhizopus, producidas por ejemplo por Rhizopus oryzae Enfermedades por Sclerotium, producidas por ejemplo por Sclerotium rolfsii; Enfermedades por Septoria, producidas por ejemplo por Septoria nodorum; Enfermedades por Typhula, producidas por ejemplo por Typhula incarnata; Enfermedades por Verticillium, producidas por ejemplo por Verticillium dahliae;
Enfermedades por chancro, retama y puntiseco tales como:
Enfermedades por Nectria, producidas por ejemplo por Nectria galligena; Enfermedades por tizon, tales como:
Enfermedades por Monilinia, producidas por ejemplo por Monilinia laxa; Enfermedades por ampolla de la hoja o encrespamiento de la hoja, tales como:
Enfermedades por Exobasidium, producidas por ejemplo por Exobasidium vexans; Enfermedades por Taphrina, producidas por ejemplo por Taphrina deformans;
Enfermedades de deterioro de plantas madereras, tales como:
Enfermedades por Esca, producidas por ejemplo por Phaemoniella clamydospora;
5 Acronecrosis por Eutypa, producida por ejemplo por Eutypa lata;
Enfermedades por Ganoderma, producidas por ejemplo por Ganoderma boninense; Enfermedades por Rigidoporus, causadas por ejemplo por Rigidoporus lignosus
Enfermedades de Flores y Semillas tales como:
Enfermedades por Botrytis, causadas por ejemplo por Botrytis cinerea;
10 Enfermedades de Tuberculos, tales como:
Enfermedades por Rhizoctonia, causadas por ejemplo por Rhizoctonia solani;
Enfermedades por Helminthosporium, producidas por ejemplo por Helminthosporium solani;
Enfermedades por Hernia de las rames de las crudferas, tales como
Enfermedades por Plasmodiophora, causadas por ejemplo por Plamodiophora brassicae.
15 Enfermedades causadas por Organismos Bacterianos, tales como:
especies de Xanthomonas, por ejemplo Xanthomonas campestris pv. oryzae; especies de Pseudomonas, por ejemplo Pseudomonas syringae pv. lachrymans; especies de Erwinia, por ejemplo Erwinia amilovora.
Leyendas de las figuras
20 Figura 1 : Medicion de la inhibicion del crecimiento de Phytophthora infestans en presencia de ARNdc dirigido
contra el ARN mensajero de sacaropina deshidrogenasa.
Figura 2 : Analisis del nivel de ARNm de sacaropina deshidrogenasa por qRT PCR.
Listado de secuencias:
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SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
N°1: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Aspergillus clavatus.
N°2: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°3: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Aspergillus fumigatus.
N°4: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°5: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Botrytis cinerea.
N°6: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°7: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Fusarium graminearum.
N°8: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°9: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Fusarium oxysporum.
N°10: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°11: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Fusarium verticilloides.
N°12: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°13: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Fusarium verticilloides.
N°14: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°15: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Mycosphaerella fijiensis. N°16: Polipeptido codificado por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°17: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Magnaporthe grisea.
N°18: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°19: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Monoliophthora perniciosa. N°20: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°21: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Puccinia graminis.
N°22: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°23: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Phytophthora infestans. N°24: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°25: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Phytophthora ramorum. N°26: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°27: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Phytophthora sojae.
N°28: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°29: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Pyrenophora tritici-repentis. N°30: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior. N°31: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Sclerotinia sclerotiorum.
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SEQ ID N°32: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°33: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Trichoderma reesei.
SEQ ID N°34: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°35: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Ustilago maydis.
SEQ ID N°36: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°37: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Verticillium albo-atrum.
SEQ ID N°38: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°39: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Mycosphaerella graminicola.
SEQ ID N°40: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°41: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Fusarium moniloform.
SEQ ID N°42: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°43: Sacaropina deshidrogenasa (LYS1) de Claviceps purpurea.
SEQ ID N°44: Protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos anterior.
SEQ ID N°45: Cebador SACdh_Pi_T7_F SEQ ID N°46: Cebador SACdh_Pi_T7_R SEQ ID N°47: Cebador Actina sentido SEQ ID N°48: Cebador Actina antisentido SEQ ID N°49: Cebador p-Tub sentido SEQ ID N°50: Cebador p-Tub antisentido SEQ ID N°51: Cebador SACdh sentido SEQ ID N°52: Cebador SACdh antisentido SEQ ID N°53: Cebador pBINB33-1 SEQ ID N°54: Cebador pBINB33-2 SEQ ID N°55: Cebador SacdhPI R SEQ ID N°56: Cebador SacdhPI F SEQ ID N°57: Cebador LYS1 Pot 117-F SEQ ID N°58: Cebador LYS1 Pot 117-R
Los diversos aspectos de la invencion se entenderan mas claramente a partir de los ejemplos experimentales siguientes.
Todos los procedimientos u operaciones descritos a continuacion se ofrecen a modo de ejemplo y corresponden a una eleccion hecha a partir de varios procedimientos asequibles para lograr el mismo resultado. Esta eleccion carece de efecto sobre la calidad del resultado y, en consecuencia, el experto en la tecnica puede usar cualquier procedimiento adecuado para obtener el mismo resultado. En particular, y a menos que se especifique lo contrario en los ejemplos, todas las tecnicas de ADN recombinante usadas se llevan a cabo segun los protocolos convencionales descritos en Sambrook y Russel. (2001, Molecular Cloning: A laboratory manual, tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, nY), en Ausubel y col. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current protocols, EE.UU. Volumenes 1 y 2), y en Brown (1998, Molecular Biology LabFax, segunda edicion, Academic Press, UK). Los materiales y procedimientos convencionales para biologfa molecular vegetal se describen en Croy R.D.D. (1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK)). Los materiales y procedimientos convencionales para PCR (Reaccion de la Cadena Polimerasa) se describen tambien en Dieffenbach y Dveksler (1995, PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y en McPherson y col. (2000, PCR - Basics: From background to bench, primera edicion, Springer Verlag, Alemania).
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Ejemplos
Ejemplo 1: Cultivo in vitro de Magnaporthe grisea
Los ensayos se llevaron a cabo usando la cepa natural de Magnaporthe grisea P1.2, procedente de la coleccion del laboratorio de fitopatologfa del CIRAD (Centre de cooperation internationale en recherche agronomique pour le developpement) de Montpellier. Las condiciones de cultivo, la composicion del medio de arroz-agar, el mantenimiento y la esporulacion, asf como las preparaciones de protoplastos se describen en Silue y col. (1998).
Ejemplo 2: Transfeccion de Magnaporthe grisea con ARNdc dirigido contra sacaropina deshidrogenasa y medicion de la inhibicion del crecimiento
La secuencia genica Lys-1 de la sacaropina deshidrogenasa (SACdh) de Magnaporthe grisea (MGG_01359.6: 1426 pb) se obtuvo del Broad Institute (
http://www.broadinstitute.org/). Se selecciono una region de aproximadamente 325 pb para el ARNdc, que comprende los nucleotidos 301 hasta 626, que se sintetizo por la comparMa Geneart y se clono en el plasmido.
Para la transfeccion, se produjo ARNdc de sacaropina deshidrogenasa de Magnaporthe grisea, usando el kit de ARNi MEGAscript (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se trataron cantidades diferentes (200 |jg a 2 |jg de ARNdc) con el agente de transfeccion Lipofectamin RNAi max (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron complejos de Lipofectamin-ARNdc a 2,5 x 106 protoplastos de Magnaporthe grisea en una placa de microtitulacion con medio TB3 (Villalba y col., 2008), y el crecimiento se monitorizo durante 5-7 dfas a una DO de 600 nm, empleando un lector de microplaca Infinite M1000 (Tecan).
El crecimiento de protoplastos de Magnaporthe grisea tratados con ARNdc de sacaropina deshidrogenasa, en comparacion con un control no tratado, se monitorizo en diversos tiempos del ensayo, poniendo de manifiesto una diferencia significativa del crecimiento.
Ejemplo 3: Cultivo in vitro de Phytophthora infestans y preparacion de zoosporas.
La cepa PT78 de Phytophthora infestans se cultivo in vitro en placas Petri de 9 cm sobre medio de guisante-agar (125 g/l de guisantes hervidos y triturados, 20 g/l de agar agar, carbenicilina 100 mg/l) a 21 °C en oscuridad. Cada 15 dfas, se inoculo nuevo medio con cuatro bloques cubicos de 5 mm de micelio.
Para liberar las zoosporas, se depositaron 12 ml de agua helada sobre un cultivo de 10 dfas de antiguedad, y el cultivo se mantuvo a 4 °C durante 2 horas. A continuacion, se recogio el sobrenadante sin alterar el micelio, y se filtro a traves de un tamiz de 100 pm para retirar los fragmentos de hifas. Las zoosporas se depositaron en hielo y se procedio al recuento con un hemocitometro.
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Ejemplo 4: Transfeccion de Magnaporthe grisea con ARNdc dirigido contra sacaropina deshidrogenasa y medicion de la inhibicion del crecimiento
La secuencia genica de sacaropina deshidrogenasa Lys-1 de Phytophthora infestans (PITG_03530 : 3020 pb) se obtuvo de la base de datos para P. infestans del Broad Institute. La comparMa Geneart sintetizo una region de aproximadamente 500 pb que ofrecio el mejor ARNip segun el software de diseno BLOCKit RNAi (Invitrogen), y que comprendio los nucleotidos 2251 hasta 2750, y se clono en el plasmido 0920357_SacDH_Pi_pMA.
La smtesis de ARNdc se llevo a cabo usando el kit Megascript RNAi (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando como molde un producto PCR amplificado a partir del plasmido 0920357_SacDH_Pi_pMA. El cebador sentido usado fue SACdh_Pi_T7_F: 5' TAATACGACTCACTATAGGGTTGCAGGAGAGCGCAGAAAGC y el cebador antisentido fue SACdh_Pi_T7_R : TAATACGACTCACTATAGGGTCAGTTGGAGTCCGCGTGGTGT.
A continuacion, el ARNdc se precipito con etanol al 100 % y acetato sodico 3 M, pH 5,2, se lavo 2 veces con etanol al 70 % y los granulados se resuspendieron en agua libre de ARNasa.
Las mezclas de transfeccion se prepararon en una placa de 48 pocillos mediante la adicion secuencial de medio V8 (5 % de zumo V8 (Campbell Foods Belgium), pH 5), la cantidad apropiada de ARNdc y 10 pl de lipofectamina RNAi max (Invitrogen) en un volumen final de 200 pl. La mezcla de transfeccion se cultivo durante 15 min a temperatura ambiente.
Las zoosporas se diluyeron en zumo V8 hasta una concentracion de 5x104 zoosporas/ml. A continuacion, se agregaron 800 pl de la solucion de zoosporas a cada pocillo de la placa. La concentracion final de zoosporas fue de 4x105 zoosporas / ml.
En cada placa se anadieron tres controles: medio V8, medio V8 + zoosporas, medio V8 + zoosporas + lipofectamina. Las placas se incubaron a 21 °C, en la oscuridad.
El crecimiento del hongo se controlo midiendo la absorbancia a 620 nm en un lector de placas (Infinite 1000, Tecan) durante 8 dfas. El porcentaje de inhibicion del crecimiento se calculo usando la formula siguiente: 100-(DOARNdc x 100 / DOcontrol lipofectamina). El crecimiento del hongo se redujo en presencia de ARNdc dirigido contra la sacaropina deshidrogenasa de forma dependiente de la concentracion (100 nM y 200 nM, respectivamente), como se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 5: Analisis por PCR cuantitativa del ARN mensajero de la sacaropina deshidrogenasa de P. infestans
Para proporcionar suficiente ARN para la smtesis de ADNc y RT-PCR en tiempo real, se combinaron varios pocillos de la placa de 48 pocillos para una concentracion del ARNdc ensayado: 10 pocillos para el punto de tiempo de 72 h, 6 pocillos para el punto de tiempo de 96 h, 3 pocillos para el punto de tiempo de 120 h.
Despues de 72 h, 96 h y 120 h de tratamiento con el ARNdc, se recogieron los micelios. Las muestras se centrifugaron para eliminar el medio. Las muestras se congelaron en nitrogeno lfquido y, a continuacion, se liofilizaron durante la noche.
Antes de la extraccion de ARN, se trituro el micelio. Se extrajo el ARN total utilizando el mini-kit RNeasy Plant (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante. Por medio de digestion con desoxirARNasa (DNasa) se elimino la contaminacion con ADN de las muestras de ARN (DNA free, Ambion). Se comprobo la integridad del ARN con el Bioanalizador 2100 (nano-kit RNA 6000, Agilent), siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. El ADNc se sintetizo a partir de 2 pg de ARN total por medio de cebado oligo dT usando el sistema de kit Thermoscript RT-PCR (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante. El ADNc se precipito con EtOH al 100 % y acetato sodico 3 M, pH 5,2, se lavo 2 veces con EtOH al 70% y los granulados se resuspendieron en 10 pL de agua libre de ARNasa. El ADNc se diluyo cien veces para el ensayo de qPCR. Se disenaron parejas de cebadores para cada secuencia genica, utilizando el software Primer Express 3 (Applied Biosystems). Se llevo a cabo una RT-PCR en tiempo real en un sistema 7900 Real Time PCR (Applied Biosystems) con una mezcla maestra Power SYBR green PCR (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. La Q-PCR se realizo de la forma siguiente: 95 °C durante 10 min, 45 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C 1 min, seguido por una etapa de disociacion a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s.
Como controles endogenos se utilizaron los genes de actina y p-tubulina. La expresion relativa de los genes se calculo con el procedimiento 2AACt. La Figura 2 muestra una reduccion significativa del nivel de ARN mensajero de sacaropina deshidrogenasa, y esta reduccion se correlaciona con la inhibicion del crecimiento.
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Tabla 1: Secuencia de cebadores para qPCR:
Nombre del cebador
secuencia del cebador sentido secuencia del cebador antisentido
actina
CGACTCTGGTGACGGTGTGT GCGTGAGGAAGAGCGTAACC
P-tub
CCGCCCAGACAATTTCGT CCTTGGCCCAGTTGTTACCA
SACdh
TGGGTGGTTTCCAAGGTCTTC AAAGGCACCAAGCCACTGAA
Ejemplo 6: Construccion de vectores de transformacion que contienen el gen de sacaropina deshidrogenasa de Phytophthora infestans.
a) Preparacion del vector de expresion en plantas IR 47-71
El plasmido pBinAR es un derivado del plasmido de vector binario pBin19 (Bevan, 1984), que se construyo del modo siguiente: Se aislo un fragmento de una longitud de 529 pb que comprendio los nucleotidos 6909-7437 del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor como el fragmento EcoR \IKpn I del plasmido pDH51 (Pietrzak y col, 1986) y se ligo entre los sitios de restriccion EcoR I y Kpn I del polienlazador de pUC18. De esta manera se formo el plasmido pUC18-35S. Utilizando las endonucleasas de restriccion Hind III y Pvu II, se aislo un fragmento con una longitud de 192 pb que incluyo la senal de poliadenilacion (extremo terminal 3') del gen de octopina sintasa (gen 3) del ADN-T del plasmido Ti pTiACHS (Gielen y col, 1984) (nucleotidos 11 749-11 939) a partir del plasmido pAGV40 (Herrera-Estrella y col, 1983). Tras la adicion de enlazadores Sph I al sitio de restriccion Pvu Il, se ligo el fragmento entre los sitios de restriccion Sph I y Hind III de pUC18-35S. Se obtuvo asf el plasmido pA7. En este, se retiro todo el polienlazador que comprende el promotor 35S y el terminador Ocs usando EcoR I y Hind III y se ligo en un vector adecuadamente escindido pBin19. Se obtuvo de esta forma el vector de expresion en plantas pBinAR (Hofgen y Willmitzer, 1990).
El promotor del gen de patatina B33 de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa y col., 1989) se ligo, como fragmento Dra I (nucleotidos -1512 - +14), en el vector escindido Ssf l pUC19, cuyos extremos habfan sido hechos romos con T4- ADN polimerasa. Esto proporciono el plasmido pUC19-B33. A partir de este plasmido, se retiro el promotor B33 usando EcoR I y Sma I y se ligo con el vector adecuadamente restringido pBinAR. De este modo, se obtuvo el vector de expresion en plantas pBinB33. Para facilitar etapas adicionales de clonacion, se amplio el MCS (Sitio de Clonacion Multiple, por sus siglas en ingles). Con este fin, se sintetizaron dos oligonucleotidos complementarios, se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, se enfriaron lentamente a temperatura ambiente para permitir una buena fijacion (hibridacion) y se clonaron en los sitios de restriccion Sal I y Kpn I de pBinB33. Los oligonucleotidos usados para ello tuvieron las secuencias siguientes:
pBINB33-1: 5'-TCG ACA GGC CTG GAT CCT TAA TTA AAC TAG TCT CGA GGA GCT CGG TAC-3 pBINB33-2: 5'-CGA GCT CCT CGA GAC TAG TTT AAT TAA GGA TCC AGG CCT G-3'
El plasmido obtenido se designo IR 47-71.
b) Preparacion de los vectores de expresion en plantas pEPA248 y pEPA262 que comprenden secuencias de acidos nucleicos para el gen de sacaropina deshidrogenasa de Phytophthora infestans.
La secuencia de sacaropina deshidrogenasa (PITG_03530: 3020 pb) se obtuvo de la base de datos ORF Prot Vi de P. infestans. La comparua Geneart sintetizo una region de aproximadamente 500 pb que ofrece el mejor ARNip, segun el software de diseno de ARNi BLOCKit (Invitrogen).
Un fragmento de 300 pb se amplifico por PCR a partir del ADN de esta secuencia con los cebadores SacdhPI R (5'- agaggtaccaagcttgcgtagctgg-3') y SacdhPI F (5'-tatctcgagtctagacaacgccattggttac-3'). El fragmento amplificado se clono en pCRII-Topo (Invitrogen) para obtener el plasmido pEPA250. Segun Wesley y col. (2001), la secuencia de interes se clono en el vector pHannibal para dar el plasmido pEPA241. A continuacion, se sub-clono la casete de expresion de ARNdc en diferentes vectores binarios (expresion en plantas) pART27 (Gleave AP, PMB 20, (1992), 1203-1207) e IR 47 para dar los vectores de expresion en plantas pEPA248 y pEPA262, respectivamente.
Los vectores pEPA248 y pEPA262 se introdujeron, respectivamente, en celulas de Agrobacteria GV3101 y C58C1RIF (pGV2260) por electroporacion (Rocha-Sosa y col.(1989)), con el objeto de transformar adicionalmente plantas de patata.
Ejemplo 7: Construccion de vectores de transformacion dirigidos contra el gen de sacaropina deshidrogenasa lysl de Sclerotinia sclerotiorum.
La comparua Geneart sintetizo los 351 pb de una region de la secuencia de codificacion Lys1 de S. sclerotiorum (sacaropina deshidrogenasa SS1G_06166.1) (pEPA293), que estuvieron flanqueados por sitios de restriccion internos (XbaI, HindIII) y externos (XhoI, KpnI) disenados para llevar a cabo una clonacion en dos etapas en el vector pHannibal (Wesley y col., 2001). El plasmido intermedio albergo dos copias invertidas del fragmento del gen Lys1, espaciadas por el intron PdK de pHannibal y reguladas por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador OCS.
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A continuacion, se escindio toda la casete de ADN con Notl y se inserto en el vector binario pART27 (Gleave, 1992), dando el plasmido final pEPA307 con un casete de seleccion de planta basado en un gen de resistencia a la kanamicina (gen nptll regulado por el promotor y terminador Nos).
El mismo casete Notl se inserto tambien en un vector binario (pFCO31) con un marcador de seleccion de plantas basado en una resistencia a los inhibidores de HPPD, a utilizar en la transformacion de soja. Entonces, el plasmido final puede transformar plantas con un ADN-T que comprende entre los margenes Derecho e Izquierdo, nuestro casete de interes y un gen HPPD regulado por un promotor CsVMV, una secuencia de peptidos de transito de cloroplasto y un terminador 3'Nos.
Ejemplo 8: Construccion de vectores de transformacion dirigidos contra el gen de sacaropina deshidrogenasa lysl de Phakopsora pachirizi.
La comparna Geneart sintetizo los 364pp de una region de la secuencia de codificacion Lysl de Phakopsora pachirizi E.S.T.(sacaropina deshidrogenasa PHAPC_EH247326.1) (pCED42), que estuvieron flanqueados por sitios de restriccion internos (Xbal, Hindlll) y externos (Xhol, Kpnl) disenados para llevar a cabo una clonacion en dos etapas en el vector pHannibal (Wesley y col., 2001). El plasmido intermedio albergo dos copias invertidas del fragmento del gen Lysl, espaciadas por el intron PdK de pHannibal y reguladas por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador OCS.
A continuacion, se escindio toda la casete de ADN con Notl y se inserto en el vector binario pART27 (Gleave, 1992), dando el plasmido final pCED45 con una casete de seleccion vegetal basado en un gen de resistencia a la kanamicina (gen nptll regulado por el promotor y terminador Nos).
La misma casete Notl se inserto tambien en un vector binario (pFCO31) con un marcador de seleccion vegetal basado en una resistencia a los inhibidores de HPPD, a utilizar en la transformacion de soja. Entonces, el plasmido final (pCED87) puede transformar plantas con un ADN-T que comprende entre los margenes Derecho e lzquierdo, nuestra casete de interes y un gen HPPD regulado por un promotor CsVMV, una secuencia de peptidos de transito de cloroplasto y un terminador 3'Nos.
Ejemplo 9: Transformacion de plantas de patata con vectores de expresion en plantas que comprenden moleculas de acido nucleico que codifican la construccion de sacaropina deshidrogenasa en horquilla pEPA262
Se transformaron plantas de patata a traves de Agrobacterium usando el vector de expresion en plantas pEPA262, que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifican sacaropina deshidrogenasa bajo el control del promotor del gen de patatina B33 de Solanum tuberosum como lo describen Rocha-Sosa y col. (1989). Las plantas de patata transgenicas transformadas con el plasmido pEPA262 se designaron “537 ES”. Se llevo a cabo un analisis molecular de los acontecimientos de “537 ES” empleando procedimientos convencionales de PCR (Sambrook y col.) para detectar la presencia de la secuencia de acidos nucleicos para sacaropina deshidrogenasa, usando los cebadores siguientes SacDH Pl F: 5'-TATCTCGAGTCTAGACAACGCCATTGGTTAC-3' y SacDH Pl R: 5'- AGAGGTACCAAGCTTGCGTAGCTGG-3'. Se logro una seleccion adicional por transferencia Northen o por analisis de expresion de la secuencia de acidos nucleicos para sacaropina deshidrogenasa a traves de RT-Q PCR que condujo a una seleccion de eventos diferentes. Los oligonucleotidos usados para ello tuvieron las secuencias siguientes: LYS1_Pot 117-F: 5'-TCA ATA GAA GCG AAC GCG TAA A-3' y LYS1_Pot 117-R: 5'-GTT CGG GAT CTG CTC GAT GT-3'
Ejemplo 10: Transformacion mediada por Agrobacterium de Arabidopsis thaliana.
El plasmido derivado de pART27 se introdujo por electroporacion en Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 (lnvitrogen Electromax). Las cepas bacterianas obtenidas se usaron entonces para la infiltracion por inmersion floral de las plantas de A. thaliana Col-0 o Wassileskija, como se describe en Clough & Bent (PlantJ 1998).
Ejemplo 11: Transformacion mediada por Agrobacterium de Glycine max.
Los plasmidos derivados de pFCO31 se introdujeron por electroporacion en Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 (lnvitrogen Electromax). Seguidamente, se usaron las cepas bacterianas obtenidas para la transformacion de soja, segun se describe mas adelante.
Se esterilizan semillas de soja durante 24 h con gas cloro (Ch). Las semillas se ponen en placas Petri y se ponen en remojo en agua desionizada esteril durante 20 horas antes de la inoculacion, en oscuridad, a temperatura ambiente. Un cultivo durante la noche, realizado a 28 °C y 200 rpm de agitacion de Agrobacterium tumefaciens en 200 ml de YEP (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCh, pH a 7,0), que contiene el antibiotico apropiado, se centrifuga a 4000 rpm, 4°C, durante 15 min. El granulado se resuspende en 40 a 50 ml de medio de infeccion hasta una DO 600 nm final de entre 0,6 y 1 y se conserva sobre hielo. Las semillas empapadas se diseccionan bajo condiciones de esterilidad, usando una hoja de escalpelo n.° 15 para separar los cotiledones y retirar las hojas primarias adheridas a los mismos. Cada cotiledon se guarda como explante para la inoculacion. Se preparan aproximadamente 100 explantes y posteriormente se inoculan conjuntamente, durante 30 minutos en el

Claims (17)

  1. 5
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    30
    35
    40
    45
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    1. Una molecula de ARNdc que comprende i) una primera cadena que comprende una secuencia identica a por lo menos 18 nucleotidos contiguos del gen de sacaropina deshidrogenasa de un hongo u oomiceto y ii) una segunda cadena que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a la primera cadena, en la que el gen de hongo u oomiceto se selecciona del grupo consistente en:
    a) un polinucleotido que comprende una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43;
    b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
    c) un polinucleotido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 %, mas preferentemente de al menos el 90 %, todavfa mas preferentemente de al menos el 95 %, con un polinucleotido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43;
    d) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 80 %, mas preferentemente de al menos el 90 %, todavfa mas preferentemente de al menos el 95 %, con un polipeptido que tiene una secuencia como define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44;
    e) un polinucleotido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleotido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43; y
    f) un polinucleotido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con un polipeptido que tiene una secuencia como se define en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44.
  2. 2. Una composicion que comprende al menos una molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1.
  3. 3. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizada porque comprende ademas un soporte, vetnculo, material de carga y/o tensioactivo agncolamente aceptables.
  4. 4. Una composicion de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, que comprende ademas un producto fitofarmaceutico o un compuesto promotor del crecimiento de la planta.
  5. 5. Un microorganismo que produce una molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1.
  6. 6. Una construccion genetica que comprende al menos una secuencia de ADN, asf como elemento o elementos heterologos de regulacion en las posiciones 5' y, opcionalmente, 3', caracterizada porque la secuencia o secuencias de ADN codifican la molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1.
  7. 7. Un vector de clonacion y/o expresion, caracterizado porque contiene al menos una construccion genetica de acuerdo con la reivindicacion 6.
  8. 8. Una celula vegetal transgenica que comprende una molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1 o una construccion de acuerdo con la reivindicacion 6.
  9. 9. Una planta, semilla o parte de la misma, transgenicas que comprenden una celula vegetal transgenica de acuerdo con la reivindicacion 8.
  10. 10. La celula vegetal transgenica de acuerdo con la reivindicacion 8, o la planta o semilla transgenica, o parte de la misma, de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dicha planta es una planta de soja, oleaginosa, arroz o patata.
  11. 11. Un procedimiento de produccion de una celula vegetal transgenica capaz de expresar un ARNdc que inhibe un gen de sacaropina deshidrogenasa de hongo u oomiceto, dicho procedimiento comprende las etapas de transformar una celula vegetal con una construccion genetica de acuerdo con la reivindicacion 6.
  12. 12. Un procedimiento de control de un patogeno vegetal, particularmente un hongo u oomiceto, que comprende proporcionar a dicho patogeno una molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
  13. 13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, caracterizado porque se aplica una cantidad eficaz de una molecula de ARNdc de acuerdo con la reivindicacion 1, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 al suelo donde crece o puede crecer la planta, a las hojas y/o a los frutos de plantas, o a las semillas de las plantas.
  14. 14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, que comprende proporcionar a la planta hospedadora de dicho patogeno vegetal una celula vegetal transformada de acuerdo con la reivindicacion 8.
  15. 15. Un procedimiento para inhibir la expresion de un gen patogeno vegetal, que comprende las etapas siguientes:
    i) transformar una celula vegetal con una construccion genetica de acuerdo con la reivindicacion 6.
    ii) colocar las celulas transformadas de este modo en condiciones que permitan la transcripcion de dicha construccion,
    5 iii) poner en contacto las celulas con el patogeno vegetal.
  16. 16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que dicho patogeno vegetal es Magnaporthe grisea, Phytophthora infestans, Sderotinia sclerotinium o Phakopsora pachyrhizi.
  17. 17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que dicha planta es soja, oleaginosa, arroz o patata.
    10
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