PT1435205E

PT1435205E - Plantas que sintetizam um amido modificado, processo para a sua produção e amido modificado

Info

Publication number: PT1435205E
Application number: PT04002725T
Authority: PT
Inventors: Jens Kossmann; Ruth Lorberth
Original assignee: Bayer Bioscience Gmbh
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 2010-02-04
Also published as: US6207880B1; CA2231774A1; US7897760B2; US7569744B2; US6815581B2; US20010007155A1; EP0851934A1; DK1435205T3; PT851934E; HUP9900510A3; DK0851934T3; JP2008173128A; DE59611501D1; EP1728441A2; ATE332382T1; US20130209635A1; HU229777B1; AU7131396A; JPH11512286A; US8586722B2

Description

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DESCRIÇÃO "PLANTAS QUE SINTETIZAM UM AMIDO MODIFICADO, PROCESSO PARA A SUA PRODUÇÃO E AMIDO MODIFICADO" A presente invenção refere-se a um método para a produção de um amido, no qual são isolados amidos de plantas transgénicas ou de células de plantas, as quais forma modificadas, através de moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína ligada ao granulo de amido. 0 amido de polissacárido que constitui uma das substâncias de armazenagem mais importantes das plantas não se utiliza apenas na área dos comestíveis, mas também desempenha um papel significativo como um material de regeneração na produção de produtos industriais. Para tornar possível a utilização desta matéria-prima em tantas áreas quantas as possíveis, é necessário obter uma grande variedade de substâncias assim como adaptar essas substâncias aos vários requisitos da indústria do processo.

Embora o amido consista num componente básico, homogéneo sob o ponto de vista químico, nomeadamente a glicose, não constitui uma matéria-prima homogénea. É uma mistura bastante complexa de vários tipos de formas moleculares diferentes que diferem umas das outras no seu grau de polimerização e no grau de ramificação das cadeias de glicose. Diferencia-se particularmente entre amido-amilose, um polímero basicamente não ramificado feito de moléculas de glicose ramificadas de forma a-1,4-glicosídica e amido-amilopectina que, por sua 2 vez, é uma mistura de cadeias de glicose mais ou menos altamente ramificadas, em que a ramificação resulta da ocorrência de interligações a-1,6-glicosidicas. A estrutura molecular do amido que é determinada principalmente pelo seu grau de ramificação, a relação amilosa/amilopectina, o comprimento médio da cadeia e a ocorrência de grupos de fosfato, é significativa para as propriedades funcionais importantes do amido ou das suas soluções aquosas. As propriedades funcionais importantes são, por exemplo , a solubilidade do amido, a tendência para retrogradar, a capacidade de formação de filmes, a viscosidade a estabilidade da cor, as propriedades de formação de pasta, isto é, as propriedades de ligação e de colagem, assim como a resistência ao frio A dimensão do grânulo de amido pode ser também ser significativa em várias utilizações. A produção de amido com um teor de amilose alto é particularmente significativa. Além disso, o amido modificado contido nas células de plantas pode, em certas condições, alterar favoravelmente o comportamento da célula da planta. Por exemplo, seria possível diminuir a degradação do amido durante a armazenagem dos órgãos contendo amido tal como sementes e tubérculos, antes do seu posterior tratamento por meio de, por exemplo, extracção do amido. Além disso, há algum interesse na produção de amidos modificados que tornarão as células das plantas e os órgãos das plantas contendo este amido mais apropriados para posterior tratamento, tal como para a produção de pipocas ou "Corn flakes a partir de batata ou de batatas fritas, batatas onduladas ou pó de batata a partir de batatas. Há um 3 interesse particular na melhoria dos amidos de tal modo que eles exibem um "adoçamento a frio" (cold sweetening) reduzido, isto é, uma libertação diminuída dos açúcares de redução (especialmente glicose) durante uma armazenagem de longo prazo, a baixas temperaturas. Em particular, as batatas são muitas vezes armazenadas a temperaturas de 4-8 °C de modo a minimizar a degradação do amido durante a armazenagem. Os açúcares redutores assim libertados, em particular a glicose, levam a reacções indesejadas que tornam o produto acastanhado (as chamadas reacções de Maillard) na produção de batatas fritas em palitos e batatas onduladas. 0 amido que pode ser isolado das plantas é muitas vezes adaptado a certos fins industriais por meio de modificações químicas que são normalmente consumidoras de tempo e caras. Por isso, é desejável encontrar possibilidades para produzir plantas que sintetizem um amido cujas propriedades já cumprem os requisitos da indústria transformadora.

Os processos convencionais para a produção dessas plantas são processos clássicos de criação e de produção de mutantes. Assim, por exemplo, produziu-se um mutante a partir de amido sintetizado do milho, com uma viscosidade alterada (patente de invenção norte-americana U.S. No. 5,331,108) e estabeleceu-se uma variedade de milho (waxi maize) por meio da criação, cujo amido consiste em quase 100% de amilopectina (Akasuka e Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Além disso, descreveram-se mutantes de batata e de ervilha que sinterizam amidos com um elevado teor de amilose (70% no milho e até 50% nas ervilhas) . Estes mutantes até agora não 4 foram caracterizados ao nível molecular e, por isso, não permitem a produção dos mutantes correspondentes noutras plantas que armazenam amido.

Alternativamente, as plantas que sintetizam amido com propriedades alteradas podem ser produzidas por meio de técnicas de ADN recombinante. Em vários casos, por exemplo, a modificação recombinante de plantas de batata que levam a uma alteração do amido sintetizado nessas plantas está descrita (por exemplo, patentes de invenção WO 92/11376; WO 92/14827). Contudo, para utilizar as técnicas da tecnologia dos genes, são necessárias sequências de ADN cujos produtos dos genes influenciam a síntese do amido, a modificação do amido ou a degradação do amido.

Por isso, o problema subjacente à presente invenção, consiste em providenciar moléculas de ácidos nucleicos e processos que permitem a alteração de plantas de tal modo que sintetizam um amido que difere do amido sintetizado naturalmente em plantas, no que respeita às suas propriedades físicas e/ou químicas, em particular um amido contendo um alto teor de amilose e é por isso mais apropriado para as utilizações gerais ou particulares.

Este problema tem sido resolvido por meio dos enquadramentos descritos nas presentes reivindicações.

Por isso, a presente invenção descreve moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos indicada na Seq ID n°2. Essas proteínas estão 5 presentes nos plastídeos das células das plantas, ligadas aos grânulos de amido, assim como na forma livre, isto é, na forma solúvel. Durante a expressão de E. coli, a actividade da enzima dessas proteínas levam a uma fosforilação aumentada do glicogénio sintetizado dentro das células. O peso molecular destas proteínas está dentro do intervalo de 140 a 160 kD se for determinado por meio de electroforese em gel de SDS . A presente invenção tem ainda por objecto moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência com a sequência de nucleótidos indicada na Seq ID n° 1, particularmente a região de codificação indicada na Seq ID n° 1. São igualmente descritas moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína da batata, a qual, nos plastídeos das células, está particularmente ligada aos grânulos e hidridiza com as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes na presente invenção ou a sua helicoidal complementar são também matéria da presente invenção. Neste contexto, o termo "hibridização" significa a hibridização em condições de hibridização convencionais, preferencialmente em condições severas, tal como descrito, por exemplo, em Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratori Manual, 2a Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, N.J.). Estas moléculas de ácido nucleico que hibridizam com as moléculas de ácido nucleico descritas em cima, podem ser derivadas principalmente de qualquer organismo desejado (isto é, procarióticas ou eucarióticas, em particular de bactérias, fungos, algas, organismos de plantas ou de animais) 6 compreendendo essas moléculas de ácidos nucleicos. Derivam principalmente de plantas monocotiledóneas ou dicotelodóneas, particularmente de plantas úteis e, particularmente preferidas, as plantas que armazenam amido.

As moléculas de ácido nucleico que hibridizam com as moléculas descritas em cima podem ser isoladas, por exemplo, a partir de bibliotecas de ADNc ou genómico de vários organismos. Por isso, a identificação e o isolamento dessas moléculas de ácido nucleico podem ter lugar utilizando moléculas de ácido nucleico descritas em cima ou parte dessas moléculas ou, se for caso disso, as helicoidais complementares reversas destas moléculas, por exemplo, por hibridização de acordo com processos normalizados (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratori Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, N.I.).

Como uma sonda de hibridização, podem-se utilizar, por exemplo, moléculas de ácido nucleico, que contêm exactamente ou basicamente a sequência de nucleótidos indicada na Seq ID N° 1 ou partes dela. Os fragmentos de ADN utilizados como sonda de hibridização podem também ser fragmentos de ADN sintéticos que foram produzidos por meio de processos de sintetização ADN comuns e cuja sequência é praticamente idêntica à da molécula de ácido nucleico da presente invenção. Depois da identificação e do isolamento dos genes de hibridização com as sequências de ácido nucleico descritas em cima, a sequência tem de ser determinada e as propriedades 7 das proteínas codificadas pela sequência têm de ser analisadas.

Para além disso, a presente invenção descreve moléculas de ácido nucleico, cujas sequências são degeneradas como resultado do código genético, em comparação com as sequências das moléculas descritas em cima, e as quais codificam uma proteína, a qual se encontram ligadas parcialmente ao grânulo de amido em células de plantas plastídeas. São igualmente descritos fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes, que codificam a proteína mencionada antes. Aqui, os fragmentos são partes das moléculas de ácidos nucleicos que são suficientemente longas de modo a codificarem a proteína descrita antes. Neste contexto, o termo derivado significa que as sequências destas moléculas diferem das sequências das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes em uma ou mais posições e exibem um elevado grau de homologia com as sequências destas moléculas. Aqui, homologia significa que uma identidade da sequência de pelo menos 40%, em particular uma identidade de pelo menos 60%, preferencialmente de mais do que 80% e ainda mais preferencialmente uma identidade da sequência da mais do que 90%. Os desvios das moléculas de ácidos nucleicos descritos antes podem ter sido causados por eliminação, substituição, inserção ou recombinação.

Além disso, homologia significa que existe equivalência funcional e/ou estrutural entre as moléculas de ácidos nucleicos respectivas ou as proteínas que elas codificam. As 8 moléculas de ácidos nucleicos descritas antes e representam derivados destas moléculas, são geralmente variações das moléculas de ácidos nucleicos que constituem modificações que exercem a mesma função biológica. Estas variações podem ser variações que ocorrem naturalmente, por exemplo, sequências de diferentes organismos ou mutações, em que estas mutações podem ter ocorrido naturalmente ou podem ter sido introduzidas deliberadamente. Além disso, as variações podem ser sequências produzidas sinteticamente. AS variantes alélicas podem ocorrer tanto naturalmente assim como serem produzidas sinteticamente ou variantes produzidas por técnicas de ADN recombinante.

As proteínas codificadas pelas várias variantes das moléculas de ácidos nucleicos exibem certas características comuns. A actividade da enzima, o peso molecular, a reactividade imunológica, a conformação, etc., podem pertencer a estas características, assim como as propriedades físicas tal como a mobilidade em gel de electroforese, características cromatográficas, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades aspectroscópicas, estabilidade, pH óptimo, temperatura óptima, etc. ervilhas, mandioca, arroz

As moléculas de ácido nucleico descritas podem ser derivadas principalmente de qualquer organismo que expressam as proteínas descritas, derivando preferencialmente de plantas, em particular de plantas que sintetizam amido ou que armazenam amido. Os cereais (tal como cevada, centeio, cevada, trigo, etc.), milho, 9 batata, etc. são particularmente preferidos. Além disso, podem ser produzidos por meio de processos de síntese conhecidos pelos especialistas na matéria.

As moléculas de ácido nucleico descritas podem ser moléculas de ADN, tal como ADNc ou ADN genómico, assim como moléculas de ARN.

Além disso, são descritos vectores, em particular plasmídeos, cosmideos, vírus, bacteriófagos e outros vectores comuns na engenharia genética, que contêm as moléculas de ácido nucleico da presente invenção mencionadas antes. São preferidas as moléculas de ácido nucleico contidas nos vectores estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células procarióticas e eucarióticas. São também descritas células hospedeiras, em particular células procarióticas e eucarióticas, que tenham sido transformadas e/ou manipuladas por meio de uma das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes ou por meio de um vector da presente invenção, assim como as células derivadas dessas células e contendo uma molécula de ácido nucleico acima descrita ou um vector da presente invenção. Preferencialmente, são células de bactérias ou de plantas.

Verificou-se agora que a proteína codificada pelas moléculas de ácidos nucleicos acima descritas influencia a síntese ou a modificação do amido e que altera a quantidade de proteína nas células das plantas conduzindo a alterações no 10 metabolismo do amido da planta, em particular na síntese de amido com propriedades físicas e químicas modificadas.

Providenciando as moléculas de ácidos nucleicos acima descritas, é assim possível produzir plantas por meio de processos tecnológicos de genes sintetizando um amido modificado que difere do amido sintetizado em plantas do tipo selvagem, no que respeita à sua estrutura e às suas propriedades físicas e químicas. Com esta finalidade, as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição e translação em células de plantas e são introduzidas nas células de plantas.

Assim, são também descritas células de plantas transgénicas que contêm uma molécula de ácido nucleico acima descrita, em que a mesma está ligada a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas. Os elementos reguladores são preferencialmente heterólogos no que respeita à molécula de ácido nucleico. Por meio de processos conhecidos dos especialistas na matéria, as células de plantas transgénicas podem ser regeneradoras e originar plantas inteiras. As plantas que se podem obter por regeneração de células de plantas transgénicas descritas são plantas que contêm as células de plantas transgénicas descritas antes. As plantas transgénicas podem, em princípio, ser plantas de qualquer espécie desejada, isto é, podem ser plantas monocotiledóneas assim como dicotiledóneas. Estas são plantas preferencialmente úteis, em particular plantas que armazenam 11 amido tal como cereais (tal como cevada, centeio, cevada, trigo, etc.), milho, arroz, ervilhas, mandioca e batata.

Devido à expressão ou à expressão adicional de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, as células de plantas transgénicas e as plantas transgénicas descritas sintetizam um amido que está modificado, quando comparado com o amido de plantas do tipo selvagem, isto é, plantas não transformadas, particularmente no que respeita à viscosidade de soluções aquosas deste amido e/ou ao teor de fosfato. Este último está normalmente aumentado no amido das células de plantas transgénicas ou plantas transgénicas, alterando assim as propriedades fisicas do amido.

Descrito é também o amido que se pode obter a partir das células de plantas transgénicas ou plantas transgénicas da presente invenção. È descrito ainda um processo para a produção de uma proteína que está presente nas células das plantas numa forma ligada a grânulos, assim como sob a forma solúvel, em que se faz uma cultura de células hospedeiras descritas em cima, em condições que permitem a expressão da proteína e em que a proteína é então isolada das células de cultura e/ou do meio da cultura. São ainda descritas as proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos acima descritas, assim como proteínas que se podem obter pelo processo descrito antes. São preferencialmente proteínas codificadas por genes nucleares e 12 que se localizam nos plastídeos. Nos plastídeos, estas enzimas estão presentes sob uma forma ligada a grânulos assim como sob a forma livre. Numa electroforese em gel de SDS, as proteínas respectivas de Solanum tuberosum exibiram um peso molecular de 140-160 kD e, durante a expressão de E.coli, conduz a uma fosforilação aumentada do glicogénio sintetizado dentro das células.

Verificou—se que é possível influenciar as propriedades do amido sintetizado em células de plantas por meio da redução de quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, nas células. Esta redução pode ser efectuada, por exemplo, por meio da expressão, em sentido inverso, das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, expressão de ribozimas apropriados ou co-supressão. A ressente invenção divulga portanto moléculas de ADN que codificam um ARN de sentido inverso que é complementar dos transcritos de uma molécula de ADN acima descrita são também matéria objecto da presente invenção, assim como estas moléculas de sentido inverso. Aqui, complementar não significa que o ARN codificado tenha de se 100% complementar, mas sim um baixo grau de complementaridade é suficiente, desde que seja suficientemente elevado de modo a inibir a expressão de uma proteína da presente invenção, após a expressão em células de plantas. O ARN transcrito é preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente 95% complementar a um transcrito da molécula de ácido nucleico da presente invenção. Para causar um efeito de sentido inverso 13 duradouro durante a transcrição em células de plantas, essas moléculas de ADN têm um comprimento de pelo menos 15 pb, preferencialmente um comprimento de mais do que 100 pb e, mais preferencialmente, um comprimento de mais do que 500 pb, contudo, normalmente menos do que 5000 pb, preferencialmente mais curto do que 2500 pb. O pedido divulga ainda moléculas de ADN que, durante a expressão nas células das plantas, leva à síntese de um ARN que, nas células das plantas, devido ao efeito de co-supressão, reduz a expressão de moléculas de ácidos nucleicos acima descritas codificando a proteína descrita. O princípio da co-supressão, assim como a produção das sequências de ADN correspondentes está descrito com precisão, por exemplo, na patente de invenção WO 90/12084. Essas moléculas de ADN codificam preferencialmente um ARN com um elevado grau de homologia com os transcritos das moléculas de ácidos nucleicos acima descritas. Aqui, não é contudo absolutamente necessário que a codificação de ARN seja traduzida numa proteína.

Num outro enquadramento, a presente invenção divulga moléculas de ADN que codificam uma molécula de ARN com actividade de ribozima, cujos transcritos clivam especificamente de uma molécula de ADN descrita em cima.

As ribozimas são moléculas ARN activas sob o ponto de vista catalítico capazes de clivar moléculas de ARN e sequências alvo específicas. Por meio de processos da tecnologia dos genes, é possível alterar a especificidade dos ribozimas. Há 14 várias classes de ribozimas. Para aplicações práticas que visam a clivagem especifica do transcrito de um certo gene, faz-se preferencialmente uso de representantes de dois grupos de ribozimas diferentes. 0 primeiro grupo é feito de ribozimas que pertencem ao grupo I de intrões do tipo de ribozima. 0 segundo grupo consiste em ribozimas que, como uma caracteristica estrutural caracteristica exibem a estrutura chamada "cabeça de martelo" (hammerhead). O reconhecimento especifico da molécula alvo de ARN pode ser modificado alterando as sequências que flanqueiam esta estrutura. Emparelhando bases com sequências na molécula alvo, estas sequências determinam a posição em que a reacção catalítica e portanto a clivagem da molécula alvo tem lugar. Dado que os requisitos da sequência para uma clivagem eficiente são extremamente baixos, é possível, em princípio, desenvolver ribozimas específicas para praticamente cada molécula de ARN desejada.

Para produzir moléculas de ADN que codificam uma ribozima que cliva especificamente os transcritos de uma molécula de ADN descrita em cima, por exemplo uma sequência de ADN que codifica um domínio catalítico de uma ribozima, estão ligados bilateralmente as sequências de ADN que são homologas às sequências da enzima alvo. As sequências que codificam o domínio catalítico podem ser, por exemplo, o domínio catalítico de ADN satélite do vírus SCMo (Davies et al.,

Virologi 177 (1990) , 216-224) ou o do ADN satélite do vírus

TobR (Steinecke et al., EMBO J. 11 (1992), 1525-1530;

Haseloff e Gerlach, Natura 334 (1988), 585-591). As sequências de ADN que flanqueiam o domínio catalítico são 15 derivadas, preferencialmente das moléculas de ADN da presente invenção descritas antes.

Um outro aspecto divulga vectores que contêm as moléculas de ADN descritas antes, em particular aquelas em que as moléculas de ADN descritas estão ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas. São ainda descritas células hospedeiras contendo as moléculas de ADN descritas ou os vectores. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana ou uma célula eucariótica. Preferencialmente, as células eucarióticas hospedeiras são células de plantas.

Além disso, a presente invenção divulga ainda células de plantas transgénicas contendo uma molécula de ADN descrita antes codificando um ARN de sentido inverso, um ribozima ou um ARN que leva a um efeito de co-supressão, em que a molécula de ADN está ligada a elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas. Estas células de plantas transgénicas podem ser regeneradas para plantas completas de acordo com técnicas bem conhecidas. Assim, a presente invenção tem por objecto plantas que se podem obter através da regeneração das células de plantas transgénicas descritas, assim como plantas que contém as células de plantas transgénicas descritas. As próprias plantas transgénicas podem ser plantas de qualquer espécie de planta desejada, preferencialmente plantas úteis, particularmente as que armazenam amido, tal como indicado antes. 16

Devido à expressão das moléculas de ADN descritas que codificam o ARN de sentido inverso, à ribozima ou a um ARN de co-supressão nas células de plantas transgénicas, a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN acima descritas que estão presentes nas células sob a forma endogénica e reduzida. Surpreendentemente, esta redução leva a uma alteração drástica das propriedades físicas e químicas do amido sintetizado nas células das plantas, em particular no que respeita às propriedades de viscosidade das soluções aquosas deste amido, o teor de fosfato, assim como a libertação de açúcares redutores na armazenagem das células de plantas ou em partes da planta, a baixa temperatura. As propriedades do amido sintetizado nas células de plantas transgénicas são explicitamente descritas aqui.

Assim, é também descrito o amido que se obtêm das células das células plantas transgénicas e das plantas descritas antes.

Além disso, a presente invenção divulga moléculas de ARN de sentido inverso codificadas pelas moléculas de ADN descritas, assim como moléculas de ARN com actividade de ribozima e moléculas de ARN que levam ao efeito de co-supressão que se obtêm, por exemplo, por meio da transcrição.

Num outro aspecto, é descrito é um processo para a produção de células de plantas transgénicas que, em comparação com as células não transformadas, sintetiza um amido modificado, em que a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de 17 ADN acima descritas, que estão presentes sob a forma endogénica, é reduzida nas células da planta.

Numa forma de realização, esta redução é efectuada por meio de um efeito de sentido inverso. Com este fim, as moléculas de ADN da presente invenção ou as suas partes são ligadas, numa orientação de sentido inverso, com um promotor que assegura a terminação da transcrição assim como a poliadenilação do transcrito. Para assegurar um efeito de sentido inverso eficiente nas células das plantas, o ARN de sentido inverso sintetizado deve exibir um comprimento mínimo de 15 nucleótidos, preferencialmente de pelo menos 100 nucleótidos e, mais preferencialmente, de mais do que 500 nucleótidos. Além disso, a sequência de ADN que codifica o ARN de sentido inverso deve ser homólogo no que respeita às espécies de plantas a ser transformadas. Contudo, as sequências de ADN que exibem um elevado grau de homologia com as sequências de ADN que estão presentes nas células sob a forma endogénica, podem também ser utilizadas, preferencialmente com uma homologia de mais do que 90% e, mais preferencialmente, com uma homologia de mais do que 95%.

Numa outra forma de realização preferida, a redução da quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN acima descritas é efectuada por um efeito de ribozima. O efeito básico dos ribozimas assim como a construção de moléculas de ADN que codificam essas moléculas de ARN já foi descrito antes. Para expressar um ARN com actividade de ribozima estão ligados com os elementos de ADN que asseguram a transcrição em células de plantas, particularmente com um 18 promotor e um sinal de terminação. As ribozimas sintetizadas nas células das plantas 1 evam à clivagem de transcritos das moléculas de ADN acima descritas que estão presentes nas células de plantas sob a forma endogénica.

Uma outra possibilidade de reduzir a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos acima descritas é a co-supressão.

Por isso, as células de plantas obtidas pelo processo descrito são caracterizadas pelo facto de a quantidade de proteínas codificadas pelas moléculas de ADN da presente invenção ser reduzida e por, em comparação com as células de tipo selvagem, sintetizarem um amido modificado.

Além disso, a presente invenção tem por objecto plantas que se obtêm por regeneração das células de plantas descritas, assim como as plantas que contêm as células descritas da presente invenção. O amido que se obtêm a partir das células de plantas e das plantas descritas na presente invenção, em comparação com os amidos de plantas de tipo selvagem, difere nas suas propriedades físicas e/ou químicas. Por exemplo, este amido contém um teor reduzido de fosfato em comparação com os amidos de plantas do tipo selvagem. Além disso, as soluções aquosas deste amido exibem propriedades de viscosidade modificadas. 19

Numa forma de realização preferida, o teor de fosfato do amido descrito é reduzido de pelo menos 50 %, mais preferencialmente de pelo menos 75% e, num enquadramento particularmente preferido, de mais de 80% em comparação com o amido derivado de plantas selvagens. A viscosidade modificada da solução aquosa deste amido é a sua caracteristica mais vantajosa.

Um ensaio bem estabelecido para a determinação de viscosidade é o chamado ensaio de Barbender. Este ensaio realiza-se utilizando uma aplicação que é conhecida, por exemplo, como viscógrafo. Este equipamento é produzido e vendido, entre outros, por Brabender OHG Duisburg (Alemanha). O ensaio consiste, basicamente, em aquecer primeiro o amido na presença de água de modo a avaliar quando tem lugar a hidratização e o aumento de volume dos grânulos de amido. Este processo, que também é designado por gelatinização ou pastificação, baseia-se na dissolução das ligações de hidrogénio e envolve um aumento mensurável da viscosidade na suspensão de amido. Embora o posterior aquecimento depois da gelatinização conduza à dissolução completa das partículas de amido e à diminuição da viscosidade, o arrefecimento imediato, após a gelatinização normalmente conduz a um aumento da viscosidade (ver fig. 3). O resultado do ensaio de Brabender é um gráfico que mostra a viscosidade em função do tempo, em que, primeiro se aquece a solução acima da temperatura de gelatinização e depois arrefece-se. 20 A análise do gráfico de Barbender geralmente conduz à determinação da temperatura de pastificação, a viscosidade máxima durante o aquecimento, ao aumento na viscosidade durante o arrefecimento, assim como a viscosidade depois do arrefecimento. Estes parâmetros são caracteristicas importantes quando se trata da qualidade de um amido e da possibilidade de utilizá-lo para vários fins. O amido que pode, por exemplo, ser isolado a partir de plantas de batata em que a quantidade de proteínas acima descritas dentro das células foi reduzida por meio de um efeito de sentido inverso, mostrou características que se desviavam fortemente das características do amido isolado das plantas selvagens. Comparado com estas, mostra apenas um aumento ligeiro na viscosidade durante o aquecimento, uma viscosidade máxima baixa, assim como um aumento mais forte na viscosidade durante o arrefecimento (ver fig. 3, 4 e 5). É por exemplo descrito um amido, cujas soluções aquosas exibem as propriedades de viscosidade características descritas nas figs. 4 ou 5. Particularmente nas condições mencionadas no exemplo 8, para a determinação da viscosidade com a ajuda de um viscosímetro de Brabender, o amido modificado, quando comparado com as plantas de tipo selvagem, exibe a caracteristica de apenas um pequeno aumento na viscosidade quando se aquece a solução. Isto oferece a oportunidade de utilizar o amido para a produção de colas altamente concentradas. Além disso, depois de se atingir a viscosidade máxima, há apenas um pequeno decréscimo na viscosidade no caso do amido modificado. Por outro lado, a 21 viscosidade aumenta fortemente durante o arrefecimento; assim, a viscosidade do amido modificado é mais elevada do que a viscosidade do amido das plantas de tipo selvagem.

Reduzindo a quantidade de proteínas acima descritas nas células de plantas transgénicas, é além disso possível produzir um amido que tem o efeito que, quando as partes da planta que contêm este amido são armazenadas a temperaturas baixas, em particular a 4-8 °C, libertam-se açucares redutores em quantidades menores do que o caso com amido de células não transformadas. Esta propriedade é particularmente vantajosa, por exemplo, para originar batatas que, durante a armazenagem, a baixas temperaturas, liberta menos açúcares redutores e assim exibe um adoçamento a frio reduzido. Essas batatas são particularmente apropriadas para a produção de batatas em palitos, batatas onduladas ou produtos semelhantes desde que não ocorram reacções que acastanham (reacções de Maillard) indesejáveis ou, pelo menos, são significativamente reduzidas durante a utilização.

De acordo com um outro aspecto, não só a síntese de uma proteína acima descrita é reduzida nas células de plantas transformadas mas, além disso, também a síntese de pelo menos uma outra enzima envolvida na síntese e/ou modificação de amido. Neste contexto, por exemplo, as sintases de amido ligadas a grânulos de amido ou enzimas ramificadas são preferidas. Surpreendentemente, verificou-se que as plantas de batata em que a síntese da proteína da presente invenção assim como da enzima de ramificação é reduzida devida a um efeito em sentido inverso de um amido que as suas 22 propriedades se desviam fortemente do amido das plantas de tipo selvagem.

Em comparação com o amido de tipo selvagem, as soluções aquosas deste amido modificado não mostram aumento na viscosidade durante o aquecimento ou o arrefecimento (ver fig. 6). Além disso, uma análise microscópica dos grânulos de amido antes e depois do aquecimento mostra claramente que, em comparação com as plantas de tipo selvagem, os grânulos de amido de plantas modificadas de tal modo que não estão abertos mas permanecem praticamente inalterados na sua estrutura. Assim, trata-se de um amido que é resistente ao processo de cozimento. Se o teor de amilose deste amido é determinado por meio do processo descrito nos exemplos, os teores de amilose de mais do que 50%, preferencialmente, de mais do que 60% e, mais preferencialmente, de mais do que 70% são medidos para este amido. As soluções aquosas do amido isolado a partir destas plantas exibem, preferencialmente as propriedades de viscosidade caracteristicas descritas na fig. 6.

Em comparação com o amido do tipo selvagem, esse amido contendo amilose em alto teor oferece um certo número de vantagens para várias utilizações. Assim, os amidos contendo altos teores de amilose têm um potencial para serem utilizados em folhas metalizada e filmes. As folhas e os filmes produzidos com base em amidos com elevado teor de amilose, que podem ser utilizados em vastas áreas da indústria da embalagem, têm a vantagem essencial de serem biodegradáveis. Independentemente desta utilização que está 23 basicamente coberta por polímeros clássicos, produzidos petroquimicamente, a amilose têm outros campos únicos de aplicação que são causados pela capacidade da amilose para formar hélices. A hélice formada pela amilose é internamente hidrofóbica e externamente hidrofílica. Devido a isto, a amilose pode ser utilizada para a complezação e encapsulação molecular de substâncias de baixo e alto peso molecular. Exemplos disto são: - a encapsulação molecular de vitaminas e substâncias para a protecção contra a oxidação, volatilização, degradação térmica ou a transição num ambiente aquoso; - a encapsulação molecular de substâncias aromáticas para aumentar a solubilidade; - a encapsulação molecular de fertilizantes/pesticidas para a estabilização e libertação controlada; - a encapsulação molecular de substâncias medicinais para a estabilização do controlo da dosagem e da libertação controlada de preparações retardantes.

Outra propriedade importante da amilose é o facto de ser uma molécula quirálica. Devido à quiralidade, pode ser preferível que se utilize depois da imobilização, por exemplo, numa coluna para a separação dos enantiómeros.

Além disso, verificou-se, surpreendentemente, que o amido que pode ser isolado a partir de plantas de batata em que a quantidade de proteínas acima descritas nas células foi reduzida devido ao efeito em sentido inverso, em combinação com uma redução das proteínas que exibem a actividade 24 enzimática de uma sintase de amido ligada aos grânulos de amido do isótopo I (SALGAT) exibem caracteristicas que se desviam fortemente das caracteristicas do amido que pode ser isolado das plantas de tipo selvagem. Quando comparadas com o amido das plantas de tipo selvagem, as soluções aquosas deste amido apenas exibem um ligeiro aumento na viscosidade durante o aquecimento, uma viscosidade máxima baixa, assim como praticamente nenhum aumento na viscosidade durante o arrefecimento (ver fig. 7) . Quando se determina a relação amilose/amilopectina deste amido, este amido é caracterizado pelo facto de não se medir quase nenhuma amilose. 0 teor de amilose deste amido está preferencialmente abaixo de 5 % e, mais preferencialmente, abaixo de 2 %. 0 amido descrito difere, além disso, do amido conhecido que pode ser produzido em plantas transgénicas de batata por inibição do gene da SALGAI unicamente por meio dos processos da tecnologia dos genes. Assim, este amido mostra um forte aumento na viscosidade durante o aquecimento. As soluções aquosas de amido da presente invenção exibem as propriedades de viscosidade caracteristicas descritas na fig. 7. Particularmente nas condições para a determinação da viscosidade por meio de um analisador de viscosidade rápido descrito no exemplo 13, tendo o amido modificado a caracteristica de exibir apenas um baixo aumento de viscosidade durante o aquecimento quando comparado com o amido de tipo selvagem, mas também quando comparado com o amido do tipo selvagem, mas também quando comparada com amido ceroso. Isto oferece a oportunidade de utilizar o amido acima descrito para a produção de colas altamente concentradas. O amido modificado, além disso, tem a propriedade de haver 25 apenas um ligeiro decréscimo da viscosidade depois de se atingir a viscosidade máxima, assim como quase nenhum aumento na viscosidade durante o arrefecimento.

As possibilidades de reduzir a actividade de uma enzima ramificada em células de plantas foram já descritas, por exemplo, nas patentes de invenção WO 92/14827 e WO 95/26407. A redução da actividade de uma sintaxe de amido ligada a grânulos de amido do isótopo I (SALGAI) pode ser realizada utilizando processos conhecidos pelos especialistas, por exemplo, por meio de um efeito de sentido inverso. As sequências de ADN que codificam um SALGAI da batata são conhecidas, por exemplo, a partir de Hegersberg (dissertação (1988) Universidade de Colónia), Visser et al. (Plant Sei. 64 (1989) , 185-192) ou van der Leii et al. (Mol. Gen. Genet. 228 (1991), 240-248). O processo de acordo com a invenção pode ser utilizado, em principio, para qualquer tipo de espécie de planta. As plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas são de interesse, em particular plantas úteis e aqui, preferencialmente as plantas que armazenam amido tal como cereais (cevada, centeio, cevada, trigo, etc.), milho, arroz, ervilhas, mandioca e batatas.

Dentro do significado da presente invenção, a expressão "elementos de ADN reguladores que asseguram a transcrição em células de plantas" está relacionada com as regiões de ADN que permitem a iniciação ou o término da transcrição em células de plantas. As regiões de ADN que asseguram a 26 iniciação da transcrição são, em particular, promotores. Para a expressão das várias moléculas de ADN da presente invenção descritas antes, pode-se utilizar qualquer promotor que funcione nas células das plantas. 0 promotor pode ser homólogo ou heterólogo no que respeita às espécies de plantas utilizadas. Pode-se utilizar, por exemplo, o promotor 35S do vírus em mosaico da couve-flor (Odell et al., Natura 313 (1985), 810-812) que assegura uma expressão constitutiva em todos os tecidos de plantas e também da estrutura do promotor descrita na patente de invenção WO/9401571. Contudo, também se podem utilizar promotores que levem a uma expressão das sequências subsequentes apenas num momento determinado por factores exógenos (tal como na patente de invenção WO/9307279) ou num tecido particular da planta (ver, por exemplo, Stockhaus et al., EMBO J. 6 (1989), 2245-2251). Os promotores que são activos nas partes que armazenam amido da planta que vai ser transformada, são os que se utilizam preferencialmente. No caso do milho, estas partes são núcleos, em que, no caso das batatas, estas partes são os tubérculos. Para transformar as batatas, pode-se utilizar, particularmente, mas não exclusivamente, o promotor B33 Rocha-Sosa et al. , EMBO J. 8 (1989), 23-29) específico dos tubérculos.

Independentemente dos promotores, as regiões de ADN que iniciam a transcrição podem também conter sequências de ADN que asseguram um outro elemento da transcrição, tal como os chamados elementos melhoradores. 27

Além disso, a expressão "elementos reguladores de ADN" podem também compreender sinais de terminação que servem para terminar correctamente a transcrição e para adicionar uma cauda de poli-A ao transcrito que se acredita que estabilize os transcritos. Esses elementos estão descritos na literatura e podem-se trocar como se queira. Exemplos dessas sequências da terminação são as regiões 3' não traduzidas, que compreendem o sinal de poliadenilação do gene de nopalisa sintase (gene NOS) ou o gene de octopina sintase ((Gielen et al. , EMBO J. 8 (1989), 23-29) da agrobactéria ou as regiões 3' não traduzidas dos genes das proteínas de armazenagem da soja assim como os genes da sub-unidade pequena de ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase (ssRUBISCO). A introdução das moléculas de ADN acima descritas em células de plantas é realizada, preferencialmente, utilizando plasmídeos. Os plasmídeos que asseguram uma integração estável do ADN no genoma da planta são preferidos.

Nos exemplos da presente invenção, utiliza-se o vector binário pBinAR (Hõfgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230). Este vector deriva de um vector binário pBinl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721), que pode ser obtido comercialmente (Clontech Laboratories, Inc. EUA).

Contudo, pode-se utilizar qualquer vector de transformação de plantas que possa ser inserido numa cassete de expressão e que assegura a integração da cassete de expressão no genoma da planta. 28

Para preparar a introdução de genes estranhos em plantas superiores, está à disposição um grande número de vectores de clonagem, contendo um sinal de replicação para E. coli e um gene marcador para a selecção das células bacterianas transformadas. Exemplos desses vectores são pBR322, séries de pUC, séries de M13mp, pACYC184 etc. A sequência desejada pode ser integrada no vector num sitio de restrição apropriado. 0 plasmideo obtido é utilizado para a transformação das células de E.coli. Faz-se uma cultura das células de E. coli num meio apropriado e em seguida colhem-se e faz-se a lise. Recupera-se o plasmideo por meio de processos padrão. Como um processo de análise para a caracterização do ADN do plasmideo obtido, utiliza-se geralmente análise da restrição e análise de sequências. Depois de cada manipulação, pode-se clivar o ADN do plasmideo e os fragmentos obtidos podem ligar-se a outras sequências de ADN.

Para introduzir o ADN numa célula da planta hospedeira, está disponível uma vasta gama de técnicas. Estas técnicas compreendem a transformação das células das plantas com ADN-T, utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como meio de transformação, a fusão de protoplastos, a injecção e a electroporação de ADN, a introdução de ADN por meio do processo biolístico, assim como outras possibilidades.

No caso de injecção e electroporação de ADN nas células das plantas, não há requisitos especiais para a utilização dos plasmídeos. Os plasmídeos simples tais como os derivados de pUC, podem ser utilizados. Contudo, no caso de serem 29 regeneradas plantas completas a partir de células transformadas dessa forma, deve estar presente um gene marcador seleccionável.

Consoante o processo de introdução nas células das plantas, dos genes desejados, podem ser necessárias mais sequências de ADN. Se, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri forem utilizados para a transformação da célula da planta, pelo menos a borda do lado direito, mais frequentemente, contudo, os bordos direito e esquerdo do ADN T dos plasmídeos Ti e Ri têm de ser ligados ao gene estranho a ser introduzido como região de flanqueio.

Se se utilizam Agrobactérias para a transformação, o ADN que se introduz deve ser clonado em plasmídeos especiais, nomeadamente quer num vector intermédio ou num vector binário. Devido aos homólogos de sequências em relação às sequências dentro do ADN-T, os vectores intermédios podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri da Agrobacterium devido à recombinação homóloga. Esta também contém a região vir necessária para a transferência do ADN-T. Os vectores intermédios não podem replicar na Agrobactéria. Por meio de um plasmídeo auxiliar, o vector intermédio pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens (conjugação). Os vectores binários podem replicar em E. coli, assim como nas Agrobactérias. Contêm um gene marcador seleccionável assim como um ligante ou um poliligante que é emoldurado à direita e à esquerda pela região da fronteira de ADN-T. Podem ser transformados directamente numa Agrobactéria (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 161-187). Os plasmídeos 30 utilizados para a transformação das Agrobactérias contêm ainda um gene marcador seleccionável, tal como o gene NPT II que permite a selecção das bactérias transformadas. A Agrobacterium que actua como célula hospedeira deve conter um plasmideo que comporta uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do ADN-T para as células de plantas. O ADN-T adicional pode estar presente. A Agrobacterium transformada dessa maneira é utilizada para a transformação de células de plantas. A utilização de ADN-T para a transformação de células de plantas foi investigada intensamente e descrito suficientemente na patente da invenção europeia EP 120 516, Hoekema, em: The Binari Plant Vector Sistem Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Capitulo V, Fralei et al., Crit. Ver. Plant. Sei., 4, 1-46 e An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287. Alguns vectores binários podem já ser obtidos comercialmente, tal como pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., EUA).

Para transferir o ADN para as células das plantas, os explantes das plantas podem ser co-cultivadas apropriadamente com Agrobacterium tumefaciens ou Agorbacterium rhizogenes. A partir do material de plantas infectadas (por exemplo, bocados de folhas, segmentos de estema, raízes, mas também protoplastos ou células de plantas em cultura numa suspensão), podem-se então regenerar plantas completas num meio apropriado que pode conter antibióticos ou biózidos para a selecção de células transformadas. As plantas obtidas dessa forma podem então ser examinadas para avaliar se o ADN introduzido está presente ou não. 31

Logo que o ADN introduzido tenha sido integrado no genoma da célula da planta, normalmente continua a ser estável ai e também permanece nos descendentes da célula originalmente transformada. A célula contém normalmente um marcador seleccionado qual transmite às células de plantas transformadas resistência contra um biocida ou antibiótico como kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin ou phosphinotricin, entre outros. Os marcadores seleccionados individualmente devem por isso permitir uma selecção das células transformadas contra as células que não têm o ADN introduzido.

As células transformadas crescem da forma usual dentro da planta (ver também McCormick et al.r Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). As plantas resultantes podem ser postas em cultura de forma usual e serem cruzadas com plantas que têm a mesma herança genética transformada ou outra herança genética. Os indivíduos híbridos resultantes têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Devem crescer duas ou mais gerações para assegurar que a característica fenotípica é conservada de forma estável e que é transferida. Além disso, devem colher-se sementes de modo a assegurar que o fenótipo correspondente ou outras propriedades permanecerão.

Devido às suas propriedades, o amido obtido das células das plantas ou das plantas da presente invenção não só é apropriado para os fins específicos já mencionados antes, mais também para várias utilizações industriais. 32

Em principio, o amido pode ser subdividido em dois campos principais. Os produtos da hidrólise compreendem essencialmente glicose e componentes de glucanos obtidos por processos enzimáticos ou químicos, podendo ser utilizados para outros processos, tal como a fermentação ou modificações químicas. Neste contexto, pode ser importante que o processo de hidrólise pode ser realizado de uma forma simples e barata, normalmente, realizando-se praticamente de uma forma enzimática utilizando amiloglicosidase. É provável que os custos possam ser reduzidos utilizando quantidades menores de enzimas para hidrólise devido às alterações na estrutura do amido, por exemplo, aumentando a superfície do grão, melhorando a possibilidade de digerir devido a uma estrutura menos ramificada ou esférica do grão, o que limita a acessibilidade para as enzimas utilizadas. A utilização do chamado amido natural que se utiliza por causa da sua estrutura polimérica, pode ser subdividida em mais duas áreas: (a) Utilização em comestíveis 0 amido é um aditivo clássico para vários comestíveis, em que serve essencialmente a finalidade de ligação dos aditivos aquosos e/ou causa uma viscosidade aumentada ou uma formação de gel aumentada. As propriedades importantes características são o comportamento de fluidez e de absorção, o aumento de volume e a temperatura de pastificação, viscosidade e desempenho do espaçamento, solubilidade do amido, transferência e estrutura da pasta, calor, corte e 33 resistência a sais ácidos, tendências para retrogradação, capacidade de formação de filmes, resistência à congelação/descongelação, capacidade de ser digerível, assim como capacidade de formação de complexos com, por exemplo, iões inorgânicos ou orgânicos. (b) Utilização em não comestíveis 0 outro campo principal de aplicação é a utilização do amido como um adjuvante em vários processos de produção ou como um aditivo em produtos técnicos. Os principais campos de aplicação para se utilizar o amido como adjuvante são, primeiro que tido, a industria do papel e do cartão. Neste domínio, o amido é principalmente utilizado para retenção (segurar os sólidos), para o dimensionamento das cargas e das partículas finas, como uma substância de solidificação e para a desidratação. Além disso, as propriedades vantajosas do amido, no que respeita à dureza, som, força, brilho, maciez, força de lágrima, assim como o uso que se faz das superfícies.

Dentro do processo para a produção do papel, pode-se fazer uma diferenciação entre quatro campos de aplicação, nomeadamente superfície, revestimento, massa e pulverização.

Os requisitos do amido no que respeita ao tratamento da superfície são essencialmente um elevado grau de brilho, a viscosidade correspondente, a estabilidade a alta viscosidade, uma boa formação de filme, assim como uma baixa formação de pó. Quando no revestimento, o teor de sólido, a viscosidade correspondente, a elevada capacidade para se 34 ligar assim como uma elevada afinidade para pigmentos desempenham um papel importante. Como aditivo para a massa, a rapidez, uniformidade, dispersão isenta de perdas, elevada estabilidade mecânica e completa retenção na pasta de papel são de importância. Quando se utiliza o amido na pulverização, o teor de sólidos correspondente, a elevada viscosidade, assim como uma elevada capacidade de ligação são também significativas. Um domínio principal de aplicação é, por exemplo, na indústria dos adesivos, em que os campos de aplicação se subdividem em quatro áreas: a utilização como cola de amido puro, a utilização em colas de amido preparadas com produtos químicos especiais, a utilização do amido como um aditivo das resinas sintéticas e das dispersões de polímeros, assim como a utilização de amidos como extensores dos adesivos sintéticos. 90% dos adesivos à base de amido dão utilizados na produção de cartão canelado, sacos de papel, materiais compósitos para papel e alumínio, caixas e cola molhável para envelopes, selos, etc.

Uma outra utilização possível como adjuvante e aditivo é na produção de têxteis e produtos para tratar os têxteis. Dentro da indústria têxtil, pode-se fazer uma diferenciação entre os quatro campos de aplicação seguintes: a utilização de amido como um agente de dimensionamento, isto é, como um adjuvante para o amaciamento e o reforço do comportamento das brocas para a protecção contra forças tênseis activas na tecelagem, assim como para aumentar a resistência ao atrito durante a tecelagem, como um agente para a melhoria dos têxteis principalmente depois dos pré-tratamentos de qualidade-deterioração, tal como o lixiviamento, coloração etc., como 35 espessantes na produção de pastas de corantes para a prevenção da difusão de corante e como um aditivo para agentes de deformação para fios de costura.

Além disso, o amido pode ser utilizado como um aditivo em materiais de construção. Um exemplo é a produção de quadros de gesso e giz, em que o amido misturado no gesso fino plastifica com a água, difunde-se na superfície do quadro de gesso e assim liga-se ao cartão do quadro. Outros campos de aplicação são a mistura do amido ao gesso e fibras minerais. Em cimento pronto para utilizar, o amido pode ser utilizado para a desaceleração do processo de dimensionamento.

Além disso, o amido é vantajoso para a produção de meios para a estabilização dos selos utilizados para a protecção temporária de partículas de selo contra a água em troca de terra artificial. De acordo com o conhecimento do estado da técnica, os produtos de combinação consistiam em amido e emulsões de polímeros podem ser considerados como tendo efeito de erosão e de incrustação como os produtos utilizados até aqui; contudo, eles são consideravelmente mais baratos.

Outro domínio de aplicação é a utilização do amido em protectores de plantas para a modificação das propriedades específicas destas preparações. Por exemplo, os amidos utilizam-se para melhorar a molhagem de protectores de plantas e fertilizantes, para a libertação doseada dos ingredientes activos, para a conversão de ingredientes activos líquidos, voláteis e/ou cheirosos em substâncias microcristalinas, estáveis, deformáveis, para a mistura de 36 composições incompatíveis e para o prolongamento da duração do efeito devido a uma desintegração reduzida.

Domínios importantes de aplicação são os domínios dos fármacos, da medicina e da indústria dos cosméticos. Na indústria farmacêutica, o amido pode ser utilizado como um ligante para comprimidos ou para a diluição do ligante em cápsulas. Além disso, o amido é apropriado como desintegrante para comprimidos, dado que, após aumentar de volume, absorve fluido e, depois de um curto espaço de tempo, aumenta tanto de volume que o ingrediente activo é libertado. Por razões qualitativas, os fluxos medicinais e os pós são outros domínios de aplicação. No domínio dos cosméticos, o amido pode, por exemplo, ser utilizado como um veículo de aditivos em pó, tal como essências e ácido salicílico. Um campo relativamente extenso de aplicação do amido é a pasta de dentes. É possível a utilização do amido como um aditivo para o carvão e os briquetes. Adicionando amido, o carvão pode ser quantitativamente aglomerado e/ou transformado em briquetes de alta qualidade, prevenindo assim a desintegração prematura das briquetes. 0 carvão para churrasco contém entre 4 e 6% de amido adicionado, o carvão calorífero tem entre 0,1% e 0,5%. Além disso, o amido é apropriado como um agente de ligação, dado que a sua adição e a briquetes pode reduzir consideravelmente a emissão de substâncias tóxicas.

Além disso, o amido pode ser utilizado como um floculante no tratamento de minério e pasta de carvão. 37

Um outro campo de aplicação é a utilização de um aditivo para tratar materiais de fundição. Para vários processos de fundição, são necessários núcleos produzidos a partir de areias misturadas com agentes de ligação. Hoje em dia, o agente de ligação mais frequentemente utilizado é a bentonite misturada com amidos modificados, a maior parte, amidos que aumentam de volume. A finalidade da adição de amido é aumentar a resistência do fluxo assim como melhorar a força de ligação. Além disso, os amidos que aumentam de volume podem cumprir todos os pré-requisitos para o processo de preparação, tal como dispersibilidade em água fria, rehidratisabilidade, boa capacidade de se misturar com a areia e uma elevada capacidade de se ligar com água.

Na indústria da borracha, pode-se utilizar amido para melhorar a qualidade técnica e óptica. As razões para isto são a melhoria do brilho da superfície, a resistência e a aparência. Com esta finalidade, dispersa-se o amido nas superfícies aborrachadas pegajosas das substâncias de borracha antes da vulcanização a frio. Também pode ser utilizado para melhorar a capacidade de imprimir na borracha.

Um outro domínio de aplicação para o amido modificado é a produção de substitutos de couro.

No mercado do plástico, estão a emergir os seguintes campos de aplicação: a integração de produtos derivados de amido no processo de transformação do amido é apenas uma carga, não há uma ligação directa entre o polímero sintético e o amidol ou, 38 alternativamente, a integração de produtos derivados de amido na produção de polímeros (amido e polímero formam uma ligação estável). A utilização do amido como uma carga pura não pode concorrer com outras substâncias tal como o talco. Esta situação é diferente quando as propriedades específicas do amido se tornam efectivas e o perfil de propriedade dos produtos finais está assim claramente alterada. Um exemplo é a utilização de produtos de amido na transformação de materiais termoplásticos, tal como polietileno. Aqui, o amido e o polímero sintético estão combinados numa relação de 1:1 por meio da co-expressão para formar um "lote mestre", a partir do qual se produzem vários produtos por meio de técnicas comuns utilizando polietileno granulado. A integração de amido nos filmes de polietileno pode causar uma permeabilidade acrescida das substâncias em corpos ocos, uma permeabilidade ao vapor de água melhorada, comportamento anti-estático melhorado, comportamento anti-bloco melhorado, assim como uma capacidade de ser impressa melhorada com corantes aquosos.

Outra possibilidade é a utilização de amido em espumas de poliuretano. Devido à adaptação dos derivados de amido, assim como devido à optimização das técnicas de transformação, é possível controlar especificamente a reacção entre polímeros sintéticos e os grupos hidroxi do amido. Os resultados são filmes de poliuretano com os perfis de propriedades que se seguem devido à utilização do amido: um coeficiente reduzido de expansão térmica, uma diminuição do comportamento de 39 enrugamento, uma melhoria do comportamento da pressão/tensão, um aumento da permeabilidade do vapor de águia sem uma alteração na absorção de água, redução da inflamabilidade e densidade de craqueamento, sem derrames de partes do combustível sem halogenetos e uma redução do envelhecimento. 0 desenvolvimento do produto do filme não é a única opção.

Também produtos plásticos sólidos, tal como potes, pratos e tigelas, podem ser produzidos por meio de um teor de amido de mais do que 50%. Além disso, as misturas de amido/polimero oferecem a vantagem de serem mais facilmente biodegradáveis.

Além disso, devido à sua extrema capacidade de se ligar à água, os polímeros de enxerto de amido ganharam uma enorme importância. Trata-se de produtos que têm uma estrutura de amido e um gradeamento de um monómero sintético enxertado de acordo com o princípio do mecanismo de cadeia lateral. Os polímeros de enxerto de amido disponíveis hoje em dia são caracterizados por uma ligação melhorada e a capacidade de retenção até 1000 g de água por g de amido a uma elevada viscosidade. Estes super-absorventes são utilizados principalmente no domínio da higiene, por exemplo, em produtos tais como guardanapos e toalhas, assim como no sector da agricultura, por exemplo em grânulos de sementes.

Os factores decisivos para a utilização do novo amido modificado pelos processos da tecnologia de genes são, por outro lado, a estrutura, o teor de água, o teor de proteína, o teor de lípido, o teor de fibra, o teor de cinzas/fosfato, a relação de amilose/amilopectina, a distribuição da massa 40 molar relativa, o grau da ramificação, a dimensão e a forma dos grânulos, assim como a cristalização e, por outro lado, as propriedades que resultam nas características seguintes: comportamento de fluxo e da absorção, temperatura de pastificação, viscosidade, desempenho do espessamento, solubilidade, estrutura da pasta, transparência, calor, corte e resistência ao ácido, tendência para retrogradação, capacidade de formação de gel, resistência à congelação/descongelação, capacidade de formação de complexos, ligação ao iodo, formação de filmes, força adesiva, estabilidade da enzima, digestibilidade e reactividade. A caracteristica mais marcante é a viscosidade.

Além disso, o amido modificado obtido das células descritas das plantas ou das plantas pode ser submetido a outras modificações químicas, o que resultará noutra melhoria da qualidade de certos campos de aplicação descritos antes ou em campos de aplicação. Estas modificações químicas são conhecidas principalmente dos especialistas na matéria. Em particular trata-se de modificações por meio de

Tratamento com ácido

Oxidação e esterificação (formação de amidos de fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato e citrato; também se podem utilizar outros ácidos orgânicos para a esterificação) formação de éteres de amido (éter de alquilo e amido, éter de O-alilo, éter de hidroxialquilo, éter de 0-carbocilmetilo, éteres de amido contendo N, éteres de amido contendo S) 41

Formação de amidos ramificados

Formação de polímeros enxertados em amido

Os plasmídeos produzidos e/ou utilizados dentro do significado da presente invenção, têm sido depositados no depósito conhecido internacionalmente "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)" em Braunschweig, República Federal da Alemanha, de acordo com os requisitos do tratado de Budapeste para o reconhecimento internacional de depósitos de microrganismos para serem patenteados (número de depósito; data de depósito): Plasmídeo pBinAR Hig (DSM 9505) (20.10.1994)

Plasmídeo p33-anti-BE (DSM 6146) (20.08.1990)

Plasmídeo pRL2 (DSM 10225) (04.09.1995)

Meios e soluções utilizados

Tampão de eluição 25 mM Tris pH 8,3 250 mM Glicina Tampão de diálise 50 mM Tris-HCl pH 7,0 50 mM NaCl 2 mM EDTA 14,7 mM β-Mercaptoetanol 0,5 mM PMSF Tampão de proteína 50 mM Tampão de fosfato 10 mM EDTA LO O mM PMSF 14,7 mM β-Mercaptoetanol 12 g Kl

Solução de lugol 6 g 12 42 ad 1,81 com ddH20

20 x SSC 175, 3 g NaCl

88,2 g de nitrato de sódio ad 1000 ml com ddH20 pH 7,0 com 10 N NaOH 10 x MEN 200 mM MOPS 50 mM acetato de sódio 10 mM EDTA pH 7,0

Tampão NSEB 0,25 M tampão fosfato de sódio pH7,2

7% SDS

1 mM EDTA 1% BSA (p/v)

Descrição das figuras A Fig.l mostra o plasmideo p35S-anti-RL.

Estrutura do plasmideo: A = Fragmento A: promotor 35S, nucleótidos 6909 a 7437 do VCMf (Franck et al, Cell 21 (1980), 285-294) B = Fragmento B: fragmento Asp718 de pRLl com um comprimento aproximado de 1949 bp

Orientação como para o promotor: sentido inverso A seta indica a direcção do fragmento de leitura aberta. C = fragmento C: nt 11748-11939 do ADN-T do plasmideo Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846) A Fig. 2 mostra o plasmideo p35S-anti-RL.

Estrutura do plasmideo: 43 A = Fragmento A: promotor B33, do gene B33 de patatina a partir de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al.r EMBO J. 8 (1989), 23-29) B = Fragmento B: fragmento Asp718 de pRLl com um comprimento aproximado de 1949 bp

Orientação como para o promotor: sentido inverso A seta indica a direcção do fragmento de leitura aberta. C = fragmento C: nt 11748-11939 do ADN-T do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen et ai., EMBO J. 3 (1984), 835-846) A Fig. 3 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido, registada com um viscógrafo do tipo Viskograph da Brabender, que foi isolada de plantas de batata não transformadas da variedade Désirée (ver também o exemplo 8).

Significando [BE] Temp. A B C D E F

Drehm. Torque Unidades de Brabender Temperatura

Inicio da pastificação Viscosidade máxima Inicio do tempo de manutenção Inicio do tempo de arrefecimento Fim do tempo de arrefecimento Fim do tempo de manutenção A linha azul indica a viscosidade; a linha vermelha representa a temperatura. A Fig. 4 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido, registada com um viscógrafo do tipo Viskograph-E da 44

Brabender, que foi isolada de plantas de batata transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL (ver também Exemplo 8) . Quanto ao significado das abreviaturas, ver figura 3. A Fig. 5 mostra uma curva de Barbender de uma solução aquosa de amido da batata transformada com o plasmideo p35S-anti-RL (ver também Exemplo 8) , registada com um viscógrafo do tipo Viskograph-E da Brabender. Quanto ao significado das abreviaturas, ver figura 3. A fig. 6 mostra as curvas de soluções aquosas de amido isolado de plantas de batata (ver também exemplo 12), que foram registadas com um analisador rápido de viscosidade. A linha vermelha corresponde à temperatura; as linhas azuis 1, 2, 3 e 4 mostram as viscosidades das soluções de amido que se seguem:

Linha 1: Amido isolado de plantas de tipo selvagem Linha 2: Amido isolado de plantas em que a enzima da ramificação foi inibida separadamente (ver o exemplo 1 do pedido de patente de invenção WO/14827),

Linha 3: Amido isolado de plantas em que somente a concentração das proteínas da presente invenção tinha sido reduzida (ver exemplo 6) ,

Linha 4: Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL em combinação com o plasmideo p35SH-anti BE (ver exemplo 12). A fig. 7 mostra as curvas de soluções aquosas de amido isolado de plantas de batata (ver também exemplo 13) , que 45 foram registadas com um analisador rápido de viscosidade. A linha vermelha corresponde à temperatura; as linhas azuis 1, 2, 3 e 4 mostram as viscosidades das soluções de amido que se seguem:

Linha 1: Amido isolado de plantas de tipo selvagem Linha 2: Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas separadamente com o plasmideo pB33-anti-GBSSI (chamada batata cerosa),

Linha 3: Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas separadamente com o plasmideo p35S-anti-RL (ver exemplo 6),

Linha 4: Amido isolado de plantas que tinham sido transformadas com o plasmideo pB33-anti-GBSSI (ver exemplo 13) . A Fig. 8 mostra o plasmideo pRL2 que compreende um ADNc de comprimento completo de batata que codifica uma enzima RI.

Os exemplos ilustram a presente invenção.

Nos exemplos, utilizara-me as seguintes técnicas normalizadas. 1. Clonagem

Para a clonagem da E. coli utilizou-se o vector pBluescriptSK. 46

Para a transformação da planta, clonaram-se as estruturas do gene no vector binário pBinAR (Hofgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230) eB33-Hig. 2. Estirpes bacterlanas

Para o vector Bluescript e para a estrutura pBinAR e B33-Hig, utilizou-se a estirpe de E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, EUA) A transformação dos plasmídeos das plantas de batata foi realizada por meio da estirpe C58C1 pGV2260 de Agrobacterium tumefaciens (Deblaere et al.r Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777:4788) . 3. Transformação de Agrobacterium tumefaciens A transferência do ADN foi realizada por meio da transformação directa de acordo com o processo de transformação de Hofgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877) . O ADN do plasmideo da Agrobacteria transformada foi isolado de acordo com o processo da Birnboim & Doli (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) e analisado por electroforese depois da clivagem de restrição apropriada. 4. Transformação de batatas

Trataram-se dez folhas pequenas de uma cultura de batata esterilizada (Solanum Tuberosum L.cv. Desiree) cortadas por um cortante, com 10 mL de meio MS (Murashige & Skoog,

Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) com sacarose a 2%. O meio continha 50 pL de uma cultura de Agrobacterium tumefaciens que cresceu durante a noite sob selecção. 47

Depois de agitar ligeiramente durante 3-5 minutos, fez-se mais uma incubação no escuro durante dois dias. As folhas foram em seguida postas num meio MS com glicose a 1,6%, 5mg/L de ácido acético de naftilo, 0,2 mg/L de benzilaminopurina, 250 mg/L de claferano, 50mg/L de canamicina ou 1 mg/L de higromicina B e Bacto Agar a 0,80 % para a indução de calos. Passada uma semana de incubação a 25°c e 30001ux, colocaram-se as folhas em meio MS com glicose a 1,6 %, 1,4 mg/L de zeatina ribose, 20 mg/L de ácido acético e de naftilo, 10 mg/L de ácido giberélico, 250 mg/L de claforano, 50mg/L de canamicina ou 3 mg/L de higromicina B e Bacto Agar a 0,80 % para a indução de rebentos.

5. Marcação radioactiva de fragmentos de ADN A marcação radioactiva dos fragmentos de ADN foi realizada por meio de um kit de marcação aleatória de iniciadores de ADN da Boehringer (Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. 6. Análise de mancha de Northern

Isolou-se o ARN do tecido das folhas das plantas de acordo com protocolos padrão. Separou-se 50 pg do ARN num gel de agarode (Agarose a 1,5%, 1 X MEN de tampão, formaldeido a 16, 6 %) . Depois da passagem pelo gel, lavou-se rapidamente o gel em água. Transferiu-se o ARN para uma membrana de nylon do tipo N da Hybond (Amersham, RU) com 20x SSC por meio de uma mancha capilar. A membrana foi em seguida levada a um forno em vácuo durante duas horas a 80 °C. A membrana foi

pré-hibridizada em tampão de NSEB durante duas horas a 68 °C 48 e em seguida hibridizou-se durante a noite em tampão NSEB na presença da sonda marcada radioactivamente a 68 °C. 7. Manutenção da planta

Mantiveram-se as plantas de batata na estufa nas seguintes condições

Período de luz Período de escuridão Humidade atmosférica 16 horas a 25000 lux e 22 °C 8 horas a 15 °C 60% 8. Determinação da relação amilose/amilopectina no amido obtido das plantas da batata

Isolou-se o amido das plantas de acordo com processos padrão e determinou-se a relação amilose/amilopectina de acordo com o processo descrito por Hovenkamp-Hermelink et al. (Potato Research 31 (1988) 241-246). 9. Determinação da glicose, frutose e sacarose

Para determinar o teor de glicose, frutose e/ou sacarose, congelaram-se pequenos bocados de tubérculos de batata (com um diâmetro de aprox. 10 mm) em azoto líquido e em seguida extraiu-se durante 30 min a 80 °C no seio de 0,5 mL de HRPES 10 mM, a pH 7,5; etanol a 80% (vol/vol) . Retirou-se o sobrenadante contendo os componentes solúveis e determinou-se o volume. Utilizou-se o sobrenadante para a determinação da quantidade de açúcares solúveis. A determinação quantitativa de glicose, frutose e sacarose solúveis realiza-se no seio de uma mistura reaccional com a seguinte composição: 49 49 100, 0 mM Imidazol/HCl, pH 6, 9 1,5 mM MgCl2 0, 5 mM NADP+ 1,3 mM ATP 10-50 μΐ Amostra O \—1 u Glicose-6-fosfato desidrogenase levedura de

Incubou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 minutos. A determinação de açúcares subsequente realiza-se por meio de processos fotométricos normalizados, medindo a absorção a 340 nm, depois da adição sucessiva de 1.0 Unidades Hexocinase a partir de levedura (para a determinação de glicose) 1.0 Unidades Fosfogliccisomerase a partir de levedura (para a determinação de frutose) e 1.0 Unidades invertase a partir de levedura (para a determinação de sacarose)

Exemplo 1

Isolamento das proteínas ligadas e grânulos de amido originário em amido de batata O isolamento das proteínas ligadas a grânulos de amido originário em amido de batata tem sido realizado por meio de electroeluição numa aplicação da eluição que se construiu em analogia com o "Model 422 Electro-Eluter" (BIORAD Laboratories Inc., EUA) mas tem um volume consideravelmente maior (aprox. 200 mL) . Dissolveu-se 25g de amido anidro num 50 tampão de eluição (volume final de 80 mL). O amido derivou de batatas que produzem um amido quase isento de amilase devido à expressão em sentido inverso de uma sequência de ADN que codifica a sintaxe de amido ligado a grânulos de amido I (SALGA I) da batata. Aqueceu-se a suspensão a 70-80 °C num banho de água. Em seguida, adicionou-se 72,07g de ureia (concentração final de 8M) e completou-se o volume para 180 mL com um tampão de eluição. Dissolveu-se o amido com uma agitação permanente e obteve-se uma consistência semelhante a uma pasta. Eluiram-se as proteínas por electroeluição à solução da noite por meio de um aparelho de eluição (100V; 50-60 mA). As proteínas eluídas foram cuidadosamente retiradas do aparelho. Eliminaram-se as partículas em suspensão com uma centrifugação curta. Fez-se a diálise do sobrenadante a 4 °C, 2 a 3 vazes durante uma hora, com um tampão de diálise. Em seguida, determinou-se o volume de solução de proteína. As proteínas precipitaram por meio da adição de sulfato de amónio (concentração final de 90%), o que foi feito com agitação permanente, a 0 °C. As proteínas precipitaram e foram amalgamadas por centrifugação e foram novamente suspensas no seio de um tampão de proteínas.

Exemplo 2

Identificação e isolamento de sequências de ADNc que codificam as proteínas ligadas a grânulos de amido As proteínas isoladas, de acordo com o exemplo 1, foram utilizadas para a produção de anticorpos policlonais de coelho, que reconhecem especificamente as proteínas ligadas a grânulos de amido. Por meio desses anticorpos, analisou-se em seguida uma biblioteca de expressão de ADNc no que respeita 51 as sequências se codificação de proteínas ligadas a grânulos de amido, utilizando processos padrão. A biblioteca de expressão produziu-se como se segue: Isolou-se poli (A+) -ARNm a partir de tubérculos de batata de variedade "berolina" de acordo com processos padrão. Partindo da poli (A+)-ARNm, produziu-se ANc de acordo com o processo de Gubler e Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269), utilizando um iniciador de Oligo d(t)ie Xho I. Cortou-se este ADNc com Xho I depois da adição do ligante EcoR I e ligou-se de uma forma orientada num vector lambda ΖΑΡ II (Stratagene) e cortou-se com EcoR I e Xho I. avaliaram-se aproximadamente 500.000 placas de uma biblioteca de ADNc construída dessa forma, para determinar que sequências eram reconhecidas pelos anticorpos policlonais dirigidos contra as proteínas ligadas a grânulos de amido.

Para analisar as placas de fago, transferiram-se estas para filtros de nitrocelulose que tinham sido previamente incubados numa solução de IPTG 10 mM, durante 30 a 60 minutos e secaram-se em seguida em papel de filtro. A transferência deu-se a 37 °C durante 3 horas. Em seguida, incubaram-se os filtros à temperatura ambiente durante 30 minutos num bloco de reagente com os anticorpos policlonais dirigidos contra proteínas ligadas a grânulos de amido, e foram lavados duas vezes por 5-10 minutos em tampão TBST. O filtrado foi agitado com os anticorpos policlonais contra a proteína ligada ao grão de amido, no seio de uma diluição apropriada durante uma hora à temperatura ambiente ou durante 16 horas a 4 °C. A identificação das placas que expressam uma proteína que foi 52 reconhecida pelos anticorpos policlonais por meio do "Kit de detecção de manchas para os anticorpos de ratos RPN23" (Amersham RU), de acordo com as instruções do fabricante.

Os clones do fago da biblioteca do ADNc que expressam uma proteína que era reconhecida pelos anticorpos policlonais foram ainda purificados pela utilização de processos padrão.

Por meio do método de excisão in vivo, obtiveram-se clones de E. coli a partir de clones de fagos positivos contendo um plasmídeo pBluescript coma inserção de ADNc correspondente. Depois de se verificar a dimensão e o modelo de restrição das inserções, analisou-se ainda um clone apropriado pRLl.

Exemplo 3

Análise de sequências da inserção de ADNc do plasmídeo pRLl Isolou-se o plasmídeo pRLl a partir de um clone de E. coli obtido de acordo com o exemplo 2 e determinou-se uma parte da sequência da sua inserção de ADNc por processos normalizados utilizando o processo do didesoxinucleótido (Sanger et al.r Proc. Natl, Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467). A inserção tem um comprimento de cerca de 2450 pb. Uma parte da sequência de nucleótido, assim como a sequência de aminoácidos derivada dela, são indicadas por Sed. ID n° 3 e por Seq. ID n° 4. Uma análise das sequências e uma comparação das sequências com sequências de ADN conhecidas mostraram a sequência indicada Seq. ID n° 3 é nova e não exibe homologia significativa com as sequências de ADN conhecidas até agora. Além disso, a análise das sequências mostrou que a inserção 53 de ADNc é apenas um ADNc parcial em que falta uma parte da região de codificação na extremidade 5'.

Exemplo 4

Identificação e isolamento de um ADNc de codificação de uma proteína ligada a grânulos de amido a partir de Solarum Tuberosum

Para isolar um ADNc completo, correspondendo à inserção parcial de ADNc do plasmideo pRLl, produziu-se mais uma biblioteca de ADNc. Trata-se de uma biblioteca de ADNc Solarum Tuberosum, que se construiu como se segue:

Primeiro, produziram-se fragmentos de epiderme de folhas de plantas de batata da variedade "Desirée", praticamente de acordo com o processo de Hedrich et al (Plant Phisiol. 89 (1989), 148), colhendo aproximadamente 60 folhas de plantas de batatas de seis semanas mantidas em estufa. Retirou-se a nervura central das folhas, em seguida, moeram-se as folhas num grande "misturador da Waring" (com um volume de 1 litro) quatro vezes, em H20 destilada arrefecida, no seu nivel mais elevado, durante 15 segundos de cada vez. Filtrou-se a suspensão através de um peneiro de nylon com uma dimensão de poros de 220 ym (Nibolt, Zurique, Suiça) e lavou-se várias vezes em água destilada fria. Filtrou-se a própria suspensão através de um peneiro de nylon com uma dimensão de poros de 220 pm e lavou-se intensamente com água destilada fria. Os fragmentos de epiderme (resíduos) foram examinados num pequeno "misturador da Waring" (volume 250 mL) e reduzidos em águas destilada e gelo, por quatro vezes por 15 segundos de cada vez. Filtrou-se a suspensão através de um peneiro de 54 nylon com uma dimensão de poros de 220 pm e lavou-se várias vezes em água destilada fria. Os fragmentos de epiderme (resíduos) foram examinados ao microscópio para avaliar a contaminação por células de mesofilo. Quando ocorre contaminação, repete-se a etapa de moagem num pequeno "misturador da Waring". O rompimento das células de guarda dos fragmentos da epiderme foi realizado por meio da pulverização em azoto líquido num almofariz arrefecido durante aproximadamente 2 horas. Para examinar o rompimento das células da guarda, recolheram-se regularmente amostras e examinaram-se ao miocroscópio. Passadas 2 horas, ou quando uma quantidade suficientemente alta de células de guarda se tinha rompido, encheu-se um tubo de reacção com o pó que se obteve (com um volume de 50 mL) e fez-se uma nova suspensão num volume de tampão de GTC (Chirgwin et al., Biochem. 18 (1979), 5294-5299). Centrifugou-se a suspensão e filtrou-se o sobrenadante através de um Miracloth (Calbiochem, La Jolla, Calif.). Submeteu-se o filtrado a ultracentrifugação durante 16 horas, tal como descrito em Glisin et al (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) e Mornex et al. (J. Clin. Invés. 77 (1986), 1952-1961). Depois da centrifugação, dissolveu-se o precipitado de ARN no seio de 250 μΐ de tampão de GTC. O RNA foi precipitado através de 0,05 volume 1M de ácido acético e 0,7 de volume de etanol. O ARN precipitou por centrifugação e lavou-se o precipitado com acetato de sódio 3M (pH 4,8) e etanol a 70%. Secou-se rapidamente o ARN e dissolveu-se em água tratada com DEPC. Isolou-se o ARN de poli A+ a partir de ARN isolado, de acordo com processos padrão. Partindo do ARNm de poli(A+), 55 produziu-se o ADNc de caordo com o processo de Gubler e Hoffmann (Gene 25 (1983) , 263-269) por meio do iniciador de oligo d(t) is de Xho I. Este ADNc foi cortado com Xho I depois da adição do ligante EcoR i e ligou-se de uma forma orientada num vector lambda ΖΑΡ II (Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemanha) e cortou-se com EcoR I e Xho I. 0 empacotamento nas cabeças dos fagos realizou-se o kit dourado da Gigapack II kit (Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A partir de uma biblioteca de ADNc, isolaram-se os clones de fagos hibridizaram com a inserção de ADNc do plasmideo pRLl e purificaram-se de acordo com processos padrão. Por meio da excisão in vivo, obtiveram-se clones de E. Coli a partir de clones positivos de fagos contendo um plasmideo pBluescript de estrutura helicoidal dupla, com a correspondente inserção de ADNc. Depois de se verificar a dimensão e o modelo de restrição das inserções, submeteram-se os clones apropriados a um mapeamento de restrição e a uma análise da sequência. A partir de um clone apropriado, isolou-se o plasmideo pRL2 (DSM 10225) que contém um ADNc completo que codifica uma proteína ligada a grânulos de amido de batata.

Exemplo 5

Análise da sequência da inserção de ADNc do plasmideo pRL2 A sequência de nucleótido da inserção de ADNc do plasmideo pRL2 foi determinada como se descreveu no exemplo 3. A inserção tinha um comprimento de 4856 pb. A sequência de nucleótidos, assim como a sequência de aminoácidos dela 56 derivada, está indicada na Seq. ID n° 1 e/ou Seq ID n° 2. A partir daqui, o gene correspondente será designado por gene RL.

Exemplo 6 A construção do plasmideo P35S-anti-RL e a introdução do plasmideo do genoma de plantas da batata

Por meio da endonuclease de restrição Aspll8, isolou-se um fragmento de ADN com um comprimento aproximado de 1800 pb a partir do plasmideo pRLl. Isto corresponde à sequência de ADN indicada pela Seq. ID n° 3 e contém uma parte do fragmento de leitura aberta. Ligou-se o fragmento no vector binário pBinAR cortado com AspllQ (Hõfgen e Willmitzer, Plant Sei. 66 (1990), 221-230). Trata-se de um derivado do vector binário pBinl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-9721). O pBinAR foi construído como se segue.

Isolou-se um fragmento com um comprimento de 529 pb compreendendo os nucleótidos 6909-7437 do promotor de virus de mosaico da couve-flor (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294), a partir do plasmideo pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) como um fragmento de EcoR Ι/Κρη I e ligou-se entre os sítios de EcoR I e Κρη I de poliligante pBinl9. Isto conduziu ao plasmideo pBinl9-A.

Por meio da endonuclease de restrição Pvu II e Hind III, isolou-se um fragmento com um comprimento de 192 pb a partir do plasmideo pAVG40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) compreendendo o sinal de poliadenilação do gene 3 do ADN-T do plasmideo de Ti pTiACH5 (Gielen et al, EMBO J. 3, 57 835-846) (nucleótidos 11749-11939). Depois da adição do ligante de Sph I ao sitio Pvu I, ligou-se o fragmento de Sph I e os sítios Hind III de pBinl9-A. Isto conduziu ao plasmídeo pBinAR.

Por meio das análises das sequências e de restrição, identificaram-se os vectores recombimantes em que se inseriu o fragmento de ADN no vector, de tal modo que um aparte da região de codificação de inserção de ADNc do pRLl está ligada ao promotor 35S numa orientação de sentido inverso. 0 plasmídeo resultante está p35S-anti-RL está indicado na figura 1. Inserindo os fragmentos de ADNc, produz-se uma cassete de expressão que consiste nos fragmentos A,B e C: 0 fragmento A (529 pb) contém o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (VMCf). 0 fragmento compreende os nucleótidos 6 90 9 a 7437 do VCMf (Franck et al, Cell 21 (1980), 285-294).

Independentemente das regiões que o flanqueiam, o fragmento B contém uma parte da região que codifica a proteína da inserção de ADNc do plasmídeo pRLl. Isolou-se este como um fragmento de Asp 718 a partir de pRLl, tal como se descreveu antes e fundiu-se com o promotor 35S em pBinAR numa orientação antisense. O fragmento C (192 pb) contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do ADN-T do plasmídeo de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846). 58 0 plasmideo p35S-anit-RL tem uma dimensão aproximada de 12,8 kb. Transferiu-se o plasmideo para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por agrobactérias, tal como se descrevei antes. A partir das células transformadas, regeneraram-se plantas completas. Fez-se uma cultura das plantas transformadas em condições de estufa. Analisando o ARN total numa análise de mancha Northern no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementares ao ADNc, e avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este fim, isolou-se o ARN total a partir de folhas de plantas transformadas de acordo com processos padrão e, em seguida, separou-se por meio de electroforese num gel de agarose, transferiu-se para uma membrana de nylon e hibridizaram-se com uma sonda marcada radioactivamente tendo a sequência indicada pela designação Seq ID n° 1 ou uma parte dela. Na análise de mancha de Northern, em cerca de 5-10 % das plantas transformadas, a banda indicou que faltava o transcrito especifico na Seq. ID n° 1. Utilizaram-se estas plantas para análise da qualidade do amido.

Exemplo 7 A construção do plasmideo pB33-anti-RL e a introdução do plasmideo no qenoma das plantas de batata

Por meio de endonuclease de restrição Aspll8, isolou-se um fragmento de ADN com um comprimento aproximado de 1800 pb, que compreende um aparte do fragmento de leitura aberta da inserção de ADNc isolada do plasmideo pRLl e ligou-se no vector B33-Hyg que foi cortado com Asp718. Construiu-se este vector como se segue: eliminou-se o promotor 35S do vector pBinAr Hyg (DSM 9505) por meio da endonuclease de restrição 59

Ecor I e AspllQ. Isolou-se um fragmento com um comprimento de cerca de 152 6 pb, compreendendo o promotor B33 a partir do plasmideo p33-anti-BE (DSM 6146) por meio de EcoR I e AspllQ e inseriu-se no vector pBinAr Hyg (DSM 9505) cortou-se com Ecor I e Asp 718. Inserindo o fragmento de ADNc num sitio de AspT18 do plasmideo B33-Hyg, produz-se uma cassete de expressão que consiste nos fragmentos A, B e C, como se segue (Figura 4) : O fragmento A contém o promotor B33 de Solanum tuberosum (EP 3775 092; Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Independentemente das regiões que o flanqueiam, o fragmento B contém uma parte da região que codifica a proteína da inserção de ADNc do plasmideo pRLl. Isolou-se este como um fragmento de Asp 718 a partir de PRLl, tal como se descreveu antes e fundiu-se com o promotor B33 em B33-Hyg, numa orinetação antisense. O fragmento C (192 pb) contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do ADN-T do plasmideo de Ti pTiACH5 (Gielen et al. , EMBO J. 3 (1984), 835-846). O plasmideo pB35S-anti-RL tem uma dimensão aproximada de 12, 8kb.

Transferiu-se o plasmideo para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por agrobactérias, tal como se descrevem antes. A partir das células transformadas, 60 regeneraram-se plantas completas. Fez-se uma cultura das plantas transformadas em condições de estufa.

Analisando o ARN total numa análise de mancha de Northern no que respeita são desaparecimento dos transcritos complementares ao ADNc, e avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este fim, isolou-se o ARN total a partir de folhas de plantas transformadas de acordo com processos padrão e, em seguida separou-se por meio de electroforese num gel de agarose, transferiu-se para uma membrana de nylon e hibridizaram-se com uma sonda marcada radioactivamente tendo a sequência indicada pela designação Seq. ID n° 1 ou uma parte dela. Na análise de mancha de Northern, em cerca de 5-10% das plantas transformadas, a banda indicou que faltava o transcrito especifico na Seq. ID n° 1. A partir destas plantas, isolou-se o amido dos tubérculos e analisou-se tal como se descreveu no exemplo 8.

Exemplo 8

Análise das plantas de batata transformadas

Examinaram-se as plantas transformadas de acordo com o exemplo 6 e o exemplo 7, no que respeita às propriedades do amido sintetizado. Realizaram-se as análises com várias linhas de plantas de batata que tinham sido transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL ou o plasmideo pB33-anti-RL e em que, na análise de mancha de Northern não exibiram a banda indicando transcritos hibridizando com as sequências de ADN da presente invenção. 61 a) Determinação da viscosidade das soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL ou o plasmideo pB33-anti-RL, utilizando processos padrão. Recolheu-se 30g de amido por cada 450 mL de H20 e utilizou-se para análise num viscosimetro E (Brabender OHG) Duisburg (Alemanha)). Utilizou-se o aparelho de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar a viscosidade da solução aquosa do amido, aqueceu-se primeiro a solução de amido de 50 °C a 96 °C a uma velocidade de 3 °C por minuto. Manteve-se em seguida a temperatura a 96 °C durante 30 minutos.

Seguidamente, a solução foi arrefecida de 96 °C a 50 °C a uma velocidade de 3 °C por minuto. Durante todo o processo, determinou-se a viscosidade. Os resultados representativos nas figuras 3, 4 e 5, em que se mostra a viscosidade em função do tempo. A figura 3 mostra um gráfico típico de Brabender para amido isolado de plantas de tipo selvagem da variedade Désirée da batata. As Figuras 4 e 5 mostram um gráfico típico de Brabender para o amido isolado de plantas de batata que foram transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL ou pB33-anti-RL. A partir destes gráficos, podem-se deduzir diferentes valores característicos.

Os valores característicos para as plantas de tipo selvagem são os seguintes: 62

Quadro 1

Valor Tempo Torque Temperatura [min : seg] [BE] [°C] A 6:30 60,5+17,7 69,9+0,57 B 11: 30 1838,0+161,2 86,0+2,1 C 15 :15 1412,0+18,4 96, 0 D 45:15 526,0117,0 96, 0 E 60:30 812,0+8,5 50,0 F 70:45 853,0+5,7 50,0

Os valores representam os valores médios obtidos de duas medições diferentes.

No quadro 1 e nos quadros 2 e 3 que se seguem, as abreviaturas têm os significados seguintes: A Inicio da plastificação B Viscosidade máxima

C Início do período de 96 °C D Início do período de arrefecimento E Fim de período de arrefecimento

F Fim do período final de 50 °C

Para plantas que tenham sido transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL (linha P2), os valores característicos são os seguintes: 63

Quadro 2

Valor Tempo Torque Temperatura [min : seg] [BE] [°C] A 6:00 50,0 69, 0 B 14 : 00 820,0 93,0 C 15 :15 815,0 96, 0 D 45:15 680,0 96, 0 E 60:30 1150,0 50,0 F 70:45 1200,0 50,0 Para plantas que tenham sido transformadas com plasmideo pB33-anti- -RL (linha P3) os valores caracteristicos são o seguintes Quadro 3 Valor Tempo Torque Temperatura A 7:0 31,0 71,0 B 12 : 45 671,0 88,3 C 15:15 662,0 96,0 D 45:15 607,0 96,0 E 60:30 1063,0 50,0 F 70:45 1021,0 50,0

As figuras 3, 4 e 5 mostram claramente que o amido obtido das plantas transformadas difere do amido das plantas de tipo selvagem particularmente no facto de a viscosidade aumentar apenas muito ligeiramente durante o aquecimento. Assim, durante o aquecimento, a viscosidade máxima do amido das plantas transformadas é mais do que 50% inferior do que o caso do amido de tipo selvagem. 64

Durante o arrefecimento, por outro lado, a viscosidade do amido isolado das plantas transformadas aumenta mais do que no caso das plantas de tipo selvagem. b) Determinação do teor de fosfato do amido 0 teor de fosfato do amido determinou-se medindo a quantidade de fosfato ligado à posição de C-6 dos resíduos de glicose. Para este fim, primeiro degradou-se o amido por hidrólise ácida e determinou-se em seguida o teor de glicose-6-fosfato, por meio de um ensaio de enzima, tal como se descreve a seguir.

Fez-se a incubação de 100 mg de amido em 500 pL de HC1 0,7 N, durante 4 horas a 100 °C. Depois da hidrólise ácida, adicionou-se 10 pL da solução a 600 pL de tampão de imidazole (imidazole 100 mM, Mg012 5 mM, a um pH de 6,9, NAD+ 0,4 mM) . Determinou-se a quantidade de glicose-6-fosfato na mistura reaccional por conversão com a glicose-6-fosfato-desidrogenase. Para este fim, adicionou-se a U de glicose-6-fosfato-desidrogenase (a partir de mesentacoides de Leuconostoc (Boehringer, Manheim)) a mistura reaccional e determinou-se a quantidade de NADH medindo a absorção a 340 nm. O teor de gtlicose-6-f osf ato de 1 mg de amido está indicado no quadro seguinte para as plantas de batatas não transformadas da variedade Désirée, assim como para as duas linhas (PI (35S-anti-RL); P2 (35S-anti-RL)) das plantas transgénicas de batata que tinham sido transformadas com o plasmídeo p35S-anti-RL. 65

Quadro 4 Plantas nmole de glicose-6-fosfato/mg de amido % Tipo selvagem 12,8911,34 100 PI(35S-anti-RL) 2,2510,41 17,4 P2 (35S-anti-RL) 1,2510 9,7 0 quadro que se segue mostra o teor de glicose-6-fosfato por miligrama de amido de batata em plantas de batata que foram transformadas com o plasmideo pB33-anti-RL, comparado com o amido de plantas não transformadas (S. Tuberosum, c.v., Désirée).

Quadro 5

Plantas nmole de glicose-6-fosfato/mg de amido % 7 4,5010,73 45,9 37 2,6410,99 26,9 45 1,1410,44 11,6 31 1,2510,49 12,8

As plantas 7, 37, 45 e 31 representam transformantes independente que tinham sido transformados com o plasmideo pB33-anti-RL. A planta 37 representa a linha P3 para a qual se desenha um gráfico Brabender na figura 5.

Os valores mostram que o teor de fosfato do amido modificado das plantas transgénicas de batata é pelo menos 50% inferior quando comparado com o amido das plantas de tipo selvagem.

c) Determinação do teor de glicose, frutose e sacarose dos tubérculos depois da armazenagem a 4 °C 66

Os tubérculos de plantas de várias linhas transgénicas que tinham sido transformadas com p35S-anti-RL de estrutura de sentido inverso, assim como tubérculos de plantas de tipo selvagem armazenadas a 4 °C ou respectivamente, a 20 °C na escuridão, durante 2 meses. Em seguida, determinam-se as quantidades de glicose, frutose e sacarose, tal como se descreveu antes. Para duas linhas transgénicas, os valores representativos obtidos foram os seguintes:

Quadro 6 Frutose 20 °C 4 0C 0, 62 52,8

Sacarose 2 0 ° C . 4 0 C 8,5 13,1

Glicose

Tipo selvagem 20°C 4°C cv Désirée 0,84 55,4

Transgénica 1,12 6,7 0,75 7,8 7,5 1,0;1

Linha 15

Transgénica 1,00 6,4 0,75 7,5 6,9 6,9

Linha 11

Os valores no quadro estão indicados em pmole de hexose ou sacarose/g de peso fresco.

Dos valores do quadro 6, torna-se óbvio que a acumulação dos açúcares redutores nos tubérculos é consideravelmente mais baixa nas plantas transgénicas armazenadas a 4 °C do que em plantas de tipo selvagem.

Considerando tudo, o amido modificado isolado das plantas transgénicas da batata parece-se com o amido das plantas de 67 milho do tipo selvagem. Contudo, em comparação, tem a vantagem de que o seu gosto é neutro e que por isso é mais apropriado para várias utilizações na área dos produtos comestíveis.

Exemplo 9

Expressão da inserção de ADNc do plasmídeo pRL2 em E. coli (a) Transformação das células bacterianas

Para expressar a inserção de ADNc do plasmídeo pRL2, transformaram-se primeiro as células da estirpe DH5a de E. coli com o plasmídeo pACAC. Este plasmídeo contém um fragmento de ADN que codifica a ADP-glicose-pirofosforilase (AGpase) de E. coli, sob o controlo do promotor lac Z. 0 fragmento tinha sido isolado do vector PECA-15 como um fragmento de Dral/HaelI com uma dimensão de cerca de 1,7 kb (ver B. Muller-Rober (1992), dissertação, FU Berlim) e depois de se preencher nas suas extremidades pegajosas, tinha sido clonado num vector pACAC184 linearizado com HindIII. A expressão de AGPase causa um aumento de síntese do glicogénio nas células de E. coli transformadas. As células transformadas deste modo serão a seguir designadas por células de E.coli Kl.

Para determinar a actividade da enzima da proteína codificada pelo ADNc do plasmídeo pRL2, transformaram-se as células de E. coli Kl com o plasmídeo pRL2. As células de E.coli transformadas que contêm o plasmídeo pACAC assim como o plasmídeo pRL2 serão a seguir designadas por células de E. coli k2. 68 A transferência do ADN do plasmídeo para as células bacterianas forma realizadas de acordo com o processo de Hanahan (J. Mol.Biol. 166 (1983), 557-580). As células de E.coli transformadas forma colocadas em placas de pratos de cultura de ágar com a seguinte composição:

Meio IT contendo: 1,5% Bacto-Agar 50 mM Tampão de fosfato de sódio, pH 7,2 1% Glicose E. coli Kl ou coli K2. 10 pg/ml Cloranfenicol no caso das células de 10 pg/ml Cloranfenicol e 10 pg/ml Ampicilina no caso das células de E.

As células de E. coli da estirpe DH5 que tinham sido transformadas com o plasmídeo pRL2+pACAC (células de E. coli K2),bem como na forma de controlo com o plasmídeo pACAC (células de E.coli kl), cresceram nas placas de agar. O glicogénio formado das várias culturas foi examinado no que respeita ao grau de fosforilação (na posição C-6 da molécula de glicose), tal como se descreve a seguir. (b) isolamento do glicogénio bacteriano

Para isolar o glicogénio bacteriano, a colónia de bactérias que tinham crescido depois da transformação flutuaram de cada uma das 6 placas de agar (0 135mm) com 5 mL de meio IT para cada placa. A suspensão bacteriana foi centrifugada a 4500 xg durante 5 minutos. Voltou a suspender-se o precipitado bacteriano no seio de 10 mL de meio IT. O rompimento da 69 bactéria foi realizado por meio da adição de 2 volumes de meio de rompimento (NaOH 0,2 N; 1% de SDS) e por incubação à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Adicionando 3 volumes de EtOH abs., incubando a 4 °C durante 30 minutos e a centrifugação subsequente a 8000 xg durante 15 minutos, sedimentou o glicogénio. Depois, lavou-se o precipitado com lOOmL de EtOH a 70% e sedimentou novamente por meio da etapa de centrifugação (10 minutos a 8000 xg) . O processo de lavagem foi repetido 4 vezes. (c) Determinação do teor total de glicogénio

Primeiro degradou-se o glicogénio isolado e sedimentado em moléculas simples de glicose por meio de hidrólise ácida (dissolvendo o precipitado em 2 mL de HCl 0,7 N; incubação durante 4 horas a 100 °C) . O teor de glicose da solução foi determinado por meio de uma reacção enzimática acoplada de um ensaio de amido com um fotómetro (Kontron) a um comprimento de onda de 340 nm, de acordo com as instruções dos fabricantes (Boehringer Manheim). O tampão de reacção contém: 100 mM MOPS, pH 7,5 10 mM MgCl2 2 mM EDTA 0,25 mM NADP 1 mM ATP 1 U/mL Glicose-6-fosfato-Desidrogenase 2 U/mL Hexocinase 70 A medição foi feita a 25 °C com uma solução de 10 pL de glicose. (d) Determinação do teor de glicose-6-fosfato

Para determinar o teor de moléculas de glicose fosforiladas na posição C-β, utilizaram-se várias culturas de bactérias. Adicionando os mesmos volumes de KOH 0,7 N aos glicogénios degradados nas suas moléculas de glicose por hidrólise ácida (ver em cima), a solução foi neutralizada. 0 tampão da reacção contém: 100 mM MOPS, pH 7,5 10 mM MgCl2

2 mM EDTA

0,25 mM NADP 2 U/ml Glicose-6-fosfato-Desidrogenase A medição foi feita a 25 °C com uma solução de 100 a 150 pL de glicose. (e) identificação de uma actividade de enzima fosforilando glicogénio bacteriano

Os resultados de determinação do teor de fosfato de glicogénio das células de E. coli, que tinham sido transformadas com os plasmideos pACAC + pRL2, exibem um aumento da fosforilação de 290±25% na posição C-6 da glicose, em comparação com a reacção de controlo (células de E.coli transformadas com o plasmideo pACYC) (ver o quadro seguinte). 71 Células E. coli Ε. coli-Kl E. coli-K2

Glicose-6-fosfato:Glicose em Glicogénio 1:(4600+1150) 1: (1570 + 390)

Os graus de fosforilação aqui indicados são o valor médio de pelo menos 6 medições partindo de 6 transformações independentes e isolamentos de glicogénio.

Exemplo 10

Integração do plasmídeo p35S-anti-RL em combinação com o plasmídeo p35SH-anti-BE no genoma de plantas de batata O plasmídeo p35S-anti-RL foi construído como se descreveu no exemplo 6. Construiu-se o plasmídeo p35SH-anti-BE conforme descrito no pedido de patente de invenção WO95/07355, exemplo 3. Ambos os plasmídeos foram transferidos sequencialmente para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por Agrobacterium, tal como se descreveu antes. Com esta finalidade, transformou-se primeiro o plasmídeo p35SH-anti-BE para plantas de batata. Regeneraram-se as plantas completas e seleccionaram-se para uma expressão reduzida do gene da enzima ramificada. Em seguida, transformou-se o plasmídeo p35S-anti-RL nas plantas transgénicas que mostraram já uma expressão da enzima de ramificação. A partir das células transformadas, as plantas transgénicas foram novamente regeneradas e as plantas transformadas foram cultivadas em condições de estufa. Analisando o ARN numa análise de mancha do ARN, no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementarmente ao ADNc da enzima ramificada ou o ADNc de RL, avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas no que respeita uma expressão altamente reduzida do gene da 72 enzima ramificada, assim como no que respeita uma expressão altamente reduzida do gene RL. Para este fim, isolou-se o ARN total das folhas de plantas transformadas de acordo com os processos descritos e subsequentemente separou-se por meio de electroforese em gel, transferiu-se para uma membrana, hibridizou-se com uma sonda marcada radioactivamente mostrando a sequência indicada na Seq. ID n° 1 ou uma parte dela e depois foi hibridizada com uma sonda marcada radioactivamente mostrando a sequência do ADNc da enzima de ramificação (ver patente de invenção W092/14827, Exemplo 1) ou uma parte dela. Na análise de mancha de ARN, em cerca de 5%-10% das plantas transformadas, a banda indicava o transcrito especifico da sequência indicada sob a designação de Seq. ID n° 1, assim como faltava a banda indicando o transcrito especifico do ADNc da enzima de ramificação (ver patente de invenção W092/14827) . Estas plantas, que foram designadas por plantas R4 foram utilizadas para a análise da qualidade do amido contido nos tubérculos.

Exemplo 11

Integração do plasmideo pB33-anti-RL em combinação com o plasmídeo pB33-anti-SALGAI no genoma de plantas de batata

Construiu-se o plasmideo pB33-anti-RL tal como se descreveu no exemplo 7. Construiu-se o plasmideo pB33-anti-SALGAI como se segue:

Ligou-se o fragmento Drall/Drall da região promotora do gene B33 da Classe I da patatina de Solanum Tuberosum compreendendo os nucleótidos -1512 a +14 (Rocha-Sosa et al.r EMBO J 8 (1989), 23-29) no sitio de Smal do plasmideo pUC19. 73

Do plasmídeo resultante, ligou-se o fragmento promotor numa região de poli-ligante do plasmídeo pBin 19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-87211) como um fragmento de EcorI/HíndIII. Em seguida, o fragmento de EcorI de 3' de 1181 a 2511 do gene SALGAI de Solanum Tuberosum (Hergersberg, Dissertação (1988), Universidade de Colónia) foi ligado no sítio de clivagem de EcorI do plasmídeo resultante.

Ambos os plasmídeos foram transferidos sequencialmente para plantas de batata por meio de uma transformação mediada por agrobacterium, tal como descrito no exemplo 10. A partir das células transformadas, regeneraram-se plantas completas e cultivaram-se as plantas transformadas, em condições de estufa. Analisando o ARN completo numa análise de mancha de ARN no que respeita ao desaparecimento dos transcritos complementares aos dois ADNcs avaliou-se o sucesso da modificação genética das plantas. Com este objectivo, isolou-se o ARN total dos tubérculos das plantas transformadas, de acordo com procedimentos padrão e em seguida separou-se em gel de agarose por meio de electroforese em gel, transferindo para a membrana e hibridizando com uma sonda marcada radioactivamente, exibindo a sequência indicada na Seq ID n° 1 ou uma parte dela. Depois, hibridizou-se a mesma membrana com uma sonda marcada radioactivamente comportando a sequência do gene SALGAT ou uma parte desta sequência (Hergersberg, dissertação (19881), Universidade de Colónia). Na análise de mancha ARN, em cerca de 5%-10% das plantas transformadas, a banda indica a hibridização dos transcritos com o ADNc da presente invenção ou o ADNc de SALGAI estavam 74 faltando. A partir dos tubérculos destas plantas, que se designaram por plantas R3, isolou-se e analisou-se o amido.

Exemplo 12

Análise do amido de plantas RI

Examinaram-se as plantas de batata transformadas de acordo com o exemplo 10, no que respeita às propriedades do amido sintetizado. Realizaram-se as análises com várias linhas das plantas de batata que tinham sido transformadas com os plasmideos p35S-anti-RL e p35SH-anti-BEs que já não exibiam -ou só exibiam de uma forma muito reduzida - as bandas que indicavam a hibridização dos transcritos com as sequências de ADN da presente invenção ou com a sequência do ADNc de ramificação na análise de mancha de ARN. a) Determinação de viscosidade de soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmideo p35S-anti-RL e o plasmideo p35SH-anti-BE utilizando processos padrão. Dissolveu-se 2g de cada um dos amidos em 25 mL de H20) e utilizou-se para análise com um Analisador rápido de viscosidade (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group. Warriewood NSW 2102, Austrália). Utilizou-se o equipamento de acordo com as instruções do fabricante. Para determinar a viscosidade da solução aquosa de amido, aqueceu-se primeiro a suspensão de amido de 50 °C para 95 °C com uma velocidade de 12 °C por minuto. Manteve-se então a temperatura a 95°C durante 2,5 75 minutos. Depois, arrefeceu-se a solução de 95 °C para 50 °C com uma velocidade de 12 °C por minuto. Durante todo o processo, mediu-se a viscosidade. Os resultados representativos dessas medições são dados sob a forma de gráficos em que se mostra que a viscosidade depende do tempo. A figura 6 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de tipo selvagem de batata da variedade Désireé. As linhas 2 e 3 mostram um gráfico de ARV típico para amido isolado de tubérculos de plantas que tinham sido transformadas com o plasmídeo p35S-anti-RL e o plasmídeo p35SH-anti-BE, respectivamente. A linha 4 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de tubérculos de plantas que tenham sido transformadas com o plasmídeo p35SH-anti-BE em combinação com o plasmídeo p35S-anti-RL. A linha 4 é caracterizada pelo facto de o aumento da viscosidade não ser dependente da temperatura. b) Determinação da relação amilose/amilopectina

Examinou-se o amido que foi isolado de tubérculos de plantas que tinham sido transformadas, no que respeita à relação amilose para amilopectina. A linha de plantas R4-1 (mostrada na linha 4 da Fig. 6) exibiu um teor de amilose de mais do que 70%. Para a linha de plantas R4-3, mediu-se um valor de amilose de 27%, em que o teor de amilose no amido de tipo selvagem da variedade Désirée varia entre 19 e 22%.

Exemplo 13

Análise do amido das plantas R3

As plantas de batata transformadas de acordo com o exemplo 11 foram examinadas no que respeita às propriedades do amido 76 sintetizado. As análises foram realizadas com várias linhas de plantas de batata que tinham sido transformadas com os plasmideos pB33-anti-RL e pB33-anti-SALGAI que já não exibiam - ou só exibiam de uma forma muito reduzida - as bandas que indicavam a hibridização dos transcritos com as sequências de ADN da presente invenção ou com a sequência do ADNc de SALGAI da análise de mancha de ARN. a) Determinação de viscosidade de soluções aquosas do amido

Para determinar a viscosidade das soluções aquosas do amido sintetizado nas plantas de batata transformadas, isolou-se o amido dos tubérculos das plantas que tinham sido transformadas com o plasmideo pB33-anti-RL em combinação com o plasmideo pB33-anti-SALGAI utilizando processos padrão. Determinou-se a viscosidade por meio de um Analisador rápido de viscosidade de acordo com o processo descrito no exemplo 12, parte a. Os resultados estão indicados na figura 7. Na linha 1, figura 7, mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de tipo selvagem de batata que tinham sido transformadas com o plasmideo pB33-anti-SALGAI e o plasmideo p35S-anti-RL, respectivamente. A Linha 4 mostra um gráfico de ARV típico para amido isolado de plantas de batatas que tinham sido transformadas com o plasmideo pB33-anti-SALGAI em combinação com o plasmideo pB33S-anti-RL. Este gráfico é caracterizado pelo facto de faltar a viscosidade máxima e o aumento de viscosidade a 50 °C. Além disso, este amido é caracterizado pelo facto de a cola obtida depois dói tratamento da ARV, quase exibir retrogradação depois da incubação à temperatura ambiente durante vários dias. 77 b) Determinação da relação amilose/amilopectina

Examinou-se o amido que foi isolado de tubérculos de plantas que tinham sido transformadas, no que respeita à relação amilose para amilopectina. A linha de plantas R3-5 (mostrada na linha 4 da Fig. 7) exibiu um teor de amilose de mais inferior a 4%. Para a linha de plantas R3-6, mediu-se um teor de amilose inferior a 3%. 0 teor de amilose no amido de tipo selvagem da variedade Désirée varia entre 19 e 22%. c) Determinação de fosfato de amido

Determinou-se o teor de fosfato do amido medindo a quantidade de fosfato ligado à posição C-6 dos resíduos de glicose. Com esta finalidade, primeiro degradou-se o amido por meio de hidrólise ácida e em seguida determinou-se o teor de glicose-6-fosfato, por meio de um ensaio da enzima, tal como se descreve a seguir.

Fez-se a incubação de 100 mg de amido em 500 pL de HC1 0,7 N, durante 4 horas, a 100 °C. Depois da hidrólise ácida, adicionou-se 10 pL da mistura reaccional a 600 pL de tampão de imidazole (100 mM imidazol, MgCl2 5 mM, pH 6,9, NAD+ 0,4 mM). A quantidade de glicose-6-fosfato na preparação é determinada pela conversão com a enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase. Para este fim, adicionou-se 1 U de glicose-6-fosfato-desodrogenase (de Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Manheim)) à mistura reaccional e determinou-se a quantidade de NADH por meio da absorção a 340 nm. O teor de glicose-6-fosfato por 1 mg de amido está indicado no quadro que se segue para as plantas de batata não 78 transformadas da variedade Désirée, assim como para a linha R3-5 e a linha R3-6 das plantas de batatas transgénicas que tinham sido transformadas por pB33-anti-RL em combinação com o plasmideo pR33-anti-SALGAI. Como comparação, o valor do amido da chamada batata cerosa (US2-10) que tinha sido transformada com o plasmideo pB33-anti-SALGAI, é também identificado.

Quadro 7

Plantas nmol Glicose-6-Fosfato/mg de amido 100

Tipo selvagem 9,80+0,68 R3-5 R3-6 US2-10 1,32+0,10 1,37+0,15 10,82+0,42 13 14 110 79

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (1) REQUERENTE: (A) NOME: Jens KoBmann (B) RUA: Golmer Fichten 9. (C) CIDADE: Golm

(E) PAÍS: DE (F) CÓDIGO POSTAL: 14476 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: plantas que sintetizam um amido modificado, processo para a sua produção e amido modificado (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) VERSÃO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPA) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4856 pares de base (B) TIPO: Nucleótido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: helicoidal simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: ADNc a ARNm 80 (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Solanum tuberosum (B) ESTIRPE: C.V. Berolina (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 105.4497 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: Seq ID N°. 1:

CATCTTCATC GAATTTCTCG AAGCTTCTTC GCTAATTTCC TGGTTTCTTC ACTCAAAATC 60 116 164 212

GACGTTTCTA GCTGAACTTG AGTGAATTAA GCCAGTGGGA GGAT ATS AGT AAT TCC

Met Ser Asn Ser 1

TTA GGG AAT AAC TTG CTG TAC CAG GGA TTC CTA ACC TCA ACA GTG TTG Leu 5 Gly Asa Asn Leu Leu 10 Tyr Gin Gly Phe Leu 15 Thr Ser Thr Vai Leu 20 GAA Cat AAA AGT AGA ATC AGT CCT CCT TGT GTT GGA GGC AAT TCT TTG Glu His Lys Ser Arg 25 Ile Ser Pro Pro Cys 30 Vai Gly Gly Asn Ser 35 Leu TTT CAA CAA CAA GTG ATC TCG AAA TCA CCT TTA TCA ACT GAG TTT CGA 260 81 81 Phe Gin Gin Gin 40 Vai Ile Ser Lys Ser 45 Pro GGT AAC AGG TTA AAG GTG CAG AAA AAG AAA Gly Asn Arg 55 Leu Lys Vai Gin Lys 60 Lys Lys CGT GCT TTT TCT AGT TCT CCT CAT GCT GTA Arg Ala 70 Phe Ser Ser Ser Pro 75 His Ala Vai TCT GAG CTA GCA GAA AAG TTC AGT CTA GGG Ser 85 Glu Leu Ala Glu Lys 90 Phe Ser Leu Gly GTT GAT GTT AGG CCT CCC ACT TCA GGT GAT Vai Asp Vai Arg Pro 105 Pro Thr Ser Gly Asp 110 CAA GTA ACA AAT GGT AGT GAT AAA CTG TTT Gin Vai Thr Asn 120 Gly Ser Asp Lys Leu 125 Phe AAA TTC GGG AAA GAA ACA TGG TCT CTT CCG Lys Phe Gly Lys 135 Glu Thr Trp Ser l40 Leu Pro ACC AAA GTG TAC AAG AAC AAÀ GCA CTT AGA Thr Lys 150 Vai Tyr Lys Asn Lys 155 Ala Leu Arg GGC TCT AAC TCC ATC CTG AGA CTG GAG ATA Gly Ser 165 Asn Ser Ile Leu 170 Arg Leu Glu Ile GCT ATT GAG TTT CTC ATA TAC GAT GAA GCC Ala Ile Glu Phe Leu 185 Ile Tyr Asp Glu Ala 190 AAT AAT GGT GGT AAT TTT CGT GTC AAA TTG Asn Asn Gly Gly Asn 200 Phe Arg Vai Lys 205 Leu GGC CCA GAT GTT TCT GTT CCT GAG GAG CTT Gly Pro Asp Vai 215 Ser Vai Pro Glu 220 Glu Leu TTG AGG TGG GAG AGG AAG GGA AAA CAG AAT Leu Arg 230 Trp Glu Arg Lys Gly 235 Lys Gin Asn AAG GAG GAA TAT GAG GCT GCT CGA ACT GTG Lys 245 Glu Glu Tyr Glu Ala 250 Ala Arg Thr val CGT GGT GCT TCC ATA CAG GAC ATT CGA GCA Arg Gly Ala Ser Ile 265 Gin Asp Ile Arg Ala 270 Leu Ser Thr Glu Phe Arg 50

ATA CCT ATG GAA AAG AAG 30B

Ile Pro Met Glu Lys Lys 65 CTT ACC ACT GAT ACC TCT 356

Leu Thr Thr Asp Thr Ser 80 GGG AAT ATT GAG CTA CAG . 404

Gly Asn Ile Glu Leu Gin 95 100 GTG TCC TTT GTG GAT TTT 4S2

Vai Ser Phe Vai Asp Phe 115

TTG CAC TGG GGG GCA GTA SOO

Leu His Trp Gly Ala Vai 130 AAT GAT CGT CCA GAT GGG 548

Asn Asp Axg Pro Asp Gly 145 ACT CCA TTT GTT AAA TCT 596

Thr Pro Phe vai Lys Ser 160 CGA GAC ACT GCT ATC GAA 644

Arg Asp Thr Ala Ile Glu 175 180 CAC GAT AAA TGG ATA AAG 692

His Asp Lys Trp Ile Lys 195 TCA AGA AAA GAG ATA CGA 740

Ser Arg Lys Glu Ile Arg 210 GTA CAG ATC CAA TCA TAT 788

Vai Gin Ile Gin Ser Tyr 225 TAC CCC CCT GAG AAA GAG 836

Tyr Pro Pro Glu Lys Glu 240 CTA CAG GAG GAA ATA GCT 884

Leu Gin Glu Glu Ile Ala 255 260 AGG CTA ACA AAA ACT AAT 932

Arg Leu Thr Lys Thr Asn 275 82 GAT AAA AGT CAA AGC AAA GAA GAG CCT CTT CAT GTA ACA AAG AGT GAT 980 Asp Lys Ser Gin 280 Ser Lys Glu Glu Pro 28S Leu His Vai Thr Lys 290 Ser' Asp ATA CCT GAT GAC CTT GCC CAA GCA CAA GCT TAC ATT AGG TGG GAG AAA 1028 Ile Pro Asp Asp 295 Leu Ala Gin Ala 300 Gin Ala Tyr Ile Arg Trp 305 Glu Lys GCA GGA AAG CCG AAC TAT CCT CCA GAA AAG CAA ATT GAA GAA CTC GAA 1076 Ala Gly Lys 310 Pro Asn Tyr Pro 315 Pro Glu Lys Gin Ile Glu Glu 320 Leu GlU GAA GCA AGA AGA GAA TTG CAA CTT GAG CTT GAG AAA GGC ATT ACC CTT 1124 Glu Ala Arg Arg 325 Glu Leu 330 Gin Leu Glu Leu Glu Lys Gly Ile 335 Thr Leu 340 GAT GAG TTG CGG AAA ACG ATT ACA AAA GGG GAG ATA AAA ACT AAG GTG 1172 Asp Glu Leu Arg Lys 345 Thr Ile Thr Lys Gly Glu Ile Lys Thr 350 Lys 355 Vai GAA AAG CAC CTG AAA AGA AGT TCT TTT GCC GTT GAA AGA ATC CAA AGA 1220 Glu Lys His Leu 360 Lys Arg Ser Ser Phe 365 Ala Vai Glu Arg He 370 Gin Arg AAG AAG AGA GAC TTT GGG CAT CTT ATT AAT AAG TAT ACT TCC AGT CCT 1268 Lys Lys Arg Asp 375 Phe Gly His Leu 380 Ile Asn Lys Tyr Thr Ser 385 Ser Pro GCA GTA CAA GTA CAA AAG GTC TTG GAA GAA CCA CCA GCC TTA TCT AAA 1316 Ala Vai 390 Gin Vai Gin Lys Vai 395 Leu GlU Glu Pro Pro Ala Leu 400 Ser Lys ATT AAG CTG TAT GCC AAG GAG AAG GAG GAG CAG ATT GAT GAT CCG ATC 1364 Ile 405 Lys Leu Tyr Ala Lys 410 Glu Lys Glu Glu Gin Ile Asp Asp 415 Pro Ile 420 CTA AAT AAA AAG ATC TTT AAG GTC GAT GAT GGG GAG CTA CTG GTA CTG 1412 Leu Asn Lys Lys Ile 425 Phe Lys Vai Asp Asp Gly Glu Leu Leu 430 Vai 435 Leu GTA GCA AAG TCC TCT GGG AAG ACA AAA GTA CAT CTA GCT ACA GAT CTG . 1460 Vai Ala Lys Ser 440 Ser Gly Lys Thr Lys 445 Vai His Leu Ala Thr 450 Asp Leu AAT CAG CCA ATT ACT CTT CAC TGG GCA TTA TCC AAA AGT CCT GGA GAG 1508 Asn Gin Pro 455 ile Thr Leu His Trp Ala 460 Leu Ser Lys Ser Pro 465 Gly Glu TGG ATG GTA CCA CCT TCA AGC ATA TTG CCT CCT GGG TCA ATT ATT TTA 1556 Trp Met 470 Vai Pro Pro Ser Ser 475 ile Leu Pro Pro Gly Ser Ile 480 Ile Leu GAC AAG GCT GCC GAA ACA CCT TTT TCA GCC AGT TCT TCT GAT GGT CTA 1604 Asp 485 Lys Ala Ala Glu Thr 490 Pro Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asp 495 Gly Leu 500 ACT TCT AAG GTA CAA TCT TTG GAT ATA GTA ATT GAA GAT GGC AAT TTT 1652 Thr Ser Lys Vai Gin 505 Ser Leu Asp Ile Vai 510 Ile Glu Asp Gly Asn 515 Phe 83 GTG GGG ATG CCA TTT GTT Val Gly Met Pro Phe Val 520 CAA GGG TCG GAT TTC TAT Gin Gly Ser Asp Phe Tyr 535 CTC AAG GCT GCT GGG GAT Leu Lys 550 Ala Ala Gly Asp AAA ATA GCA GAT ATG GAA Lys Ile Ala Asp Met Glu 565 570 TTT AAT ATT GCA GCT GAC Phe Asn Ile Ala Ala Asp 585 CTT GGT TTT GCT GGA ATT Leu Gly Phe Ala Gly Ile 600 CAA CTG ATA TGG AAC AAA Gin Leu Ile 615 Trp Asn Lys AAG GCT CAG GAC AGA CTT Lys Ala 630 Gin Asp Arg Leu CAC CCT CAG TAC CGT GAA His 645 Pro Gin Tyr Arg Glu 650 CGT GGA GGT GAA GGG GAT Arg Gly Gly Glu Gly Asp 665 GTC ATC CAG AGG AAC AAT Val Ile Gin Arg Ásn Asn 680 CAT CAG AAA TTG CAT AAT His Gin Lys 695 Leu His Asn CAG GCA TTA ATT GAC TAC Gin Ala 710 Leu Ile Asp Tyr TGG AAA ACC CTG AAT GAG Trp 725 Lys Thr Leu Asn Glu 730 TAT GAC CGT GCT ATC CAT Tyr Asp Arg Ala Ile His 745 CTT TTG TCT GGT GAA AAA Leu Leu Ser 525 Gly Glu Lys GTT GGC TTC AGT GCT GCA Vál Gly 540 Phe Ser Ala Ala GGC AGT GGA ACT GCA AAG Gly 555 Ser Gly Thr Ala Lys 560 AGT GAG GCT CAG AAG TCA Ser Glu Ala Gin Lys 575 Ser TTG ATA GAA GAT GCC ACT Leu Ile Glu Asp Ala 590 Thr CTT GTA TGG ATG AGG TTC Leu Val' Trp Met Arg 605 Phe AAC TAT AAC GTA AAA CCA Asn Tyr Asn 620' Val Lys Pro- ACA GAC TTG TTG CAG AAT Thr Asp Leu Leu Gin Asn 635 640 ATT TTG CGG ATG ATT ATG Ile Leu Arg Met Ile 655 Met GTA GGA CAG CGA ATT AGG Val Gly Gin Arg Ile 670 . Arg GAC TGC AAG GGT GGT ATG Asp Cys Lys 685 Gly Gly Met AAT ACT AGT CCT GAT GAT Asn Thr 700 Ser Pro Asp Asp ATC AAG AGT GAT TTT GAT Ile 715 Lys Ser Asp Phe Asp 720 AAC GGA ATA ACA AAA GAG Asn Gly Ile Thr Lys 735 Glu TCT GAA CCA AAT TTT AGA Ser Glu Pro Asn Phe 750 Arg TGG ATT AAG AAC 1700

Trp Ile Lya Asn 530

TCC AAA TTA GCA 174B

Ser Lys Leu Ala 545 TCT TTA CTG GAT 1796

Ser Leu Leu Asp TTT ATG CAC CGG 1B44

Fhe Met His Arg 580 AGT GCT GGT GAA 1B92

Ser Ala Gly Glu 595 ATG GCT ACA AGG 1940

Met Ala Thr Arg 610 CGT GAA ATA AGC 1988

Arg Glu Ile Ser 625 GCT TTC ACC AGT 2036

Ala Phe Thr Ser TCA ACT GTT GGA 2084

Ser Thr Vai Gly 660 GAT GAA ATT TTG 2132

Asp Glu Ile Leu 675 ATG CAA GAA TGG 2180

Met Gin Glu Trp 690 GTT GTG ATC TGT 2228 val Vai Ile Cys 705 CTT GGT GTT TAT 2276

Leu Gly Val Tyr CGT CTT TTG AGT 2324

Arg Leu Leu Ser 740 GGA GAT CAA AAG 2372

Gly Asp Gin Lys 755 84 GGT GGT CTT TTG CGT GAT TTA GGT CAC TAT ATG AGA ACA TTG AAG GCA 2420 Gly Gly Leu Leu Arg 760 Asp Leu Gly His 765 Tyr Met Arg Thr Leu 770 Lys Ala GTT CAT TCA GGT GCA GAT CTT GAG TCT GCT ATT GCA AAC TGC ATG GGC 2468 Vai His Ser 775 Gly Ala Asp Leu Glu 780 Ser Ala Ile Ala Asn 785 Cys Met Gly TAC AAA ACT GAG GGA GAA GGC TTT ATG GTT GGA GTC CAG ATA AAT CCT 2516 Tyr Lys 790 Thr Glu Gly Glu Gly 795 Phe Met Vai Gly Vai 800 Gin Ile Asn Pro GTA TCA GGC TTG CCA TCT GGC TTT CAG GAC CTC CTC CAT TTT GTC TTA 2564 Vai 805 Ser Gly Leu Pro Ser 810 Gly Phe Gin Asp Leu 815 Leu His Phe val Leu 820 GAC CAT GTG GAA GAT AAA AAT GTG GAA ACT CTT CTT GAG AGA TTG CTA 2612 Asp His Vai Glu Asp 825 Lys Asn Vai Glu Thr 830 Leu Leu Glu Arg Leu 835 Leu GAG GCT CGT GAG GAG CTT AGG CCC TTG CTT CTC AAA CCA AAC AAC CGT 2660 Glu Ala Arg Glu 840 Glu Leu Arg Pro Leu 845 Leu Leu Lys Pro Asn 850 Asn Arg CTA AAG GAT CTG CTG TTT TTG GAC ATA GCA CTT GAT TCT ACA GTT AGA 2708 Leu Lys Asp 855 Leu Leu Phe Leu Asp 860 lie Ala Leu Asp Ser 865 Thr Val Arg ACA GCA GTA GAA AGG GGA TAT GAA GAA TTG AAC AAC GCT AAT CCT GAG 2756 Thr Ala 870 Vai Glu Arg Gly Tyr 875 Glu Glu Leu Asn Asn 880 Ala Asn Pro Glu AAA ATC ATG TAC TTC ATC TCC CTC GTT CTT GAA AAT CTC GCA CTC TCT 2804 Lys 885 Ile Met Tyr Phe Ile 890 Ser Leu Vai Leu Glu 895 Asn Leu Ala Leu ser 900 GTG GAC GAT AAT GAA GAT CTT GTT TAT TGC TTG AAG GGA TGG AAT CAA 2852 Vai Asp Asp Asn Glu 905 Asp Leu Vai Tyr Cys 910 Leu Lys Gly Trp Asn 915 Gin GCT CTT TCA ATG TCC AAT GGT GGG GAC AAC CAT TGG GCT TTA TTT GCA 2900 Ala Leu Ser Met 920 Ser Asn Gly Gly Asp 925 Asn His Trp Ala Leu 930 Phe Ala AAA GCT GTG CTT GAC AGA ACC CGT CTT GCA CTT GCA AGC AAG GCA GAG 2948 Lys Ala Vai 935 Leu Asp Arg Thr Arg 940 Leu Ala Leu Ala Ser 945 Lys Ala Glu TGG TAC CAT CAC TTA TTG CAG CCA TCT GCC GAA TAT CTA GGA TCA ATA 2996 Trp Tyr 950 His His Leu Leu GÍn 955 Pro Ser Ala Glu Tyr 960 Leu Gly Ser Ile CTT GGG GTG GAC CAA TGG GCT TTG AAC ATA TTT ACT GAA GAA ATT ATA 3044 Leu 965 Gly Vai Asp Gin Trp 970 Ala Leu Asn Ile Phe 975 Thr Glu Glu Ile Ile 980 CGT GCT GGA TCA GCA GCT TCA TTA TCC TCT CTT CTT AAT AGA CTC GAT 3092. Arg Ala Gly Ser Ala 985 Ala Ser Leu Ser Ser 990 Leu Leu Asn Arg Leu Asp 995 85 85 CCC GTG CTT CGG AAA ACT GCA AAT CTA GGA AGT TGG CAG ATT ATC AGT Pro Vai Leu Arg Lys 1000 Thr Ala Asn Leu Gly 1005 Ser Trp Gin Ile Ile 1010 Ser CCA GTT GAA GCC GTT GGA TAT GTT GTC GTT GTG GAT GAG TTG CTT TCA Pro Vai Glu Ala 1015 Val Gly Tyr Val Val 1020 Val Val Asp Glu Leu 1025 Leu Ser GTT CAG AAT GAA ATC TAC GAG AAG CCC ACG ATC TTA GTA GCA AAA TCT Vai Gin Asn 1030 Glu Ile Tyr Glu Lys 1035 Pro Thr Ile Leu Val 1040 Ala Lys Ser GTT AAA GGA GAG GAG GAA ATT CCT GAT GGT GCT GTT GCC CTG ATA ACA Vai Lys 1045 Gly Glu Glu Glu Ile 1050 Pro Asp Gly Ala Val 1055 Ala Leu Ile Thr 1060 CCA GAC ATG CCA GAT GTT CTT TCA CAT GTT TCT GTT CGA GCT AGA AAT Pro Asp Met Pro Asp Val Leu 1065 Ser His Val Ser 1070 Val Arg Ala Arg Asn 1075 GGG AAG GTT TGC TTT GCT ACA TGC TTT GAT CCC AAT ATA TTG GCT GAC Gly Lys val Cys Phe 1080 Ala Thr Cys Phe Asp 1085 Pro Asn Ile Leu Ala 1090 Asp CTC CAA GCA AAG GAA GGA AGG ATT TTG CTC TTA AAG CCT ACA CCT TCA Leu Gin Ala Lys 1095 Glu Gly Arg Ile Leu 1100 Leu Leu Lys Pro Thr 1105 Pro Ser GAC ATA ATC TAT AGT GAG GTG AAT GAG ATT GAG CTC CAA AGT TCA AGT Asp Ile Ile 1110 Tyr Ser Glu Val Asn 1115 Glu Ile Glu Leu Gin 1120 Ser ser Ser AAC TTG GTA GAA GCT GAA ACT TCA GCA ACA CTT AGA TTG GTG AAA AAG Asn Leu 1125 Val Glu Ala Glu Thr 1130 Ser Ala Thr Leu Arg 1135 . Leu val Lys Lys 1140 CAA ITT GGT GGT TGT TAC GCA ATA TCA GCA GAT GAA TTC ACA AGT GAA Gin Phe Gly. Gly Cys Tyr Ala 1145 Ile Ser Ala Asp 11S0 Glu Phe Thr Ser Glu 1155 ATG GTT GGA GCT AAA TCA CGT AAT ATT GCA TAT CTG AAA GGA AAA GTG Met Vai Gly Ala Lys 1160 Ser Arg Asn Ile Ala 1165 Tyr Leu Lys Gly Lys 1170 Val CCT TCC TCG GTG GGA ATT CCT ACG TCA GTA GCT CTT CCA TTT GGA GTC Pro Ser Ser Val 1175 Gly Ile Pro Thr Ser 1180 Val Ala Leu Pro Phe 1185 Gly Val TTT GAG AAA· GTA CTT. TCA GAC GAC ATA AAT CAG GGA GTG GCA AAA GAG Phe Glu Lys 1190 Val Leu Ser Asp Asp 1195 Ile Asn Gin Gly Val 1200 Ala Lys Glu TTG CAA ATT CTG ATG AAA AAA CTA TCT GAA GGA GAC TTC AGC GCT CTT Leu Gin 1205 Ile Leu Met Lys Lys 1210 Leu Ser Glu Gly Asp Phe 1215 Ser Ala Leu 1220 GGT GAA ATT CGC ACA ACG GTT TTA GAT CTT TCA GCA CCA GCT CAA TTG Gly Glu Ile Arg Thr Thr Val 1225 Leu Asp Leu Ser 1230 Ala Pro Ala Gin Leu 1235 3140 3188 3236 3284 3332 3380 3428 3476 3524 3572 3620 3668 3716 3764 3812 86 GTC AAA GAG CTG AAG GAG AAG ATG CAG GGT TCT GGC ATG CCT TGG CCT 3860 Vai Lys Glu Leu Lys 1240 Glu Lys Met Gin Gly 1245 Ser Gly Met Pro Trp 1250 Pro GGT GAT GAA GGT CCA AAG CGG TGG GAA CAA GCA TGG ATG GCC ATA AAA 3908 Gly Asp Glu Gly 1255 Pro Lys Arg Trp Glu 1260 Gin Ala Trp Met Ala 1265 Ile Lys AAG GTG TGG GCT TCA AAA TGG AAT GAG AGA GCA TAC TTC AGC ACA AGG 3956 Lys Val Trp Ala 1270 Ser Lys Trp Asn 1275 Glu Arg Ala Tyr Phe 1280 Ser Thr Arg AAG GTG AAA CTG GAT CAT GAC TAT CTG TGC ATG GCT GTC CTT GTT CAA 4004 Lys Val 1285 Lys Leu Asp His Asp 1290 Tyr Leu Cys Met Ala 1295 Val Leu Val Gin 1300 GAA ATA ATA AAT GCT GAT TAT GCA TTT GTC ATT CAC ACA ACC AAC CCA 4052 Glu Ile' Ile Asn Ala Asp 1305 Tyr Ala Phe Val Ile 1310 His Thr Thr Asn Pro 1315 TCT TCC GGA GAC GAC TCA GAA ATA TAT GCC GAG GTG GTC AGG GGC CTT 4100 Ser Ser Gly Asp Asp 1320 Ser Glu Ile Tyr Ala 1325 GÍU Val Val Arg Gly Leu 1330 GGG GAA ACA CTT GTT GGA GCT TAT CCA GGA CGT GCT TTG AGT TTT ATC 4148 Gly Glu Thr Leu 1335 Val Gly Ala Tyr Pro 1340 Gly Arg Ala Leu Ser 1345 Phe Ile TGC AAG AAA AAG GAT CTC AAC TCT CCT CAA GTG TTA GGT TAC. CCA AGC 4196 Cys Lys Lys Lys 1350 Asp Leu Asn Ser 1355 Pro Gin Val Leu Gly 1360 Tyr Pro Ser AAA CCG ATC GGC CTT TTC ATA AAA AGA TCT ATC ATC TTC CGA TCT GAT 4244 Lys Pro 1365 Ile Gly Leu Phe Ile 1370 Lys Arg Ser Ile Ile 1375 Phe Arg Ser Asp 1380 TCC AAT GGG GAA GAT TTG GAA GGT TAT GCC GGT GCT GGC CTC TAC GAC 4292 Ser Asn Gly Glu Asp Leu 1385 Glu Gly Tyr Ala Gly 1390 Ala Gly Leu Tyr Asp 1395 AGT GTA CCA ATG GAT GAG GAG GAA AAA GTT GTA ATT GAT TAC TCT TCC 4340 Ser Val Pro Met Asp 1400 Glu Glu Glu Lys Val 1405 Val Ile Asp Tyr Ser 1410 Ser GAC CCA TTG ATA ACT GAT GGT AAC TTC CGC CAG ACA ATC CTG TCC AAC 4388 Asp Pro Leu Ile 1415 Thr Asp Gly Asn Phe 1420 Arg Gin Thr Ile Leu 1425 Ser Asn ATT GCT CGT GCT GGA CAT GCT ATC GAG GAG CTA TAT GGC TCT CCT CAA 4436 Ile Ala Arg Ala 1430 Gly His Ala Ile 1435 Glu Glu Leu Tyr Gly Ser 1440 Pro Gin GAC ATT GAG GGT GTA GTG AGG GAT GGA AAG ATT TAT GTC GTT CAG ACA 4484 Asp Ile 1445 Glu Gly Val Val Arg Asp Gly 1450 Lys Ile Tyr Val 1455 Val Gin Thr 1460 AGA CCA CAG ATG T GATTATATTC TCGTTGTATG TTGTTCAGAG AAGACCACAG 4S37

Arg Pro Gin Met ATGTGATCAT ATTCTCATTG TATCAGATCT GTGACCACTT ACCTGATACC TCCCATGAAG 4597 TTACCTGTAT GATTATACGT GATCCAAAGC CATCACATCA TGTTCACCTT CAGCTATTGG 4657 AGGAGAAGTG AGAAGTAGGA ATTGCAATAT GAGGAATAAT AAGAAAAACT TTGTAAAAGC 4717 TAAATTAGCT GGGTATGATA TAGGGAGAAA TGTGTAAACA TTGTACTATA TATAGTATAT 4777 ACACACGCAT TATGTATTCC ATTATGCACT GAATAATATC GCAGCATCAA AGAAGAAATC 4B37 CTTTGGGTGG TTTCAAAAA 4856 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA SEQ ID N° 2: (i) CARACTERISTICA DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1464 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2: 88

Met 1 Ser Asn Ser Leu 5 Gly Asn Asn Leu Leu Tyr 10 Gin Gly Phe Leu . 15 Thr Ser Thr Vai Leu 20 Glu His Lys Ser Arg 25 Ile Ser Pro Pro Cys 30 vai Gly Gly Asn Ser 35 Leu Phe Gin Gin Gin 40 Vai Ile Ser Lys Ser 45 Pro Leu Ser Thr Glu 50 Phe Arg Gly Asn Arg 55 Leu Lys Vai Gin Lys 60 Lys Lys Ile Pro Met 65 Glu Lys Lys Arg Ala 70 Phe Ser Ser Ser Pro 75 His Ala Vai Leu Thr 80 Thr Asp Thr Ser Ser 85 Glu Leu Ala Glu Lys Phe 90 Ser Leu Gly Gly 95 Asn Ile Glu Leu Gin 100 Vai Asp Vai Arg Pro 105 Pro Thr Ser Gly Asp 110 Vai Ser Fhe Vai Asp 115 Phe Gin Vai Thr Asn 120 Gly Ser Asp Lys Leu 125 Phe Leu His Trp Gly 130 Ala Vai Lys Phe Gly 135 Lys Glu Thr Trp Ser 140 Leu Pro Asn Asp Arg 145 Pro Asp Gly Thr Lys 150 Vai Tyr Lys Asn Lys 155 Ala Leu Arg Thr Pro 160 Phe Vai Lys Ser Gly 165 Ser Asn Ser Ile Leu Arg 170 Leu Glu Ile Arg 175 Asp Thr Ala Ile Glu 180 Ala Ile Glu Phe Leu 185 Ile Tyr Asp Glu Ala 190 His Asp Lys Trp Ile 195 Lys Asn Asn Gly Gly 200 Asn Phe Arg Vai Lys 205 Leu Ser Arg 89

Lys Glu Ile Arg Gly Pro Asp Vai 210 215

Ile Gin Ser Tyr Leu Arg Trp Glu 225 230

Pro Glu Lys Glu Lys Glu Glu Tyr 245

Glu Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ser 260

Thr Lys Thr Asn Asp Lys Ser Gin 275 280

Thr Lys Ser Asp Ile Pro Asp Asp 290 295

Arg Trp Glu Lys Ala Gly Lys Pro 305 310

Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Arg 325

Gly Ile Thr Leu Asp Glu Leu Arg 340

Lys Thr Lys Vai Glu Lys His Leu 355 360

Arg Ile Gin Arg Lys Lys Arg Asp 370 375

Thr Ser Ser Pro Ala Vai Gin Vai 385 390

Ala Leu Ser Lys Ile Lys Leu Tyr 405

Asp Asp Pro Ile Leu Asn Lys Lys 420

Leu Leu Vai Leu Vai Ala Lys Ser 435 440

Ala Thr Asp Leu Asn Gin Pro Ile 450 455

Ser Pro Gly Glu Trp Met Vai Pro 465 470

Ser Ile Ile Leu Asp Lys Ala Ala 485

Ser Asp Gly Leu Thr Ser Lys Vai 500

Asp Gly Asn Phe Vai Gly Met Pro 515 520

Ser Vai Pro Glu Glu Leu Vai Gin • 220

Arg Lys Gly Lys Gin Asn Tyr Pro 235 240

Glu Ala Ala Arg Thr Vai Leu Gin 250 255

Ile Gin Asp Ile Arg Ala Arg Leu 265 270

Ser Lys Glu Glu Pro Leu His vai 285

Leu Ala Gin Ala Gin Ala Tyr Ile 300

Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gin Ile 315 320

Glu Leu Gin Leu Glu Leu Glu Lys 330 335

Lys Thr Ile Thr Lys Gly Glu Ile 345 3S0

Lys Arg Ser Ser Phe Ala Vai Glu 365

Phe Gly His Leu Ile Asn Lys Tyr 380

Gin Lys Vai Leu Glu Glu Pro Pro 395 400

Ala Lys Glu Lys Glii Glu Gin Ile 410 415

Ile Phe Lys Vai Asp Asp Gly Glu 425. 430

Ser Gly Lys Thr Lys Vai His Leu 445

Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys 460

Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gly 475 480

Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser 490 495

Gin Ser Leu Asp Ile Vai Ile Glu 505 510

Phe Vai Leu Leu Ser Gly Glu Lys 525 90 90 Trp Ile Lys Asn Gin Gly Ser Asp 530 S3S Ser Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ala 545 550 Ser Leu Leu Asp Lys Ile Ala Asp 565 Phe Met His Arg Phe Asn Ile Ala 580 Ser Ala Gly Glu Leu Gly Phe Ala 595 600 Met Ala Thr Arg Gin Leu Ile Trp 610 615 Arg Glu Ile Ser Lys Ala Gin Asp 625 630 Ala Phe Thr Ser His Pro Gin Tyr 645 Ser Thr Vai Gly Arg Gly Gly Glu 660 Asp Glu Ile Leu Vai Ile Gin Arg 675 680 Met Gin Glu Trp His Gin Lys Leu 690 695 Vai Vai Ile Cys Gin Ala Leu Ile 705 710 Leu Gly Vai Tyr Trp Lys Thr Leu 725 Arg Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Ala 740 Gly Asp Gin Lys Gly Gly Leu Leu 755 760 Thr Leu Lys Ala Vai His Ser Gly 770 775 Asn Cys Met Gly Tyr Lys Thr Glu 785 790 Gin Ile Asn Pro Vai Ser Gly Leu 805 His Phe Vai Leu Asp His Vai Glu 820 Glu Arg Leu Leu Glu Ala Arg Glu 835 840

Phe Tyr Vai Gly Phe Ser Ala Ala 540

Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys 555 560

Met Glu Ser Glu Ala Gin Lys Ser 570 575

Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Thr 585 590

Gly Ile Leu Vai Trp Met Arg Phe 605

Asn Lys Asn Tyr Asn Vai Lys Pro 620

Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gin Asn 635 640

Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met 650 655

Gly Asp Vai Gly Gin Arg Ile Arg 665 670

Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met 685

His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp 700

Asp Tyr.Ile Lys Ser Asp Phe Asp 715 720

Asn Glu Asn Gly Ile Thr Lys Glu 730 735

Ile His Ser Glu Pro Asn Phe Arg 745 750

Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg 765

Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala 780

Gly Glu Gly Phe Met Vai Gly Vai. 795 800

Pro Ser Gly Phe Gin Asp Leu Leu 810 815

Asp Lys Asn Vai Glu Thr Leu Leu 825 830

Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lys 845 91

Pro Asn 850 Asn Arg Leu Lys Asp 855 Leu Leu Phe Leu Asp 860 Ile Ala Leu Asp Ser Thr 865 Vai Arg Thr Ala Vai 870 Glu Arg Gly Tyr Glu 875 Glu Leu Asn Asn 880 Ala Asn Pro Glu Lys 885 Ile Met Tyr Phe Ile Ser Leu 890 ' Vai Leu Glu Asn 895 Leu Ala Leu Ser Vai Asp Asp 900 Asn Glu Asp Leu Vai 905 Tyr Cys 910 Leu Lys Gly Trp Asn 915 Gin Ala Leu Ser Met 920 Ser Asn Gly Gly Asp 925 Asn His .Trp Ala Leu 930 Phe Ala Lys Ala Vai 935 Leu Asp Arg Thr Arg 940 Leu Ala Leu Ala Ser Lys 945 Ala Glu Trp Tyr His 950 Mis Leu Leu Gin Pro 955 Ser Ala Glu Tyr 960 Leu Gly Ser Ile Leu 965 Gly Vai Asp Gin Trp Ala Leu 970 Asn Ile Phe Thr 975 Glu Glu Ile Ile Arg 980 Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu 985 Ser Ser 990 Leu Leu Asn Arg Leu Asp Pro 995 Vai Leu Arg Lys Thr Ala Asn 1000 Leu Gly Ser Trp 1005 Gin Ile Ile Ser Pro Vai Glu Ala Vai Gly Tyr Vai Vai Vai Vai Asp 1010 1015 1020 Glu Leu 1025 Leu Ser Vai Gin Asn 1030 Glu Ile Tyr Glu Lys 1035 Pro Thr Ile Leu 1040 Vai Ala Lys Ser Vai Lys Gly 1045 Glu Glu Glu Ile Pro 1050 Asp Gly Ala Vai 1055 Ala Leu Ile Thr Pro 1060 Asp Met Pro Asp Vai Leu Ser 1065 His- Vai ser vai 1070 Arg Ala Arg Asn Gly 1075 Lys Vai Cys Phe Ala Thr Cys 1080 Phe Ásp 1085 Pro Asn Ile Leu Ala 1090 Asp Leu Gin Ala Lys 1095 Glu Gly Arg Ile Leu 1100 Leu Leu Lys Pro Thr 1105 Pro Ser Asp Ile Ile 1110 Tyr Ser Glu Vai Asn 1115 Glu Ile Glu Leu 1120 Gin Ser Ser Ser Asn Leu Vai 1125 Glu Ala Glu Thr Ser 1130 Ala Thr Leu Arg 1135 Leu vai Lys Lye Gin Phe Gly Gly Cys Tyr Ala Ile Ser Ala Asp Glu 1140 1145 1150

Phe Thr Ser Glu Met Vai Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ala Tyr Leu 1155 1160 1165 92

Lys Gly Lys Vai Pro Ser Ser Vai Gly Ile Pro Thr Ser Vai Ala Leu 1170 1175 1180 Pro Phe Gly Vai Phe Glu Lys Vai Leu Ser Asp Asp Ile Asn Gin Gly 1185 1190 1195 1200 Vai Ala Lys Glu Leu Gin Ile Leu Met Lys Lys Leu Ser Glu Gly Asp 1205 1210 1215 Phe Ser Ala Leu Gly Glu Ile Arg Thr Thr Vai Leu Asp Leu Ser Ala 1220 1225 1230 Pro Ala Gin Leu Vai Lys Glu Leu Lys Glu Lys Met Gin Gly Ser Gly 1235 1240 1245 Met Pro Trp Pro Gly Asp Glu Gly Pro Lys Arg Trp Glu Gin Ala Trp 1250 1255 1260 Met Ala Ile Lys Lys Vai Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu Arg Ala Tyr 1265 1270 1275 1280 Phe Ser Thr Arg Lys Vai Lys Leu Asp Hls Asp Tyr Leu Cys Met Ala 1285 1290 1295 Vai Leu Vai Gin Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tyr Ala Phe Vai Ile His 1300 1305 1310 Thr Thr Ash Pro Ser Ser Gly Asp Asp Ser Glu Ile Tyr Ala Glu Vai 1315 1320 1325 Vai Arg Gly Leu Gly Glu Thr Leu Vai Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala 1330 1335 1340 Leu Ser Phe Xle Cys Lys Lys Lys Asp Leu Asn Ser Pro Gin Vai Leu 1345 1350 1355 1360 Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Ile Gly Leu Phe Ile Lys Arg Ser Ile Ile 1365 1370 1375 Phe Arg Ser Asp Ser Asn Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala 1380 1385 1390 Gly Leu Tyr Asp Ser Vai Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Vai Vai Ile 1395 1400 1405 Asp Tyr Ser Ser Asp Pro Leu Ile Thr Asp Gly Asn Phe Arg Gin Thr 1410 1415 1420 lie Leu Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gly His Ala Ile Glu Glu Leu Tyr 1425 1430 1435 1440 Gly Ser Pro Gin Asp Ile Glu Gly Vai Vai Arg Asp Gly Lys Ile Tyr 1445 1450 1455 Vai Vai Gin Thr Arg Pro Gin Met 1460 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA SEQ ID N° 3: 93 93 (i) (A) (B) (C) simples (D) CARACTERISTICA DA SEQUENCIA: COMPRIMENTO: 1918 aminoácidos TIPO: Nucleótido ESTRUTURA HELICOIDAL: estrutura helicoidal TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: solanum tuberosum (B) ESTIRPE: C.V. Desiree (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: cds (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1555 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3: 94 GCA GAG TGG TAC CAT CAC TTA TTG CAG CCA TCT GCC GAA TAT CTA GGA 48 Ala 1 Glu Trp Tyr HÍS 5 His Leu Leu Gin • Pro 10 Ser Ala Glu Tyr Leu 15 Gly TCA ATA CTT GGG GTG GAC CAA TGG GCT TTG AAC ATA TTT ACT GAA GAA 96 Ser Ile Leu Gly 20 Vai Asp Gin Trp Ala 25 Leu Asn Ile Phe Thr 30 Glu Glu ATT ATA CGT GCT GGA TCA GCA GCT TCA TTA TCC TCT CTT CTT AAT AGA 144 Ile Ile Arg 35 Ala Gly Ser Ala Ala 40 Ser Leu Ser Ser Leu 45 Leu Asn Arg CTC GAT ccc GTG CTT CGG AAA ACT GCA AAT CTA GGA AGT TGG CAG ATT 192 Leu Asp 50 Pro Vai Leu Arg Lys 55 Thr Ala Asn Leu Gly 60 Ser Trp Gin Ile ATC AGT CCA GTT GAA GCC GTT GGA TAT GTT GTC GTT GTG GAT GAG TTG 240 Ile 65 Ser Pro Vai Glu Ala 70 Vai Gly Tyr Vai Vai 75 Vai Vai Asp Glu Leu 80 CTT TCA GTT CAG AAT GAA ATC TAC GAG AAG CCC ACG ATC TTA GTA GCA 288 Leu Ser Vai Gin Asn 85 Glu Ile Tyr Glu Lys 90 Pro Thr Ile Leu Vai 95 Ala AAA TCT GTT AAA GGA GAG GAG GAA ATT CCT GAT GGT GCT GTT GCC CTG 336 Lys Ser Vai Lys 100 Gly Glu Glu Glu Ile 105 Pro Asp Gly Ala Vai 110 Ala Leu ATA ACA CCA GAC ATG CCA GAT GTT CTT TCA CAT GTT TCT GTT CGA GCT 384 Ile Thr Pro 115 Asp Met Pro Asp Vai 120 Leu Ser HiS Vai Ser 125 Vai Arg Ala AGA. AAT GGG AAG GTT TGC TTT GCT ACA TGC TTT GAT CCC AAT ATA TTG 432 Arg Asn 130 Gly Lys Vai Cys Phe 135 Ala Thr Cys Phe Asp 140 PrO Asn Ile Leu GCT GAC CTC CAA GCA AAG GAA GGA AGG ATT TTG CTC TTA AAG CCT ACA 480 Ala 145 Asp Leu Gin Ala Lys 150 Glu Gly Arg Ile Leu 155 Leu Leu Lys Pro Thr 160 95 CCT TCA GAC ATA ATC TAT AGT GAG GTG AAT GAG ATT GAG CTC CAA AGT 528 Pro Ser Asp Ile Ile Tyr Ser 165 Glu Vai Asn 170 Glu Ile Glu Leu Gin 175 Ser TCA AGT AAC TTG GTA GAA GCT GAA ACT TCA GCA ACA CTT AGA TTG GTG 576 Ser Ser Asn Leu 1B0 Vai Glu Ala Glu Thr 185 Ser Ala Thr Leu Arg 190 Leu Vai AAA AAG CAA TTT GGT GGT TGT TAC GCA ATA TCA GCA GAT GAA TTC ACA 624 Lys Lys Gin 195 Phe Gly Gly Cys Tyr Ala 200 Ile Ser Ala Asp Glu 205 Phe Thr AGT GAA ATG GTT GGA GCT AAA TCA CGT AAT ATT GCA TAT CTG AAA GGA 672 Ser Glu 210 Met Vai Gly Ala Lys 215 Ser Arg Asn Ile Ala 220 Tyr· Leu Lys Gly AAA GTG CCT TCC TCG GTG GGA ATT CCT ACG TCA GTA GCT CTT CCA TTT 720 Lys 225 Vai Pro Ser Ser Vai Gly 230 Ile Pro Thr Ser 235 Vai Ala Leu Pro Phe 240 GGA GTC TTT GAG AAA GTA CTT TCA GAC GAC ATA AAT CAG GGA GTG GCA 768 Gly Vai Phe Glu Lys Vai Leu 245 Ser Asp Asp 250 Ile Asn Gin Gly Vai 255 Ala AAA GAG TTG CAA ATT CTG ACA AAA AAA CTA TCT GAA GGA GAC TTT AGC 816 10 s A Glu Leu Gin 260 Ile Leu Thr Lys Lys 265 Leu Ser Glu Gly Asp 270 Phe Ser GCT CTT GGT GAA ATT CGC ACA ACG GTT TTA GAT CTT TCG ACA CCA GCT 864 Ala Leu Gly GlU 275 Ile Arg Thr Thr 280 Vai Leu Asp Leu Ser Thr 285 Pro Ala • CAA TTG GTC AAA GAG CTG AAG GAG AAG ATG CAG GGT. TCT GGC ATG CCT 912 Gin Leu 290 Vai Lys Glu Leu Lys 295 Glu Lys Met Gin Gly 300 Ser Gly Met Pro TGG CCT GGT GAT GAA GGT CCA AAG CGG TGG GAA CAA GCA TGG ATG GCC 960 Trp 305 Pro Gly Asp Glu Gly Pro 310 Lys Arg Trp Glu 315 Gin Ala Trp Met Ala 320 ATA AAA AAG GTG TGG GCT TCA AAA TGG AAT GAG AGA GCA TAC TTC AGC 1008 lie Lys Lys Vai Trp Ala Ser Lys 325 Trp Asn 330 Glu Arg Ala Tyr Phe 335 Ser ACA AGG AAG GTG AAA CTG GAT CAT GAC TAT CTG TGC ATG GCT GTC CTT 1056 Thr Arg Lys Vai 340 Lys Leu Asp His Asp 345 Tyr Leu Cys Met Ala 350 Vai Leu GTT CAA GAA ATA ATA AAT GCT GAT TAT GCA TTT GTC ATT CAC ACA ACC 1104 Vai Gin Glu 355 Ile Ile Asn Ala Asp 360 Tyr Ala Phe Vai Ile His 365 Thr Thr AAC CCA tct TCC GGA GAC GAC TCA GAA ATA TAT GCC GAG GTG GTC AGG 1152 Asn Pro 370 Ser .Ser Gly Asp Asp 375 Ser GlU Ile Tyr Ala 380 Glu Vai Vai Arg GGC CTT GGG GAA ACA CTT GTT GGA GCT TAT CCA GGA CGT GCT TTG AGT 1200 Gly Leu 385 Gly Glu Thr Leu Vai 390 Gly Ala Tyr Pro 39S Gly Arg Ala Leu Ser 400 96 TTT ATC TGC AAG AAA AAG GAT CTC AAC TCT CCT CAA GTG TTA GGT TAC 1248 Phe Ile Cys Lys Lys 405 Lys Asp Leu Asn Ser 410 Pro Gin Vai Leu Gly 415 Tyr CCÀ AGC AAA CCG ATC GGC CTT TTC ATA AAA AGA TCT ATC ATC TTC CGA 1296 Pro Ser Lye Pro 420 Ile Gly Leu Phe Ile 425 Lys Arg Ser Ile Ile 430 Phe Arg TCT GAT TCC AAT GGG GAA GAT TTG GAA GGT TAT GCC GGT GCT GGC CTC 1344 Ser Asp Ser 435 Asn Gly Glu Asp Leu 440 Glu Gly Tyr Ala Gly 445 Ala Gly Leu TAC GAC AGT GTA CCA ATG GAT GAG GAG GAA AAA GTT GTA ATT GAT TAC 1392 Tyr Asp 450 Ser Vai Pro Met Asp 455 Glu Glu Glu Lys Vai 460 Vai Ile Asp Tyr TCT TCC GAC CCA TTG ATA ACT GAT GGT AAC TTC CGC CAG ACA ATC CTG 1440 Ser 465 Ser Asp Pro Leu Ile 470 Thr Asp Gly Asn Phe 475 Arg Gin Thr Ile Leu 480 TCC AAC ATT GCT CGT GCT GGA CAT GCT ATC GAG GAG CTA TAT GGC TCT 1488 Ser Asn Ile Ala Arg 485 Ala Gly His Ala Ile 490 Glu Glu Leu Tyr Gly. 495 Ser - CCT CAA GAC ATT GAG GGT GTA GTG. AGG GAT GGA AAG ATT TAT GTC GTT 1536 Pro Gin Asp Ile 500 Glu Gly Vai Vai Arg 505 Asp Gly Lys Ile Tyr 510 Vai Vai CAG ACA AGA CCA CAG ATG T GATTATATTC TCGTTGTATG TTGTTCAGAG 1585

Gin Thr Arg Pro Gin Met 51S AAGACCACAG ATGTGATCAT ATTCTCATTG TATCAGATCT GTGACCACTT ACCTGATACC 1645 TCCCATGAAG TTACCTGTAT GATTATACGT GATCCAAAGC CATCACATCA TGTTCACCTT 1705 CAGCTATTGG AGGAGAAGTG AGAAGTAGGA ATTGCAATAT GAGGAATAAT AAGAAAAACT 1765 TTGTAAAAGC TAAATTAGCT GGGTATGATA TAGGGAGAAA TGTGTAAACA TTGTACTATA 1825 TATAGTATAT ACACACGCAT TATGTATTGC ATTATGCACT GAATAATATC GCAGCATCAA 1885 AGAAGAAATC CTTTGGGTGG TTTCAAAAAA AAA 1918 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA SEQ ID N° 4: (i) CARACTERÍSTICA DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 518 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4: 97 97 Gin Pro 10 Ser Ala Glu Tyr Leu 15 Gly Ala 25 Leu Asn Ile Phe Thr 30 Glu Glu Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg 45

Ala Glu Trp Tyr His His Leu Leu 1 5

Ser Ile Leu Gly Vai Asp Gin Trp 20

Ile Ilé Arg Ala Gly Sèr Ala Ala 3S 40

Leu Asp Pro Vai Leu Arg Lys Thr 50 55

Ile Ser Pro Vai Glu Ala Vai Gly 65 70

Leu Ser Vai Gin Asn Glu Ile Tyr 85

Lys Ser Vai Lys Gly Glu Glu Glu 100

Ile Thr Pro Asp Met Pro Asp Vai 115 120

Arg Asn Gly Lys Vai Cys Phe Ala 130 135

Ala Asp Leu Gin Ala Lys Glu Gly 145 150

Pro Ser Asp Ile Ile Tyr Ser Glu 165

Ser Ser Asn Leu Vai Glu Ala Glu 180

Lys Lys Gin Phe Gly Gly Cys Tyr 195 200

Ser Glu Met Vai Gly Ala Lys Ser 210 215

Lys Vai Pro Ser Ser Vai Gly Ile 225 230

Gly Vai Phe Glu Lys Vai Leu Ser 245

Lys Glu Leu Gin Ile Leu Thr Lys 260

Ala Leu Gly Glu Ile Arg Thr Thr . 275 280

Gin Leu Vai Lys Glu Leu Lys Glu 290 295

Trp Pro Gly Asp Glu Gly Pro Lys 305 310

Ile Lys Lys Vai Trp Ala Ser Lys 325

Thr Arg Lys Vai Lys Leu Asp His 340

Ala Asn Leu Gly Ser Trp Gin Ile 60

Tyr Vai Vai Vai Vai Asp Glu Leu 75 80

Glu Lys Pro Thr Ile Leu Vai Ala 90 95

Ile Pro Asp Gly Ala Vai Ala Leu 105 110

Leu Ser His Vai Ser Vai Arg Ala 125

Thr Cys Phe Asp Pro Asn Ile Leu 140

Arg Ile Leu Leu Leu Lys Pro Thr 155 160

Vai Asn Glu Ile Glu Leu Gin Ser 170 175

Thr Ser Ala Thr Leu Arg Leu Vai 185 190

Ala Ile Ser Ala Asp Glu Phe Thr 205

Arg Asn Ile Ala Tyr Leu Lys Gly 220

Pro Thr Ser Vai Ala Leu Pro Phe 235 . 240

Asp Asp Ile Asn Gin Gly Vai Ala 250 . 255

Lys Leu Ser Glu Gly Asp Phe Ser 265 270

Vai Leu Asp Leu Ser Thr Pro Ala 285 .

Lys Met Gin Gly Ser Gly Met Pro 300

Arg Trp Glu Gin Ala Trp Met Ala 315 320

Trp Asn Glu Arg Ala Tyr Phe Ser 330 335

Asp Tyr Leu Cys Met Ala Vai Leu 345 350 98

Val Gin Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tyr Ala Phe Val Ile His Thr Thr 355 360 365 Asn Pro Ser Ser Gly Asp Asp Ser Glu Ile Tyr Ala Glu Val Val Arg 370 375 380 Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala Leu Ser 385 390 395 400 Phe Ile Cys Lys Lys Lys Asp Leu Asn Ser Pro Gin Val Leu Gly Tyr 405 410 415 Pro Ser Lys Pro Ile Gly Leu Phe ile Lys Arg Ser Ile Ile Phe Arg 420 425 430 Ser Asp Ser Asn Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Gly Leu 435 440 445 Tyr Asp Ser Val Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Val Val Ile Asp Tyr 450 455 460 Ser Ser Asp Pro Leu Ile Thr Asp Gly Asn Phe Arg Gin Thr Ile Leu 465 470 475 480 Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gly His Ala Ile GlU Glu Leu Tyr Gly Ser 485 490 495 Pro Gin Asp Ile Glu Gly Val Val Arg Asp Gly Lys Ile Tyr Val Val 500 505 510 Gin Thr Arg Pro Gin Met 515

Lisboa, 28 de Janeiro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção de um amido, caracterizado por o amido ser isolado de células de plantas transgénicas ou de plantas transgénicas contando tais células de plantas transgénicas, em que as células de plantas transgénicas são caracterizadas por serem transformadas com uma molécula de ácido nucleico, o qual codifica uma proteína, a qual se encontra nas células de plantas, tanto em ligação a um grão de amido, como na forma solúvel, e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com reduzido teor de fosfato ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetisado nas células, aquando da expressão de E. coli, em que a molécula de ácido nucleico é seleccionada do grupo composto por: (a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°2; (b) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a região de codificação da sequência de nucleótidos indicada na SEQ ID N° 1; (c) moléculas de ácidos nucleicos, as quais se hibridizam com as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas em (a) ou (b) e as quais codificam uma proteína, a qual se encontra em células de plantas tanto ligadas a grãos de amido, como também na forma solúvel, e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com baixo teor de fosfato, ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetizado na célula aquando em expressão de E. coli. 2 (d) moléculas de ácidos nucleicos de (c) , em que a hibridização tem lugar em condições severas; (e) moléculas de ácidos nucleicos cuja sequência é pelo menos 60% idêntica à da região de codificação da sequência de nucleótidos indicada na SEQ ID N° 1; e as quais codificam uma proteína a qual em células de plantas se encontra não só ligada ao grão de amido, mas também na forma solúvel, e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com reduzido teor de fosfato ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetisado nas células, aquando da expressão de E. coli, e (f) Fragmentos das moléculas de ácido nucleico mencionadas em (a) a (e) , em que os fragmentos possuem comprimento suficiente para codificar uma proteína, a qual se encontra em células de plantas tanto em ligação aos grãos de amido, como também na forma solúvel e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com reduzido teor de fosfato ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetizado nas células, aquando da expressão de E. coli; em que esta molécula de ácido nucleico é associada a elementos de ADN reguladores, os quais garantem a transcrição e tradução em células de plantas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as células de plantas transgénicas são caracterizadas por serem células de plantas como milho, arroz ou cevada. 3

3. Método para a produção de um amido, caracterizado por o amido ser isolado de células de plantas transgénicas ou de plantas transgénicas contendo tais células de plantas transgénicas, em que as células de plantas transgénicas são caracterizadas por (A) ser inibida nas mesmas a expressão de uma proteína, a qual se encontra em células de plantas tanto em ligação aos grãos de amido, como também na forma solúvel e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com reduzido teor de fosfato ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetizado nas células, aquando da expressão de E. coli e a qual é codificada por uma molécula de ácido nucleico, seleccionada do grupo composto por: (a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína com a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID N°2; (b) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a região de codificação da sequência de nucleótidos indicada na SEQ ID N° 1; (c) moléculas de ácidos nucleicos, as quais se hibridizam com as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas em (a) ou (b) e as quais codificam uma proteína, a qual se encontra em células de plantas tanto ligadas a grãos de amido, como também na forma solúvel, e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com baixo teor de fosfato, ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetizado na célula aquando em expressão de E. coli. 4 (d) moléculas de ácidos nucleicos de (c) , em que a hibridização tem lugar em condições severas; (e) moléculas de ácidos nucleicos cuja sequência é pelo menos 60% idêntica à da região de codificação da sequência de nucleótidos indicada na SEQ ID N° 1; e as quais codificam uma proteína a qual em células de plantas se encontra não só ligada ao grão de amido, mas também na forma solúvel, e cuja redução nas células de plantas conduz à síntese de um amido com reduzido teor de fosfato ou a qual conduz a uma fosforilação do glicogénio sintetizado nas células, aquando da expressão de E. coli, e e em que as células de plantas transgénicas são caracterizadas por (B) (i) conterem uma molécula de ADN, a qual é expressa e codifica um ARN de sentido inverso, o qual inibe a expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (a) a € na célula; ou (ii) conterem uma molécula de ADN, a qual é expressa e codifica uma ribozima que cliva transcritos específicos de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (a) e (b); ou (iii) conterem uma molécula de ADN, a qual, aquando de expressão numa célula de planta devido a um efeito de co-supressão é expressa e codifica um ARN, o qual conduz à redução da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com (a) a (e) , e que apresenta uma elevado grau de homologia de transcrição da referida molécula de ácido nucleico. 5

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que as células de plantas transgénicas são ainda caracterizadas por serem células de plantas de batata. Lisboa, 28 de Janeiro de 2010