DE19836097A1 - Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine alpha-Glukosidase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer alpha-Glukosidase aus Kartoffel kodieren sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren zur Herstellung dieser Stärke.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität
einer α-Glukosidase aus Kartoffel kodieren sowie Verfahren zur Herstellung transgener
Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren. Desweiteren
betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen
Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den
erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren
zur Herstellung dieser Stärke.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen Inhaltsstoffen als
erneuerbaren Rohstoffquellen beigemessen wird, ist die biotechnologische Forschung
um eine Anpassung pflanzlicher Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden
Industrie bemüht. Um die Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst
vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es insofern erforderlich, eine große
Stoffvielfalt zur Verfügung zu stellen.
Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide wichtige, nachwachsende
Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt
neben Cellulose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren
Pflanzen ist. Neben Mais, Reis und Weizen spielt die Kartoffel insbesondere bei der
Stärkeproduktion eine wichtige Rolle.
Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen,
den Glukosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch
aus unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades
und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Daher stellt
Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die
Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-glykosidisch
verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein
komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die
Verzweigungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6-
glykosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für die Stärkeproduktion
verwendeten Pflanzen, wie z. B. Mais oder Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke
zu ca. 25% aus Amylosestärke und zu ca. 75% aus Amylopektin-Stärke.
Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den
Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, die durchschnittliche Länge
und Verteilung der Seitenketten sowie das Vorhandensein von Phosphatgruppen
bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktionelle Eigenschaften der Stärke
bzw. ihrer wäßrigen Lösungen. Als wichtige funktionelle Eigenschaften sind hierbei
beispielsweise zu nennen, die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die
Filmbildungseigenschaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die
Verkleisterungseigenschaften sowie Binde- und Klebeeigenschaften. Auch die
Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein. Für
bestimmte Anwendungen ist auch die Erzeugung von hochamylosehaltigen Stärken
von besonderem Interesse. Ferner kann eine in Pflanzenzellen enthaltene modifizierte
Stärke das Verhalten der Pflanzenzelle unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft
verändern. Denkbar ist beispielsweise eine Verringerung des Stärkeabbaus während
der Lagerung von Stärke-enthaltenden Organen, wie z. B. Samen oder Knollen, vor
deren weiterer Verarbeitung, z. B. zur Extraktion der Stärke. Ferner ist es von
Interesse, modifizierte Stärken herzustellen, die dazu führen, daß Pflanzenzellen oder
pflanzliche Organe, die diese Stärke enthalten, besser zur Weiterverarbeitung geeignet
sind, beispielsweise bei der Herstellung von Lebensmitteln wie "Popcorn" oder
"Cornflakes" aus Mais oder von Pommes frites, Chips oder Kartoffelpulver aus
Kartoffeln. Von besonderem Interesse ist hierbei die Verbesserung der Stärken in der
Hinsicht, daß sie ein reduziertes "cold sweetening" aufweisen, d. h. eine verringerte
Freisetzung von reduzierenden Zuckern (insbesondere Glucose) bei einer längeren
Lagerung bei niedrigen Temperaturen. Gerade Kartoffeln werden häufig bei
Temperaturen von 4 bis 8°C gelagert, um den Stärkeabbau während der Lagerung zu
minimieren. Die hierbei freigesetzten reduzierenden Zucker, insbesondere Glucose,
führen beispielsweise bei der Herstellung von Pommes frites oder Chips zu
unerwünschten Bräunungsreaktionen (sogenannte Maillard-Reaktionen).
Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an bestimmte industrielle
Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der
Regel zeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Möglichkeiten
zu finden, Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die in ihren
Eigenschaften bereits den spezifischen Anforderungen der verarbeitenden Industrie
entsprechen und somit ökonomische und ökologische Vorteile in sich vereinen.
Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen
Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus
stärkeproduzierender Pflanzen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung
hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese
modifikation und -abbau (Stärkemetabolismus) beteiligten Enzyme sowie die Isolierung
der entsprechenden, für diese Enzyme kodierenden DNA-Sequenzen.
Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke führen, sind im
wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Plastiden
statt. In photosynthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in
photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.
Wichtige am Stärkemetabolismus beteiligte Enzyme sind z. B. die Verzweigungsenzyme
(branching enzyme), ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundene
Stärkesynthasen, lösliche Stärkesynthasen, Entzweigungsenzyme (debranching
enzyme), Disproportionierungsenzyme, plastidäre Stärkephosphorylasen, die
R1-Enzyme, Amylasen oder Glukosidasen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere bzw. alternative gentechnische
Ansätze zur Modifizierung des Stärkemetabolismus in stärkebildenden Pflanzen (z. B.
Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok,
Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse,
Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot) geeignete Nukleinsäuremoleküle zur
Verfügung zu stellen, mittels derer Pflanzenzellen transformiert werden können, so
daß die Synthese von veränderten, vorteilhaften Stärkevarietäten ermöglicht wird.
Solche veränderten Stärkevarietäten weisen z. B. Modifikationen in bezug auf ihren
Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, den Phosphatgehalt, die
Stärkekorngröße und/oder die durchschnittliche Länge und Verteilung der Seitenketten
(d. h. Seitenkettenstruktur) auf.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die
Herstellung transgener Pflanzen ermöglichen, die eine veränderte Stärkevarietät
synthetisieren.
Überraschenderweise synthetisieren transgene Pflanzen, die mit den
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen transformiert wurden, eine Stärke, die in
der besonderer Weise in ihren physikochemischen Eigenschaften und/oder in ihrer
Seitenkettenstruktur verändert ist. Hingegen zeigen Stärken, die von transgenen
Pflanzen synthetisiert werden, die mit im Stand der Technik bekannten
Nukleinsäuremolekülen transformiert wurden, keine erfindungsgemäßen
Veränderungen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den
Ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Protein mit
der Funktion einer α-Glukosidase aus Kartoffel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt,
- b) Nukleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder Teile davon umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
- c) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nukleinsäuremolekülen hybridisieren oder komplementär sind, vorzugsweise spezifisch hybridisieren und
- d) Nukleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nukleinsäuremoleküle abweicht.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül,
enthaltend a) eine Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer
α-Glukosidase, vorzugsweise aus Kartoffel, oder Teile besagter Nucleotidsequenz und
b) ein oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus
der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen,
ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen
Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären
Stärkephosphorylasen, R1-Enzymen, Amylasen, Glukosidasen, Teilen von
Nukleotidsequenzen kodierend für Proteine ausgewählt aus der Gruppe A und
Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren
Teilen hybridisiert, vorzugsweise ein Desoxyribonukleinsäure- oder Ribonuklein
säure-Molekül, besonders bevorzugt ein cDNA-Molekül. Besonders bevorzugt ist ein
Nukleinsäuremolekül, das mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren
Teilen spezifisch hybridisiert.
Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion
einer α-Glukosidase aus Kartoffel ist durch Seq. ID Nr. 1 dargestellt, das durch die
Nukleotidsequenz kodierte Protein durch Seq. ID Nr. 2.
Die erfindungsgemäße α-Glukosidase-Nukleotidsequenz weist zu bekannten
α-Glukosidase-kodierenden Molekülen (Taylor et al., 1998, Plant J. 13: 419-424;
Sugimoto et al., 1997, Plant Mol. Biol. 33, 765-768; EMBL Datenbank-Einträge:
U22450, P10253, D86624) eine vergleichsweise geringe Sequenzhomologie auf. Die
Aminosäuresequenz unterscheidet sich deutlich von den im Stand der Technik
beschriebenen α-Glukosidasen insbesondere im 5'-Bereich, wie einem
Sequenzvergleich mit Sequenz ID Nr. 2 zu entnehmen ist.
Erfindungsgemäß geeignete Nukleotidsequenzen, die für ein Protein der Gruppe A
kodieren, sind beispielsweise für lösliche (Typ I, II, III oder IV) oder Stärkekorn
gebundene Stärkesynthase-Isoformen beschrieben in Hergersberg, 1988, Dissertation
Universität Köln; Abel, 1995, Dissertation FU Berlin; Abel et al., 1996, Plant Journal
10(6): 981-991; Visser et al., 1989, Plant Sci. 64: 185-192; van der Leij et al., 1991,
Mol. Gen. Genet. 228: 240-248; EP-A-0779363; WO 92/11376; WO 96/15248;
WO 97/26362; WO 97/44472; WO 97/45545; Delrue et al., 1992, J. Bacteriol. 174:
3612-3620; Baba et al., 1993, Plant Physiol. 103: 565-573; Dry et al., 1992, The
Plant Journal 2,2: 193-202 oder auch in den EMBL Datenbank Einträgen X74160;
X58453; X88789; X94400; für Verzweigungsenzym-Isoformen (branching enzyme I,
IIa oder IIb), Entzweigungsenzym-Isoformen (debranching enzyme, Isoamylasen,
Pullulanasen, R1-Enzyme) oder Disproportionierungsenzym-Isoformen beispielsweise
beschrieben in WO 92/14827; WO 95/07335; WO 95/09922; WO 96/19581; WO 97/22703;
WO 97/32985; WO 97/42328; Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:
1391-1396 oder auch in dem EMBL Datenbank Eintrag X83969 und solche für
ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen und plastidäre Stärkephosphorylase-Isoformen
beispielsweise beschrieben in EP-A-0368506; EP-A-0455316; WO 94/28146;
DE 196 53 176.4; WO 97/11188; Brisson et al., 1989, The Plant Cell 1: 559-566;
Buchner et al., 1996, Planta 199: 64-73; Camirand et al., 1989, Plant Physiol. 89(4
Suppl.) 61; Bhatt & Knowler, J. Exp. Botany 41 (Suppl.) 5-7; Lin et al., 1991, Plant
Physiol. 95: 1250-1253; Sonnewald et al., 1995, Plant Mol. Biol. 27: 567-576; DDBJ
Nr. D23280; Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 473-477.
Die erfindungsgemäß geeignet einzusetzenden Nukleotidsequenzen sind pro- oder
eukaryontischen Ursprungs, vorzugsweise bakteriellen, pilzlichen oder pflanzlichen
Ursprungs.
Der Begriff "Teile von Nukleotidsequenzen" bedeutet im Sinne der vorliegenden
Erfindung Teile der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleotidsequenzen, die
mindestens 15 bp, vorzugsweise mindestens 150 bp, besonders bevorzugt
mindestens 500 bp lang sind, jedoch eine Länge von 5000 bp, vorzugsweise 2500 bp
nicht überschreiten.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung
unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten
Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY) beschrieben sind.
Besonders bevorzugt erfolgt eine "spezifische Hybridisierung", unter den folgenden
hoch-stringenten Bedingungen:
Hybridisierungspuffer: 2×SSC; 10×Denhardt-Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1: 1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 µg/ml Heringssperma-DNA; 50 µg/ml tRNA; oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS bei einer
Hybridisierungstemperatur: T = 55 bis 68°C,
Waschpuffer: 0,2×SSC; 0,1% SDS und
Waschtemperatur: T = 40 bis 68°C.
Hybridisierungspuffer: 2×SSC; 10×Denhardt-Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1: 1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 µg/ml Heringssperma-DNA; 50 µg/ml tRNA; oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS bei einer
Hybridisierungstemperatur: T = 55 bis 68°C,
Waschpuffer: 0,2×SSC; 0,1% SDS und
Waschtemperatur: T = 40 bis 68°C.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle
umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle
verstanden, die lang genug sind, um einen Teil der beschriebenen Proteine zu codieren.
Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser
Moleküle sich von den Sequenzen der erfindungsgemaßen Nukleinsäuremoleküle an
einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu
diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von
mindestens 60%, vorzugsweise über 70% und besonders bevorzugt über 85%. Die
Abweichungen zu den erfindungsgemaßen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch
Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Rekombinationen entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen
den betreffenden Nukleinsäuremolekülen oder den durch sie kodierten Proteinen,
besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den erfindungsgemäßen
Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel
um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische
Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende
Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Pflanzenspezies, oder
um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können
oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den
Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen
Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch
um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian
ten.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen kann es sich um DNA-Moleküle
handeln, insbesondere um cDNA- oder genomische Moleküle. Ferner können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sein. Die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon können z. B. aus natürlichen Quellen
gewonnen sein, durch rekombinante Techniken oder synthetisch hergestellt sein.
Zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in sense- oder
antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA-Elementen
verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen
insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen
Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die
Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem
bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse
determinierten Zeitpunkt, der z. B. chemisch oder biologisch induzierbar sein kann. In
Bezug auf die transformierte Pflanze kann der Promotor - wie auch die
Nukleotidsequenz - homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z. B. der
Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus für eine konstitutive Expression,
der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) für eine
knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression
lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor
(Stockhaus et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al.,
1989, EMBO J. 8: 2445-2451) oder für eine endosperm-spezifische Expression der
HMG-Promotor aus Weizen oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais.
Eine das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül abschließende Terminationssequenz
kann der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines
Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der
Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben
(vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) und sind beliebig austauschbar.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können für die Herstellung transgener
Pflanzenzellen und Pflanzen verwendet werden, die in der Aktivität der α-Glukosidase
oder in der Aktivität der α-Glukosidase und mindestens eines weiteren Enzyms des
Stärkemetabolismus erhöht oder erniedrigt sind. Hierfür werden die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in geeignete Vektoren eingebracht, mit den
notwendigen regulatorischen Nukleinsäure-Sequenzen für eine effiziente Transkription
in pflanzlichen Zellen versehen und in pflanzliche Zellen eingeführt. Es besteht zum
einen die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Inhibierung
der Synthese der endogenen α-Glukosidase oder der endogenen α-Glukosidase und
mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden. Dies
kann mit Hilfe von antisense-Konstrukten, in vivo Mutagenese, eines auftretenden
Cosuppressionseffektes oder mit Hilfe von in entsprechender Weise konstruierten
Ribozymen erreicht werden. Andererseits können die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle zur Expression der α-Glukosidase oder der α-Glukosidase und
mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in Zellen transgener Pflanzen
verwendet werden und so zu einer Steigerung der Aktivität der jeweils exprimierten
Enzyme in den Zellen führen.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle
zur Inhibierung der Synthese der endogenen α-Glukosidase und der Überexpression
mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden.
Schließlich können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auch zur Expression
der α-Glukosidase und der Inhibierung mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe
A in Zellen transgener Pflanzen verwendet werden. Die beiden letztgenannten
Ausführungsformen der Erfindung führen so zu einer gleichzeitigen Hemmung und
Steigerung der Aktivitäten der jeweils inhibierten bzw. exprimierten Enzyme in den
Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül.
Der Begriff "Vektor" umfaßt Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in
der Gentechnik gängige Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle
enthalten und zur Transformation von Zellen geeignet sind. Vorzugsweise sind
derartige Vektoren zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet. Besonders
bevorzugt erlauben sie die Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle,
gegebenenfalls zusammen mit flankierenden regulatorischen Regionen, in das Genom
der Pflanzenzelle. Beispiele hierfür sind binäre Vektoren, wie pBinAR oder pBinB33, die
bei dem Agrobakterien-vermittelten Gentransfer eingesetzt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor
dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit der Funktion einer
α-Glukosidase codiert oder deren Teile in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße
Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere Proteine
ausgewählt aus der Gruppe A oder Teilen davon kodiert, in sense- oder
anti-sense-Richtung vorliegt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der
erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für mehrere
Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Teilen davon kodiert, teilweise in
sense-Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
Der erfindungsgemäße Vektor ist ganz besonders bevorzugt mit regulatorischen
Elementen verknüpft, die die Expression, d. h. z. B. die Transkription und Synthese
einer RNA, die im Fall einer in sense-Richtung vorliegenden Nukleotidsequenz translatierbar
ist, in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
Darüberhinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe
z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) verschiedenartige
Mutationen in die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen einzuführen, wodurch es zur
Synthese von Proteinen mit gegebenenfalls veränderten biologischen Eigenschaften
kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei
denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden
DNA-Sequenzen erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine
führen. Durch derartige Deletionen am 5'-Ende der DNA-Sequenz ist es beispielsweise
möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Transit- oder
Signal-Sequenzen nicht mehr in ihrem ursprünglichen (homologen) Kompartiment,
sondern im Cytosol, oder aufgrund der Addition von anderen Signalsequenzen in
einem oder mehreren anderen (heterologen) Kompartimenten lokalisiert sind.
Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei
denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielweise auf die
Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B.
Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten KM- oder kcat-Wert besitzen oder
die nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen
über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile dieser Sequenzen in Plasmide
eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch
Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von molekularbiologischen
Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, loc.cit.) können Basenaustausche
vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für
die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren
oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende
Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder
Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen
oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair",
Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im
allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und ggf. weitere
biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere
prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche
Zellen (z. B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer,
Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps,
Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder
Arrowroot), die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen
erfindungsgemäßen Vektor enthält oder die von einer Zelle, die mit einem
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor
transformiert wurde, abstammt.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere
prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche
Zellen (z. B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer,
Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps,
Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder
Arrowroot), die neben einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül codierend für ein
Protein mit der Funktion einer β-Amylase, ein oder mehrere weitere rekombinante
Nukleinsäuremoleküle enthält, die für ein Protein ausgewählt aus der Gruppe A
kodieren, oder deren Teilen oder mit diesen Nukleinsäuremolekülen hybridisierende
Nukleotidsequenzen.
Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle lassen sich die
erfindungsgemäßen Wirtszellen ggf. auch durch sukzessive Transformation herstellen
(sog. "Supertransformation"), indem einzelne Nukleotidsequenzen oder Vektoren
enthaltend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein codieren mit der Funktion von
Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen
Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I, II, III oder IV, Entzweigungsenzymen,
Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1-Enzymen,
Amylasen, Glukosidasen, Teilen davon, sowie Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der
besagten Nukleotidsequenzen oder deren Teilen hybridisiert, in mehreren,
aufeinderfolgenden Transformationen der Zellen eingesetzt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine modifizierte Stärke synthetisiert,
dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein
erfindungsgemäßer Vektor in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich,
mit Hilfe gentechnischer Methoden in den Stärkemetabolismus von Pflanzen
einzugreifen und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer
modifizierten Stärke kommt, die beispielsweise in bezug auf Struktur, Wassergehalt,
Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt,
Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße
und -form sowie Kristallisation oder auch in ihren physikalisch-chemischen
Eigenschaften wie Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur,
Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher-
und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität,
Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit
oder Reaktivität im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert
ist. Durch eine Erhöhung der Aktivität von am Stärkemetabolismus beteiligten
Proteinen, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nukleinsäuremoleküle,
oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen
Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unterschiedliche
Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivität besitzen, besteht die Möglichkeit
der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Durch die
Steigerung der Aktivität einer oder mehrerer am Stärkemetabolismus beteiligten
Proteinen in bestimmten Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter
Pflanzen wie z. B. in der Knolle bei der Kartoffel oder in dem Endosperm von Mais oder
Weizen kann es zu einer besonders ausgeprägten Ertragssteigerung kommen. Die
wirtschaftliche Bedeutung und die Vorteile dieser Möglichkeiten des Eingriffs in den
Stärkemetabolismus liegen auf der Hand.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht
grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen
Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem
bestimmten Kompartiment (Cytosol, Vakuole, Apoplast, Plastiden, Mitochondrien) zu
erreichen, muß die die Lokalisation gewährleistende Transit- oder Signalsequenz ggf.
deletiert (entfernt) werden und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit
DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen
Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise
Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).
Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität eines am
Stärkemetabolismus beteiligten Proteins kann beispielsweise erzielt werden durch die
Expression einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines
Cosuppressionseffektes, in vivo Mutagenese oder die Expression eines entsprechend
konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der am
Stärkemetabolismus beteiligten Proteine codieren, unter Verwendung eines er
findungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise durch Expression eines
antisense-Transkripts.
Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das die gesamte für ein
am Stärkemetabolismus beteiligtes Protein codierende Sequenz einschließlich eventuell
vorhandener flankierender Sequenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile
der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile eine Mindestlänge von 15 bp,
vorzugsweise von mindestens 100-500 bp, und insbesondere von über 500 bp
aufweisen. In der Regel werden DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp,
vorzugsweise kürzer als 2500 bp sind.
Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an
Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber
nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65%
sein. Die Verwendung von Sequenzen mit einer Homologie von 75% und insbesondere
80% ist zu bevorzugen.
Die Expression von Ribozymen zur Verringerung der Aktivität von bestimmten
Proteinen in Zellen ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise beschrieben in
EP-B1-0 321 201. Die Expression von Ribozymen in pflanzlichen Zellen wurden z. B.
beschrieben in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
Ferner kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Proteine der
Gruppe A in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen auch durch die sogenannte "in
vivo-Mutagenese" erreicht werden, bei der durch Transformation von Zellen ein
hybrides RNA-DNA-Oligonucleotid ("Chimeroplast") in Zellen eingeführt wird (Kipp
P.B. et al., Poster Session beim "5th International Congress of Plant Molecular Biology,
21-27, September 1997, Singapore; R.A. Dixon und C.J. Arntzen, Meeting report zu
"Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain,
CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-447; internationale Patentanmeldung
WO 95/15972; Kren et al., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al.,
Science 273 (1996), 1386-1389).
Ein Teil der DNA-Komponente des hierbei verwendeten RNA-DNA-Oligonucleotids ist
homolog zu einer Nucleinsäuresequenz eines endogenen Proteins der Gruppe A, weist
jedoch im Vergleich zur Nucleinsäuresequenz des endogenen Proteins der Gruppe A
eine Mutation auf oder enthält eine heterologe Region, die von den homologen
Regionen umschlossen ist.
Durch Basenpaarung der homologen Regionen des RNA-DNA-Oligonucleotids und des
endogenen Nucleinsäuremoleküls, gefolgt von homologer Rekombination kann die in
der DNA-Komponente des RNA-DNA-Oligonucleotids enthaltene Mutation oder
heterologen Region in das Genom einer Pflanzenzelle übertragen werden. Dies führt zu
einer Verringerung der Aktivität des am Stärkemetabolismus beteiligten Proteins der
Gruppe A.
Alternativ kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Enzymaktivi
täten in den Pflanzenzellen durch einen Cosuppressionseffekt erfolgen. Dieses
Verfahren ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Jorgensen
(Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol.
197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995),
43-46), Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al.,
(Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243
(1994), 613-621) und anderen Quellen.
Zur Inhibierung der Synthese mehrerer an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme in
den transformierten Pflanzen können DNA-Moleküle zur Transformation verwendet
werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Enzyme codierenden Regionen in
antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten.
Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors
stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor
transkribiert werden, so daß die Synthese der betreffenden Proteine in etwa gleichem
oder unterschiedlichem Ausmaß inhibiert wird. Für die Länge der einzelnen
codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das,
was oben bereits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde.
Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem
Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es im Prinzip nicht. Das
entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 25 kb, vorzugsweise
von 15 kb nicht überschreiten.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich, Pflanzenzellen
zu transformieren und die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in klassische
Mutanten eingebracht werden, die in bezug auf ein oder mehrere Gene der
Stärkebiosynthese defizient oder defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in
Whistler, BeMiller und Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press,
London, 2nd Edition: 25-86). Diese Defekte können sich z. B. auf folgende Proteine
beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I) und lösliche Stärkesynthasen (SSS I, II, III
und IV), Verzweigungsenzyme (BE I, IIa und IIb), "Debranching"-Enzyme (R-Enzyme,
Isoamylasen, Pullulanasen), Disproportionierungsenzyme und plastidäre
Stärkephosphorylasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, erhältlich nach
einem erfindungsgemäßen Verfahren, die mit einem erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzel
len, die von derartig transformierten Zellen abstammen. Die erfindungsgemäßen Zellen
enthalten ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, wobei dieses vorzugsweise mit
regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zel
len gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die erfindungsgemäßen Zellen
lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem dadurch
unterscheiden, daß sie ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten, das
natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches
Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es sonst nicht
vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung. Ferner lassen sich die
erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden
Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens eine Kopie eines
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls stabil integriert in ihr Genom enthalten,
gegebenenfalls zusätzlich zu natürlicherweise in den Zellen vorkommenden Kopien
eines solchen Moleküls. Handelt es sich bei dem (den) in die Zellen eingeführten
Nukleinesäuremolekül(en) um zusätzliche Kopien zu bereits natürlicherweise in den
Zellen vorkommenden Molekülen, so lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen
von natürlicherweise vorkommenden insbesondere dadurch unterscheiden, daß diese
zusätzliche(n) Kopie(n) an Orten im Genom lokalisiert ist (sind) an denen sie
natürlicherweise nicht vorkommt (vorkommen). Dies läßt sich beispielsweise mit Hilfe
einer Southern Blot-Analyse nachprüfen.
Bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, in denen die Enzymaktivität
einzelner, am Stärkemetabolismus beteiligter Enzyme zu mindestens 10%, besonders
bevorzugt zu mindestens 30% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 50%
erhöht oder erniedrigt ist.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise
vorkommenden Pflanzenzellen vorzugsweise durch mindestens eines der folgenden
Merkmale unterscheiden: Ist das eingeführte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül
heterolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, so weisen die transgenen Pflanzenzellen
Transkripte der eingeführten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auf. Diese
lassen sich z. B. durch Northern-Blot-Analyse nachweisen. Beispielsweise enthalten
die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen ein oder mehrere Proteine, die durch ein
eingeführtes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül codiert werden. Dies kann z. B.
durch immunologische Methoden, insbesondere durch eine Western-Blot-Analyse
nachgewiesen werden.
Ist das eingeführte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül homolog in Bezug auf die
Pflanzenzelle, können die erfindungsgemäßen Zellen von natürlicherweise auftretenden
beispielsweise aufgrund der zusätzlichen Expression erfindungsgemäßer
Nukleinsäuremoleküle unterschieden werden. Die transgenen Pflanzenzellen enthalten
z. B. mehr oder weniger Transkripte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle.
Dies kann z. B. durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. "Mehr" bzw.
"weniger"bedeutet dabei vorzugsweise mindestens 10% mehr bzw. weniger, bevorzugt
mindestens 20% mehr bzw. weniger und besonders bevorzugt mindestens 50% mehr
bzw. weniger Transkripte als entsprechende nicht-transformierte Zellen. Vorzugsweise
weisen die Zellen ferner eine entsprechende (mindestens 10%, 20% bzw. 50%ige)
Steigerung bzw. Verminderung des Gehalts an erfindungsgemäßen Protein auf. Die
transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu
ganzen Pflanzen regeneriert werden.
Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen
Pflanzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen durch Regeneration von
ganzen Pflanzen aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen sind ebenfalls Gegenstand
der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die
erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen
kann es sich prinzipiell um pflanzen jeder beliebigen Spezies handeln, d. h. sowohl
monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen,
d. h. Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung oder für
technische, insbesondere industrielle Zwecke. Vorzugsweise sind dies
stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Mais,
Weizen, Hirse, Sago etc.), Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps,
Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne oder Arrowroot.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen,
beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, Kalli,
Protoplasten, Zellkulturen etc.
Durch die Veränderung der enzymatischen Aktivitäten der in den Stärkemetabolismus
involvierten Enzyme kommt es zur Synthese einer in ihrer Struktur veränderten Stärke
in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große
Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli
und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die
gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor
eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen
verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium
gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als
Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im
allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch
molekularbiologische Methoden eingesetzt (Sambrook et al. loc.cit.). Nach jeder
Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit
anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den
gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von
Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher
Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten,
mittels Polyethylenglykol (PEG), die Injektion, die Elektroporation von DNA, die
Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine
speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide bzw. DNA gestellt. Es können
einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aus derartig
transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist jedoch die Anwesenheit
eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere
DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle
das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig
jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als
Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA
in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären
Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von
Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe
Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses
enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre
Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann
der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden
(Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien
replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker,
welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können
direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen.
Genet. 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid,
das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in
die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig
transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv
untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector
System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al.,
Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben
worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate
zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes
kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke,
Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte
Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder
Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen
regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der
eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder
DNA unter Verwendung des biolistsischen Verfahrens oder durch
Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L, 1993 Transgenic
plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G.
Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New
York-Basel-Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit
Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf
hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium
basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22
(1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die
Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die Protoplastentransformation, die
Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels
Glasfasern.
Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich
beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0465 875). In EP 292 435
wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen,
weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können.
Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) haben in diesem Zusammenhang
beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist,
von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende
Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach
einer in vitro Kultivierungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit
lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitäten in der Morphologie und der
Reproduktivität aufweisen. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589)
beschreiben ebenfalls die Regeneration und die Gewinnung fertiler Mais-Pflanzen aus
Mais-Protoplasten.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in
der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten
Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den
transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem
Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin
u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion
transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe
auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen
können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte
Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden
hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Merkmale.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen,
daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten
Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder
andere Merkmale erhalten geblieben sind.
Ebenfalls ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung von
Stärke in an sich bekannter Weise, worin erfindungsgemäße Pflanzenzellen, Pflanzen,
Pflanzenteilen oder Vermehrungsmaterial verarbeitet bzw. in das Verfahren integriert
werden.
Verfahren zur Extraktion der Stärke aus Pflanzen oder aus stärkespeichernden Teilen
von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Verfahren zur Extraktion von Stärke aus
Maissamen sind z. B. in Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996) 54-57) beschrieben.
Die Extraktion von Maisstärke im industriellen Maßstab wird in der Regel durch das
sogenannte "wet milling" erreicht. Weiterhin sind Verfahren zur Extraktion der Stärke
aus verschiedenen stärkespeichernden Pflanzen beschrieben, z. B. in "Starch:
Chemistry and Technology (Hrsg.: Whistler, BeMiller und Paschall (1994), 2. Ausgabe,
Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; siehe z. B. Kapitel XII, Seite
412-468: Mais und Sorghum-Stärken: Herstellung; von Watson; Kapitel XIII, Seite
469-479: Tapioca-, Arrowroot- und Sagostärken: Herstellung; von Corbishley und
Miller; Kapitel XIV, Seite 479-490: Kartoffelstärke: Herstellung und Verwendungen;
von Mitch; Kapitel XV, Seite 491 bis 506: Weizenstärke: Herstellung, Modifizierung
und Verwendungen; von Knight und Oson; und Kapitel XVI, Seite 507 bis
528: Reisstärke: Herstellung und Verwendungen; von Rohmer und Klem). Vorrichtungen,
die für gewöhnlich bei Verfahren zur Extraktion von Stärke von Pflanzenmaterial
verwendet werden, sind Separatoren, Dekanter, Hydrocyclone, Sprühtrockner und
Wirbelschichttrockner.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren
aufgrund der Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls eine Stärke,
die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu in
Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist auch die Stärke, die aus einer
erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, Pflanze, deren Vermehrungsmaterial oder einem
erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Zu einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zählt auch die
industrielle Verwendung der erfindungsgemäßen Stärke zur Herstellung von
Nahrungsmitteln, Verpackungsmaterialien oder Einwegartikeln.
Die erfindungsgemäßen Stärke kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren
modifiziert werden und eignet sich in unmodifizierter oder modifizierter Form für
verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbereich.
Die Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Stärke lassen sich grundsätzlich in
zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der
Stärke, hauptsächlich Glukose und Glukosebausteine, die über enzymatische oder
chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere
chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Von Bedeutung kann hier
die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens sein, wie es
gegenwärtig im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglukosidase
verläuft. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von
Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Oberflächenvergrößerung des
Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische
Struktur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies
bewirken.
Der andere Bereich, in dem die erfindungsgemäße Stärke wegen ihrer polymeren
Struktur als sogenannte native Stärke verwendet werden kann, gliedert sich in zwei
weitere Einsatzgebiete:
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nahrungsmittel, bei denen sie im
wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw.
eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige
Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und
Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der
Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die
Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die
Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorganischen oder
organischen Ionen.
In diesem großen Bereich wird Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche
Herstellungsprozesse bzw. als Zusatzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei
der Verwendung von Stärke als Hilfsstoff ist hier insbesondere die Papier- und
Pappeindustrie zu nennen. Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation
(Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füllstoff- und Feinstoffteilchen,
als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen
Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff,
den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier Anwendungsbereiche, nämlich
Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden. Auf die Oberflächenstärke
entfällt mit 80% des Verbrauchs die mit Abstand größte Stärkemenge, 8% werden
als Strichstärke, 7% als Massestärke und 5% als Sprühstärke eingesetzt.
Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im
wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe
Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der
Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes
Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur
Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mechanische
Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim
Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe
Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
Ein großer Einsatzbereich von Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die
Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem
Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen,
die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und
Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für
synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen
Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung
von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und
Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
Ein großes Einsatzfeld für Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich
Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die
folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als
Schlichtmittel, d. h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum
Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der
Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach
qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als
Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von
Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung von Stärken als Zusatz bei Baustoffen.
Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei
vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte
diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die
Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte
zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.
Ein mengenmäßig begrenzter Markt für Stärkeprodukte bietet sich bei der Herstellung
von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum
temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden.
Kombinationsprodukte aus Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis
in ihrer Erosions- und verkrustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten
Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur
Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So werden Stärken zur
Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten
Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender
Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung
inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung
der Zersetzung eingesetzt.
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Pharmaka, Medizin und
Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie werden Stärken als Bindemittel
für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt. Weiterhin dienen
Stärken als Tablettensprengmittel, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren
und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische
Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der
Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie
Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für Stärke
liegt bei Zahnpasta.
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann
mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden,
wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt
bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des
weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu
Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.
Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammaufbereitung als Flockungsmittel
eingesetzt werden.
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei
verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten
Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit
eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.
Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfestigkeit sowie die Verbesserung
der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere
produktionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar,
rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen,
aufweisen.
In der Kautschukindustrie wird Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen
Qualität eingesetzt. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die
Verbesserung des Griffs und des Aussehens, dafür wird Stärke vor der
Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen
gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.
Eine weitere Absatzmöglichkeit von modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung
von Lederersatzstoffen.
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatzgebiete ab: die Einbindung
von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es
besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder
alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren
(Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung von Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen
wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen
Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der
Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Bespiel hierfür ist die Anwendung von
Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei
werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis
von 1 : 1 zu einem "master batch" kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen
unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt
werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte
Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit,
ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine
verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden. Gegenwärtige
Nachteile betreffen die ungenügende Transparenz, die verringerte Zugfestigkeit sowie
eine verringerte Dehnbarkeit.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung von Stärke in Polyurethanschäumen. Mit
der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist
es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen
der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die
Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des
Wärmeausdehnungsoffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung
des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne
Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der
Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte
Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte
Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch
feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt
von über 50% herzustellen. Des weiteren sind Stärke/Polymermischungen günstig zu
beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen
Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewonnen. Dies sind Produkte
mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des
Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen
Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein
besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei
hoher Viskosität aus. Die Anwendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in
den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Produkten
Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z. B. bei
Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz von neuen, gentechnisch veränderten Stärken sind zum
einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt,
Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung,
Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation, zum anderen auch die
Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten,
Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur,
Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung,
Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft,
Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Verfahren kann zum einen
die Eigenschaften der z. B. aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahingehend verändern,
daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Veränderungen
nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können jedoch auch durch
gentechnische Verfahren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen
unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der
oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind
grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch
Hitze- und Druckbehandlung, Behandlung mit organischen oder anorganischen Säuren,
enzymatische Behandlung, Oxidationen und Veresterungen, welche z. B. zur
Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen.
Desweiteren können ein- oder mehrwertige Alkohole in Gegenwart starker Säuren zur
Erzeugung von Erzeugung von Stärkeethern eingesetzt werden, so daß Stärke-Alkylether,
O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige
Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether,vernetzte Stärken oder
Stärke-Pfropf-Polymerisate resultieren.
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Stärken liegt in der industriellen
Anwendung, vorzugsweise für Lebensmittel oder der Herstellung von
Verpackungsmaterialien und Einwegartikeln.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustrierung der Erfindung und stellen in keiner
Weise eine Einschränkung dar.
BE branching enzyme (Verzweigungsenzym)
bp Basenpaar
IPTG Isopropyl p-D-Thiogalacto-Pyranosid
SS soluble starch synthase (lösliche Stärkesynthase)
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
bp Basenpaar
IPTG Isopropyl p-D-Thiogalacto-Pyranosid
SS soluble starch synthase (lösliche Stärkesynthase)
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
175,3 g NaCl
88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH2
88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH2
O
pH 7,0 mit 10N NaOH
pH 7,0 mit 10N NaOH
50 mM Tris-HCl pH 8,0
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,4 mM PMSF
10% Glycerin
0,1% Natriumdithionit
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,4 mM PMSF
10% Glycerin
0,1% Natriumdithionit
50 mM Tris-HCl pH 7,6
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,5 M Natriumcitrat pH 7,6
50 mM Tris-HCl pH 7,6
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
50 mM Tris-HCl pH 7,6
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,2 M Tris-HCl pH 7,5
5,0 M NaCl
5,0 M NaCl
10×TBS
0,1% (v/v) Tween 20
0,1% (v/v) Tween 20
25 mM Tris pH 8,3
250 mM Glycin
250 mM Glycin
50 mM Tris-HCl pH 7,0
50 mM NaCl
2 mM EDTA
14,7 mM β-Mercaptoethanol
0,5 mM PMSF
50 mM NaCl
2 mM EDTA
14,7 mM β-Mercaptoethanol
0,5 mM PMSF
50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2
10 mM EDTA
0,5 mM PMSF
14,7 mM β-Mercaptoethanol
10 mM EDTA
0,5 mM PMSF
14,7 mM β-Mercaptoethanol
Fig. 1 stellt ein schematisches RVA-Temperaturprofil (Viskosität vs. Zeit [min]) dar
mit den viskosimetrischen Parametern T = Verkleisterungstemperatur,
Temperatur zum Zeitpunkt des Verkleisterungsbeginns; Max bezeichnet die
maximale Viskosität; Min bezeichnet die maximale Viskosität; Fin
bezeichnet die Viskosität am Ende der Messung; Set ist die Differenz (Δ)
aus Min und Fin (Setback).
In den Beispielen wurden die folgenden Methoden verwendet:
Zur Klonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor
pBinAR Hyg (Höfgen & Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) und pBinB33-Hyg
kloniert.
Für den Bluescript-Vektor p Bluescript II KS (Stratagene) und für die pBinAR Hyg- und
pBinB33 Hyg-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research
Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E.
coli-Stamm XL1-Blue verwendet.
Das Plasmid pBinAR ist ein Derivat des binären Vektorplasmids pBin19 (Bevan, 1984,
Nucl. Acid Res. 12: 8711-8721), das folgendermaßen konstruiert wurde:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfaßt, wurde als EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) isoliert und zwischen die EcoRI- und KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 ligiert und wurde Plasmid pUC18-35S bezeichnet. Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen HindIII und PvuII ein 192 bp langes Fragment isoliert, DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, 1984, EMBO J.: 835-846) umfaßt (Nukleotide 11749-11939). Nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die SpHI- und HindIII-Schnittstellen von pUC18-35S ligiert und wurde Plasmid pA7 bezeichnet. Desweiteren wurde der gesamte Polylinker enthaltend den 35S-Promotor und ocs-Terminator mit EcoRI und HindIII herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen pBin19 ligiert. Dabei entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990).
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfaßt, wurde als EcoRI/KpnI-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) isoliert und zwischen die EcoRI- und KpnI-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 ligiert und wurde Plasmid pUC18-35S bezeichnet. Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen HindIII und PvuII ein 192 bp langes Fragment isoliert, DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, 1984, EMBO J.: 835-846) umfaßt (Nukleotide 11749-11939). Nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die SpHI- und HindIII-Schnittstellen von pUC18-35S ligiert und wurde Plasmid pA7 bezeichnet. Desweiteren wurde der gesamte Polylinker enthaltend den 35S-Promotor und ocs-Terminator mit EcoRI und HindIII herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen pBin19 ligiert. Dabei entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990).
Der Promotor des Patatin Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al.,
1989) wurde als DraI-Fragment (Nukleotide -1512 - +14) in den mit Sst I
geschnittenen Vektor pUC19, dessen Enden mit Hilfe der T4-DNA Polymerase
geglättet worden waren, ligiert. Daraus entstand das Plasmid pUC19-B33. Aus diesem
Plasmid wurde der B33-Promotor mit EcoRI und SmaI herausgeschnitten und in den
entsprechend geschnittenen Vektor pBinAR ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche
Expressionsvektor pBinB33.
Ausgehend vom Plasmid pA7 (vgl. Beschreibung des Vektors pBinAR) wurde das
EcoRI-HindIII Fragment umfassend den 35S-Promotor, den ocs-Terminator sowie den
zwischen 35S-Promotor und ocs-Terminator gelegenen Teil des Polylinker in das
entsprechend geschnittene pBin-Hyg Plasmid gesetzt.
Ausgehend vom Plasmid pBinB33 wurde das EcoRI-HindIII Fragment umfassend den
B33-Promotor, einen Teil des Polylinkers sowie den ocs-Terminator
herausgeschnittenen und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBin-Hyg ligiert.
Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33-Hyg.
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von
Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA
transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979,
Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung
gelelektrophoretisch analysiert.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L.cv.
Desiree, Vereinigte Saatzuchten eG, Ebstorf) wurde mit Hilfe des Agrobacterium
tumefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt (Dietze et al. (1995) in Gene Transfer to
Plants. S. 24-29, eds.: Potrykus, I. and Spangenberg, G., Springer Verlag, Deblaere et
al., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788).
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in
10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 2%
Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium
tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln
erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter
zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure,
0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80.%
Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die
Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose,
20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l
Kanamycin, und 0,80.% Bacto Agar gelegt.
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%
Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random
Primer Labelling Kits der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland) nach den Angaben
des Herstellers durchgeführt.
Die Bestimmung der Stärkesynthaseaktivität erfolgte durch Bestimmung des Einbaus
von 14C-Glukose aus ADP[14C-Glukose] in ein in Methanol/KCl unlösliches Produkt wie
beschrieben in Denyer & Smith, 1992, Planta 186: 609-617.
Zum Nachweis der Aktivität löslicher Stärkesynthasen durch nicht-denaturierende
Gelelektrophorese wurden Gewebeproben von Kartoffelknollen in 50 mM Tris-HCl pH
7,6, 2 mM DTT, 2,5 mM EDTA, 10% Glycerin und 0,4 mM PMSF aufgeschlossen.
Die Elektrophorese wurde in einer MiniProtean II Kammer (BioRAD) durchgeführt. Die
Monomerkonzentration der 1,5 mm dicken Gele war 7,5% (w/v), als Gel- und
Laufpuffer diente 25 mM Tris-Glycin pH 8,4. Gleiche Mengen an Proteinextrakt
wurden aufgetragen und für 2 h bei 10 mA je Gel aufgetrennt.
Anschließend erfolgte die Inkubation der Aktivitäts-Gele in 50 mM Tricine-NaOH pH
8,5, 25 mM Kaliumacetat, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-Glukose, 0,1% (w/v)
Amylopektin und 0,5 M Natriumcitrat. Gebildete Glukane wurden mit Lugolscher
Lösung angefärbt.
Die von den transgenen Kartoffelpflanzen gebildete Stärke wurde durch folgende
Methoden charakterisiert:
Stärke wurde nach Standardmethoden aus Kartoffelpflanzen isoliert
und das Verhältnis Amylose zu Amylopektin nach der von
Hovenkamp-Hermelink et al. beschriebenen Methode (Potato
Research 31(1988) 241-246) bestimmt.
In der Kartoffelstärke können einige Glucoseeinheiten an den Kohlenstoffatomen der
Position C2, C3 und C6 phosphoryliert sein. Zur Bestimmung des
Phosphorylierungsgrades an der C6-Position der Glucose wurden 100 mg Stärke in 1
ml 0.7 M HCl für 4 Stunden bei 95°C hydrolysiert (Nielsen et. al. (1994) Plant Physiol.
105: 111-117). Nach Neutralisation mit 0.7 M KOH wurden zur Glucose-6-phosphat-Be
stimmung 50 ml des Hydrolysats einem optisch-enzymatischen Test unterzogen.
Die Änderung der Absorption des Testansatzes (100 mM Imidazol/HCl; 10 mM MgCl2;
0.4 mM NAD; 2 units Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Leuconostoc
mesenteroides; 30°C) wurde bei 334 nm verfolgt.
Die Bestimmung des Gesamtphosphats erfolgte wie in Ames, 1996, Methods in
Enzymology VIII, 115-118 beschrieben.
Zur Analyse der Verteilung und Länge der Seitenketten in den Stärkeproben wurde 1
ml einer 0,1%igen Stärkelösung mit 0,4 U Isoamylase (Megazyme International
Ireland Ltd., Bray, Ireland) über Nacht bei 37°C in 100 mM Na-citrat-Puffer, pH 3,5
verdaut.
Die weitere Analyse erfolgte, sofern nicht anders erwähnt, entsprechend den Angaben
von Tomlinson et al., (1997), Plant J. 11: 31-47.
Die Korngrößenbestimmung wurde mit einem Fotosedimentometer des Typs
"Lumosed" der Firma Retsch GmbH, Deutschland, durchgeführt. Hierfür wurden 0.2 g
Stärke in ca. 150 ml Wasser suspendiert und sofort vermessen. Das vom Hersteller
mitgelieferte Programm berechnete den mittleren Durchmesser der Stärkekörner auf
der Annahme einer durchschnittlichen Dichte der Stärke von 1,5 g/l.
Die Verkleisterungs- bzw. Viskositätseigenschaften der Stärke wurden mit einem
Viskograph E der Firma Brabender oHG, Deutschland, oder mit einem Rapid Visco
Analyser, Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW
2102, Australien, aufgezeichnet. Bei Verwendung des Viskographen E wurde eine
Suspension von 30 g Stärke in 450 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen:
aufheizen von 50°C auf 96°C mit 3°/min., 30 Minuten konstant halten, abkühlen auf
30°C mit 3°/min. und abermals 30 Minuten konstant halten. Das Temperaturprofil
lieferte charakteristische Verkleisterungseigenschaften.
Bei der Messung mittels des Rapid Visco Analysers (RVA) wurde eine Suspension von
2 g Stärke in 25 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen: 60 s bei 50°C
suspendieren, aufheizen von 50°C auf 95°C mit 12°/min., 2,5 Minuten konstant
halten, abkühlen auf 50°C mit 12°C/min. und abermals 2 Minuten konstant halten.
Das RVA-Temperaturprofil lieferte die viskosimetrischen Parameter der untersuchten
Stärken für die maximale (Max) und Endviskosität (Fin), die Verkleisterungstemperatur
(T), die nach der maximalen Viskosität auftretende minimale Viskosität (Min) sowie die
Differenz aus minimaler und Endviskosität (Setback, Set) (vgl. Tabelle 1 und Fig. 1).
Zur Bestimmung der Gelfestigkeit mittels eines Texture Analyser wurden 2 g Stärke in
25 ml Wasser verkleistert (vgl. Messung mittels RVA) und anschließend 24 h lang bei
25°C luftdicht verschlossen gelagert. Die Proben wurden unter der Sonde (runder
Stempel) eines Texture Analysers TA-XT2 (Stable Micro Systems) fixiert und die
Gelfestigkeit mit folgenden Parameter-Einstellungen bestimmt:
Test-Geschwindigkeit 0,5 mm
Eindringtiefe 7 mm
Kontaktfläche (des Stempels) 113 mm2
Druck/Kontaktfläche 2 g
Test-Geschwindigkeit 0,5 mm
Eindringtiefe 7 mm
Kontaktfläche (des Stempels) 113 mm2
Druck/Kontaktfläche 2 g
Zur Bestimmung des Glucose-, Fructose- bzw. Saccharosegehalts wurden kleine
Knollenstücke (Durchmesser ca. 10 mm) von Kartoffelknollen in flüssigem Stickstoff
eingefroren und anschließend für 30 min bei 80°C in 0,5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5;
80% (Vol. ./Vol.) Ethanol extrahiert. Der Überstand, der die löslichen Bestandteile
enthält, wurde abgenommen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde zur
Bestimmung der Menge an löslichen Zuckern verwendet. Die quantitative Bestimmung
von löslicher Glucose, Fructose und Saccharose wurde in einem Ansatz mit folgender
Zusammensetzung durchgeführt.
100,0 mM Imidazol/HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl2
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50 µl Probe
1,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe.
100,0 mM Imidazol/HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl2
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50 µl Probe
1,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe.
Der Ansatz wurde 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmung der
Zucker erfolgt anschließend photometrisch durch Messung der Absorption bei 340 nm
nach aufeinanderfolgender Zugabe von
1,0 Einheiten Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose),
1,0 Einheiten Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1,0 Einheiten Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).
1,0 Einheiten Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose),
1,0 Einheiten Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1,0 Einheiten Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).
Gesamt-RNA von Kartoffelknollengewebe, direkt unterhalb (ca. 1 cm) auskeimender
Triebe wurde nach Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) präpariert.
Die gereinigte Gesamt-RNA diente als Ausgangsmaterial zur Herstellung von poly A +
RNA (Oligotex, mRNA Purification Kit, nach Herstellerangaben). 5 µg dieser poly A +
RNA wurde zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek (λ ZAPII, Stratagene) verwendet.
Etwa 3×105 Plaque forming units (pfus) dieser unamplifizierten cDNA-Bibbliothek
(Primärbank) wurden nach Herstellerangaben (Stratagene) zum "Plaque Lifting"
plattiert. Als radioaktiv markierte Sonde (Random Primed DNA Labeling Kit, nach
Herstellerangaben) zur Plaque-Hybridisierung diente die Sequenz der Genbank
Accession No. T76451. Die Filter wurden für 4 Stunden bei 42 °C prähybridisiert
(Puffer: 5×SSC, 0,5% BSA, 5×Denhardt, 1% SDS, 40 mM Phosphatpuffer, pH
7.2, 100 mg/l Heringssperma-DNA, 25% Formamid) und anschließend bei der
gleichen Temperatur für 14 Stunden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die
Filter 3× für 20 Minuten mit 3×SSC, 0,5% SDS bei 42°C gewaschen und
autoradiographiert. Hybridisierende Plaques wurden vereinzelt und die isolierten
Phagen zur "in vivo excision" nach Herstellerangaben verwendet. Plasmid-DNA aus
den erhaltenen Bakterienkolonien wurde isoliert, zur Sequenzanalyse eingesetzt und als
Seq. ID Nr. 1 identifiziert.
Eine auf diese Weise isolierte Plasmid-DNA wurde am 24.07.98 unter der Nummer
DSM 12348 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig,
BRD, hinterlegt.
Ein 1831 bp langes Asp718/XbaI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend
für die SSS I aus Kartoffel (Abel, G., (1995) Dissertation, Freie Universität Berlin),
wurde in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und
XbaI-Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt.
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus
Kartoffel, (Abel 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in dem mit SmaI vorgeschnittenen
Vektor pBinAR in "sense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors eingeführt.
Ein 1959 bp langes SmaI/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend
für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, dort als GBSS II bezeichnet), wurde geglättet
und in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die SmaI-Schnittstelle
des Vektors pBinAR eingeführt.
Ein 2619 bp langes SmaI/SaII Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die SS II
aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den mit SmaI und SaII vorgeschnittenen
Vektor pBinB33-Hyg in "sense "-Orientierung bezüglich des B33-Promotors eingeführt.
Ein 4212 bp langes Asp718/XbaI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die
SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, Plant J. 10(6): 981-991), wurde in "antisense"-Orien
tierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und die
XbaI-Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt.
Ein 4191 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS III aus
Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), wurde geglättet und in "sense"-Orientierung
bezüglich des 35S-Promotors in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pBinAR eingeführt.
Ein 1650 bp langes HindII-Fragment, welches eine partielle cDNA kodierend für das
BE-Enzym aus Kartoffel enthält (Kossmann et al., 1991, Mol. & Gen. Genetics 230
(1-2): 39-44), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33
Promotors in den mit SmaI vorgeschnittenen Vektor pBinB33 eingeführt. Das erhaltene
Plasmid wurde mit BamHI aufgeschnitten. In die Schnittstelle wurde ein 1362 Bp
langes BamHI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für das SS III-Enzym
aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in "antisense"-Orientierung
bezüglich des B33-Promotors eingeführt.
Ein 1546 bp langes EcoRV/HincII-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend
für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den EcoRV/HincII-
geschnittenen Vektor pBluescript II KS kloniert und anschließend über einen
Asp718/BamHI-Verdau wieder herausgeschnitten und in den ebenso verdauten Vektor
pBinAR in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors eingefügt. Danach
wurde ein 1356 Bp langes BamHI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend
für die SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in
"antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die BamHI-Schnitt
stelle des Vektors pBinAR-αSSII eingeführt.
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus
Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in die SmaI-Schnittstelle des
pBinB33-Vektors in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33-Promotors kloniert. Ein
1362 Bp langes BamHI-Fragment enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS
III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.) wurde in die BamHI-Schnittstelle des
resultierenden Vektors ebenfalls in "antisense"-Orientierung bezüglich des
B33-Promotors eingeführt.
Ein 1959 bp langes SmaI/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend
für die SS II (Abel, 1995, loc.cit.), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung
bezüglich des 35S-Promotors in die SmaI-Schnittstelle des pBinAR-Hyg-Vektors
eingeführt.
Die in Beispiel 1 bis 11 aufgeführten Plasmide wurden einzeln und/oder
aufeinanderfolgend in Agrobakterien transferiert, mit deren Hilfe die Transformation
von Kartoffelzellen wie oben beschrieben vorgenommen wurde. Aus den
transformierten Pflanzenzellen wurden anschließend ganze Pflanzen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation zeigten die transgenen Kartoffelpflanzen eine
Veränderung der physiko-chemischen Eigenschaften der von ihnen synthetisierten
Stärken. Die von diesen Pflanzen gebildete Stärke unterscheidet sich z. B. von in
Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke in ihrem Phosphat- oder Amylosegehalt, den
mittels RVA bestimmten Viskositäts- oder Verkleisterungseigenschaften sowie ihrem
chromatographischen Verhalten.
Claims (25)
1. Nukleinsäuremolekül, codierend ein Protein mit der Funktion einer α-Glukosidase
aus Kartoffel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt,
- b) Nukleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder Teile davon umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz;
- c) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, vorzugsweise spezifisch hybridisieren oder komplementär sind, und
- d) Nukleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nukleinsäuremoleküle abweicht.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend
- a) ein Nukleinsäuremolekül codierend für ein Protein mit der Funktion einer α-Glukosidase aus Kartoffel gemäß Anspruch 1 und
- b) ein oder mehrere Nukleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Stärkephosphorylasen, R1-Enzymen, Amylasen, Glukosidasen, Teilen besagter Nukleotidsequenzen oder mit besagten Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleinsäuremoleküle.
3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, das ein Desoxyribonuklein
säure-Molekül ist.
4. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.
5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein Ribonukleinsäure-Molekül ist.
6. Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül einem oder mehreren
der Ansprüche 1 bis 5 hybridisiert, vorzugsweise spezifisch hybridisiert.
7. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1 bis 6.
8. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend
für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Teile
davon in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
9. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend
für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Teile davon in
sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
10. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend
für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A teilweise in
sense-Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
11. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es mit regulatorischen Elementen
verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer RNA, die ggf.
translatierbar ist, in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
12. Wirtszelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6 oder einem Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 7-11
transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt.
13. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine modifizierte
Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nukleinsäuremolekül nach
einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, oder ein Vektors nach Anspruch 7-11
in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird.
14. Pflanzenzelle, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 13.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Stärke
synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Zelle nach Anspruch 14
eine vollständige Pflanze regeneriert wird.
16. Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 14.
17. Pflanze nach Anspruch 16, die eine Nutzpflanze ist.
18. Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17, die eine
stärkespeichernde Pflanze ist.
19. Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 18, die eine Weizen-,
Mais-, Kartoffel- oder Reispflanze ist.
20. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16
bis 19.
21. Verfahren zur Herstellung von Stärke nach einem an sich bekannten Verfahren,
dadurch gekennzeichnet, daß Pflanzenzellen gemäß Anspruch 14, Pflanzen nach
einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 19 oder Vermehrungsmaterial nach
Anspruch 20 in das Verfahren integriert werden.
22. Stärke, erhältlich aus einer Zelle gemäß Anspruch 12 oder 14, einer Pflanze nach
einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 19, aus Vermehrungsmaterial nach
Anspruch 20 oder einem Verfahren nach Anspruch 21.
23. Verwendung der Stärke nach Anspruch 22 im industriellen Bereich,
vorzugsweise zur Herstellung von Lebensmitteln, Verpackungsmaterialien oder
Einwegartikeln.
24. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen nach einem oder mehreren der
Ansprüche 1-6 oder Vektoren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7-11
zur Herstellung von transgenen Zellen, vorzugsweise bakteriellen oder
pflanzlichen Zellen.
25. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 14, Pflanzen nach einem oder
mehreren der Ansprüche 16 bis 19 oder Vermehrungsmaterial nach Anspruch 20
zur Herstellung von Stärke.
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