ES2242968T3 - D-pantolactona hidrolasa y gen que la codifica. - Google Patents
D-pantolactona hidrolasa y gen que la codifica.Info
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Abstract
Un péptido recombinante que tiene actividad de D-pantolactona hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº:1 o una sal del mismo, y que puede ser obtenido mediante la expresión de (i) una secuencia de ADN exógeno que codifica dicho péptido en células huésped procariotas, o (ii) una secuencia de ácido nucleico exógeno de SEC ID Nº:2 en células huésped eucariotas.
Description
D-pantolactona hidrolasa y gen
que la codifica.
La presente invención se refiere a una nueva
enzima que es útil para una resolución óptica de
D,L-pantolactona por medio de un procedimiento de
hidrólisis asimétrica D-selectiva, y también a un
gen que codifica la misma. Más precisamente, la presente invención
se refiere a proteínas que tienen una actividad de
D-pantolactona hidrolasa natural, producida por el
Fusarium oxysporum, o una actividad substancialmente
equivalente a la misma y a los genes que codifican las mismas.
Específicamente, la presente invención se refiere al ADN que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína; a
las células huésped transformadas o transfectadas con dicho ADN; a
un procedimiento para la producción de dicha proteína
D-pantolactona hidrolasa mediante el uso de dichas
células huésped; y al uso de tales proteínas y células huésped.
La D-pantolactona ha sido
conocida como un intermedio en la preparación del ácido
D-pantoténico y pantetina que son útiles como
vitaminas de importancia médica o fisiológica. La
D-pantolactona ha sido hasta el momento preparada a
través de una resolución óptica de D,L-pantolactona
sintetizada químicamente. Tal procedimiento, sin embargo, tiene
desventajas porque se requiere el uso de agentes de resolución
óptica costosos tal como quinina o brucina y además por que la
recuperación de la D-pantolactona no es fácil. Para
solucionar estos problemas, los presentes inventores ya propusieron
un procedimiento de resolución óptica mediante una hidrólisis
enzimática asimétrica de D,L-pantolactona en la
publicación de patente no examinada Japanese Patent Publication
(Kokkai Tokio) Nos. 03-65,198 y Hei
04-144,681.
Así, es un procedimiento para la producción de
D-pantolactona, en el que la
D-pantolactona en mezclas de
D,L-pantolactona es sometida selectivamente a una
hidrólisis asimétrica usando un microorganismo que posee una
actividad hidrolizante de lactona para formar ácido
D-pantóico, que es luego separado y convertido en
D-pantolactona, en el que dicho microorganismo es un
miembro seleccionado del grupo constituido por microorganismos que
pertenecen a los géneros: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella,
Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium,
Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora,
Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium, y
Arthroderma. Es también un procedimiento para la producción
de D-pantolactona hidrolasa que comprende el uso de
un microorganismo que pertenece al género anteriormente
mencionado.
Sin embargo, no siempre puede decirse que muchos
de esos microorganismos como los descritos anteriormente poseen una
actividad hidrolizante tal que puedan aplicarse a la industria
inmediatamente. Además, al incrementar la actividad enzimática de
dichos microorganismos hasta un nivel que se pueda aplicar
industrialmente, se necesitan investigaciones problemáticas y
difíciles que requieren mucho tiempo para establecer las
condiciones de crecimiento de las células, las condiciones para la
inducción de la actividad enzimática, etc. Existe además otro
problema, como los mencionados microorganismos son verdaderos
hongos, sus cuerpos celulares son hifas de formas variadas y
comparados con las bacterias que tienen una única forma, es
considerablemente más difícil preparar células inmovilizadas que son
ventajosas para la producción industrial. Existe además otro
problema y es que, al purificar la enzima de las células, la tasa
de recuperación es considerablemente pobre en lo que se refiere a la
D-pantolactona hidrolasa.
Uno de los propósitos de la presente invención es
resolver aquellos problemas así como proporcionar los medios para
realizar un aumento significativo de la actividad enzimática
posible, por ejemplo, los medios para modificar y mejorar la
D-pantolactona hidrolasa per se.
De esta manera, un aspecto de la presente
invención es revelar y proveer un nuevo gen que codifique una
proteína que tenga bien una actividad D-pantolactona
hidrolasa de origen natural, (tal como la actividad de la
D-pantolactona hidrolasa del Fusarium
oxysporum) o bien una actividad substancialmente equivalente a
la ya mencionada; una célula huésped trasformada con ADN que
contenga una secuencia de nucleótidos que codifique dicha proteína;
un procedimiento para producir dicha proteína mediante el uso de
dichas células huésped; y los usos de dichas proteínas y células
huésped.
La presente invención, que esta dirigida a un gen
que codifica la D-pantolactona hidrolasa aislada de
los microorganismos mencionados anteriormente que posea la capacidad
de hidrolizar una lactona y a un sistema con una alta eficiencia y
buena productividad para producir D-pantolactona es
desarrollada exitosamente mediante la utilización de un gen de
D-pantolactona hidrolasa aislado como tal, y no sólo
soluciona los problemas que se mencionaron anteriormente sino que
también contribuye mucho al desarrollo de las enzimas que poseen la
capacidad de hidrolizar una lactona, junto con nuevas funciones; y
al desarrollo de técnicas que usan la nueva enzima.
Particularmente, los presentes inventores han tenido éxito en el
aislamiento de un nuevo gen que codifica una hidrolasa con capacidad
para hidrolizar la D-pantolactona, derivado de
microorganismos del género Fusarium (tal como el Fusarium
oxysporum) que produce la D-pantolactona
hidrolasa, mediante la cual se consiguió la presente invención.
La presente invención se refiere a:
(i) una proteína con actividad de
D-pantolactona hidrolasa o una actividad
sustancialmente equivalente a la misma o una sal de la misma; o
(ii) una proteína con una conformación
estructural primaria equivalente a la misma o una sal de la misma;
o
(iii) un péptido parcial característico de dicha
proteína o una sal del mismo; o
(iv) genes, como ADN o ARN, que codifiquen dicha
proteína;
(v) vectores o plásmidos que contienen dicho gen
operativo en una técnica de recombinación genética;
(vi) células huésped transformadas con dicho
vector, etc;
(vii) un procedimiento para producir dicha
proteína o una sal de la misma que comprende el cultivo de dichas
células huésped;
(viii) un procedimiento para producir
D-pantolactona que comprende una resolución óptica
de D,L-pantolactona con tal célula huésped
genéticamente manipulada (trasformante), tal proteína recombinante o
una sal de la misma etc; y
(ix) un sistema, tal como una enzima
inmovilizada, para producir la D-pantolactona.
En la presente invención, una proteína
recombinante de preferencia es una D-pantolactona
hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 o
una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la
anterior, o una sal de la misma.
De acuerdo a lo mencionado, un aspecto de la
presente invención es:
(1) una proteína que tenga una actividad de
D-pantolactona hidrolasa de origen natural o una
actividad sustancialmente equivalente a la anterior o que tenga una
conformación estructural primaria sustancialmente equivalente a la
misma, o una sal de la misma.
(2) la proteína de acuerdo con la anterior (1),
originándose dicha proteína que tiene una actividad de
D-pantolactona hidrolasa natural en un
microorganismo que pertenece a un miembro seleccionado del grupo
constituido por los géneros:
Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella,
Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium,
Eurotium, Nectoria., Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora,
Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium, y
Arthroderma;
(3) la proteína de acuerdo con la anterior.(1),
originándose dicha proteína que tiene una actividad de
D-pantolactona hidrolasa natural en el género
Fusarium;
(4) la proteína de acuerdo con uno cualquiera de
los anteriores (1) a (3), que es una D-pantolactona
hidrolasa, o una sal de la misma, que tiene una secuencia de
aminoácidos representada por SEC ID Nº: 1 o bien una secuencia de
aminoácidos sustancialmente equivalente a la misma;
(5) la proteína de acuerdo con uno cualquiera de
los anteriores (1) a (4), que se produce expresando una secuencia
de ADN exógena en células huésped parocariotas,
(6) la proteína de acuerdo con una cualquiera de
los anteriores (1) a (5) que tiene una secuencia de aminoácidos
representada por SEC ID Nº: 1 o una secuencia de aminoácidos
sustancialmente igual a la que tiene;
(7) un péptido parcial, o una sal del mismo, de
la proteína de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) a
(6);
(8) un ácido nucleico que tenga una secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína o péptido parcial de la misma
de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7),
(9) el ácido nucleico de acuerdo con el punto
anterior (8), que tiene una secuencia de nucleótidos con una
porción correspondiente a un marco abierto de lectura en la
secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:2 o una secuencia de nucleótidos
que tiene una actividad sustancialmente equivalente a la
anterior;
(10) un vector que transporta el ácido nucleico
de acuerdo con los puntos anteriores (8) o (9);
(11) un transformante en el que es hospedado el
vector de acuerdo con lo anteriormente expuesto en (10);
(12) un procedimiento para producir la proteína o
el péptido parcial de la misma de acuerdo con cualquiera de los
puntos anteriormente mencionados (1) a (7), incluyendo una
D-pantolactona hidrolasa o una sal de la misma, que
comprende:
Cultivar el transformante de acuerdo con el punto
anterior (11) en un medio nutritivo adecuado para que crezca dicho
transformante con el fin de producir, como una proteína
recombinante, la proteína o el péptido parcial de la misma de
acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7),
incluyendo dicha D-pantolactona hidrolasa o una
sal de la misma; y
(13) un procedimiento para producir
D-pantolactona, que comprende:
llevar a cabo una resolución óptica de
D,L-pantolactona en presencia de
(i) la proteína o péptido parcial de la misma de
acuerdo con uno cualquiera de los puntos anteriores (1) a (7) o
(ii) el transformante de acuerdo con el punto
anteriormente mencionado (11).
Más específicamente, la presente invención provee
una D-pantolactona hidrolasa, o una sal de la misma,
que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:1.
La figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos
obtenidas mediante la secuenciación de péptidos digestivos de
D-pantolactona hidrolasa.
La figura 2 muestra sitios, cada uno de ellos
correspondiente a un péptido digestivo de
D-pantolactona hidrolasa, sobre la secuencia de
aminoácidos que codifica el ADNc aislado.
La figura 3 muestra la secuencia de los cebadores
aplicados en PCR en los que un ADN genómico para la
D-pantolactona hidrolasa es usado como molde.
La figura 4 muestra la estructura de los
cebadores aplicados en PCR para la construcción de un vector usado
para expresar la D-pantolactona hidrolasa
recombinante.
La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos y
la secuencia de nucleótidos de la D-pantolactona
hidrolasa.
La presente invención provee técnicas tales como
la clonación de un gen que codifica una
D-pantolactona hidrolasa natural (tal como la
D-pantolactona hidrolasa natural derivada del (u
originada en) Fusarium oxysporum) o una proteína que tiene
una actividad substancialmente equivalente a la misma,
identificación de dicho gen y determinación de la secuencia
característica (secuenciación) de dicho gen así como la
recombinación de dicho gen a un vector de expresión; producción y
cultivo/crecimiento de células huésped transformadas con un ADN que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína,
(transformantes); producción de dicha proteína usando las
mencionadas células huésped; y el uso de tales proteínas y células
huésped.
A continuación se describen las técnicas y
operaciones detalladas de acuerdo con la presente invención.
La presente invención también provee varios
medios para la utilización de genes que codifican la anteriormente
citada D-pantolactona hidrolasa y más adelante
provee un sistema de producción de D-pantolactona
hidrolasa con una buena eficiencia y una productividad más excelente
aún en el que se utiliza dicho gen aislado de
D-pantolactona hidrolasa.
La presente invención se refiere a una proteína
que tiene una actividad de D-pantolactona hidrolasa
de origen natural o bien una actividad sustancialmente equivalente
a la misma o a una sal de la misma; o a una proteína que tiene una
conformación estructural primaria sustancialmente equivalente a la
misma o una sal de la misma; a un péptido parcial característico de
dicha proteína o una sal del mismo; a un gen, tal como ADN o ARN,
que codifica dicha proteína o péptido; a un vector o plásmido (o
vehículo) que contiene dicho gen operativo en una técnica de
recombinación genética; a una célula huésped trasformada con ese
vector, etc; a un procedimiento para producir dicha proteína o una
sal de la misma que comprende el cultivo de dicha célula huésped; a
un procedimiento para sintetizar D-pantolactona que
comprende una resolución óptica de D,L-pantolactona
con tal célula huésped manipulada genéticamente, o dicha proteína
recombinante o una sal de la misma; y a sistemas y medios, tales
como enzimas inmovilizadas, para producir
D-pantolactona.
En la presente invención, la
D-pantolactona hidrolasa o la sal de la misma que
comprende, de preferencia, una secuencia de aminoácidos de SEC ID
Nº:1 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente equivalente a la
misma está específicamente ilustrada pero la
D-pantolactona hidrolasa de la presente invención
incluye cualquier enzima que tenga la capacidad de hidrolizar la
D-pantolactona mientras tenga una secuencia de
aminoácidos nueva. La capacidad de hidrolizar
D-pantolactona se refiere a cualquier capacidad con
la misma calidad para producir la hidrólisis de
D-pantolactona. De más preferencia, la
D-pantolactona de la presente invención incluye
todas las sustancias con una secuencia de aminoácidos de SEC ID
Nº:1; o que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente
equivalente a la misma y/o la secuencia de aminoácidos
sustancialmente igual.
El gen de la D-pantolactona
hidrolasa de acuerdo con la presente invención puede ser clonado,
por ejemplo, por los siguientes procedimientos:
Debe señalarse que las técnicas de recombinación
genética pueden ser conducidas, por ejemplo, por los métodos
descritos en T. Maniatis y col., "Molecular Cloning", 2º
Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.T,
(1989), Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan)
ed.,"Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1; Idensi Kenkyuho II (Lectures
on Biochemical Experiments (Second Series; 1); Methods for Gene
Study II)", Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1986); Nippon Seikagaku
Kai (Biochemical Society of Japan) ed.,
"Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2, Kakusan III,
(Kumikae DNA Gijutsu) (New Lectures on Biochemical Experiments 2,
Nucleic Acids III (Recombinant DNA Technique))", Tokyo Kagaku
Dojin, Japan (1992); R.Wu (ed),"Methods in Enzymology", Vol.
68, Academic Press, New York (1980); R. Wu y col. (ed.), "Methods
in Enzymology", Vols. 100 y 101, Academic Press, New York (1983);
R. Wu y col. (ed.), "Methods in Enzymology", Vols. 153, 154 y
155, Academic Press, New York (1987), etc., así como también
mediante las técnicas descritas en las referencias citadas en las
mismas, cuyas descripciones son incorporadas como referencias aquí,
o por técnicas sustancialmente iguales a las que ellas describen o
técnicas modificadas de las mismas. Tales técnicas y medios pueden
ser también aquellos que son individualmente modificados/mejorados a
partir de las técnicas convencionales que dependen del objeto de la
presente
invención.
invención.
Las células cultivadas de Fusarium
oxysporum son lisadas y centrifugadas para aislar el ADN
cromosómico, seguido por una descomposición y remoción del ARN, de
la manera convencional. Los componentes del ADN son purificados
mediante la remoción de las proteínas presentes. Más información
acerca de la preparación de los materiales referidos a esta
solicitud, está descrita, por ejemplo, en "Shokubutsu
Biotechnology-Jikken Manual (Plant Biotechnology
Experiment Manual)", Noson Bunkasha, página 252, descripciones
que son incorporadas aquí como referencias.
Como una fuente de ADN, puede ser usado
adecuadamente cualquier microorganismo que pertenezca al género
Fusarium y que tenga la capacidad de producir
D-Pantolactona hidrolasa. Ejemplos de los
microorganismos que pertenecen al género Fusarium que son aplicables
aquí son Fusarium oxysporum IFO 5942, Fusarium
semitectam IFO 30200, etc.
De manera similar, otros microorganismos que
pertenecen a un miembro seleccionado del grupo constituido por los
géneros:
Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria,
Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina,
Absidia, Sporothrix, Verticillium o Arthroderma y tienen
capacidad de producir D-pantolactona hidrolasa
pueden ser usados como fuente de ADN. Son ejemplos de tales
microorganismos Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561,
Gibberella fujikuroi IFO 6349, Aspergillus awamori IFO
4033, Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus
orizae IFO 4706, Volutella buxi IFO 6003, Gliocladium
catenulatum IFO 6121, Eurotium chevalieri IFO 4334,
Nectria elegans IFO 7187, Schizophyllum commune IFO
4928, Myrothecium roridum IFO 9531, Neurospora
crassa, IFO 6067, Acremonium fusidioides IFO 6813,
Tuberculina persicina IFO 6464, Absidia lichtheimi IFO
4009, Sporothrix schenckii IFO 5983, Verticillium
malthousei IFO 6624, Arthroderma uncinatum IFO 7865,
etc, en los que "IFO" es Zaidan-Hojin Hakko
Kenkyusho (The Institute for Fermentation Osaka;
17-85,
Juso-hon-machi 2 chome,
Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan,) y cada número
subsiguiente corresponde al número en el Catálogo publicado por
dicho IFO o el número de acceso proporcionado por el
IFO.
IFO.
Los iniciadores de oligonucleótidos sintéticos
se preparan de acuerdo con la información de las secuencias de
aminoácidos referidos al péptido interno de la
D-pantolactona hidrolasa. Por ejemplo, los
iniciadores de oligonucleótidos sintéticos pueden ser preparados de
acuerdo con la información de las secuencias de aminoácidos
relacionadas con el péptido interno de la
D-pantolactona hidrolasa pura obtenida del
microorganismo que se ha seleccionado de los nombrados anteriormente
y que tiene la capacidad de producir
D-pantolactona hidrolasa. En un caso típico, los
iniciadores degenerados, etc., son diseñados y preparados basados
en la información de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos
de la D-pantolactona hidrolasa natural. La
preparación de los iniciadores puede ser llevada a cabo mediante
técnicas que son conocidas en la materia. Por ejemplo, los
iniciadores pueden ser sintetizados por medio del procedimiento del
fosfodiéster, del procedimiento del fosfotriéster, del
procedimiento del fosfito, etc., usando un sintetizador de ADN
automático. Para ser más específico, la
D-pantolactona hidrolasa se purifica a partir de
las células obtenidas mediante el cultivo del Fusarium
oxysporum IFO 5942 en un medio nutritivo y se fragmenta, si es
necesario, con una peptidasa, etc., con lo que se obtiene la
información de una secuencia de aminoácidos del péptido interno de
la enzima. A partir de la información sobre la secuencia del
aminoácido obtenida como tal, son diseñados y preparados los
cebadores de oligonucleótidos sintéticos de preferencia. Se lleva a
cabo una reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando un par de
dichos cebadores en los que se usa como molde un ADN genómico para
la D-pantolactona hidrolasa. La PCR puede ser
efectuada mediante técnicas conocidas en la materia o por
procedimientos sustancialmente equivalentes a las mismas o técnicas
modificadas. La reacción puede ser conducida por los métodos
descritos, por ejemplo en R.Saiki, y col. Science ,vol. 230, pp
1350 (1985); R.Saiki, y col., Science, vol. 239, pp 487 (1988); y
Henry A. Erlich, PCR Technology, Stockton Press. La reacción se
puede llevar a cabo también, por ejemplo, usando un kit o reactivo
comercial.
Los fragmentos de ADN amplificados resultantes
son secuenciados y, luego de confirmar que contienen una secuencia
que es homóloga a aquella que codifica la secuencia del aminoácido
del péptido interno de la enzima purificada, son marcados con un
isótopo y son usado para experimentos futuros o similar. La
secuenciación de las secuencias de nucleótidos puede ser llevada a
cabo por una técnica didesoxi (tal como un procedimiento M13
didesoxi), por el método de Maxam-Gilbert, etc., o
puede realizarse usando un kit de secuenciación comercial tal como
un kit de secuenciación cíclica dyeprimer Taq o un secuenciador
automático de nucleótidos tal como un secuenciador de ADN
fluorescente. El marcado de sondas, etc, con un radioisótopo, etc,
pude ser efectuado usando un kit de marcaje disponible en el
comercio tal como un kit de marcaje de ADN random primed (Boehringer
Mannheim).
Las células cultivadas de Fusarium
oxysporum son lisadas, extraídas de acuerdo a un procedimiento
AGPC para aislar el ARN total. Luego es aislado el ARNm y purificado
de la fracción de ARN total por un procedimiento adecuado tal como
mediante el uso de una columna de celulosa de oligo dT. Sin embargo,
en una forma de realización, el ARNm puede ser aislado mediante un
procedimiento conocido en la técnica o por el sustancialmente mismo
método o modificaciones del mismo, el aislamiento y la purificación
del RNAm puede ser efectuado por los métodos descritos, por
ejemplo, en T. Maniatis, y col. ed., "Molecular Cloning" 2º
Ed., Capítulo 7, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.T. (1989); L. Grossman, y col., ed., "Methods in Enzymology",
Vol. 12, Partes A & B, Academic Press, New York (1968); S. L.
Berger y col. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.33
& p. 215, Academic Press, New York (l987); Biochemistry, 18,
5294-5299, 1979; etc, cuyas descripciones se
incorporan aquí como referencia. Ejemplos de dichas técnicas de
aislamiento y purificación ARNm son un procedimiento de cloruro
guanidina-cesio, el procedimiento de tiocianato de
guanidina, un procedimiento con fenol, etc. Si fuera necesario, el
ARN total resultante puede ser sometido a un procedimiento de
purificación usando un una columna de
celulosa-oligo(dT), etc, para dar
poli(A)+ RNAm. Como una fuente de ARNm, puede ser usado
convenientemente cualquier microorganismo que pertenezca al género
Fusarium y tenga la capacidad de producir
D-pantolactona hidrolasa. Ejemplos de los
microorganismos que pertenecen al género Fusarium que son aplicables
aquí son Fusarium oxysporum IFO 5942, Fusarium
semitectam IFO 30200, etc. De manera similar, otros
microorganismos que pertenezcan a un miembro seleccionado del grupo
constituido por los géneros:
Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium. Eurotium, Nectoria,
Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina,
Absidia, Sporothrix, Verticillium o Arthroderma y tengan la
capacidad de producir D-pantolactona hidrolasa
pueden ser usados como fuente de RNAm. Ejemplos de dichos
microorganismos son Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561,
Gibberella fujikuroi IFO 6349, Aspergillus awamori
IFO 4033, Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus
oryzae IFO 4706, Volutella buxi IFO 6003,
Gliocladium catenulatum IFO 6121, Eurotium chevalieri
IFO 4334, Nectria elegans IFO 7187, Schizophyllum
commune IFO 4928, Myrothecium roridum IFO 9531,
Neurospora crassa IFO 6067, Acremonium fusidioides
IFO 6813, Tuberculina persicina IFO 6464, Absidia
lichtheimi IFO 4009, Sporothrix schenckii IFO 5983,
Verticillium malthousei IFO 6624, Arthroderma
uncinatum IFO 7865, etc.
Los ADNc son preparados usando, como modelo, el
ARNm resultante y una transcriptasa inversa, etc. La síntesis del
ADNc por la transcriptasa inversa usando ARNm puede ser llevada a
cabo por técnicas estándar convencionales conocidas en la técnica,
mediante las sustancialmente técnicas o por técnicas modificadas de
las mismas. Se encuentran técnicas detalladas en, por ejemplo, en H.
Land y col., "Nucleic Acids Res.", Vol .9, 2251 (1981); U.
Gubler y col., "Gene", Vol. 25, 263-269
(1983); S.L. Berger y col., ed., "Methods in Enzimology", Vol
.152, p.307, Academic Press, New York (1987); etc., cuyas
revelaciones son incorporadas aquí como referencia. El ADNc obtenido
de esta manera es insertado en un vector fago disponible
comercialmente o, además, sometido a un empaquetamiento mediante
técnicas convencionales. Luego, basado en el ADNc preparado de esta
manera, se pueden construir las genotecas de
ADNc.
ADNc.
El fago recombinante anteriormente mencionado fue
transfectado en las células huésped, a continuación se lo sometió a
una hibridación en placa para seleccionar las placas positivas
(clones). Los fragmentos de ADN de los clones resultantes son
secuenciados. Las secuencias de nucleótidos resultantes son
decodificadas y analizadas en vista de una secuencia codificada de
aminoácidos. Como resultado de dichos análisis e investigaciones, se
confirma que el gen buscado de la D-pantolactona
hidrolasa está clonado.
Además de la técnica que usa un vector fago,
pueden realizarse transformaciones de las células huésped incluyendo
Escherichia coli de acuerdo con las técnicas conocidas en la
materia, tales como una técnica con calcio y una técnica con
calcio/rubidio, o sustancialmente los mismos métodos (D. Hanahan, J.
Mol. Biol.., Vol. 166, p. 557 (1983), etc.).
La PCR puede realizarse usando el ADNc preparado
como modelo. En una forma de realización, puede usarse el iniciador
obtenido en el punto 2) anteriormente expuesto.
Con respecto a un plásmido dentro del cual es
incorporado el gen de D-pantolactona hidrolasa, se
puede usar cualquier plásmido siempre que dicho ADN pueda ser
expresado en células huésped usadas convencionalmente en técnicas de
ingeniería genética (tales como células huésped procariótas
incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. y
células huésped eucariótas incluyendo levaduras). En tal secuencia
del plásmido, se puede incorporar, por ejemplo, codones adecuados
para expresar el ADN clonado en células huésped seleccionadas o para
construir sitios de enzimas de restricción. También es posible
contener secuencias de control, secuencias de promoción, etc. para
facilitar la expresión del gen buscado; conectores, adaptadores,
etc. útiles para la unión del gen buscado; secuencias útiles para
controlar la resistencia a los antibióticos o para controlar el
metabolismo o para selección; y similares.
De preferencia, pueden usarse promotores
adecuados. Por ejemplo, tales promotores pueden incluir promotor
triptófano (trp), promotor lactosa, (lac), promotor
triptófano-lactosa (tac), promotor lipoproteína
(lpp), promotor \lambda fago PL, etc. en el caso de plásmidos en
los que se usa como huésped Escherichia coli; y promotores
GAL1, GAL10, etc. en el caso de plásmidos donde se usa levadura como
huésped.
Ejemplos del plásmido adecuado para huésped
Escherichia coli son pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119,
pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U,
pTZ-19R/-19U, pGEM-3,
pGEM-4, PGEM-3Z, ,
pGEM-4Z., pGEM-5Zf (-), pBluescript
KS TM (Stratagene), etc. Ejemplos del vector plásmido adecuados para
expresión en Escherichia coli son: pAS, pKK223 (Pharmacia),
pMC1403, pMC931, pKC30, etc. Ejemplos de plásmido para huésped
levadura son el vector YIp, el vector YEp, vector YRp, vector YCp,
etc., incluyendo pGPD-2, etc. Las células huésped de
Escherichia coli pueden incluir aquellas derivadas de las
cepas de Escherichia coli K12, tales como NM 533,
XL1-Blue, C600, DH1, HB101 y JM109.
En las técnicas de ingeniería genética de la
presente invención, es posible usar varias enzimas de restricción,
transcriptasas inversas, enzimas para la modificación y
descomposición del ADN, usadas para modificar o convertir un
fragmento de ADN en una estructura adecuada para el clonado,
polimerasas de ADN, nucleotidil transferasas terminales, ADN
ligasas; etc., que son conocidas o comunes en la técnica. Son
ejemplos de enzima de restricción aquellas descritas en R.J.
Roberts, "Nucleic Acid Res.", Vol. 13, r165 (1985); S. Linn y
col. ed., "Nucleases", p.109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; etc. Son ejemplos de transferasa
inversa aquellas derivadas de virus de leucemia Moloney en ratón
(MMLV), del virus de mieloblastosis aviar (AMV), etc.
Particularmente, la transferasa inversa H-deficiente
RNase o similares son las usadas de preferencia. Ejemplos de ADN
polimerasa son ADN polimerasa de Escherichia coli, fragmento
Klenow que es un derivado de la ADN polimerasa de E.coli,
ADN polimerasa E. coli fago T4, ADN polimerasa E. coli
fago T7, ADN polimerasa de bacteria termoresistente,
etc.
etc.
La nucleotidil trasnferasa terminal incluye
TdTasa capaz de a agregar un dideoxinucleótido (dNMP) a un
3'-OH terminal, como se describe en R.Wu y col. ed..
"Methods in Enzymology", Vol 100, p.96, Academic Press, New
York, (1983). La enzima para modificar y descomponer ADN incluye
exonucleasa, endonucleasa, etc. Ejemplos de tales enzima son
fosfodiesterasa de toxina de víbora, fosfodiesterasa de bazo, ADN
exonucleasa I de E. coli, ADN exonucleasa III de E.
coli, ADN exonucleasa VII de E. coli, exonucleasa
\lambda, ADNasa I, nucleasa S1, nucleasa de Micrococcus,
etc. Son ejemplos de ADN ligasa, ADN ligasa de E. coli, ADN
ligasa T4, etc.
El vector (o vehículo) que es adecuado para
clonar genes ADN y construir genotecas de ADN incluye plásmido, fago
\lambda, cósmido, fago P1, factor F, YAC, etc. Son ejemplos de
preferencia de dichos vectores los vectores derivados de fago
\lambda, tal como Charon 4ª, Charon 21ª, \lambda gt10, \lambda
gt11, DASHII \lambda, FIXII \lambda, EMBL3 \lambda y ZAPII
\lambda^{TM} (Stratagene), etc.
Además, basándose en la secuencia de nucleótidos
del gen que codifica la D-pantolactona hidrolasa de
la presente invención, medios y procedimientos convencionalmente
usados en técnicas de ingeniería genética nos permiten fabricar
proteínas, tales como variantes y mutantes, en las que una
modificación es introducida en la secuencia de aminoácidos de la
D-pantolactona hidrolasa de manera tal que uno o más
aminoácido(s) es/son sustituidos, eliminados, insertados,
translocados o añadidos.
Ejemplos de los procedimientos y medios para tal
variación, sustitución y modificación son aquellos descritos en
Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) ed.,
``Zoku-Seikagaku Jikken Kouza 1, Idensi Kenkyuho II
(Lectures on Biochemical Experiments (Second Series; 1), Methods for
Gene Study II), p.105 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin, Japan,
(1986); Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) ed.,
"Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2, Kakusan III
(Kumikae DNA Gijutsu) (New Lectures on Biochemical Experiments 2,
Nucleic Acids III (Recombinant DNA Technique))", p. 233 (Susumu
Hirose), Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1992); R. Wu, L. Grossman, ed.,
"Methods in Enzymology", Vol. 100, p.457 y p. 468, Academic
Press, New York (1983); J. A. Wells y col., "Gene", Vol. 34,
p. 315 (1985); T. Grudstroem y col., "Nucleic Acids Res.",
Vol. 13, p. 3305 (1985); J. Taylor y col., "Nucleic Acids
Res.", Vol. 13, p. 8765 (1985); R. Wu, ed., "Methods in
Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987);
A. R. Oliphant y col., "Gene", Vol. 44, p.177 (1986); etc.,
cuyas descripciones están incorporadas en este documento como
referencia. Son ejemplos de dichos procedimientos y medios las
técnicas que usan oligonucleótidos sintéticos para introducir una
mutación o variación en un sitio específico (técnicas de mutagénesis
dirigida a un sitio), técnicas Kunkel, técnicas
dNTP[\alpha S] (método Eckstein), técnicas que usan ácido
sulfuroso (o bisulfito), ácido nitroso (o nitrito), etc. para
introducir una mutación o variación en un dominio o área
específicos, etc.
Por otra parte, la proteína resultante de acuerdo
con la presente invención puede ser sometida a técnicas químicas
por las que un residuo(s) aminoácido contenido en la misma
es(son) modificados o puede ser transformado en
su(sus) derivado(s) por medio de una descomposición
parcial o una modificación usando una enzima como una peptidasa (por
ejemplo, pepsina, quimotripsina, papaína, bromalina, endopeptidasa,
exopeptidasa, etc.). También es posible expresar, como proteínas de
fusión, las proteínas recombinantes de la presente invención y luego
convertir/procesar las proteínas de fusión in vivo o in
vitro en productos con actividad biológica sustancialmente
equivalente a la D-pantolactona hidrolasa natural.
Una producción de fusión convencionalmente usada en técnicas de
ingeniería genética puede también ser usada. Tal proteína de fusión
puede ser purificada por medio de cromatografía de afinidad, etc.
usando su parte de fusión. Se pueden encontrar modificaciones,
alteraciones, etc. de estructuras proteicas en, por ej. Nippon
Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) ed.,
"Shin-Seikagaku Jikken Kouza 1, Tanpakushitsu VII,
Tanpakushitsu Kogaku (New Lectures on Biochemical Experiments 1,
Protein VII, Protein Engineering)", Tokyo Kagaku Dojin, Japan
(1993), cuyas descripciones están incorporadas en este documento
como referencia. Tales modificaciones, alteraciones, etc. pueden ser
llevadas a cabo de acuerdo con técnicas descritas en las mismas,
técnicas descritas en referencias de las mismas, y aquellas
sustancialmente similares a las mismas.
Así, los productos de acuerdo con la presente
invención pueden incluir proteínas en las que uno o más
residuo(s) aminoácidos es/son diferente(s) del/los
natural(es) en términos de identidad o proteínas en las que
uno o más residuo(s) aminoácidos es/son cambiado(s) de
la(s) posición(es) que tiene(n) en la proteína
natural. Los productos de la presente invención pueden incluir
análogos de deleción en los que uno o más residuo(s)
aminoácido especificado para la D-pantolactona
hidrolasa natural está(n) ausente(s) (por ejemplo, 1 a 80, de
preferencia 1 a 60, de más preferencia 1 a 40 residuo(s)
aminoácido especificado para la D-pantolactona
hidrolasa natural está(n) ausente(s)); análogos de
sustitución, en los que uno o más residuo(s) aminoácido
especificado para la D-pantolactona hidrolasa
natural es/son reemplazado(s) con otro(s)
residuo(s) (por ejemplo, 1 a 80, de preferencia 1 a 60, de
más preferencia 1 a 40 residuo(s), de más preferencia aún 1 a
20 y particularmente de preferencia 1 a 10 residuo(s)
aminoácido especificado para la D-pantolactona
hidrolasa natural es(son) reemplazado(s) por
otro(s) residuo(s)); y análogos de adición, en los que
uno o más en los que uno o más residuo(s) aminoácido
es(son) adicionado(s) a la secuencia especificada para
la D-pantolactona hidrolasa natural (por ejemplo, 1
a 80, de preferencia 1 a 60, de más preferencia 1 a 40
residuo(s), de más preferencia aún 1 a 20 y particularmente
de preferencia 1 a 10 residuo(s) aminoácido es/son
adicionado(s) a la secuencia especificada para la
D-pantolactona hidrolasa natural). Los productos
pueden incluir proteínas en las que una estructura de dominio
característica de la D-pantolactona hidrolasa
natural contenida o mantenida. Además, los productos pueden incluir
proteínas que tienen la misma calidad desde el punto de vista de la
actividad D-pantolactona hidrolasa que la
D-pantolactona hidrolasa natural.
Los productos de la presente invención pueden
incluir todas las variantes y análogos que se han mencionado
anteriormente, siempre que tengan la estructura del dominio que es
característica de la D-pantolactona hidrolasa
natural. Se cree también que los productos de la presente invención
pueden incluir todas las proteínas que tienen una conformación
estructural primaria sustancialmente equivalente a aquella de la
D-pantolactona hidrolasa natural de acuerdo con la
presente invención y aquellas que tienen una porción de la
conformación estructural primaria de la
D-pantolactona hidrolasa natural de acuerdo con la
presente invención.
Se cree además que los productos de la presente
invención pueden incluir proteínas que comparten todas o parte de
las propiedades biológicas de la D-pantolactona
hidrolasa natural o que tienen una actividad biológica
sustancialmente equivalente a aquella de la
D-pantolactona hidrolasa natural. Además, el
producto de la presente invención puede incluir una de las variantes
que se presentan naturalmente. Los productos
D-pantolactona hidrolasa de la presente invención
pueden ser separados, aislados y/o purificados como se ilustra a
continuación.
Además, los productos de acuerdo con la presente
invención pueden incluir secuencias de ADN que codifican para los
polipéptidos anteriormente mencionados y secuencias de ADN que
codifican para polipéptidos de D-pantolactona
hidrolasa (incluyendo análogos y derivados de los mismos) que tengan
todas o parte de las características naturales de la
D-pantolactona hidrolasa natural. Dichas secuencias
de nucleótidos de D-pantolactona hidrolasa pueden
también ser modificados (con inserciones, adiciones, deleciones y
sustituciones). Por lo tanto, los productos de acuerdo con la
presente invención pueden incluir también tales secuencias de
nucleótidos modificadas.
Puesto que las secuencias de ADN de la presente
invención proveen información de la secuencia de aminoácidos de la
proteína D-pantolactona hidrolasa, que hasta el
momento no se encontraba disponible, la utilización de tal
información está también dentro del alcance de la presente
invención. Tal utilización puede incluir el diseño de sondas para
aislamiento y/o detección de ADN genómico y ADNc que codifica para
D-pantolactona hidrolasa o proteínas relacionadas
con la misma, de microorganismos, o particularmente de preferencia
microorganismos que tengan la capacidad de producir
D-pantolactona hidrolasa, tales como aquellos que
pertenecen a un miembro seleccionado del grupo constituido por el
género: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria,
Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina,
Absidia, Sporothrix, Verticillium y Arthroderma con
capacidad de producir D-pantolactona hidro-
lasa.
lasa.
Las secuencias de ADN de la presente invención de
valor, por ejemplo, como sondas para aislamiento y/o detección de
ADN genómico y ADNc que codifica para D-pantolactona
hidrolasa o proteínas relacionadas con la misma, de microorganismos
que tengan la capacidad de producir D-pantolactona
hidrolasa, o particularmente de preferencia microorganismos
pertenecientes a los géneros anteriormente mencionados, incluyendo
el Fusarium, etc. El aislamiento del gen puede llevarse a cabo
utilizando técnicas de PCR o técnicas de RT-PCR (PCR
usando transcriptasa inversa (RT)). El ADN de
D-pantolactona hidrolasa y sus ADN relacionados
pueden ser usados para aislamiento, detección, etc. de genes
relacionados con D-pantolactona hidrolasa por medio
de técnicas de PCR, técnicas de RT-PCR u otros
procedimientos, usando un iniciador de ADN obtenido por síntesis
química como resultado de la selección de un dominio (o porción)
característico basado en una secuencia de aminoácidos supuesta
derivada de la secuencia de ADNc de D-pantolactona
hidrolasa clonada y secuenciada y en el diseño del iniciador de ADN
dependiente del dominio (o porción) seleccionado.
Como se ha mencionado anteriormente, la presente
invención provee un procedimiento para la producción de la
D-pantolactona hidrolasa buscada que comprende la
importación de una molécula de ADN y/o gen recombinante de
D-pantolactona hidrolasa dentro de huéspedes seguida
por la expresión de la D-pantolactona hidrolasa en
los mismos. De este modo, de acuerdo con la presente invención, se
proveen los recombinantes (transformantes) o transfectantes que
están dotados con la capacidad para expresar sustancialmente la
misma; y el uso de los mis-
mos.
mos.
Otro aspecto de la presente invención también se
relaciona con ácidos nucleicos, tal como ADN y ARN, que permiten la
expresión en células huésped eucariotas o procariotas, tales como
células huésped Escherichia coli de
(1) proteínas que tienen actividad de
D-pantolactona hidrolasa o sales de las mismas;
(2) proteínas caracterizadas por tener una
actividad sustancialmente equivalente a la misma o sales de las
mismas; o
(3) polipéptidos que tienen toda o al menos una
parte de una proteína D-pantolactona hidrolasa o
sal de la misma (de más preferencia proteína
D-pantolactona hidrolasa originada en Fusarium
oxysporum) y que tienen la actividad sustancialmente equivalente
o la conformación estructural primaria sustancialmente igual.
Adicionalmente, tal ácido nucleico,
particularmente ADN, puede ser:
(a) una secuencia capaz de codificar la secuencia
de aminoácidos de SEC ID Nº:1 o una secuencia complementaria de la
misma;
(b) una secuencia capaz de hibridar con dicha
secuencia de ADN o un fragmento de la misma; y
(c) una secuencia que tiene un código degenerado
capaz de hibridar con la secuencia (a) o (b).
Las características de la presente invención
residen en células huésped eucariotas o procariotas, tales como
células huésped Escherichia coli, transformadas o
transfectadas con tal ácido nucleico, que están dotadas con la
capacidad de expresar dicho polipéptido de la presente
invención.
También es posible, de acuerdo con la presente
invención, obtener un microorganismo en el que su capacidad para
producir D-pantolactona hidrolasa es modificada por
la introducción de
(i) ADN que codifica una proteína que tiene una
actividad D-pantolactona hidrolasa o una proteína
que tiene la actividad sustancialmente equivalente a la misma o
(ii) ADN, tal como un vector, que contiene dicho
ADN, dentro de dicho microorganismo en una manera expresable. Dichos
microorganismos con capacidad de producir
D-pantolactona hidrolasa pueden incluir
microorganismos que pertenecen a un miembro seleccionado del grupo
constituido por el género: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella,
Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium,
Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora,
Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium, y
Arthroderma. Ejemplos de dichos microorganismos son
Fusarium oxysporum IFO 5942, Fusarium semitectam IFO
30200, Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561, Gibberella
fujikuroi IFO 6349, Aspergillus awamori IFO 4033,
Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus oryzae IFO
4706, Volutella buxi IFO 6003, Gliocladium
catenulatum IFO 6121, Eurotium chevalieri IFO 4334,
Nectria elegans IFO 7187, Schizophyllum commune IFO
4928, Myrothecium roridum IFO 9531, Neurospora crassa
IFO 6067, Acremonium fusidioides IFO 6813, Tuberculina
persicina IFO 6464, Absidia lichtheimi IFO 4009,
Sporothrix schenckii IFO 5983, Verticillium
malthousei IFO 6624, Arthroderma uncinatum IFO
7865,
etc.
etc.
La transformación puede incluir técnicas en las
que los protoplastos preparados con el uso de enzimas líticas de la
pared celular adecuadas son puestas en contacto con el ADN en
presencia de cloruro de calcio, polietilenglicol, etc.; técnicas de
electroporación (ver: por ejemplo, E. Neumann y col., EMBO J, Vol.
1, pp. 841 (1982), etc.); técnicas de microinyección; utilización de
procedimientos con pistola de genes; etc.
Las enzimas pueden ser aisladas y preparadas por
técnicas de purificación desde varios materiales, tales como
materiales enzimáticos producidos que incluyen medios de cultivo de
crecimiento celular, células de cultivo lisadas, células
transformadas, etc. La purificación puede incluir procedimientos
conocidos en la técnica, incluyendo el "salting out" tal como
la precipitación con sulfato de amonio; filtración con gel usando
Sephadex o similar; usando técnicas de cromatografía de intercambio
iónico, por ejemplo, un vehículo con un grupo dietilaminoetilo o un
grupo carboximetilo; usando técnicas de cromatografía hidrófoba, por
ejemplo, un vehículo con grupos hidrófobos incluyendo un grupo
butilo, un grupo octilo, un grupo fenilo, etc.; técnica de
cromatografía con gel pigmentado; técnica de electroforesis;
diálisis; ultrafiltración; técnica de cromatografía de afinidad;
técnica de cromatografía líquida de alta performance; etc..
Cuando la enzima es obtenida como un cuerpo de
inclusión, puede ser sometida a un tratamiento de solubilización
usando, por ejemplo, un agente desnaturalizante, tal como
clorhidrato de guanidina y urea, y, si es necesario, en presencia
de un agente reductor, como el 2-mercaptoetanol y
ditiotreitol, con lo cual es producida una enzima en la forma
activada.
Para materiales enzimáticos, pueden ser usadas
células productoras de enzimas per se. Las enzimas
inmovilizadas pueden incluir productos preparados por inmovilización
de enzimas o células productoras de enzimas de acuerdo con técnicas
conocidas en la materia. La inmovilización puede llevarse a cabo por
técnicas de unión, tales como un procedimiento covalente y un
procedimiento de adsorción, un procedimiento de unión cruzada, un
encapsulamiento, etc. La inmovilización puede también llevarse a
cabo usando un agente condensador como el glutaraldehído,
diisocianato de hexametileno y diisotiocianato de hexametileno si es
necesario. Adicionalmente, pueden ser ejemplificadas técnicas con
monómeros en las que los monómeros son gelificados en una
polimerización, técnicas con prepolímeros en las que las moléculas
de mayor tamaño que los monómeros convencionales son polimerizadas,
técnicas con polímero en las que los polímeros son gelificados,
etc.. Pueden incluirse una inmovilización usando poliacrilamida, una
inmovilización usando polímeros naturales como ácido algínico,
colágeno, gelatina, agar y \kappa carragenina, una inmovilización
usando polímeros sintéticos como resinas de fotocurado y polímeros
de uretano, etc.. Es posible llevar a cabo la resolución óptica de
los compuestos lactona por una hidrólisis asimétrica enzimática
usando una lactona hidrolasa (como una hidrólisis
D-pantolactona usando un cultivo de microorganismos
y enzimas), así como el tratamiento de los productos obtenidos de la
misma manera que se describe en Unexamide Japanese Patent
Publication ( KOKAI TOKKYO) Nº Hei 3-65.198 y Hei
4-144.681.
Por ejemplo, los microorganismos transformados
(transformantes) así obtenidos son sometidos a cultivo en agitación
en un medio líquido. Las células cultivadas resultantes son
recolectadas y se les agrega una solución acuosa de
D,L-pantolactona (concentraciones: 2 a 60%). Se hace
reaccionar la mezcla a una temperatura de entre 10 y 40ºC durante
varias horas hasta un día mientras se ajusta el pH de 6 a 8. Una vez
completada la reacción, las células son separadas y se separa de la
solución de reacción la L-pantolactona sin
reaccionar extrayéndola con un solvente orgánico (de preferencia un
éster como acetato de etilo, un hidrocarburo aromático como el
benceno o un hidrocarburo halogenado como el cloroformo). El ácido
D-pantóico remanente en la capa acuosa es calentado
bajo condición ácida con ácido clorhídrico para producir una
lactonación seguida de extracción con los solventes orgánicos antes
mencionados con lo que se obtiene la D-pantolactona
resultante. Como tal, las células procesadas (células secadas,
células inmovilizadas, etc.) de los microorganismos transformados o
encimas y encimas inmovilizadas obtenidas de las células
transformadas pueden ser también usadas de la misma manera.
Como resultado de la utilización de varias formas
de realización de la presente invención como han sido mencionadas
anteriormente, es posible ahora proveer de varios medios técnicos,
tales como medios valiosos o útiles para estudios sintéticos que
conciernen una resolución óptica de compuestos lactona por una
hidrólisis asimétrica enzimática usando una lactona hidrolasa (por
ejemplo, D-pantolactona hidrolasa) así como medios
aplicables a otros usos. La presente invención será ilustrada más
específicamente por medio de los siguientes ejemplos aunque debe
entenderse que la presente invención no está limitada a tales
ejemplos y son posibles varias formas de realización dentro del
alcance de esta memoria.
Por cierto, cuando los nucleótidos (bases) y
aminoácidos están indicados por medio de abreviaturas en esta
memoria y en los gráficos, dependen de "IUPAC-UIB
Commission on Biochemical Nomenclature" o de los significados de
los términos que son comúnmente usados en la técnica. Cuando están
presentes isómeros ópticos en aminoácidos, se refiere a un
L-isómero a menos que se especifique lo
contrario.
El transformante Escherichia coli,
designado JM109 (EJM-ESE-1) que
tiene un vector recombinante (PFLC40E) dentro del cual es integrado
el gen de la enzima D-pantolactona hidrolasa y
obtenido en el Ejemplo 1 mencionado en anteriormente en este
documento ha sido depositado como 30 de Agosto de 1995 (fecha del
depósito original) en el National Institute of Bioscience and Human
Techonolgy (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry, Japan, ubicado en
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, IBARAKI (código postal: 305), JAPÓN, y
se le ha asignado el Número de Acceso FERM P-15141.
El depósito original del transformante E. coli JM109
(EJM-ESE-1) ha sido transferido bajo
el tratado de Budapest por un requerimiento con fecha 28 de Agosto
de 1996 y está en depósito con Número de Acceso FERM
BP-5638 bajo los términos del Tratado de Budapest en
NIBH.
A continuación se proveen ejemplos de la presente
invención con propósito ilustrativo y que no limitan el alcance de
la presente invención. A la luz de la presente descripción,
numerosas formas de realización dentro del alcance de las
reivindicaciones resultarán evidentes para aquellos expertos en la
técnica.
Se disolvió una muestra de
D-pantolactona hidrolasa liofilizada (14,3 nmol;
peso molecular de la subunidad: 60.000) preparada de acuerdo con el
Ejemplo 1 de la Publicación de la Patente Japonesa no Revisada
(KOKAI TOKKIO) Nº Hei 4-144.681 en 44 \mul de
Tris-HCl 50 mM (pH: 9,0) que contiene urea 8 M y se
desnaturalizó a 37ºC durante 1 hora. Se agregaron a esta solución 44
\mul de Tris-HCl 50 mM (pH: 9) resultando como
consecuencia una concentración de urea 4 M. Luego se agregaron 12
\mul (0,144 nmol; E/S = 1/100) de endopeptidasa lítica (Wako Pure
Chemicals, Japón) 12 nmol/ml y se llevó a cabo una digestión a 30ºC
durante 12 horas. El péptido digerido resultante fue recolectado por
una columna de fase inversa (Nakarai Tesuku, Japón) y se llevó a
cabo el análisis de la secuencia de aminoácidos usando un
Secuenciador de Proteínas 477A (ABI, EE UU).
| Columna: | Cosmosil 5C18-AR (4,6 X 250 mm) |
| Velocidad de Flujo: | 1 ml/min |
| Temperatura: | 35ºC |
| Longitud de Onda de Detección: | 210 nm |
| Solución de Elución: | A, TFA 0,1% (TFA: ácido trifluoroacético) |
| B, TFA 0,1%/CH_{3}CN 80% | |
| Condiciones de Elución: | Elución en gradiente de A \rightarrow B (15%/min) |
El resultado de la secuenciación de aminoácidos
fue como se muestra en las Figuras 1 y 2.
Las células cultivadas en anafase de una fase de
crecimiento logarítmico fueron recolectadas por medio de filtración
en vacío. Se pusieron las células en nitrógeno líquido y finalmente
se las lisó usando un Mezclador Waring. Las mezclas celulares fueron
transferidas a un mortero y agrupadas con la adición de nitrógeno
líquido. Este producto fue suspendido en una solución 2 x CTAB (CTAB
2% (CTAB: bromuro de cetiltrimetilamonio; Sigma, EEUU),
Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0), NaCl 1,4 y PVP 1% (PVP:
polivinilpirrolidona; Sigma, EEUU)) y mantenido a 70ºC e incubado a
65ºC durante 3-4 horas. El sobrenadante líquido
obtenido por centrifugación fue tratado sucesivamente con fenol,
fenol/cloroformo y cloroformo y la solución resultante fue luego
tratada con el mismo volumen de isopropanol para precipitar el ADN.
Esta pasta de ADN fue lavada con etanol 70%, secada con aire y
disuelta en un tampón TE (Tris 10 mM y EDTA 1 mM; pH 7,8). Se
descompuso el ARN con ribonucleasa A y ribonucleasa T1. Luego el
producto ADN fue tratado sucesivamente con fenol, fenol/cloroformo y
cloroformo para remover las proteínas del mismo. El producto
resultante fue tratado con el mismo volumen de isopropanol para
precipitar el ADN. Este ADN fue lavado con etanol 70%, secado con
aire y disuelto en un tampón TE para obtener la muestra
genómica.
En base a la información de las secuencias de
aminoácidos (Figuras 1 y 2) de los péptidos internos de
D-pantolactona hidrolasa fueron sintetizados un
cebador con sentido que corresponde a una cadena con sentido que
codifica la secuencia de aminoácidos N-terminal y un
cebador sin sentido que corresponde a una cadena sin sentido para la
secuencia de péptidos interna (Figura 3).
Se llevó a cabo una PCR bajo las siguientes
condiciones, como molde, una muestra de ADN genómico de
D-pantolactona hidrolasa:
La PCR fue llevada a cabo mediante las técnicas
mencionadas en la materia, por ejemplo, en R. Saiki y col., Science,
Vol. 230, pág. 1350 (1985); R. Saiki y col., Science, Vol. 239,
pág. 487 (1988); PCR Technology, Stockton Press (1989); etc..
Como resultado de la PCR se obtuvieron fragmentos
de ADN amplificados de alrededor de 1 kb.
| ADN Genómico: | 2,5 \mug |
| Cebador con sentido: | 250 pmol (cfr. Figura 3) |
| Cebador sin sentido: | 250 pmol (cfr. Figura 3) |
| dNTP (2 mM): | 5 \mul |
| Tampón PolimerasaTth (x 10): | 5 \mul |
| ADN Polimerasa Tth (Toyobo, Japón): | 3 unidades |
| H_{2}O: | |
| Total: | 50 \mul |
El ciclo para la amplificación fue repetido 30
veces, incluye 92ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 73ºC
durante 3 minutos.
El resultado de los fragmentos de ADN
amplificados fue sometido a secuenciación y la secuencia de ADN
descrita fue decodificada para una secuencia de aminoácidos por lo
que la porción que corresponde a la secuencia parcial de aminoácidos
de péptido interno de D-pantolactona hidrolasa fue
encontrada dentro de la secuencia de aminoácidos decodificada.
Las células cultivadas fueron recolectadas en
profase de una fase de crecimiento logarítmico, inmediatamente
fueron congeladas con nitrógeno líquido, lisadas y sometidas a una
AGPC (Método Tiocianato de Guanidinio Ácido Fenol Cloroformo); ver,
por ej., Jikken Igaku, Vol. 15, pág. 99 (1991)) para extraer el ARN
total. El ARN total resultante fue sometido a una columna de oligo
dT-celulosa (Pharmacia) para su purificación para
obtener una fracción de ARNm.
El ARNm resultante fue usado como modelo para la
síntesis de ADNc mediante un módulo de unión adaptador rápido de
ADNc (módulo de síntesis de ADNc RPN 1256, 1994; Amersham
International PLC) y el ADNc fue usado para la construcción de
genotecas de ADNc.
Las genotecas de ADNc fueron infectadas en
células huésped Escherichia coli y se seleccionaron las
placas positivas mediante una hibridación de placa. En la
hibridación de placa, las sondas usadas para la selección fueron
preparadas mediante el uso de alrededor 1 kb de fragmentos que
contenían el gen de D-pantolactona hidrolasa de
Fusarium oxisporum y etiquetando fragmentos de alrededor de 1
kb de acuerdo con un procedimiento multiprime. El clon positivo
resultante fue secuenciado y la secuencia de ADN revelada fue
decodificada a una secuencia de aminoácidos mediante la cual se
encontró que la longitud completa del gen de
D-pantolactona hidrolasa anteriormente mencionado
fue clonado con éxito.
Como tal, el ADN aislado y secuenciado tiene una
secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº:2. La secuencia que muestra
una homología con la secuencia de aminoácidos representada por SEC
ID Nº:1 codificada mediante esta secuencia de nucleótidos no está
presente en el Banco de Datos de la Secuencia de Proteínas de NBRF
(National Biomedical Research Foundation). De esta manera, se ha
encontrado que el ADN que tiene esta secuencia de nucleótidos es
completamente nuevo.
Se descubrió que una parte de la región
N-terminal faltaba en el ADNc donde los nucleótidos
fueron secuenciados y no existía codón de iniciación en el mismo.
Por lo tanto, se incorporó artificialmente una secuencia de
iniciación dentro del ADNc mediante una técnica de PCR para
construir un vector que exprese el gen (PFLC40E).
Los cebadores oligonucleótidos con sentido y sin
sentido que tienen los sitios de enzimas de restricción como se
muestra en la Figura 4 fueron sintetizados. Se llevó a cabo una PCR
utilizando aquellos cebadores bajo las siguientes condiciones:
La PCR fue llevada a cabo por las técnicas que se
mencionan en la técnica, por ejemplo, en R. Saiki, y col., Science
Vol. 230, pág. 1350 (1985); R. Saiki, y col., Science Vol. 239,
pág. 487 (1988); PCR Technology, Stockton Press (1989).
| ADN Total (ADNc): | 10 \mug |
| Cebador con sentido: | 0,1 nmol (cfr. Figura 4) |
| Cebador sin sentido: | 0,1 nmol (cfr. Figura 4) |
| dNTP (2 mM): | 10 \mul |
| Tampón PolimerasaTth (x 10): | 10 \mul |
| ADN Polimerasa Tth (Toyobo, Japón): | 4 unidades |
| H_{2}O: | |
| Total: | 100 \mul |
El ciclo para la amplificación fue repetido 30
veces, incluyendo 94ºC durante 1 minuto y 55ºC durante 1 minutos y
75ºC durante 3 minutos.
Los productos de PCR preparados como tal tenían
los sitios de cada enzima de restricción EcoRI y XbaI en ambos
extremos. Por lo tanto, cada uno de ellos fue tratado con EcoRI
(Takara Shuzo, Japón) y XbaI (Takara Shuzo, Japón) seguido por una
unión con puC18 (Takara Ligation Kit; Takar Shuzo, Japón) como
resultado de esto se construyó el vector de expresión (PFLC40E).
Luego, dicho vector fue transfectado en células
competentes de E. coli JM 109 de acuerdo con una técnica
como se mencionó en "Molecular Cloning", Second Edition, 1989,
editado por J. Sambrook, y col., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, para transformar células huésped. Los transformantes a los
que se apunta fueron seleccionados en un medio 2 x YT (1,5%
triptona, 1% de extracto de levadura y 0,5% NaCl) que contiene 50
mg/litro de ampicilina. La transformación se efectuó de acuerdo con
una técnica de cloruro de calcio.
La E. coli transformante preparada como
tal fue precultivada en un tubo de ensayo que contenía 10 ml del
anteriormente mencionado medio 2 x YT que contenía 50 mg/litro de
ampicilina y entonces la solución precultivada resultante (100
\mul en total) fue usada como células seminales para controlar el
tiempo de cultivo, la temperatura de cultivo y períodos para
agregar
isopropil-\beta-tiogalacto-piranósido
(IPTG) en 100 ml de los principales caldos de cultivo que tenían
la misma composición que el caldo de precultivo.
Los resultados del cultivo se muestran en la
Tabla 1.
Luego del cultivo, las células recogidas
resultantes fueron lisadas mediante ultrasonido y centrifugadas para
proporcionar el sobrenadante. Se midió la actividad de
D-pantolactona hidrolasa en el sobrenadante
obtenido.
La actividad específica fue de 2,25 U/mg en
condiciones óptimas. Se analizaron las actividades enzimáticas de
las proteínas recombinantes en función de su actividad
D-pantolactona hidrolasa bajo las condiciones
siguientes:
La actividad enzimática capaz de hidrolizar 1
\mumol de D-pantolactona por minuto fue definida
como una unidad (U). Para 200 \mul de solución al 10% de
D-pantolactona en 0,5 M de tampón PIPES (pH 7,0) se
agregaron 50 \mul de una solución enzimática y se hizo reaccionar
la mezcla a 30ºC durante 120 minutos seguido por la adición de 250
\mul de EDTA 2 mM en metanol para frenar la reacción. Después de
haber completado la reacción, la mezcla de reacción líquida fue
sometida a HPLC (Nucleosil 5C_{18} 4,6 x 150 mm; eluyente: metanol
al 10%; velocidad de flujo: 1 ml/minuto; longitud de onda de
detección: 230 nm) para determinar el % de hidrólisis. Por ejemplo,
donde el % de hidrólisis es 1%, la actividad enzimática/ml de la
solución enzimática corresponde a 1,6 x 10^{-2} U/ml.
El transformante E. coli JM109,
transformado con PFLC40E, fue cultivado en un medio 2 x YT. Se le
agregó IPTG para alcanzar una concentración final de 2 mM.
| Tiempo para suministrar IPTG | Tiempo de Cultivo | Temperatura de Cultivo | Actividad Específica |
| (h) | (h) | (ºC) | (unidades/mg) |
| 0 (a) | 6 | 28 | 0,86 |
| 0 (a) | 12 | 28 | 1,94 |
| 4 (b) | 7 | 28 | 1,33 |
| 4 (b) | 12 | 28 | 2,25 |
| Tiempo para suministrar IPTG | Tiempo de Cultivo | Temperatura de Cultivo | Actividad Específica |
| (h) | (h) | (ºC) | (unidades/mg) |
| 0 (a) | 6 | 37 | 1,05 |
| 0 (a) | 12 | 37 | 1,73 |
| 4 (b) | 7 | 37 | 1,31 |
| 4 (b) | 12 | 37 | 1,67 |
| (a): se agregó IPTG al medio 2 x YT junto con el comienzo del cultivo. | |||
| (b): se agregó IPTG al medio 2 x YT después de cuatro horas del comienzo del cultivo. |
Como resultado de un SDS-PAGE, se
detectó una banda profunda con un peso molecular esperado para una
fracción insoluble de precipitado centrifugado. La banda fue
sometida a transferencia y la muestra fue estudiada en función de
una secuencia de aminoácidos N-terminal mediante una
técnica de degradación de Edman por la cual su secuencia de
aminoácidos N-terminal se encontró que era idéntica
a la de la D-pantolactona hidrolasa.
De acuerdo con esto, es probable que, aunque la
D-pantolactona hidrolasa recombinante estaba en
parte expresada como una forma soluble en este sistema de expresión
de E. coli para expresar la D-pantolactona
hidrolasa ADNc, la mayoría de la D-pantolactona
hidrolasa recombinante está expresada como un cuerpo de
inclusión.
La Escherichia coli transformante,
designada JM109 (EJM-ESE-1), que
tiene un vector recombinante (PFLC40E) dentro del cual fue integrado
el anteriormente mencionado gen de la enzima de la
D-pantolactona hidrolasa ha sido depositado y
almacenado en el National Institute of Bioscience and Human
Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry, Japón, ubicado en
1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, IBARAKI (código postal: 305), Japón. Al
E. coli transformante JM109
(EJM-ESE-1) le ha sido asignado el
Número de Acceso FERM BP-5638 por NIBH. El 28 de
Agosto de 1996 se solicitó un pedido de transferencia de depósito
original (Número de Acceso FERM P-15141 depositado
el 30 de Agosto de 1995) a otro bajo el Tratado de Budapest.
La presente invención describe la codificación de
estructuras genéticas para la D-pantolactona
hidrolasa natural (tal como la D-pantolactona
hidrolasa natural que se origina en Fusarium oxysporum) o
para proteínas que tienen una actividad sustancialmente equivalente
a la anteriormente mencionada. Así, pueden esperarse desarrollos
significativos en las aplicaciones, incluyendo los usos de células
huésped que son transformadas con ADN que contiene la codificación
de la secuencia de nucleótidos para dicha proteína, procedimientos
para la preparación de dicha proteína usando dichas células huésped
y procedimientos de fabricación para producir
D-pantolactona usando dichas proteínas y células
huésped. Además, es posible alcanzar un incremento significativo en
la actividad enzimática mediante la modificación de la
D-pantolactona hidrolasa per se.
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 380
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1140
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum IFO 5942
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
Claims (7)
1. Un péptido recombinante que tiene actividad de
D-pantolactona hidrolasa que tiene una secuencia de
aminoácidos representada por SEC ID Nº:1 o una sal del mismo, y que
puede ser obtenido mediante la expresión de
- (i)
- una secuencia de ADN exógeno que codifica dicho péptido en células huésped procariotas, o
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico exógeno de SEC ID Nº:2 en células huésped eucariotas.
2. El péptido recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, originándose dicho péptido recombinante que tiene
una actividad de D-pantolactona hidrolasa en un
microorganismo que pertenece a un miembro seleccionado de los
géneros: Fusarium, Cylindocarpon, Gibberella, Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Erotium, Nectoria,
Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina,
Absidia, Sporothrix, Verticillium y Arthroderma.
3. El péptido recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, originándose dicho péptido recombinante que tiene
actividad de D-pantolactona hidrolasa en el género
Fusarium.
4. El péptido recombinante de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un péptido de SEC
ID Nº:1 del cual han sido eliminados uno o más aminoácidos, o una
sal del mismo.
5. Una célula huésped procariota o eucariota
transformada que alberga un vector que tiene un ácido nucleico que
codifica un péptido como el definido en las reivindicaciones 1 a
4.
6. Un procedimiento para producir un péptido
recombinante como el definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 que comprende células huésped eucariotas o
procariotas como las definidas en la reivindicación 5.
7. Un procedimiento para producir
D-pantolactona, que comprende la realización de una
resolución óptica de D, L-pantolactona en presencia
de (i) un péptido recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 o (ii) la célula huésped procariota o
eucariota transformada de acuerdo con la reivindicación 5.
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