DE69634815T2

DE69634815T2 - D-pantolactonhydrolase und dafür kodierendes gen

Info

Publication number: DE69634815T2
Application number: DE69634815T
Authority: DE
Inventors: Keiji Takaoka-shi SAKAMOTO; Hideaki Kyoto-shi Yamada; Sakayu Kyoto-shi Shimizu; Michihiko Kyoto-shi KOBAYASHI
Original assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Current assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2016-09-14
Also published as: EP0794251B1; CN1121497C; ES2242968T3; MX221102B; US6406898B1; CA2204743C; US6794171B2; JP3830165B2; DE69634815D1; HU222434B1; EP0794251A4; HUP9701904A2; CN1166182A; AU1810197A; WO1997010341A1; RU2218405C2; CA2204743A1; EP0794251A1; MX9703475A; US20030124697A1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Enzym, das für die Racematspaltung von D,L-Pantolacton durch einen D-selektiven asymmetrischen Hydrolysevorgang geeignet ist, und auch auf ein Gen, das dasselbe codiert. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Proteine mit einer natürlichen D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität, die von Fusarium oxysporum erzeugt werden, oder einer Aktivität, die dieser im Wesentlichen äquivalent ist, und auf Gene, die dafür codieren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für das Protein codiert; auf Wirtszellen, die mit der DNA transformiert oder transfiziert sind; auf ein Verfahren zur Herstellung des D-Pantolacton-Hydrolyse-Proteins durch Verwendung dieser Wirtszellen; und auf die Verwendung solcher Proteine und Wirtszellen.
Technischer Hintergrund
D-Pantolacton ist als Zwischenstufe bei der Herstellung von D-Panthothensäure und Panthetin bekannt, die als Vitamine von medizinischer oder physiologischer Bedeutung von Nutzen sind. D-Pantolacton wurde bisher durch Racematspaltung von chemisch synthetisiertem D,L-Pantolacton hergestellt. Ein solches Verfahren hat jedoch insofern Nachteile, als es die Verwendung von teuren Racematspaltungsreagentien, wie Chinin oder Brucin, erfordert und weiterhin als die Gewinnung von D-Pantolacton nicht leicht ist. Um solche Probleme zu lösen, haben die Erfinder bereits in den Japanischen Offenlegungsschriften Nr. Hei 03-65,198 und Hei 04-144,681 ein Racematspaltungsverfahren durch enzymatische asymmetrische Hydrolyse von D,L-Pantolacton vorgeschlagen.
Es handelt sich also um ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, wobei das D-Pantolacton in D,L-Pantolacton-Gemischen selektiv einer asymmetrischen Hydrolyse unter Verwendung eines Mikroorganismus, der eine lactonhydrolysierende Aktivität besitzt, unterzogen wird, wobei D-Pantoinsäure entsteht, die dann abgetrennt und in D-Pantolacton umgewandelt wird, wobei der Mikroorganismus ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mikroorganismen besteht, die zu den Gattungen Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium und Arthroderma gehören. Es handelt sich außerdem um ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton-Hydrolyse, das die Verwendung eines Mikroorganismus umfasst, der zu der oben genannten Gattung gehört.
Man kann jedoch nicht immer sagen, dass viele der oben offenbarten Mikroorganismen eine hydrolysierende Aktivität in einem solchen Maße besitzen, dass sie unmittelbar in der Industrie anwendbar sind. Indem man die enzymatische Aktivität der Mikroorganismen auf ein industriell anwendbares Niveau erhöht, werden weiterhin mühsame und schwierige, zeitaufwändige Untersuchungen benötigt, um Bedingungen für das Wachstum von Zellen, Bedingungen für die Induktion der Enzymaktivität usw. herauszufinden. Ein anderes Problem besteht darin, dass diese Mikroorganismen echte Pilze sind und daher ihre Zellkörper aus verschieden geformten Hyphen bestehen, und im Vergleich zu Bakterien, die eine einzige Form haben, ist es erheblich schwierig, immobilisierte Zellen herzustellen, die für die industrielle Produktion vorteilhaft sind. Noch ein weiteres Problem besteht darin, dass die Ausbeute des Enzyms bei seiner Reinigung aus den Zellen, was D-Pantolacton-Hydrolase betrifft, sehr schlecht ist.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese Probleme zu lösen, und auch darin, Mittel bereitzustellen, die eine erhebliche Erhöhung der enzymatischen Aktivität ermöglichen, zum Beispiel Mittel, um die D-Pantolacton-Hydrolase an sich zu modifizieren und zu verbessern.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht also darin, Folgendes zu offenbaren und bereitzustellen: ein neues Gen, das für ein Protein codiert, das entweder eine natürlich vorkommende D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität (wie eine Fusarium-oxysporum-D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität) oder eine zu dieser im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweist; eine Wirtszelle, die mit DNA transformiert ist, welche eine für das Protein codierende Nucleotidsequenz enthält; ein Verfahren zur Herstellung des Proteins durch Verwendung dieser Wirtszelle; und Verwendungen solcher Proteine und Wirtszellen.
Die vorliegende Erfindung, die auf ein Gen, das für D-Pantolacton-Hydrolase codiert, die aus den oben genannten Mikroorganismen isoliert wird und die Fähigkeit besitzt, ein Lacton zu hydrolysieren, und ein System mit einer hohen Effizienz und reichen Produktivität zur Herstellung von D-Pantolacton, das erfolgreich durch die Verwendung des als solchen isolierten D-Pantolacton-Hydrolase-Gens entwickelt wird, gerichtet ist, löst nicht nur die oben genannten verschiedenen Probleme, sondern trägt auch stark zur Entwicklung von Enzymen, die die Fähigkeit, ein Lacton zu hydrolysieren, zusammen mit neuen Funktionen besitzen, und zur Entwicklung von Techniken unter Verwendung des neuen Enzyms bei. Insbesondere ist es den Erfindern gelungen, ein neues Gen zu isolieren, das für eine Hydrolase mit einer D-Pantolacton-hydrolysierenden Fähigkeit codiert und von Mikroorganismen der Gattung Fusarium (wie Fusarium oxysporum) abgeleitet ist, das die D-Pantolacton-Hydrolase erzeugt, wodurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt wurde.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf:

(i) ein Protein mit einer natürlichen D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität oder einer Aktivität, die dieser im Wesentlichen äquivalent ist, oder ein Salz davon; oder
(ii) ein Protein mit einer primären strukturellen Konformation, die dazu im Wesentlichen äquivalent ist, oder ein Salz davon;
(iii) ein charakteristisches partielles Peptid von diesem Protein oder ein Salz davon;
(iv) Gene, die DNA und RNA, die für das Protein codieren;
(v) Vektoren oder Plasmide, die das Gen so enthalten, dass es in einer Gen-Rekombinationstechnik operabel ist;
(vi) Wirtszellen, die mit einem solchen Vektor transformiert sind, usw.;
(vii) ein Verfahren zur Herstellung des Proteins oder eines Salzes davon, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle;
(viii) ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, das eine Racematspaltung von D,L-Pantolacton mit einer solchen genmanipulierten Wirtszelle (Transformante), einem solchen rekombinanten Protein oder Salz davon usw. umfasst; und
(ix) ein Systemmittel, wie ein immobilisiertes Enzym, zur Herstellung von D-Pantolacton.

In der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes rekombinantes Protein eine D-Pantolacton-Hydrolase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einer zu dieser im Wesentlichen äquivalenten Aminosäuresequenz oder ein Salz davon.
Dementsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung:

(1) ein Protein mit einer natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität oder einer Aktivität, die dieser im Wesentlichen äquivalent ist, oder mit einer primären strukturellen Konformation, die dazu im Wesentlichen äquivalent ist, oder ein Salz davon;
(2) das Protein gemäß dem obigen Punkt (1), wobei das Protein mit der natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität auf einen Mikroorganismus zurückgeht, der zu einem Vertreter gehört, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium und Arthroderma besteht;
(3) das Protein gemäß dem obigen Punkt (1), wobei das Protein mit der natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität auf die Gattung Fusarium zurückgeht;
(4) das Protein gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (3), bei dem es sich um eine D-Pantolacton-Hydrolase oder ein Salz davon mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, oder einer zu dieser im Wesentlichen äquivalenten Aminosäuresequenz handelt;
(5) das Protein gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (4), das hergestellt wird, indem man eine exogene DNA-Sequenz in prokaryontischen Wirtszellen exprimiert;
(6) das Protein gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (5), das eine durch SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder im Wesentlichen diese Aminosäuresequenz hat;
(7) partielles Peptid des Proteins gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (6) oder ein Salz davon;
(8) Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die für das Protein oder das partielle Peptid davon gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7) codiert;
(9) Nucleinsäure gemäß dem obigen Punkt (8), die eine Nucleotidsequenz hat, die einen Teil aufweist, der einem offenen Leseraster in der Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 2 entspricht, oder eine Nucleotidsequenz mit einer dazu im Wesentlichen äquivalenten Aktivität hat;
(10) Vektor, der die Nucleinsäure gemäß dem obigen Punkt (8) oder (9) trägt;
(11) Transformante, die den Vektor gemäß dem obigen Punkt (10) beherbergt;
(12) Verfahren zur Herstellung des Proteins oder partiellen Peptids davon gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7), das eine D-Pantolacton-Hydrolase oder ein Salz davon beinhaltet, umfassend: Kultivieren der Transformante gemäß dem obigen Punkt (11) in einem Nährmedium, das zum Züchten der Transformanten geeignet ist, wobei das Protein oder partielle Peptid davon gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7), das eine D-Pantolacton-Hydrolase oder ein Salz davon beinhaltet, als rekombinantes Protein entsteht; und
(13) Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, umfassend: das Durchführen einer Racematspaltung mit D,L-Pantolacton in Gegenwart von:
(i) dem Protein oder partiellen Peptid davon gemäß einem der obigen Punkte (1) bis (7); oder
(ii) der Transformante gemäß dem obigen Punkt (11).

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine D-Pantolacton-Hydrolase oder ein Salz davon mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 bereit.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Aminosäuresequenzen, die man erhält, indem man Verdauungspeptide von D-Pantolacton-Hydrolase sequenziert.
2 zeigt Stellen, die jeweils einem Verdauungspeptid von D-Pantolacton-Hydrolase entsprechen, auf der Aminosäuresequenz, für die die isolierte cDNA codiert.
3 zeigt die Strukturen von Primern, die bei der PCR angewendet werden, wobei eine genomische DNA für D-Pantolacton-Hydrolase als Matrize verwendet wird.
4 zeigt die Strukturen von Primern, die bei der PCR zum Aufbau eines Vektors angewendet werden, der zum Exprimieren von rekombinanter D-Pantolacton-Hydrolase verwendet wird.
5 zeigt die Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz von D-Pantolacton-Hydrolase.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit: Techniken wie das Klonieren eines Gens, das für natürlich vorkommende D-Pantolacton-Hydrolase (wie natürliche D-Pantolacton-Hydrolase, die von Fusarium oxysporum stammt (oder darauf zurückgeht)) oder ein Protein mit einer dazu im Wesentlichen äquivalenten Aktivität codiert, die Identifizierung dieses Gens und die Bestimmung der charakteristischen Sequenz (Sequenzieren) des Gens sowie die Rekombination des Gens mit einem Expressionsvektor; die Herstellung und Kultur/Zucht von Wirtszellen, die mit DNA transformiert sind, die eine Nucleotidsequenz enthält, welche für das Protein codiert (Transformanten); die Herstellung des Proteins unter Verwendung der Wirtszelle; und die Verwendung solcher Proteine und Wirtszellen.
Im Folgenden sind die Techniken und Arbeitsschritte gemäß der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch verschiedene Mittel zur Verwendung von Genen, die für die oben genannte D-Pantolacton-Hydrolase codieren, bereit und stellt weiterhin ein D-Pantolacton-Hydrolase-Produktionssystem mit einer guten Effizienz und einer ausgezeichneteren Produktivität bereit, wobei das isolierte D-Pantolacton-Hydrolyse-Gen verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Protein mit einer natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolyse-Aktivität oder einer Aktivität, die dieser im Wesentlichen äquivalent ist, oder ein Salz davon oder auf ein Protein mit einer primären strukturellen Konformation, die dazu im Wesentlichen äquivalent ist, oder ein Salz davon; ein charakteristisches partielles Peptid von diesem Protein oder ein Salz davon; ein Gen, wie DNA und RNA, das für das Protein oder Peptid codiert; ein Vektor oder Plasmid (oder Überträger), der bzw. das das Gen so enthält, dass es in einer Gen-Rekombinationstechnik operabel ist; eine Wirtszelle, die mit einem solchen Vektor transformiert ist, usw.; ein Verfahren zur Herstellung des Proteins oder eines Salzes davon, das das Kultivieren der Wirtszelle umfasst; ein Verfahren zum Synthetisieren von D-Pantolacton, das eine Racematspaltung von D,L-Pantolacton mit einer solchen genmanipulierten Wirtszelle oder mit einem rekombinanten Protein oder einem Salz davon umfasst; und Systeme und Mittel, wie immobilisierte Enzyme, zur Herstellung von D-Pantolacton.
In der vorliegenden Erfindung wird insbesondere D-Pantolacton-Hydrolase oder ein Salz davon, die bzw. das vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder eine dazu im Wesentlichen äquivalente Aminosäuresequenz umfasst, erläutert, aber die D-Pantolacton-Hydrolyse der vorliegenden Erfindung umfasst auch jedes Enzym, das eine D-Pantolacton-Hydrolysefähigkeit aufweist, solange es eine neue Aminosäuresequenz hat. "D-Pantolacton-Hydrolysefähigkeit" bezieht sich auf jede Fähigkeit, die in Bezug auf die Hydrolyse von D-Pantolacton dieselbe Qualität hat. Vorzugsweise umfasst. die D-Pantolacton-Hydrolyse der vorliegenden Erfindung alle Substanzen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder mit einer dazu im Wesentlichen äquivalenten Aminosäuresequenz und/oder im Wesentlichen derselben Aminosäuresequenz.
Das D-Pantolacton-Hydrolase-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch die folgenden Verfahren kloniert werden:
Es sei angemerkt, dass Gen-Rekombinationstechniken durchgeführt werden können zum Beispiel durch die Verfahren, die offenbart sind in T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989); Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) Hrsg., "Zoku-Seikagaku Jikken Kouza 1, Idensi Kenkyuho II (Lectures on Biochemical Experiments (Second Series; 1), Methods for Gene Study II)", Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1986); Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) Hrsg., "Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2, Kakusan III (Kumikae DNA Gijutsu) (New Lectures on Biochemical Experiments 2, Nucleic Acids III (Recombinant DNA Technology))", Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1992); R. Wu (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 68, Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 100 und 101, Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. (Hrsg.), "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 und 155, Academic Press, New York (1987), usw. sowie durch die Techniken, die in den dort zitierten Literaturstellen offenbart sind, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, oder im Wesentlichen durch dieselben Techniken, wie sie offenbart sind, oder durch modifizierte Techniken davon. Solche Techniken und Mittel können auch solche sein, die je nach dem Ziel der vorliegenden Erfindung ausgehend von herkömmlichen Techniken individuell modifiziert/verbessert sind.
1) Klonieren von partieller genomischer DNA von D-Pantolacton-Hydrolase
Kultivierte Fusarium-oxysporum-Zellen werden in herkömmlicher Weise aufgeschlossen und zentrifugiert, um chromosomale DNA zu isolieren, woraufhin eine Zersetzung und Entfernung von RNA erfolgt. DNA-Komponenten werden gereinigt, indem man Proteine daraus entfernt. Weitere Informationen zur Herstellung der Materialien, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, sind zum Beispiel in "Shokubutsu Biotechnology-Jikken Manual (Plant Biotechnology Experiment Manual)", Noson Bunkasha, Seite 252, offenbart, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Als Quelle für die DNA kann jeder Mikroorganismus, der zur Gattung Fusarium gehört und die Fähigkeit hat, D-Pantolacton-Hydrolase zu erzeugen, in geeigneter Weise verwendet werden. Beispiele für den Mikroorganismus, der zur Gattung Fusarium gehört und hier angewendet werden kann, sind Fusarium oxysporum IFO 5942, Fusarium semitectam IFO 30200 usw.
Ähnlich können auch andere Mikroorganismen, die zu einem Vertreter gehören, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium oder Arthroderma besteht, und die Fähigkeit haben, D-Pantolacton-Hydrolase zu erzeugen, als Quelle für die DNA verwendet werden. Beispiele für solche Mikroorganismen sind Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561, Gibberella fujikuroi IFO 6349, Aspergillus awamori IFO 4033, Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus oryzae IFO 4706, Volutella buxi IFO 6003, Gliocladium catenulatum IFO 6121, Eurotium chevalieri IFO 4334, Nectria elegans IFO 7187, Schizophyllum commune IFO 4928, Myrothecium roridum IFO 9531, Neurospora crassa IFO 6067, Acremonium fusidioides IFO 6813, Tuberculina persicina IFO 6464, Absidia lichtheimi IFO 4009, Sporothrix schenckii IFO 5983, Verticillium malthousei IFO 6624, Arthroderma uncinatum IFO 7865 usw., wobei "IFO" Zaidan-Hojin Hakko Kenkyusho (the Institute for Fermentation, Osaka; 17-85, Juso-hon-machi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan) bedeutet und jede Zahl danach für die Nummer im Katalog, der vom IFO herausgegeben wird, oder die vom IFO vergebene Zugriffsnummer steht.
2) Herstellung einer Sonde
Synthetische Oligonucleotidprimer werden gemäß Informationen über Aminosäuresequenzen, die das interne Peptid von D-Pantolacton-Hydrolase betreffen, hergestellt. Zum Beispiel können synthetische Oligonucleotidprimer gemäß Informationen über Aminosäuresequenzen, die das interne Peptid von reiner D-Pantolacton-Hydrolase betreffen, die aus dem Mikroorganismus erhalten wird, der aus den oben genannten ausgewählt ist und eine Fähigkeit zur Erzeugung von D-Pantolacton-Hydrolase hat, hergestellt werden. In einem typischen Fall werden degenerierte Primer usw. auf der Grundlage von Informationen über die Aminosäuresequenz von natürlichen D-Pantolacton-Hydrolase-Fragmenten entworfen und hergestellt. Die Herstellung von Primern kann mit Techniken durchgeführt werden, die in der Technik bekannt sind. Zum Beispiel können die Primer mittels eines Phosphodiesterverfahrens, eines Phosphotriesterverfahrens, eines Phosphoamiditverfahrens usw. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers hergestellt werden. Genauer gesagt, wird D-Pantolacton-Hydrolase aus den Zellen, die durch Kultivieren von Fusarium oxysporum IFO 5942 in einem Nährmedium erhalten wurden, gereinigt und gegebenenfalls mit einer Peptidase usw. fragmentiert, woraufhin die Informationen über eine Aminosäuresequenz des internen Peptids des Enzyms gesammelt werden. Anhand der Informationen über die als solche erhaltene Aminosäuresequenz werden bevorzugte synthetische Oligonucleotidprimer entworfen und hergestellt. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird unter Verwendung eines Paares dieser Primer durchgeführt, wobei eine genomische DNA für D-Pantolacton-Hydrolase als Matrize verwendet wird. Die PCR kann mit in der Technik bekannten Methoden oder mit Verfahren, die dazu im Wesentlichen äquivalent sind, oder mit modifizierten Techniken durchgeführt werden. Die Reaktion kann mit den Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel in R. Saiki et al., Science, Vol. 230, S. 1350 (1985); R. Saiki et al., Science, Vol. 239, S. 487 (1988), und Henry A. Erlich, PCR Technology, Stockton Press, offenbart sind. Die Reaktion kann zum Beispiel auch unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits oder Reagens durchgeführt werden.
Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente werden sequenziert, und nachdem bestätigt wurde, dass sie eine Sequenz enthalten, die zu derjenigen, die für die Aminosäuresequenz des internen Peptids. des gereinigten Enzyms codiert, homolog ist, werden sie mit einem Isotop markiert und für zukünftige Experimente oder dergleichen verwendet. Die Sequenzierung von Nucleotidsequenzen kann mit einer Didesoxy-Technik (wie einem M13-Didesoxy-Verfahren), einem Maxam-Gilbert-Verfahren usw. durchgeführt werden oder kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sequenzierungskits, wie eines Taq- Farbstoffprimer-Cyclus-Sequenzierungskits oder eines automatischen Nucleotidsequenzers, wie eines Fluoreszenz-DNA-Sequenzers, durchgeführt werden. Die Markierung von Sonden usw. mit einem Radioisotop usw. kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Markierungskits, wie eines DNA-Markierungskits mit statistischen Primern (Boehringer Mannheim), durchgeführt werden.
3) Klonierung von D-Pantolacton-Hydrolase-cDNA
a) Herstellung von mRNA und Aufbau einer cDNA-Bibliothek
Kultivierte Fusarium-oxysporum-Zellen werden aufgeschlossen und gemäß einem AGPC-Verfahren extrahiert, um Gesamt-RNA zu isolieren. Dann wird mRNA mit einem geeigneten Verfahren, wie durch Verwendung einer Oligo-dT-Cellulose-Säule, isoliert und aus der Gesamt-RNA-Fraktion gereinigt. In einer Ausführungsform kann mRNA zwar mit einem in der Technik bekannten Verfahren oder durch ein im Wesentlichen identisches Verfahren oder Modifikationen davon isoliert werden, doch kann die Isolierung und Reinigung von mRNA auch mit Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel in T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 2. Aufl., Kapitel 7, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989); L. Grossman et al., Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 12, Parts A & B, Academic Press, New York (1968); S. L. Berger et al., Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 152, S. 33 & S. 215, Academic Press, New York (1987); Biochemistry, 18, 5294–5299, 1979, usw. offenbart sind, auf die alle hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Beispiele für solche mRNA-Isolierungs- und -Reinigungstechniken sind ein Guanidin-Cäsiumchlorid-Verfahren, ein Guanidinthiocyanat-Verfahren, ein Phenolverfahren usw. Falls notwendig, kann die resultierende Gesamt-RNA auch einem Reinigungsverfahren unter Verwendung einer Oligo(dT)-Cellulose-Säule usw. unterzogen werden, was Poly(A)⁺mRNA ergibt. Als Quelle für mRNA kann zweckmäßigerweise jeder Mikroorganismus verwendet werden, der zur Gattung Fusarium gehört und die Fähigkeit hat, D-Pantolacton-Hydrolase zu erzeugen. Beispiele für den Mikroorganismus, der zur Gattung Fusarium gehört oxysporum IFO 5942, Fusarium semitectam IFO 30200 usw. Ähnlich können auch andere Mikroorganismen, die zu einem Vertreter gehören, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium oder Arthroderma besteht, und die Fähigkeit haben, D-Pantolacton-Hydrolase zu erzeugen, als Quelle für die mRNA verwendet werden. Beispiele für solche Mikroorganismen sind Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561, Gibberella fujikuroi IFO 6349, Aspergillus awamori IFO 4033, Penicillium chrysogenum IFO 4626, Rhizopus oryzae IFO 4706, Volutella buxi IFO 6003, Gliocladium catenulatum IFO 6121, Eurotium chevalieri IFO 4334, Nectria elegans IFO 7187, Schizophyllum commune IFO 4928, Myrothecium roridum IFO 9531, Neurospora crassa IFO 6067, Acremonium fusidioides IFO 6813, Tuberculina persicina IFO 6464, Absidia lichtheimi IFO 4009, Sporothrix schenckii IFO 5983, Verticillium malthousei IFO 6624, Arthroderma uncinatum IFO 7865 usw.
cDNAs werden hergestellt, indem man die resultierende mRNA als Matrize und eine Reverse Transcriptase usw. verwendet. Die Reverse-Transcriptase-Synthese von cDNA unter Verwendung von mRNA kann mit in der Technik bekannten Standardtechniken, mit im Wesentlichen identischen Techniken oder mit modifizierten Techniken durchgeführt werden. Ausführliche Techniken findet man zum Beispiel in H. Land et al., "Nucleic Acids Res.", Vol. 9, 2251 (1981); U. Gubler et al., "Gene", Vol. 25, 263–269 (1983); S. L. Berger et al., Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 152, S. 307, Academic Press, New York (1987); usw., auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Die so erhaltene cDNA wird in einen kommerziell erhältlichen Phagenvektor eingesetzt oder weiter einer Verpackung mit herkömmlichen Techniken unterzogen. Auf der Basis der so hergestellten cDNA können dann cDNA-Bibliotheken hergestellt werden.
b) Klonierung von D-Pantolacton-Hydrolase-DNA
Mit dem obigen rekombinanten Phagen wurden Wirtszellen transfiziert, und anschließend wurde er einer Plaque-Hybridisierung unterzogen, um positive Plaques (Klone) zu selektieren. DNA-Fragmente aus den resultierenden Klonen werden sequenziert. Die resultierenden Nucleotidsequenzen werden dekodiert und im Hinblick auf eine darin codierte Aminosäuresequenz analysiert. Als Ergebnis solcher Analysen und Untersuchungen wird bestätigt, dass das gewünschte D-Pantolacton-Hydrolase-Gen kloniert wurde.
Neben der Technik unter Verwendung eines Phagenvektors können auch Transformationen von Wirtszellen einschließlich Escherichia coli gemäß in der Technik bekannten Methoden, wie einer Calciumtechnik und einer Rubidium/Calcium-Technik oder im Wesentlichen identischen Verfahren, durchgeführt werden (D. Hanahan, J. Mol. Biol., Vol. 166, S. 557 (1983), usw.).
PCR kann unter Verwendung der hergestellten cDNA als Matrize durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann der im obigen Punkt 2) erhaltene Primer verwendet werden.
Als Plasmid, in das das D-Pantolacton-Hydrolase-Gen eingebaut wird, kann jedes Plasmid verwendet werden, solange die DNA in Wirtszellen exprimiert werden kann, die herkömmlicherweise bei Gentechnikmethoden verwendet werden (wie prokaryontische Wirtszellen einschließlich Escherichia coli, Bacillus subtilis usw. und eukaryontische Wirtszellen einschließlich Hefen). In einer solchen Sequenz des Plasmids ist es zum Beispiel möglich, Codons, die für die Expression der klonierten DNA in ausgewählten Wirtszellen geeignet sind, einzubauen oder Restriktionsenzymstellen zu konstruieren. Es ist auch möglich, Steuersequenzen, Promotorsequenzen usw., um die Expression des gewünschten Gens zu erleichtern, Linker, Adapter usw., die zum Ligieren des gewünschten Gens geeignet sind, Sequenzen, die für die Steuerung der Resistenz gegenüber Antibiotika oder für die Steuerung des Stoffwechsels oder die Selektion geeignet sind, und dergleichen einzubauen.
Vorzugsweise können geeignete Promotoren verwendet werden. Solche Promotoren können zum Beispiel die Folgenden einschließen: Tryptophan(trp)-Promotor, Lactose(lac)-Promotor, Tryptophan-Lactose(tac)-Promotor, Lipoprotein (lpp)-Promotor, λ-Phage-P_L-Promotor usw. im Falle von Plasmiden, bei denen Escherichia coli als Wirt verwendet wird, und GAL1-, GAL10-Promotoren usw. im Falle von Plasmiden, bei denen Hefe als Wirt verwendet wird.
Beispiele für das Plasmid, das für Escherichia coli als Wirt geeignet ist, sind pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(–), pBluescript KS^TM (Stratagene) usw. Beispiele für den Plasmidvektor, der für die Expression in Escherichia coli geeignet ist, sind pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30 usw. Beispiele für das Plasmid für Hefen als Wirte sind YIp-Vektor, YEp-Vektor, YRp-Vektor, YCp-Vektor usw. einschließlich pGPD-2 usw. Escherichia-coli-Wirtszellen können solche einschließen, die von Escherichia-coli-K12-Stämmen abgeleitet sind, wie NM533, XL1-Blue, c600, DH1, HB101 und JM109.
Bei den Gentechnikmethoden der vorliegenden Erfindung ist es möglich, verschiedene Restriktionsenzyme, Reverse Transcriptasen, Enzyme für die DNA-Modifikation und -Zersetzung, die zum Modifizieren oder Umwandeln eines DNA-Fragments in eine zum Klonieren geeignete Struktur verwendet werden, DNA-Polymerasen, Terminales-Nucleotidyl-Transferasen, DNA-Ligasen usw., die in der Technik bekannt oder üblich sind, zu verwenden. Beispiele für das Restriktionsenzym sind solche, die in R. J. Roberts, "Nucleic Acids Res.", Vol. 13, r165 (1985); S. Linn et al., Hrsg., "Nucleases", S. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982; usw. offenbart sind. Beispiele für die Reverse Transcriptase sind solche, die vom Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV), vom Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV) usw. abgeleitet sind. Insbesondere wird vorzugsweise eine Reverse Transcriptase ohne RNase-H-Aktivität oder dergleichen verwendet. Beispiele für die DNA-Polymerase sind Escherichia-coli-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, das ein Derivat von E.-coli-DNA-Polymerase ist, E.-coli-Phage-T4-DNA-Polymerase, E.-coli-Phage-T7-DNA-Polymerase, DNA-Polymerase von wärmeresistenten Bakterien usw.
Die Terminales-Nucleotidyl-Transferase umfasst TdTase, die ein Didesoxynucleotid (dNMP) an einen 3'-OH-Terminus addieren kann, wie es in R. Wu et al., Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 100, S. 96, Academic Press, New York (1983), offenbart ist. Das Enzym zum Modifizieren und Zersetzen von DNA umfasst Exonuclease, Endonuclease usw. Beispiele für solche Enzyme sind Schlangengift-Phosphodiesterase, Milz-Phosphodiesterase, E.-coli-DNA-Exonuclease I, E.-coli-DNA-Exonuclease III, E.-coli-DNA-Exonuclease VII, λ-Exonuclease, DNase I, Nuclease S1, Micrococcus-Nuclease usw. Beispiele für die DNA-Ligase sind E.-coli-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase usw.
Der Vektor (oder Überträger), der für die Klonierung von DNA-Genen und den Aufbau von DNA-Bibliotheken geeignet ist, umfasst ein Plasmid, λ-Phage, Cosmid, P1-Phage, F-Faktor, YAC usw. Bevorzugte Beispiele für solche Vektoren sind Vektoren, die von λ-Phage abgeleitet sind, wie Charon 4A, Charon 21A, λ-gt10, λ-gt11, λ-DASHII, λ-FIXII, λ-EMBL3 und λ-ZAPII^TM (Stratagene) usw.
Auf der Basis der Gennucleotidsequenz, in der die D-Pantolacton-Hydrolase der vorliegenden Erfindung codiert ist, ermöglichen Verfahren und Mittel, die herkömmlicherweise bei Gentechnikmethoden verwendet werden, außerdem die Herstellung von Proteinen, wie Varianten und Mutanten, wobei eine Modifikation so in die Aminosäuresequenz der D-Pantolacton-Hydrolase eingeführt wird, dass eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, insertiert, transloziert oder addiert werden.
Beispiele für die Verfahren und Mittel für eine solche Variation, Substitution und Modifikation sind offenbart in Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) Hrsg., "Zoku-Seikagaku Jikken Kouza 1, Idensi Kenkyuho II (Lectures on Biochemical Experiments (Second Series; 1), Methods for Gene Study II)", S. 105 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1986); Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan), Hrsg., "Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2, Kakusan III (Kumikae DNA Gijutsu) (New Lectures on Biochemical Experiments 2, Nucleic Acids III (Recombinant DNA Technology))", S. 233 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1992); R. Wu, L. Grossman, Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 154, S. 350 und S. 367, Academic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 100, S. 457 und S. 468, Academic Press, New York (1983); J. A. Wells et al., "Gene", Vol. 34, S. 315 (1985); T. Grundstroem et al., "Nucleic Acids Res.", Vol. 13, S. 3305 (1985); J. Taylor et al., "Nucleic Acids Res.", Vol. 13, S. 8765 (1985); R. Wu, Hrsg., "Methods in Enzymology", Vol. 155, S. 568, Academic Press, New York (1987); A. R. Oliphant et al., "Gene", Vol. 44, S. 177 (1986); usw., auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Beispiele für solche Verfahren und Mittel sind Techniken, bei denen synthetische Oligonucleotide verwendet werden, um eine Mutation oder Variation in eine spezifische Stelle einzuführen (Techniken der ortsgerichteten Mutagenese), Kunkel-Techniken, dNTP[αS]-Techniken (Eckstein-Verfahren), Techniken unter Verwendung von Schwefliger Säure (oder Hydrogensulfit), Salpetriger Säure (oder Nitrit) usw. zur Einführung einer Mutation oder Variation in eine spezifische Domäne oder einen spezifischen Bereich usw.
Außerdem kann das resultierende Protein gemäß der vorliegenden Erfindung chemischen Techniken unterzogen werden, durch die ein oder mehrere darin enthaltene Aminosäurereste modifiziert oder derivatisiert werden können, indem man sie einer partiellen Zersetzung oder einer Modifikation mit Hilfe eines Enzyms, wie Peptidase (zum Beispiel Pepsin, Chymotrypsin, Papain, Bromelain, Endopeptidase, Exopeptidase usw.), unterzieht. Es ist auch möglich, die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung mittels Gen-Rekombinationstechniken als Fusionsproteine zu exprimieren und dann die Fusionsproteine in vivo oder in vitro zu Produkten zu konvertieren/verarbeiten, die eine biologische Aktivität haben, die derjenigen einer natürlichen D-Pantolacton-Hydrolase im Wesentlichen äquivalent ist. Eine Fusionsproduktion, die üblicherweise in Gentechnikmethoden verwendet wird, kann ebenfalls verwendet werden. Ein solches Fusionsprotein kann mit Hilfe von Affinitätschromatographie usw. gereinigt werden, wobei man sich seinen Fusionsteil zu Nutze macht. Modifikationen, Veränderungen usw. von Proteinstrukturen findet man zum Beispiel in Nippon Seikagaku Kai (Biochemical Society of Japan) Hrsg., "Shin-Seikagaku Jikken Kouza 1, Tanpakushitsu VII, Tanpakushitsu Kogaku (New Lectures on Biochemical Experiments 1, Protein VII, Protein Engineering)", Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1993), auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Solche Modifikationen, Veränderungen usw. können gemäß den dort offenbarten Techniken, gemäß Techniken, die in dort zitierten Literaturstellen offenbart sind, und gemäß solchen, die diesen im Wesentlichen ähnlich sind, durchgeführt werden.
Die Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können also entweder Proteine, bei denen sich ein oder mehrere Aminosäurereste von denjenigen des natürlichen Proteins in Bezug auf ihre Identität unterscheiden, oder Proteine, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste gegenüber ihren Positionen im natürlichen Protein verschoben sind, umfassen. Die Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können Folgendes umfassen: Deletionsanaloga, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben sind, fehlen (zum Beispiel 1 bis 80, vorzugsweise 1 bis 60, besonders bevorzugt 1 bis 40, ganz besonders bevorzugt 1 bis 20 und besonders bevorzugt 1 bis 10 Aminosäurereste, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben sind, fehlen); Substitutionsanaloga, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben sind, durch andere Reste ersetzt sind (zum Beispiel 1 bis 80, vorzugsweise 1 bis 60, besonders bevorzugt 1 bis 40, ganz besonders bevorzugt 1 bis 20 und besonders bevorzugt 1 bis 10 Aminosäurereste, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben sind, durch andere Reste ersetzt sind); und Additionsanaloga, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste zu der Sequenz, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben wird, hinzugefügt sind (zum Beispiel 1 bis 80, vorzugsweise 1 bis 60, besonders bevorzugt 1 bis 40, ganz besonders bevorzugt 1 bis 20 und besonders bevorzugt 1 bis 10 Aminosäurereste zu der Sequenz, die für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase angegeben wird, hinzugefügt sind). Die Produkte können Proteine umfassen, bei denen eine für die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase charakteristische Domänenstruktur enthalten ist oder beibehalten wird. Weiterhin können die Produkte Proteine umfassen, die in Bezug auf die D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität dieselbe Qualität aufweisen wie die natürliche D-Pantolacton-Hydrolase.
Die Produkte der vorliegenden Erfindung können alle oben genannten Varianten und Analoga umfassen, solange sie die Domänenstruktur aufweisen, die für die natürlich vorkommende D-Pantolacton-Hydrolase charakteristisch ist. Es wird auch angenommen, dass die Produkte der vorliegenden Erfindung alle Proteine, die eine primäre strukturelle Konformation aufweisen, die derjenigen der natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase gemäß der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen äquivalent ist, und solche, die einen Teil der primären strukturellen Konformation der natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen, umfassen können. Es wird weiterhin angenommen, dass die Produkte der vorliegenden Erfindung Proteine umfassen können, die alle oder einen Teil der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommender D-Pantolacton-Hydrolase teilen oder eine biologische Aktivität aufweisen, die derjenigen der natürlichen D-Pantolacton-Hydrolase im Wesentlichen äquivalent ist. Weiterhin kann das Produkt der vorliegenden Erfindung eine der Varianten umfassen, die natürlich vorkommen. Die D-Pantolacton-Hydrolase-Produkte der vorliegenden Erfindung können abgetrennt, isoliert oder/und gereinigt werden, wie im Folgenden erläutert wird.
Weiterhin können die Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen, die für das oben genannte Polypeptid codieren, und DNA-Sequenzen, in denen D-Pantolacton-Hydrolase-Polypeptide (einschließlich Analoga und Derivaten davon) codiert sind, die alle oder einen Teil der natürlichen Merkmale der natürlich vorkommenden D-Pantolacton-Hydrolase aufweisen, umfassen. Diese D-Pantolacton-Hydrolase-Nucleotidsequenzen können auch modifiziert (wie etwa durch Insertion, Addition, Deletion und Substitution) sein. Die Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können also auch solche modifizierten Nucleotidsequenzen umfassen.
Da die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung Informationen über die Aminosäuresequenz von D-Pantolacton-Hydrolase-Protein liefern, die vorher nicht zur Verfügung standen, fällt die Verwendung dieser Informationen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Diese Verwendung kann das Entwerfen von Sonden für die Isolierung und/oder den Nachweis von genomischer DNA und cDNA, die für D-Pantolacton-Hydrolase oder damit verwandte Proteine codiert, von Mikroorganismen oder besonders bevorzugt Mikroorganis men mit der Fähigkeit, D-Pantolacton-Hydrolase zu produzieren, wie solche, die zu einem Vertreter gehören, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Gattungen besteht, umfassen: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium und Arthroderma mit der Fähigkeit, D-Pantolacton-Hydrolase zu produzieren.
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel wertvoll als Sonden für die Isolierung und/oder den Nachweis von genomischer DNA und cDNA, die für D-Pantolacton-Hydrolase oder damit verwandte Proteine codiert, von Mikroorganismen mit der Fähigkeit, D-Pantolacton-Hydrolase zu produzieren, oder besonders bevorzugt Mikroorganismen, die zu der oben genannten Gattung gehören, einschließlich Fusarium usw. Die Isolierung des Gens kann unter Verwendung von PCR-Techniken oder RT-PCR-Techniken (PCR unter Verwendung einer Reversen Transcriptase (RT)) durchgeführt werden. D-Pantolacton-Hydrolase-DNA und ihre verwandte DNA können für die Isolierung, den Nachweis usw. von Genen, die mit D-Pantolacton-Hydrolase im Zusammenhang stehen, verwendet werden, und zwar mittels PCR-Techniken, RT-PCR-Techniken oder anderer Verfahren, wobei man einen DNA-Primer verwendet, der durch eine chemische Synthese als Ergebnis der Auswahl einer charakteristischen Domäne (oder eines charakteristischen Teils) auf der Grundlage einer mutmaßlichen Aminosäuresequenz, die von der klonierten und sequenzierten D-Pantolacton-Hydrolase-cDNA-Sequenz abgeleitet ist und des Entwerfens des DNA-Primers, der auf derselben Domäne (oder demselben Teil) beruht, erhalten wurde.
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der gewünschten D-Pantolacton-Hydrolase bereit, das das Importieren eines rekombinanten D-Pantolacton-Hydrolase-DNA-Moleküls und/oder -Gens in Wirte und die anschließende Expression der D-Pantolacton-Hydrolase darin umfasst. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden also Rekombinanten (Transformanten) oder Transfektanten, die die Fähigkeit haben, dieselbe im Wesentlichen zu exprimieren, und deren Verwendung bereitgestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Nucleinsäuren, wie DNA und RNA, die die Expression von Folgendem in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen, wie Escherichia-coli-Wirtszellen, ermöglichen:

(1) Proteine oder Salze davon mit D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität;
(2) Proteine oder Salze davon, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine dazu im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweisen; oder
(3) Polypeptide, die das gesamte oder wenigstens einen Teil eines D-Pantolacton-Hydrolase-Proteins aufweisen, oder ein Salz davon (vorzugsweise ein D-Pantolacton-Hydrolase-Protein, das auf Fusarium oxysporum zurückgeht), die bzw. das eine im Wesentlichen äquivalente Aktivität oder im Wesentlichen dieselbe primäre strukturelle Konformation aufweist.

Eine solche Nucleinsäure, insbesondere DNA, kann außerdem Folgendes sein:

(a) eine Sequenz, die befähigt ist, die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder eine dazu komplementäre Sequenz zu codieren;
(b) eine Sequenz, die befähigt ist, mit der DNA-Sequenz (a) oder einem Fragment davon zu hybridisieren; und
(c) eine Sequenz mit einem degenerierten Code, die befähigt ist, mit der Sequenz (a) oder (b) zu hybridisieren.

Die Merkmale der vorliegenden Erfindung liegen in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen, wie Escherichia-coli-Wirtszellen, die mit einer solchen Nucleinsäure transformiert oder transfiziert sind und die Fähigkeit aufweisen, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es auch möglich sein, einen Mikroorganismus zu erhalten, dessen Fähigkeit, D-Pantolacton-Hydrolase zu erzeugen, modifiziert ist, indem man

(i) DNA, die für ein Protein, das D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität aufweist, oder ein Protein, das eine dazu im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweist, codiert; oder
(ii) DNA, wie ein Vektor, der die DNA enthält,

Die Transformation kann Folgendes umfassen: Techniken, bei denen Protoplastenzellen, die unter Verwendung eines geeigneten zellwandlysierenden Enzyms hergestellt werden, in Gegenwart von Calciumchlorid, Polyethylenglycol usw. mit DNA in Kontakt gebracht werden; Elektroporationstechniken (siehe zum Beispiel E. Neumann et al., EMBO J., Vol. 1, S. 841 (1982) usw.); Mikroinjekti onstechniken; Schrotgewehrverfahren zum Schießen eines Gens mit einer Kanone usw.
Die Enzyme können durch Reinigungstechniken aus verschiedenen Materialien, wie hergestellten Enzymmaterialien einschließlich Zellwachstumskulturmedium, lysierten Zellen, transformierten Zellen usw., isoliert und hergestellt werden. Die Reinigung kann in der Technik bekannte Verfahren umfassen, einschließlich des Aussalzens, wie Fällung mit Ammoniumsulfat; Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex oder dergleichen; Ionenaustausch-Chromatographietechnik unter Verwendung zum Beispiel eines Trägers, der eine Diethylaminoethylgruppe oder eine Carboxymethylgruppe aufweist; Hydrophob-Chromatographietechnik unter Verwendung zum Beispiel eines Trägers, der hydrophobe Gruppen einschließlich einer Butylgruppe, einer Octylgruppe, einer Phenylgruppe usw. aufweist; Pigment-Gel-Chromatographietechnik; Elektrophoresetechnik; Dialyse; Ultrafiltration; Affinitätschromatographietechnik; HPLC-Technik; usw.
Wenn das Enzym als Einschlusskörper erhalten wird, kann es einer Solubilisierungsbehandlung unter Verwendung zum Beispiel eines Denaturierungsmittels, wie Guanidin-Hydrochlorid und Harnstoff, und, falls notwendig, in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie 2-Mercaptoethanol und Dithiothreit unterzogen werden, wobei eine aktivierte Form des Enzyms entsteht.
Für Enzymmaterialien können stattdessen auch enzymerzeugende Zellen an sich verwendet werden. Immobilisierte Enzyme können Produkte umfassen, die durch Immobilisieren des Enzyms oder der enzymproduzierenden Zellen mit in der Technik bekannten Methoden hergestellt werden. Die Immobilisierung kann mit Trägerbindungstechniken durchgeführt werden, wie einem kovalenten Verfahren und einem Adsorptionsverfahren, einem Vernetzungsverfahren, einer Einkapselung usw. Falls notwendig, kann die Immobilisierung auch unter Verwendung eines Kondensationsmittels, wie Glutaraldehyd, Hexamethylendiisocyanat und Hexamethylendiisothiocyanat, durchgeführt werden. Als Beispiele können außerdem Monomertechniken, bei denen Monomere in einer Polymerisation geliert werden, Prepolymertechniken, bei denen Moleküle, die größer sind als herkömm liche Monomere, polymerisiert werden, Polymertechniken, bei denen Polymere geliert werden, usw. genannt werden. Sie kann eine Immobilisierung unter Verwendung von Polyacrylamid, eine Immobilisierung unter Verwendung von natürlichen Polymeren, wie Alginsäure, Collagen, Gelatine, Agar und κ-Carrageen, eine Immobilisierung unter Verwendung von synthetischen Polymeren, wie photohärtbaren Harzen und Urethanpolymeren, usw. umfassen. Es kann möglich sein, die Racematspaltung von Lactonverbindungen durch eine enzymatische asymmetrische Hydrolyse unter Verwendung einer Lacton-Hydrolyse (wie einer D-Pantolacton-Hydrolyse unter Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen und Enzymen) sowie die Behandlung von dadurch erhaltenen Produkten in derselben Weise durchzuführen, wie es in den Japanischen Offenlegungsschriften Nr. Hei 3-65,198 und Hei 4-144,681 offenbart ist.
Zum Beispiel werden die so erhaltenen transformierten Mikroorganismen (Transformanten) einer Schüttelkultur in einem flüssigen Medium unterzogen. Die resultierenden kultivierten Zellen werden geerntet, und eine wässrige Lösung von D,L-Pantolacton (Konzentrationen: 2 bis 60%) wird hinzugefügt. Das Gemisch wird mehrere Stunden bis einen Tag lang bei 10 bis 40°C reagieren gelassen, wobei der pH-Wert auf 6 bis 8 eingestellt wird. Nach Beendigung der Reaktion werden die Zellen getrennt, und das nicht umgesetzte L-Pantolacton in der Reaktionslösung wird durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel (vorzugsweise einem Ester, wie Ethylacetat, einem aromatischen Kohlenwasserstoff, wie Benzol, oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform) abgetrennt. D-Pantoinsäure, die in der wässrigen Schicht verbleibt, wird unter sauren Bedingungen mit Chlorwasserstoffsäure erhitzt, um eine Lactonierung durchzuführen, und dann wird mit dem oben genannten organischen Lösungsmittel extrahiert, woraufhin das resultierende D-Pantolacton erhalten wird. Als solche können auch verarbeitete Zellen (getrocknete Zellen, immobilisierte Zellen usw.) der transformierten Mikroorganismen oder Enzyme und immobilisierte Enzyme, die aus den transformierten Zellen erhalten wurden, in derselben Weise verwendet werden.
Als Ergebnis der Verwendung verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie sie oben erwähnt sind, ist es jetzt möglich, verschiedene technische Mittel, wie Mittel, die für Synthesestudien bezüglich der Racematspaltung von Lactonverbindungen durch eine enzymatische asymmetrische Hydrolyse unter Verwendung einer Lacton-Hydrolase (zum Beispiel D-Pantolacton-Hydrolase) wertvoll oder nützlich sind, sowie Mittel, die für andere Verwendungen anwendbar sind, bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher anhand der folgenden Beispiele erläutert, obwohl man sich darüber im Klaren sein sollte, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist, sondern verschiedene Ausführungsformen gemäß dem Wesen dieser Beschreibung möglich sind.
Wenn übrigens in der Beschreibung und den Zeichnungen Nucleotide (Basen) und Aminosäuren durch Abkürzungen angegeben werden, richten sich diese nach der "IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature" oder nach den Bedeutungen der Ausdrücke, die in der Technik üblicherweise verwendet werden. Wenn in Aminosäuren optische Isomere vorhanden sind, ist von einem L-Isomer die Rede, wenn nichts anderes angegeben ist.
Die transformante Escherichia coli, die als JM109 bezeichnet wird (EJM-ESE-1) und einen rekombinanten Vektor (PFLC40E) aufweist, in den das Gen für das Enzym D-Pantolacton-Hydrolase integriert ist und der in dem weiter unten aufgeführten Beispiel 1 erhalten wird, wurde am 30. August 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, IBARAKI (Zip Code: 305), Japan, hinterlegt und erhielt die Zugriffs-Nr. FERM P-15141. Die ursprüngliche Hinterlegung der Transformante E. coli JM109 (EJM-ESE-1) wurde auf den Antrag vom 28. August 1996 in eine Hinterlegung unter dem Budapester Abkommen übergeführt und ist beim NIBH mit der Zugriffs-Nr. FERM BP-5638 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens hinterlegt.
Beispiele
Im Folgenden sind Beispiele für die vorliegende Erfindung beschrieben, die nur zu Erläuterungszwecken angegeben werden, und nicht, um den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken. Im Lichte der vorliegenden Offenbarung werden dem Fachmann zahlreiche Ausführungsformen einfallen, die in den Umfang der Ansprüche fallen.
Beispiel 1
1) Aminosäuresequenzierung des gereinigten Enzyms

Eine Probe von gefriergetrockneter D-Pantolacton-Hydrolase (14,3 nmol; Molekulargewicht einer Untereinheit: 60000), die gemäß Beispiel 1 der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. Hei 4-144,681 hergestellt wurde, wurde in 44 μl 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), das 8 M Harnstoff enthielt, gelöst und 1 h lang bei 37°C denaturiert. Zu dieser Lösung wurden 44 μl 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) gegeben, woraufhin die Harnstoffkonzentration auf 4 M eingestellt wurde. Dann wurden 12 μl (0,144 nmol; E/S = 1/100) einer 12 nmol/ml Lysyl-Endopeptidase (Wako Pure Chemicals, Japan) hinzugefügt, und eine Spaltung wurde 12 Stunden lang bei 30°C durchgeführt. Das resultierende gespaltene Peptid wurde mittels einer Umkehrphasensäule (Nakarai Tesuku, Japan) isoliert, und eine Analyse der Aminosäuresequenz wurde durchgeführt, wobei man einen 477A-Proteinsequencer (ABI, USA) verwendete. Isolierungsbedingungen

Säule:	Cosmosil 5C18-AR (4,6 × 250 mm)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Temperatur:	35°C
Nachweiswellenlänge:	210 nm
Elutionslösung:	A, 0,1% TFA (TFA: Trifluoressigsäure) B, 0,1% TFA/80% CH₃CN
Elutionsbedingungen:	Gradientenelution von A → B (15%/min).

Die Ergebnisse der Aminosäuresequenzierung waren so, wie es in den 1 und 2 gezeigt ist.
2) Herstellung von genomischer DNA
a) Verfahren zur Extraktion von genomischer D-Pantolacton-Hydrolase-DNA
Kultivierte Zellen in einer Anaphase der logarithmischen Wachstumsphase wurden mittels Vakuumfiltration geerntet. Die Zellen wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und mit Hilfe eines Waring-Mischers fein aufgeschlossen. Die Zellgemische, die bis zu einem gewissen Grad fein gemacht wurden, wurden in einen Mörser übertragen und unter Zugabe von flüssigem Stickstoff vermahlen. Dieses Produkt wurde in einer 2 × CTAB-Lösung (2% CTAB (CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid; Sigma, USA), 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,4 M NaCl und 1% PVP (PVP: Polyvinylpyrrolidon; Sigma, USA)) suspendiert, auf 70°C gehalten und 3–4 Stunden lang bei 65°C inkubiert. Die durch Zentrifugation erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde nacheinander mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, und die resultierende Lösung wurde dann mit demselben Volumen an Isopropanol behandelt, um DNA auszufällen. Diese DNA-Paste wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in einem TE-Puffer (10 mM Tris und 1 mM EDTA; pH 7,8) gelöst. RNA wurde mit Ribonuclease A und Ribonuclease T1 zersetzt. Dann wurde das DNA-Produkt nacheinander mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, um das Protein daraus zu entfernen. Das resultierende Produkt wurde mit demselben Volumen Isopropanol behandelt, um DNA auszufällen. Diese DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in einem TE-Puffer gelöst, was eine Genomprobe ergab.
b) Amplifikation eines D-Pantolacton-Hydrolase-Gens
Auf der Grundlage der Informationen über Aminosäuresequenzen (1 und 2) von internen Peptiden der D-Pantolacton-Hydrolase wurden ein Sense-Primer, der einem für die N-terminale Aminosäuresequenz codierenden Sinnstrang entsprach, und ein Antisense-Primer, der einem Antisense-Strang für die Sequenz des internen Peptids entsprach, synthetisiert (3).
Eine PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, wobei man als Matrize eine genomische DNA-Probe von D-Pantolacton-Hydrolase verwendete:
Die PCR wurde nach den Methoden durchgeführt, die in der Technik erwähnt sind, zum Beispiel in R. Saiki et al., Science, Vol. 230, S. 1350 (1985); R. Saiki et al., Science, Vol. 239, S. 487 (1988); PCR Technology, Stockton Press (1989); usw.

Als Ergebnis der PCR wurden amplifizierte DNA-Fragmente mit etwa 1 kb erhalten. PCR-Bedingungen

Genomische DNA:	2,5 μg
Sense-Primer:	250 pmol (vgl. Figur 3)
Antisense-Primer:	250 pmol (vgl. Figur 3)
dNTP (2 mM):	5 μl
T.-th.-Polymerase-Puffer (×10):	5 μl
T.-th.-DNA-Polymerase (Toyobo, Japan):	3 Einheiten
H₂O:
insgesamt	50 μl

Der Cyclus für die Amplifikation war 1 min bei 92°C, 1 min bei 55°C und 3 min bei 73°C und wurde 30mal wiederholt.
Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente wurden einer Sequenzierung unterzogen, und die offenbarte DNA-Sequenz wurde zu einer Aminosäuresequenz decodiert, wobei unter den decodierten Aminosäuresequenzen ein Teil gefunden wurde, der der partiellen Aminosäuresequenz des internen Peptids der D-Pantolacton-Hydrolase entsprach.
3) Herstellung von cDNA
a) Herstellung von mRNA
Kultivierte Zellen wurden in einer Prophase der logarithmischen Wachstumsphase geerntet, sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren, lysiert und einer AGPC unterzogen (Acid Guanidinium Thiocyanate Phenol Chloroform Method; siehe zum Beispiel Jikken Igaku, Vol. 15, S. 99 (1991)), um Gesamt-RNA zu extrahieren. Die resultierende Gesamt-RNA wurde zur Reinigung einer Oligo-dT-Cellulose-Säule (Pharmacia) ausgesetzt, was eine mRNA-Fraktion ergab.
b) Herstellung einer cDNA-Bibliothek
Die resultierende mRNA wurde als Matrize zum Synthetisieren von cDNA durch ein cDNA-Rapido-Adapter-Ligierungsmodul (cDNA-Synthesemodul RPN 1256, 1994; Amersham International PLC) verwendet, und die cDNA wurde zum Aufbau von cDNA-Bibliotheken verwendet.
c) Klonierung von D-Pantolacton-Hydrolase-cDNA
Mit den cDNA-Bibliotheken wurden Escherichia-coli-Wirtszellen infiziert, und positive Plaques wurden mittels Plaque-Hybridisierung selektiert. Bei der Plaque-Hybridisierung wurden Sonden, die für die Selektion verwendet wurden, hergestellt, indem man etwa 1-kb-Fragmente, die Fusarium-oxysporum-D-Pantolacton-Hydrolase-Gen enthielten, verwendete und etwa 1-kb-Fragmente nach einem Multiprime-Verfahren markierte. Der resultierende positive Klon wurde sequenziert, und die offenbarte DNA-Sequenz wurde zu einer Aminosäuresequenz decodiert, wobei sich zeigte, dass die volle Länge des obigen D-Pantolacton-Hydrolase-Gens erfolgreich kloniert worden war.
Als solche hat die isolierte und sequenzierte DNA die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 2. Die Sequenz, die eine Homologie mit der durch SEQ ID Nr. 1 dargestellten, von dieser Nucleotidsequenz codierten Aminosäuresequenz zeigt, ist in der Protein Sequence Data Bank der NBRF (National Biomedical Research Foundation) nicht vorhanden. Die DNA mit dieser Nucleotidsequenz erweist sich also als völlig neu.
Es zeigte sich, dass in der cDNA, deren Nucleotide sequenziert wurden, ein Teil des N-Terminalen Bereichs fehlte und es daher kein Startcodon darin gab. Daher wurde ein Startcodon mit einer PCR-Technik künstlich in die cDNA eingebaut, um einen Vektor zum Exprimieren des Gens (PFLC40E) aufzubauen.

Sense- und Antisense-Oligonucleotidprimer mit den in 4 gezeigten Restriktionsenzymstellen wurden synthetisiert. Unter Verwendung dieser Primer wurde eine PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Die PCR wurde nach den Methoden durchgeführt, die in der Technik erwähnt sind, zum Beispiel in R. Saiki et al., Science, Vol. 230, S. 1350 (1985); R. Saiki et al., Science, Vol. 239, S. 487 (1988); und PCR Technology, Stockton Press (1989). PCR-Bedingungen

Gesamt-DNA (cDNA):	10 μg
Sense-Primer:	0,1 nmol (vgl. Figur 4)
Antisense-Primer:	0,1 nmol (vgl. Figur 4)
dNTP (2 mM):	10 μl
T.-th.-Polymerase-Puffer (×10):	10 μl
T.-th.-DNA-Polymerase:	4 Einheiten
H₂O:
insgesamt	100 μl

Der Cyclus für die Amplifikation war 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C und 3 min bei 75°C und wurde 30mal wiederholt.
Die hergestellten PCR-Produkte als solche hatten jeweils Restriktionsenzym-EcoRI- und -XbaI-Stellen an ihren beiden Enden. Daher wurde jedes PCR-Produkt mit EcoRI (Takara Shuzo, Japan) und XbaI (Takara Shuzo, Japan) behandelt, und anschließend erfolgte eine Ligierung mit pUC18 (Takara Ligation Kit; Takara Shuzo, Japan), wodurch der Expressionsvektor (PFLC40E) aufgebaut wurde.
Mit diesem Vektor wurden dann kompetente E.-coli-JM-109-Zellen gemäß einer Technik transfiziert, wie sie in "Molecular Cloning", 2. Aufl., 1989, Hrsg. J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, erwähnt ist, um Wirtszellen zu transformieren. Die gewünschten Transformanten wurden auf einem 2 × YT-Medium (1,5% Trypton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl), das 50 mg/Liter Ampicillin enthielt, selektiert. Die Transformation erfolgte gemäß einer Calciumchlorid-Technik.
Die hergestellte transformante E. coli als solche wurde in einem Reagenzglas, das 10 ml des oben genannten 2 × YT-Mediums mit 50 mg/Liter Ampicillin enthielt, vorkultiviert, und dann wurde die resultierende vorkultivierte Lösung (insgesamt 100 μl) als Impfzellen zur Überprüfung der Kulturzeit, Kulturtempe ratur und der Zeiten für die Zugabe von Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) in 100 ml Hauptkulturbrühe, die dieselbe Zusammensetzung wie die Vorkulturbrühe hat, verwendet.
Ergebnisse der Kultur sind in Tabelle 1 gezeigt.
Nach der Kultivierung wurden die resultierenden geernteten Zellen durch Ultraschall lysiert und zentrifugiert, was einen Überstand ergab. Der resultierende Überstand wurde im Hinblick auf die D-Pantolacton-Hydrolyse-Aktivität gemessen.
Die spezifische Aktivität betrug unter optimalen Bedingungen 2,25 E/mg. Die enzymatischen Aktivitäten der rekombinanten Proteine wurden im Hinblick auf D-Pantolacton-Hydrolyse unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
Die enzymatische Aktivität, die in der Lage ist, 1 μmol D-Pantolacton pro Minute zu hydrolysieren, wurde als eine Einheit (E) definiert. Zu 200 μl 10%iger D-Pantolacton-Lösung in 0,5 M PIPES-Puffer (pH 7,0) wurden 50 μl einer Enzymlösung gegeben, und das Gemisch wurde 120 Minuten lang bei 30°C reagieren gelassen, und anschließend wurden 250 μl 2 mM EDTA in Methanol hinzugefügt, um die Reaktion abzubrechen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das flüssige Reaktionsgemisch einer HPLC unterzogen (Nucleosil 5C₁₈ 4,6 × 150 mm; Eluent: 10% Methanol; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Minute; Nachweiswellenlänge: 230 nm), um die prozentuale Hydrolyse zu bestimmen. Wenn die prozentuale Hydrolyse zum Beispiel 1% beträgt, entspricht die enzymatische Aktivität der Enzymlösung pro ml 1,6 × 10^–2 E/ml.
Die transformante E. coli JM109, die mit PFLC40E transformiert wurde, wurde in 2 × YT-Medium kultiviert. IPTG wurde hinzugefügt, so dass man eine endgültige Konzentration von 2 mM erhielt. Tabelle 1

^(a): IPTG wurde zu Beginn der Kultur zu dem 2 × YT-Medium gegeben.
^(b): IPTG wurde vier Stunden nach Beginn der Kultur zu dem 2 × YT-Medium gegeben.

Als Ergebnis einer SDS-PAGE wurde eine tiefe Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht für eine unlösliche Fraktion des zentrifugierten Niederschlags nachgewiesen. Daher wurde die Bande einem Blotting unterzogen, und die Probe wurde durch Edman-Abbautechnik im Hinblick auf die N-terminale Aminosäuresequenz untersucht, wobei sich zeigte, dass ihre N-terminale Aminosäuresequenz identisch mit der von D-Pantolacton-Hydrolase war.
Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass der größte Teil der rekombinanten D-Pantolacton-Hydrolase als Einschlusskörper exprimiert wird, obwohl die rekombinante D-Pantolacton-Hydrolase in diesem E.-coli-Expressionssystem zum Exprimieren der D-Pantolacton-Hydrolase-cDNA zum Teil in löslicher Form exprimiert wurde.
Die transformante Escherichia coli, die als JM109 bezeichnet wird (EJM-ESE-1) und einen rekombinanten Vektor (PFLC40E) aufweist, in den das oben genannte Gen für das Enzym D-Pantolacton-Hydrolase integriert ist, wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, IBARAKI (Zip Code: 305), Japan, hinterlegt und gespeichert. Die transformante E. coli JM109 (EJM-ESE-1) erhielt vom NIBH die Zugriffs-Nr. FERM BP-5638. Ein Antrag auf Überführung der ursprünglichen Hinterlegung (Zugriffs-Nr. FERM P-15141, hinterlegt am 30. August 1995) in eine solche unter dem Budapester Abkommen wurde am 28. August 1996 gestellt.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung offenbart Genstrukturen, die für natürlich vorkommende D-Pantolacton-Hydrolase (wie natürliche D-Pantolacton-Hydrolase, die auf Fusarium oxysporum zurückgeht) oder für Proteine, die eine dazu im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweisen, codieren. Bei Anwendungen sind also erhebliche Entwicklungen zu erwarten, einschließlich Verwendungen von Wirtszellen, die mit DNA transformiert sind, die die für dieses Protein codierende Nucleotidsequenz enthält, Verfahren zur Herstellung dieses Proteins durch Verwendung der Wirtszellen und Herstellungsverfahren zur Herstellung von D-Pantolacton unter Verwendung solcher Proteine und Wirtszellen. Außerdem ist es möglich, eine erhebliche Erhöhung der enzymatischen Aktivität durch Modifikation der D-Pantolacton-Hydrolase an sich zu erreichen.
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinantes Peptid mit D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität, das eine durch SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz hat, oder ein Salz davon, erhältlich durch Exprimieren von (i) einer exogenen DNA-Sequenz, die das Peptid codiert, in prokaryontischen Wirtszellen; oder (ii) einer exogenen Nucleinsäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 in eukaryontischen Wirtszellen.
Rekombinantes Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das rekombinante Peptid mit D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität auf einen Mikroorganismus zurückgeht, der zu einem Vertreter gehört, der aus den Gattungen Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium und Arthroderma ausgewählt ist.
Rekombinantes Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das rekombinante Peptid mit D-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität auf die Gattung Fusarium zurückgeht.
Rekombinantes Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem es sich um ein Peptid der SEQ ID Nr. 1, aus dem eine oder mehrere Aminosäuren deletiert sind, oder ein Salz davon handelt.
Transformierte prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die einen Vektor beherbergt, der eine Nucleinsäure aufweist, die ein Peptid codiert, wie es in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Peptids, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, umfassend das Kultivieren von eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen, wie sie in Anspruch 5 definiert sind.
Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, umfassend das Durchführen einer Racemattrennung von D,L-Pantolacton in Gegenwart von (i) einem rekombinanten Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder (ii) der transformierten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle gemäß Anspruch 5.