JPH0445789A - リンホトキシン類発現ベクターおよびこれを利用したリンホトキシン類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、リンホトキシン類を有利に発現させるための
ベクターおよびこれを利用したリンホトキシン類の製造
法に関する。

［従来の技術およびその課題］ 従来、抗踵瘍性ペプチドとして、ＴＮＦ、リンホトキシ
ン等が知られており、その臨床での利用が検討されてい
る。

しかし、このうちＴＮＦは、投与時の血圧低下や発熱等
の副作用が問題となっており、実際の治療への適用は難
しいとされている。

一方、天然リンホトキシンやこれに高い相同性を有する
リンホトキシン様ペプチド等のリンホトキシン類はＴＮ
Ｆのような副作用の問題はないが、その生産に問題があ
った。

すなわち−現在、リンホトキシン類は主に遺伝子組替え
によって生産されているが、その発現量が少ないために
生産効率が悪く、実際の治療に必要な量のリンホトキシ
ン類を確保するのが困難であるというのが現状であった
。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、リンホトキシン類を臨床で使用するため
、その発現量を飛躍的に増加させるべく鋭意研究を行な
った。そしてその結果、特定のベクターを利用すれば、
従来極めてわずかしか発現しなかったリンホトキシン類
が効率良く発現することを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明の目的は、開始コドンの１３塩基上流に
ＳＤ領領域有し、−１０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ
、−３５領域の塩基配列がＴＴＧＡＣＡであり、リンホ
トキシン類をコードする遺伝子を除いた大きさが２．７
〜３．１ｋｂであるリンホトキシン類発現ベクターを提
供することである。

また本発明の他の目的は、宿主微生物を上記ベクターで
形質転換し、これを培養することを特徴とするリンホト
キシン類の製造法を提供することである。

本発明のベクターは、−１０１ｉｊ域の塩基配列がＴＴ
ＡＡＣＴ、−３５領域の塩基配列がＴＴＧＡＣＡである
プロモーターを用い、ＳＤ領領域リポソーム結合部位）
と開始コドン（ＡＴＧ）の間を１３塩基とし、これにリ
ンホトキシン類（以下ｒＬＴＪと略称する〉をコードす
る遺伝子（以下ｒＬＴ構造遺伝子」と略称する）を結合
せしめ、かつ、ＬＴ構造遺伝子を除くベクターの塩基長
を　２．７〜３．１ｋｂとすることにより構築すること
ができる。

具体的には、例えば第１図ないし第３図の手順のいずれ
かに従い構築することができる。

第１図に示された方法によれば、本発明ベクターは、ブ
ーロモーターの前半部分をコードする塩基配列（遺伝子
１）、ＳＤ領領域よび開始コドンを含むプロモーターの
後半部分とＬＴ遺伝子の先頭部分をコードする塩基配列
（遺伝子２）および駐止コドンを含む塩基配列く遺伝子
４）を合成し、これらと公知のＬＴベクターから切り出
したＬＴ構造遺伝子の大部分をコードする塩基配列（遺
伝子３）ならびに発現ベクター（遺伝子５〉とをライゲ
ーションすることにより構築することができる。

この方法によると、化学合成された遺伝子２を用いるこ
とによって、ＳＤ領領域よび開始コドンの距離が１３塩
基とすることが可能となる。

また、ライゲーションされる発現ベクターは、構築され
た本発明のベクターがＬＴ構造遺伝子を除いて塩基長が
２．７〜３．１ｋｂとなるようなものであることが必要
であり、例えば、ｐＵｃ系のベクターであるｐｔｙｃ、
ｐＴＺ、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　）
等を利用することにより、その要求を満足させることが
できる。

更に、本発明のベクターにおいて使用されるＬＴ構造遺
伝子は、天然リンホトキシン遺伝子であっても、天然リ
ンホトキシン遺伝子を利用し、その一部を改変したり、
有機合成により全く人工的に製造された天然リンホトキ
シン相同性の高いペプチドをコードする遺伝子であって
も良い。

また、第２図の方法によれば、第１図の方法で得られた
ＬＴ発現ベクターのＬＴ構造遺伝子を他のＬＴ構造遺伝
子に交換することができる。すなわち、第１図に示す方
法で調製されたＬＴ発現ベクターからプロモーターの大
部分をコードする遺伝子（遺伝子６）を切出し、これと
他のベクターから切出すか、合成したＬＴの構造遺伝子
の大部分をコードする遺伝子（遺伝子８）、ＳＤ領領域
よび関始コドン（ＡＴＧ）を含み、この距離が１３塩基
であるように調製した遺伝子（構造遺伝子７または１０
）および発現ベクター（遺伝子３）とライゲーションす
ることにより本発明のベクターが構築される。

また、第３図に示した方法は、第１図の方法で得られた
ＬＴ発現ベクターのＬＴ構造遺伝子をそのまま他のベク
ターに組み込むものであり、コピー数等の面での特徴の
ある本発明のベクターを得ることができる。

上記した方法は、本発明のＬＴ発現ベクターを調製する
方法の一例であり、他の方法によっても調製することが
できる０例えば、−１０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ
、−３５領域の塩基配列がＴＴＧＡＣＡである条件を満
たすプロモーターにはＴｒｐプロモーターが含まれるの
で、公知のＴｒｐプロモーターを有するベクターにＬＴ
構造遺伝子を組み込み、得られたベクターから不用な塩
基を取り除き本発明ベクターを調製することも可能であ
る。

斜上の如くして得られたＬＴ発現ベクターは、常法に従
いこれを用いて宿主微生物を形質転換し、形質転換され
た微生物を培養することによりＬＴを製造させることが
できる。

形質転換体の培養も常法にしたがって行なうことができ
、Ｌ−培地、Ｍ９培地、Ｍ９−カザミノ酸培地、高りん
酸培地、高りん酸−カザミノ酸培地等を利用することが
できる。

特に、高いＬＴの発現を得るためには、培地中にインド
ールアクリル酸を添加することが好ましい、インドール
アクリル酸の添加量としては、培地１ｍｌ当り２０〜１
００μｇ程度である。

培養により得られたＬＴを培養物中から分１ＩｌｆＩ製
するには、微生物を例えば超音波処理等で破壊した後、
遠心分離等によって上清を得、この上清を硫安沈澱、透
析、イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ーアフィニティークロマトグラフィー等の精製手段を組
合せるｍ製方法に付すことにより実施される。

［発明の効果］ 本発明によれば、従来１〜２％程度しか発現が得られな
かった天然ＬＴが、１０％以上発現させることが可能に
なった。

特に、本発明者らが先に開発した天然リンホトキシンと
高い相同性を有するペプチド（特願平１−２３４８００
号）をコードする遺伝子をＬＴ構造遺伝子として利用す
ると３７％の高温度で発現させることが可能であった。

従って、本発明はＬＴを工業的に有利に製造し、臨床に
使用する道を開くものであり極めて有用なものである。

［実施例］ 次に実施例を挙げ、本発明を更に説明する。

実施例　１ （１）プロモーターの先頭部分の構築 −１０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ、−３５領域の塩
基配列がＴＴＧＡＣＡであるプロモータ一部分く以下、
これをｒｔｒｐプロモーター」という）を含む遺伝子（
遺伝子１）並びにＳＤｍ域および開始コドンを１３塩基
の距離に有する、特願平１−２３４８００号に従って調
製されたＬＴ構造遺伝子（以下、ｒＭＬＴ、と略称する
）の先頭部分（遺伝子２）をＤＮＡ合成装置を用いて有
機合成した。遺伝子１および遺伝子２の合成は、次の（
１）〜（６）のオリゴヌクレオチドおよび（７）〜（１
４）のオリゴヌクレオチドを用いて行なった。

（遺伝子ｌ調製のためのオリゴヌクレオチド）以 下 余 白 （遺伝子２調製のためのオリゴヌクレオチド）（７）５
’　ＡＣＧｑＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧ（８）
３’　ＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣ
ＡＴＡＧＣ（１）５’ＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡ
ＴＧ（１０）３’　ＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡ
Ｃ（１１）　５”ＡＡＴＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＣＡＧ（
１２）　３°ＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＣＴＧ（１コ
）　５°　ＣＣＣＡ、ＧＡＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＣＡ
ＴＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＡ（１４）　３°ＴＣＧＡＧＣ
ＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴ各オリゴヌクレオチド　
０．１０Ｄを滅菌水１５μｍに溶解し、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ、４００ｍＭ　ＡＴＰ、１０倍量のカイ
ネーション緩衝液を加えて３０μｍとし、３７°Ｃで２
時間反応させた。反応終了後６５°Ｃで１０分間熱処理
し、酵素を失活させた。

その後、各オリゴヌクレオチド０．０５０　Ｄを１本の
チューブにまとめ、アニーリング緩衝液を等量大れ、９
０°Ｃで３分反応し、ゆっくり冷却した。これにＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ２０００単位（宝社）とＩＭ　ＤＴ７　１
μｌ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　　１０μｌ、アニーリング１
１衝液７．１を入れ、１００μｍとした。　その後、１
６℃で１６時間反応させ、１０％ＰＡＧＥゲルにて泳動
後、目的の遺伝子１および２を切出し、３７°Ｃにて溶
出した。

得られた遺伝子１および２はそれぞれ次の塩基配列を有
していた。

遺伝子１ ＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＧＧ
ＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＧ
ＴＡＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＥ
〒’ＬＡＧ丁 ｃＡ 以 下 余 白 遺伝子２ ＴＡＡＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ
ＡＧＣＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＡ ＴＣＴ （２）ＭＬＴ遺伝子の回収 特願平１−２３４８００号に開示のｐｋｋ２２３−３　
　ＭＬＴ　　ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ−５ｃａＩ　
（東洋紡社）にて切断し、４９５ｂｐのＤＮＡ断片を回
収し、更にこれをＮ５ｉＩ　（ＮＦ２社）にて切断し、
４３１　ｂｐのＤＮＡ断片（遺伝子３）を回収した。

（３）駐止コドンを含み、更にＨｉｎｄＩ［１部位を保
有するオリゴヌクレオチドの作製ＡＢＩ社ＤＮＡ合成機
を用いて、下に示すオリゴヌクレオチドから駐止コドン
を２つ連続し、更にＨｉｎｄＩ１１部位を保有するオリ
ゴヌクレオチド（遺伝子４）を有機合成した。

（遺伝子４ｍ製のためのオリゴヌクレオチド）（ｉ５）
　５°ＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧ
ＣＴＣＴＧＴＡＧＴＡＧＡ（１６）３’　ＴＧＡＣＡＧ
ＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＡ
ＴＣＴＴＣＧ上記の合成遺伝子０．１０Ｄをアニーリン
グ緩衝液１００μｍに溶解し、９０℃で３分間反応させ
た後、ゆっくり冷却して次に示す塩基配列を有する遺伝
子４を得た。

遺伝子４ ＾ＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴＣ
ＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣ
ＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡ（４）
ブルースクリプト　Ｍ１３６ＫＩＩ（＋）の切断 ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｍ　１３
ＳＫ！Ｉ（＋）２μｇ（東洋紡社）を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩにて切断後、０．８％低融点アガロ
ースゲルにて泳動し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ
）染色後、目的の２．９ｋｂからなるプラスミドＤＮＡ
　（遺伝子５）を得た。

（５）ｔｒｐプロモーターを保有し、ＭＬＴを保有する
プラスミドの構築 遺伝子５と遺伝子１．２．３および４とをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて反応させ、ＭＬＴの遺伝子を有するプラ
スミド（ｐＢｔ　ｒｐＭＬＴ）を得た。更に一７０℃で
冷凍保存しておいた形質転換用ＨＢＩＯＩ株菌体を融解
し、この懸濁液１００μｍに、ｐＢｔｒｐＭＬＴを２０
ｎｇ添加した。水冷４５分反応後、４２℃で９０秒間ヒ
ートショックを与え、２分氷冷した。ＳＯＣ培地９００
μｍを添加し、３７°Ｃで１時間培養後、懸濁液を０．
１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレー
ト上にまき、３７°Ｃで一夜培養し、遺伝子１．２．３
．４および５からなるベクター（ｐＢｔｒｐ　　ＭＬＴ
）を有する形質転換体を得た。この形質転換体からＤＮ
Ａを分離し制限酵素ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｍで切断した
後、１％アガロースゲルで泳動し、ＥｔＢｒ染色にて６
２９ｂｐのフラグメントを確認した。

（６）ｐＢｔｒｐ　　ＭＬＴの発現 ｐＢｔｒｐＭＬＴについて、３０℃および３７℃の条件
での蛋白質の発現を確認した。

ｐＢｔｒｐ　ＭＬＴの単一コロニーを、２．５μｇ／ｍ
ｌ）リプトファンを含有するＭ９ＣＡ培地（Ｍ９最小培
地、１％グルコース、１ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏ，，０、１ｍ
　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２，０，５％　カザミノ酸、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ　　チアミン−塩酸、０．１　ｒｎｇ／ｒｎ　
１アンピシリン、１００ｍＭＨｅｐ′ｅｓ）にうえつけ
、それぞれの温度にて一夜培養した。翌日新しいＭ９Ｃ
Ａ培地に１７５０量うえ、ＯＤ６゜。＝０．５まで培養
後、３βインド一ルアクリル酸２０μｇ／ｍ１を添加し
、更に各々の温度にて１６時間培養した。培養終了後１
ｍｌの菌体液を１．５ｍｌの遠心管に移し、遠心にて菌
体を得た。この菌体を２００μ１Ｏ３ＤＳ　　ＰＡＧＥ
用緩１５渣にて溶解し、９０゛Ｃで５分熱処理を加え、
１５％　５ＤＳＰＡＧＥにて泳動した。泳動終了後、ク
マシブルーにて染色し、次いで脱色した。脱色後、ＬＫ
Ｂレーザースキャナーにて、全蛋白質当りのＭＬＴの発
現量を測定したところ、３０℃の培養条件では全蛋白質
当り３７％、また、３７°Ｃの培養条件では全蛋白質当
り２５％のＭＬＴ蛋白質の発現が確認された。これは、
３０℃の培養条件では、Ｕ当り４０〜８０ｍｇの蛋白質
量に相当する。

（７）蛋白質の生産および精製 ｐＢｔｒｐ　　ＭＬＴを、２．５μｇ／ｍｌトリプトフ
ァンを含有するＭ９ＣＡ培地２００ｍ１にて一夜培養し
、この培養液を　７１のＭ９ＣＡ培地に接種し、ＯＤ、
。。＝０．５まで３０℃にて培養した。その徨、３βイ
ンドールアクリル酸を最純濃度２　ＯＡｔｇ　／　ｍ　
１になるように加え、更に１６時間培養した後、遠心分
離により菌体を回収した。

得られた菌体３３．７ｇ／ｗｅｔを　３０ｍＭ　ＮａＣ
１及び０．１ｍＭ　　ｐ−ＡＰＭＳＦを含む５０ｍＭ　
　トリス塩酸（ｐＨ８，０）５００ｍｌに懸濁し、この
菌体懸濁液を高圧ホモジナイザー（ＲＡＮＮＩＥ社）に
、６０００ｐ、ｓ、ｉにて３回通し、菌体を破壊した。

更に遠心分離により菌体残漬を除き、上清液を得た。

得られた上清５００ｍ１に最絣濃度として０．１％にな
るようにポリエチレンイミンを添加し、４°Ｃにて１０
分撹拌律、遠心分離を行い、除核酸を行なった。上清４
８０ｍ１を回収し、硫酸アンモニウムを５０％飽和とな
るように添加後、４°Ｃにて６時間撹拌後、遠心分離を
行い沈澱として粗蛋白を得た。

この粗蛋白を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）４５ｍ
ｌにて溶Ｍ後、同ｍｔ１ｉ液で透析した。更に遠心弁１
１＆、不溶性蛋白を除去し、上清５２ｍ１を回収した。

更に５０℃にて１０分熱処理を行い、沈澱する蛋白を除
去した。その回収液５０ｍ１をあらかじめ５ｎｎＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したＤ　ＥＡＥ　　セ
ファローズファスト　フロー（ファルマシア社）のカラ
ムに付し、５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で溶出
させた。

この溶出液をアミコン社製限外ろ過機（ＹＭＩＯ膜）に
より濃縮し、１３０ｍ１の濃縮液を得た。この濃縮液を
５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて透析して１３
２ｍ１の蛋白質溶液を得た。得られた蛋白質溶液を、５
ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡化したＣ
Ｍ　　セファローズファスト　フロー（ファルマシア社
）のカラムに吸着させ、５ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）にて洗浄後、ＮａＣ１を含む５ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にて段階的濃度勾配により溶出した。

溶出液からペプチドを含む分画を回収し、リン酸緩衝液
に対し透析後、Ｌ９２９試験により活性を求め、各精製
過程における比活性および回収率を求めた。なお、蛋白
質定量は、バイオラッド社製プロティン・アッセイ・シ
ステムを用いて測定した。この結果を第１表に示す。

（以下余白） （８）精製した蛋白質の純度検定 精製した蛋白質２μｇを１５％５ＤＳ ＰＡＧＥにて泳動後、クマシブルーにて染色し、脱色し
たのち、ＬＫＢレーザースキャナーにて純度検定した。

その結果、本発明にて精製した蛋白質は、純度９５％以
上で回収されていた。

実施例２ インタクトＬＴの構築発現 （１）　　Ｐｔｒｐ　　ＭＬＴベクターがらｔｒｐプロ
モータ一部分の取得 実施例１で得たｐｔｒｐＭＬＴ　ＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ　（東洋結社）　−Ｃ１ａｌ（ファルマシア社）
を用いて切断後、１．５％低融点アガロースゲルで泳動
し、１２９ｂｐからなるプロモーター領域（遺伝子６）
を回収した。この遺伝子６は次に示すような塩基配列を
有していた。

遺伝子６ ＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴ
ＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣ
ＧＴＣＣＴＴＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＧＴＡＧＴＧＴ
ＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＡＴ
ＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＣＣ
ＧＴＴＴＡＴＴＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴ
ＧＴＴＡＡＴＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴ
ＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴ
ＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣ
ＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＧＧＧＴＡＴ ＴＣＣＣＡＴＡＧＣ ＬＴ先頭部分の構築 以下に示す６つのオリゴヌクレオチドからＳＤ領領域開
始コ ドンを１ ３塩基の距離に保 ち、 同時にＬＴの先頭部分をコードする遺伝子 （遺伝子７）を調製した。

（遺伝子７調製のためのオリゴヌクレオチド）（１）５
°ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴ
（２）３°ＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧ
ＡＡＣＣＡ、ＧＡＡ（３）５°ＡＧＧＴＣＴＴＡＣＡＣ
ＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＧ（４）３’　ＣＧＴＧＧ
ＴＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＧ（５）５’
　ＡＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＧＡＡＧＡＴＧ
ＣＡ（６）３’　ＣＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴ上記
ヌクレオチドのうち、（２）〜（５）のオリゴヌクレオ
チドの各々０．１０Ｄを、滅菌水１５μｌに溶解し、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ、４００ｍＭ　ＡＴＰ、１
０倍量のカイネーション緩衝液を加えて３０μｌとし、
３７°Ｃで２時間反応させた０反応絆了徨、６５℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させた。

その後、オリゴヌクレオチド（１）〜（６）の各々０．
０５０Ｄを１本のチューブにまとめ、アニーリング緩衝
液を等量大れ、９０℃で３分反応させ、ゆっくり冷却し
た。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位（宝社）と
ＩＭＤＴＴ　　１μｍ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　　１０μｌ
、アニーリングｌ１ｆｆｉ液７μｍを入れ、１００μｍ
とした。その後、１６℃で１６時間反応させ、１０％Ｐ
ＡＧＥゲルにて泳動後、目的の遺伝子７を切出し、３７
℃にて溶出した。

得られた遺伝子７の塩基配列は次の通りである。

遺伝子７ ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＡＧ
ＧＴＣＴＴＡＣＡＣＣＡＴＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣＧＡＡ
ＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧ
ＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣ
ＧＡＡＧＡＴＣ；ＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣ
ＧＡＧＣＡＧＴＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＴ（３）ＬＴ遺伝
子の取得 ｐｔｒｐ　　ＭＬＴ　　ＤＮＡを制限酵＄１４Ｎｓｉ１
　（ＮＥＢ社）−Ｈｉｎｄ［Ｉ　（東洋結社）を用いて
切断後、１％低融点アガロースゲルで泳動し、４６５ｂ
ｐからなる遺伝子（遺伝子８）を回収した。

（４）ブルースクリプトＭ１３８ＫＩＩ（＋）の切断 ブル−スクリプト　Ｍ１３３ＫＩＩ（＋）２〃ｇ（東洋
結社）を制限酵素ＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄｍにて切断後
、０．８％低融点アガロースゲルにて泳動し、ＥｔＢｒ
染色後、目的の２．９ｋｂからなるプラスミドＤＮＡ（
遺伝子９）を得た。

（５）ｔｒｐプロモーターを保有しかつＬＴを保有する
プラスミドの構築 遺伝子６．７．８．９にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させ
、ＬＴの遺伝子を有するプラスミド（ｐＢｔｒｐ　ＬＴ
）を得た。更に、−７０°Ｃで冷凍保存しておいた形質
転換用ＨＢｌｏ１株菌体を融解し、この懸濁液１００μ
ｌに、ｐＢｔｒｐ　　ＬＴを２０ｎｇ添加した。水冷４
５分反応復、４２℃で９０秒間ヒートショックを与え、
２分氷冷した。これにＳＯＣ培地９００μｍを添加し、
３７゛Ｃで１時間培ｌｉ後、懸濁液を０　、１　ｍ　ｇ
　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレー
ト上にまき、３７°Ｃで一夜培養し、ｐＢｔｒｐＬＴを
有する形質転換体を得た。この形質転換体からＤＮＡを
分離し、制限酵素ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｍで切断した後
、１％アガロースゲルにて泳動し、ＥｔＢｒ染色にて６
６５ｂｐのフラグメントを確認した。

（６）ｐＢｔｒｐ　　ＬＴの発現 ｐＢｔｒｐ　　ＬＴの３７℃の条件での蛋白質の発現を
確認した。ｐＢｔｒｐ　　ＬＴの単一コロニーを、２．
５βｇ／ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ培地（
Ｍ９最小培地、１％グルコース、１　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　
ＳＯａ、０．１ｍＭ　　ＣａＣ１，，０，５％　カザミ
ノ酸、０　、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１　　チアミン−塩
酸、０．１ｍｇ／ｍｌ　　アンピシリン、１００ｍＭＨ
ｅｐｅｓ）にうえつけ、３７℃にて一夜培養した。翌日
新しいＭ９ＣＡ培地に１１５０量うえ、ＯＤａｏｏ＝　
０　、５まで培養後、３βインド一ルアクリル酸２０μ
ｇ　／　ｍ　ｌを添加し、更に３７°Ｃにて１６時間培
養した。培養終了後、１ｍｌの菌体液を１．５ｍｌの遠
心管に移し、遠心にて菌体を得た。この菌体を２００μ
１Ｏ８ＤＳ　　ＰＡＧＥ用Ｉ！衝液にて溶解し、９０°
Ｃ５分熱処理を加え１５％ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにて泳動
した。泳動終了後、クマシブルーにて染色した後、脱色
した。

脱色後、ＬＫＢレーザースキャナーにて、全蛋白質当り
のＬＴの発現量を測定したところ、３７°Ｃの培養条件
では全蛋白質当り１０％のＬＴ蛋白質の発現が確認され
た。これは、３７°Ｃの培養条件では、？１当り１０〜
２０ｍｇの蛋白質量に相当する。

（７）蛋白質の生産および精製 ｐＢｔｒｐ　　ＬＴを、２．５μｇ／ｍユ　トリプトフ
ァンを含有するＭ９ＣＡ培地１００ｍ１にて一夜培養し
、この培養液を３．５１のＭ９ＣＡ培地に接種し、ＯＤ
　ｓｏｎ　＝　０　、５まで３７°Ｃにて培養した。そ
の後、３βインドールアクリル酸を最終温度２０μｇ　
／　ｍ　１になるように加え、更に１６時間培養した徨
、遠心分離により菌体を回収した。

得られた菌体１５．９５ｇ／ｗｅｔを３０ｍＭ　ＮａＣ
１及び０．１ｍＭ　　ｐ−ＡＰＭＳＦを含む５０ｍＭ　
　）リス塩酸（ｐＨ８，０）３００ｍｌに懸濁し、この
懸濁液を高圧ホモジナイザー（ＲＡＮＮＩＥ社）に６０
００９゜Ｓ、ｉで３回通し、菌体を破壊した。更に２０
０ｍ１の同一緩衝液にて高圧ホモジナイザー内を洗浄し
、この回収液と破壊液を遠心分離し、粗抽出液を得た。

この粗抽出液５００ｍ１に最終温度として０．１％にな
るようにポリエチレンイミンを添加し、４°Ｃにて１０
分撹拌復、遠心分離を行い、除核酸を行なった。上清　
４８０ｍ１を回収し、硫酸アンモニウムを５０％飽和と
なるーように添加後、４°Ｃにて５時間撹拌し、次いで
遠心分離を行い、沈澱として粗蛋白を得た。この粗蛋白
を５ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）４５ｍｌにて
溶解後、同Ｉ！衛液で透析した。更に遠心分ＪＩｌ後、
不溶性蛋白を除去し、その上清５２ｍ１を回収した。

更に、５０°Ｃにて１０分熱処理を行い、沈澱する蛋白
を除去した。その回収液５０ｍ１ヲアラカシめ５ｍＭ　
　リン酸Ｉ！１ｌｌｉｉｉ（ｐＨ７，４）で平衡化した
ＤＥＡＥ　セファローズファスト　フロー（ファルマシ
ア社）のカラムに付し、５ｍＭ　　リン酸１１ｆＩ液（
ｐＨ７，４）で溶比させた。

二の溶出液をアミコン社製限外ろ過機（ＹＭＩＯ膜）に
より濃縮し、　１３０ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液
を５ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて透析後、
１３２ｍｌの蛋白質溶液を得た。この蛋白質溶液を５ｍ
Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡化したＣＭ
　セファローズファスト　フロー（ファルマシア社）の
カラムに吸着させ、５ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）にて洗浄後、ＮａＣ１を含む５ｍＭ　　リン酸Ｉ！
衛液（ｐＨ７，０）にて段階的濃度勾配により溶出した
。このペプチドを含む分画を回収し、リン酸ｍ衝液に対
し透析後、Ｌ９２９試験により活性を求め、各精製過程
における比活性および回収率を求めた。なお、蛋白質定
量は、バイオラッド社製プロティン・アッセイ・システ
ムを用いて測定した。

この結果を第２表に示す。

（８）精製した蛋白質の純度検定 精製した蛋白質２μｇを１５％５ＤＳ ＰＡＧＥにて泳動後、クマシブルーにて染色し、脱色後
、ＬＫＢレーザースキャナーにて純度検定した。その結
果、本発明にて精製した蛋白質は、純度９５％以上で回
収されていた。

実施例３ 組換え型ＬＴ　（ＴＬＴ）の構築と発現（１）ｐｔｒｐ
　　ＭＬＴ　ベクターからｔｒｐプロモータ一部分の取
得 実施例２の（１）と同様にして、ｐｔ　ｒｐＭＬＴ　　
ＤＮＡから１２９ｂｐのプロモーター領域（遺伝子６）
を得た。

（２）ＬＴ先頭部分の構築 以下に示す４つのオリゴヌクレオチドからＳＤ領領域開
始コドンを１３塩基の距離に保ち、同時にＬＴの先頭部
分をコードする遺伝子（遺伝子１０）を調製した。

（遺伝子１０調製のためのオリゴヌクレオチド）（４）
３’　ＧＣＡＧＴＣＧＴＧＧＧＧＴＴＣＴ上記オリゴヌ
クレオチドのうち（２）および（３）の各０．１０Ｄを
滅菌水１５μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ、４００ｍＭＡＴＰ、１０倍量のカイネーション緩衝
液を加えて３０μｍとし、３７°Ｃで２時間反応させた
。反応終了後、６５°Ｃで１ｏ分間熱処理し、酵素を失
活させた。その後、（１）〜（４）のオリゴヌクレオチ
ド各０．０５０　Ｄを１本のチューブにまとめ、アニー
リング！！衝液を等量大れ、９０″０３分反応しゆっく
り冷却した。

これにＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位（宝社）とＩＭ
ＤＴＴ１ｕユ、１０ｍＭＡＴＰ　　１０μｍ、アニーリ
ングＷ面液　７μｌを入れ、１００μｍとした。その後
、１６℃で１６時間反応させ、１０％　ＰＡＧＥゲルに
て泳動後、目的の遺伝子１ｏを切出し、３７°Ｃにて溶
出した。得られた遺伝子１０は、次に示す塩基配列を有
していた。

遺伝子１０ ＣＧＡ、ＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＴ
ＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣ
ＧＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＧＴＣＧＴＧＧ
ＧＧＡＡＧＡＴＧＣＡ ＴＣＴ （３）ＬＴ遺伝子の取得 ｐｔｒｐ　　ＭＬＴ　　ＤＮＡを制限酵素Ｎ５ｉ１　（
ＮＥＢ社）−ＨｉｎｄＩｎ　（東洋結社）を用いて切断
後、１％低融点アガロースゲルで泳動し、４６５ｂｐか
らなる遺伝子く遺伝子８）を回収した。

（４）ブルースクリプト　Ｍ２Ｓ　　８ＫＩＩ（＋）の
切断 ブルースクリプトＭ１３　６ＫＩＩ（＋）２μｇ（東洋
結社）を制限酵素ＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄｍにて切断後
、０．８％低融点アガロースゲルにて泳動し、ＥｔＢｒ
染色後、目的の２．９ｋｂからなるプラスミドＤＮＡ（
遺伝子９〉を得た。

（５）ｔｒｐプロモーターを保有しかつＴＬＴを保有す
るプラスミドの構築 遺伝子６．８．９．１０にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せ、ＴＬＴの遺伝子を有するプラスミド（ｐＢｔｒｐ　
　ＴＬＴ）を得た。更に一７０℃で冷凍保存しておいた
形質転換用ＨＢＩＯＩ株菌体を融解し、この懸濁液１０
０μｍに、ｐＢｔｒｐＭＴＬＴを２０ｎｇ添加した。４
５分水冷徨、４２°Ｃで９０秒間ヒートショックを与え
、２分氷冷し方。ＳＯＣ培地９００μｍを添加し、３７
℃で１時間培Ｉｉ後、懸濁液を０．１ｍｌ／ｍ１のアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート上にまき、３７゛
Ｃで一夜培養し、　ｐＢｔｒｐ　　ＴＬＴを有する形質
転換体を得た。

この形質転換体からＤＮＡを分離し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ−Ｈｉｎｄ［ＩＩで切断した後、１％アガロースゲル
にて泳動し、ＥｔＢｒ染色にて６３７ｂｐのフラグメン
トを確認した。

（６）ｐＢｔｒｐ　　ＴＬＴの発現 ｐＢｔｒｐ　　ＴＬＴについて、３７℃の条件での蛋白
質の発現を確認した。ｐＢｔｒｐＴＬＴの単一コロニー
を、２．５　μｇ　／　ｍ　１トリプトフアンを含有す
るＭ９ＣＡ培地（Ｍ９最小培地、１％グルコース、１ｍ
ＭＭｇ５Ｏａ、０　、１　ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２，０，
５％カザミノ酸、０．１　　ｍｇ／ｍｌ　　チアミン−
塩酸、０．１ｍｇ／ｍｌ　　アンピシリン、１００ｍＭ
　Ｈｅｐｅｓ）にうえつけ、３７℃にて一夜培養した。

翌日新しいＭ９ＣＡ培地ニ１　／　５０量うえ、０Ｄｓ
ｏｏ＝０．５まで培！２後、３βインド一ルアクリル酸
２０μｇ／　ｍ　１を添加し、更に３７°Ｃにて１６時
間培養した。培養絣了後１ｍｌの菌体液を１．５ｍｌの
遠心管に移し、遠心にて菌体を得た。

この菌体を２００μｍのＳＤＳ　　ＰＡＧＥ用＃！衝液
にて溶解し、９０℃で５分熱処理を加え、１５％　ＳＤ
Ｓ　　ＰＡＧＥにて泳動した。

泳動紡了後、クマシブルーにて染色し、次いで脱色した
。脱色後、ＬＫＢレーザースキャナーにて、全蛋白質当
りのＴＬＴの発現量を測定したところ、３７℃の培養条
件で、全蛋白質当り１０％のＴＬＴ蛋白質の発現が確認
された。これは、３７℃の培養条件では、′？１当り１
０〜２０ｍｇの蛋白質量に相当する。

（７）蛋白質の生産および精製 ｐＢｔｒｐ　　ＴＬＴを、２　、５　μｇ　／　ｍ　１
トリプトフアンを含有するＭ９ＣＡ培地２００ｍ１にて
一夜培養し、この培養液を７１のＭ９ＣＡ培地ニ接種シ
、ＯＤ　ａｏｏ　＝　０　、５まで３７℃にて培養した
。その後、３βインドールアクリル酸を最纒濃度２０μ
ｇ　／　ｍｌになるように加え、更に１６時間培養した
後、遠心分離により菌体を回収した。

得られた菌体１６．９２　ｇ／ｗｅ　ｔ　（３，５１分
）を３０ｍＭ　ＮａＣ１及び０．１　ｍＭｐ−ＡＰＭＳ
Ｆを含む５０ｍＭ　　トリス塩酸（ｐＨ８，０）１２０
ｍｌに懸濁し、この懸濁液を高圧ホモジナイザー（ＲＡ
ＮＮＩＥ社〉に６０００　ｐ；ｓ、ｉで３回通し、菌体
を破壊した。更に１２０ｍ１の同一緩衝液にて高圧ホモ
ジナイザー内を洗浄し、この回収液と破壊液を遠心分離
し、粗抽出液を得た。

この粗抽出液２５０ｍ１に最駐漬度として０．１％にな
るようにポリエチレンイミンを添加し、４℃にて１０分
撹拌後、遠心分離を行い、除核酸を行なった。上清２３
５ｍ１を回収し、硫酸アンモニウムを５０％飽和となる
ように添加後、４°Ｃにて４時間撹拌後、遠心分離を行
い、沈澱として粗蛋白を得た。

この粗蛋白を５ｍＭ　　リン酸１１面液（ｐＨ７，４）
４５ｍｌにて溶解後、同１１衝液で透析した。更に遠心
分離後、不溶性蛋白を除去し、その上清６４．５ｍｌを
回収した。この上清を５０℃にて１０分熱処理に付し、
沈澱する蛋白を除去した。その回収Ｍ６３．５ｍｌをあ
らかじめ５ｍＭリン酸ａ酸液Ｓ液Ｈ７，４）で平衡化し
たＤＥＡＥ　　セファローズファスト　フロー（ファル
マシア社）のカラムに付し、５ｍＭ　　リン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）で溶出させた。

この溶出液（素通り分Ｄｉ）２５０ｍｌをｐＨ７，０に
調整した。得られた蛋白質溶液を５ｍＭ　　リン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）にて平衡化したＣＭ　　セファローズ
ファスト　フロー（ファルマシア社）のカラムに吸着さ
せ、５　　ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて洗
浄後、ＮａＣ１を含む５ｍＭ　　リンＭ緩ｉ！ｉ液（ｐ
Ｈ７゜０）にて段階的濃度勾配により溶出した。　ペプ
チドを含む分画を回収し、リン酸緩衝液に対し透析後、
Ｌ９２９試験により活性を求め、各精製過程における比
活性および回収率を求めた。なお、蛋白質定量は、バイ
オラッド社製プロティン・アッセイ・システムを用いて
測定した。

この結果を第３表に示す。

（８）精製した蛋白質の純度検定 精製した蛋白ｌ１２μｇを１５％　５ＤＳＰＡＧＥにて
泳動後、クマシブルーにて染色し脱色後、ＬＫＢレーザ
ースキャナーにて純度検定した。その結果、本発明にて
精製した蛋白質は、純度９５％以上で回収されていた。

実施例　４ （１）ｔｒｐプロモーター及びＭＬＴ横道遺伝子の単離 ｐＢｔｒｐＭＬＴプラスミドＤＮＡを制限酸素ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩｌ　（東洋紡〉にて切断後、１％低融
点アガロース・ゲルで泳動し、ＥｔＢｒ染色後、６２９
ｂｐのフラグメント（遺伝子１１）を得た。この塩基配
列及びこれがコードするペプチドを第４図に示す。

（２）ｐｕｃ９ベクターの切断回収 ｐｕｃ９　２μｇ（ファルマシア社〉を制限酸素Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄｍにて切断後、０．８％低融点アガロー
ス・ゲルにて泳動し、ＥｔＢｒ染色後、目的の２．７Ｋ
ｂからなるプラスミドＤＮＡを得た（遺伝子１２）。

（３）ｔｒｐプロモーターを保有し、かつ、ＭＬＴを保
有するプラスミドの構築 遺伝子１１と遺伝子１２にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用さ
せ、ＭＬＴの遺伝子を有するプラスミド（ｐ９ｔｒｐＭ
ＬＴ　）を得た。更に、−７０・Ｃで凍結保存しておい
た形質転換用ＨＢ１０１株菌体を融解し、この懸ｓＲ液
１００μｍに、ｐ９ｔｒｐ　　Ｍ　ＬＴを２０ｎｇ添加
した。水冷４５分反応律、４２°Ｃで９０秒間ヒートシ
ョックを与え、２分氷冷したＳＯＣ培地９００μｍを添
加し、３７℃で１時間培養後、懸濁液を０．１ｍｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート上にまき
、３７℃で一夜培養し、遺伝子１１．１２を有する形質
転換体を得た。この形質転換体からＤＮＡを分離し、制
限酵素　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｍ　で切断した後、１％
アガロ−スゲルにて泳動させ、ＥｔＢｒ染色にて６２９
ｂｐのフラグメントを確認した（遺伝子１１）。

（４）ｐ９ｔｒｐ　ＭＬＴの発現 ｐ９ｔｒｐ　　ＬＴの、３７℃の条件での蛋白質の発現
を確認した。ｐ９ｔｒｐ　ＭＬＴの単一コロニーを、２
．５μｇ／ｍｌトリプトファンを含有するＭ９ＣＡ培地
（Ｍ９最少培地、１％グルコース、１ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，
，０、１ｍＭ　Ｃａ　０１ｇ、０．５％　カザミノ酸、
０．１ｍｇ／ｍｌ　　チアミン−ＨＣｌ、０．１ｍ　ｇ
　／　ｍ　１　　アンピシリン、１００ｍＭ　Ｈｅｐｅ
ｓ）にうえつけ、３７℃にて一夜培養した。翌日新しい
Ｍ９ＣＡ培地に１７５０貴うえ、ＯＤ、。。＝０．５ま
で培養後、３βインドールアクリル［２０℃ｇ　／　ｍ
　１を添加し、更【こ　３７°Ｃにて１６時間培養した
。培養終了後１　ｍ　ｌの菌体液を１．５ｍｌの遠心管
に移し、遠心にて菌体を得た。この菌体を２００μ１Ｏ
８ＤＳ　　ＰＡＧＥｆｉｆＩ液にて溶解し、９０°Ｃで
５分間熱処理を加え、１５％　ＳＤＳ　　ＰＡＧＥにて
泳動した。泳動終了後、クマシブルーにて染色し、次い
で脱色した。

脱色後、ＬＫＢレーザースキャナーにて、全蛋白質当り
のＭＬＴ発現量を測定した所、３７°Ｃの培養条件では
、全蛋白質当り１０％のＭＬＴ蛋白質の発現が確認され
た。これは、３７℃の培養条件では、１当り１０〜２０
ｉ＋ｇの蛋白質量に相当する。

（５）活性の測定 （４）にて発現を確認した培養液の残り１ｍｌを遠心に
て分離し、菌体を１ｍｌのＰＢＳ　（−）緩衝液に懸濁
し、１０分間超音波処理おこなったのち、遠心分離によ
り、蛋白質上清を得た。この蛋白質上清を０．２２ミク
ロンのフィルターを通した後、Ｌ９２９細胞障害性試験
を行なった所、菌体液１ｍｌ当り１ｘｌｏ’ｕｎｉｔ／
ｍｌの活性が確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第３図は、本発明ベクター構築の手順を示
す図面である。 第４図は、遺伝子１１及びこれがコードするペプチドを
示す図面である。 以　　　　　上 出 願 人 株 式

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）開始コドンの１３塩基上流にＳＤ領域を有し、−
   １０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ、−３５領域の塩基
   配列がＴＴＧＡＣＡであり、リンホトキシン類をコード
   する遺伝子を除いた大きさが２．７〜３．１ｋｂである
   リンホトキシン類発現ベクター。
2. （２）開始コドンの１３塩基上流にＳＤ領域を有し、−
   １０領域の塩基配列がＴＴＡＡＣＴ、−３５領域の塩基
   配列がＴＴＧＡＣＡであり、リンホトキシン類をコード
   する遺伝子を除いた大きさが２．７〜３．１ｋｂである
   リンホトキシン類発現ベクターで宿主微生物を形質転換
   し、得られた微生物を培養することを特徴とするリンホ
   トキシン類の製造法。
3. （３）培養をインドールアクリル酸の存在下実施する請
   求項第２項記載のリンホトキシン類の製造法。