ES2395945T3 - Expandasas mutantes - Google Patents

Abstract

Una expandasa mutante que es una variante de un polipéptido modelo con actividad de expandasa mediante laque la treonina en la posición 89 de aminoácido en el péptido modelo se ha sustituido por lisina usando lanumeración de las posiciones de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la enzima expandasa como serepresenta en SEC ID NO: 1, y mediante la cual el polipéptido modelo con actividad de expandasa tiene lasecuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene almenos 70% de identidad con SEC ID NO: 1.

Description

Expandasas mutantes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a enzimas expandasas mutantes, a polinucleótidos que codifican tales enzimas, a microorganismos transformados con dichos polinucleótidos que codifican dichas enzimas expandasas mutantes, y al uso de tales enzimas expandasas mutantes o tales microorganismos en la expansión anular del ácido 5carboxipentanoil-6-aminopenicilánico (adipil-6-APA = ad-6-APA).

Antecedentes de la invención

Los antibióticos beta-lactámicos constituyen el grupo más importante de compuestos antibióticos con una larga historia de uso clínico. Entre este grupo, los sobresalientes son las penicilinas y cefalosporinas. Las penicilinas se producen de forma natural por diversos hongos filamentosos tales como Penicillium (por ejemplo P. chrysogenum). Las cefalosporinas son producidas de forma natural por diversos microorganismos tales como Acremonium (por ejemplo A. chrysogenum) y Streptomyces (por ejemplo Streptomyces clavuligerus).

Como resultado de técnicas de mejora de cepas clásicas, los niveles de producción de los antibióticos en P. chrysogenum y A. chrysogenum han aumentado notablemente durante las últimas décadas. Con el conocimiento creciente de las rutas biosintéticas que conducen a penicilinas y cefalosporinas, y el advenimiento de la tecnología de ADN recombinante, ahora hay disponibles nuevas herramientas para la mejora de cepas de producción.

Se ha identificado a la mayoría de las enzimas implicadas en la biosíntesis de !-lactama, y se han clonado sus genes correspondientes, como se puede encontrar en Ingolia y Queener, Med Res Rev (1989) 9:245-264 (ruta biosintética y enzimas), y Aharonowitz, Cohen, y Martin, Ann Rev Microbiol (1992) 46:461-495 (clonación de genes).

Las dos primeras etapas en la biosíntesis de penicilina en P. chrysogenum son la condensación de los tres aminoácidos ácido L-5-amino-5-carboxipentanoico (ácido L-∀-aminoadípico) (A), L-cisteína (C) y L-valina (V) en el tripéptido LLD-ACV, seguido de la ciclación de este tripéptido para formar isopenicilina N. Este compuesto contiene la estructura típica de !-lactama.

La tercera etapa implica la sustitución de la cadena lateral hidrófila del ácido L-5-amino-5-carboxipentanoico por una cadena lateral hidrófoba mediante la acción de la enzima aciltransferasa (AT).

En el documento EP-A-0448180 se ha descrito que la reacción de intercambio enzimática mediada por AT tiene lugar dentro de un orgánulo celular, el microcuerpo. La observación de que se pueden formar cantidades sustanciales de desacetoxicefalosporina C (DAOC) mediante transformantes de P. chrysogenum no pronosticados que expresan desacetoxicefalosporina C sintasa (EC 1.14.20.1 - DAOCS, indicada aquí en lo sucesivo como expandasa) implica la presencia de cantidades significativas de penicilina N, el sustrato natural para la expandasa, en P. chrysogenum (Alvi et al., J Antibiot (1995) 48:338-340). Sin embargo, las cadenas laterales de D-∀aminoadipilo de DAOC no se pueden eliminar fácilmente.

Las cefalosporinas son mucho más caras que las penicilinas. Una razón es que algunas cefalosporinas (por ejemplo, cefalexina) se obtienen a partir de penicilinas mediante un número de conversiones típicas. Otra razón es que, hasta ahora, sólo se pudieron fermentar cefalosporinas con una cadena lateral de D-∀-amino-adipilo. La cefalosporina C, de lejos el material de partida más importante a este respecto, es muy soluble en agua en cualquier pH, implicando así a procesos de aislamiento largos y costosos que usan tecnología en columna engorrosa y cara. La cefalosporina C obtenida de esta manera se ha de convertir en cefalosporinas usadas terapéuticamente mediante un número de conversiones químicas y enzimáticas.

Los métodos actualmente favorecidos en la industria para preparar el ácido 7-amino-desacetoxicefalosporánico (7-ADCA) intermedio implican etapas químicas complejas que conducen a la expansión y derivatización de penicilina

G. Una de las etapas químicas necesarias para producir 7-ADCA implica la expansión de la estructura anular de penicilina de 5 miembros a una estructura anular de cefalosporina de 6 miembros (véase, por ejemplo, el documento US 4.003.894). Este procesamiento químico complejo es tanto caro como nocivo para el medioambiente.

En consecuencia, hay un gran deseo de sustituir tales procesos químicos por reacciones enzimáticas tales como catálisis enzimática, preferiblemente durante la fermentación. Una clave para la sustitución del proceso de expansión química por un proceso biológico es la enzima central en la ruta biosintética de cefalosporinas, la expandasa.

Se encontró que la enzima expandasa procedente de la bacteria Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) lleva a cabo, en algunos casos, las expansiones anulares de penicilina. Cuando se introduce en P. chrysogenum, puede convertir la estructura anular de penicilina en la estructura anular de cefalosporina, como se describe en Cantwell et al., Proc R Soc Lond B (1992) 248:283-289. La enzima expandasa se ha caracterizado bien (documento EP-A0366354) tanto bioquímica como funcionalmente, y tiene su gen correspondiente. Se han descrito tanto los mapas físicos del gen cefE (el gen que codifica la enzima expandasa de S. clavuligerus – documento EP-A-0341892), la

secuencia de ADN y estudios de transformación en P. chrysogenum con cefE. La secuencia de ADN y de aminoácidos de la enzima expandasa de S. clavuligerus se representan en SEC ID NO 1.

Otra fuente para una enzima expandasa es la bacteria Nocardia lactamdurans (N. lactamdurans, antiguamente S. lactamdurans). Se han descrito tanto las propiedades bioquímicas de la enzima como la secuencia de ADN del gen que codifica la enzima – véanse Cortes et al., J Gen Microbiol (1987) 133:3165-3174 y Coque et al., Mol Gen Genet (1993) 236:453-458, respectivamente. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la enzima expandasa de N. lactamdurans se representan en SEC ID NO 2.

Recientemente, se han encontrado nuevos genes (cefE) y enzimas expandasas en Streptomyces jumonjinensis, Streptomyces ambofaciens y Streptomyces chartreuses - véase Hsu et al. (2004), Appl. and Environm. Microbiol. 70, 6257-6263. La Tabla 1 resume las identidades de secuencias de aminoácidos de varias expandasas, y muestra que las identidades de secuencias oscilan de 67 a 85%, dependiendo de la fuente de la enzima.

Tabla 1: Identidades de secuencias de aminoácidos de varias expandasas (datos tomados de Hsu et al.).

Fuente

S. clavuligerus S. jumonjinensis S. ambofaciens S. chartreuses N. lactamdurans

S. clavuligerus

100

S. jumonjinensis

81 100

S. ambofaciens

81 85 100

S. chartreuses

76 77 79 100

N. lactamdurans

70 68 70 67 100

En la biosíntesis de cefalosporinas, que tiene lugar principalmente en células procariotas, la desacetoxicefalosporina C se convierte subsiguientemente en desacetilcefalosporina C mediante la enzima desacetilcefalosporina C sintasa, también denominada desacetoxicefalosporina C hidroxilasa o hidroxilasa (EC 1.14.11.26 - DACS). Los genes que codifican tales hidroxilasas se denominan genes cefF (por ejemplo, véase Hsu et al.). La expandasa encontrada en células eucariotas, por ejemplo Acremonium chrysogenum, puede catalizar la conversión directa de penicilina N en desacetoxicefalosporina C debido a la posesión tanto de actividad expandasa como hidroxilasa. Por tanto, el gen codificado se denomina cefEF (véase Hsu et al.).

Como se define aquí, el término expandasa se refiere a enzimas expandasas (EC 1.14.20.1, codificadas por genes cefE) así como expandasas que poseen también además la actividad de hidroxilasa (EC 1.14.20.1 + EC 1.14.11.26, codificadas por genes cefEF).

Puesto que la enzima expandasa cataliza la expansión del anillo de tiazolidina de 5 miembros de penicilina N hasta el anillo de dihidrotiazina de 6 miembros de DAOC, esta enzima sería por supuesto un candidato lógico para sustituir a las etapas de expansión de anillo del proceso químico. Desafortunadamente, la enzima trabaja sobre el intermedio de penicilina N de la ruta biosintética de cefalosporinas, pero no, o muy ineficazmente, sobre las penicilinas baratas ya disponibles como se producen mediante P. chrysogenum, como penicilina V o penicilina G. La penicilina N no está comercialmente disponible, e incluso cuando se expande, su cadena lateral de D-∀-aminoadipilo no se puede eliminar fácilmente por acilasas penicilínicas.

Se ha dado a conocer que la enzima expandasa es capaz de expandir penicilinas con cadenas laterales particulares hasta el derivado de 7-ADCA correspondiente. Este rasgo de la expandasa se ha explotado en la tecnología como se describe en los documentos EP-A-0532341, WO 95/04148 y WO 95/04149. En estas descripciones, la conversión in vitro química convencional de penicilina G en 7-ADCA se ha sustituido por la conversión in vivo de ciertos derivados del ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) en cepas de Penicillium chrysogenum recombinantes transformadas con un gen de expandasa.

Más particularmente, el documento EP-A-0532341 enseña el uso in vivo de la enzima expandasa en P. chrysogenum, en combinación con una cadena lateral de adipilo (en lo sucesivo denominado adipilo) como materia prima, que es un sustrato para la enzima aciltransferasa en P. chrysogenum. Esto conduce a la formación de adipil-6-APA, que se convierte mediante una enzima expandasa introducida en la cepa de P. chrysogenum para producir

adipil-7-ADCA. Finalmente, se describe la eliminación de la cadena lateral de adipilo, que produce 7-ADCA como producto final. Además, el documento EP-A-540210 enseña la producción similar de adipil-7-ADAC y adipil-7-ACA.

Como enfoque alternativo, en el documento EP0828850 se ha propuesto la expansión de penicilina G usando P. chrysogenum transformado con cefE. Además, a fin de incrementar la expansión de penicilina G, se ha descrito el uso del gen mutante cefE de S. clavuligerus. Los documentos US 5.919.680, WO 98/02551, WO 99/33994, WO 01/85951 y EP 1348759 describen todos genes mutantes cefE que codifican supuestamente enzimas que tienen una mayor actividad de expandasa sobre penicilina G.

No obstante, estas expandasas mutantes todavía no proporcionan un procedimiento comercialmente atractivo para la producción de cefalosporinas.

Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar adicionalmente el procedimiento en el que se preparan cefalosporinas a partir de la expansión de adipil-6-APA. Este procedimiento se caracteriza por una eliminación eficiente del material de cadena lateral desde el material central cefalosporínico. Una etapa para mejorar adicionalmente este procedimiento es la mejora de la actividad de expandasa sobre adipil-6-APA.

Descripción de las figuras

1/3. A y B Alineamiento de aminoácidos de mutantes de expandasas mejoradas; SCLAVEIW representa la secuencia de aminoácidos de expandasa de S. clavuligerus; NOCAEIW representa la secuencia de aminoácidos de expandasa de N. lactamdurans; para las otras secuencias, la notación es la siguiente: 309EIWIT representa la secuencia de aminoácidos de expandasa de expandasa mutante H309, etc.

2/3. Representación esquemática del vector pIATWAn.

3/3 Análisis mediante HPLC de una mezcla de ensayo de expandasas según el Ejemplo 3

A. a t = 0 minutos

B. a t = 30 minutos

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona una expandasa mutante que es una variante de un polipéptido modelo con actividad de expandasa que tiene la secuencia como se representa en SEC ID NO. 1 o una secuencias de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con SEC ID NO. 1, y mediante la cual la treonina en la posición 89 de aminoácidos en el péptido modelo se ha sustituido por lisina usando la numeración de la posición de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la enzima expandasa como se representa en SEC ID NO. 1. Preferiblemente, la invención proporciona una expandasa mutante, mediante la cual la expandasa mutante tiene una actividad de expandasa in vitro mejorada de al menos 2 veces con respecto a adipil-6-APA en comparación con el polipéptido modelo con actividad de expandasa de SEC ID NO. 1. La determinación de la actividad de expandasa in vitro con respecto a adipil-6-APA se describe con detalle en los Materiales y Métodos (Ensayo (1)-(3)). Más preferiblemente, la actividad de expandasa in vitro frente a adipil-6-APA de la expandasa mutante está mejorada al menos 2,5 veces, más preferiblemente al menos 3 veces, más preferiblemente al menos 4 veces, más preferiblemente al menos 5 veces, más preferiblemente al menos 6 veces, más preferiblemente al menos 7 veces, más preferiblemente al menos 8 veces, más preferiblemente al menos 9 veces, más preferiblemente al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 11 veces.

En algunas de las enzimas expandasas mutantes descritas aquí, partes de la secuencia de aminoácidos de la expandasa de S. clavuligerus se han sustituido por partes correspondientes de la secuencia de aminoácidos de expandasa de N. lactamdurans. La secuencia de aminoácidos del gen CefE de la cepa ATCC27382 de N. lactamdurans se representa en SEC ID NO: 2.

En la descripción de estas expandasas mutantes, los aminoácidos se numeran según la numeración de las partes homólogas de la secuencia de aminoácidos de la expandasa de S. clavuligerus. La homología de las secuencias de aminoácidos de las expandasas de S. clavuligerus y N. lactamdurans se deriva a partir de la Figura 1 y Tabla 1.

Con “expandasa alterada o mutante” se quiere decir, en el contexto de la presente invención, cualquier enzima que tenga actividad de expandasa, que no se ha obtenido a partir de una fuente natural y para la cual la secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos completa de las enzimas expandasas naturales de S. clavuligerus y N. lactamdurans.

La invención también proporciona una expandasa mutante que se modifica adicionalmente al menos en una posición de aminoácido seleccionada del grupo 1 que consiste en las posiciones 2, 18, 59, 73, 74, 89, 90, 99, 101, 105, 112, 113, 155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277, 278, 280, 281, 284, 293, 300, 307 y 311 usando la numeración de la posición de los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la enzima expandasa codificada por el gen cefE de Streptomyces clavuligerus. La secuencia nucleotídica del gen cefE de Streptomyces clavuligerus, así como la secuencia de aminoácidos codificada por dicho gen cefE, se representan en SEC ID NO: 1. Más preferiblemente, la expandasa mutante se modifica al menos en una posición de aminoácido seleccionada del grupo 2 que consiste en las posiciones 2, 18, 59, 89, 90, 99, 101, 105, 112, 113, 170, 177, 209, 213, 217, 249, 251, 278, 280, 284 y 293. La expandasa mutante también puede haber sido modificada al menos en una posición de aminoácido seleccionada del grupo 1 que no forma parte del grupo 2, junto con al menos una posición de

5 aminoácido seleccionada del grupo 2.

La modificación en una posición de aminoácido puede comprender una sustitución por otro aminoácido, seleccionado del grupo de 20 L-aminoácidos que aparecen en la naturaleza – véase la Tabla 2. Como alternativa, la modificación en una posición de aminoácido puede comprender una supresión del aminoácido en dicha posición. Además, la modificación en una posición de aminoácido puede comprender una sustitución de uno o más

10 aminoácidos en el lado C-terminal o N-terminal de dicho aminoácido.

Tabla 2

Aminoácido

Código de 3 letras Código de 1 letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Ácido aspártico

Asp D

Cisteína

Cys C

Ácido glutámico

Glu E

Glutamina

Gln Q

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptófano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

El polipéptido modelo con actividad de expandasa, como se usa en la presente invención, se selecciona del grupo

que consiste en un polipéptido con actividad de expandasa, que tiene preferiblemente una secuencia de 15 aminoácidos según SEC ID NO: 1, y polipéptidos con actividad de expandasa que tienen una secuencia de

aminoácidos con un porcentaje de identidad con SEC ID NO: 1 de al menos 70%, preferiblemente al menos 75%,

más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, lo más

preferible al menos 95%, tal como las enzimas expandasas que se resumen en la Tabla 1. El más preferido como

polipéptido modelo con actividad de expandasa como se usa en la presente invención es un polipéptido con 20 actividad de expandasa que tiene la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO:1 o que tiene la secuencia de

aminoácidos según SEC ID NO: 2.

Las expandasas mutantes descritas aquí tienen modificaciones en al menos

o 2 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 89, 277, 281 y 300, más preferiblemente en las posiciones 2+281 ó 89+281 ó 277+300.

o 3 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 89, 281, 293 y 311, más preferiblemente en las posiciones 2+89+281 ó 89+281+311 ó 89+281+293.

5 o 4 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 73, 89, 90, 217, 244, 277, 280, 281, 306, 307 y 311, más preferiblemente en las posiciones 2+277+280+281 ó 2+281+307+311 ó 73+89+281+311 ó 89+217+281+311 ó 89+244+281+311 ó 89+281+307+311 ó 277+281+306+311 ó 89+281+306+311 ó 90+281+306+311.

o 5 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 73, 89, 90, 155, 213,

10 249, 278, 281, 293, 300, 306, 307 y 311, más preferiblemente en las posiciones 2+89+281+306+311 ó 2+155+281+306+311 ó 73+89+213+281+311 ó 89+78+218+307+311, 89+281+293+300+311 ó 89+249+281+307+311.

o 6 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 90+105+113+281+306+311.

o 7 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 73, 89, 105, 113, 155,

15 170, 177, 251, 277, 280, 281, 293, 300, 306, 307 y 311, más preferiblemente en 73+89+281+293+300+307+311 ó 105+113+155+177+281+306+311 ó 155+177+277+280+281+306+311.

o 8 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 89, 90, 99, 105, 113,

155, 177, 277, 281, 307 y 311 más preferiblemente en 2+90+99+105+113+281+306+311 ó 20 2+90+105+113+155+177+277+281

o 9 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2+90+105+113+155+177+281+306+311.

o 10 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 59, 90, 101, 105, 113, 155, 177, 209, 277, 281, 307 y 311 más preferiblemente en 2+90+105+113+155+177+277+281+306+311.

25 o 11 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 2, 90, 105, 113, 155, 177, 277, 281, 293, 307, 311.

Las sustituciones de algunos de los aminoácidos de expandasa implican preferiblemente la sustitución de:

# histidina en la posición 18 según SEC ID NO 1 por cisteína, serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, lisina y arginina; más preferiblemente serina, treonina, asparagina, glutamina, lisina y arginina; lo más 30 preferible arginina;

# metionina en la posición 74 según SEC ID NO 4 por treonina o por un aminoácido hidrófobo tal como valina, leucina, isoleucina y fenilalanina, o por un aminoácido anfifílico tal como tirosina, triptófano, histidina, glutamina y asparagina, más preferiblemente treonina o isoleucina;

# treonina en la posición 89 según SEC ID NO 1 preferiblemente por un aminoácido cargado, preferiblemente 35 un aminoácido cargado negativamente tal como ácido aspártico o ácido glutámico, lo más preferible un aminoácido cargado positivamente tal como lisina, arginina o histidina; siendo lo más preferido lisina;

# serina en la posición 112 según SEC ID NO 1 preferiblemente por treonina;

# histidina en la posición 244 según SEC ID NO 1 por glutamina o asparagina, más preferiblemente glutamina;

# ácido aspártico en la posición 284 según SEC ID NO 1 y en la posición 285 en SEC ID NO 4 por un

40 aminoácido con una cadena lateral polar tal como serina, treonina, asparagina, glutamina, acido glutámico, histidina, lisina, arginina y tirosina, más preferiblemente asparagina, glutamina, acido glutámico, lisina y arginina; siendo lo más preferido asparagina;

# glicina en la posición 300 según SEC ID NO 1 por un aminoácido con un resto pequeño, tal como alanina, serina, treonina, cisteína, valina, isoleucina, leucina, asparagina y acido aspártico, más preferiblemente 45 valina.

Además, se describen expandasas mutantes que son variantes del grupo que consiste en las expandasas de tipo salvaje de S. clavuligerus, S. jumonjinensis, S. ambofaciens, S. chartreuses y N. lactamdurans. Las más preferidas son expandasas mutantes como se definen aquí anteriormente que son variantes de la expandasa de tipo salvaje de

S. clavuligerus o N. lactamdurans. Las más preferidas son expandasas mutantes como se definen aquí

50 anteriormente que son variantes de la expandasa de tipo salvaje de S. clavuligerus. Las expandasas mutantes preferidas que son mutantes de la expandasa de Streptomyces clavuligerus tienen modificaciones en al menos

o 2 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, T89, L277, C281 y G300

o 3 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, T89, C281, T293 y A311

o 4 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, M73, T89, N90, Y217, H244, L277, E280, C281, R306, R307 y A311

o 5 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, M73, T89, N90, C155, T213, R249, A278, C281, T293, R306, R307 y A311

o 6 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N90+T105+G113+C281+R306+A311

o 7 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, M73, T89, T105, G113, C155, H170, P177, D251, L277, E280, C281, T293, G300, R306, R307 y A311

o 8 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, T89, N90, M99, T105, G113, C155, P177, L277, C281, R306, R307 y A311

o 9 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2+N90+T105+G113+C155+P177+C281+R306+A311

o 10 o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, S59, N90, T105, G113, T105, G113, C155, P177, G209, L277, C281, R306, R307, A311

o 11 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en D2, N90, T105, G113, C155, P177, L277, C281, R306, R307, A311.

Las modificaciones preferidas en las posiciones respectivas son D2N, D2H, D2Y, S59G, M73H, M73I, T89A, T89K, T89V, N90W, N90S, M99T, T105I, Y101F, G113D, C155W, H170Y, P177L, G209A, T213A, Y217H, H244R, R249C, D251G, L277Q, L277T, A278V, E280G, C281Y, T293K, G300S, R306supresión, R307supresión, R370T y A311D. En esta notación, la letra que sigue al número representa el aminoácido (código de una letra) presente en la expandasa mutante. La supresión en la posición R306 o R307 significa que la arginina original en la posición 306 ó 307 ya no está presente en la expandasa mutante. Las expandasas mutantes muy preferidas son las expandasas mutantes que se resumen en la Tabla 3.

Preferiblemente, las expandasas mutantes descritas aquí tienen una actividad de expandasa mejorada sobre adipil-6-APA como se define aquí anteriormente, y las expandasas mutantes proporcionadas por la presente invención tienen igualmente una actividad de expandasa mejorada sobre Pen-G. Preferiblemente, las expandasas mutantes tienen una actividad de expandasa mejorada tanto sobre adipil-6-APA así como sobre Pen-G. Las expandasas mutantes con una actividad mejorada sobre Pen-G se pueden usar ventajosamente en un procedimiento para la producción de fenilacetil-7-ADCA como se describe posteriormente más abajo.

La presente invención también proporciona expandasas mutantes con una actividad de expandasa disminuida o incluso ausente con isopenicilina N (iPN). Preferiblemente, la actividad de expandasa con adipil-6-APA o Pen-G no se ve afectada, sino más preferiblemente la actividad de expandasa con adipil-6-APA o Pen-G, o con ambos, está mejorada como se define aquí anteriormente. La ventaja de estas expandasas mutantes más preferidas es que la actividad de expandasa disminuida o incluso ausente con isopenicilina N (iPN) da como resultado menos subproducto en un proceso de fermentación para producir ad-7-ADCA o fenilacetil-7-ADCA.

Las expandasas mutantes preferidas tienen una actividad de expandasa disminuida o incluso ausente con isopenicilina N (iPN) como sustrato, opcionalmente combinado con una actividad de expandasa mejorada sobre ad-6-APA como sustrato, y se han modificado en la posición 89 según la numeración de aminoácidos de SEC ID NO 1, con lo que el aminoácido de origen natural se ha sustituido por lisina.

Una expandasa mutante muy preferida se selecciona del grupo que consiste en H101, H106, H111, H122, H127, H262, H301, H305, H308, H309, H401, H402, H403, H501, H502, H503, H504, H505, H506, H507, H508, H601, H602, H603, H604, H605, H606, H607, H608, H609, H650, H651, H652, H653, H654, H655, H656, H657, H658, H659, H660, H661, H662, G601, G602, G603, G604, G605, G606, G607, G608, G609, G610, G611, G613 y G614 (véase la Tabla 3).

En un segundo aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la expandasa mutante de la presente invención. El polinucleótido que codifica la expandasa mutante según la presente invención puede ser cualquier polinucleótido que codifique la secuencia de aminoácidos apropiada según la invención. Esto implica que puede corresponder al gen cefE de S. clavuligerus, excepto para los nucleótidos que codifican las modificaciones en las posiciones de aminoácidos respectivas. Como alternativa, el polinucleótido de la invención puede comprender una secuencia codificante en la que el uso de codones para los diversos aminoácidos se desvía del uso de codones

en S. clavuligerus y/o en N. lactamdurans. Por ejemplo, el uso de codones se puede adaptar al uso de codones de una célula hospedante particular, que se transformará o se ha transformado con el fragmento de ADN que codifica la expandasa alterada.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión o casete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención como se define aquí anteriormente.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula transformada, transformada con el polinucleótido de la invención o el vector de expresión o casete de expresión de la invención. La célula hospedante transformada se puede usar para la producción de la expandasa mutante de la invención, o la célula hospedante se puede usar para la producción de un compuesto beta-lactámico de interés.

Las células hospedantes para la producción de la expandasa mutante de la invención son preferiblemente células hospedantes que son conocidas en la técnica por su producción eficiente de proteínas o enzimas, ya sea extracelular o intracelularmente, por ejemplo microorganismos tales como hongos, levaduras y bacterias. Los ejemplos de células hospedantes preferidas comprenden, pero no se limitan a, los siguientes géneros: Aspergillus (por ejemplo A. niger, A. oryzea), Penicillium (por ejemplo P. emersonii, P. chrysogenum), Saccharomyces (por ejemplo S. cerevisiae), Kluyveromyces (por ejemplo K. lactis), Bacillus (por ejemplo B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens), Escherichia, (E. coli), Streptomyces (por ejemplo S. clavuligerus).

Las células hospedantes para la producción de un compuesto beta-lactámico de interés son preferiblemente células hospedantes que son conocidas en la técnica por su producción eficiente de compuestos beta-lactámicos. Los ejemplos de células hospedantes preferidas comprenden, pero no se limitan a, los siguientes géneros: especies de Penicillium (por ejemplo P. chrysogenum), Acremonium (por ejemplo A. chrysogenum), Streptomyces (por ejemplo

S. clavuligerus), Nocardia (por ejemplo N. lactamdurans), Lysobacter (por ejemplo L. lactamgenus) y Flavobacterium.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de la expandasa mutante de la invención, que comprende cultivar la célula hospedante transformada según la invención en condiciones que conduzcan a la producción de la expandasa mutante, y, opcionalmente, recuperar la expandasa mutante. La expandasa mutante recuperada se puede usar ventajosamente en un procedimiento in vitro para producir una cefalosporina deseada a partir de una penicilina correspondiente, por ejemplo la expandasa mutante recuperada se puede usar en un procedimiento para producir fenilacetil-7-ADCA a partir de Pen-G, o adipil-7-ADCA a partir de adipil-6-APA.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un compuesto beta-lactámico de interés, que comprende cultivar la célula hospedante transformada según la invención en condiciones que conduzcan a la producción del compuesto beta-lactámico de interés, y, opcionalmente, recuperar el compuesto betalactámico. Los compuestos beta-lactámicos preferidos pertenecen al grupo de cefalosporinas tales como fenilacetil-7-ADCA, adipil-7-ADCA, adipil-7-ADAC y adipil-7-ACA. En una realización preferida, la invención proporciona un procedimiento para la producción de fenilacetil-7-ADCA o adipil-7-ADCA cultivando una cepa seleccionada de Penicillium chrysogenum, que se ha transformado con un polinucleótido seleccionado de la invención que codifica una expandasa mutante de la invención. Para la producción de fenilacetil-7-ADCA, se selecciona una expandasa mutante que tiene un factor de mejora elevado sobre Pen-G como sustrato. Para la producción de adipil-7-ADCA, se selecciona una expandasa mutante que tiene un factor de mejora elevado sobre ad-6-APA como sustrato.

En otra realización preferida, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 7-ADCA, que comprende el procedimiento para la producción de fenilacetil-7-ADCA o adipil-7-ADCA como se describe aquí anteriormente, seguido de tras la purificación opcional de dichos derivados de 7-ADCA, una etapa del procedimiento en la que la cadena lateral de fenilacetilo o de adipilo de fenilacetil-7-ADCA y de adipil-7-ADCA, respectivamente, se separa por escisión generando de ese modo 7-ADCA y el ácido de cadenas laterales liberado. Dicha escisión se puede obtener por medios químicos o, más preferiblemente, de forma enzimática usando una enzima acilasa. Las acilasas adecuadas para la escisión de la cadena lateral de adipilo son obtenibles a partir de diversas especies de Pseudomonas tales como Pseudomonas SY-77 o Pseudomonas SE-83. Las acilasas adecuadas para la escisión de las cadenas laterales de fenilacetilo son las acilasas penicilínicas de Escherichia coli o Alcaligenes feacalis.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de una cefalosporina a partir de una penicilina correspondiente, mediante el cual la expansión del anillo tiazolidínico de 5 miembros de la penicilina al anillo dihidrotiazínico de 6 miembros de la cefalosporina se produce en un procedimiento in vitro, catalizado por una expandasa mutante de la invención. En un procedimiento preferido, adipil-6-APA se expande al adipil-7-ADCA correspondiente por una expandasa mutante de la invención, preferiblemente una expandasa mutante que tiene un factor de mejora elevado sobre adipil-6-APA como sustrato. En otro procedimiento preferido, Pen-G se expande al fenilacetil-7-ADCA correspondiente mediante una expandasa mutante de la invención, preferiblemente una expandasa mutante que tiene un factor de mejora elevado sobre Pen-G como sustrato.

El procedimiento puede estar seguido por, tras la purificación opcional de dichos derivados de 7-ADCA, una etapa del procedimiento en la que las cadenas laterales de adipil-7-ADCA y fenilacetil-7-ADCA son separadas por escisión, generando de ese modo 7-ADCA y el ácido de cadenas laterales liberado – véase más arriba.

El producto final deseado, 7-ADCA, se puede recuperar según métodos conocidos en la técnica que implican la escisión química o enzimática de la cadena lateral de adipil-7-ADCA o fenilacetil-7-ADCA, y opcionalmente el 7-ADCA resultante se puede purificar y/o cristalizar adicionalmente.

La clonación del gen que codifica un polipéptido modelo con actividad de expandasa se puede llevar a cabo según métodos conocidos en la técnica.

Los polipéptidos modelo preferidos con actividad de expandasa se seleccionan del grupo que consiste en un polipéptido con actividad de expandasa obtenible de Streptomyces clavuligerus, preferiblemente que tienen una secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 1, y polipéptidos con actividad de expandasa que tienen una secuencia de aminoácidos con un porcentaje de identidad con SEC ID NO: 1 de al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, lo más preferible al menos 95%, tal como las enzimas expandasas que se resumen en la Tabla 1.

Se puede emplear cualquier técnica de mutagénesis que dé como resultado mutaciones sobre todo el gen. Las técnicas adecuadas son PCR (reacción en cadena de la polimerasa) propensa a error (EP), y/o usando PCR con cebadores saturados específicos de la mutación (sMPP) exactamente según del documento WO 03/010183.

Materiales y Métodos

1. General

Los oligonucleótidos se sintetizaron por Invitrogen (Carlsbad CA, US).

La secuenciación del ADN se llevó a cabo por SEQLAB (Göttingen, Alemania) o por Baseclear (Leiden, Países Bajos).

Las enzimas de restricción se adquirieron de Invitrogen.

Los ensayos proteicos se llevaron a cabo según el método descrito por Bradford, M.M. (1976) Anal Biochem. 72:248-54.

Las células competentes ElectroMAX de Escherichia coli DH10B se obtuvieron de Invitrogen. El protocolo fue suministrado por el fabricante.

La electroforesis en SDS-PAGE se llevó a cabo en el sistema suministrado por Invitrogen. NuPAGE Novex Bis-Tris Gels (Invitrogen). SimplyBlue SafeStain Microwave protocol.

Resumen de los constructos usados

Plásmido

Descripción

PBAD-MH-Zeo-MBP-ScEwt

Constructo de expresión en E. coli, inducible por arabinosa, con proteína de unión a maltosa (MBP) fusionada a expandasa de S. clavuligerus de tipo salvaje. Marcador de zeocina

PBAD-MH-Zeo-MBP-H127

Igual pero fusionado a expandasa H127 (véase también la Tabla 3x)

PBAD-MH-Zeo-MBP-H406

Igual pero fusionado a expandasa H406 (véase también la Tabla 3x)

PBAD-MH-Zeo-MBP-H402

Igual pero fusionado a expandasa H402 (véase también la Tabla 3x)

PBAD-MH-Zeo-MBP-H403

Igual pero fusionado a expandasa H403 (véase también la Tabla 3x)

1.

Clonación de los vectores de expresión de E. coli

El producto de fusión se liga en el vector pBAD/MH MBP-ScEwt Dest zeo mediante digestión con EcoRI/SalI. Esto sustituye el gen de expandasa de tipo salvaje por los genes de la librería. Para evitar números significativos de constructos de tipo salvaje, los constructos de la ligación se digirieron con SmaI.

2.

Construcción de las librerías

La transformación de E. coli con la mezcla de ligación produjo librerías de aproximadamente 12.000-13.000 colonias. Para ensayar la calidad de las librerías, se seleccionó un conjunto aleatorio de colonias, y los constructos se digirieron con enzimas de restricción. Esto mostró que aproximadamente el 26% de la librería reveló un patrón aberrante. A continuación, se llevó a cabo el análisis de secuencia sobre 10 clones normales para determinar las frecuencias de mutación. Las secuencias mostraron que estaban presentes tanto mutaciones de saturación como mutaciones propensas a error, en un nivel satisfactorio.

3. Expresión y cribado de expandasas mutantes

3.1. Cribado de la librería de cefE en busca de actividad mejorada

Células de E. coli TG1 que contienen la librería A se sembraron en placas y se hicieron crecer en placas de agar. Las colonias se aplicaron a través de un robot en placas de microtitulación de 96 pocillos que contienen medio líquido (2YT, 30 ∃g/ml de cloranfenicol, 0,5% de glucosa), y se hicieron crecer hasta saturación agitando a 37ºC. Las células se subcultivaron en placas de megatitulación de 96 pocillos; inóculo 1:40 en 2YT, 30 ∃g/ml de cloranfenicol, y se indujeron mediante 0,2 mM de IPTG agitando a 28ºC durante 24 h. Las células se peletizaron y se lavaron con un volumen igual de tampón (5 mM de morfolina, pH 7,5). Después de centrifugar, las células se resuspendieron en mezcla de lisis para el cribado primario (ensayo de expandasa (1)).

3.2. Cribado primario en placas de microtitulación (MTP)

Crecimiento e inducción

La librería de expandasa de E. coli se sembró en placas con medio de Luria-Bertani (LB) con agar con bajo contenido en sal + 25 ∃g/ml de zeocina, y se incubó toda la noche a 37ºC. Placas de microtitulación (MTP) con 150 ∃l de medio con bajo contenido de sal de LB y 25 ∃g/ml de zeocina se inocularon a partir de las placas y se incubaron 36 h a 25ºC y 550 rpm.

A partir de la MTP, se inocularon 5 ∃l en una placa de pocillo profundo con 1 ml de medio 2*TY (triptona y extracto de levadura) + 50 ∃g/ml de zeocina + arabinosa. Al cultivo restante en las MTP se añadieron 100 ∃l de glicerol al 50% y se congeló a -80ºC como lote de glicerol.

La placa de pocillos profundos se incubó durante 30 h a 25ºC y 550 rpm. Los cultivos de la placa de pocillos profundos se centrifugó a 2750 rpm (Heraeus multifuge 4 kr.) durante 10 min. El sobrenadante se desechó, y el pelete se congeló a -20ºC.

Extracto libre de células (CFE)

Los peletes congelados obtenidos en la sección previa se descongelaron en 200 ∃l de tampón de extracción (50 mM de Tris/HCl pH = 7,5; 5 mM de DTT; 0,1 mg/ml de ADNasa; 5 mM de MgSO4·H2O y 0,5 mg/ml de lisozima). Para resuspender los peletes, las placas se agitaron. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 10 minutos a 2750 rpm.

3.3 Cribado secundario en matraces de agitación

Crecimiento e inducción

Se inocularon colonias seleccionadas a partir de placa en 10 ml de LB con bajo contenido en sal + zeocina 25 ∃g/ml, y se incubó toda la noche a 37ºC, 280 rpm. El cultivo que se hizo crecer se inoculó en 100 ml de LB con bajo contenido en sal con 25 ∃g/ml de zeocina a una densidad óptica (600 nm) entre 0,010 y 0,050 (Biochrom Ultraspec 2000). Después del crecimiento a 37ºC, 280 rpm, las células se cosecharon a una densidad óptica a 600 nm entre 0,4-0,6. Después, se añadió arabinosa (concentración final 0,2%) y se indujeron toda la noche a 27ºC a 220 rpm.

4. Ensayos de expandasa

4.1 Ensayo de expandasa (1) – Ensayo de cribado (ensayo primario):

Tampón de ensayo de expandasa: 5 mM de tampón de morfolina, pH 7,5, y mezcla de cofactores (concentraciones finales 50 ∃M de ATP, 1 mM de DTT, 60 ∃M de FESO4, 2,7 mM de ascorbato), 500 ∃M de ad-6-APA, 1/10 volumen de lisado celular de E. coli y 2,4 mM de ∀-KG. Cada cofactor se obtuvo en tampón pH 7,5, que fue crítico para la actividad.

Se encontró que la reacción de expandasa fue lineal durante un tiempo hasta 3 horas con respecto a la formación/detección de adipil-7ADCA. Se determinó que la temperatura óptima para la reacción de expandasa in vitro fue aproximadamente 11ºC, probablemente debido a la inestabilidad de la enzima o producción a mayores temperaturas. No obstante, el cribado real se llevó a cabo a una temperatura entre la temperatura ambiente y 25ºC, lo que refleja mejor la temperatura de la condición de reacción deseada.

El cribado de las librerías propagadas de la familia en busca de la formación mejorada de 7-ADCA se determinó mediante Análisis de Inyección de Flujo -MS (FIA-MS, modo negativo, transición de masa [M-H]-341>295). Análisis final: columna de LC: usando condiciones de disolvente entre ácido fórmico al 0,1% en MeOH al 40% hasta MeOH al 100%. Se usaron dos canales (dos transiciones de masas [M-H-] para monitorizar cada producto de reacción. Las muestras se analizaron después de 30 minutos de reacción.

4.2 Ensayo de expandasa (2) – Ensayo de expandasa secundario

Tampón de ensayo de expandasa: 5 mM de tampón de morfolina, pH 7,5, y mezcla de cofactores (concentraciones finales: 50 ∃M de ATP, 1 mM de DTT, 60 ∃M de FESO4, 2,7 mM de ascorbato), 2 mM de ad-6-APA, 1/10 volumen de lisado celular de E. coli y 2,4 mM de ∀-cetoglutarato. Cada cofactor se obtuvo en tampón pH 7,5, que fue crítico para la actividad. La conversión se llevó a cabo a 29ºC, y las muestras se tomaron entre 0 y 30 minutos. La reacción se detuvo con una concentración final de acetonitrilo al 60% (v/v). El adipil-7-ADCA formado se analizó en HPLC (fase móvil: 10% de acetonitrilo en 10 mM de tampón de fosfato, pH 3,0) columna: X-TerraTM RP18 3,5 ∃, 3,9 x 100 mm, detectado a 214 y 254 nm (254 nm para analizar antibióticos expandidos). Análisis de datos de HPLC: software: Waters Millennium32® 3.20.

4.3 Ensayo de expandasa (3) – Ensayo de expandasa

Se añadió un total de 300 ∃l de una mezcla de reacción que consiste en 50 mM de Tris/HCl pH 7,5; 1 mM de DTT; 2,7 mM de ascorbato; 0,05 mM de ATP; 24 mM de a-cetoglutarato; 0,06 mM de FESO4.7H2O; 4 mM de ácido adipil6-aminopenicilánico (ad-6-APA) a 75 ∃l de CFE, y se incubó a 29ºC durante el tiempo deseado. La adición de 60 ∃l de ácido maleico con 10 g/l de EDTA detuvo la reacción. La formación de ácido adipil-7aminodesacetoxicefalosporínico (ad-7-ADCA) se detectó usando RMN 1H.

El adipil-6-APA se obtuvo a partir de 6-APA y ácido adípico catalizado por penicilina acilasa (EC 3.5.1.11). Como alternativa, adipil-6-APA se puede obtener cultivando por ejemplo una cepa adecuada de Penicillium chrysogenum en presencia de ácido adípico como precursor.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Clonación de expandasa de tipo salvaje

El gen cefE se clonó mediante PCR a partir de ADN genómico de S. clavuligerus y se ligó en los vectores de fusión de GFP, la denominada serie pCK, y se usó para transformar E. coli TG1 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. NJ USA). Varias colonias de las transformaciones sembradas en placas se seleccionaron y se comprobaron en busca de un clon activo. Se identificaron varios clones activos. El clon “778” pareció ser un gen de tipo salvaje, pero de forma interesante, otro clon, el clon “779”, reveló una actividad fuertemente mejorada sobre la expansión de adipil-6-APA. El producto del clon “779” se secuenció y reveló tres mutaciones de aminoácidos (H18R, D284N y G300V). La producción de adipil-7-ADCA de los clones analizados mediante Análisis de Inyección de Flujo-Espectrometría de Masas (FIA/MS) mostró que el mutante de SC-cefE “779” fue superior a los progenitores de tipo salvaje. La medida de la fluorescencia de GFP sugiere que la mejora del producto de la enzima expandasa del clon “779” no es debida a la expresión mejorada de cefE allí. Por tanto, se concluyó que la mejora del producto enzimático de expandasa del clon “779” es una mejora de la actividad como resultado de las sustituciones de aminoácidos.

Vectores de fusión de GFP derivados de pCK

Se construyeron series de vectores de fusión con marcadores (las denominadas series pCK) que contienen un marcador His fusionado al extremo 3’ de expandasa con fusión de proteína fluorescente verde (GFP) en el extremo 3’ del marcador HIS. Los vectores que contienen GFP permitieron la normalización de producción elevada de los datos de la actividad de expandasa en ensayos subsiguientes con respecto a la concentración de proteína. Los vectores contienen el origen de replicación p15A (número bajo de copias), y un promotor lac que está reprimido en presencia de glucosa.

Ejemplo 2

Propagación de la familia y cribado de los genes cefE de N. lactamdurans y S. clavuligerus de tipo salvaje – Librería A

Los genes de expandasa se propagaron mediante recombinación según el procedimiento descrito en el documento EP 752008. Se obtuvieron librerías mutantes de expandasas usando los vectores con marcadores con fusión con GFP (pCK). Sólo se propagó el ORF de CefE, mientras que otras secuencias no cambiaron. Después de mover el conjunto propagado de expandasas a los vectores pCK, se obtuvo un conjunto de librerías (Librería A) usando los dos genes de expandasas de tipo salvaje progenitores (S. clavuligerus y N. lactamdurans) más el clon “779”.

La siembra en placas inicial de una muestra de la librería mostró que las librerías contenían al menos 70% de colonias fluorescentes verdes. Debido a esto, no se consideró necesario cribar previamente colonias no fluorescentes antes de proceder a los primeros cribados de FIA/MS. La secuenciación de ADN de colonias distribuidas al azar del conjunto de la librería A indicó que todos los progenitores estuvieron representados en la librería, de manera que esta librería se seleccionó para el cribado inicial.

Se cribaron 720 clones de la librería A y se volvieron a ensayar 14 clones (expandasas mutantes H101, H102, H104, H106, H108, H111, H112, H114, H115, H117, H120, H122, H125, H127), y los resultados preliminares mostraron una mejora de la actividad de expandasa en comparación con la expandasa de S. clavuligerus) (clon “778”) como se puede juzgar mediante el ensayo de expandasa in vitro (1). Estos clones se escogieron para el ensayo posterior. La normalización de la actividad de expandasa con respecto a la concentración de expandasa-GFP (es decir, corrigiendo diferencias en la concentración de proteína de expandasa) confirmó que estos clones mejoraron en la actividad específica.

Ejemplo 3

Propagación de la familia de los genes cefE de N. lactamdurans y S. clavuligerus de tipo salvaje. Librería B

Se construyó la librería B propagando cefE de N. lactamdurans y S. clavuligerus de tipo salvaje como genes progenitores. La secuencia objetivo “779” no se usó en la construcción de esta librería. La librería de expandasa mostró que tiene un nivel significativo de clones inactivos o muy poco activos en la librería. A fin de eliminar los clones inactivos del ensayo posterior, se usó un cribado previo a base de FACS para el cribado de la librería B para mejorar el porcentaje de clones activos que entran en los ensayos de expandasas.

Después de la clasificación mediante FACS basada en su fluorescencia mediante GFP, las células seleccionadas se recuperaron en condiciones represivas. El ADN preparado a partir de estos cultivos se usó para transformar E. coli TG1. Estos constructos de expandasas usados son también proteínas de fusión con GFP como se describe para la librería A.

70-80 por ciento de la librería fue activa para GFP. En total, se cribaron entonces 2200 clones de esta librería usando el ensayo de expandasa in vitro y la detección mediante FIA-MS de la formación de adipil-7-ADCA.

Se seleccionaron catorce resultados posibles (serie H200). Cuatro de estos resultados, entre ellos H262, se confirmaron mediante un procedimiento de ensayo repetido que incluye la retransformación y el ensayo in vitro y análisis de MS.

Ejemplo 4

Construcción de secuencias de expandasas quiméricas usando expandasas propagadas. Librería C

Usando técnicas de biología molecular tradicionales y herramientas bioinformáticas, se recombinaron las secuencias objetivo procedentes de las dos librerías descritas anteriormente (librerías A y B), resultando la librería C (serie H300). Se ensayaron tres quimeras resultantes en busca de la actividad, entre ellas la expandasa H301.

Seis clones restantes (entre ellos: H305, H307, H308, H309) no se ensayaron como producto de fusión de GFP ni se analizaron mediante FIA-MS. Estos clones se volvieron a clonar directamente en la serie de vectores pSJ fusionados con la proteína de unión a maltosa (MBP) en dirección de los genes mutantes CefE, y se analizaron, tras el ensayo in vitro, en HPLC.

Ejemplo 5

Reclonación de genes que codifican expandasas mejoradas usando la serie de vectores basados en pSJ, y actividad enzimática de las expandasas mejoradas

Como vector de clonación para las librerías de expandasas, se usó pSJ08. Este plásmido se construyó sustituyendo el gen de expandasa (como fragmento NdeI-NsiI) por un oligonucleótido pequeño que introduce un sitio de restricción NotI. cefE de S. clavuligerus se clonó como un fragmento NdeI-NsiI en pSJ08, dando como resultado pSJ05.

pSJ05 contenía un sitio NdeI adicional justo en dirección del sitio NsiI. Este sitio se eliminó para evitar la posible interferencia con la clonación posterior de los genes propagados en los sitios NdeI-NsiI, dando como resultado pSJ11. A continuación, la proteína de unión a maltosa (MBP) se fusionó al extremo 5’ de cefE, dando como resultado pSJ10. También se construyó un plásmido que contiene los genes de fusión de MBP-cefE para Nocardia lactambdurans (pSJ01). El análisis de las secuencias de ADN confirmó todas las secuencias.

Los clones mejorados procedentes de la librería A, B y C se volvieron a clonar a partir de los vectores pCK en el vector pSJ10 (MBP-cefE detrás del promotor tac). Esto se llevó a cabo amplificando las expandasas mejoradas mediante PCR. El cebador directo (extremo 5’) introduce un NdeI, y el cebador inverso (extremo 3’) introduce un sitio NsiI. Después de la digestión con NdeI y NsiI, el resultado se clonó en el vector E. coli (pSJ10) y en el vector de Penicillium chrysogenum (pIATWAn - Figura 2/3) Tabla 2.

Finalmente, se secuenciaron unos pocos clones de cada, y se usó uno de cada, que contiene la secuencia correcta verificada, para el análisis posterior.

5 Las secuencias de ADN y de aminoácidos de los mejores resultados de expandasas se incluyeron en el listado de secuencias – véase la Tabla 2 para un resumen.

Inducción de la expresión

NM554 de E. coli se hizo crecer toda la noche en medio 2xTY con cloranfenicol (30 ∃g/ml) a 37ºC. Las células se diluyeron hasta una densidad óptica a 540 nm (OD540) de 0,010-0,020 en 2xTY reciente con cloranfenicol (30 ∃g/ml).

10 Cuando las células alcanzaron una densidad óptica a 540 nm de 0,4-0,6, se añadió IPTG (concentración final 0,5 mM) y se indujo la expresión toda la noche a 27ºC.

Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de extracción (5 mM de DTT, 50 mM de Tris/HCl, pH 7,5, con lisozima), y se sometieron a ultrasonidos (en agua con hielo). Tras centrifugar, el sobrenadante se usó para el ensayo de expandasa (2).

15 La expresión de la expandasa en el extracto libre de células se determinó mediante SDS-PAGE.

Tabla 2. Resultados de expandasas de las series H100, H200 y H300, su mutación o mutaciones, sus vectores de expresión de E. coli y de Penicillium, y su actividad de expandasa (ensayo 2).

Expandasa

SEC ID nº Secuencia de la cadena principal mutaciones Vector Act. esp. * I.F. (**)

Penicillium

MBP-cefE

CefE de S. clavuligerus “778”

1 Tipo salvaje Ninguna pAJL104 12 1

CefE de N. lactamdurans

2 Tipo salvaje Ninguna pJS01 4 0,3

“779”

3 778 H18R+D284N +G300V

H101

6 pSJ101 63 5,3

H106

778 H18R, S112T pSJ106 59 4,9

H111

7 pSJ111 77 6,4

H122

8 pSJ122 61 5,1

H127

5 pSJ127 72 6,0

H262

4 Propagada pIAT262 pSJ262 40 3,3

H301

9 H18R, D284N, G300V, M73T plAT301 pSJ301 49 4,1

H305

10 H261 G300V pIAT305 pSJ305 45 3,8

H307

11 H262 M74T pIAT307 pSJ307

H308

12 H262 D285N pIAT308 pSJ308 48 4,0

H309

13 H262 M74T, D285N pIAT309 pSJ309 46 3,8

* Actividad específica (nmoles de 7-ADCA.min-1.mg-1 de proteína)

** I.F. = Factor de mejora; igual a la relación de la actividad específica de las expandasa mutante y la actividad específica de la expandasa de S. clavuligeris

Ejemplo 6

Expresión de expandasa H122 y H127 en Penicillium chrysogenum

Las variantes H122 y H127 de las expandasas se clonaron en vectores para la expresión en Penicillium chrysogenum (plásmidos de las series pIAT, Tabla 2). Los genes de expandasas propagados se clonaron en un vector plasmídico con un replicón de E. coli y un marcador seleccionable. Para expresar el gen de expandasa, se usó un promotor compatible con la expresión en P. chrysogenum, es decir, el promotor IPNS. Adicionalmente está presente un marcador seleccionable para Penicillium chrysogenum (amdS).

Los constructos de expresión se obtuvieron digiriendo el constructo de expresión, pIAT127 (expandasa H127) y pIAT122 (expandasa H122), con NotI. Una Penicillium chrysogenum altamente productiva se cotransformó con los fragmentos lineales junto con el casete de expresión amdS (digestión con HindIII).

Prediciendo con adipato, la producción de adipil-7-ADCA se puede ensayar en cepas que expresan genes de expandasa activos.

La producción de cefalosporina de la cepa de expandasa de expresión H127 se comparó con la cepa que expresa expandasa de tipo salvaje en un régimen discontinuo con lactosa como fuente de carbono. La producción de adipil-7-ADCA aumentó entre 10-50%, y la producción total de !-lactama aumentó en 0-30%, dependiendo de la concentración de lactosa y de adipato.

Adicionalmente, la expandasa H122 se expresó en Penicillium chrysogenum. La comparación de la producción de cefalosporina con la cepa que expresa expandasa de tipo salvaje mostró que la producción de adipil-7-ADCA aumentó entre 0 y 50%, y la producción total de beta-lactama varió entre -20 a 0%, dependiendo de la concentración de lactosa y de adipato en el medio.

Ejemplo 7

Expandasas mejoradas de 1ª generación (serie H400)

La librería de expandasas de primera generación se construyó llevando a cabo una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) propensa a error (EP) en el gen CefE de Streptomyces clavuligerus de tipo salvaje (SEC ID No. 1). Después de cribar esta librería en busca de la conversión mejorada de ad-6-APA en ad-7-ADCA, se seleccionaron 3 genes mutantes diferentes. Los mutantes mostraron una actividad de expansión de ad-6-APA mejorada de hasta 2,5 veces (H401, H402, H403: véase la Tabla 3).

Ejemplo 8

Expandasas mejoradas de 2ª generación (serie H500)

La librería de expandasas de segunda generación se construyó usando PCR con cebadores de mutación saturados (sMPP) exactamente según el documento WO 03/010183. Los genes mutantes seleccionados procedentes de la primera generación (H401, H402 y H403) se usaron como moldes para la construcción de la librería de 2ª generación.

La sMPP se llevó a cabo usando Taq polimerasa, introduciendo de ese modo mutaciones adicionales (al azar) e incrementando la variación de la librería. Los cebadores diseñados se hibridaron en las posiciones de las mutaciones y se saturaron en las mutaciones encontradas en los resultados de expandasas de 1ª generación. Adicionalmente, se diseñó un cebador directo e inverso universal en el que se introdujeron respectivamente un sitio NdeI y NsiI. Esto facilitó la clonación en el vector de expresión de Penicillium para el ensayo in vivo de las expandasas mutantes.

La librería se hizo crecer, y se indujo la expresión de la expandasa como se describe en la sección de Materiales y Métodos. La formación de ad-7-ADCA se determinó usando RMN como se describe en la sección de Materiales y Métodos.

Se seleccionaron aproximadamente 150 expandasas mutantes mejoradas, y se volvieron a ensayar para determinar su actividad de expandasa en ad-6-APA. Basándose en los resultados de este nuevo ensayo, se seleccionaron 17 mutantes para los ensayos finales en matraces de agitación y los análisis mediante HPLC como se describe en los Materiales y Métodos.

En total, 15 de los 17 resultados seleccionados mostraron una actividad de expandasa significativamente mejorada con ad-6-APA como sustrato. Para excluir la selección de falsos positivos de mutantes de expresión, los niveles proteicos se cuantificaron en SDS-PAGE. Esto confirmó que la actividad mejorada no fue debida a una expresión más potente de expandasa en E. coli, sino que la mejora se pudo atribuir a una actividad específica mejorada del mutante de expandasa.

En total, se identificaron 8 expandasas mutantes que mostraron un factor de mejora de su expandasa en ad-6-APA de hasta 4,5 veces (en comparación con la expandasa de tipo salvaje de S. clavuligerus - SEC ID No 1). Estos mutantes se denominaron H501-H508 (véase la Tabla 3).

Ejemplo 9

3ª Generación de expandasas mejoradas (serie H600)

Los 8 mutantes obtenidos en el Ejemplo 2 de la 2ª generación (H501-H508) se usaron como moldes para la construcción de la librería de expandasas de 3ª generación. Esta librería se construyó de la misma manera como la librería de expandasas de 2ª generación. Adicionalmente, la secuencia de señalización SKA en el término C de las expandasas se cambió a SKD, provocando la expresión de expandasa únicamente en el citosol cuando se expresa en Penicillium.

El cribado de esta librería produjo 22 genes mutantes de expandasas diferentes que se mejoraron significativamente entre 5 veces y 11 veces en comparación con expandasa de S. clavuligerus (Tabla 3, serie H600).

El cribado de la misma librería una segunda vez produjo 13 expandasas mutantes adicionales (G601-G611 y G613-G614; véase la Tabla 3).

Ejemplo 10

Actividad de expandasas mutantes mejoradas con isopenicilina N (iPN) y Penicilina-G (Pen-G) como sustrato

La actividad de varias expandasas mutantes se midió usando iPN y Pen-G como sustrato. El ensayo con iPN como sustrato se llevó a cabo como se describió en la sección de Materiales y Métodos, excepto que se sustituyó ad-6-APA por la misma concentración de iPN (4 mM). El ensayo con Pen-G como sustrato se llevó a cabo como se describe en la sección de Materiales y Métodos, excepto que se sustituyó ad-6-APA por 7 mM de Pen-G. La Tabla 3 resume las actividades de los diversos mutantes de expandasas para iPN y Pen-G.

Mientras que la mayoría de los mutantes de expandasas ensayados mostró una mejora de 5 veces de su actividad de expandasa con iPN, los mutantes que poseen la mutación T89K perdieron virtualmente toda la actividad con respecto a iPN.

La actividad con respecto a Pen-G de los diversos mutantes de expandasas ensayados fue la misma que la expandasa de tipo salvaje (el factor de mejora es 1) o mejoraron hasta 8 veces. Los datos muestran además que no hay ninguna correlación en absoluto entre los factores de mejora obtenidos para un único mutante con ad-6-APA y Pen-G como sustrato. La relación entre los factores de mejora respectivos para ad-6-APA y Pen-G varían en un intervalo de 0,1 (por ejemplo H654) a 1,2 (por ejemplo H503).

Tabla 3. Expandasas mutantes y su actividad de expandasa frente a ad-6-APA, Pen-G e iPN. Cada mutante se identifica por su código; las mutaciones se introducen en la expandasa modelo de S. clavuligerus (SEC ID NO 1). La actividad de expandasa se expresa como factor de mejora en comparación con la expandasa modelo de S. clavuligerus (por definición, actividad de expandasa = 1) según los ensayos de expandasas in vitro descritos en la sección Materiales y Métodos y en el Ejemplo 4.

Mutante

Mutaciones Actividad de expandasa (factor de mejora)

Código

ad-6-APA Pen-G iPN

1.

H401 L277Q 1,5

2.

H402 D2N+C281Y 2,5

3.

H403 T89A 1,5

4.

H501 T89A+C281Y 3,9 3,0 2,6

5.

H502 D2Y+C281Y+R306?+A311D 4,5 4,0 5,3

6.

H503 D2N+T89V+C281Y 3,5 4,0 3,2

7.

H504 T89K+C281Y+T293K 3,9 1,0 0,0

8.

H505 T89K+C281Y 3,3 1,0 0,0

9.

H506 L277Q+G300S 2,9 3,0 4,6

10.

H507 D2Y+N90S+T105I+G113D+C155W+P177L+L277T+C281Y 3,7 3,0 3,0

11.

H508 D2H+L277Q+E280G+C281Y 4,6 4,0 5,1

Mutante

Mutaciones Actividad de expandasa (factor de mejora)

Código

ad-6-APA Pen-G iPN

12.

H601 M73H+T89K+C281Y+A311D 7,5 1,2 0,0

13.

H602 T89K+Y217H+C281Y+A311D 7,6 1,1 0,0

14.

H603 T89K+H244R+C281Y+A311D 6,8 1,7 0,0

15.

H604 T89K+C281Y+R307T+A311D 6,9 1,4 0,0

16.

H605 T89K+C281Y+R307T+A311D 7,2 1,5 0,0

17.

H606 M73I+T89K+C281Y+T293K+G300S+R307T+A311D 8,8 1,9 0,0

18.

H607 T89K+C281Y+T293K+G300S+A311D 7,0 1,3 0,0

19.

H608 T89K+C281Y+A311D 5,8 1,0 0,0

20.

H609 M73H+T89K+T213A+C281Y+A311D 6,2 1,3 0,0

21.

H650 T105I+G113D+C155W+P177L+C281Y+R306?+A311D 8,2 7,1 11,0

22.

H651 C155W+P177L+L277Q+E280G+C281Y+R306?+A311D 10,6 8,9 11,0

23.

H652 L277Q+C281Y+R306?+A311D 5,0 10,0

24.

H653 T89V+C281Y+R306?+A311D 9,0 5,8 11,0

25.

H654 T89K+R249C+C281Y+R306?+A311D 6,3 0,8 0,0

26.

H655 D2Y+N90S+T105I+G113D+C155W+P177L+C281Y+R306?+A311D 8,2 7,1 10,0

27.

H656 D2N+N90S+M99T+T105I+G113D+C281Y+R306 ?+A311D 5,0 3,7 5,0

28.

H657 N90S+T105I+G113D+C281Y+R306?+A311D 6,9 4,6 8,0

29.

H658 D2N+T89V+C281Y+R306?+A311D 8,4 6,3 10,0

30.

H659 T89K+C281Y+R306?+A311D 6,4 0,8 0,0

31.

H660 N90W+C281Y+R306?+A311D 5,3 4,4 5,0

32.

H661 D2Y+C155W+C281Y+R306?+A311D 9,7 6,4

33.

H662 D2Y+N90S+T105I+G113D+C155W+P177L+L277T+C281Y+R306?+A311D 5,6 5,2 6,0

34.

G601 T89V+A278V+C281L+307supresión+A311D 7,4 6,8

35.

G602 D2N+T89V+C155W+P177L+L277T+C281Y+A311D 3,9 4,4

36.

G603 S59G+N90S+T105I+G113D+C155W+P177L+G209S+C281Y+307supresión+A311D 6,3 6,4

37.

G604 D2N+N90W+C281Y+307supresión+A311D 4,6 5,7

38.

G605 D2Y+C155W+P177I+C281Y+307supresión+A311D+SGRS 5,1 4,6

39.

G606 D2Y+N90S+Y101F+T105I+G113D+C155W+P177I+C281Y+307supresión+A311D 8,2 8,1

40.

G607 N90S+T105I+G113D+C155W+P177I+C281Y+R307T+A311D 7,2 6,7

41.

G608 D2Y+N90S+T105I+G113D+C155W+P177I+L277T+C281Y+R307I+A311D 6,0 4,6

42.

G609 D2Y+T89V+C281Y+307supresión+A311D 6,6 4,5

43.

G610 D2N+T89V+T105I+G13D+C155W+P177L+C281Y+A311D 6,4 7,7

44.

G611 T89V+T105I+G13D+C155W+P177L+C281Q+307supresión+A311D 7,0 7,9

45.

G613 T89V+H170Y+D251G+L277Q+C281Y+307supresión+A311D 4,3 4,4

Mutante

Mutaciones Actividad de expandasa (factor de mejora)

Código

ad-6-APA Pen-G iPN

46.

G614 D2Y+N90S+T105I+G113D+C155W+P177L+L277T+C281Y+T293K+307supresión+A311D 7,2 8,9

La Tabla 3 muestra que se han obtenido expandasas mutantes que tienen factores de mejora en el intervalo de 1,5 a 10,6 veces.

LISTADO DE SECUENCIAS

5 <110> DSM IP Assets B.V.

<120> Expandasas mutantes

<130> 24172WO

<160> 14

<170> Patentln version 3.1 10 <210> 1

<211> 936

<212> ADN

<213> Streptomyces clavuligerus

<220> 15 <221> exón

<222> (1)..(933)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 970

<212> ADN 5 <213> Nocardia lactamdurans

<220>

<221> exón

<222> (1)..(942)

<223> 10 <400> 2

<210> 3

<211> 936

<212> ADN 5 <213> Artificial

<22 0>

<223> 779

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(936)

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 939

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H262

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(936)

<223>

<400> 4

<210> 5

<211> 936

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H127

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(933)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 962

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H101

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(933)

<223>

<400> 6

<210> 7

<211> 936

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H111

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(933)

<223>

<400> 7

<210> 8

<211> 936

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> H122

<220>

<221> exón

<222> (1)..(933)

<223>

<400> 8 <210> 9

<211> 936

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H301

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(933)

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 936

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H305

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(933)

<223>

<400> 10

<210> 11

<211> 939

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> H307

<220>

<221> exón

<222> (1)..(936)

<223>

<400> 11 <210> 12

<211> 939

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H308

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(936)

<223>

<400> 12

<210> 13

<211> 939

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> H309

<220>

<221> exón 10 <222> (1)..(936)

<223>

<400> 13

<210> 14

<211> 5335

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido de casete de expresión en Penicillium

<220>

<221> exón

<222> (930)..(1862)

<223> Secuencia codificante de expandasa

<400> 14

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una expandasa mutante que es una variante de un polipéptido modelo con actividad de expandasa mediante la que la treonina en la posición 89 de aminoácido en el péptido modelo se ha sustituido por lisina usando la numeración de las posiciones de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la enzima expandasa como se representa en SEC ID NO: 1, y mediante la cual el polipéptido modelo con actividad de expandasa tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con SEC ID NO: 1.

2. 2.

   Una expandasa mutante según la reivindicación 1, mediante la cual la expandasa mutante se ha modificado en la posición 89 de aminoácido como se describe en la reivindicación 1, y se ha modificado en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo 1 que consiste en las posiciones 2, 18, 59, 73, 74, 90, 99, 101, 105, 112, 113, 155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277, 278, 280, 281, 284, 293, 300, 307 y 311 usando la numeración de las posiciones de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la enzima expandasa codificada por el gen cefE Streptomyces clavuligerus (SEC ID NO: 1).

3. 3.

   Una expandasa mutante según la reivindicación 1, mediante la cual la expandasa mutante se ha modificado en la posición 89 de aminoácido como se describe en la reivindicación 1, y se ha modificado en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo 2 que consiste en las posiciones 2, 18,59, 90, 99, 101, 105, 112, 113, 170, 177, 209, 213, 217, 249, 251, 278, 280, 284 y 293, opcionalmente en combinación con al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo 1 y que no pertenece al grupo 2.

4. 4.

   Una expandasa mutante según la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en: T89K+C281Y+T293K T89K+C281Y M73H+T89K+C281Y+A311D T89K+Y217H+C281Y+A311D T89K+H244R+C281Y+A311D T89K+C281Y+R307T+A311D T89K+C281Y+R307T+A311D M73I+T89K+C281Y+T293K+G300S+R307T+A311D T89K+C281Y+T293K+G300S+A311D T89K+C281Y+A311D M73H+T89K+T213A+C281Y+A311D T89K+R249C+C281Y+R306?+A311D T89K+C281Y+R306?+A311D y mediante la cual las mutaciones se introducen en SEC ID NO 1.

5. 5.

   Un polinucleótido que codifica la expandasa mutante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. 6.

   Un vector de expresión o casete que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.

7. 7.

   Una célula hospedante transformada con el polinucleótido de la reivindicación 5 o el vector o casete de la reivindicación 6.

8. 8.

   Un método para producir la expandasa mutante de las reivindicaciones 1-4, que comprende cultivar una célula hospedante según la reivindicación 7 en condiciones que conduzcan a la producción de la expandasa mutante, y, opcionalmente, recuperar el polipéptido.

9. 9.

   Un método para producir un compuesto !-lactámico de interés, que comprende cultivar una célula hospedante según la reivindicación 7 en condiciones que conduzcan a la producción del compuesto !-lactámico, y, opcionalmente, recuperar el compuesto !-lactámico.

10. 10.

    Un método según la reivindicación 9, que comprende además N-desacilar el compuesto !-lactámico para producir un compuesto !-lactámico N-desacilado.

11. 11.

    Uso del polipéptido de expandasa mutante según la reivindicación 1 a 4 en la expansión del anillo penam en un anillo ceph-3-em.

12. 12.

    Uso del polipéptido de expandasa mutante según la reivindicación 1 a 4 en la expansión del anillo penam de adipil-6-APA en un anillo ceph-3-em.

    5 13. Uso según la reivindicación 11 en la producción de adipil-7-ADCA, adipil-7-ADAC o adipil-7-ACA.

13. 14.

    Un microorganismo productor de adipil-6-APA transformado con un fragmento de ADN que codifica un polipéptido de expandasa alterado según la reivindicación 1 a 4.

14. 15.

    Método para la producción fermentativa de adipil-7-ADCA, que comprende

    (a)

    Cultivar un microorganismo capaz de producir adipil-6-APA y transformado con un fragmento de ADN que 10 codifica una expandasa alterada según la reivindicación 1 a 4 en condiciones para producir adipil-6-APA

    (b)

    Convertir in situ el adipil-6-APA en adipil-7-ADCA usando la expandasa alterada; y

    (c)

    Aislar el adipil-7-ADCA deseado.

15. 16. Método para la producción de 7-ADCA, que comprende

    (a)

    Cultivar un microorganismo capaz de producir adipil-6-APA y transformado con un fragmento de ADN que 15 codifica una expandasa alterada según la reivindicación 1 a 4 en condiciones para producir adipil-6-APA

    (b)

    Convertir in situ el adipil-6-APA en adipil-7-ADCA usando la expandasa alterada;

    (c)

    Aislar el adipil-7-ADCA deseado;

    (d)

    Eliminar la cadena lateral de adipilo para producir 7-ADCA; y

    (e)

    Recuperar 7-ADCA.