JPH08205864A

JPH08205864A - 新規セファロスポリンｃアシラーゼおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH08205864A
Application number: JP7312619A
Authority: JP
Inventors: Yoshimasa Saito; 善正斎藤; Yoshinori Ishii; 芳則石井; Yoshiko Ueda; 佳子上田; Toru Mori; 徹森; Choji Yamada; 長司山田
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1996-08-13
Also published as: GB9424945D0

Abstract

(57)【要約】【解決手段】天然型セファロスポリンＣアシラーゼ
（ＣＣアシラーゼ）のアミノ酸配列のＬｅｕ¹⁶⁰および
／またはＴｒｐ¹⁶⁸部位のアミノ酸が、その他のアミノ
酸により置換されてなる変異型ＣＣアシラーゼ、それを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、
該発現ベクターで形質転換された微生物および該形質転
換体を培養することによる変異型ＣＣアシラーゼの製造
方法。【効果】高い酵素力および高いプロセッシング効率を
もつ変異型セファロスポリンＣアシラーゼ、該酵素を高
収率発現する発現系並びに該酵素の製造方法が提供でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規セファロスポ
リンＣアシラーゼ（以下、ＣＣアシラーゼという）に関
する。より詳細には、新規な変異型ＣＣアシラーゼ、そ
れをコードする遺伝子、その遺伝子を含有する発現ベク
ター、該発現ベクターで形質転換された微生物および変
異型ＣＣアシラーゼの製造方法に関する。更に、本発明
は上記形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセ
ファロスポリン化合物の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＣアシラーゼは、一般にセファロスポ
リンＣを７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）
に加水分解する酵素である。今まで、ＣＣアシラーゼと
して分類される酵素としては、セファロスポリンＣアシ
ラーゼＳＥ８３、Ｎ１７６およびＶ２２の三酵素が見つ
かっており、それらのアミノ酸配列は、Journal of Fer
mentation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (19
91) に開示されている。この文献では、ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列の番号表記はそのＮ末端部位のメチオニ
ン基から始まっている。

【０００３】しかし、本明細書においてはＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列の番号表記はそのＮ末端部のメチオニ
ン基に隣接するスレオニン基から始まる。これは原核生
物中でＣＣアシラーゼ遺伝子を発現することによって得
られる成熟ＣＣアシラーゼのα−サブユニットのＮ末端
部のメチオニンは、酵素（例えば、アミノペプチダーゼ
など）によって脱離して、そのＮ末端アミノ酸としてス
レオニン基をもつ成熟ＣＣアシラーゼとなるからであ
る。

【０００４】上記文献は、組換えＤＮＡ技術による天然
型ＣＣアシラーゼの製造についても開示するものであ
り、発現されたＣＣアシラーゼは細胞内でプロセッシン
グを受けてα−サブユニットとβ−サブユニットからな
る活性体となることが知られている。しかしながら、
Ｅ．ｃｏｌｉ中における該プロセッシングの効率は、一
般に低い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な変異型ＣＣアシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクターを導入した形質
転換体、および該形質転換体を培養することによる変異
型ＣＣアシラーゼの製造方法を提供することである。ま
た、本発明の他の目的は、上記形質転換体の培養物また
はその処理物を用いたセファロスポリン化合物の製造方
法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、より高い
酵素活性、より高いプロセッシング効率などのより望ま
しい特性を有するＣＣアシラーゼを得るべく鋭意研究を
重ねた結果、かかる望ましい性質を持つ変異型ＣＣアシ
ラーゼの製造に成功し、本発明を完成した。

【０００７】即ち本発明は、以下の通りである。天然型
ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列のＬｅｕ¹⁶⁰および／ま
たはＴｒｐ¹⁶⁸部位のアミノ酸が、その他のアミノ酸に
より置換されてなる変異型ＣＣアシラーゼ。また、該変
異型ＣＣアシラーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含
む発現ベクター、該ベクターを導入した形質転換体、お
よび該形質転換体を培養することによる変異型ＣＣアシ
ラーゼの製造方法。さらに、後記化合物（II）に上記形
質転換体の培養物またはその処理物接触させることを含
む、セファロスポリン化合物の製造方法。

【０００８】

【発明の実施の形態】Ｌｅｕ¹⁶⁰が置換するその他のア
ミノ酸の好適な例としては、アラニンなどが挙げられ
る。Ｔｒｐ¹⁶⁸が置換するその他のアミノ酸の好適な例
としては、チロシンなどが挙げられる。変異型ＣＣアシ
ラーゼの好適な例としては、宿主細胞中でα−サブユニ
ットとβ−サブユニットにプロセッシングされる前の前
駆体形としてのアミノ酸配列が、式：Ａ^1-159−Ｘ₁−Ａ^161-167−Ｘ₂−Ａ^169-773 （式中、Ａ^1-159は、天然型ＣＣアシラーゼのＴｈｒ¹
からＡｒｇ¹⁵⁹までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
列を示す。Ａ^161-167は、天然型ＣＣアシラーゼのＧｌ
ｙ¹⁶¹からＶａｌ¹⁶⁷までのアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を示す。Ａ^169-773は、天然型ＣＣアシラーゼ
のＰｈｅ¹⁶⁹からＡｌａ⁷⁷³までのアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列を示す。Ｘ₁は、Ｌｅｕまたはその他の
アミノ酸を、Ｘ₂は、Ｔｒｐまたはその他のアミノ酸を
示す。但し、Ｘ₁がＬｅｕであるとき、Ｘ₂はＴｒｐ以
外のアミノ酸である）で示される変異型ＣＣアシラーゼ
が挙げられる。変異型ＣＣアシラーゼの最も好適な例と
しては、上記式においてＸ₁がアラニン、Ｘ₂がチロシ
ン、およびその組合せが挙げられる。

【０００９】本明細書中、個々の変異型ＣＣアシラーゼ
の命名について、この分野の学会で広く用いられている
次のような命名法を便宜的に採用する。この命名法によ
れば、例えば、天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の
１６０位のロイシン残基をアラニンで置換することによ
り調製された変異型ＣＣアシラーゼは、変異型ＣＣアシ
ラーゼＬ１６０Ａと命名され、ここでＬは置換されるロ
イシン（アミノ酸）残基の一文字記号を意味し、１６０
は天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の置換位置を意
味し、Ａは前記ロイシン（アミノ酸）残基を置換したア
ラニン（他のアミノ酸）の一文字記号を意味する。言い
換えれば、例えば、変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙは
天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の１６８位のトリ
プトファン残基をチロシンで置換した変異型ＣＣアシラ
ーゼを意味する。

【００１０】かかる特徴を有する本発明の変異型ＣＣア
シラーゼのアミノ酸配列、ならびにそれをコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の具体例を後記配列表に記す。
配列番号１に、プラスミドｐＣＫＬ１６０Ａ中における
変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの前駆体をコードする
ＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから推定したアミ
ノ酸配列を示す。配列番号２に、プラスミドｐＣＫＷ１
６８Ｙ中における変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの前
駆体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれ
から推定したアミノ酸配列を示す。

【００１１】本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、組換え
ＤＮＡ技術、ポリペプチド合成法などによって調製する
ことができる。

【００１２】即ち、組換えＤＮＡ技術を用いる場合に
は、新規ＣＣアシラーゼは、そのアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された宿主細
胞を培地中で培養し、該培養物から新規ＣＣアシラーゼ
を採取することによって調製することができる。

【００１３】この過程について、その詳細を以下に詳し
く説明する。宿主細胞としては、微生物〔細菌（例え
ば、Escherichia coli，Bacillus subtilis など）、酵
母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiaeなど）、動物
細胞系および培養植物細胞など〕が挙げられる。微生物
として好適には、細菌、特にEscherichia 属に属する菌
株（例えばE. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101A
TCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. coli
294 ATCC 31446 など）、酵母、特にSaccharomyces 属
に属する菌株（例えば、Saccharomyces cerevisiae AH2
2 ）、動物細胞（例えばマウスＬ９２９細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）などが挙げら
れる。

【００１４】細菌、特にE. coli を宿主細胞として用い
る場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、新規ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、ター
ミネーター領域および複製可能単位から構成される。酵
母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベ
クターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグ
ナルペプチドおよび新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、および終止コドンを含んでいるこ
とが好ましい。エンハンサー配列、新規ＣＣアシラーゼ
の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接
合部、ポリアデニレーション部位および複製可能単位も
また発現ベクターに組み込むことが可能である。

【００１５】プロモーター−オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配
列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。好まし
くはプロモーター−オペレーター領域は、常套的に用い
られるプロモーター−オペレーター領域（例えば、E. c
oli のＰＬ−プロモーターおよびｔｒｐ−プロモータ
ー）およびＣＣアシラーゼＮ１７６染色体遺伝子のプロ
モーターを含んでいてもよい。

【００１６】酵母中で新規ＣＣアシラーゼを発現させる
ためのプロモーターとしては、S. cerevisiae の場合、
ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子、
および酸ホスファターゼ（ｐＨ０５）遺伝子のプロモー
ターが、また哺乳動物細胞中で新規ＣＣアシラーゼを発
現させるためのプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プ
ロモーターまたは後期プロモーター、ＨＴＬＶ−ＬＴＲ
−プロモーター、マウスメタロチオネインＩ（ＭＭＴ）
−プロモーター、ワクシニア−プロモーターなどが含ま
れる。

【００１７】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が含まれる。

【００１８】シグナルペプチドとしては、一般に使用さ
れる他の酵素のシグナルペプチド（天然型ｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペ
プチド）などが含まれる。

【００１９】新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡは、従来の方法で調製することができる。
例えば、ＤＮＡ合成機を用いて一部のまたは全てのＤＮ
Ａを合成したり、および／または形質転換体〔例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＣＣＮ１７６−２）FERM
BP-3047〕から得られる適切なベクター（例えば、ｐＣ
ＣＮ１７６−２）に挿入された天然型ＣＣアシラーゼを
コードする完全なＤＮＡ配列を、例えば適切な酵素（例
えば、制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ
など）での処理に加えて、常套の変異方法〔例えば、カ
セット変異法（徳永，Ｔら、Eur. J. Biochem. Vol.15
3, p445-449 (1985) 参照）、ＰＣＲ変異法（樋口，Ｒ
ら、Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7367 (1988)参
照）、クンケル法（Kunkel, T. Aら、Methods Enzymol.
Vol.154, p367 (1987) 参照）など〕のような適切な方
法で処理することによって調製することができる。

【００２０】終止コドンとしては、常用の終止コドン
（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が含まれる。

【００２１】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター（例えば、合成ｆｄファージター
ミネーターなど）が含まれる。

【００２２】複製可能単位とは、宿主細胞中においてそ
の全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮ
Ａ化合物であり、天然のプラスミド、人工的に修飾され
たプラスミド（例えば、天然のプラスミドから調製され
たＤＮＡフラグメント）および合成プラスミドが含まれ
る。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、およびその人工的修飾物（ｐＢＲ３２
２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメ
ント）が、酵母では酵母２μプラスミド、および酵母染
色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミド pRSVn
eo ATCC 37198、プラスミド pSV2dhfr ATCC 37145、プ
ラスミド pdBPV-MMTneo ATCC 37224、およびプラスミド
pSV2neo ATCC 37149などが挙げられる。

【００２３】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２b.p.）が含まれる。

【００２４】ポリアデニレーション部位としては、ＳＶ
４０のポリアデニレーション部位が含まれる。

【００２５】スプライシング接合部位としては、ＳＶ４
０のスプライシング接合部位が含まれる。

【００２６】プロモーター、開始コドン、新規ＣＣアシ
ラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン
およびターミネーター領域は、連続的かつ環状に適当な
複製可能単位（プラスミド）に連結させることができ、
この際所望により、常法（例えば、制限酵素での消化、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション）で適当な
ＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリ
クションサイトなど）を用いることにより、発現ベクタ
ーが得られる。

【００２７】宿主細胞は、該発現ベクターを用いて形質
転換（形質移入）される。形質転換（形質移入）は従来
の方法（例えば、E. coli は Kushner法、哺乳動物細胞
はリン酸カルシウム法、マイクロインジェクションな
ど）を用いて行うことができ、形質転換体（形質移入
体）が得られる。

【００２８】本発明の工程で新規ＣＣアシラーゼを製造
するために、かくして得られた上記発現ベクターを含む
形質転換体は、栄養培養水溶液中で培養される。

【００２９】栄養培地は、炭素源（例えば、グルコー
ス、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクト
ースなど）および無機窒素もしくは有機窒素源（例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水
分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプト
ン、ビーフ抽出物など）を含んでいてもよい。所望によ
り、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナ
トリウム、二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウ
ム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ₁）、抗生物質
（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など〕を培地
中に添加してもよい。哺乳動物細胞を培養するために、
胎児ウシ血清および抗生物質を配合したDulbecco's Mod
ified Eagle'sMinimum Essenntial Medium (DMEM)がし
ばしば用いられる。

【００３０】形質転換体（形質移入体を含む）の培養
は、通常ｐＨ５．５〜８．５（好適にはｐＨ７〜７．
５）、１８〜４０℃（好適には２０〜３０℃）で５〜５
０時間実施される。

【００３１】かくして製造された新規ＣＣアシラーゼが
培養液中に存在する場合は、その培養液を濾過または遠
心分離することにより、培養濾液（上清）を得る。新規
ＣＣアシラーゼは、該培養濾液から、天然または合成蛋
白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法
（例えば、透析、ゲル濾過、抗ＣＣアシラーゼモノクロ
ーナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラ
フィー、適当な吸着剤のカラムクロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなど）を用いて精製すること
ができる。

【００３２】製造された新規ＣＣアシラーゼが、培養さ
れた形質転換体のペリプラズムおよび細胞質内に存在す
る場合は、細胞を濾過および遠心分離により集め、その
細胞壁および／または細胞膜を、例えば超音波および／
またはリゾチームで処理することにより破壊し、細胞破
片および／または破砕物が得られる。該細胞破片および
／または破砕物を適当な水溶液（例えば、８Ｍ尿素水溶
液、６Ｍグアニジウム塩水溶液）に溶解する。新規ＣＣ
アシラーゼは、該水溶液から先に例示したような常法に
より精製することができる。

【００３３】本発明は更に、式：

【００３４】

【化３】

【００３５】（式中、Ｒ¹はアセトキシ、ヒドロキシま
たは水素を示す。Ｒ²はカルボン酸アシルを示す）で示
される化合物（II）またはその塩を、本発明の新規ＣＣ
アシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形
質転換された微生物の培養物またはその処理物と接触さ
せることを含む、式：

【００３６】

【化４】

【００３７】（式中、Ｒ¹は前記と同意義である）で示
される化合物（Ｉ）またはその塩の製造方法を提供する
ものである。

【００３８】Ｒ²におけるカルボン酸アシルとしては、
脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙げら
れ、その適切な例としては、アミノ基、ヒドロキシ基、
カルボキシ基、Ｃ₁−Ｃ₆のアルカノイルアミノ基、ベ
ンズアミド基、チエニル基などからなる群から選択され
る１つもしくは２つの適当な置換基を有していてもよい
Ｃ₁−Ｃ₆のアルカノイルが挙げられる。

【００３９】化合物（Ｉ）および化合物（II）の適当な
塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩）が挙げられる。

【００４０】ＣＣアシラーゼ活性が通常形質転換細胞内
に存在するなら、培養物を処理して得られる物質（以
下、処理物という）としては、以下のものが例示され
る。

【００４１】（１）生細胞：濾過または遠心分離などの
常法にて培養物から分離される；（２）乾燥細胞：上記(1) の生細胞を凍結乾燥または真
空乾燥などの常法により乾燥させることにより得られ
る；（３）無細胞抽出物：上記(1) の生細胞または上記(2)
の乾燥細胞を常法（例えば、有機溶媒を用いた細胞の自
己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の粉砕、また
は超音波による細胞の処理）により破壊することにより
得られる；（４）酵素溶液：上記(3) の無細胞抽出物を常法（例え
ば、カラムクロマトグラフィー）により精製または部分
精製することによって得られる；および（５）固定化細胞または酵素：上記(1) もしくは(2) の
細胞または上記(4) の酵素を常法（例えば、アクリルア
ミド、グラスビーズ、イオン交換樹脂などを用いた方
法）で固定化することにより調製される。

【００４２】本発明の化合物（II）を酵素と接触させる
ことからなる反応は、水または緩衝液のような水性媒質
中で実施することができる。即ち、通常、化合物（II）
を含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物ま
たはその処理物を溶解または懸濁することによって行わ
れる。

【００４３】該反応混液の好適なｐＨ、化合物（II）の
濃度、反応時間および反応温度は、用いられる培養物ま
たはその処理物の性質によって変わりうる。一般に、該
反応はｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９、５〜４０
℃、好ましくは５〜３７℃で０．５〜５０時間実施され
る。

【００４４】反応混液中、基質としての化合物（II）の
濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲から適宜選択する
ことができる。

【００４５】このようにして製造された化合物（Ｉ）
は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。

【００４６】以下の実施例において、プラスミド、制限
酵素のような酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、および他の物
質は市販のものであり、常法により使用された。特に、
実施例で開始物質として用いられるプラスミドｐＣＣＮ
１７６−２およびプラスミドｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐは、
国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所
に、それぞれ形質転換E. coli JM109 (pCCN176-2) FERM
BP-3047および形質転換E. coli HB101-16 (pTQiPAΔtr
p) FERM BP-1870 として預けられており、そして米国特
許第5,192,678 号および欧州特許出願公開明細書第３０
２４５６号に基づいて容易に得ることができる。その他
のプラスミドなどは、これら明細書の記載に従って、上
記ｐＣＣＮ１７６−２、ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐおよびそ
れらの市販品から容易に調製することができる。ＤＮＡ
のクローニング、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培
養、該培養物からの新規ＣＣアシラーゼの採取などに用
いられた操作は、当業者によく知られているものである
か、もしくは文献から採用できるものである。

【００４７】

【実施例・実験例】以下の実施例は、本発明を説明する
ことを目的として挙げられているものであり、本発明は
これらにより何ら限定されるものではない。

【００４８】実施例１オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの合成（１）ＳＯ−Ｌ１６０Ａ：ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｌ１
６０Ａ(5'-CGCGGTGATGCGCAGGGCGGGCCTGCTTATG-3') を３
９２型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて合成した。そのＤＮＡを、ＣＰＧ
（controlled poreglass)ポリマー支持体から２８％ア
ンモニア水で遊離させ、その後６０℃で９時間加熱する
ことにより全保護基を除去した。その反応混合物を減圧
留去し、残渣をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ〕２００μｌに溶解した。
得られた粗ＤＮＡ溶液を、逆相ＨＰＬＣ〔カラム；COSM
OSIL C18, 4.6 mm×150 mm（ナカライテスク）、溶出
液；Ａ：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液
（ｐＨ７．２〜７．４）、Ｂ：アセトニトリル、グラジ
ェント；開始：Ａ（１００％）、終わり：Ａ（６０％）
＋Ｂ（４０％）、２５分間直線グラジェント、流速；
１．２ ml/min 〕に付した。目的のＤＮＡオリゴマーを
含む溶出液を集め、減圧留去した。精製したＤＮＡをＴ
Ｅ緩衝液２００μｌに溶解し、使用まで−２０℃で保存
した。

【００４９】（２）ＳＯ−Ｗ１６８Ｙ：ＤＮＡオリゴマ
ーＳＯ−Ｗ１６８Ｙ(5'-CAGCATCCGCCAAAGCTTGAAATACACC
GAACCCATAAG-3') を上述と同様の方法で合成、精製し
た。

【００５０】実施例２ｔｒｐプロモーター制御下での
天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターの調製（１）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアンピシリン耐
性発現ベクターであるｐＣＣ００２Ａの構築：（ｉ）ｐＣＣ００１Ａの構築：プラスミドｐＣＣＮ１７
６−３〔JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERIN
G, Vol. 72, p235 (1991)に、プラスミドｐＣＣＮ１７
６−２（これは、常法により形質転換体であるＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９(ｐＣＣＮ１７６−２）ＦＥＲＭＢ
Ｐ−３０４７から得ることができる）からこのプラスミ
ドを調製する方法が記載されている〕（１．０μｇ）
を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化し、ＣＣアシ
ラーゼＮ１７６の全てのコード領域を担持する２．９ｋ
ｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離
した。一方、変異型ｔ−ＰＡの発現ベクターであるｐＴ
ＱｉＰＡΔｔｒｐ〔これは、常法により形質転換体であ
るE. coli HB101-16（ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ）ＦＥＲＭ
ＢＰ−１８７０から得ることができる。その調製方法
については、欧州特許出願公開明細書第３０２４５６号
に記載されている〕（１．０μｇ）をＸｍａＩおよびＸ
ｈｏＩで消化し、大きいＤＮＡ（５１１３ｂｐ）を単離
した。合成ＤＮＡオリゴマーＣＴ−１ (5'-CCGGGTGTGTA
CACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGT
GA-3')、ＣＴ−２ (5'-AGCTTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATC
CAGTCTAGGTAGTTGGTAACCTTGGTGTACACAC-3')、ＴＲ−１
(5'-AGCTTGTCCTCGAGATCAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTT
TTTTG-3')およびＴＲ−２ (5'-TCGACAAAAAAAAAAGGCTCCA
AAAGGAGCCTTTAATTGATCTCGAGGACA-3')をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合させて、ＸｍａＩ／ＳａｌＩＤＮＡフラグメン
ト（１１４ｂｐ）を得た。得られたＤＮＡフラグメント
を上記ＸｍａＩ／ＸｈｏＩＤＮＡに結合させ、ｐＴＱｉ
ＰＡｄｔｒｐを得た。ｐＴＱｉＰＡｄｔｒｐ（１．０μ
ｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化した。得ら
れたｔｒｐプロモーター、ｔ−ＰＡコード領域の一部分
（Ｃｙｓ⁹²からＴｒｐ¹¹³）、およびｆｄファージセン
トラルターミネーターの複写配列を担持する４．３ｋｂ
ＤＮＡを単離した。５０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ
ＡＴＰからなるライゲーション緩衝液４０μｌ中、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）の存在
下、上記２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントと当該４．３
ｋｂのＤＮＡフラグメントを混合して、１６℃、５時間
かけて結合させた。該結合混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性の形
質転換体の一つからｐＣＣ００１Ａと命名される所望の
プラスミドを取得し、制限酵素マッピングにより、その
特性を調べた。

【００５１】（ii）ｐＣＣ００２Ａの構築：プラスミド
ｐＣＣ００１Ａは、ｔｒｐプロモーターとアシラーゼ遺
伝子との間のｔ−ＰＡ遺伝子の一部分（Ｃｙｓ⁹²からＴ
ｒｐ¹¹ ³）を含む。この領域を除去するために、ｐＣＣ
００１Ａ（１．０μｇ）をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで消
化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離
した。一方、ｐＣＣＮ１７６−３（１μｇ）をＭｌｕＩ
およびＳａｕ３ＡＩで消化し、アシラーゼのＡｓｐ⁷か
らＡｒｇ⁷¹間をコードする１８９ｂｐのＤＮＡを単離し
た。合成ＤＮＡオリゴマー００２ａおよび００２ｂ（各
々０．５ｎｍｏｌ、後記表１参照）を、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（１．５ユニット、宝酒造製）を用い
て、緩衝液（キネーション緩衝液；５０ｍＭトリス塩
酸、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、１．０ｍ
ＭＡＴＰ）１０μｌ中、３７℃、１時間でリン酸化
し、該反応混合物を５５℃で２０分間加熱して酵素を不
活性化した。得られた混合物を、ライゲーション緩衝液
２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１５℃、３時
間、上記１８９ｂｐのＳａｕ３ＡＩ／ＭｌｕＩＤＮＡと
混合して結合させた。得られた結合混合物に、６．１ｋ
ｂのＣｌａＩ／ＭｌｕＩＤＮＡフラグメントを添加し、
その混合物を更に追加したＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００
ユニット）の存在下で４℃、１６時間インキュベートし
た。得られた結合混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９を形質転換した。これらの形質転換体の一つか
ら、ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターである所望
のプラスミドｐＣＣ００２Ａを単離して、制限酵素マッ
ピングによりその特性を調べた。

【００５２】

【表１】

【００５３】（２）ＣＣアシラーゼＮ１７６のカナマイ
シン耐性発現ベクターであるｐＣＫ００２の構築：プラ
スミドｐＣＣ００２ＡをＤｒａＩ（東洋紡績（株）製）
で消化した。得られた混合物をフェノールで処理して酵
素を除去し、エタノールで沈澱させた。回収したＤＮＡ
をライゲーション緩衝液２０μｌに懸濁させ、リン酸化
したＥｃｏＲＩリンカー（２μｇ、ファルマシア製）と
混合し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）
とともに４℃で１６時間インキュベートした。該反応混
合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。
回収したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、得られたアンピ
シリン耐性遺伝子を欠失した５．６ｋｂのＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動によって単離した。一方、プラスミ
ドｐＡＯ９７〔これは、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９（ｐＡＯ９７）ＦＥＲＭＢＰ−３７７２から得
ることができる〕（１μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、そ
の結果、カナマイシン耐性遺伝子の１．２ｋｂＤＮＡを
単離した。ライゲーション緩衝液５０μｌ中、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（３００ユニット）を用いて、当該１．２ｋ
ｂのＥｃｏＲＩＤＮＡを１６℃、２時間かけて、５．
６ｋｂのＥｃｏＲＩＤＮＡに結合させた。該結合混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、抗
生物質マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持す
る所望のプラスミドｐＣＫ００２を得た。

【００５４】実施例３ＣＣアシラーゼＮ１７６の高発
現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築（１）ｐＣＣ０１３Ａの構築：（ｉ）ｐＣＣ００７Ａの構築：プラスミドｐＣＣ００１
ＡをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩで消化し、得られた６．
４ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動
により単離した。回収したＤＮＡを、予めリン酸化して
おいた合成ＤＮＡオリゴマー００７ａおよび００７ｂ
（各々０．５μｇ、後記表２参照）に、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（３００ユニット）を用いて１６℃、５時間かけて
結合させた。得られた混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９を形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣ００７
Ａを得た。

【００５５】（ii）ｐＣＣＮｔ０１３の構築：プラスミ
ドｐＣＣ００７Ａ（１．０μｇ）をＣｌａＩとＢａｍＨ
Ｉで消化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡを５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により単離した。該ＤＮＡを
合成オリゴマー０１３ａと０１３ｂ（各々０．５μｇ、
それぞれリン酸化されている。後記表２参照）に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用いて、結合させ
た。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を
形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣＮｔ０１３をアン
ピシリン耐性形質転換体から単離した。

【００５６】

【表２】

【００５７】（iii) ｐＣＣ０１３Ａの構築：プラスミ
ドｐＣＣＮｔ０１３をＢａｍＨＩとＭｌｕＩで消化し、
得られた６．１ｋｂのＤＮＡを単離した。一方、ｐＣＣ
００２Ａ（１．０μｇ）をＭｌｕＩとＳａｕ３ＡＩで消
化して１８９ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。得られ
たＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を
用いて、６．１ｋｂのＢａｍＨＩ／ＭｌｕＩのＤＮＡフ
ラグメントに結合させ、該結合混合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性の
形質転換体の一つから、ＡＴリッチなＮＨ₂末端側ＤＮ
Ａ配列（天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアミノ酸配列
と同一のアミノ酸配列をコードする）をもつ所望のプラ
スミドｐＣＣ０１３Ａを単離した。

【００５８】（２）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のカ
ナマイシン耐性発現ベクターであるｐＣＫ０１３の構
築：（ｉ）ｐΔＮ１７６の構築：プラスミドｐＣＫ００２
（１．０μｇ）をＡａｔII（東洋紡績（株）製）で消化
し、得られたＤＮＡを自己結合させる為にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（１５０ユニット）で処理した。該結合混合物を
用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、ユニーク
なＡａｔII制限酵素切断部位を担持する所望のプラスミ
ドｐΔＮ１７６を得た。

【００５９】（ii）ｐＣＫ０１３の構築：プラスミドｐ
ΔＮ１７６（１．０μｇ）をＡａｔIIで消化し、直線化
したＤＮＡを細菌由来のアルカリホスファターゼ（１ユ
ニット、宝酒造製）で、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）中、４２℃にて１時間処理した。該脱リ
ン酸化されたＤＮＡを単離して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いてｐＣＣ０１３Ａ由来の２．５ｋｂのＡａｔIIＤＮ
Ａに結合させた。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換し、マーカーとしてカナマイシン
耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドｐＣＫ０１３を
得た。

【００６０】実施例４ＣＣアシラーゼＮ１７６をコー
ドするＤＮＡのクンケル法によるポイントミューテーシ
ョン（１）ＣＣアシラーゼＮ１７６をコードするＤＮＡのＭ
１３ファージへのサブクローニング：（ｉ）ｍｐ１８ｐ１８１の調製：プラスミドｐＣＣ０１
３ＡをＨｐａＩおよびＳｍａＩで消化し、ＣＣアシラー
ゼＮ１７６のｆＭｅｔからＰｒｏ²⁶⁷までをコードする
８４２ｂｐのＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、ＳｍａＩ
で消化された７２５０ｂｐのＭ１３ｍｐ１８に、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下で結合させ、該結合混合物を用い
てＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。プラーク
のうちの一つから、上記アシラーゼＤＮＡ部分がＭ１３
ファージのｏｒｉを含むＤＮＡを伴って逆方向に挿入さ
れた所望のＲＦＤＮＡｍｐ１８ｐ１８１を単離し、制
限酵素マッピングによりその特性を調べた。該ＲＦＤ
ＮＡｍｐ１８ｐ１８１から調製されたファージ溶液を使
用するまで４℃で保存した。

【００６１】（ii）ｍｐ１８ｐ１８３の調製：上述と同
様の方法で、ｐＣＣ０１３Ａ由来のＣＣアシラーゼＮ１
７６のｆＭｅｔからＡｌａ³⁷⁴までをコードする１１６
２ｂｐのＨｐａＩ／Ｅｃｏ４７III ＤＮＡと、Ｈｉｎｃ
IIで消化された７２５０ｂｐのＭ１３ｍｐ１８とから、
ＲＦＤＮＡｍｐ１８ｐ１８３を調製した。

【００６２】（２）一本鎖ウラシル鋳型ＤＮＡの調製
（Kunkel, T.A.ら, Methods Enzyml., Vol.154, p367参
照) ：（ｉ）Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８１−ＳＳ：Ｅ．ｃｏｌｉＣ
Ｊ２３６（ｄｕｔ−，ｕｎｇ−，Ｆ’）（バイオ・ラッ
ドラボラトリーズ製）のシングルコロニーをクロラムフ
ェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＸＴＹブロ
ス２ｍｌ中で３７℃、１６時間培養した。細胞（０．１
ｍｌ）を３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有す
る新鮮な２ＸＴＹブロス（５０ｍｌ）に移し、３７℃で
培養を継続した。６００ｎｍでの吸光度が０．３に達し
たとき、該培養物にｍｐ１８ｐ１８１のファージ溶液
（ＭＯＩ＜０．２）を添加し、さらに５時間培養を続け
た。これを４℃、１７，０００×ｇで１５分間遠心分離
した後、再び上清を遠心分離した。得られた上清（３０
ｍｌ）を常温で、３０分間、ＲＮａｓｅ（１５０μｇ／
ｍｌ，シグマ社製）で処理し、７．５ｍｌのＰＥＧ溶液
（３．５ＭＮＨ₄ＯＡｃの２０％ポリエチレングリコ
ール８，０００溶液）を添加した。遠心分離（１７，０
００×ｇ，１５分，４℃）後、残渣を３００ｍＭＮａ
Ｃｌ，１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）および０．
１ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液２００μｌに懸濁させ
た。得られた溶液をフェノール２００μｌおよびフェノ
ール／ＣＨＣｌ₃（１／１）２００μｌで抽出し、続い
てＣＨＣｌ₃（２００μｌ）で２回洗浄した。該溶液
に、７．５ＭＮＨ₄ＯＡｃ（１００μｌ）とエタノー
ル（６００μｌ）を添加してファージＤＮＡを沈澱させ
た。該ＤＮＡを遠心分離により採取し、氷冷９０％エタ
ノール７００μｌで洗浄し、真空下で乾燥させた。精製
した１本鎖Ｕ−ＤＮＡ（Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８１−ＳＳ）
をＴＥ緩衝液２０μｌで懸濁させ、使用するまで４℃で
保存した。

【００６３】（ii）Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８３−ＳＳ：クン
ケルの変異方法に用いる他の１本鎖Ｕ−ＤＮＡであるＵ
−ｍｐ１８ｐ１８３−ＳＳもまた上述と同様の方法で調
製した。

【００６４】（３）変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａを
コードするＲＦＤＮＡ（ｍｐ１８ｐ１８１Ｌ１６０
Ａ）の調製：（ｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドのリン酸化：Ｄ
ＮＡオリゴマーＳＯ−Ｌ１６０Ａ（１．８４μｌ，約１
６７ｐｍｏｌ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（４．５ユニット、宝酒造製）を用いて、５０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭＡＴＰおよ
び５０μｌ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からな
るライゲーション緩衝液３０μｌ中、３７℃で１時間リ
ン酸化した。

【００６５】（ii）アニーリング反応：１０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭＭｇＣｌ₂および４０ｍ
ＭＮａＣｌからなる緩衝液９μｌ中で、上記のリン酸
化されたオリゴマー（１μｌ、約５．６ｐｍｏｌ）を鋳
型Ｕ−ｍｐ１８ｐ１８１−ＳＳ（０．１ｐｍｏｌ、約２
５０ｎｇ）と混合した。該混合物を７０℃、５分間加熱
し、次いで４０分かけて３０℃で冷却して０℃で静置し
た。

【００６６】（iii)ｉｎｖｉｔｒｏでの２重鎖ＤＮＡ
の合成：得られたアニーリング溶液（１０μｌ）を、合
成緩衝液〔２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）−４０
ｍＭＭｇＣｌ₂〕１μｌ、５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）１μｌ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）およびＴ
４ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット、ファルマシア
製）と混合した。該混合物を氷上で５分間、２５℃で５
分間、さらに３７℃で９０分間、順次インキューベート
した。１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）および１０ｍ
ＭＥＤＴＡからなる緩衝液９０μｌを添加して、反応
を停止させた。

【００６７】（iv）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の形質転
換：上記反応混合物の一部（３μｌ）をSigesada法〔Si
gesada, K., 細胞工学２, p616-626 (1983) 〕に従って
調製したＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のコンピテントセル
（２００μｌ）に添加し、該セルを氷上で３０分間イン
キュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングル
コロニーをＬブロス（２ｍｌ）中で１６時間培養した。
該培養物（０．１ｍｌ）を新鮮なＬブロス（２ｍｌ）に
移し、更に２時間培養して、インディケーターセルを得
た。形質転換された細胞（２００μｌ）に、該インディ
ケーターセル（２００μｌ）を加えて、それらを５５℃
で前加熱したＨ−Ｔｏｐ寒天（１％バクトトリプトン、
０．８％ＮａＣｌ、０．８％寒天）３ｍｌと混合した。
該細胞−寒天混合物をＨプレート（１％バクトトリプト
ン、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上に延展し、
そのプレートを３７℃で１６時間インキュベートした。

【００６８】（ｖ）形質転換体から得られたＲＦＤＮ
Ａの特性：Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングルコロニ
ーを２ＸＴＹブロス（１．６％バクトトリプトン、１％
酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）２ｍｌ中で１６時間培
養した。該培養物（０．１ｍｌ）を新しい２ＸＴＹブロ
ス（２ｍｌ）に移し、更に２時間培養した。ステップ
（iv）で調製されたプレートのプラークを竹製爪楊枝
（１５ｃｍ）で拾い、該爪楊枝を直ちに上記の培養した
２ＸＴＹブロスに移した。培養を３７℃、５〜６時間続
けた。該培養物１ｍｌから、常温、１５秒間、１０，０
００ｒｐｍで遠心分離することにより、細胞を集め、上
清（次の実験でのＲＦＤＮＡの大量調製に使用される
ファージ溶液）を、使用するまで４℃で保存した。該細
胞をＧＴＥ緩衝液〔５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８．０）、２５ｍＭＥＤＴＡ〕１００μ
ｌに懸濁させ、アルカリ−ＳＤＳ溶液（０．２ＮＮａＯ
Ｈ、１％ＳＤＳ）２００μｌと緩やかに混合し、そして
ボルテックス^TMミキサーを用いて高塩緩衝液（３ＭＫ
ＯＡｃ、３ＭＡｃＯＨ）１５０μｌと激しく混合し
た。得られた混合液を常温、５分間、１０，０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。その上清（４００μｌ）をイソプロ
ピルアルコール３００μｌで処理し、１０，０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離した。その上層（３００μｌ）を分
離し、エタノール６００μｌと混合した。それを遠心分
離（１０，０００ｒｐｍ、５分間）した後、沈澱を氷冷
７０％エタノール５００μｌで洗浄し、真空下で乾燥
し、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）１００μｇ／ｍｌを含有
するＴＥ緩衝液５０μｌに懸濁し、ＲＦＤＮＡｍｐ
１８ｐ１８１Ｌ１６０Ａを得た。該ＲＦＤＮＡ溶液の
一部（１０μｌ）をＦｓｐＩを用いた制限エンドヌクレ
アーゼマッピングに用いた。これは、変異を調べるた
め、ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｌ１６０Ａがその配列中に
ＦｓｐＩ部位を計画的に導入することによる。

【００６９】（４）変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙを
コードするＲＦＤＮＡ（ｍｐ１８ｐ１８３Ｗ１６８
Ｙ）の調製：変異型ＲＦＤＮＡ（ｍｐ１８ｐ１８３Ｗ
１６８Ｙと命名）を上述の方法と同様にｍｐ１８ｐ１８
３の一本鎖Ｕ−ＤＮＡ（鋳型として）およびオリゴマー
ＳＯ−Ｗ１６８Ｙから調製した。

【００７０】実施例５発現ベクターの構築（１）ｐＣＫＬ１６０Ａの構築：ｍｐ１８ｐ１８１Ｌ１
６０ＡをＭｌｕＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、５８２ｂ
ｐのＤＮＡを単離した。一方、ｐＣＫ０１３をＢｓｔＢ
ＩおよびＭｌｕＩで消化し、大型ＤＮＡ（約６．２ｋ
ｂ）を単離した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて前記５８２ｂｐのＤＮＡフラグメントと結合さ
せ、マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する
所望のプラスミドｐＣＫＬ１６０Ａを得た。

【００７１】（２）ｐＣＫＷ１６８Ｙの構築：ｍｐ１８
ｐ１８３Ｗ１６８ＹをＭｌｕＩとＢｓｔＢＩで消化し
た。小型ＤＮＡフラグメント（５８２ｂｐ）を単離し、
それを、ＭｌｕＩとＢｓｔＢＩを用いて消化したｐＣＫ
０１３の大型ＤＮＡ（約６．２ｋｂ）に、ライゲーショ
ン緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ〕２０μｌ中で結合
させた。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
９を形質転換した。これらの形質転換体の一つから、所
望のプラスミドｐＣＫＷ１６８Ｙを単離し、制限エンド
ヌクレアーゼ消化により、その特性を調べた。

【００７２】実施例６ヌクレオチド配列決定ｐＣＫＬ１６０ＡおよびｐＣＫＷ１６８Ｙのヌクレオチ
ド配列は、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサー（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用い、ＤｙｅＤｅｏｘｙ
^TM法によって直接的に決定した。ＤＮＡオリゴマーＰ４
０８（CCCTGCCTGTCGAATACGGA, コーディング鎖：ヌクレ
オチドＮｏ．４０８−４２７）およびＰ６６１（ATCGCC
TTCAGCAGCGCATC, 逆鎖：ヌクレオチドＮｏ．６７１−６
９０）をプライマーに用いた。

【００７３】実施例７培養のための組換えＥ．ｃｏｌ
ｉ実施例５で得られた各々の発現ベクター（ｐＣＫＬ１６
０Ａ，ｐＣＫＷ１６８Ｙ）を、培養前にそれぞれＥ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９に導入した。発現ベクター（Ｅ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＬ１６０ＡまたはＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＷ１６８Ｙ）を担持するＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングルコロニーを、５０μｇ
／ｍｌカナマイシンを含むＬブロス（５ｍｌ）中で、３
７℃、１６時間培養した。得られた培養物（０．８ｍ
ｌ）を８０％グリセロール水（０．２ｍｌ）と混合し、
使用するまで−８０℃で保存した。

【００７４】実施例８組換えＥ．ｃｏｌｉの培養（１）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＬ１６０Ａの
培養：Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＬ１６０Ａ
（１ｍｌ）のグリセロールストックを、５０μｇ／ｍｌ
カナマイシンを含有するＬブロス１００ｍｌに加え、該
混合物を３０℃で８時間培養した。該培養物の一部
（３．７５ｍｌ）を１％グリセロールおよび２５μｇ／
ｍｌカナマイシンを含有するＮ−３ブロス（成分：5.0
％大豆加水分解物、0.608 ％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、0.7 ％Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄、0.7 ％Ｋ ₂ＨＰＯ₄、0.12％（ＮＨ₄）₂
ＳＯ₄、0.02％ＮＨ₄Ｃｌ、0.0011％ＦｅＳＯ ₄、0.00
11％ＣａＣｌ₂、0.00028 ％ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂Ｏ、0.
00028 ％ＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、0.00011 ％ＣｏＣｌ₂
・６Ｈ₂Ｏ、0.000055％ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、0.0000
55％ＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、0.000028％ＣｕＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ、0.000014％Ｈ₃ＢＯ₄、0.096 ％ＭｇＳ
Ｏ₄）２５ｍｌに加えた。該混合物を２０〜２２℃でイ
ンキュベートし、培養開始後１６時間にインドールアク
リル酸（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を、１６および２４
時間にグリセロール（最終濃度１．０％）を加えた。３
０時間後、培養物の６００ｎｍでの吸収が１５．０に達
したとき、該細胞を遠心分離（４℃、７，０００ｒｐ
ｍ、１０分間）により採取し、超音波処理により破砕し
た。遠心分離後、上清を集め、４℃で保存し、ＣＣアシ
ラーゼ活性およびＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性を測定
するため、および精製した変異型ＣＣアシラーゼＬ１６
０Ａを調製するために使用した。

【００７５】（２）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫ
Ｗ１６８Ｙの培養：Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫ
Ｗ１６８Ｙもまた上述と同様の方法で培養した。

【００７６】実施例９変異型ＣＣアシラーゼの精製と
特性（１）変異型ＣＣアシラーゼの精製（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａ：培養物２０ｍ
ｌから得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＬ１
６０Ａの破砕物（２０ｍｌ）に、硫酸アンモニウム
（４．１８ｇ、最終濃度：３５％飽和）を加え、該混合
物を常温で２０分間攪拌した。得られた混合物を遠心分
離（２０℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清
を集めて硫酸アンモニウム処理した（５．５６ｇ、最終
濃度：７５％飽和）。遠心分離（２０℃、１５，０００
ｒｐｍ、２０分間）により沈澱物を集め、それを２５ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）５ｍｌに溶解した。得られ
た溶液を４℃で２５ｍＭトリス塩酸緩衝液各々４Ｌに対
して２回の透析を行った。得られた透析物をＭｉｌｌｅ
ｘ−ＨＶ^TM（０．４５μｍ、ミリポア製）で濾過し、高
速液体クロマトグラフィー〔カラム；ＴＳＫ−ｇｅｌ^TM
ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー製，７．５ｍｍ×７５ｍ
ｍ）、溶出液；Ａ：２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
０）、Ｂ：０．５ＭＮａＣｌ−２５ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）、グラジェント；始め：Ａ（８０％）＋
Ｂ（２０％）、終わり（３０分後）：Ａ（５０％）＋Ｂ
（５０％）、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕により精製し
た。約０．１６Ｍ濃度のＮａＣｌと共に溶出したメイン
ピークを集め、トリス塩酸（ｐＨ９．０）４Ｌに対して
透析して、純粋な変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａを得
た。

【００７７】精製した変異型ＣＣアシラーゼを逆相ＨＰ
ＬＣ〔カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ，４．６ｍｍ×５０ｍ
ｍ（ナカライテスク製）、溶出液；０．０５％トリフル
オロ酢酸中、アセトニトリル水初濃度３６％から２０分
で６０％の直線グラジェント〕およびドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）により分析した。そのようにして得られたアシ
ラーゼの純度は、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、約９５％であった。

【００７８】（ii）変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙ：
変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙを上述と同様の方法で
精製、分析を行った。

【００７９】（２）変異型ＣＣアシラーゼの特性：（ｉ）ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性：３７℃で１０分
間プレインキュベートしたＧＬ−７ＡＣＡ溶液〔０．１
５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．７）中に１０ｍｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈは１ＮＮａＯＨで８．７に再調整された〕５００μ
ｌに、サンプルアシラーゼ１００μｌを加え、該混合液
を３７℃で５分間インキュベートした。反応を５％酢酸
を５５０μｌ加えることにより停止させ、得られた上清
を７ＡＣＡ生成の測定に用いた。ＨＰＬＣ条件；カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１０
０ＲＰ−１８（４．０ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｅ．Ｍｅｒ
ｋ製）、溶出液：２．０９％クエン酸および０．０９％
１−ヘキサンスルホン酸を含む９．５％（ｖ／ｖ）アセ
トニトリル水、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１
０μｌ、検出器２５４ｎｍ１ユニットを、３７℃で１分間にＧＬ−７ＡＣＡから
１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しうる活性として定義
した。

【００８０】（ii）ＣＣアシラーゼ活性：３７℃で１０
分間プレインキュベートしたＣＣアシラーゼ溶液〔１０
ｍｇ／ｍｌセファロスポリンＣナトリウム塩を含む０．
１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．７）溶液、ｐＨは１ＮＮ
ａＯＨで８．７に再調整された〕５００μｌに、サンプ
ルアシラーゼ１００μｌを加え、該混合液を３７℃で３
０分間インキュベートした。反応を５％酢酸を５５０μ
ｌ加えることにより停止させ、得られた上清を７ＡＣＡ
生成の測定に用いた。ＨＰＬＣ条件；カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１０
０ＲＰ−１８（４．０ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｅ．Ｍｅｒ
ｋ製）、溶出液：２．０９％クエン酸および０．０９％
１−ヘキサンスルホン酸を含む９．５％（ｖ／ｖ）アセ
トニトリル水、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１
０μｌ、検出器２５４ｎｍ１ユニットを、３７℃下で１分間にセファロスポリンＣ
ナトリウム塩から１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しう
る活性として定義した。この結果を表３に示す。

【００８１】

【表３】

【００８２】(iii）ケト−ＣＣアシラーゼ活性：３７℃
で１０分間プレインキュベートしたＣＣアシラーゼ溶液
〔１０ｍｇ／ｍｌセファロスポリンＣナトリウム塩を含
む０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液、ｐＨは
１ＮＮａＯＨで７．５に再調整された〕３０５μｌ
に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ２４ユニットおよびカタ
ラーゼ２０μｌを加えた（最終量５００μｌ）。該混合
物を常温で５分間激しく攪拌した。ＣＣアシラーゼの完
全な消失をＨＰＬＣ分析により確認した後、反応混合物
を基質、７−β−（５−カルボキシ−５−オキソ−１−
ペンタノイル）アミノ−セファロスポラン酸（ケト−Ｃ
Ｃ）に用いた。３７℃で１０分間プレインキュベートし
たケト−ＣＣ溶液５００μｌに、サンプルアシラーゼ１
００μｌを加え、該混合液を３７℃で３０分間インキュ
ベートした。反応を５％酢酸を５５０μｌ加えることに
より停止した。得られた混合物の遠心分離（常温、１
０，０００ｒｐｍ、５分間）後、上清を７ＡＣＡ生成の
測定に用いた。ＨＰＬＣ条件；カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１０
０ＲＰ−１８（４．０ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｅ．Ｍｅｒ
ｋ製）、溶出液：２．０９％クエン酸および０．０９％
１−ヘキサンスルホン酸を含む９．５％（ｖ／ｖ）アセ
トニトリル水、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１
０μｌ、検出器２５４ｎｍ１ユニットを、３７℃下で１分間にケト−ＣＣから１．
０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しうる活性として定義し
た。この結果を表４に示す。

【００８３】

【表４】

【００８４】（３）変異型ＣＣアシラーゼのアミノ末端
配列の決定：（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａのαおよびβサ
ブユニットの単離：変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａを
逆相ＨＰＬＣ〔カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ４
（４．６ｍｍ×５０ｍｍ，ナカライテスク製）、溶出
液：０．０５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル水
初濃度３６％から２０分で６０％の直線グラジェント、
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕に付した。ＨＰＬＣ分析に
おいて、精製したアシラーゼは２成分ペプチド、αおよ
びβサブユニットに解離し、これらはそれぞれ約５１％
および約４８％濃度のアセトニトリルと共に溶出した。
各溶出液を集め、アミノ末端分析用のサンプルに用い
た。

【００８５】（ii）アミノ末端配列の決定：当該α
（β）サブユニットのアミノ末端配列を、気相シークエ
ンサー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）に
より決定し、予想されたものと一致することを確認し
た。

【００８６】実施例１０（１）変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの大量精製：
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＬ１６０Ａを、上述
と同様の方法により５Ｌ容のジャーファーメンター中で
培養した。２Ｌの培養物から得られた細胞を、２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）１．５Ｌ中で懸濁させ、マン
トン−ゴーリン（５００ｋｇ／ｃｍ、７回）により破砕
した。遠心分離（４℃、７，０００ｒｐｍ、３０分間）
後、上清をＰｏｌｙｍｉｎＰ（最終濃度０．０１％）
で処理した。該混合物を７，０００ｒｐｍで、３０分間
遠心分離し、上清を水に対して透析した（収率３．８
ｇ）。該アシラーゼ（２．３ｇ）をＱＡＥ−トーヨーパ
ール５５０Ｃカラムクロマトグラフィー〔条件；カラ
ム：５．０ｃｍ×１３ｃｍ（２６０ｍｌ），開始平衡溶
液：２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０），溶出液：０．
５ＭＮａＣｌ−２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０），
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ〕により精製して、０．９２ｇ
の精製変異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａを得た。精製変
異型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの比活性は、実施例９
（３）で述べた方法に従って測定されたＣＣアシラーゼ
と同様に３．５１ユニット／ｍｇであった。

【００８７】（３）変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの
大量精製：Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＷ１６８
Ｙを、上述と同様の方法により５Ｌ容のジャーファーメ
ンター中で培養した。２Ｌの培養物から得られた細胞
を、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）１．５Ｌ中で懸
濁させ、マントン−ゴーリン（５００ｋｇ／ｃｍ、７
回）により破砕した。遠心分離（４℃、７，０００ｒｐ
ｍ、３０分間）後、上清をＰｏｌｙｍｉｎＰ（最終濃
度０．０１％）で処理した。該混合物を７，０００ｒｐ
ｍで、３０分間遠心分離し、上清を水に対して透析した
（収率８．３ｇ）。該アシラーゼ（１．０ｇ）をＱＡＥ
−トーヨーパール５５０Ｃカラムクロマトグラフィー
〔条件；カラム：５．０ｃｍ×１３ｃｍ（２６０ｍ
ｌ），開始平衡溶液：２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
０），溶出液：０．５ＭＮａＣｌ−２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．０），流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ〕により精
製して、０．９ｇの精製変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８
Ｙを得た。精製変異型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの比活
性は、実施例９（３）で述べた方法に従って測定された
ＣＣアシラーゼと同様に４．０６ユニット／ｍｇであっ
た。

【００８８】

【発明の効果】本発明によれば、高い酵素活性および高
いプロセッシング効率をもつ変異型セファロスポリンＣ
アシラーゼ、該酵素を高収率発現する発現系並びに該酵
素の製造方法を提供することができる。

【００８９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２３３２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１１．．２３２９特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１１．．２３２９特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ存在位置：１６０特徴を決定した方法：Ｓ配列 CGATAAA ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG 49 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala -1 1 5 10 GCG CTG CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG 97 Ala Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala 15 20 25 TCG GTC CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC 145 Ser Val Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala 30 35 40 45 TCG GGC GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG 193 Ser Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln 50 55 60 GAC CGT CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC 241 Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg 65 70 75 GCG GCC GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG 289 Ala Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val 80 85 90 CGC CGG CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG 337 Arg Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu 95 100 105 GGC GTC GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC 385 Gly Val Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn 110 115 120 125 GCA TTC CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC 433 Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu 130 135 140 GGA GCA GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG 481 Gly Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met 145 150 155 CGC AGG GCG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG 529 Arg Arg Ala Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg 160 165 170 ATG CTG GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC 577 Met Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg 175 180 185 TAT GAC GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA 625 Tyr Asp Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu 190 195 200 205 GCC GAT CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT 673 Ala Asp Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp 210 215 220 GCG CTG CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC 721 Ala Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly 225 230 235 GGC AGC AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG 769 Gly Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg 240 245 250 CCG ATC CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG 817 Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met 255 260 265 TAT GCG CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG 865 Tyr Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu 270 275 280 285 ACC GTG CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG 913 Thr Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys 290 295 300 GTC GCC TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT 961 Val Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr 305 310 315 CTC GAG CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT 1009 Leu Glu Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp 320 325 330 TTC GAG CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC 1057 Phe Glu Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly 335 340 345 GCC GAT CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC 1105 Ala Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile 350 355 360 365 GCG GGC GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG 1153 Ala Gly Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln 370 375 380 TTC GCC GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC 1201 Phe Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly 385 390 395 GCA TCG ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG 1249 Ala Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu 400 405 410 ATC GAC CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT 1297 Ile Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His 415 420 425 CTG GTC CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG 1345 Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu 430 435 440 445 CCG GTG CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG 1393 Pro Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro 450 455 460 CAC GAG GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC 1441 His Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val 465 470 475 ACG GCG AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC 1489 Thr Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys 480 485 490 ACC GAT TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG 1537 Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu 495 500 505 GTC GCC AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC 1585 Val Ala Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala 510 515 520 525 GAT ACG CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG 1633 Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala 530 535 540 CTT GGA GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC 1681 Leu Gly Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu 545 550 555 GTC GCC TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC 1729 Val Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala 560 565 570 TAC AAT GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC 1777 Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser 575 580 585 GGG CTG GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC 1825 Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly 590 595 600 605 GTC TCA CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC 1873 Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg 610 615 620 GAC GAC GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG 1921 Asp Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu 625 630 635 TCT GAG GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG 1969 Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp 640 645 650 GGC GAA GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC 2017 Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe 655 660 665 CCG GCC TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC 2065 Pro Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly 670 675 680 685 GAT GGC GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG 2113 Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro 690 695 700 CAG GCG ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT 2161 Gln Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn 705 710 715 TGG GAC AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG 2209 Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro 720 725 730 GCC AGC GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG 2257 Ala Ser Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala 735 740 745 ATG GTG CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG 2305 Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val 750 755 760 765 ACG TCG CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2332 Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【００９０】配列番号：２配列の長さ：２３３２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１１．．２３２９特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１１．．２３２９特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ存在位置：１６８特徴を決定した方法：Ｓ配列 CGATAAA ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG 49 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala -1 1 5 10 GCG CTG CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG 97 Ala Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala 15 20 25 TCG GTC CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC 145 Ser Val Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala 30 35 40 45 TCG GGC GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG 193 Ser Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln 50 55 60 GAC CGT CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC 241 Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg 65 70 75 GCG GCC GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG 289 Ala Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val 80 85 90 CGC CGG CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG 337 Arg Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu 95 100 105 GGC GTC GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC 385 Gly Val Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn 110 115 120 125 GCA TTC CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC 433 Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu 130 135 140 GGA GCA GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG 481 Gly Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met 145 150 155 CGC CGG CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TAT TTC AAG CTT TGG CGG 529 Arg Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Tyr Phe Lys Leu Trp Arg 160 165 170 ATG CTG GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC 577 Met Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg 175 180 185 TAT GAC GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA 625 Tyr Asp Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu 190 195 200 205 GCC GAT CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT 673 Ala Asp Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp 210 215 220 GCG CTG CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC 721 Ala Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly 225 230 235 GGC AGC AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG 769 Gly Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg 240 245 250 CCG ATC CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG 817 Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met 255 260 265 TAT GCG CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG 865 Tyr Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu 270 275 280 285 ACC GTG CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG 913 Thr Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys 290 295 300 GTC GCC TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT 961 Val Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr 305 310 315 CTC GAG CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT 1009 Leu Glu Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp 320 325 330 TTC GAG CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC 1057 Phe Glu Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly 335 340 345 GCC GAT CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC 1105 Ala Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile 350 355 360 365 GCG GGC GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG 1153 Ala Gly Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln 370 375 380 TTC GCC GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC 1201 Phe Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly 385 390 395 GCA TCG ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG 1249 Ala Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu 400 405 410 ATC GAC CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT 1297 Ile Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His 415 420 425 CTG GTC CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG 1345 Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu 430 435 440 445 CCG GTG CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG 1393 Pro Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro 450 455 460 CAC GAG GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC 1441 His Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val 465 470 475 ACG GCG AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC 1489 Thr Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys 480 485 490 ACC GAT TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG 1537 Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu 495 500 505 GTC GCC AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC 1585 Val Ala Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala 510 515 520 525 GAT ACG CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG 1633 Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala 530 535 540 CTT GGA GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC 1681 Leu Gly Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu 545 550 555 GTC GCC TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC 1729 Val Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala 560 565 570 TAC AAT GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC 1777 Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser 575 580 585 GGG CTG GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC 1825 Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly 590 595 600 605 GTC TCA CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC 1873 Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg 610 615 620 GAC GAC GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG 1921 Asp Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu 625 630 635 TCT GAG GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG 1969 Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp 640 645 650 GGC GAA GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC 2017 Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe 655 660 665 CCG GCC TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC 2065 Pro Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly 670 675 680 685 GAT GGC GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG 2113 Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro 690 695 700 CAG GCG ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT 2161 Gln Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn 705 710 715 TGG GAC AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG 2209 Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro 720 725 730 GCC AGC GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG 2257 Ala Ser Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala 735 740 745 ATG GTG CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG 2305 Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val 750 755 760 765 ACG TCG CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2332 Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＴＱｉＰＡｄｔｒｐの構築工程を示す図であ
る。

【図２】ｐＣＣ００１Ａの構築工程を示す図である。

【図３】ｐＣＣ００２Ａの構築工程を示す図である。

【図４】ｐＣＫ００２の構築工程を示す図である。

【図５】ｐＣＣ００７ＡおよびｐＣＣＮｔ０１３の構築
工程を示す図である。

【図６】ｐＣＣ０１３Ａの構築工程を示す図である。

【図７】ｐΔＮ１７６およびｐＣＫ０１３の構築工程を
示す図である。

【図８】ｍｐ１８ｐ１８１およびｍｐ１８ｐ１８３の構
築工程を示す図である。

【図９】ｍｐ１８ｐ１８１Ｌ１６０ＡおよびｐＣＫＬ１
６０Ａの構築工程を示す図である。

【図１０】ｍｐ１８ｐ１８３Ｗ１６８ＹおよびｐＣＫＷ
１６８Ｙの構築工程を示す図である。

【図１１】プラスミドｐＣＫＬ１６０Ａ中における変異
型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（１〜８４０）およびそれから推
定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１２】プラスミドｐＣＫＬ１６０Ａ中における変異
型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（８４１〜１６８０）およびそれ
から推定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１３】プラスミドｐＣＫＬ１６０Ａ中における変異
型ＣＣアシラーゼＬ１６０Ａの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（１６８１〜２３３２）およびそ
れから推定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１４】プラスミドｐＣＫＷ１６８Ｙ中における変異
型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（１〜８４０）およびそれから推
定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１５】プラスミドｐＣＫＷ１６８Ｙ中における変異
型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（８４１〜１６８０）およびそれ
から推定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１６】プラスミドｐＣＫＷ１６８Ｙ中における変異
型ＣＣアシラーゼＷ１６８Ｙの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列（１６８１〜２３３２）およびそ
れから推定したアミノ酸配列を示す図である。

【図１７】プラスミドｐＣＫＬ１６０Ａの制限酵素地図
を示す図である。

【図１８】プラスミドｐＣＫＷ１６８Ｙの制限酵素地図
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者山田長司兵庫県三田市あかしあ台３−19−８

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型セファロスポリンＣアシラーゼの
アミノ酸配列のＬｅｕ¹⁶⁰および／またはＴｒｐ¹⁶⁸部
位のアミノ酸が、その他のアミノ酸により置換されてな
る変異型セファロスポリンＣアシラーゼ。
【請求項２】宿主細胞中でα−サブユニットとβ−サ
ブユニットにプロセッシングされる前の前駆体形として
のアミノ酸配列が、式：Ａ^1-159−Ｘ₁−Ａ^161-167−Ｘ₂−Ａ^169-773 （式中、Ａ^1-159は、天然型セファロスポリンＣアシラ
ーゼのＴｈｒ¹からＡｒｇ¹⁵⁹までのアミノ酸配列と同
一のアミノ酸配列を示す。Ａ^161-167は、天然型セファ
ロスポリンＣアシラーゼのＧｌｙ¹⁶¹からＶａｌ¹⁶⁷ま
でのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。Ａ
^169-773は、天然型セファロスポリンＣアシラーゼのＰ
ｈｅ¹⁶⁹からＡｌａ⁷⁷³までのアミノ酸配列と同一のア
ミノ酸配列を示す。Ｘ₁は、Ｌｅｕまたはその他のアミ
ノ酸を、Ｘ₂は、Ｔｒｐまたはその他のアミノ酸を示
す。但し、Ｘ₁がＬｅｕであるとき、Ｘ₂はＴｒｐ以外
のアミノ酸である）で示される、請求項１記載の変異型
セファロスポリンＣアシラーゼ。
【請求項３】Ｘ₁がＡｌａおよび／またはＸ₂がＴｙ
ｒである請求項２記載の変異型セファロスポリンＣアシ
ラーゼ。
【請求項４】請求項１記載のセファロスポリンＣアシ
ラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項５】請求項４記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ー。
【請求項６】請求項５記載の発現ベクターによって形
質転換された宿主細胞。
【請求項７】請求項６記載の宿主細胞を培地で培養
し、得られる培養物から変異型セファロスポリンＣアシ
ラーゼを採取することを特徴とする請求項１記載の変異
型セファロスポリンＣアシラーゼの製造方法。
【請求項８】式：【化１】（式中、Ｒ¹はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素を、
Ｒ²はカルボン酸アシルを示す）で示される化合物（I
I）またはその塩に、請求項６記載の形質転換体の培養
物またはその処理物を接触させることを含む、式：【化２】（式中、Ｒ¹は前記と同意義である）で示される化合物
（Ｉ）またはその塩の製造方法。