TWI811703B - 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體 - Google Patents
與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體 Download PDFInfo
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- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
本發明一般涉及與 CD3 及 CD19 結合之抗體，其例如用於活化 T 細胞。另外，本發明涉及編碼此等抗體之多核苷酸，以及包含此等多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步涉及產生該等抗體之方法，以及使用該等抗體治療疾病之方法。
Description
本發明一般涉及與CD3及CD19結合之抗體，其例如用於活化T細胞。另外，本發明涉及編碼此等抗體之多核苷酸，以及包含此等多核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步涉及產生該等抗體之方法，以及使用該等抗體治療疾病之方法。
CD3(分化簇3)是由四個次單元，即CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈，構成之蛋白質複合體。CD3與T細胞受體及ζ鏈締合，以在T淋巴細胞中產生活化訊號。
CD3作為藥物標靶已被廣泛探索。靶向CD3之單株抗體已被用為自體免疫疾病(諸如第I型糖尿病)的免疫抑制劑療法，或用於治療移植排斥。1985年，CD3抗體莫羅單抗(muromonab)-CD3(OKT3)是第一種被核准用於人類臨床用途之單株抗體。
CD3抗體的最新應用是雙特異性抗體的形式，一方面結合CD3，另一方面結合標靶細胞抗原，如CD19。此類抗體與其兩個標靶的同時結合將迫使標靶細胞與T細胞之間暫時相互作用，從而導致任何細胞毒性T細
胞之活化及隨後標靶細胞之溶解。例如在WO 2017/055314中描述了與CD3及CD19結合之雙特異性抗體。
出於治療目的，抗體必須滿足的一個重要的要求是在活體外(對於藥物的存放)及體內(在投予患者之後)都具有足夠的穩定性。
天冬醯胺酸脫醯胺等修飾是對重組抗體的典型降解，且即可影響活體外穩定性，又會影響體內生物學功能。
鑑於抗體、特定而言是用於活化T細胞之雙特異性抗體的巨大治療潛力，需要具有優化特性之CD3抗體，包含多特異性抗體。
本發明提供了抗體，包含多特異性(例如雙特異性)抗體，其與CD3結合且對由例如天冬醯胺酸脫醯胺產生之降解具有抗性，因此特定而言具有如治療目的所需之穩定性。所提供之(多特異性)抗體進一步兼具良好的功效和可生產性以及低毒性和有利的藥物動力學特性。
如本文所示，本發明提供的與CD3結合之抗體，包含多特異性抗體，在pH 7.4、37℃ 2週後保留超過約90%的CD3結合活性，其相對於藉由表面電漿子共振(SPR)所測量之在pH 6、-80℃ 2週後之結合活性。
在一個方面，本發明提供了一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含(a)與CD3結合之第一抗原結合域，其包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：
10之LCDR 3；及(b)與CD19結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及/或第一抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
在又一方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含(a)與CD3結合之第一抗原結合域，其包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：11之VL序列；及(b)與CD19結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域。
在一個態樣中，第二抗原結合域及/或在存在時之第三抗原結合域為Fab分子。
在一個態樣中，抗體包含Fc域，該Fc域由第一次單元及第二次單元構成。
在一個方面，第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1，特定而言可變域VL及VH彼此替換。
在一個方面，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域為習用Fab分子。
在一個方面，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域為Fab分子，其中在恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在恆定域CH1
中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一個態樣中，第一抗原結合域與第二抗原結合域彼此融合，視情況經由肽連接子彼此融合。
在一個方面，第一抗原結合域與第二抗原結合域各自為Fab分子，且(i)第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域之Fab重鏈之N端融合。
在一個方面，第一抗原結合域、第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域各自為Fab分子，且抗體包含由第一及第二次單元構成之Fc域；且其中(i)第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一次單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域之Fab重鏈之N端融合且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一次單元之N端融合；且第三抗原結合域在存在時在Fab重鏈之C端與Fc域之第二次單元之N端融合。
在一個態樣中，Fc域為IgG Fc域，特定而言IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域為人Fc域。在一個態樣中，Fc包含促進Fc域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。在一個態樣中，Fc域包含降低與Fc受體之結合及/或效應功能之一種或多種胺基酸取代。
在一個方面，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：(i)VH，其包含SEQ ID NO：15之HCDR 1、SEQ ID NO：16之HCDR 2及SEQ ID NO：17之HCDR 3，及VL，其包含SEQ ID NO：19之LCDR 1、SEQ ID NO：20之LCDR 2及SEQ ID NO：21之LCDR 3；或(ii)VH，其包含SEQ ID NO：28之HCDR 1、SEQ ID NO：29之HCDR 2及SEQ ID NO：30之HCDR 3，及VL，其包含SEQ ID NO：32之LCDR 1、SEQ ID NO：33之LCDR 2及SEQ ID NO：34之LCDR 3。在一個方面，第二抗原結合域及在存在時之第三抗原結合域包含：(i)VH，其包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及/或VL，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列；或(ii)VH，其包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及/或VL，其包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
根據本發明之又一態樣，提供一種編碼本發明之抗體的經分離之多核苷酸，以及包含本發明之經分離之多核苷酸的宿主細胞。
在另一方面，提供一種產生與CD3及CD19結合之抗體之方法，其包含如下步驟：(a)在適於表現該抗體之條件下培養本發明之宿主細胞，及視情況(b)回收該抗體。本發明亦涵蓋一種與CD3及CD19結合之抗體，其藉由本發明之方法產生。
本發明進一步提供一種包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
本發明亦涵蓋使用本發明之抗體及醫藥組成物之方法。在一個方面，本發明提供一種根據本發明用為藥劑之抗體或醫藥組成物。在一個態樣中，提供一種根據本發明用於治療疾病之抗體或醫藥組成物。亦提供根據本發明之抗體或醫藥組成物在用於製造藥劑中之用途，及根據本發明之抗體或醫藥組成物在用於製造供治療疾病之藥劑中之用途。本發明亦提供一種治療受試者之疾病之方法，其包含向所述個體投予有效量的根據本發明之抗體或醫藥組成物。在某些方面，該疾病為癌症。在其他方面，該疾病為自體免疫疾病。
圖1.本發明之(多特異性)抗體之例示性構型。(A、D)「1+1 CrossMab」分子之圖示。(B、E)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有Crossfab和Fab組成之順序替換(「反向(inverted)」)。(C、F)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(G、K)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有Crossfab和Fab組成之順序替換(「反向」)。(H、L)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(I、M)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個CrossFab。(J、N)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個CrossFab及Crossfab和Fab組成之順序替換(「反向」)。(O、S)「Fab-Crossfab」分子之圖示。(P、T)「Crossfab-Fab」分子之圖示。(Q、U)「(Fab)2-Crossfab」分子之圖示。(R、V)「Crossfab-(Fab)2」分子之圖示。(W、Y)「Fab-(Crossfab)2」分子之圖示。(X、Z)「(Crossfab)2-Fab」分子之圖示。黑點：Fc域中的可選修飾，其促進異源二聚化(heterodimerization)。++、--：在CH1和CL域中視情況引入相反電荷的胺基酸。Crossfab分子描述為包含VH和VL區域
的交換，但可以(在其中CH1和CL域中沒有引入電荷修飾的態樣中)交替地包含CH1和CL域的交換。
圖2.原始和優化的CD3黏合劑(CD3原始和CD3優化)與重組CD3的相對結合活性，其是藉由SPR在非應力條件下、40℃pH 6下14天後或37℃pH 7.4下14天後所測量(IgG形式)。
圖3.藉由流式細胞術所測量之原始和優化的CD3黏合劑(CD3原始和CD3優化)與Jurkat NFAT細胞之結合(IgG形式)。以經螢光標記之抗人類Fc特異性二級抗體檢測與Jurkat NFAT細胞結合之抗體。
圖4.實例3中使用的CD3活化測定的示意圖。
圖5.以原始和優化的CD3黏合劑(CD3原始和CD3優化)活化Jurkat NFAT(IgG形式)。在作為陰性對照的CD3原始或CD3優化IgG PGLALA或CD3優化IgG wt的存在下，將Jurkat NFAT報告細胞與表現抗PGLALA之CHO(CHO-PGLALA)細胞共同培育。藉由測量24小時後的發光對CD3活化進行定量。
圖6.(A)在實例中使用之T細胞雙特異性抗體(TCB)分子之示意圖。所有經測試之TCB抗體分子均以「2+1 IgG CrossFab，反向」的形式產生，具有電荷修飾(CD3黏合劑中之VH/VL交換、標靶抗原黏合劑中之電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)。(B-E)用於組裝TCB的組件：CH1和CL中帶有電荷修飾的抗TYRP1 Fab分子之輕鏈(B)、抗CD3交換型Fab分子之輕鏈(C)、Fc區中具有杵及PG LALA突變之重鏈(D)、Fc區具有臼及PG LALA突變之重鏈(E)。
圖7.藉由流式細胞術所測量之CD19-TCB抗體與表現CD3之Jurkat細胞(A)及與表現CD19之Z-138(B)和Nalm-6(C)細胞之結合。
圖8.CD19-TCB抗體誘導的CD19+標靶細胞之標靶特異性毒殺。(A)Z-138標靶細胞，(B)Nalm-6標靶細胞。
圖9.毒殺Z-138標靶細胞後由CD19-TCB抗體誘導之T細胞活化。(A)CD4 T細胞上之CD25表現，(B)CD4 T細胞上之CD69表現，(C)CD4 T細胞上之CD107表現，(D)CD8 T細胞上之CD25表現，(E)CD8 T細胞上之CD69表現，(F)CD8 T細胞上之CD107表現。
圖10.毒殺Nalm-6標靶細胞後由CD19-TCB抗體誘導之T細胞活化。(A)CD4 T細胞上之CD25表現，(B)CD4 T細胞上之CD69表現，(C)CD4 T細胞上之CD107表現，(D)CD8 T細胞上之CD25表現，(E)CD8 T細胞上之CD69表現，(F)CD8 T細胞上之CD107表現。
圖11.實例10之體內研究的設計。
圖12.在實例10之研究中，用不同劑量之CD19-TCB或CD20-TCB處理後的體重變化。每組n=3隻小鼠。平均值+/- SEM。
圖13.在實例10之研究中，在有或沒有obinituzumab(Gazyva(R)預處理(GPT))的情況下，用CD19-TCB或CD20-TCB處理後4小時之時血清中的細胞激素釋放。(A)MIP-1β，(B)IL-6，(C)IFN-γ，(D)IL-5，(E)GM-CSF，(F)TNF-α，(G)IL-2，(H)IL-1β，(I)IL-13，(J)MCP1，(K)IL-8，(L)IL-10，(M)G-CSF，(N)IL-12p70，(O)IL-17。每個組中的條從左到右：CD19-TCB 0.5mg/kg，CD19-TCB 0.15mg/kg，CD19-TCB 0.05mg/kg，GPT+CD19-TCB 0.5mg/kg，CD20-TCB 0.15mg/kg，GPT+CD20-TCB 0.15mg/kg。平均值±SEM。
圖14.在實例10之研究中，在有或沒有obinituzumab(Gazyva®)預處理(GPT)的情況下，CD19-TCB或CD20-TCB處理後4小時、24小時及72小時之時血液中的B細胞計數。平均值±SEM。
圖15.治療計劃及實驗設置。人源化NSG小鼠經皮下植入淋巴瘤患者來源的異種移植物(PDX)(500萬個細胞)。透過卡尺測量計算腫瘤體積。當腫瘤體積達
至200mm3時，基於腫瘤大小將小鼠隨機分為8組。然後每週給小鼠注射(i.v.)載體或0.5mg/kg CD19-TCB。
圖16.CD19-TCB治療對腫瘤生長之影響。如圖15所述，對於B組中的n=7隻小鼠及A組中的n=8隻小鼠，透過卡尺測量每週兩次(體積<1000mm3)或三次(體積
1000mm3)計算腫瘤體積。平均值+ SD，*p
0.05，**p
0.01，***p
0.001，透過Mann-Whitney檢驗。箭頭表示用CD19-TCB或載體進行的4次治療中的每一次。
定義除非在下文中另外定義，否則本文所用的術語為本技術領域中的一般使用。
如本文中所使用的關於抗原結合域等的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便區分每一類型之部分何時存在多於一個。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予部分特定之順序或方向。
術語「抗CD3抗體」及「結合至CD3之抗體」是指能夠以足夠親和力結合CD3，從而使得該抗體可用作靶向CD3之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個態樣中，抗CD3抗體與無關、非CD3蛋白質結合之程度低於該抗體與CD3結合約10%，其藉由例如表面電漿子共振(SPR)所測量。在某些方面，與CD3結合之抗體之解離常數(KD)
1μM、
500nM、
200nM或
100nM。當抗體的例如藉由SPR測量之KD為1μM或更少時，稱該抗體
與CD3「特異性結合」。在某些態樣中，抗CD3抗體結合至CD3之表位，其在不同物種之CD3是保守性。
類似地，術語「抗CD19抗體」及「與CD19結合之抗體」是指能夠以足夠親和力結合CD19，從而使得該抗體可用作靶向CD19之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個態樣中，抗CD19抗體與無關、非CD19蛋白質結合之程度低於該抗體與CD19結合約10%，其藉由例如表面電漿子共振(SPR)所量測。在某些方面，與CD19結合之抗體之解離常數(KD)
1μM、
500nM、
200nM或
100nM。當抗體的例如藉由SPR測量之KD為1μM或更少時，稱該抗體與CD19「特異性結合」。在某些態樣中，抗CD19抗體結合至CD19之表位，其在不同物種之CD19是保守性。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其等展示出期望之抗原結合活性即可。
「抗體片段」是指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，該完整抗體結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv及scFab)、單域抗體及由抗體片段所形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23：1126-1136(2005)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體。
如本文中所使用的術語「單株抗體(monoclonal antibody)」，是指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，但不包括(例如)含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「經分高之」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些態樣中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC、親和力層析、粒徑篩析層析法)方法所測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。在某些態樣中，本發明所提供的抗體是經分離之抗體。
術語"嵌合"抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
「人源化(humanized)」抗體係指包含來自非人CDR之胺基酸殘基及來自人FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些方面，人源化抗體將包含實質上所有至少一個(且通常兩個)可變域，其中所有或實質上所有CDR對應
於非人抗體之其等，及所有或實質上所有FR對應對於人抗體之其等。此等可變域在本文中稱為「人源化可變區(humanized variable region)」。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基經來自非人抗體(例如衍生HVR殘基之抗體)之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。抗體(例如非人抗體)之「人源化形式(humanized form)」是指已經歷人源化之抗體。
「人抗體(human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系(antibody repertoire)或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。在某些態樣中，人抗體係衍生自非人轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些態樣中，人抗體衍生自融合瘤細胞株。從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中亦被視作人抗體或人抗體片段。
術語「抗原結合域」係指抗體之部分，其包含結合至抗原之部分或全部且與其互補之區域。抗原結合域可由例如一個或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。在較佳態樣中，抗原結合域包含抗體輕鏈變異域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。
術語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之變異域通常具有類似的結構，其中每個域均包含四個保守性骨架區(FR)及互補決定區(CDR)。參見，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman & Co.，第91頁(2007)。單個VH或VL
域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用VH或VL域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補VL或VH域的文庫。參見，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。如在本文中結合可變區序列所使用的「Kabat編號」，是指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991)描述的編號系統。
如本文中所使用的重鏈及輕鏈之所有恆定區及域之胺基酸位置，根據描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat編號系統(在本文中稱為「根據Kabat編號」或「Kabat編號」)編號。具體而言，Kabat編號系統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的第647-660頁)用於κ及λ同型之輕鏈恆定域CL及Kabat及EU索引編號系統(參見第661-723頁)用於重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)，在此情況中，其於本文中藉由參考「根據Kabat EU索引編號」或「Kabat EU索引編號」進一步闡明。
如本文中所使用的術語「高度可變區」或「HVR」是指抗體可變域中序列高度可變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。一般而言，抗體包含六個CDR：三個在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，及三個在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在本文中，例示性CDR包括：
(a)高度可變環存在於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)處(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)CDR存在於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；及(c)抗原接觸存在於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及93-101(H3)處(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。
除非另有說明，否則CDR根據Kabat等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，也可以根據Chothia在上述文獻、McCallum在上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來確定CDR名稱。
「骨架」或「FR」係指互補決定區(CDR)之外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常以如下順序出現在VH(或VL)中：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另有說明，否則可變域中之CDR殘基和其他殘基(例如FR殘基)在本文中根據Kabat等人(同上文)編號。
就本文目的而言，「接受者人骨架(acceptor human framework)」是包含衍生自人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的輕鏈可變域(VL)骨架或重鏈可變域(VH)骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自」人
免疫球蛋白骨架或人共通骨架的接受者人骨架可包含其相同的胺基酸序列，或者其可含有胺基酸序列變化。在一些態樣中，胺基酸變化的數目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些態樣中，VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共通骨架序列的序列相同。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變域序列的亞組。通常，序列的亞組是如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷)中所述之亞組。
在本文中術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構之蛋白質。例如，IgG類的免疫球蛋白為約150,000道耳頓、由二條輕鏈及二條重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條重鏈具有可變域(VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區，接著係三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可被歸類為五種類型中的一種，稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分為亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。基於其恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕(κ)及蘭姆達(λ)。免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接的二個Fab分子及一個Fc域組成。
抗體或免疫球蛋白之「類別(class)」是指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類(同型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成之蛋白質。
「交換型(crossover)」Fab分子(亦稱為「Crossfab」)意指Fab分子，其中Fab重鏈及Fab輕鏈之可變域或恆定域被交換(即彼此替換)，即，交換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1CH1組成之肽鏈(VL-CH1，在N端至C端方向)、及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL組成之肽鏈(VH-CL，在N端至C端方向)。為清楚起見，在Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域被交換之交換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1CH1之肽鏈在本文中稱為(交換型)Fab分子之「重鏈」。相反地，在Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定域被交換之交換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH之肽鏈在本文中稱為(交換型)Fab分子之「重鏈」。
與此相反，「習用」Fab分子意指其自然形式(即包含由重鏈可變域及恆定域組成之重鏈(VH-CH1，在N端至C端方向)及由輕鏈可變域及恆定域組成之輕鏈(VL-CL，在N端至C端方向))之Fab分子。
本文中的術語「Fc域」或「Fc區」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的C端區。該術語包括天然序列Fc區域和變異Fc區域。在一個方面，人IgG重鏈Fc區域從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羧基
端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈C端的一種或多種，特定而言一種或兩種胺基酸之翻譯後切割。因此，由宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變異體。可能是這種情況，其中重鏈的最後兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)。因此，可以存在或可以不存在Fc區域之C端離胺酸(Lys447)或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(Lys447)。除非另有說明，否則包括Fc區(或本文定義的Fc域的次單元)之重鏈之胺基酸序列在本文中表示不含C端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之Fc區(次單元)的重鏈包含另外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446和K447，根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文所述之Fc區(次單元)的重鏈包含另外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據EU編號系統(亦稱為EU索引)進行，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述(另見上文)。如本文中所使用的Fc域之「次單元」，是指形成二聚體Fc域之兩個多肽之一，即包含能夠穩定自締合之免疫球蛋白重鏈之C端恆定區之多肽。例如，IgG Fc域之次單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「融合」意指組分(例如Fab分子及Fc域次單元)經肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
術語「多特異性」意指抗體能夠與至少二個不同的抗原決定位特異性結合。多特異性抗體可以是例如雙特異性抗體。通常，雙特異性抗體包
含兩個抗原結合位點，其中每個位點對不同的抗原決定子具有特異性。在某些態樣中，多特異性(例如雙特異性)抗體能夠同時結合二個抗原決定位，特定而言在二種不同細胞上表現之二個抗原決定位。
如本文中所使用的術語「價數(valent)」，表示抗原結合分子中存在指定數量之抗原結合位點。因此，術語「單價結合抗原(monovalent binding to an antigen)」表示抗原結合分子中存在對抗原具有特異性之一個(且不超過一個)抗原結合位點。
「抗原結合位點(antigen binding site)」係指提供與抗原相互作用的抗原結合分子之位點，即一個或多個胺基酸殘基。例如，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。未處理之(native)免疫球蛋白分子通常具有二個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文中所使用，術語「抗原決定子(antigenic determinant)」或「抗原決定基(epitope)」係指與抗原結合域結合之多肽大分子上的形成抗原結合域-抗原複合體之位點(例如，胺基酸之連續延伸或由非連續胺基酸之不同區域構成的構象構型)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質(ECM)中。在一較佳態樣中，該抗原為人蛋白質。
除非另有說明，否則「CD3」係指源自任何脊椎動物的任何天然CD3，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人)、非人靈長類動物(例如食蟹獼猴)及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之CD3以及在細胞處理中得到的任何形式的CD3。該術語亦涵蓋天然生成
之CD3變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一個態樣中，CD3是人CD3，特定而言人CD3的ε次單元(CD3ε)。人CD3ε之胺基酸序列示於SEQ ID NO：45(無信號肽)中。另見UniProt(www.uniprot.org)登錄號P07766(版本209)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。在另一態樣中，CD3是食蟹獼猴(cynomolgus/Macaca fascicularis)CD3，特定而言食蟹獼猴CD3ε。食蟹獼猴CD3ε之胺基酸序列示於SEQ ID NO：46(無信號肽)中。另見NCBI GenBank號BAB71849.1。在某些態樣中，本發明之抗體結合至CD3之抗原決定基，該CD3之抗原決定基在來自不同物種的CD3抗原中，特定而言在人和食蟹獼猴CD3中是保守的。在較佳態樣中，抗體結合至人CD3。
如本文中所使用，「標靶細胞抗原」是指在標靶細胞例如B細胞表面上提呈之抗原決定子。較佳地，標靶細胞抗原不是CD3，及/或在不同於CD3之細胞上表現。根據本發明，標靶細胞抗原為CD19，特定而言為人CD19。
除非另有說明，否則「CD19」代表分化簇19(亦稱為B淋巴細胞抗原CD19或B淋巴細胞表面抗原B4)，且是指來自任何脊椎動物來源的任何天然CD19，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人)、非人靈長類動物(例如食蟹獼猴)和囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之CD19以及在細胞處理中得到的任何形式的CD19。該術語亦涵蓋天然生成之CD19變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一個方面，CD19為人CD19。參見UniProt(www.uniprot.org)登錄號P15391(版本211)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_001761.3瞭解人蛋白質。在
某些態樣中，本發明之抗體結合至CD19之抗原決定基，該CD19之抗原決定基在來自不同物種的CD19抗原中，特定而言在人和食蟹獼猴CD3中是保守的。在較佳方面，抗體結合至人CD19。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體及抗原)之間1：1交互作用的內在結合親和力。分子X對於其搭配物Y之親和力通常可藉由解離常數(KD)來表示。可透過本領域已知的既定方法測量親和力，該方法包含那些本文所述之方法。用於測量親和力之較佳方法為表面電漿子共振(SPR)。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區(CDR)中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
「減少結合」，例如減少結合Fc受體，係指(例如)藉由SPR測量各自相互作用之親和力降低。為清楚起見，該術語亦包括將親和力降低至零(或低於分析方法的檢測限度)，即相互作用完全廢除。相反，「增加結合」是指各自相互作用之結合親和力增加。
如本文中所使用的「T細胞活化」，係指T淋巴細胞(特定而言細胞毒性T淋巴細胞)之一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記之表現。測量T細胞活化之適宜測定係本技術中已知的並在本文中描述。
「促進Fc域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾」係對胜肽主鏈的操作或對Fc域次單元之翻譯後修飾，其減少或阻止包含Fc域次單元
之多肽與相同多肽之締合形成同型二聚體。本文所用之促進締合之修飾，較佳包括對期望締合之兩個Fc域次單元(即Fc域之第一次單元及第二次單元)中的每一個所進行之單獨修飾，其中，該修飾彼此互補，以便促進兩個Fc域次單元之締合。例如，促進締合之修飾可改變一個或兩個Fc域次單元之結構或電荷，以分別使其在空間或靜電上有利。因此，(雜)二聚化發生在包含第一Fc域次單元之多肽與包含第二Fc域次單元之多肽之間，其就融合到每個次單元(例如，抗原結合域)的其他組分而言可能有所不同。在一些方面，促進Fc域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾包含Fc域中的胺基酸突變，具體而言為胺基酸取代。在一較佳態樣中，促進Fc域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾包含Fc域之二個次單元的每一個中之單獨的胺基酸突變，具體而言胺基酸取代。
術語「效應功能」，係指歸因於抗體的Fc區域的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞激素分泌、抗原呈遞細胞攝取之免疫複合體媒介抗原、細胞表面受體(例如，B細胞受體)降調及B細胞活化。
「活化Fc受體」為在抗體之Fc域參與之後引起刺激受體攜帶細胞執行效應功能的信號轉導事件的Fc受體。人活化Fc受體包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性(ADCC)為一種免疫機制，其導致免疫效應細胞溶解抗體包被的標靶細胞。標靶細胞為抗體或其衍生物包含
Fc區的細胞，其通常透過作為N端的蛋白質部分與Fc區特異性結合。如本文中所使用的術語「減少ADCC」，是指透過上文定義的ADCC機制在給定時間內以標靶細胞周圍之培養基中給定濃度的抗體在給定時間內溶解的標靶細胞數量的減少，及/或透過ADCC機制在給定時間內實現給定數量的標靶細胞之裂解所需的標靶細胞周圍之培養基中抗體濃度的增加。ADCC的減少相對於使用相同標準生產、純化、配製和儲存方法(本技術領域具有通常知識者已知的方法)由相同類型的宿主細胞所產生的相同抗體(但尚未工程化)所媒介的ADCC。例如，由Fc域中包含減少ADCC的胺基酸取代的抗體所媒介的ADCC的減少為相對於在Fc域中不含此胺基酸取代的相同抗體所媒介的ADCC。用於測量ADCC的合適的測定法為本技術領域中熟知的(參見例如PCT公開號WO 2006/082515或PCT公開號WO 2012/130831)。
如本文中所使用的術語「工程改造(engineer、engineered、engineering)」，被認為包括對胜肽主鏈的任何操作或天然存在的或重組的多肽或其片段的轉譯後修飾。工程改造包括修改胺基酸序列、醣基化模式、或單個胺基酸的側鏈基團，以及這些方法的組合。
如本文所用的術語「胺基酸突變」，意指涵蓋胺基酸取代、缺失、***和修飾。可實施取代、缺失、***和修飾之任意組合以得到最終構建體，前提條件為最終構建體具有所需之特徵，例如，與Fc受體之結合減少或與另一種肽之締合增加。胺基酸序列缺失和***包括胺基酸之胺基及/或羰基末端之缺失和***。較佳的胺基酸突變為胺基酸取代。為改變例如Fc區域之結合特徵，特定而言優選非保守胺基酸取代，即將一種胺基酸取代為具有不同結構及/或化學性質之另一種胺基酸。胺基酸取代包括用二十種標準胺基酸之非天
然存在之胺基酸或天然存在之胺基酸衍生物(例如，4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)取代。可使用本領域中熟知的遺傳或化學方法產生胺基酸突變。遺傳方法可包括定點突變、PCR、基因合成等。預期透過遺傳工程以外之方法諸如化學修飾改變胺基酸之側鏈基團的方法也可能有用。本文可使用各種名稱指示同一胺基酸突變。例如，Fc域位置329處之脯胺酸取代為甘胺酸，可表示為329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
相對於參考多肽序列所述之「百分比(%)胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後(如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守性替換作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)軟件或FASTA程式封裝實現。本領域之技術人員可確定用於排列序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大排列所需之任何演算法。可替代地，可使用序列比較計算機程式ALIGN-2生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比較計算機程式由建南德克公司(Genentech,Inc.)開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區20559的美國著作權局，其已經注冊(美國版權註冊號TXU510087)並在WO 2001/007611中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用FASTA封裝36.3.8c版本或更高版本的ggsearch程式與BLOSUM50比較矩陣來生成胺基酸序列同一性%值。FASTA程式封裝由以下作者開發：W.R.Pearson及D.J.Lipman(「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」，PNAS 85(1988)
2444-2448)，W.R.Pearson(「Effective protein sequence comparison」Meth.Enzymol.266(1996)227-258)，及Pearson等人(Genomics 46(1997)24-36)且可自www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公開獲取。可替代地，可使用透過http：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi存取的公用伺服器，使用ggsearch(global protein：protein)程式和預設選項(BLOSUM50；open：-10；ext：-2；Ktup=2)比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「多核苷酸」或「核酸分子」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基(即，胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即，脫氧核糖或核糖)及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構(線性結構)。鹼基序列通常由5’至3’表示。在本文中，術語核酸分子包括：脫氧核糖核酸(DNA)，其包括例如互補DNA(cDNA)和基因組DNA；核糖核酸(RNA)，特定而言信使RNA(mRNA)；DNA或RNA的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或體內例如在宿主或患者體內直接表達本發明之抗體的載體的DNA和RNA分子。此等DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，
mRNA可經過化學修飾以增強RNA載體之穩定性及/或編碼分子之表達，從而將mRNA注入個體體內以產生抗體(參見例如Stadler等人(2017)Nature Medicine 23：815-817或EP 2 101 823 B1)。
「經分離之」核酸分子係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。經分離之核酸分子包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體之經分離之多核苷酸(或核酸)」係指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)之一種或多種多核苷酸分子，包括在單個載體或單獨載體中之此等多核苷酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處之此等多核苷酸分子。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明之抗體的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，諸如HEK細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細
胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個態樣中，本發明之宿主細胞是真核細胞，特定而言哺乳動物細胞。在一個態樣中，宿主細胞不是人體內的細胞。
術語「醫藥組成物」或「藥學製劑」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且其不含對將投予組成物之個體具有不可接受之毒性的另外的組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或配方中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療」(及其語法變體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改善預後。在一些方面，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些方面，個體或受試者為人類。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
術語「包裝插頁」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、組合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
本發明提供結合CD3及CD19之抗體。抗體顯示出優異的穩定性，兼具其他用於治療應用之有利特性，例如，關於有效性及安全性、藥物動力學以及可生產性。本發明之抗體例如可用於治療疾病，諸如癌症或自體免疫疾病。
A.抗CD3/CD19抗體
在一個方面，本發明提供與CD3及CD19結合之抗體。在一個方面，提供了與CD3及CD19結合之經分離之抗體。在一個方面，本發明提供與CD3及CD19特異性結合之抗體。在某些方面，抗CD3/CD19抗體在pH 7.4、37℃ 2週後保留超過約90%的CD3結合活性，其相對於藉由表面電漿子共振(SPR)所測量之在pH 6、-80℃ 2週後之結合活性。
在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含(a)第一抗原結合域，其包含：與CD3結合之重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3。
在一個態樣中，抗體為人源化抗體。在一個方面，第一抗原結合域為人源化抗原結合域(即人源化抗體之抗原結合域)。在一個方面，第一抗原結合域之VH及/或VL為人源化可變區。
在一個方面，第一抗原結合域之VH及/或VL包含受體人骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。
在一個方面，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區之一個或多個重鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VH序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與CD3結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：7的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。視情況，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第一抗原結合域之VL包含SEQ ID NO：11之輕鏈可變區之一個或多個輕鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第一抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約
95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VL序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與CD3結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：11的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第一抗原結合域之VL包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。視情況，第一抗原結合域之VL包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第一抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列，且第一抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第一抗原結合域之VH域包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列且第一抗原結合域之VL域包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
在又一方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含與CD3結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，及VL，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
在又一方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含與CD3結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含SEQ ID NO：7之VH序列，及SEQ ID NO：11之VL序列。
在另一方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含與CD3結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH，其包含SEQ ID NO：7之VH之重鏈CDR序列，及VL，其包含SEQ ID NO：11之VL之輕鏈CDR序列。
在又一方面，第一抗原結合域包含SEQ ID NO：7之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO：11之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個方面，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：7之VH之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：7之VH之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第一抗原結合域之VH包含SEQ ID NO：7之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：7之VH之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
在一個方面，第一抗原結合域之VL包含SEQ ID NO：11之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：11之VL之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第一抗原結合域之VL包含SEQ ID NO：11之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：11之VL之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第一抗原結合域之
VL包含SEQ ID NO：11之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：11之VL之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含與CD3結合之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含如上文所提供之任何方面之VH序列及如上文所提供之任何方面之VL序列。
在一個態樣中，抗體包含人恆定區。在一個態樣中，抗體為包含人恆定區的免疫球蛋白分子，特定而言包含人CH1、CH2、CH3及/或CL域的IgG類免疫球蛋白分子。人恆定域的示例性序列在SEQ ID NO 52和53(分別為人κ和λ CL域)以及SEQ ID NO：54(人IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一個態樣中，抗體包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53之胺基酸序列，特定而言SEQ ID NO：52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與SEQ ID NO：54之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。特定而言，如本文所述，重鏈恆定區可在Fc域中包含胺基酸突變。
在一個態樣中，第一抗原結合域包含人恆定區。在一個態樣中，第一抗原結合部分為Fab分子，該Fab分子包含人恆定區，特定而言人CH1及/或CL域。在一個態樣中，第一抗原結合域包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53之胺基酸序列，特定而言SEQ ID NO：52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，及/或可在交換型Fab分子中包含一個或多個(特別是兩個)N端胺基酸
之缺失或取代。在一些態樣中，第一抗原結合域包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在SEQ ID NO：54之胺基酸序列中之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區(具體而言CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在一個態樣中，抗體為單株抗體。
在一個態樣中，抗體為IgG抗體，特定而言IgG1抗體。在一個態樣中，抗體為全長抗體。
在另一態樣中，抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab')2分子之群組的抗體片段；特定而言Fab分子的抗體片段。在另一個實施例中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。
在一個態樣中，第一抗原結合域為Fab分子。在一較佳方面，第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈和Fab重鏈之可變域VL和VH或恆定域CL及CH1，特定而言可變域VL及VH彼此替換(即，第一抗原結合域為交換型Fab分子)。
在又一方面，根據以上任一方面之抗體可單獨或組合地結合任何特徵，如以下章節II.A.1.-8.所述。
在一較佳方面，抗體包含Fc域，特定而言IgG Fc域，更特別地是IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域為人Fc域。在一個態樣中，Fc域為人IgG1 Fc域。Fc域由第一和第二次單元組成，且可單獨或組合地結合下文中關於Fc域變體所描述的任何特徵(章節II.A.8.)。
根據本發明，抗體包含與CD19結合之第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域(即抗體為多特異性抗體，如下文進一步描述的(章節II.A.7.)。
1.抗體片段
在某些方面，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個態樣中，抗體片段為Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2分子，特定而言如本文中所描述的Fab分子。「Fab’分子」與Fab分子的區別在於在CH1域之羧基端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH是Fab’分子，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個F(ab')2分子，該分子具有兩個抗原結合位點(兩個Fab分子)和一部分Fc區。
在另一個實施例中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。雙抗體為具有兩個抗原結合位點(其可為二價或雙特異性的)之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
在又一態樣中，抗體片段為單鏈Fab分子。「單鏈Fab分子」或「scFab」由抗體重鏈可變域(VH)、抗體重鏈恆定域1(CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成，其中所述抗體域及所述連接子在N端至C端方向具有以下序列之一：a)VH-CH1-連接子-VL-CL、b)VL-CL-連接子-VH-CH1、c)VH-CL-連接子-VL-CH1或d)VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，所述連接子為至少30個胺基酸且較佳地32至50個胺基酸組成之多
肽。所述單鏈Fab分子通過CL域與CH1域之間的天然二硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈Fab分子可通過***半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定(例如，根據Kabat編號，在變異重鏈之位置44和變異輕鏈之位置100處***)。
在另一方面，抗體片段為單鏈變異片段(scFv)。「單鏈變異片段」或「scFv」為抗體之重鏈(VH)和輕鏈(VL)的變異域之融合蛋白，其通過連接子連接。特別地，連接子為10個至25個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將VH之N端與VL之C端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於scFv片段的綜述，參見例如Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag，New York，第269頁至第315頁(1994)；亦可參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。
在另一方面，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些方面，單域抗體為人單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利號6,248,516 B1)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞(例如大腸桿菌)之重組產生。
2.人源化抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為人源化抗體。通常，非人抗體被人源化以降低對人類的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和
力。通常，人源化抗體包含一個或多個變異域，其中CDR(或其部分)來源於非人抗體，並且FR(或其部分)來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將也包含人恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基經來自非人抗體(例如衍生HVR殘基之抗體)之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，並且進一步描述於例如：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；US專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(具體描述了決定區(SDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述了「FR改組」)；Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)；及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了FR改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人骨架區包含但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的骨架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；來源於輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共通序列的骨架區(參見例如：Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟的(體細胞突變)骨架區或人類生殖系骨架區(參見例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及來源於篩選FR文庫的骨架區(參見例如：Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)；及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
3.醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或刪除醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含Fc區域時，可改變與其相連的寡糖。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖，其通常藉由N鍵連接至Fc區域CH2域之Asn297。參見例如，Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙觸角寡糖結構之「莖」中連接至GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變體。
在一個實施例中，提供了具有非岩藻醣基化寡糖的抗體變體，即缺少(直接或間接地)連接至Fc區域的岩藻糖的寡糖結構。此等非岩藻醣基化寡糖(也稱為「去岩藻醣基化」寡糖)特定而言在雙天線型寡糖結構的莖中缺少與第一GlcNAc連接之岩藻糖殘基的N-連接寡糖。在一個實施例中，提供了與天然或親本抗體相比在Fc區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體變體。例如，非岩藻醣基化寡糖的比例可以為至少約20%、至少約40%、至少約60%、至少約80%或甚至約100%(即不存在岩藻醣基化寡糖)。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至Asn 297(例如複合體、雜合和高甘露糖結構)的所有寡糖的總和之(平均)量，該百分比透過MALDI-TOF質譜法測量，例如WO 2006/082515中所述。Asn297係指位於Fc區位置297附近之天冬醯胺殘基(Fc區殘基的EU編號)；但是，Asn297也可以位於位
置297上游或下游大約±3個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置294和300之間。此等在Fc區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的FcγRIIIa受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的ADCC功能。參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其是在實例11中)；和敲除細胞株，諸如敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8的CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614-622(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)；或GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞(參見例如US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個實施例中，抗體變體被提供有二等分之寡糖，例如，其中連接至抗體之Fc區域的雙天線型寡糖被GlcNAc平分。此等抗體變體可具有如上文所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的ADCC功能。此等抗體變體之實例描述於例如：Umana等人，Nat Biotechnol 17，176-180(1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93，851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
還提供了在寡糖上具有至少一個連接至Fc區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的CDC功能。此等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087、WO 1998/58964及WO 1999/22764中。
4.半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些方面，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如THIOMABTM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在較佳態樣中，經取代殘基出現在抗體之可進入的位點。藉由用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團從而被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分(例如，藥物部分或連接子-藥物部分)結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO 2016040856所屬的方法產生。
5.抗體衍生物
在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的另外的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三
、乙烯/順丁烯二酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)以及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
6.免疫結合物
本發明亦提供了包含如本文所述之抗CD3/CD19抗體的免疫結合物，其結合(化學鍵結)至一種或多種治療劑，諸如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑綴合。通常使用連接子將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC技術概述(包括治療劑、藥物和連接子之實例)載於Pharmacol Review 68：3-19(2016)中。
在另一態樣中，免疫結合物包含綴合至酶活性毒素或其片段的本發明之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲***素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和。
在另一態樣中，免疫結合物包含結合至放射性原子以形成放射性複合體的本發明之抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性共軛體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。當放射性共軛物用於檢測時，它可能包含用於閃爍顯像研究之放射性原子，例如Tc99m或I123，或用於核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記物，諸如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能基蛋白耦聯劑進行製備，該雙功能蛋白耦合劑例如，N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷鹽(IT)、亞胺酯的雙官能基衍生物(例如，己二酸二甲酯鹽酸鹽，HCl)、活性酯(例如，雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛(例如，戊二醛)、雙疊氮化合物(例如，雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如，雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如，甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照Vitetta等人(Science 238：1098(1987))所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸結合至抗體的一種示例性螯合劑為碳-14標記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)。參見WO 94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接基、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國第5,208,020號專利)。
本文之免疫結合物或ADC明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之結合物，該交聯劑包括但不限於可商購獲得(例如從Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL.,U.S.A)商購獲得)之BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。
7.多特異性抗體
本文提供之抗體為多特異性抗體，特定而言為雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定位(例如兩種不同蛋白質，或同一蛋白質上的兩個不同抗原決定基)具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。根據本發明，結合特異性之一為對CD3之結合特異性，而其他特異性則為針對CD19。
多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello，Nature 305：537(1983))及「杵臼」(knob-in-hole)工程(參見例如美國專利號5,731,168，及Atwell等人J.Mol.Biol.270：26(1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體Fc-異型二聚體分子的工程靜電轉向效應(參見例如WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見例如美國專利號4,676,980；及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)；及WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題(參見例如WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段(參見例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；以及按照例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)所述之方法製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies)或DVD-Ig(參見例如WO 2001/77342及WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他
實例可參見WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2013/026831中。多特異性抗體或其抗原結合片段也包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含與CD3以及另一種不同抗原或CD3的兩個不同抗原決定基結合之抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820及WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可以不對稱形式提供，其中域在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交換(所謂的「CrossMab」技術)，即透過交換VH/VL域(參見例如WO 2009/080252及WO 2015/150447)、CH1/CL域(參見例如WO 2009/080253)或完整的Fab臂(參見例如WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見Schaefer等人，PNAS，108(2011)1187-1191，及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)實現。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確Fab配對，從而設計不對稱之Fab臂。參見例如WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中(參見例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞(例如B細胞)上之表面抗原以及T細胞受體(TCR)之活化不變組分(例如CD3)複合體，用於重定向T細胞以毒殺標靶細胞。因此，本文中提供之抗體為多特異性抗體，特定而言為雙特異性抗體，其中結合特異性之一針對CD3，且其他結合特異性則針對CD19，其作為標靶細胞抗原。
可用於此目的之雙特異性抗體形式的實例包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager)分子，其中兩個scFv分子透過柔性連接子融合(參見例如WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261及WO 2008/119567；Nagorsen及Bäuerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))；雙抗體(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，諸如串聯雙抗體(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；「DART」(雙親和力重定位)分子，其基於雙抗體形式，但具有C端雙硫鍵以供另外的穩定(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所謂triomab，它們為完整的小鼠/大鼠IgG雜合分子(參見Seimetz等人的綜述：Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))。本文所包括之特定T細胞雙特異性抗體形式描述於WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；及Bacac等人Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498.
下面描述本發明之抗體的較佳方面。
在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之抗體，其包含與CD3結合之第一抗原結合域，如本文所述，且包含與CD19結合之第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域。
根據本發明之較佳態樣，包含在抗體中之抗原結合域為Fab分子(即，由重鏈和輕鏈組成的抗原結合域，其中每一個均包含變異域和恆定域)。在一個態樣中，第二抗原結合域及/或在存在時之第三抗原結合域為Fab分子。在一個態樣中，所述Fab分子為人Fab分子。在一較佳方面，該Fab分子為人源化的。在又一態樣中，所述Fab分子包含人重鏈恆定域及人輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合域中之至少一個為交換型Fab分子。此等修飾減少了來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高重組產生本發明之(多特異性)抗體的產率和純度。在用於本發明之(多特異性)抗體的較佳交換型Fab分子中，交換了Fab輕鏈及Fab重鏈(分別為VL和VH)的變異域。然而，即使采用此域交換，由於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂Bence Jones型相互作用，(多特異性)抗體的製備也可能包含某些副產物(參見Schaefer等人，PNAS，108(2011)11187-11191)。為進一步減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高所需之(多特異性)抗體的純度和產率，可在與CD3結合之Fab分子或與CD19結合之Fab分子的CH1和CL域中特定之胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸，如本文中進一步所述。在包含在(多特異性)抗體中的習用Fab分子(諸如例如圖1的A至C、G至J中所示的)中或在包含在(多特異性)抗體中的VH/VL交換型Fab分子(諸如例如圖1的D至F、K至N中所示的)中(但不是兩者兼有)進行電荷修飾。在較佳方面，在包含在(多特異性)抗體中的習用Fab分子中進行電荷修飾(在較佳方面，其與CD19結合)。
在根據本發明的一較佳方面，(多特異性)抗體能夠同時結合至CD3及CD19。在一個方面，(多特異性)抗體能夠透過同時結合至CD3及CD19而交聯T細胞及標靶細胞。在一更佳方面，此類同時結合使得標靶細胞、特定而言表現CD19之標靶細胞例如B細胞溶解。在一個態樣中，此等同時結合導致T細胞活化。在其他態樣中，此等同時結合導致T淋巴細胞、特定而言細胞毒性T淋巴細胞之細胞回應，該細胞回應選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物之表現。在一個
方面，(多特異性)抗體與CD3結合而不同時結合至CD19不會導致T細胞活化。
在一個態樣中，(多特異性)抗體能夠將T細胞之細胞毒性活性重定向至標靶細胞。在一較佳態樣中，所述重定向不依賴於標靶細胞之MHC介導的肽抗原呈遞及/或T細胞之特異性。
較佳地，根據本發明之任何態樣的T細胞為細胞毒性T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4+或CD8+ T細胞，特定而言CD8+ T細胞。
a)第一抗原結合域
本發明之(多特異性)抗體包含與CD3結合之至少一個抗原結合域(第一抗原結合域)。在較佳方面，CD3為人CD3(SEQ ID NO：45)或食蟹獼猴CD3(SEQ ID NO：46)，最特定而言為人CD3。在一個方面，第一抗原結合域對人及食蟹獼猴CD3具有交叉反應(即與之特異性結合)。在一些態樣中，CD3為CD3之ε次單元(CD3 ε)。
在一較佳方面，(多特異性)抗體包含多於一個與CD3結合之抗原結合域。在一個方面，(多特異性)抗體提供與CD3之單價結合。
在一個方面，與CD3結合之抗原結合域為選自下組之抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2分子。在一較佳方面，與CD3結合之抗原結合域為Fab分子。
在較佳方面，與CD3結合之抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/替換的Fab分子。在此等方面，與CD19結合之抗原結合域較佳為習用Fab分子。在其中存在多於一個與(多特異性)抗體中包含之CD19結合之抗原
結合域、特定而言Fab分子之方面，與CD3結合之抗原結合域較佳為交換型Fab分子，且與CD19結合之抗原結合域為習用Fab分子。
在替代方面，與CD3結合之抗原結合域較佳為習用Fab分子。在此等方面，與CD19結合之抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/替換的Fab分子。在其中存在多於一個與(多特異性)抗體中包含之CD3結合之抗原結合域，特定而言Fab分子之方面，與CD19結合之抗原結合域較佳為交換型Fab分子，且與CD3結合之抗原結合域為習用Fab分子。
在較佳方面，第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1，特定而言可變域VL及VH彼此替換(即根據此類方面，第一抗原結合域為交換型Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域或恆定域發生交換)。在一個此類態樣中，第二抗原結合域(及第三抗原結合域，如果有的話)為習用Fab分子。
在一個方面，(多特異性)抗體中存在不超過一個與CD3結合之抗原結合域(即抗體提供與CD3之單價結合)。
b)第二抗原結合域(及第三抗原結合域)
本發明之(多特異性)抗體包含與CD19結合之至少一個抗原結合域(第二抗原結合域及視情況的第三抗原結合域)，特定而言為Fab分子。第二抗原結合域能夠將(多特異性)抗體導向標靶位點，例如導向表現CD19的特定類型之細胞。
在一個方面，與CD19結合之抗原結合域為選自下組之抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2分子。在一較佳方面，與CD19結合之抗原結合域為Fab分子。
在某些方面，(多特異性)抗體包含兩個與CD19結合之抗原結合域，特定而言Fab分子。在一較佳方面，所有這些抗原結合域都是相同的，即它們具有相同的分子形式(例如習用或交換型Fab分子)，並且包含相同的胺基酸序列，其包含與本文中所述相同的在CH1及CL域中之胺基酸取代(如果有的話)。在一個方面，(多特異性)抗體包含不超過兩個與CD19結合之抗原結合域，特定而言Fab分子。
在較佳方面，與CD19結合之抗原結合域為習用Fab分子。在此等方面，與CD3結合之抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/替換的Fab分子。
在替代方面，與CD19結合之抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/替換的Fab分子。在此等方面，與CD3結合之抗原結合域為習用Fab分子。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含人恆定區。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)為Fab分子，該Fab分子包含人恆定區，特定而言人CH1及/或CL域。人恆定域的示例性序列在SEQ ID NO 52和53(分別為人κ和λ CL域)以及SEQ ID NO：54(人IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一個方面，第二抗原
結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53之胺基酸序列，特定而言SEQ ID NO：52之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。特定而言，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變，及/或可在交換型Fab分子中包含一個或多個(特別是兩個)N端胺基酸之缺失或取代。在一些方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含在SEQ ID NO：54之胺基酸序列中的CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。特定而言，重鏈恆定區(具體而言CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所述之胺基酸突變。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：15之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：16之HCDR 2及SEQ ID NO：17之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：19之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：20之LCDR 2及SEQ ID NO：21之LCDR 3。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)為(來源於)人源化抗體。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)為人源化抗原結合域(即人源化抗體之抗原結合域)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH及/或VL為人源化可變區。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH及/或VL包含受體人骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之一個或多個重鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VH序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與CD19結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：18的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之一個或多個輕鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少約95%相同之胺基
酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VL序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與CD19結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：22的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列，且第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH域包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列且第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL域包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：VH，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，及VL，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含SEQ ID NO：18之VH序列及SEQ ID NO：22之VL序列。
在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：VH，其包含SEQ ID NO：18之VH之重鏈CDR序列，及VL，其包含SEQ ID NO：22之VL之輕鏈CDR序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含SEQ ID NO：18之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO：22之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：18之VH之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：18之VH之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：18之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：18之VH之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：22之VL之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：22之VL之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：22之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：22之VL之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：28之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：29之HCDR 2及SEQ ID NO：30之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：32之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：33之LCDR 2及SEQ ID NO：34之LCDR 3。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)為(來源於)人源化抗體。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)為人源化抗原結合域(即人源化抗體之抗原結合域)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH及/或VL為人源化可變區。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH及/或VL包含受體人骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共通骨架。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：31之一個或多個重鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VH序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與
CD19結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：31的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之一個或多個輕鏈骨架序列(即FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約95%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約98%相同之胺基酸序列。在某些方面，具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性之VL序列包含相對於參比序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含該序列的抗體保留與CD19結合之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO：35的胺基酸序列中，共有1至10個胺基酸被取代、***及/或缺失。在某些方面，取代、***或缺失發生在CDR以外的區域(即，在FR中)。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。視情況，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，其包含該序列之轉譯後修飾。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列，且第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH域包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列且第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL域包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：VH，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，及VL，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含SEQ ID NO：31之VH序列及SEQ ID NO：35之VL序列。
在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含：VH，其包含SEQ ID NO：31之VH之重鏈CDR序列，及VL，其包含SEQ ID NO：35之VL之輕鏈CDR序列。
在又一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)包含SEQ ID NO：31之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO：35之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：31之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：31之VH之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ
ID NO：31之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：31之VH之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VH包含SEQ ID NO：31之VH之重鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：31之VH之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：35之VL之骨架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的骨架。在一個方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：35之VL之骨架序列具有至少95%序列同一性的骨架。在另一方面，第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之VL包含SEQ ID NO：35之VL之輕鏈CDR序列，及與SEQ ID NO：35之VL之骨架序列具有至少98%序列同一性的骨架。
c)電荷修飾
本發明之(多特異性)抗體可在其中所包含之Fab分子中包含胺基酸取代，其特別有效地減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配(Bence-Jones型副產物)，該錯配可能發生在基於Fab之多特異性抗體的產生中，其中在其結合臂之一個(或多個，如果分子包含兩個以上之抗原結合Fab分子)中發生VH/VL交換(另見PCT公開號WO 2015/150447，特定而言其中的實例，其全部內容以引用方式併入本文)。所需的(多特異性)抗體與不希望的副產物，特定而言在其結合臂之一中具有VH/VL域交換之多特異性抗體中發生的Bence Jones型副產物之比率可透過在CH1和CL域中之特定胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸來改善(有時在本文中稱為「電荷修飾」)。
因此，在一些方面，其中，(多特異性)抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)均為Fab分子，且在抗原結合域之一(特定而言第一抗原結合域)中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，i)在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸被帶正電荷之胺基酸(根據Kabat編號)取代，且其中在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸被帶負電荷之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)取代；或ii)在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被帶正電荷之胺基酸(根據Kabat編號)取代，且其中在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸被帶負電荷之胺基酸(根據Kabat EU索引編號)取代。
(多特異性)抗體不包含i)及ii)下所提及的修飾。具有VH/VL交換之抗原結合域之恆定域CL和CH1未彼此替換(即保留未交換狀態)。
在一個更具體之態樣中，i)在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代；或ii)在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第一抗
原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一個此類態樣中，在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在又一方面，在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一較佳方面，在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一更佳方面，在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗
原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一個甚至更佳方面，在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被精胺酸(R)(根據Kabat編號)取代，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在較佳方面，如果根據上述方面之胺基酸取代發生在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL及恆定域CH1中，則第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL為κ同型。
可替代地，根據上述方面之胺基酸取代可發生在第一抗原結合域之恆定域CL及恆定域CH1中，而不是第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL及恆定域CH1中。在較佳的此等方面，第一抗原結合域之恆定域CL為κ同型。
因此，在一個方面，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸或位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在又一方面，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，
並且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在又一方面，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，並且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一個方面，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，並且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在另一方面，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被精胺酸(R)(根據Kabat編號)取代，並且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代。
在一較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含(a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區
(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；及(b)與CD19結合之第二抗原結合域及視情況之第三抗原結合域；其中在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代(在一較佳方面，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代(在一較佳方面，被離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，並且在第二抗原結合域(及在存在時之第三抗原結合域)之恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
d)多特異性抗體形式
根據本發明之(多特異性)抗體可具有各種構型。例示性構型如圖1所示。
在較佳態樣中，包含在(多特異性)抗體中的抗原結合域為Fab分子。在此等態樣中，第一抗原結合域、第二抗原結合域、第三抗原結合域等在本文中可分別稱為第一Fab分子、第二Fab分子、第三Fab分子等。
在一個態樣中，(多特異性)抗體之第一抗原結合域與第二抗原結合域彼此融合，視情況經由肽連接子彼此融合。在較佳態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子。在一個此類態樣中，第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。在另一此類態樣
中，第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。另外，在其中，(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域的Fab重鏈之N端融合，或(ii)第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端融合的態樣中，第一抗原結合域的Fab輕鏈與第二抗原結合域的Fab輕鏈可彼此融合，視情況可經由肽連接子融合。
可使用能夠與第二抗原例如標靶細胞抗原(諸如CD19)特異性結合之具有單個抗原結合域(諸如Fab分子)的(多特異性)抗體(例如，如圖1的A、D、G、H、K、L所示)，特定而言在高親和力抗原結合域結合後預期第二抗原發生內在化的情況下。在此等情況下，對第二抗原具有特異性之多於一個抗原結合域的存在可能會增強第二抗原的內在化，從而降低其可用性。
然而，在其他情況下，具有包含兩個或更多個對第二抗原具有特異性之抗原結合域(諸如Fab分子)之(多特異性)抗體例如標靶細胞(諸如CD19)(如圖1B、圖1C、圖1E、圖1F、圖1I、圖1.J、圖1M或圖1N所示之實例)將是有利的，例如有利於優化對標靶位點的靶向或使標靶細胞抗原交聯。
因此，在較佳態樣中，根據本發明之(多特異性)抗體包含第三抗原結合域。
在一個方面，第三抗原結合域與CD19結合。在一個態樣中，第三抗原結合域為Fab分子。
在一個方面，第三抗原域與第二抗原結合域相同。
在一些方面，第三抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，並且第三抗原結合域與第二抗原結合域相同。因此，在這些方面，第二抗
原結合域及第三抗原結合域包含相同的重鏈及輕鏈胺基酸序列，並且具有相同排列的域(即習用或交換型)。此外，在這些方面，第三抗原結合域包含與第二抗原結合域相同之胺基酸取代(如果有的話)。例如，本文描述為「電荷修飾」之胺基酸取代將在第二抗原結合域及第三抗原結合域中的每個的恆定域CL及恆定域CH1中進行。可替代地，該等胺基酸取代可在第一抗原結合域(其在較佳方面亦為Fab分子)之恆定域CL及恆定域CH1中進行，但是不在第二抗原結合域和第三抗原結合域之恆定域CL及恆定域CH1中進行。
與第二抗原結合域類似，第三抗原結合域較佳為習用Fab分子。但是，亦可以設想其中，第二抗原結合域及第三抗原結合域為交換型Fab分子(且第一抗原結合域為習用Fab分子)的方面。因此，在較佳方面，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為習用Fab分子，並且第一抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/替換的Fab分子。在其他方面，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為交換型Fab分子，並且第一抗原結合域為習用Fab分子。
如果存在第三抗原結合域，在一較佳方面，第一抗原域與CD3結合，且第二抗原結合域及第三抗原結合域與CD19結合。
在較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域，該Fc域由第一次單元及第二次單元構成。Fc域之第一次單元及第二次單元能夠穩定締合。
根據本發明之(多特異性)抗體可具有不同的構型，即第一抗原結合域、第二抗原結合域(及視情況存在之第三抗原結合域)可彼此融合並以不同方式與Fc域融合。這些成分可直接彼此融合或優選地通過一個或多個合適
的肽連接子融合。在Fab分子與Fc域的次單元之N端融合的情況下，其通常透過免疫球蛋白鉸鏈區融合。
在一些態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，並且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合。在此等方面，第二抗原結合域可在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端或與Fc域的次單元中另一個之N端融合。在較佳的此等方面，第二抗原結合域為習用Fab分子，並且第一抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中，Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/替換的Fab分子。在其他此等方面，第二抗原結合域為交換型Fab分子，並且第一抗原結合域為習用Fab分子。
在一個態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合，並且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。在一具體態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子及第二Fab分子組成，Fc域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第一Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合。圖1G及圖1K中示意性地描繪了此類構型(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子)。另外，視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可彼此融合。
在另一態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，並且第一抗原結合域及第二抗原結合域各自在Fab重鏈之C端與Fc域
的次單元中之一個的N端融合。在一具體態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子及第二Fab分子組成，該Fc域由第一次單元及第二次單元以及視情況由一個或多個肽連接子構成，其中，第一Fab分子及第二Fab分子各自在Fab重鏈之C端與Fc域的次單元中之一個的N端融合。圖1A及圖1D中示意性地描繪了此類構型(在此等實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子並且第二抗原結合域為習用Fab分子)。第一Fab分子及第二Fab分子可直接或透過肽連接子與Fc域融合。在一較佳態樣中，第一Fab分子及第二Fab分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一具體態樣中，免疫球蛋白鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區，特定而言，其中Fc域為IgG1 Fc域。
在一些態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，並且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合。在此等方面，第一抗原結合域可在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端或(如上文所述)Fc域的次單元中另一個之N端融合。在較佳的此等方面，該第二抗原結合域為習用Fab分子，並且第一抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中，Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/替換的Fab分子。在其他此等方面，該第二抗原結合域為交換型Fab分子，並且第一抗原結合域為習用Fab分子。
在一個態樣中，第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為Fab分子，第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合，並且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。在一具體態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子及第二Fab分子組成，Fc域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或
多個肽連接子構成，其中，第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第二Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合。圖1H及圖1L中示意性地描繪了此類構型(在此等實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子並且第二抗原結合域為習用Fab分子)。另外，視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可彼此融合。
在一些態樣中，第三抗原結合域，特定而言第三Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元或第二次單元之N端融合。在較佳的此等方面，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為習用Fab分子，並且第一抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/替換的Fab分子。在其他此等方面，該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為交換型Fab分子，並且第一抗原結合域為習用Fab分子。
在一較佳的此類方面，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自在Fab重鏈之C端與Fc域的次單元中之一個的N端融合，並且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一Fab分子的Fab重鏈之N端融合。在一個具體態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子、第二Fab分子及第三Fab分子組成，該Fc域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第一Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元之N端融合，且其中，第三Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第二次單元之N端融合。圖1B及圖1E(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分
子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用Fab分子)以及圖1J及圖1N(在這些實例中，第一抗原結合域為習用Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子)中示意性描繪了此類構型。第一Fab分子及第三Fab分子可直接或透過肽連接子與Fc域融合。在一較佳態樣中，第一Fab分子及第三Fab分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一具體態樣中，免疫球蛋白鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區，特定而言，其中Fc域為IgG1 Fc域。另外，視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可彼此融合。
在另一此類方面，第二抗原結合域及第三抗原結合域各自在Fab重鏈之C端與Fc域的次單元中之一個的N端融合，並且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。在一個具體態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子、第二Fab分子及第三Fab分子組成，該Fc域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中，第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第二Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第一次單元之N端融合，且其中，第三Fab分子在Fab重鏈之C端與Fc域的第二次單元之N端融合。圖1C及圖1F(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用Fab分子)以及圖1I及圖1M(在這些實例中，第一抗原結合域為習用Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子)中示意性描繪了此類構型。第二Fab分子及第三Fab分子可直接或透過肽連接子與Fc域融合。在一較佳方面，第二Fab分子及第三Fab分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一
具體態樣中，免疫球蛋白鉸鏈區為人IgG1鉸鏈區，特定而言，其中Fc域為IgG1 Fc域。另外，視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可彼此融合。
在其中，Fab分子在Fab重鏈之C端透過免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域的次單元中的每個之N端融合的(多特異性)抗體之構型中，兩個Fab分子、鉸鏈區和Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一較佳方面，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個甚至更佳的方面，免疫球蛋白為IgG1亞型免疫球蛋白。在另一方面，免疫球蛋白為IgG4亞型免疫球蛋白。在又一較佳方面，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其他方面，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個態樣中，免疫球蛋白包含人恆定區，特定而言人Fc區。
在本發明之一些(多特異性)抗體中，第一Fab分子之Fab輕鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合，視情況經由肽連接子融合。根據第一Fab分子及第二Fab分子的構型不同，第一Fab分子之Fab輕鏈可在其C端與第二Fab分子之Fab輕鏈之N端融合，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C端與第一Fab分子之Fab輕鏈之N端融合。第一Fab分子與第二Fab分子之Fab輕鏈的融合進一步減少了Fab重鏈與輕鏈之錯配，並且還減少了表現本發明的一些(多特異性)抗體所需的質體數量。
抗原結合域可直接與Fc域融合或彼此融合，或者透過肽連接子與Fc融合或彼此融合，該肽連接子包含一個或多個胺基酸，通常約2-20個胺基酸。肽連接子為本領域中所公知的並且如本文所述。合適的非免疫性肽連接子包含例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或(G4S)nG5肽連接子。「N」通
常為1至10的整數，特別為2至4。在一個方面，該肽連接子的長度為至少5個胺基酸；在一個方面，長度為5至100個胺基酸；在又一方面，長度為10至50個胺基酸。在一個方面，該肽連接子為(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，並且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=1、2、3、4或5，且m=0、1、2、3、4或5)，在一個方面，x=4且n=2或3，在又一方面，x=4且n=2，在再一方面，x=4，n=1且m=5。在一個方面，該肽連接子為(G4S)2。在另一方面，該肽連接子為G4SG5。一種用於使第一Fab分子及第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合的特別合適的肽連接子為(G4S)2。一種適用於連接第一Fab片段及第二Fab片段之Fab重鏈的示例性肽連接子包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 48及49)。另一個特別合適的此類連接子包含序列(D)-G4SG5(SEQ ID NO 50及51)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(的一部分)。特定而言，在其中Fab分子與Fc域次單元之N端融合的情況下，可透過包含附加的肽連接子或不含另外的胜肽連接子的免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含：多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，並且與第二Fab分子之Fab輕鏈多
肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在某些態樣中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含：多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在某些態樣中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些方面，(多特異性)抗體包含多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特異性)抗體包含多肽，其中，第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在這些方面的一些中，(多特異性)抗體進一步包含：第一Fab分子之交換型Fab輕鏈多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一
Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在這些方面的另一些中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2))；或多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈多肽與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))(在適當情況下)。根據這些態樣之(多特異性)抗體可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中，第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，且與第三Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(3)-CL(3))。在某些態樣中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些方面，(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他方面，(多特異性)抗體包含多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))。在這些方面的一些中，(多特異性)抗體進一步包含：第一Fab分
子之交換型Fab輕鏈多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在這些方面的另一些中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2))；或多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈多肽與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))(在適當情況下)。根據這些態樣之(多特異性)抗體可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中，第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共享羰基末端肽鍵(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，且與第三Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(3)-CL(3))。在某些態樣中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些態樣中，(多特異性)抗體不包含Fc域。在較佳的此等方面，該第二抗原結合域及(如果存在)第三抗原結合域各自為習用Fab分子，並且第一抗原結合域為本文所述之交換型Fab分子，即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/替換的Fab分子。在其他此等方面，該第二抗原結合域及(如果存在)第三抗原結合域各自為交換型Fab分子，並且第一抗原結合域為習用Fab分子。
在一個此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一抗原結合域及第二抗原結合域組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中第一抗原結合域及第二抗原結合域均為Fab分子，並且第二抗原結合域在Fab重鏈之C
端與第一抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。圖1O及圖1S中示意性描繪了此類構型(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子並且第二抗原結合域為習用Fab分子)。
在另一個此類方面，(多特異性)抗體基本上由第一抗原結合域及第二抗原結合域組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中第一抗原結合域及第二抗原結合域均為Fab分子，並且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域的Fab重鏈之N端融合。圖1P及圖1T中示意性地描繪了此類構型(在此等實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子並且第二抗原結合域為習用Fab分子)。
在一些方面，第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且(多特異性)抗體進一步包含第三抗原結合域，特定而言第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合。在某些此等方面，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子、第二Fab分子及第三Fab分子組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第三Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合。圖1Q及圖1U(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用Fab分子)或圖1X及圖1Z(在這些實例中，第一抗原結合域為習用Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為VH/VL交換型Fab分子)中示意性描繪了此類構型。
在一些方面，第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且(多特異性)抗體進一步包含第三抗原結合域，特
定而言第三Fab分子，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之N端與第二Fab分子的Fab重鏈之C端融合。在某些此等方面，(多特異性)抗體基本上由第一Fab分子、第二Fab分子及第三Fab分子組成，並且視情況包含一個或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子的Fab重鏈之N端融合，並且第三Fab分子在Fab重鏈之N端與第二Fab分子的Fab重鏈之C端融合。圖1R及圖1V(在這些實例中，第一抗原結合域為VH/VL交換型Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域為習用Fab分子)或圖1W和圖1Y(在這些實例中，第一抗原結合域為習用Fab分子，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為VH/VL交換型Fab分子)中示意性描繪了此類構型。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，並且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中，重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，
第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，並且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第二Fab分子之Fab輕鏈與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子
之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)(VH(3)-CH1(3)-VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，並且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)(VH(3)-CH1(3)-VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與第三Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3))。在
一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1))，並且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第一Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵，其繼而與第三Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-VH(3)-CH1(3))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CH1(1))，且與第二Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CL(2))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些態樣
中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CL(2))，並且與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含多肽，其中，第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第三Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2))，並且與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含多肽，其中，第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(3)-CH1(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交換型
Fab重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(2)-CL(2))，並且與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含多肽，其中，第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VH(3)-CL(3))。
在某些方面，根據本發明之(多特異性)抗體包含多肽，其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第三Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共享羰基末端肽鍵，其繼而與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(即第二Fab分子包含交換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一Fab分子之Fab重鏈共享羰基末端肽鍵(VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些態樣中，該(多特異性)抗體進一步包含：多肽，其中，第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(2)-CH1(2))，並且與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共享羰基末端肽鍵(VL(1)-CL(1))。在一些態樣中，(多特異性)抗體進一步包含多肽，其中，第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共享羰基末端肽鍵(VL(3)-CH1(3))。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此替
換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為(習用)Fab分子；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中(i)在a)下所述之第一抗原結合域在Fab重鏈的C端與在b)下所述之第二抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合，或(ii)在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在一較佳態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；
b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子；及c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中(i)在a)下所述之第一抗原結合域在Fab重鏈的C端與在b)下所述之第二抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在b)下所述之第二抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合，或(ii)在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在另一態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為(習用)Fab分子；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中
(i)在a)下所述之第一抗原結合域與在b)下所述之第二抗原結合域各自在Fab重鏈之C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在根據本發明之(多特異性)抗體的所有不同構型中，本文所述之胺基酸取代(「電荷修飾」)(如果存在)可在第二抗原結合域及(如果存在)第三抗原結合域/Fab分子的CH1及CL域中，或在第一抗原結合域/Fab分子的CH1及CL域中。較佳地，它們在第二抗原結合域及(如果存在)第三抗原結合域/Fab分子的CH1及CL域中。根據本發明之概念，如果本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合域(及(如果存在)第三抗原結合域)/Fab分子中進行，則第一抗原結合域/Fab分子中不存在此等胺基酸取代。相反，如果本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合域/Fab分子中進行，則第二抗原結合域(及(如果存在)第三抗原結合域)/Fab分子中不存在此等胺基酸取代。胺基酸取代較佳在包含Fab分子的(多特異性)抗體中進行，在該Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈之變異域VL和VH1彼此替換。
在根據本發明之(多特異性)抗體的較佳方面，特定而言其中，如本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合域(及(如果存在)第三抗原結合域)/Fab分子中進行的情況下，第二Fab分子(及(如果存在)第三Fab分子)之恆定域CL為κ同型。在根據本發明之(多特異性)抗體的其他方面，特定而言其中，如本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合域/Fab分子中進行的情況下，第一抗原結合域/Fab分子之恆定域CL為κ同型。在一些方面，第二抗原結合域(及(如果存在)第三抗原結合域)/Fab分子之恆定域CL及第一抗原結合域/Fab分子之恆定域CL為κ同型。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為(習用)Fab分子；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在b)下所述之第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；且其中(i)在a)下所述之第一抗原結合域在Fab重鏈的C端與在b)下所述之第二抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合，或(ii)在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一
抗原結合域在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在一較佳態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子；及c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在b)下所述之第二抗原結合域及b)下所述之第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域及b)下所述之第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；且其中(i)在a)下所述之第一抗原結合域在Fab重鏈的C端與在b)下所述之第二抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在b)下所述之第二抗
原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合，或(ii)在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在另一態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域，其中，該第二抗原結合域為(習用)Fab分子；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在b)下所述之第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；且
其中，在a)下所述之第一抗原結合域與在b)下所述之第二抗原結合域各自在Fab重鏈之C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
根據上述任一態樣，(多特異性)抗體的組分(例如Fab分子、Fc域)可直接融合或透過各種連接子融合，特定而言透過本文所述或本領域中所公知的包含一個或多個胺基酸(通常約2-20個胺基酸)的肽連接子進行融合。合適的非免疫性肽連接子包含例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或(G4S)nG5肽連接子，其中n通常為1至10的整數，特別為2至4。
在一較佳態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)結合CD3之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子，且包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：15之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：16之HCDR 2及SEQ ID NO：17之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：19之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：20之LCDR 2及SEQ ID NO：21之LCDR 3；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中
在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；並且其中另外在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在又一較佳態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，並且該第一抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11之的胺基酸序列；b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子，且包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中
在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；並且其中另外在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在又一較佳態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)結合CD3之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，且第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：2之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：3之HCDR 2及SEQ ID NO：5之HCDR 3，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：8之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：9之LCDR 2及SEQ ID NO：10之LCDR 3；b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子，且包含：重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：28之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：29之HCDR 2及SEQ ID NO：30之HCDR 3；及輕鏈可變區(VL)，其包含
SEQ ID NO：32之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：33之LCDR 2及SEQ ID NO：34之LCDR 3；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；並且其中另外在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在再一較佳方面，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，並且該第一抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11之的胺基酸序列；b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為(習用)Fab分子，且包含：重鏈可變區，
其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列；c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)(最佳地被精胺酸(R))取代，並且其中在b)下所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代；並且其中另外在b)下所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在a)下所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在a)下所述之第一抗原結合域及在b)下所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在c)下所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
在根據本發明這些態樣的一個態樣中，在Fc域之第一次單元中，位置366的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基替換(T366W)，並且在Fc域之第二次單元中，位置407的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基替換(Y407V)，並且視情況，位置366的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基替換(T366S)，並且位置368的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明這些態樣的另一態樣中，在Fc域之第一次單元中，位置354的絲胺酸殘基又被半胱胺酸殘基替換(S354C)或位置356的麩胺
酸殘基被半胱胺酸殘基替換(E356C)(特定而言位置354的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換)，並且在Fc域之第二次單元中，位置349的另外酪胺酸殘基又被半胱胺酸殘基替換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明這些態樣的又一態樣中，在Fc域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置234的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L234A)，位置235的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L235A)，並且位置329的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基替換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明這些態樣的又一態樣中，Fc域為人IgG1 Fc域。
在一較佳的具體方面，(多特異性)抗體包含：包含與SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：39(特定而言SEQ ID NO：39)之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：24之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：25之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含與SEQ ID NO：27之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在又一具體方面，(多特異性)抗體包含：多肽，包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：39(特定而言SEQ ID NO：39)之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之多肽。
在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之(多特異性)抗體，其包含：包含與SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：39(特定而言SEQ ID NO：39)之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多
肽；包含與SEQ ID NO：24之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：25之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含與SEQ ID NO：27之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之(多特異性)抗體，其包含：包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：39(特定而言SEQ ID NO：39)之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之多肽。
在一較佳的具體方面，(多特異性)抗體包含：包含與SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：40(特定而言SEQ ID NO：36)之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：37之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：38之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含與SEQ ID NO：27之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在又一個具體方面，(多特異性)抗體包含：包含SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：40(特定而言SEQ ID NO：36)之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之多肽。
在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之(多特異性)抗體，其包含：包含與SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：40(特定而言SEQ ID
NO：36)之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：37之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽；包含與SEQ ID NO：38之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含與SEQ ID NO：27之序列至少95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列之多肽。在一個方面，本發明提供一種與CD3及CD19結合之(多特異性)抗體，其包含：包含SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：40(特定而言SEQ ID NO：36)之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之多肽；包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之多肽(特定而言兩個多肽)；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之多肽。
8.Fc域變體
在較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域，該Fc域由第一次單元及第二次單元構成。
(多特異性)抗體之Fc域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc域為二聚體，其每個次單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含不超過一個Fc域。
在一個態樣中，(多特異性)抗體之Fc域為IgG Fc域。在一較佳態樣中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。在一個更具體之態樣中，Fc域為IgG4 Fc域，其包含在位置S228(根據Kabat EU索引編號)的胺基酸取代，特定而言胺基酸取代S228P。該胺基酸取代減少體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition
38，84-91(2010))。在另一個較佳態樣中，Fc域為人Fc域。在一個甚至更佳的態樣中，Fc域為人IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區的一個示例性序列在SEQ ID No：47中給出。
a)促進異源二聚化的Fc域修飾
根據本發明之(多特異性)抗體包含不同的抗原結合域，其可與Fc域之兩個次單元中的一個或另一個融合，因此Fc域之兩個次單元通常包含在兩個不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組產生中(多特異性)抗體之產率和純度，在(多特異性)抗體之Fc域中引入促進所需之多肽締合之修飾將為有利的。
因此，在較佳態樣中，根據本發明之(多特異性)抗體的Fc域包含促進Fc域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾。人類IgG Fc域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在Fc域之CH3結構域中。因此，在一個態樣中，所述修飾在Fc域之CH3域中進行。
存在多種對Fc域之CH3結構域進行修飾以便增強異源二聚化之方法，這些方法很好地描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此等方法中，Fc域之第一次單元的CH3域及Fc域之第二次單元的CH3域均以互補的方式進行工程改造，以使每個CH3域(或包含CH3域的重鏈)不再能夠與自身發生同源二聚化，而是被迫與經互補工程改造之其他CH3域進行異源二聚化(使得第一CH3域及第二CH3域異源二聚化，並且在兩個第一CH3域或兩個第二CH3域之間不形成同
源二聚體)。這些用於改善重鏈異源二聚化之不同方法被視為與(多特異性)抗體中重鏈-輕鏈修飾(例如，一個結合臂中之VH和VL交換/替換，以及在CH1/CL界面中引入帶有相反電荷的胺基酸的取代基)結合之不同選擇，其減少了重鏈/輕鏈錯配及Bence Jones型副產物。
在一個具體態樣中，所述促進Fc域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾為所謂的「杵臼(knob-into-hole)」修飾，其包括在Fc域之兩個次單元中的一個的「杵」修飾及Fc域之兩個次單元中的另一個的「臼」修飾。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)；及Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起(「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔(「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，在一較佳態樣中，在(多特異性)抗體之Fc域的第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基替換，從而在第一次單元之CH3域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之CH3域內的空腔中，並且在Fc域的第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基替換，從而在第二次單元之CH3域內產生空腔，第二次單元之CH3域內的突起為可定位在該空腔內。
較佳地，該具有較大側鏈體積的胺基酸殘基選自精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)和色胺酸(W)所組成之群組。
較佳地，該具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)和纈胺酸(V)所組成之群組。
可透過改變編碼多肽的核酸(例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成)來製備突起和空腔。
在一個具體態樣中，在Fc域之第一次單元(「杵」次單元)(之CH3域)中，位置366的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基替換(T366W)，並且在Fc域之第二次單元(「臼」次單元)(之CH3域)中，位置407的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基替換(Y407V)。在一個態樣中，在Fc域之第二次單元中，位置366的另外蘇胺酸殘基又被絲胺酸殘基替換(T366S)，並且位置368的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在又一態樣中，在Fc域之第一次單元中，位置354的絲胺酸殘基又被半胱胺酸殘基替換(S354C)或位置356的麩胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(E356C)(特定而言位置354的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換)，並且在Fc域之第二次單元中，位置349的另外酪胺酸殘基又被半胱胺酸殘基替換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入這兩個半胱胺酸殘基導致在Fc域之兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體(Carter，J Immunol Methods 248，7-15(2001))。
在一較佳態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C和T366W，並且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
在一較佳方面，與CD3結合之抗原結合域與Fc域之第一次單元(包含「杵」修飾)融合(視情況，經由與CD19結合之第二抗原結合域融合，及/或經由肽連接子融合)。不希望被理論束縛，與CD3結合之抗原結合域與Fc域之含杵次單元的融合將(進一步)最大限度減少包含兩個與CD3結合之抗原結合域之抗體的產生(兩個含杵多肽之空間碰撞)。
可以設想將用於強制異源二聚化的CH3修飾的其他技術作為本發明之替代方案，並且這些技術描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個態樣中，可替代地使用EP 1870459中所述之異源二聚化方法。該方法基於在Fc域之兩個次單元之間的CH3/CH3結構域界面的特定胺基酸位置引入帶有相反電荷的胺基酸。本發明之(多特異性)抗體的一個特定態樣為(Fc域之)兩個CH3域之一中的胺基酸突變R409D和K370E；及Fc域的CH3域之另一個中的胺基酸突變D399K和E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域之第一次單元的CH3域中的胺基酸突變T366W和Fc域之第二次單元的CH3域中的胺基酸突變T366S、L368A、Y407V，以及Fc域之第一次單元的CH3域中的另外胺基酸突變R409D、K370E和Fc域之第二次單元的CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域之第一次單元的CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W和Fc域之第二次單元的CH3
域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述(多特異性)抗體包含Fc域之第一次單元的CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W和Fc域之第二次單元的CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，以及Fc域之第一次單元的CH3域中的另外胺基酸突變R409D、K370E和Fc域之第二次單元的CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(全部根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，可替代地使用WO 2013/157953中所述之異源二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K，並且第二CH3域包含胺基酸突變L351D(根據Kabat EU索引編號)。在另一個態樣中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一個態樣中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D和L368E(特定而言L368E)(根據Kabat EU索引編號)的胺基酸突變。
在一個態樣中，可替代地使用WO 2012/058768中所述之異源二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，並且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個態樣中，第二CH3域進一步包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392的胺基酸突變，所述位置選自例如：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b)D399R、D399W、D399Y或D399K；c)S400E、S400D、S400R或S400K；d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e)N390R、N390K或N390D；f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，並且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一個
態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A，並且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個態樣中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R和S400R(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，可替代地使用WO 2011/143545中所述之異源二聚化方法，例如，在選自368和409(根據Kabat EU索引編號)所組成之群組的位置處進行胺基酸修飾。
在一個態樣中，可替代地使用WO 2011/090762中所述之異源二聚化方法，該方法同樣使用上述之「杵臼」技術。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W，並且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y，並且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，(多特異性)抗體或其Fc域屬於IgG2亞類，並且另選地使用WO 2010/129304中所述之異源二聚化方法。
在一替代態樣中，促進Fc域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如PCT公開WO 2009/089004中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個Fc域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。在一個此類態樣中，第一CH3域包含帶負電荷之胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，特定而言K392D或N392D)對K392和N392之胺基酸取代，並且第二CH3域包含帶正電荷之胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，特定而言D399K、E356K、D356K或E357K且更特定而言D399K和E356K)對D399、E356、D356或E357之胺基酸取代。在另一個態樣中，第一
CH3域進一步包含帶負電荷之胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，特定而言K409D或R409D)對K409或R409之胺基酸取代。在另一個態樣中，第一CH3域進一步或可替代地包含帶負電荷之胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370之胺基酸取代(全部根據Kabat EU索引編號)。
在又一態樣中，可替代地使用WO 2007/147901中所述之異源二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K和K322D，並且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K和K292D(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個態樣中，可替代地使用WO 2007/110205中所述之異源二聚化方法。
在一個態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代K392D和K409D，並且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代D356K和D399K(根據Kabat EU索引編號)。
b)減少Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾
Fc域賦予(多特異性)抗體有利的藥代動力學特性，包括較長之血清半衰期，其有助於在標靶組織中獲得良好的累積比和有利的組織-血液分配比。但是，與此同時，這可能導致不希望地將(多特異性)抗體靶向表現Fc受體之細胞，而不是靶向較佳的攜帶抗原的細胞。此外，Fc受體信號傳導途徑的共激活可能導致細胞因子釋放，這在與T細胞活化特性和(多特異性)抗體的長半衰期相結合的情況下，導致在全身投予後細胞激素受體的過度活化和嚴重的副作用。由於T細胞的潛在破壞(例如透過NK細胞)，因此除T細胞外的(攜帶Fc受體的)免疫細胞的活化甚至可能降低(多特異性)抗體的功效。
因此，在較佳態樣中，與天然IgG1 Fc域相比，根據本發明的(多特異性)抗體之Fc域表現出對Fc受體的降低的結合親和力及/或降低的效應功能。在一個此類態樣中，該Fc域(或包含所述Fc域的(多特異性)抗體)與天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的(多特異性)抗體)相比，表現出小於50%，特定而言小於20%，更特定而言小於10%且最特定而言小於5%的對Fc受體的結合親和力，及/或與天然IgG1 Fc域域(或包含天然IgG1 Fc域的(多特異性)抗體)相比，表現出小於50%，特定而言小於20%，更特定而言小於10%且最特定而言小於5%的效應功能。在一個態樣中，Fc域域(或包含所述Fc域的(多特異性)抗體)基本上不與Fc受體結合及/或誘導效應功能。在一較佳態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一個具體態樣中，Fc受體為活化人Fcγ受體，更具體而言人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言FcγRIIIa。在一個態樣中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP和細胞激素分泌之群組中的一種或多種。在一較佳態樣中，效應功能為ADCC。在一個態樣中，與天然IgG1 Fc域域相比，Fc域域對新生Fc受體(FcRn)表現出基本類似的結合親和力。當Fc域(或包含所述Fc域的(多特異性)抗體)表現出大於約70%、特定而言大於約80%、更特定而言大於約90%的天然IgG1 Fc域(或包含IgG1 Fc域的(多特異性)抗體)對FcRn的結合親和力時，實現了與FcRn的基本上類似的結合。
在某些態樣中，與非工程改造的Fc域相比，工程改造的Fc域對Fc受體具有降低的結合親和力及/或降低的效應功能。在較佳態樣中，(多特異性)抗體之Fc域包含一種或多種胺基酸突變，其降低Fc域對Fc受體的結合
親和力及/或效應功能。通常，在Fc域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。在一個態樣中，胺基酸突變降低了Fc域與Fc受體的結合親和力。在一個態樣中，胺基酸突變將Fc域與Fc受體的結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在多於一種降低胺基酸對Fc受體的結合親和力的胺基酸突變的態樣中，這些胺基酸突變的組合可使Fc域對Fc受體的結合親和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個態樣中，與包含非工程改造的Fc域之(多特異性)抗體相比，包含工程改造的Fc域之(多特異性)抗體表現出小於20%、特定而言小於10%、更特定而言小於5%的與Fc受體的結合親和力。在一較佳態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一些態樣中，Fc受體為人Fc受體。在一些態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一個具體態樣中，Fc受體為活化人Fcγ受體，更具體而言人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言人FcγRIIIa。較佳地，減少與這些受體中的每個之結合。在一些態樣中，也降低了與補體組分的結合親和力，具體而言與C1q的結合親和力。在一個態樣中，不降低與新生Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含所述Fc域的(多特異性)抗體)表現出大於約70%的非工程改造形式的Fc域(或包含所述非工程改造形式的Fc域的(多特異性)抗體)對FcRn之結合親和力時，實現了與FcRn基本上類似的結合，即Fc域對所述受體的結合親和力得以保持。Fc域或包含所述Fc域的本發明之(多特異性)抗體可表現出大於約80%及甚至大於約90%的此等親和力。在某些態樣中，與非工程改造的Fc域相比，(多特異性)抗體之Fc域經工程改造以具有降低的效應功能。降低的效應功能可包括但不限於以下一種或多種：降低補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性(ADCC)、降低抗體依賴性細胞吞噬作
用(ADCP)、減少細胞激素分泌、減少抗原呈遞細胞的免疫複合體介導的抗原攝取、減少與NK細胞的結合、減少與巨噬細胞的結合、減少與單核細胞的結合、減少與多形核細胞的結合、減少直接信號傳導誘導的細胞凋亡、減少靶標結合抗體的交聯、降低樹突狀細胞成熟度或減少T細胞引發。在一個態樣中，降低的效應功能選自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和減少的細胞激素分泌之群組中的一種或多種。在一較佳態樣中，降低的效應功能為降低的ADCC。在一個態樣中，降低的ADCC小於非工程改造的Fc域(或包含非工程改造的Fc域之(多特異性)抗體)誘導的ADCC的20%。
在一個態樣中，降低Fc域與Fc受體的結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個態樣中，Fc域包含在選自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根據Kabat EU索引編號)的位置的胺基酸取代。在一個更具體之態樣中，Fc域包含在選自L234、L235和P329(根據Kabat EU索引編號)的位置的胺基酸取代。在一些態樣中，Fc域包含L234A和L235A(根據Kabat EU索引編號)的胺基酸取代。在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定而言人IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329的胺基酸取代。在一個更具體之態樣中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定而言P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329的胺基酸取代，以及在選自E233、L234、L235、N297和P331(根據Kabat EU索引編號)的位置的另一個胺基酸取代。在一個更具體之態樣中，該另一個胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在較佳態樣中，Fc域包含在位置P329、L234和L235(根據Kabat EU索引編號)的胺基酸取代。在更佳的態樣中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A和P329G
(「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體而言，在較佳態樣中，Fc域之每個次單元包含胺基酸替換L234A、L235A和P329G(根據Kabat Eu指數編號)，即在Fc域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置234的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L234A)，位置235的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L235A)，並且位置329的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基替換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定而言人IgG1 Fc域。胺基酸取代的「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類IgG1 Fc域的Fcγ受體(以及補體)結合，如PCT公開號WO 2012/130831所述，其全文以引用方式併入本文。WO 2012/130831還描述了用於製備此等突變Fc域的方法及確定其性質(例如Fc受體結合或效應功能)的方法。
IgG4抗體與IgG1抗體相比，表現出與Fc受體的降低的結合親和力和降低的效應功能。因此，在一些態樣中，本發明之(多特異性)抗體的Fc域為IgG4 Fc域，特定而言人IgG4 Fc域。在一個態樣中，IgG4 Fc域包含在位置S228的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代S228P(根據Kabat EU索引編號)。為進一步降低其與Fc受體的結合親和力及/或其效應功能，在一個態樣中，IgG4 Fc域包含在位置L235的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代L235E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個態樣中，IgG4 Fc域包含在位置P329的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一較佳態樣中，IgG4 Fc域包含在位置S228、L235和P329的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代S228P、L235E和P329G(根據Kabat EU索引編號)。此等IgG4 Fc域
突變體及其Fcγ受體結合性質描述於PCT公開號WO 2012/130831中，其全文以引用方式併入本文。
在一較佳態樣中，與天然IgG1 Fc域相比，表現出降低的對Fc受體的結合親和力及/或降低的效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在的P329G的人IgG1 Fc域或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在的P329G(根據Kabat EU索引編號)的人IgG4 Fc域。
在某些態樣中，已消除Fc域的N-醣基化。在一個此類態樣中，Fc域包含在位置N297的胺基酸突變，特定而言天冬醯胺酸被丙胺酸取代(N297A)或被天冬胺酸取代(N297D)之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及PCT公開號WO 2012/130831中所述的Fc域以外，具有降低的Fc受體結合及/或效應功能的Fc域也包括被Fc域殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個取代的那些(美國專利號6,737,056)(根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297和327中的兩個或更多個取代的Fc突變體，包括所謂的「DANA」Fc突變體，其中殘基265和297被丙胺酸所取代(美國專利號7,332,581)。
可使用此領域中所公知遺傳或化學方法，透過胺基酸缺失、取代、***或修飾來製備變異型Fc域。遺傳方法可包括編碼DNA序列的位點特異性突變、PCR、基因合成等。可透過例如測序來驗證核苷酸變化是否正確。
與Fc受體之結合可易於透過ELISA確定，或透過表面電漿子共振(SPR)使用標準儀器例如BIAcore儀器(GE Healthcare)進行確定，並且Fc受體可透過例如重組表現來獲得。可替代地，Fc域或包含Fc域的(多特異性)
抗體對Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(例如表現FcγIIIa受體的人NK細胞)進行評估。
Fc域或包含Fc域的(多特異性)抗體的效應功能可透過此領域中所公知的方法進行測量。用於評估目標分子之ADCC活性的體外測定方法的實例描述於例如：美國專利號5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063(1986)；及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502(1985)；美國專利號5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166，1351-1361(1987)。可替代地，可采用非放射性分析(參見例如：用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定(Promega，Madison，WI))。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。可替代地或另外地，可在例如Clynes等人在Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656(1998)中公開的動物模型中在體內評估目標分子之ADCC活性。
在一些態樣中，減少Fc域與補體組分之結合，具體而言減少與C1q之結合。因此，在一些態樣中，其中，Fc域工程改造為具有降低的效應功能，所述降低的效應功能包括降低的CDC。可實施C1q結合測定以確定Fc域或包含Fc域的(多特異性)抗體能否結合C1q並因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為評估補體活化，可實施CDC測定(參見例如：Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202，163(1996)；Cragg等人，Blood 101，1045-1052(2003)；及Cragg和Glennie，Blood 103，2738-2743(2004))。
FcRn結合和體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行(參見例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
B.多核苷酸
本發明進一步提供一種編碼本發明抗體的經分離之多核苷酸。所述經分離之多核苷酸可以是單個多核苷酸或複數個多核苷酸。
編碼本發明之(多特異性)抗體的多核苷酸可表現為編碼整個抗體的單個多核苷酸或表現為共表現的多個(例如兩個或更多個)多核苷酸。共表現的由多核苷酸編碼的多肽可透過例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗體。例如，抗體的輕鏈部分可以由與包含抗體重鏈的抗體部分分開的多核苷酸進行編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗體。在另一個實例中，包含兩個Fc域次單元之一和視情況存在的一個或多個Fab分子(的一部分)的抗體的部分可由與包含兩個Fc域次單元之另一個和視情況存在的Fab分子(的一部分)的抗體的部分分開的多核苷酸進行編碼。當共表現時，Fc域次單元將締合以形成Fc域。
在一些態樣中，經分離之多核苷酸編碼根據本發明的整個抗體分子，如本文所述。在其他態樣中，經分離之多核苷酸編碼根據本發明之抗體中包含的多肽，如本文所述。
在某些方面，多核苷酸或核酸為DNA。在其他態樣中，本發明之多核苷酸為RNA，例如，呈信使RNA(mRNA)的形式。本發明之RNA可以為單鏈或雙鏈RNA。
C.重組方法
可透過固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組產生獲得本發明之抗體。在重組產生時，將例如如上所述之編碼抗體之一種或多種多核苷酸分離並***一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步克隆及/或表達。此等多核苷酸可易於使用習用方法進行分離和測序。在一個態樣中，提供了一種包含本發明之多核苷酸(即單個多核苷酸或複數個多核苷酸)的載體，特定而言表現載體。可使用本領域的技術人員所公知的方法來構建包含抗體的編碼序列以及適當的轉錄/轉譯控制信號的表現載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術及體內重組/基因重組。參見，例如，在Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y(1989)中所述之技術。表現載體可以為質體、病毒的一部分，也可以為核酸片段。表現載體包括表達盒，其中將編碼抗體(即編碼區)的多核苷酸與啟動子及/或其他轉錄或轉翻控制元件可操縱地締合以進行克隆。如本文所用的「編碼區」，為由翻譯成胺基酸的密碼子組成的核酸的一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)不翻譯成胺基酸，但可以將其視為編碼區的一部分(如果存在)，但是任何側翼序列(例如啟動子、核醣體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’和3’非翻譯區等)不屬於編碼區的一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構建體中，例如，存在於單個載體上，或存在於單獨的多核苷酸構建體中，例如，存在於單獨的(不同的)載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一種或多種多肽，該多肽經由蛋白水解後翻譯或共翻譯分離成最終蛋白。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可
編碼異源編碼區，其與編碼本發明之抗體的多核苷酸或其變體或衍生物融合或不融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或基序(諸如分泌信號胜肽)或異源功能域。可操作的締合是指基因產物的編碼區(例如，多肽)與一個或多個調控序列締合，從而使基因產物的表現處於調控序列的影響或控制之下。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的mRNA轉錄，並且兩個DNA片段之間的連接子性質不干擾表現調控序列指導基因產物表現的能力，也不干擾DNA模板被轉錄的能力，則兩個DNA片段(例如多肽編碼區以及與之相締合的啟動子)「可操縱地締合」。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則該啟動子區將與編碼多肽的核酸可操縱地締合。啟動子可以為細胞特異性啟動子，其僅指導預定細胞中DNA的大量轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、抑制子和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操縱地締合以指導細胞特異性轉錄。本文公開了合適的啟動子及其他轉錄控制區。各種轉錄控制區為本領域的技術人員所公知的。其中包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如但不限於鉅細胞病毒(例如，直接早期啟動子，與內含子A結合)、猿猴病毒40(例如，早期啟動子)和逆轉錄病毒(例如，勞斯肉瘤病毒)。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因的那些，例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔β-珠蛋白以及能夠控制真核細胞中基因表現的其他序列。另外的合適的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子以及誘導型啟動子(例如四環素誘導的啟動子)。類似地，各種翻譯控制元件為本領域的普通技術人員所公知的。其中包括但不限於核醣體結合位點、翻譯起始和終止密碼子以及來源於病毒體系的元件(特定而言內部核醣體進入位點或IRES，也稱為CITE序列)。表現盒還可包含其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件，
例如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或信號肽的另外的編碼區締合，該分泌或信號胜肽指導由本發明之多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗體，則可將編碼信號序列的DNA置於編碼本發明之抗體或其片段的核酸的上游。根據信號假說，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號胜肽或分泌前導序列，其在增長的蛋白質鏈透過粗內質網輸出時從成熟蛋白質上裂解下來。本領域的普通技術人員將認識到，脊椎動物細胞所分泌之多肽通常具有與多肽之N端融合的信號胜肽，其從翻譯後的多肽上裂解下來以產生分泌或「成熟」形式的多肽。在某些態樣中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽或該序列的功能性衍生物，該功能性衍生物保留指導與之可操縱地締合的分泌的能力。可替代地，可使用異源哺乳動物信號胜肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可被人組織胞漿素原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸苷酶的前導序列取代。
編碼可用於促進以後的純化(例如組胺酸標籤)或輔助標記抗體的短蛋白質序列的DNA可包括在編碼多核苷酸的抗體(片段)的內部或末端。
在另一個態樣中，提供了一種包含本發明之多核苷酸(即單個多核苷酸或複數個多核苷酸)的宿主細胞。在某些態樣中，提供了包含本發明之載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別單獨或組合結合本文中相對於多核苷酸和載體所述的任何特徵。在一個此類態樣中，宿主細胞包含一種或多種載體(例如已被其轉化或轉染)，該載體包含一種或多種編碼本發明之抗體(的一部分)的多核苷酸。如本文所用的術語「宿主細胞」，係指可被工程改造以產
生本發明之抗體或其片段的任何類型的細胞體系。適於複製並支持抗體之表現的宿主細胞為此領域中所公知。可在適當情況下用特定的表現載體轉染或轉導此等細胞，並且可生長大量包含載體的細胞以接種大規模發酵劑，獲得足夠量的抗體以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物(例如大腸桿菌)或各種真核細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞等)。例如，多肽可能在細菌中產生，特定而言在無需醣基化的情況下。在表現後，多肽可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。除原核生物以外，真核微生物(如絲狀真菌或酵母菌)也為合適的多肽編碼載體的克隆或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414(2004)；及Li等人，Nat Biotech 24，210-215(2006)。用於表現(醣基化)多肽的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特定而言用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見例如，美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述在基因轉殖植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由SV40(COS-7)轉化的猴腎CV1系；人胚胎腎系(如Graham等人，J Gen Virol 36，59(1977)中所述之293或293T細胞)；幼地鼠腎細胞(BHK)；小鼠睾丸支持細胞(例如Mather，Biol Reprod 23，243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞
(MDCK)；Buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68(1982)所述)；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，例如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。有關某些適用於蛋白質產生的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo主編，Humana Press，Totowa,NJ)，pp.255-268(2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定而言哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎(HEK)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個態樣中，宿主細胞不是人體內的細胞。
標準技術為此領域中所公知，可在這些系統中表現外源基因。可對表現包含抗原結合域(例如抗體)的重鏈或輕鏈的多肽的細胞進行工程改造，使其也表現其他抗體鏈，從而使表現的產物為兼有重鏈和輕鏈的抗體。
在一個方面，提供了一種產生根據本發明之抗體的方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如本文所述之編碼抗體的多核苷酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收該抗體。
本發明之(多特異性)抗體之組分可彼此基因融合。(多特異性)抗體可設計為使其組分直接彼此融合或透過連接子序列間接融合。可根據此領域中所公知的方法確定連接子的組成和長度，並可以對其效力進行測試。本文
提供了介於(多特異性)抗體的不同組分之間的連接子序列之實例。如果需要，還可以包括另外的序列以摻入切割位點，以分離融合體的各種組分，例如內肽酶識別序列。
按照本文所述之方法製備的抗體可透過本領域中已知的技術進行純化，諸如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、粒徑篩析層析法等。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對本領域的技術人員而言為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用抗體、配體、受體或抗原以結合抗體。例如，對於本發明之抗體的親和力層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G的基體。可使用順序Protein A或G親和力層析法和粒徑篩析層析法隔離基本上如實例中所述之抗體。抗體的純度可透過多種熟知的分析方法(包括凝膠電泳法、高壓液相層析法等)中的任一種進行測定。
D.測定
可用此領域中所公知的各種測定法對本文所提供之抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1.結合測定
抗體與Fc受體或標靶抗原之結合(親和力)可例如藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器及受體或標靶蛋白(諸如可透過重組表現得到的那些)進行測定。可替代地，可使用表現特定受體或標靶抗原的細胞株(例如通過流式細胞術(FACS))評估抗體與不同受體或標靶抗原的結合。下面描述了用於測量對CD3之結合活性的具體的說明性及例示性方面。
在一個方面，與CD3之結合活性藉由SPR確定，具體如下：SPR係在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上進行。抗Fab捕獲抗體(GE Healthcare,#28958325)係使用標準胺耦合化學固定在S系列感測器晶片CM5(GE Healthcare)上，表面密度為4000-6000共振單位(RU)。作為運轉及稀釋緩衝液，使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.05%界面活性劑P20)。將濃度為2μg/ml(在20mM His，140mM NaCl，pH 6.0中)之CD3抗體以5μl/min的流速注射約60秒。所用的CD3抗原為融合至具有杵臼修飾及C端Avi-tag的人Fc域之CD3δ與CD3ε胞外域的異二聚體(參見SEQ ID NO 41及42)。CD3抗原以10μg/ml的濃度注射120秒，並以5μl/min的流速監測解離約120秒。晶片表面藉由兩次連續注射10mM甘胺酸pH 2.1進行再生，每次注射約60秒。藉由減去空白注射及減去從空白對照流通池得到的反應來校正整體折射率差異。為了評估，在註射結束後5秒量取結合反應。為了使結合訊號歸一化，將CD3結合除以抗Fab反應(在固定化抗Fab抗體上捕獲CD3抗體後得到的訊號(RU))。特定處理後抗體與CD3之結合活性(相對於不同處理後抗體與CD3之結合活性(亦稱為相對活性濃度(RAC)))係透過參考該特定處理後的抗體樣品之結合活性與該不同處理後的相應抗體樣品之結合活性來計算。
2.活性測定
本發明之(多特異性)抗體的生物活性可藉由如實例中所述的各種測定法來測量。生物活性可例如包括誘導T細胞的增殖、誘導T細胞中的信號傳導、誘導T細胞中活化標志物的表現、誘導T細胞分泌細胞激素、誘導標靶細胞(如B細胞)溶解以及誘導腫瘤消退及/或改善存活。
E.組成、調配物和投予途徑
在又一態樣中，本發明提供了包含本文所提供之任何抗體的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含根據本發明之抗體和醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含根據本發明之抗體及至少一種例如如下文所述的另外的治療劑。
還提供了一種以適合於體內投予的形式產生本發明之抗體的方法，該方法包括(a)獲得根據本發明之抗體，及(b)與至少一種醫藥上可接受之載劑一起配製抗體，從而配製用於體內給藥之抗體的製劑。
本發明之醫藥組成物包含有效量的溶於或分散於醫藥上可接受之載劑中之抗體。短語「醫藥上可接受」係指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組合物，即在投予動物(例如人)時不產生不利的、過敏或其他不良反應(在適當情況下)。根據本揭示，本領域技術人員將認識到包含抗體及視情況存在的另外的活性成分的醫藥組成物的製備方法，如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版(Mack Printing Company，1990)所例示，該文獻以引用方式併入本文中。此外，對於動物(例如，人)投予，應當理解，製劑應符合FDA生物製品標準辦公室或其他國家/地區的有關部門所要求的無菌性、熱原性、一般安全性和純度標準。較佳的組成物為凍乾製劑或水溶液。如本文所使用的「醫藥上可接受之載劑」，包括任何及所有溶劑、緩沖液、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料，諸如本技術領域具有通常知識者已知的材料及其組合(參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，pp.1289-
1329，該文獻以引用方式併入本文)。除非任何習用載劑與活性成分不相容，否則考慮將其用於醫藥組成物中。
本發明之抗體(及任何另外的治療劑)可透過任何合適的方式投予，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。
腸胃外組成物包括那些設計用於注射投予的組成物，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹腔內注射。對於注射，本發明之抗體可以配製在水溶液中，特定而言在生理相容性緩衝液中，如Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩衝液。該溶液可包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。可替代地，抗體可以呈粉末形式，以便在使用前與合適的載體(例如無菌無熱原水)一起配製。藉由將所需量的本發明之抗體併入適當的溶劑以及所需的以下枚舉之多種其他成分中來製備無菌注射溶液。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。通常，透過將各種滅菌后的活性成分摻入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌載體中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何另外的所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在註射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於0.5ng/mg蛋白質。合適的醫藥
上可接受之載劑包括但不限於：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑(例如EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可包含提高混懸劑黏度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。視情況，懸浮液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸浮液製備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質體。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊(例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊(nanocapsule))中或粗滴乳狀液中。此等技術公開於Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)中。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定態樣中，可以藉由在
組合物中使用延遲吸收的物質(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來產生可注射組成物的延長吸收。
除先前描述的組合物外，抗體還可以配製為儲存製劑。此等長效製劑可以透過植入(例如皮下或肌內)或透過肌內注射投予。因此，例如，抗體可以用適宜的聚合物質或疏水物質(例如作為可用油中的乳狀液)或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如配製為微溶的鹽類。
包含本發明之抗體的醫藥組成物可以利用習用的混合、溶解、乳化、包膜、誘捕或凍乾方法來製備。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製醫藥組成物。適宜的製劑視所選的投予途徑而定。
抗體可以以游離酸或鹼、中性或鹽形式配製成組成物。醫藥上可接受之鹽類是基本上保留游離酸或鹼的生物活性的鹽。這些包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物的游離胺基形成的那些，或與無機酸(例如，鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。
F.治療方法和組成物
本文提供之任何抗體均可用於治療方法中。本發明之抗體可以用為免疫治療劑，例如用於癌症或自體免疫疾病的治療中。
為了在治療方法中使用，本發明之抗體將以符合良好醫療實踐的方式予以配製、給藥和投予。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體
障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。
在一個態樣中，提供了用為藥劑的本發明之抗體。在另一態樣中，提供了用於治療疾病的本發明之抗體。在某些態樣中，提供了用於治療方法中的本發明之抗體。在一個態樣中，本發明提供了一種用於治療有需要的受試者之疾病的本發明之抗體。在某些態樣中，本發明提供了一種用於治療患有癌症之受試者的方法中的抗體，該方法包含向該受試者投予有效量之抗體。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面，該疾病為癌症，特定而言表現CD19之癌症。在一具體方面，該癌症為B細胞癌症。在一個方面之B細胞癌症為B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一個方面，B細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。在其他方面，該疾病為自體免疫疾病。在一具體方面，該疾病為狼瘡，特定而言系統性紅斑性狼瘡(SLE)或狼瘡性腎炎(LN)。
在某些方面，該方法進一步包含向該受試者投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑(如果該待治療的疾病為癌症)或免疫抑制劑(如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。在又一方面，本發明提供了一種用於誘導標靶細胞，特定而言B細胞溶解的抗體。在某些方面，本發明提供了一種用於誘導個體中之標靶細胞、特定而言B細胞溶解的方法中的本發明之抗體，該方法包含對受試者投予有效量之抗體以誘導標靶細胞溶解。根據上述任一方面的「受試者」(individual)為哺乳動物，較佳地為人。
在另一態樣中，本發明提供了本發明之抗體在用於製造或製備藥劑中之用途。在一個方面，藥劑用於治療有此需要之受試者的疾病。在另一
態樣中，藥劑用於治療疾病的方法中，該方法包含向患有疾病的受試者投予治療有效量之藥劑。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面，該疾病為癌症，特定而言表現CD19之癌症。在一具體方面，該癌症為B細胞癌症。在一個方面之B細胞癌症為B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一個方面，B細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。在其他方面，該疾病為自體免疫疾病。在一具體方面，該疾病為狼瘡，特定而言系統性紅斑性狼瘡(SLE)或狼瘡性腎炎(LN)。在一個方面，該方法進一步包含向該受試者投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑(如果待治療的疾病為癌症)或免疫抑制劑(如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。在又一方面，藥劑用於誘導標靶細胞、特定而言B細胞溶解。在再一方面，藥劑用於誘導受試者中之標靶細胞、特定而言B細胞溶解的方法中，該方法包含向該受試者投予有效量之藥劑以誘導標靶細胞溶解。根據上述任一態樣之「受試者」可為哺乳動物，較佳地為人。
本發明之另一方面提供了一種治療疾病的方法。在一個態樣中，該方法包括向患有此類疾病的受試者投予治療有效量的本發明之抗體。在一個方面，向該受試者投予包含本發明之抗體的呈醫藥上可接受之形式的組成物。在某些方面，該疾病為增生性疾病。在某些方面，該疾病為癌症，特定而言表現CD19之癌症。在一具體方面，該癌症為B細胞癌症。在一個方面之B細胞癌症為B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一個方面，B細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。在其他方面，該疾病為自體免疫疾病。在一具體方面，該疾病為狼瘡，特定而言系統性紅斑性狼瘡(SLE)或狼瘡性腎炎(LN)。在某些方面，該方法進一步包含向該受試者投予
有效量之至少一種另外的治療劑，例如抗癌劑(如果該待治療的疾病為癌症)或免疫抑制劑(如果該待治療的疾病為自體免疫疾病)。根據上述任一態樣之「受試者」可為哺乳動物，較佳地為人。
在又一方面，本發明提供一種誘導標靶細胞、特定而言表現CD19之細胞(諸如B細胞)溶解的方法。在一個態樣中，該方法包含在T細胞、特定而言細胞毒性T細胞的存在下，使標靶細胞與本發明之抗體接觸。在又一方面，提供一種誘導受試者中標靶細胞、特定而言表現CD19之細胞(諸如B細胞)溶解的方法。在一個此類態樣中，該方法包括對受試者投予有效量的本發明之抗體以誘導標靶細胞溶解。在一個方面，「受試者」為人。
熟練的技術人員容易地認識到，在許多情況下，該抗體可能無法提供治愈，而只能提供部分益處。在一些態樣中，還認為具有某種益處的生理變化在治療上有益。因此，在一些態樣中，提供生理變化的抗體量被認為是「有效量」。需要治療的個體、患者或受試者通常為哺乳動物，更具體而言人。
在一些態樣中，對受試者投予有效量的本發明之抗體以治療疾病。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量(單獨使用或與一種或多種另外的治療劑組合使用)將取決於待治療的疾病的類型、給藥途徑、患者體重、抗體類型、疾病的嚴重程度和病程、為了預防或是治療的目的投予該抗體、之前的或同時進行的治療干預、患者的臨床病史和對該抗體的反應以及主治醫師的判斷。在任何情況下，負責投予的從業者將確定組成物中一種或多種活性成分的濃度以及單獨個體的合適劑量。本文中考慮各種給藥方
案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予及脈衝輸注。
在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可為例如透過一次或多次分開的投予或透過連續輸注來對患者投予的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從0.005mg/kg至約10mg/kg的範圍內。在其他非限制性實例中，劑量亦可以包含每次投予從約1微克/公斤體重、約5微克/公斤體重、約10微克/公斤體重、約50微克/公斤體重、約100微克/公斤體重、約200微克/公斤體重、約350微克/公斤體重、約500微克/公斤體重、約1毫克/公斤體重、約5毫克/公斤體重、約10毫克/公斤體重、約50毫克/公斤體重、約100毫克/公斤體重、約200毫克/公斤體重、約350毫克/公斤體重、約500毫克/公斤體重、至約1000毫克/公斤體重或更多及其衍生的任何範圍。在從本文中所列的數字衍生的範圍的非限制性實例中，可基於上述數字投予約5毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重，約5微克/公斤體重至約500毫克/公斤體重範圍內的劑量。因此，可以對患者投予約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg中的一種或多種劑量(或其任意組合)。此等劑量可以間歇投予，例如每週或每三週投予(例如，使得患者接受約2種至約20種或例如約6種劑量的抗體)。可以投予初始較高的負荷劑量，然後投予一種或多種較低的劑量。但是，可以使用其他劑量方案。透過習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
本發明之抗體通常將以能夠達到預期目的量使用。為用於治療或預防疾病病症，以有效量投予或應用本發明之抗體或其醫藥組成物。
對於全身投予，最初可以從諸如細胞培養物測定的體外測定估計有效劑量。然後可以在動物模型中製定劑量，以達到包括細胞培養物中確定的IC50在內的循環濃度範圍。此等資訊可用於更準確地確定對人體有用的劑量。
也可以使用本技術領域中熟知的技術，根據體內資料(例如動物模型)估計初始劑量。
可以單獨調節劑量和間隔來提供足以維持治療效果的抗體的血漿濃度。透過注射投予的常見患者劑量在約0.1-50mg/kg/天的範圍內，典型範圍為0.5-1mg/kg/天。可以透過每天投予多種劑量來達到治療有效的血漿濃度。血漿中的濃度可以例如透過HPLC來測量。
本發明之抗體的有效劑量將一般地提供治療益處而不會引起實質性毒性。可透過標準藥學方法在細胞培養物或實驗動物中測定抗體的毒性和治療有效性。可以用細胞培養物測定和動物研究來測定LD50(致死群體的50%的劑量)和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其可以表示為比值LD50/ED50。表現出大治療指數的抗體是較佳的。在一個態樣中，根據本發明之抗體表現出高治療指數。從細胞培養測定法和動物研究中得到的資料可用於配製適用於人類的一系列劑量。劑量較佳地在包括很小毒性或無毒性的ED50的循環濃度範圍內。劑量可根據多種因素(例如所採用的劑型、所利用的投予途徑、個體的狀況等)在此範圍內變化。精確的製劑、投予途徑和劑量可以由個別醫師基於患者的病症來選擇(參見例如
Fingl等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章第1頁，該文獻全文以引用方式併入本文)。
用本發明之抗體治療的患者的主治醫師將指導如何及何時由於毒性、器官功能障礙等而終止、中斷或調整投予。相反，主治醫師還將知道在臨床反應不充分(排除毒性)時如何將治療調整至更高的水平。在目標疾病的治療中，投予劑量的大小將隨待治療疾病的嚴重程度、投予途徑等而變化。病症的嚴重程度可部分地透過例如標準預後評價法來評價。此外，劑量以及可能的給藥頻率也將根據個體患者的年齡、體重和反應而變化。
本發明之抗體可以在治療中與一種或多種其他藥物聯合投予。例如，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可以與至少一種另外的治療劑聯合投予。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此等治療的受試者中的症狀或疾病而投予的任何藥劑。此等另外的治療劑可包含適合於所治療的特定疾病的任何活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。在某些態樣中，該另外的治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑。在某些方面，該另外的治療劑為抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡啟動劑或抗血管新生劑。在其他方面，另外的治療劑為免疫抑制劑。在具體方面，另外的治療劑為選自下組之一者或多者：皮質類固醇、羥氯喹、黴酚酸酯、黴酚酸、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、環磷醯胺、鈣調神經磷酸酶抑制劑、貝立單抗(belimumab)、利妥昔單抗(rituximab)及奧比妥珠單抗(obinutuzumab)。
此等其他藥物適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此等其他藥劑的有效量取決於所使用的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。該等抗體通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約1%至99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合投予(其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的組合物中)，以及單獨投予，在這種情況下，本發明之抗體的投予可在投予另外的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。本發明之抗體亦可以與放射療法組合使用。
G.製品
本發明的另一方面提供包含用於治療、預防及/或診斷上述疾病的製成品。該製品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可以由多種材料例如，玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口(例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。該標籤或藥品說明書指示該組成物用於治療所選擇的症狀。此外，該製品可以包括(a)其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及(b)其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的包裝說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之
緩衝劑，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
H.用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些方面，本文提供的任何抗體均可用於檢測生物樣品中是否存在其標靶(例如CD3或CD19)。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些態樣中，生物樣品包含細胞或組織，諸如***組織。
在一個態樣中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的根據本發明之抗體。在又一方面，提供一種檢測生物樣品中是否存在CD3或CD19的方法。在某些方面，該方法包含：在允許抗體與CD3或CD19結合的條件下，使生物樣品與本發明之抗體接觸，以及檢測抗體與CD3或CD19之間是否形成複合體。此等方法可為體外或體內方法。在一個方面，使用本發明之抗體來選擇適合使用與CD3及/或CD19結合之抗體進行治療的個體，例如其中CD3及/或CD19為用於選擇患者的生物標記。
可使用本發明之抗體來診斷之例示性疾病包含癌症，特定而言B細胞癌症。
在某些態樣中，提供了根據本發明的抗體，其中，該抗體被標記。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分(例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測(例如，透過酶促反應或分子相互作用)的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶
(美國專利號4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體(例如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他態樣。
從先前描述的(參見例如WO 2014/131712，該文獻以引用方式併入本文中)CD3黏合劑開始，其在本文中稱為「CD3原始」，並分別包含序列SEQ ID NO 6及11之VH及VL序列，我們的目的是藉由去除重鏈CDR3之Kabat位置97及100的兩個天冬醯胺酸脫醯胺序列模體來優化這種黏合劑的效能。
為此，我們製備了一個適合噬菌體展示的重鏈抗體庫，去除了Kabat位置97及100的天冬醯胺，並且隨機分配了CDR H1、CDR H2及CDR H3，以補償透過親和力成熟過程替換Asn97及Asn100造成的親和力損失。
該文庫經由與小外殼蛋白p3(Marks等人(1991)J Mol Biol 222,581-597)的融合被置於絲狀噬菌體上，並被選擇用於與重組CD3ε結合。
在初步篩選中鑒定出10個候選殖株，作為Fab片段(在大腸桿菌中產生)，藉由SPR測量顯示其對重組抗原之可接受的結合。
然而，這些殖株中只有一個在轉化為IgG形式後藉由流式細胞術測量到與表現CD3之細胞具有可接受的結合活性。
所選擇的殖株(本文中稱為「CD3優化」且分別包含SEQ ID NO 7及11之VH及VL序列)經進一步評估並轉化為如下所述之雙特異性格式。
與重組CD3之結合
針對優化的CD3黏合劑「CD3優化」及原始CD3黏合劑「CD3原始」，透過表面電漿子共振(SPR)測定與重組CD3之結合，兩者均為人IgG1格式，在Fc區(SEQ ID NO 12和14(CD3原始)及SEQ ID NO 13和14(CD3優化))中具有P329G L234A L235A(「PGLALA」，EU編號)突變。
為了評估脫醯胺位點去除的效果及其對抗體穩定性的影響，在37℃或40℃溫度應力14天後，檢測了原始的及優化的CD3黏合劑與重組CD3之結合。樣品儲存在-80℃作為參考。參考樣品及40℃應力的樣品在20mM His，140mM NaCl(pH 6.0)中，且37℃應力的樣品在PBS(pH 7.4)中，濃度均為1.2-1.3mg/ml。在應力期(14天)後，將PBS中的樣品透析回20mM His，140mM NaCl(pH 6.0)以進行進一步分析。
樣品的相對活性濃度(RAC)藉由SPR測量如下。
在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上進行SPR。抗Fab捕獲抗體(GE Healthcare,#28958325)係使用標準胺耦合化學固定在S系列感測器晶片CM5(GE Healthcare)上，使得表面密度為4000-6000共振單位(RU)。作為運轉及稀釋緩衝液，使用了HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05%界面活性劑P20)。將濃度為2μg/ml的CD3抗體以5μl/min的流速注射60秒。CD3抗原(見下文)以10μg/ml的濃度注射120秒，並以5μl/min的流速監測解離120秒。晶片表面藉由連續兩次注射10mM甘胺酸pH 2.1進行再生，每次注射約60秒。藉由減去空白注射及減去從空白對照流通池得到的反應來校正整體折射率差異。為了評估，在注射結束後5秒量取結合反應。為了使結合訊號歸一化，將CD3結合除以抗Fab反應(在固定化抗Fab抗體上捕獲
CD3抗體後得到的訊號(RU))。參考每個溫度應力的樣品與相應的非應力樣品來計算相對活性濃度。
所用的抗原為融合至具有杵臼修飾及C端Avi-tag的人Fc域之CD3δ與CD3ε胞外域的異二聚體(參見SEQ ID NO 41及42)。
該實驗的結果示於圖2中。可以看出，與原始CD3黏合劑CD3原始相比，溫度應力原始相比，溫度應力(37℃，pH 7.42週)後，優化的CD3黏合劑CD3優化顯示出與CD3之結合得到極大改進。這一結果表明，脫醯胺位點去除是成功的，並產生了一種具有優異穩定性特性(與體內半衰期有關)之抗體，以及抗體在中性pH的配方。
與Jurkat細胞上的CD3之結合
針對優化的CD3黏合劑「CD3優化」及原始CD3黏合劑「CD3原始」，透過FACS測定與人報告T細胞株Jurkat NFAT上的CD3之結合，兩者均為人IgG1格式，在Fc區(SEQ ID NO 12和14(CD3原始)及SEQ ID NO 13和14(CD3優化))中具有P329G L234A L235A(「PGLALA」，EU編號)突變。
Jurkat-NFAT報告細胞(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P；Promega #CS176501)是一種具有NFAT啟動子的人急性淋巴細胞白血病報告細胞株，表現人CD3。該等細胞在RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10% FCS、25mM HEPES、2mM L-麩醯胺酸、1 x NEAA、1 x丙酮酸鈉中以0.1-0.5mio細胞/ml培養。當細胞傳代時，添加200μg每ml最終濃度的潮黴素B。
在結合測定中，收穫Jurkat NFAT細胞，用PBS洗滌並再懸浮在FACS緩衝液中。抗體染色在96孔圓底盤中進行。因此，每孔接種100000
至200000個細胞。將盤在400 x g離心4min並去除上澄液。將測試抗體在FACS緩衝液中稀釋，並在4℃將20μl的抗體溶液加入細胞持續30min。為了去除未結合的抗體，在加入稀釋的二級抗體(PE結合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特異性；Jackson ImmunoResearch #109-116-170)之前，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在4℃培育30min後洗掉未結合的二級抗體。在測量之前，將細胞再懸浮在200μl FACS緩衝液中，然後使用BD Canto II裝置藉由流式細胞術進行分析。
如圖3所示，優化的CD3黏合劑「CD3優化」及原始CD3黏合劑「CD3原始」與Jurkat細胞上的CD3結合得相當好。
在Jurkat報告細胞測定中測試優化的CD3黏合劑「CD3優化」之功能活性並與原始CD3黏合劑「CD3原始」之活性進行比較。為了測試IgG的功能活性，在CD3優化人IgG1 PGLALA或CD3原始人IgG1 PGLALA的濃度增加的情況下，將表現抗PGLALA之CHO細胞與Jurkat NFAT報告細胞共培育。T細胞交聯後CD3在Jurkat NFAT報告細胞上的活化誘導螢光素酶的產生，且發光可被測量為活化標記。CD3原始人IgG1 wt作為陰性對照被誘導，其無法與表現抗PGLALA之CHO細胞結合，且因此無法在Jurkat NFAT細胞上交聯。該測定之示意圖在圖4中提供。
表現抗PGLALA之CHO細胞為CHO-K1細胞，其經工程改造以在其表面上表現抗體，該抗體特異性結合人IgG1 Fc(PGLALA)(參見WO 2017/072210，該文獻以引用方式併入本文中)。將這些細胞在含5% FCS+1%
GluMax的DMEM/F12培養基中進行培養。Jurkat NFAT報告細胞如實例2中所述。
在CD3 huIgG1 PGLALA與CHO上表現的抗PGLALA及Jurkat-NFAT報告細胞上表現的CD3同時結合後，NFAT啟動子被活化並導致活性螢火蟲螢光素酶的表現。發光信號的強度(藉由添加螢光素酶受質取得)與CD3活化和信號傳導的強度成正比。Jurkat-NFAT報告細胞在懸浮液中生長，並且在RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10% FCS、25mM HEPES、2mM L-麩醯胺酸、1 x NEAA、1 x丙酮酸鈉中以0.1-0.5mio細胞/ml、200μg/ml潮黴素培養。對於該測定，收穫CHO細胞並使用ViCell確定活力。在100μl培養基中，將30000個標靶細胞/孔平鋪於平底白壁96孔盤(Greiner bio-one #655098)中，且添加50μl/孔之經稀釋之抗體或培養基(對於對照)至CHO細胞。隨後，收穫Jurkat-NFAT報告細胞，且使用ViCell評估存活率。將細胞以1.2mio細胞/ml再懸浮於不含潮黴素B的細胞培養基中，並以60000個細胞/孔(50μl/孔)添加至CHO細胞以得到2：1的最終效應-標靶(E：T)比率及200μl/孔的最終體積。然後，將4μl的GloSensor(Promega #E1291)添加至每個孔(2%的最終體積)。在加濕培養箱中，使細胞在37℃下培育24小時。在培育時間結束時，使用TECAN Spark 10M檢測發光。
如圖5中所示，優化的CD3黏合劑CD3優化在交聯後在Jurkat NFAT細胞上具有與CD3原始類似的活性。
在實例1中鑒定之優化的CD3黏合劑(「CD3優化」，SEQ ID NO 7(VH)和SEQ ID NO 11(VL))用於產生靶向CD3及CD19(「CD19-
TCB」)之T細胞雙特異性抗體(TCB)，抗CD19抗體2B11或018作為CD19結合部分(分別為SEQ ID NO 15-22或28-35)。
TCB分子的示意圖在圖6A中提供，且其全序列在SEQ ID NO 39、24、25及27(2B11)、以及SEQ ID NO 36、37、38及27(018)中給出。
還製備了包含上述抗CD19抗體作為標靶細胞抗原結合部分及CD3原始作為CD3黏合劑的相應分子(SEQ ID NO 39、24、25及26(2B11)、以及SEQ ID NO 40、37、38及26(018))。
重鏈及輕鏈DNA序列的可變區在骨架中進行次選殖，其中將恒定重鏈或恒定輕鏈預***到相應的受體哺乳動物表現載體中，如圖6的B至E所示。
為了改進輕鏈與相應重鏈的正確配對，在CD19結合Fab分子的人CL(E123R，Q124K)及人CH1(K147E，K213E)中引入突變。
為了使重鏈正確配對(形成異型二聚體分子)，在抗體重鏈的恒定區引入了杵臼結構突變(分別為T366W/S354C及T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，在抗體重鏈的恒定區引入P329G、L234A及L235A突變以消除與Fcγ受體的結合。
該等TCB是由Evitria(Switzerland)使用其專有的載體系統和習用(非PCR)選殖技術及使用懸浮適應的CHO K1細胞所製備(最初從ATCC及)適應於Evitria懸浮培養的無血清生長中取得。在產生過程中，Evitria使用其專有的、不含動物成分和無血清的培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染試劑(eviFect)。以1：1：2：1(「載體杵重鏈」：「載體臼重鏈」：「載體CD3
輕鏈」：「載體CD19輕鏈」)比例用相應表現載體轉染該等細胞。透過離心和隨後的過濾(0.2μm過濾器)收集上澄液。
作為Evitria製備的替代方法，TCB分子是藉由HEK293-EBNA細胞的瞬態轉染在室內製備的。將細胞離心，並且培養基用預熱的CD CHO培養基(Thermo Fisher,#10743029)替換。將表現載體混合在CD CHO培養基中，加入聚乙烯亞胺(PEI；Polysciences Inc，#23966-1)，將溶液渦旋並在室溫培育10分鐘。然後，將細胞(2mio/ml)與載體/PEI溶液混合，轉移到燒瓶中，並在振盪培養箱中在5% CO2氣氛下於37℃培育3小時。培育後，添加具有補充劑(佔總體積的80%)的Excell培養基(W.Zhou和A.Kantardjieff，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing,DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。轉染後一天，加入補充劑(進料，佔總體積的12%)。7天後透過離心和隨後的過濾(0.2μm過濾器)收穫細胞上澄液。
透過標準方法從收穫的上澄液中純化蛋白質。簡而言之，透過蛋白A-親和層析術從經過濾的細胞培養上澄液中純化含Fc的蛋白質(平衡緩衝液：20mM檸檬酸鈉、20mM磷酸鈉、pH 7.5；洗脫緩衝液：20mM檸檬酸鈉，pH 3.0)。在pH 3.0下完成洗脫，然後立即中和樣品的pH。通過離心(Millipore Amicon® ULTRA-15,#UFC903096)濃縮蛋白質，並通過粒徑篩析層析法在20mM組胺酸，140mM氯化鈉，pH 6.0中將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
通過使用根據Pace等人，Protein Science,1995,4,2411-1423基於胺基酸序列計算的質量消光係數來測量在280nm處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在存在和不存在還原劑的情況下，使用LabChipGXII(Perkin
Elmer)，透過CE-SDS來分析蛋白質的純度和分子量。在25℃藉由HPLC色層分離法，使用在運轉緩衝液(分別為25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM L-精胺酸單氯化氫，pH 6.7或200mM KH2PO4，250mM KCl pH 6.2)中平衡的分析用粒徑篩析柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)執行聚集體含量測定。
表1給出了製備的TCB分子的生化分析及生物物理分析的結果。
可以高品質產生所有四種TCB分子。
使用實例4中製備的CD19-TCB分子在Biacore T200儀器上以25℃進行SPR實驗，其中HBS-EP+作為運轉緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005%界面活性劑P20(GE Healthcare，#BR-1006-69))。抗Fc(P329G)IgG(特異性結合人IgG1 Fc(P329G)的抗體；「抗PG抗體」-參見WO 2017/072210，該文獻以引用方式併入本文中)透過胺耦合直接固定在C1晶片上(GE Healthcare)。在25nM處捕獲不同的TCB分子。CD19抗原(人
CD19胞外域(ECD)-Fc融合；參見SEQ ID NO 43及44)或CD3抗原(CD3ε/δ-Fc融合；參見實例2，SEQ ID NO 41及42)的三倍稀釋系列(在HBS-EP中為0.14至100nM)以30μl/min流過配位體240秒以記錄締合相。監測解離相1500秒(CD19抗原)或800秒(CD3抗原)，並透過從樣品溶液切換到HBS-EP+來觸發該解離相。在每個循環後，注射兩次10mM甘胺酸pH 2.1持續60秒鐘，使晶片表面再生。透過減去在參考流通細胞上得到的響應來校正大折射率差(未捕獲TCB)。透過使用Biaeval軟體(GE Healthcare)擬合1：1Langmuir結合來從動力學速率常數中得出親和力常數。採用三個獨立的稀釋系列進行測量。
測定了四種經測試的TCB與重組人CD19(表2)及與重組人CD3(表3)的1：1 Langmuir結合的動力學常數。
表3.與人CD3結合：動力學常數。同一運轉中獨立稀釋系列的平均值及標準差(括弧內)。
不同的黏合劑在不同的TCB中表現出相似的親和力。CD19黏合劑2B11在相應TCB中的KD約為0.4nM。CD19黏合劑018的親和力稍低，在相應TCB中的KD約為1.1nM。具有CD3黏合劑CD3原始或CD3優化的TCB與KD約為3.4nM的CD3具有相當的親和力。雖然CD19及CD3抗原相互作用的KD相似，但動力學不同。CD19的解離速度比CD3慢，但CD3的締合速度比CD19快，從而導致類似的KD值。
測試了實例4中製備的CD19-TCB分子與表現人CD19之標靶細胞及表現人CD3之標靶細胞之結合。使用兩種具有不同CD19表現量之表現CD19之細胞株。Nalm-6是一種具有CD19高表現的急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞株，且Z-138(被套細胞淋巴瘤)具有平均表現量。使用永生化T淋巴細胞株(Jurkat細胞株)檢測CD3結合。簡言之，收穫細胞，對其進行計數，檢查其活力，並以1 x 106個細胞/ml再懸浮於FACS緩衝液(PBS+2% FCS+5mM EDTA+0.25%疊氮化鈉)中。在CD19-TCB分子的濃度增加的情況下(在
Jurkat細胞上為200nM-0.05nM；在Z-128及Nalm-6細胞上為200nM-0.0002nM)，將100μl細胞懸液(含0.1 x 106個細胞)於圓底96孔盤中在4℃培育30min，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，在4℃用PE-結合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特異性二級抗體(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)再培育30min，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，並立即使用FACS CantoII(軟體FlowJo 10.5.3)透過FACS進行分析。結合曲線及與結合相關的EC50值用GraphPad Prism 7計算。
結果示於圖7及表4和表5中。包含CD3優化作為CD3黏合劑的CD19-TCB分子顯示出與包含CD3黏合劑CD3原始的分子相當(或稍好)的CD3結合(圖7A及表4)。
CD19-TCB分子(包含2B11或018作為CD19黏合劑)顯示出與表現CD19之細胞類似的結合(圖7B、圖7C及表5)。對於Z-138細胞，由於結合曲線未達到飽和，因此無法計算EC50值。
對Nalm-6細胞(ALL)及Z-138細胞(被套細胞淋巴瘤)評估由實例4中製備的CD19-TCB分子介導的表現CD19之腫瘤細胞的溶解及隨後的T細胞活化。將人PBMC用作效應子，並在用不同的TCB分子培育20小時時檢測到腫瘤溶解。
周邊血單核細胞(PBMC)是透過對從健康人供體得到富集的淋巴細胞製劑(膚色血球層)進行Histopaque密度離心來製備的。新鮮血液用無菌PBS稀釋並以Histopaque梯度(Sigma,#H8889)分層。在離心(450 x g，30分鐘，無制動，室溫)後，丟棄含有PBMC的中間相上方的血漿，並將PBMC轉移到新的離心管中，隨後用50mlPBS填充。將混合物離心(350 x g，10分鐘，室溫)，丟棄上澄液，且在用無菌PBS洗滌之前，將PBMC片狀沉澱物在37℃於紅血球溶解液中培育5min(離心300 x g，10分鐘)。將得到的PBMC族群在PBS中再懸浮並自動計數(ViCell)。在含有10% FCS及1% GlutaMAX(Gibco)(含有10% DMSO(Sigma，#D2650))的RPMI1640培養基(Gibco，#21870076)中冷凍50mio PBMC/冷凍管。PBMC在測定當天解凍並再次自動計數(ViCell)。所需量用無菌PBS洗滌一次。根據製造商的說明，使用CD20微珠(Miltenyi，#130-091-104)進行B細胞耗乏。對B細胞耗乏PBMC進行計數(ViCell)並在含有10% FCS及1% GlutaMAX的RPMI1640培養基中以5 x 106個細胞/ml再懸浮。
為了進行毒殺測定，將0.25mio B細胞耗乏PBMC添加至U型底96孔盤。簡言之，以50000個細胞/孔的密度收穫、洗滌及平鋪標靶細胞，
得到最終效應-標靶(E：T)比率為5：1。以指示濃度(0.02pM-1000pM範圍，一式三份)添加TCB分子。在測定中已經將CD107a(LAMP-1)直接染色(PE抗人CD107a；Biolegend，#328608)。
在37℃，5% CO2下培育20小時後，透過定量由凋亡/壞死細胞釋放到細胞上澄液中的LDH(LDH檢測套組，Roche Applied Science，#11 644 793 001)來評估腫瘤細胞溶解。通過將標靶細胞與1% Triton X-100一起培育，實現標靶細胞的最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指與沒有雙特異性構建體的效應細胞共同培育的標靶細胞。
為了評估腫瘤細胞溶解時發生的T細胞活化，將PBMC以400 x g離心4分鐘，並用FACS緩衝液洗滌兩次。簡言之，將細胞用PBS洗滌兩次，然後進行活/死染色(Zombie Aqua Fixable activity套組；Biolegend，#423102，RT 20分鐘)。先用PBS、再用FACS緩衝液反復洗滌，根據供應商的說明對CD3(PE-Cy5抗人CD3；BD Pharmigen，#555341)、CD4(BV605抗人CD4；Biolegend，#317438)、CD8(BV711抗人CD8；Biolegend，#301044)、CD25(PE-Cy7抗人CD25，Biolegend，#302612)及CD69(BV421抗人CD69；Biolegend，#310930)進行表面染色。將細胞用150μl/孔FACS緩衝液洗滌兩次並用120μl/孔1x溶解液(BD Biosciences # 349202).固定。將樣品在BD FACS Fortessa(軟體FlowJo 10.5.3)進行分析。
圖8顯示出CD19-TCB分子誘導CD19+標靶細胞的標靶特異性毒殺。四種不同的CD19-TCB分子在誘導表現CD19之腫瘤細胞的溶解方面具有整體可比性。圖9及圖10顯示出，與含有CD3原始黏合劑的分子相比，含有CD3優化黏合劑的CD19-TCB在腫瘤毒殺(毒殺Nalm-6或Z-138標靶細胞後
CD8及CD4T細胞上的CD25、CD69及CD107表現)後對T細胞活化的誘導略优。未觀察到CD19黏合劑2B11及018對T細胞活化的影響。
包含優化的抗CD3抗體CD3優化(及CD19黏合劑2B11，參見實例4)的CD19-TCB分子的熱穩定性係透過靜態光散射(SLS)進行監測，該靜態光散射透過使用Uncle系統(Unchained Labs，USA)施加溫度斜坡。
將9μl的蛋白質濃度為1mg/ml的經過濾蛋白質樣品施加至Uncle裝置。溫度以0.1℃/min從30℃上升至90℃，在266nm處收集散射強度。
結果顯示於表9中。
為了證實脫醯胺位點去除的效果及其對抗體穩定性的影響，將包含優化的抗CD3抗體CD3優化(及CD19黏合劑2B11，參見實例4)的CD19-TCB分子在37℃、pH 7.4及40℃、pH 6培育14天，並進一步藉由SPR分析其與人CD3ε/δ的結合能力。在-80℃、pH 6儲存的樣品用為參考。參考樣品及40℃應力的樣品在20mM His，140mM NaCl(pH 6.0)中，且37℃應力的樣品在PBS(pH 7.4)中，濃度均為1.0mg/ml。在應力期(14天)後，將PBS中的樣品透析回20mM His，140mM NaCl(pH 6.0)以進行進一步分析。
在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上於25℃以HBS-P+(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05%界面活性劑P20)作為運轉緩衝液及稀釋緩衝液來執行所有SPR實驗。生物素化人CD3ε/δ(參見實例2，SEQ ID NO 41及42)以及生物素化抗huIgG(Capture Select，Thermo Scientific，
#7103262100)固定在S系列感測器晶片SA(GE Healthcare，#29104992)上，產生至少1000個共振單位(RU)的表面密度。將濃度為2μg/ml的TCB以5μl/min的流速注射30秒，並監測解離120秒。該表面藉由注射10mM甘胺酸pH 1.5持續60秒進行再生。藉由減去空白注射及減去從空白對照流通池得到的反應來校正整體折射率差異。為了評估，在注射結束後5秒量取結合反應。為了使結合訊號歸一化，將CD3結合除以抗huIgG反應(在固定化抗huIgG抗體上捕獲TCB抗體後得到的訊號(RU))。參考每個溫度應力的樣品與相應的非應力樣品來計算相對結合活性。
如表10所示，包含優化的抗CD3黏合劑CD3優化的CD19-TCB與CD3ε/δ之結合基本上不受應力影響，與CD3黏合劑的結果一致(實例2)。
為了瞭解CD19-TCB分子(包含優化的抗CD3抗體CD3優化及2B11CD19黏合劑)的效力及安全性型態，進行了一項體內作用模式研究，評估人源化NSG小鼠的周邊B細胞耗乏及細胞激素釋放。
根據規定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)將在實驗開始時4-5週齡的雌性NSG小鼠(Jackson實驗室)維持於無特定病原的條件下，其中每
天使用光照12小時/黑暗12小時之循環。實驗研究方案已經由地方政府審查及批准(ZH223-17)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。
向雌性NSG小鼠經腹膜腔內注射15mg/kg硫酸布他卡因(Busulfan)，隨後在一天後經靜脈內注射自臍帶血分離之1x105個人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，在舌下對小鼠放血且藉由流式細胞術分析血液是否成功實現人類化。將有效植入之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分入不同治療組中。隨機化後，三組中的小鼠用奧比妥珠單抗(Gazyva®)(30mg/kg)預處理一次，作為防止細胞激素過度釋放的措施。
預處理7天後，即第0天，所有組均接受不同劑量的CD19-TCB、CD20-TCB(靶向CD20並包含CD3黏合劑CD3原始的TCB)或載體。注射三種不同劑量(0.5、0.15及0.05mg/kg)的CD19-TCB。有及未有Gazyva®預處理的CD20-TCB(0.15mg/kg)用為比較劑。所有小鼠均被靜脈注射200μl的適當溶液。每組三只小鼠在治療後(第0天)4小時、24小時及72小時放血。
研究設計如圖11所示，且研究組匯總如表11所示。
終止時(第3天)，犧牲小鼠，採集脾、淋巴結(LN)和骨髓(BM)，稱重，通過釋放酶及DNA水解酶的酶消化製備單細胞懸液，用於隨後的FACS分析。對脾單細胞和所有血樣進行人CD45、CD19、CD20染色，並在BD Fortessa流式細胞儀上進行分析。另外地，透過多重分析對三個出血時間點的血清進行細胞激素含量分析。
圖12顯示出各治療組的體重變化(%)。與CD20-TCB治療相比，CD19-TCB分子誘導的體重下降較少。體重下降與使用的劑量無關。此外，經治療動物的血清中的細胞激素分析顯示，在用CD20-TCB分子治療後4小時，細胞激素量升高到峰值(其可以透過用Gazyva®(GPT)預處理來降低)，而CD19-TCB分子僅檢測到低量的細胞激素(圖13)。
關於血液中B細胞耗乏動力學的免疫PD資料(圖14)顯示出隨著時間的推移透過CD19-TCB的CD19+CD20+B細胞的強烈耗乏(CD19+或CD20+的平均計數，細胞/μl血液+/- SEM)，且顯示有劑量依賴性。在CD19-TCB與CD20-TCB同樣有效的治療後72小時，在分析的所有淋巴器官中亦觀察到這種B細胞耗乏效應(資料未示出)。
為了評估CD19-TCB分子(包含優化的抗CD3抗體CD3優化及2B11 CD19黏合劑)在體內的抗腫瘤效果，給人源化NSG小鼠植入來自R-CHOP治療之復發患者的CD19+淋巴瘤患者來源的異種移植(PDX)細胞。當
腫瘤體積達到200mm3時，根據腫瘤大小將小鼠隨機分為8組。然後每週給他們注射0.5mg/kg CD19-TCB或載體(i.v.)，如圖15所示。為了評估CD19-TCB對腫瘤生長的影響，從每週兩次或三次的卡尺測量來計算腫瘤體積。
因此，與載體治療相比，每週CD19-TCB治療可顯著控制腫瘤生長(圖16)。這些資料表明，每週給藥0.5mg/kg CD19-TCB對荷淋巴瘤PDX的huNSG小鼠有效，並提示R-CHOP治療復發的淋巴瘤患者可受益於CD19-TCB治療。
* * *
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示及實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是這些描述及實例不應解釋為限製本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的揭示內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
Claims (37)
- 一種與CD3及CD19結合之抗體，其中該抗體包含(a)與CD3結合之第一抗原結合域，其包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區(VH)序列及SEQ ID NO：11之輕鏈可變區(VL)序列；及(b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中該第二抗原結合域及該第三抗原結合域包含VH及VL，該VH包含SEQ ID NO：15之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：16之HCDR 2及SEQ ID NO：17之HCDR3，以及該VL包含SEQ ID NO：19之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：20之LCDR2及SEQ ID NO：21之LCDR 3。
- 如請求項1之抗體，其中該第一抗原結合域、該第二抗原結合域及/或該第三抗原結合域為Fab分子。
- 如請求項1或2之抗體，其包含由第一次單元及第二次單元構成之Fc域。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第二抗原結合域及該第三抗原結合域為習用Fab分子。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第二抗原結合域及該第三抗原結合域為Fab分子，其中在該恆定域CL中，位置124的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)(根據Kabat編號)取代，且在該恆定域CH1中，位置147的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)(根據Kabat EU索引編號)取代。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第一抗原結合域與該第二抗原結合域彼此融合。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自為Fab分子，且(i)該第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，或(ii)該第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與該第二抗原結合域之Fab重鏈之N端融合。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第一抗原結合域、該第二抗原結合域及該第三抗原結合域各自為Fab分子，且該抗體包含由第一次單元及第二次單元構成之Fc域；且其中(i)該第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合且該第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一次單元之N端融合，或(ii)該第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與該第二抗原結合域之Fab重鏈之N端融合且該第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一次單元之N端融合；且該第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第二次單元之N端 融合。
- 如請求項9之抗體，其中該抗體係由該第一抗原結合域、該第二抗原結合域及該第三抗原結合域、該Fc域及一個或多個肽連接子組成，其中該第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合域的Fab重鏈之N端融合，並且該第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與該Fc域的第一次單元之N端融合，且其中該第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與該Fc域的第二次單元之N端融合。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域為IgG Fc域。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域為IgG1 Fc域。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域為人Fc域。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域為人IgG1 Fc域。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域包含促進該Fc域之該第一次單元與該第二次單元之締合之修飾。
- 如請求項15之抗體，其中在該Fc域之第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基替換，從而在該第一次單元之CH3域內產生突起，該突起可定位在該第二次單元之CH3域內的空腔中，並且在該Fc域之第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺 基酸殘基替換，從而在該第二次單元之CH3域內產生空腔，該第一次單元之CH3域內的突起為可定位在該空腔內。
- 如請求項15之抗體，其中在該Fc域之第一次單元中，位置366的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基替換(T366W)，並且在該Fc域之第二次單元中，位置407的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基替換(Y407V)(根據Kabat EU索引編號)。
- 如請求項17之抗體，其中(a)該Fc域之第二次單元中，額外地位置366的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基替換(T366S)，且位置368的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L368A)；及/或(b)在該Fc域之第一次單元中，額外地位置354的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(S354C)或位置356的麩胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(E356C)，且在該Fc域之第二次單元中，額外地位置349的酪胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
- 如請求項3之抗體，其中該Fc域包含降低與Fc受體之結合及/或效應功能之一種或多種胺基酸取代。
- 如請求項19之抗體，其中該Fc域包含在選自L234、L235及P329(根據Kabat EU索引編號)之群的位置之胺基酸取代。
- 如請求項19之抗體，其中該Fc域之各次單元包含L234A、L235A及P329G胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
- 如請求項1或2之抗體，其中該第二抗原結合域及該第三抗原結合域包含(i)VH，其包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列，及/或VL，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列。
- 如請求項1或2之抗體，其包含(a)與CD3結合之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH彼此替換，並且該第一抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(b)與CD19結合之第二抗原結合域及第三抗原結合域，其中第二抗原結合域及第三抗原結合域各自為習用Fab分子，且包含：重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；以及(c)Fc域，其由第一次單元及第二次單元構成；其中在(b)中所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CL中，位置124的胺基酸被離胺酸(K)(根據Kabat編號)取代，且位置123的胺基酸被離胺酸(K)或精胺酸(R)(根據Kabat編號)取代，並且其中在(b)中所述之第二抗原結合域及第三抗原結合域之恆定域CH1中，位置147的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213的胺基酸被麩胺酸(E)(根據Kabat EU索引編號)取代； 並且其中另外在(b)中所述之第二抗原結合域在Fab重鏈的C端與在(a)中所述之第一抗原結合域的Fab重鏈的N端融合，並且在(a)中所述之第一抗原結合域及在(b)中所述之第三抗原結合域各自在Fab重鏈的C端與在(c)中所述之Fc域的次單元中之一個的N端融合。
- 如請求項23之抗體，其中該Fc域為人IgG1 Fc域，以及其中在該Fc域之第一次單元中，位置366的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基替換(T366W)，且位置354的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(S354C)，並且在該Fc域之第二次單元中，位置407的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基替換(Y407V)、位置366的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基替換(T366S)、位置368的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L368A)以及位置349的酪胺酸殘基被半胱胺酸殘基替換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)，且其中進一步於該Fc域之第一次單元及第二次單元中，位置234的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L234A)、位置235的白胺酸殘基被丙胺酸殘基替換(L235A)以及位置329的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基替換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
- 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含：包含與SEQ ID NO：39之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：24之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：25之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列的二個多肽、以及包含與SEQ ID NO：27之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列的多肽。
- 一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項1至25中任一項之抗體。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項26之經分離之多核苷酸。
- 一種產生與CD3及CD19結合之抗體之方法，其包含如下步驟：(a)在適於表現該抗體之條件下培養如請求項27之宿主細胞，及(b)回收該抗體。
- 一種與CD3及CD19結合之抗體，其藉由如請求項28之方法產生。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至25或29中任一項之抗體以及醫藥上可接受之載劑。
- 一種如請求項1至25或29中任一項之抗體或如請求項30之醫藥組成物在製造用於治療疾病之藥劑中之用途。
- 如請求項31之用途，其中該疾病為癌症或自體免疫疾病。
- 如請求項32之用途，其中該癌症為(i)表現CD19之癌症，及/或(ii)B細胞癌症。
- 如請求項33之用途，其中該B細胞癌症為B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。
- 如請求項34之用途，其中該B細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴細胞白血病或慢性淋巴細胞白血病。
- 如請求項32之用途，其中該自體免疫疾病為狼瘡。
- 如請求項36之用途，其中該狼瘡為系統性紅斑性狼瘡(SLE)或狼瘡性腎炎(LN)。
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