ES2296899T3 - Factores neurotroficos. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: (a) aminoácidos 37-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 104); (b) aminoácidos 39-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 102); y (c) aminoácidos 42-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 99).
Description
Factores neurotróficos.
La invención se refiere a polipéptidos de
factores neurotróficos, a ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos de factores neurotróficos, y a anticuerpos que se unen
específicamente a los factores neurotróficos.
Los factores neurotróficos son proteínas
naturales que promueven la supervivencia, mantienen la
diferenciación fenotípica, previenen la degeneración y potencian la
actividad de las células y tejidos neuronales. Los factores
neurotróficos se aíslan de tejido neural y de tejido no neural que
está inervado por el sistema nervioso, y se han clasificado en
grupos relacionados funcional y estructuralmente, también
denominados familias, superfamilias o subfamilias. Entre las
superfamilias de factores neurotróficos están las superfamilias del
factor de crecimiento de fibroblastos, neurotrofina y factor de
crecimiento transformante \beta (TGF-\beta). Las
especies individuales de los factores neurotróficos se distinguen
por su estructura física, su interacción con sus receptores
compuestos, y sus efectos en diferentes tipos de células nerviosas.
Están clasificados dentro de la superfamilia de
TGF-\beta (Massague, y col., 1994, Trends in
Cell Biology, 4:172-178) los ligandos de
factores neurotróficos derivados de líneas celulares gliales
("GDNF"; documento WO 93/06116, incorporado en el presente
documento por referencia), que incluye GDNF, persefina ("PSP";
Milbrandt y col., 1998, Neuron 20:245-253,
incorporado en el presente documento por referencia) y neurturina
("NTN"; documento WO 97/08196, incorporado en el presente
documento por referencia). Los ligandos de la subfamilia de GDNF
tienen en común su capacidad para inducir la señalización a través
del receptor de la tirosina quinasa RET. Estos tres ligandos de la
subfamilia de GDNF difieren en sus afinidades relativas por una
familia de receptores neurotróficos, los receptores GFR\alpha.
Debido a los efectos de los factores
neurotróficos en tejidos neuronales, sigue siendo necesario
identificar y caracterizar factores neurotróficos adicionales para
el diagnóstico y tratamiento de trastornos del sistema nervioso.
Esta invención se refiere a un nuevo factor
neurotrófico llamado en el presente documento "neublastina" o
"NBN". La neublastina se clasifica dentro de la subfamilia de
GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos GDNF
(véase las Tablas 3 y 4, más adelante) y debido a su capacidad para
interaccionar con RET (véase, p. ej., Airaksinen y col., Mol.
Cell. Neuroscience, 13, pp. 313-325 (1999)), la
neublastina es un factor neurotrófico nuevo y único. A diferencia
de los ligandos GDNF, la neublastina presenta una alta afinidad por
el complejo receptor GFR\alpha3-RET y tiene
subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos.
En la invención se incluyen los ácidos nucleicos
de NBN y los polipéptidos que estos codifican. Los polipéptidos de
NBN son biológicamente activos como dímeros, y como monómeros tienen
poca o ninguna actividad. En un aspecto, la invención proporciona
un polipéptido de neublastina truncado, en el que el extremo amino
del polipéptido de neublastina truncado carece de uno o más
aminoácidos amino-terminales de un polipéptido de
neublastina maduro. Preferiblemente, el polipéptido de neublastina
truncado, cuando dimeriza, se une a un polipéptido RET.
Preferiblemente, el polipéptido de neublastina truncado activo
induce la dimerización del polipéptido RET.
En algunas realizaciones, el polipéptido de
neublastina truncado incluye 7 restos de cisteína en las posiciones
correspondientes a las posiciones 16, 43, 47, 80, 81, 109 y 111 del
polipéptido de neublastina del ID SEC Nº: 12 (maduro 113AA), que
corresponde, por ejemplo, a las posiciones 43, 70, 74, 107, 108,
136, 138 del ID SEC Nº:9. El ID SEC Nº:9 se numera de forma que los
restos de -80 a -1 corresponden a la sección prepro del polipéptido
de NBN traducido, y los restos 1-140 corresponden a
los 140 aminoácidos de NBN140 madura. Este esquema de numeración se
presenta sólo por conveniencia, y no debe sacarse ninguna deducción
de ella en relación a una cualquiera o más formas de NBN prepro,
pro, madura o truncada descritas en el presente documento.
También está dentro de la invención un
polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido de neublastina truncado. La secuencia de aminoácidos
del polipéptido de neublastina truncado tiene menos de 113
aminoácidos de longitud e incluye una secuencia de aminoácidos al
menos 70% homóloga con los aminoácidos 28-140 del
ID SEC Nº: 9.
En algunas realizaciones, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 80%
homóloga con los aminoácidos 42-140 del ID SEC Nº 9.
Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina truncado es al menos 90% homóloga con los aminoácidos
42-140 del ID SEC Nº 9. Incluso más
preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina truncado es al menos 95% homóloga con los aminoácidos
42-140 del ID SEC Nº 9. En otra realización, la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos
99% homóloga con los aminoácidos 42-140 del ID SEC
Nº 9. En las realizaciones más preferidas, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado comprende los
aminoácidos 42-140 del ID SEC Nº 9. En algunas
realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina truncado consiste esencialmente en 99 aminoácidos del ID
SEC Nº 48.
En algunas realizaciones, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es al menos 80%
homóloga con los aminoácidos 39-140 del ID SEC Nº 9.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina es al menos 90% homóloga con los aminoácidos
39-140 del ID SEC Nº 9. Más preferiblemente, la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina es al menos
95% homóloga con los aminoácidos 39-140 del ID SEC
Nº 9. En las realizaciones más preferidas, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado comprende los
aminoácidos 39-140 del ID SEC Nº 9. En otra
realización, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina es al menos 99% homóloga con los aminoácidos
39-140 del ID SEC Nº 9. En algunas realizaciones,
la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado
consiste esencialmente en los 102 aminoácidos del ID SEC Nº 45.
En otras realizaciones, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado es idéntico, o
al menos 80%, 90%, 95% o 99% homóloga con los aminoácidos
29-140 del ID SEC Nº: 9, y consta esencialmente de
112 aminoácidos. En realizaciones alternativas, la identidad o
porcentaje de homología mencionados antes es con respecto a los
aminoácidos 30-140 del ID SEC Nº: 9,
31-140 del ID SEC Nº: 9, 32-140 del
ID SEC Nº: 9, 33-140 del ID SEC Nº: 9,
34-140 del ID SEC Nº: 9, 35-140 del
ID SEC Nº: 9, 36-140 del ID SEC Nº: 9,
37-140 del ID SEC Nº: 9, 38-140 del
ID SEC Nº: 9, 40-140 del ID SEC Nº: 9 o
41-140 del ID SEC Nº:9. En estas realizaciones, la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina truncado
consiste esencialmente en 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104,
103, 101 o 100 aminoácidos, respectivamente. En realizaciones
específicas, el polipéptido de neublastina truncado es el
polipéptido de uno cualquiera de los ID SEC Nº: 35, 36, 37, 38, 39,
40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ó 48.
El polipéptido de neublastina truncado se puede
obtener proporcionando un polipéptido de neublastina maduro tal
como NBN113, y poniendo en contacto el polipéptido de neublastina
maduro con al menos una proteasa en condiciones suficientes para
producir el polipéptido de neublastina truncado. Preferiblemente, el
polipéptido de neublastina truncado se produce como un producto de
digestión del polipéptido de neublastina por exoproteasa poniendo
en contacto el polipéptido de neublastina maduro con al menos una
exoproteasa. Una proteasa preferida es una cualquiera de
aminopeptidasa, Endo Lys C y tripsina. En algunas realizaciones, el
procedimiento incluye poner además en contacto el producto de
digestión del polipéptido de neublastina por la exonucleasa con una
dipeptidil peptidasa.
En una realización, el polipéptido de
neublastina truncado es un polipéptido glicosilado. En una
realización alternativa, el polipéptido de neublastina truncado no
está glicosilado.
También está dentro de la invención un ácido
nucleico que incluye un polipéptido que incluye la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido de neublastina truncado. En algunas
realizaciones, el ácido nucleico hibrida específicamente en
condiciones de hibridación en solución muy restrictivas, con un
ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina
variante.
El ácido nucleico que codifica un polipéptido de
neublastina truncado se puede usar introduciendo el ácido nucleico
en una célula y haciendo que sea expresado el polipéptido codificado
por el ácido nucleico en una célula. Si se desea, el procedimiento
puede incluir la etapa de administrar el ácido nucleico a un animal
y hacer que el polipéptido sea expresado en el animal.
El ácido nucleico que codifica un polipéptido de
neublastina truncado se puede proporcionar como un vector, p. ej.,
un vector de expresión. El vector se puede usar para expresar el
polipéptido de neublastina truncado codificado.
La invención también incluye una célula
transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido que
incluye un polipéptido de neublastina truncado. La célula puede ser,
por ejemplo, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula
de levadura, una célula de insecto y una célula bacteriana. Una
célula de mamífero preferida es una célula de ovario de hámster
chino, o una célula derivada del sistema nervioso central de
mamífero.
En otro aspecto, la invención incluye un
procedimiento para hacer un polipéptido de neublastina truncado,
expresando un ácido nucleico que codifica un polipéptido de
neublastina truncado. Preferiblemente, el procedimiento incluye la
etapa de cultivar una célula que comprende el ácido nucleico en un
medio de cultivo que permite la producción del polipéptido de
neublastina truncado. El procedimiento también puede incluir la
etapa de recuperar el polipéptido del medio de cultivo. La
invención también proporciona un polipéptido de neublastina
truncado (p. ej., una proteína purificada) obtenida por el
procedimiento.
La invención también proporciona una composición
farmacéutica que incluye un polipéptido de neublastina truncado y
un vehículo farmacéuticamente aceptable. También está dentro de la
invención una composición farmacéutica que comprende un ácido
nucleico que codifica un polipéptido de neublastina truncado y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más, la invención proporciona un
procedimiento para administrar el polipéptido de neublastina
truncado suministrando el polipéptido a una célula aislada o in
vivo a un mamífero (tal como un ser humano). Preferiblemente,
la administración in vivo comprende la administración
sistémica. El mamífero puede padecer una afección tal como, p. ej.,
daño neuronal isquémico, lesión cerebral traumática, neuropatía
periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad
de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral
amiotrófica, y deterioro de la memoria. En algunas realizaciones, el
mamífero padece un trastorno neuronal de sistema nervioso
periférico, la médula o la médula espinal.
La invención también proporciona un
procedimiento para tratar una enfermedad neurodegenerativa o
trastorno en un mamífero, administrando al mamífero de un ácido
nucleico que codifica un polipéptido de neublastina truncado.
La invención también proporciona un
procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno
neurodegenerativos en un animal, administrando al animal el
polipéptido de neublastina truncado. En otro aspecto, la invención
presenta un procedimiento para tratar una neuropatía periférica en
un mamífero, que comprende administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido de neublastina truncado al
mamífero. La neuropatía periférica puede ser, p. ej., una o más de
neuropatías inducidas por traumatismo, neuropatías inducidas por
virus, neuropatías inducidas por quimioterapia, neuropatías
inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos,
neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías
idiopáticas; y neuropatías diabéticas. En algunas realizaciones, el
polipéptido de neublastina truncado se suministra directamente al
sistema nervioso central. En otras realizaciones, el polipéptido de
neublastina truncado se suministra preferiblemente sistémicamente
por inyección subcutánea, intramuscular, administración intravenosa
o infusión intravenosa.
También está dentro de la invención un
procedimiento para tratar el dolor neuropático en un mamífero, que
comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un
polipéptido de neublastina truncado al mamífero. En algunas
realizaciones, dolor neuropático asociado con daño de nervios
inducido por toxinas, daño de nervios inducido por patógenos, daño
de nervios inducido por inflamación, o neurodegeneración.
En otro aspecto, la invención presenta un
procedimiento para tratar una neuropatía periférica en un mamífero
administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido
nucleico que codifica el polipéptido de neublastina truncado al
mamífero. La neuropatía periférica preferiblemente es una o más de
neuropatías inducidas por traumatismo, neuropatías inducidas por
quimioterapia, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías
inducidas por virus, neuropatías inducidas por fármacos,
neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por
deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías
diabéticas. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica el
polipéptido de neublastina truncado se suministra directamente en el
sistema nervioso central. Preferiblemente, el ácido nucleico que
codifica el polipéptido de neublastina truncado se suministra de
forma sistémica por inyección subcutánea, administración
intravenosa o infusión intravenosa.
La invención también proporciona un kit que
incluye, en uno o más envases, una sustancia seleccionada del grupo
que consiste en un polipéptido de neublastina truncado y un ácido
nucleico que codifica un polipéptido de neublastina truncado.
Un "polipéptido de neublastina", tal como
se usa en el presente documento, es un polipéptido que tiene
actividad neurotrófica (p. ej., como se describe en los ejemplos 6,
7, 8 y 9) e incluye los polipéptidos que tienen una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología de al menos 70% con los
polipéptidos de "neublastina" humanos expuestos en los
AA_{95}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{1}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{97}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{41}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4 ("pro"),
AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{80}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9 ("tipo
salvaje" preproNBN), AA_{41}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 9 (proNBN), AA_{1}-AA_{140} del ID SEC
Nº: 5 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del ID SEC
Nº: 6 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113} del ID
SEC Nº: 7 (maduro 113AA), AA_{1}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 10 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del
ID SEC Nº: 11 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113}
del ID SEC Nº: 12 (maduro 113AA), y los polipéptidos truncados de
las variantes de los ID SEC Nº: 35-48 y derivados de
los mismos. Además, la invención contempla aquellos polipéptidos
que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de
homología con los polipéptidos de "neublastina" murinos
expuestos en los AA_{1}-AA_{224 }del ID SEC Nº:
16 o con los polipéptidos de neublastina de rata expuestos en los
AA_{1}-AA_{224} del ID SEC Nº: 34.
Preferiblemente, la secuencia
C-terminal de los polipéptidos de neublastina
identificados antes tiene una secuencia de aminoácidos como se
expone en los AA_{72}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2
(es decir,AA_{107}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9),
más preferiblemente AA_{41}-AA_{105} del ID SEC
Nº: 2 (es decir, AA_{76}-AA_{140} del ID SEC
Nº: 9), o la secuencia de aminoácidos expuesta en los
AA_{191}-AA_{224} del ID SEC Nº: 16 ó 34.
También se prefiere que el polipéptido de
neublastina retenga los 7 restos de Cys conservados que son
característicos de la familia de GDNF de la superfamilia de
TGF-beta. Los 7 restos de cisteína conservados se
localizan en las posiciones 16, 43, 47, 80, 81, 109 y 111 del
polipéptido de neublastina de ID SEC Nº: 12 (maduro 113AA). Estas
corresponden, por ejemplo, a las posiciones 43, 70, 74, 107, 108,
136 y 138 del ID SEC Nº: 9, o, por ejemplo, a las posiciones 127,
154, 158, 191, 192, 220 y 222 de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
Preferiblemente, el polipéptido de neublastina
tiene una secuencia de aminoácidos que con una homología mayor de
85%, más preferiblemente con una homología mayor de 90%, más
preferiblemente con una homología mayor que 95%, lo más
preferiblemente con una homología mayor que 99%, con las secuencias
anteriores (AA_{95}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{1}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{97}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{41}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{80}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9 ("tipo
salvaje" prepro), AA_{41}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 9 (pro), AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº:
5 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del ID SEC
Nº: 6 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113} del ID SEC
Nº: 7 (maduro 113AA), AA_{1}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 10 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del
ID SEC Nº: 11 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113}
del ID SEC Nº: 12 (maduro 113AA), y
AA_{1}-AA_{224} del ID SEC Nº: 16 ó 34, y de los
ID SEC Nº: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 y 48
(NBN112 truncada a NBN99, respectiva-
mente).
mente).
Un "ácido nucleico de neublastina", tal
como se usa en el presente documento, es un polinucleótido que
codifica un polipéptido de neublastina. Por consiguiente, un ácido
nucleico de neublastina aislado es una molécula de polinucleótido
que tiene un marco de lectura abierto de codones de nucleótidos que,
si se expusiera a los componentes adecuados necesarios para la
traducción, codificaría o codifica un polipéptido de neublastina.
Los ácidos nucleicos de neublastina de la invención pueden ser ARN o
ADN, p. ej., ADN genómico, o ADN que es complementario de y/o se ha
transcrito de un ARNm de neublastina ("ADNc"). Por lo tanto, un
ácido nucleico de neublastina de la invención incluye además
moléculas de polinucleótido que hibridan con especificidad, en
condiciones de hibridación de restricción alta, con un
polinucleótido que codifican un polipéptido de neublastina. Esta
invención también se refiere a cebadores de ácido nucleico que son
útiles para identificar, aislar y amplificar polinucleótidos que
codifican polipéptidos de neublastina, o fragmentos de los mismos.
En determinadas realizaciones de la invención, algunos de estos
cebadores son sondas específicas de neublastina útiles para
hibridar con un ácido nucleico de neublastina, pero no con ácidos
nucleicos que codifican otros miembros de la familia de GDNF. Por
"específico", "especificidad" o "específicamente", se
entiende la capacidad para hibridar con ácido nucleico de
neublastina e incapacidad para hibridar con ácidos nucleicos que no
son de neublastina, incluyendo una incapacidad para hibridar con
ácidos nucleicos que codifican solamente los otros ligandos GDNF (p.
ej., GDNF, persefina y neurturina).
En otra realización, un ácido nucleico de
neublastina de la invención es uno que se identifica como
complementario de un polinucleótido que codifica un polipéptido de
neublastina, o bien tener una secuencia de ácido nucleico
complementaria o por demostrar que hibrida con especificidad en
condiciones de hibridación muy restrictivas con un polinucleótido
que codifica la neublastina. Los ácidos nucleicos de neublastina
particulares incluyen, sin limitación, las secuencias de ácidos
nucleicos mostradas en el presente documento y designadas ID SEC
Nº: 1, ID SEC Nº: 3, ID SEC Nº: 8, ID SEC Nº: 13, ID SEC Nº: 14, ID
SEC Nº: 15, ID SEC Nº: 29 e ID SEC Nº: 30, así como los cebadores
de ID SEC Nº: 17-28, 31 y 32. Un ácido nucleico de
neublastina de la invención incluye además una subregión única, o
fragmento, de un ácido nucleico de neublastina, que incluye sin
limitación los fragmentos de ácidos nucleicos mostrados en la fig.
8.
Los ácidos nucleicos de neublastina de la
invención se pueden usar para expresar un polipéptido de
neublastina, p. ej., expresando un polipéptido de neublastina in
vivo, o administrando un ácido nucleico de neublastina a un
animal para la expresión in vivo. Los ácidos nucleicos de
neublastina pueden incluirse dentro de un vector de ácido nucleico,
p. ej., un vector de expresión o un vector de clonación. Un ácido
nucleico de neublastina se puede, pero no es necesario, mantener,
reproducir, transferir o expresar como parte de un vector de ácido
nucleico. Se puede introducir y/o mantener dentro de la célula un
vector de expresión recombinante que contiene una secuencia de
polipéptido de neublastina. Las células que hospedan un vector de
neublastina pueden ser procariotas. Alternativamente, se puede
introducir un ácido nucleico de neublastina en una célula eucariota,
p. ej., una célula eucariota que contiene los mecanismos adecuados
para el procesamiento postraduccional de un polipéptido en una
proteína madura y/o los mecanismos adecuados para segregar un
polipéptido en el entorno extracelular de la célula.
La invención presenta además por un factor
neurotrófico neublastina, "neublastina". La neublastina puede
estar en forma de un polipéptido o puede ser un multímero de dos o
más polipéptidos de neublastina, p. ej., un dímero de neublastina.
Los polipéptidos de neublastina se asocian como multímeros por
asociaciones estructurales intermoleculares que conocen los
expertos en la materia, incluyendo sin limitación, interacción
cisteína-cisteína, enlaces disulfuro e
interacciones no covalentes. Los polipéptidos de neublastina
particulares incluyen, sin limitación, una secuencia de aminoácidos
descrita en el presente documento y designada ID SEC Nº: 2; ID SEC
Nº: 4; ID SEC Nº: 5; ID SEC Nº: 6; ID SEC Nº: 7; ID SEC Nº: 9; ID
SEC Nº: 10; ID SEC Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 16, ID SEC Nº:
34 e ID SEC Nº: 35-48. Preferiblemente, los
polipéptidos de neublastina de la presente invención, cuando
dimerizan se unen a RET. Más preferiblemente, los presentes
polipéptidos de neublastina, cuando dimerizan inducen la
dimerización de RET. La dimerización de RET en la superficie de una
célula conduce a la autofosforilación del dímero de RET y
finalmente a la activación de RET mediante cascada de señalización
intracelular.
Un polipéptido de neublastina de la invención es
útil para tratar un defecto en una neurona, incluyendo sin
limitación, neuronas lesionadas y neuronas traumatizadas. Los
nervios periféricos que experimentan traumatismo incluyen, pero no
se limitan a nervios de la médula o de la médula espinal. Los
polipéptidos de neublastina son útiles en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, p. ej., daño neuronal isquémico
cerebral; neuropatía, p. ej., neuropatía periférica, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson,
esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Los polipéptidos de
neublastina se contemplan además para usar en el tratamiento de la
memoria deteriorada, p. ej., deterioro de la memoria asociado con
demencia.
Son ejemplos adicionales de afecciones o
enfermedades los trastornos del sistema nervioso periférico, la
médula o la médula espinal, así como neuropatías inducidas por
traumatismo, neuropatías inducidas por quimioterapia, neuropatías
inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos,
neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por
deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías
diabéticas, dolor neuropático asociado con el daño de nervios
inducido por toxinas, daño de nervios inducido por patógenos, daño
de nervios inducido por inflamación o neurodegeneración. Los
ejemplos adicionales de neuropatías periféricas incluyen
neuropatías inducidas por traumatismo, neuropatías inducidas por
quimioterapia, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías
inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencia de
vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas.
Salvo que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende habitualmente el experto en
la materia a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar
procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos
en el presente documento en la práctica o ensayo de la invención,
se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados.
Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, y otras
referencias mencionadas en el presente documento, se incorporan por
referencia en su totalidad. En caso de conflicto, controla la
presente memoria descriptiva, incluyendo las defini-
ciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
ciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y
reivindicaciones.
la fig. 1 es una imagen fotográfica de dos
transferencias northern con sondas de ADNc de neublastina marcadas
con ^{32}P, que compara los niveles de expresión relativos del gen
de neublastina en diferentes tipos de tejidos humanos de adulto
(panel A) y en diferentes regiones del cerebro humano de adulto
(panel B).
la fig. 2 es una imagen fotográfica de una
transferencia northern con sonda de ADNc de neublastina marcada con
^{32}P, que compara la cantidad de ADNc de neublastina expresado
en una línea celular no transfectada, HiB5, con la cantidad de ADNc
de neublastina expresado en una línea celular transfectada con ADNc
de neublastina, y con una línea celular transfectada con ADNc de
GDNF.
la fig. 3 es una imagen fotográfica de dos
transferencias western que comparan los grados con los que se
expresa la proteína de neublastina en células HiB5 no transfectadas
(calle 1) con respecto a una línea celular HiB5 transfectada
establemente con ADNc de neublastina (calle 2) con sonda del
anticuerpo Ab-2 específico de neublastina
(transferencia izquierda; panel A) o del anticuerpo
Ab-1 específico de neublastina (transferencia de la
derecha, Panel B).
la fig. 4 es una ilustración gráfica del efecto
de la neublastina en la supervivencia de neuronas mesencefálicas
ventrales, dopaminérgicas, embrionarias de rata cultivadas y la
actividad de ChAT en las neuronas motoras de nervios craneales
colinérgicos en medio sin suero. En particular, la Fig. 4A es una
ilustración de la curva de respuesta a la dosis para GDNF
recombinante en la actividad de ChAT (dpm/hora). La figura 4B es una
ilustración de la actividad de ChAT (dpm/hora) usando medio
condicionado diluido de células que producen neublastina o células
que producen GDNF. La fig. 4C es una ilustración del número de
células inmunorreactivas para la tirosina hidroxilasa por
pocillo.
la fig. 5 es una ilustración del efecto de la
neublastina segregada de células HiB5pUbi1zNBN22 en la función y
supervivencia de cultivos de láminas de neuronas mesencefálicas
ventrales, dopaminérgicas, embrionarias de cerdo cocultivadas con
células HiB5pUbi1zNBN22 (neublastina) o células HiB5 (control). La
fig. 5A y fig. 5B ilustran la dopamina liberada al medio en DIV12
(dopamina (pmol/l) - días 12) y DIV21 (dopamina (pmol/ml) - día
21), respectivamente. La fig. 5C es una ilustración del número de
células inmunorreactivas para la tirosina hidroxilasa por cultivo
(células TH-ir por cultivo) en DIV21.
la fig. 6 es una ilustración del efecto in
vivo de la neublastina producida por lentivirus en neuronas
nigrales dopaminérgicas.
la fig. 7 es un diagrama esquemático de la
estructura genómica del gen de neublastina, que incluye cebadores
de ácido nucleico que se pueden usar para identificar el gen de
neublastina de longitud completa, y su orientación espacial
respecto a la secuencia genómica que codifica la neublastina (es
decir, el gen).
la fig. 8 es una ilustración de los cebadores
específicos de neublastina usados para identificar el clon de ADNc
que codifica el polipéptido de neublastina humana que hibrida con
ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de neublastina, pero no
hibridan con ácidos nucleicos que codifican los otros miembros
conocidos de la familia de GDNF (es decir, GDNF, persefina y
neurturina).
la fig. 9 ilustra la actividad neurotrófica en
cultivos de células de ganglios de la raíz dorsal de rata
disociadas de diferentes estados de desarrollo, de un polipéptido
descrito en la presente invención comparado con los obtenidos con
factores neurotróficos conocidos (0 experimento de control (en
ausencia de factores); 1 en presencia de GDNF; 2 en presencia de
neurturina; 3 en presencia de la neublastina de la invención; E12,
día embrionario 12; E16, día embrionario 16; P0, día del nacimiento;
P7, día 7 después del nacimiento; y P15, día 15 después del
nacimiento).
la fig. 10 ilustra la producción de neublastina
de líneas celulares CHO.
la fig. 11 ilustra una comparación de la unión
de neublastina y GDNF a los receptores GFR\alpha-1
y GFR\alpha3.
la fig. 12 es una imagen fotográfica de una
transferencia western que ilustra la unión del anticuerpo
antipéptido R30 y anticuerpo antipéptido R31 a la neublastina.
la fig. 13 es una imagen de un gel que muestra
la extracción de neublastina por unión por afinidad a
RETL3-Ig.
la fig. 14 es un mapa de plásmido de
pET19b-Neublastina, junto con la secuencia del gen
sintético para la neublastina.
la fig. 15 es un mapa de plásmido de
pMJB164-HisNeublastina, junto con la secuencia del
gen sintético para la His-neublastina.
la fig. 16 ilustra una comparación de una forma
de 102 aminoácidos de la neublastina truncada (NBN) y una forma de
113 aminoácidos de la neublastina en un ensayo de activación celular
de RET.
la fig. 17 ilustra una comparación de diferentes
formas de neublastina o muteínas de neublastina en un ensayo de
activación celular de RET.
la fig. 18 ilustra una comparación de diferentes
formas madura (113 aa) y truncada (106 aa, 104 aa o 99 aa) de la
neublastina o muteínas R14K de neublastina en un ensayo celular
ELISA KIRA.
Los autores de la invención han identificado un
ácido nucleico que codifica un nuevo factor neurotrófico que en el
presente documento se denomina "neublastina" o "NBN". La
neublastina es un miembro de la subclase de factores neurotróficos
derivados de líneas celulares gliales (GDNF) de la superfamilia del
factor de crecimiento transformante \beta
(TGF-\beta) de los factores neurotróficos. Los
polipéptidos de NBN son biológicamente activos como dímeros, y
tienen poca o no tienen actividad neurotrófica como monómeros. Por
lo tanto, la referencia en el presente documento a cualquier
polipéptido de neublastina de la invención se entiende que designa
la forma homodimérica de la neublastina designada, salvo que se
especifique lo contrario.
El ADNc que codifica la neublastina se
identificó originalmente como sigue. Usando el algoritmo TBLASTN
1.4.11 (Atschul y col., Nucl. Acids Res., 25, pp.
3389-3402 (1997)) y la persefina humana como
consulta (GenBank nº de acceso AF040962), inicialmente se
identificó un fragmento de 290 pb en la base de datos
High-Throughput Genomic Sequence (HTGS) de dos
cromosomas artificiales bacterianos humanos (BAC) con los accesos en
GenBank AC005038 y AC005051. AC005038 consiste en aproximadamente
190.000 pb de 5 cóntigos de secuencias desordenadas, y AC0005051
consiste en aproximadamente 132.000 pb de 12 cóntigos de secuencias
desordenadas. El fragmento de 290 pb identificado en los dos clones
BAC demostró tener regiones que eran homólogas, pero no idénticas,
con una región de codificación del ADNc del factor neurotrófico, la
persefina humana.
A partir de esta secuencia de 290 pb se
sintetizaron dos cebadores de PCR específicos de neublastina
(cebador de la cadena superior (ID SEC Nº: 17) y cebador de la
cadena inferior (ID SEC Nº: 18)). Se llevó a cabo el cribado de la
biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano. El cribado inicial
comprendía el cribado basado en PCR en 96 pocillos con dos
cebadores de PCR (ID SEC Nº: 17 y 18) de una "Placa principal"
de la biblioteca de ADNc de 500.000 clones de ADNc que contenía
aproximadamente 5.000 clones/pocillo. Se llevó a cabo un segundo
cribado basado en PCR en una "Subplaca" de la biblioteca de
ADNc de cerebro fetal humano que contenía solución madre en
glicerol de E. coli con aproximadamente 5.000
clones/pocillo.
Se identificó un fragmento de 102 pb (ID SEC Nº:
13) en los cribados basados en PCR tanto de la placa principal como
de la subplaca. Se seleccionó un clon de ADNc positivo (que tenía un
fragmento de 102 pb), se puso en dos placas que contenían
LB/antibiótico, y se hicieron crecer toda la noche. De estas placas,
se seleccionaron u total de 96 colonias bacterianas y se pusieron
individualmente en los pocillos de una nueva placa de PCR de 96
pocillos que contenía tanto los cebadores de la PCR (ID SEC Nº 17 y
18) como los reactivos necesarios para la amplificación por PCR.
Después se llevó a cabo la amplificación por PCR y se analizaron las
96 reacciones de PCR individuales mediante electroforesis en gel de
agarosa al 2%. Después se identificó la colonia positiva con el
clon que contenía el fragmento de 102 pb. El ADN del plásmido se
obtuvo de la colonia positiva que contenía el fragmento de 102 pb y
se secuenció. El posterior análisis de secuenciación puso de
manifiesto la presencia de un ADNc de longitud completa de 861 pb
(ID SEC Nº: 8). El marco de lectura abierto (ORF) de 663 pb,
también denominado la región codificante (CDS), identificada en el
ID SEC Nº: 8, codifica el
pre-pro-polipéptido (denominado
"pre-pro-neublastina") y se
muestra en el ID SEC Nº: 9. De acuerdo con el ID SEC Nº: 9, se
identificaron tres variantes de polipéptidos de neublastina. Estas
variantes incluyen:
(i) el polipéptido de 140 AA denominado en el
presente documento NBN140, que tiene la secuencia de aminoácidos
designada como ID SEC Nº: 10;
(ii) el polipéptido de 116 AA denominado en el
presente documento NBN116, que tiene la secuencia de aminoácidos
designada como ID SEC Nº: 11;
(iii) el polipéptido de 113 AA denominado en el
presente documento NBN113, que tiene la secuencia de aminoácidos
designada como ID SEC Nº: 12.
Otras variantes de la neublastina incluyen las
formas de NBN truncadas. Los ejemplos de estas incluyen:
(iv) la secuencia de polipéptido de 112 AA
designada en el presente documento como NBN112, que tiene los 112
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 29-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 35) o los aminoácidos 113-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(v) la secuencia de polipéptido de 111 AA
designada en el presente documento como NBN111, que tiene los 111
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 30-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 36) o los aminoácidos 114-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(vi) la secuencia de polipéptido de 110 AA
designada en el presente documento como NBN110, que tiene los 110
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 31-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 37) o los aminoácidos 115-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(vii) la secuencia de polipéptido de 109 AA
designada en el presente documento como NBN109, que tiene los 109
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 32-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 38) o los aminoácidos 116-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(viii) la secuencia de polipéptido de 108 AA
designada en el presente documento como NBN108, que tiene los 108
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 33-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 39) o los aminoácidos 117-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(ix) la secuencia de polipéptido de 107 AA
designada en el presente documento como NBN107, que tiene los 107
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 34-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 40) o los aminoácidos 118-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(x) la secuencia de polipéptido de 106 AA
designada en el presente documento alternativamente como NBN106 o
N-7, que tiene los 106 aminoácidos
carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina,
p. ej., los aminoácidos 35-140 del ID SEC Nº: 9 (ID
SEC Nº: 41) o los aminoácidos 119-224 de los ID SEC
Nº: 16 ó 34.
(xi) la secuencia de polipéptido de 105 AA
designada en el presente documento como NBN105, que tiene los 105
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 36-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 42) o los aminoácidos 120-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(xii) la secuencia de polipéptido de 104 AA
designada en el presente documento alternativamente como NBN104 o
N-9, que tiene los 104 aminoácidos
carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina,
p. ej., los aminoácidos 37-140 del ID SEC Nº: 9 (ID
SEC Nº: 43) o los aminoácidos 121-224 de los ID SEC
Nº: 16 ó 34.
(xiii) la secuencia de polipéptido de 103 AA
designada en el presente documento como NBN103, que tiene los 103
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 38-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 44) o los aminoácidos 122-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(xiv) la secuencia de polipéptido de 102 AA
designada en el presente documento como NBN102, que tiene los 102
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 39-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 45) o los aminoácidos 123-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(xv) la secuencia de polipéptido de 101 AA
designada en el presente documento como NBN101, que tiene los 101
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 40-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 46) o los aminoácidos 124-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(xvi) la secuencia de polipéptido de 100 AA
designada en el presente documento como NBN100, que tiene los 100
aminoácidos carboxi-terminales de un polipéptido de
neublastina, p. ej., los aminoácidos 41-140 del ID
SEC Nº: 9 (ID SEC Nº: 47) o los aminoácidos 125-224
de los ID SEC Nº: 16 ó 34.
(xvii) la secuencia de polipéptido de 99 AA
designada en el presente documento alternativamente como NBN99 o
N-14, que tiene los 99 aminoácidos
carboxi-terminales de un polipéptido de neublastina,
p. ej., los aminoácidos 42-140 del ID SEC Nº: 9 (ID
SEC Nº: 48) o los aminoácidos 126-224 de los ID SEC
Nº: 16 ó 34.
Los polipéptidos de neublastina descritos en el
presente documento se pueden proporcionar en cualquier forma
bioactiva que incluye la forma de
pre-pro-proteínas,
pro-proteínas, proteínas maduras, proteínas
glicosiladas, proteínas no glicosiladas, proteínas fosforiladas,
proteínas no fosforiladas, formas truncadas, o cualquier otra
proteína modificada postraduccionalmente. Se supone que una
neublastina bioactiva está en la forma dimerizada para cada
variante de la NBN, cuando se requiere la formación de dímero para
la actividad. Se observa poca o no se observa actividad
neurotrófica en un polipéptido de NBN monómero. Un polipéptido de
neublastina bioactivo incluye un polipéptido dimerizado, que en
presencia de un cofactor (tal como GFR\alpha3 o RET), se une a
GFR\alpha3 o a un complejo de GFR\alpha3 y RET, induce la
dimerización de RET y autofosforila RET. Se entiende que las formas
truncadas de la neublastina descritas en el presente documento (p.
ej. las formas de 112AA, 111AA, 110AA, 109AA, 108AA, 107AA, 106AA,
105AA, 104AA, 103AA, 102AA, 101AA, 100AA o 99AA, mostradas en los
ID SEC Nº: 35-48, respectivamente), así como todos
los demás polipéptidos de NBN descritos antes, son dímeros, y que
cada dímero tiene actividad neurotrófica.
La secuencia de ADNc entera que contiene ADN 5'
no traducido de 782 pb, ADN codificante de 663 pb y 3' no traducido
de 447 (en total 1992 pb), se ha enviado a GenBank con el número de
acceso AF 120274.
La secuencia genómica que codifica la
neublastina se identificó como sigue:
Con el objetivo de clonar la secuencia genómica
que codifica la neublastina, se preparó un grupo adicional de
cebadores. En particular, la pareja de cebadores nº 1 comprendía
(cadena homosentido mostrada como en el ID SEC Nº: 23 y antisentido
mostrada como el ID SEC Nº: 24) y la pareja de cebadores nº 2
comprendía (cadena homosentido mostrada como el ID SEC Nº: 25 y
antisentido mostrada como el ID SEC Nº: 26).
Usando la pareja de cebadores nº 2, se amplificó
un segmento de ADN de 887 pb por PCR a partir de una preparación de
ADN genómico humano, y se clonó en el vector pCRII (Invitrogen) y se
transformó en E. coli. El plásmido resultante se secuenció y
se predijo una secuencia de ADNc putativo de 861 pb (que codifica
una proteína denominada neublastina en el presente documento)
(expuesta como el ID SEC Nº: 3). De forma similar, usando la pareja
de cebadores nº 1, se obtuvo un fragmento de ADN de 870 pb por PCR
de ADN genómico humano. En este fragmento se encontró una región
adicional de 42 pb en el extremo 3' del marco de lectura abierto
(ORF), en comparación a la secuencia de 887 pb. La estructura
genómica del gen de la neublastina se predijo por comparación con
las secuencias de ácidos nucleicos de otros factores neurotróficos,
mediante cartografía de los límites exón-intrón.
Este análisis demostraba que el gen de neublastina tiene al menos
dos exones separados por un intrón de 70 pb.
Esta secuencia también se usó para cribar la
secuencia EST de neublastina en GenBank. Se identificaron tres con
los accesos en GenBank AA844072, AA931637 y AA533512, que indicaba
que los ácidos nucleicos de neublastina se transcriben a ARNm.
La comparación de la secuencia de ADNc entero
obtenida (AF 120274) y la secuencia genómica presente en GenBank
con los accesos AC005038 y AC005051 puso de manifiesto que el gen de
neublastina consiste en al menos cinco exones (que incluyen tres
codificantes) separados por cuatro intrones (véase, p. ej., la fig.
7). Juntos los exones tienen una secuencia de aminoácidos prevista
de un polipéptido de neublastina de longitud completa. Debe
indicarse también que se encontró que el fragmento de 887 pb
contenía la región codificante completa de la
pro-neublastina. El ADNc previsto (ID SEC Nº: 3)
contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica la
pro-neublastina (181 restos de aminoácidos) que
mostraba homología con las tres proteínas humanas conocidas
(persefina, neurturina y GDNF). Véase la Tabla 3 en los
ejemplos.
En otro aspecto, la invención proporciona
polinucleótidos capaces de expresar los polipéptidos de la
invención. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias
de ADN, ADNc y ARN, así como secuencias antisentido, e incluyen
polinucleótidos naturales, sintéticos y modificados deliberadamente.
Los polinucleótidos de la invención también incluyen secuencias que
son degeneradas como resultado del código genético, pero que
codifican para la expresión de un polipéptido de neublastina.
Como se define en el presente documento, el
término "polipéptido" se refiere a una forma polímera de
nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, preferiblemente al
menos 15 bases de longitud. Por "polinucleótido aislado" se
entiende un polinucleótido que no está inmediatamente contiguo a
ambas secuencias codificantes con las que está inmediatamente
contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma
natural del organismo del cual se obtiene. Por lo tanto, el término
incluye ADN recombinante que se incorpora en un vector de expresión,
en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN
genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una
molécula separada, p. ej., un ADNc, independiente de otras
secuencias.
Los polinucleótidos de la invención también
incluyen variantes alélicas y "polinucleótidos mutados" que
tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias
de nucleótidos presentadas en el presente documento en una o más
posiciones de nucleótidos.
En una realización preferida, el polinucleótido
de la invención tiene una secuencia de ácido nucleico (ADN) capaz
de hibridar con la secuencia de polinucleótido presentada como ID
SEC Nº: 1, la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC
Nº: 3, la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 8,
o la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 15, su
cadena complementaria, o una subsecuencia de las mismas en
condiciones de restricción al menos media, media/alta o alta, como
se describe con más detalle a conti-
nuación.
nuación.
En otra realización preferida, el polinucleótido
aislado de la invención tiene una secuencia de ácido nucleico (ADN)
que es al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más
preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, lo
más preferiblemente al menos 99% homóloga con la secuencia de
polinucleótido presentada como ID SEC Nº 1, la secuencia de
polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 3, la secuencia de
polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 8, o la secuencia de
polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 15.
En su realización más preferida, el
polinucleótido tiene la secuencia de ADN presentada como ID SEC Nº:
1, la secuencia de ADN presentada como ID SEC Nº: 3, la secuencia
de ADN presentada como ID SEC Nº: 8, o la secuencia de ADN
presentada como ID SEC Nº: 15.
Esta invención también proporciona cebadores y
secuencias de ADN nuevos para identificar, aislar y amplificar
polinucleótidos de neublastina que codifican la expresión de
polipéptidos de neublastina o fragmentos de los mismos. Dichos
cebadores incluyen los polinucleótidos expuestos en los ID SEC Nº:
17-28 y 31-32. Además, esta
invención proporciona secuencias de ADN de neublastina generadas a
partir de estos cebadores, que incluyen las expuestas en los ID SEC
Nº: 13 y 14. Además, esta invención proporciona secuencias de ADN de
las regiones 3' o 5' no traducidas ("UTR") en el ADN genómico
que flanquea los exones de neublastina; dichas secuencias son
útiles para identificar, aislar y amplificar polinucleótidos de
neublastina que codifican la expresión de polipéptidos de
neublastina o fragmentos de los mismos.
Las secuencias 3' UTR de esta invención incluyen
las secuencias expuestas en:
nucleótidos 721 - 865 del ID SEC Nº: 1,
nucleótidos 718 - 861 del ID SEC Nº: 3,
nucleótidos 718 - 861 del ID SEC Nº: 8,
nucleótidos 1647-2136 del ID SEC
Nº: 15, y
secuencias contiguas de entre
10-25 nucleótidos derivadas (es decir, que caen
dentro de) de las secuencias anteriores (que son útiles, p. ej.,
como cebadores).
Las secuencias 5' UTR de esta invención incluyen
las secuencias expuestas en:
nucleótidos 1-10 del ID SEC Nº:
1,
nucleótidos 1 - 57 del ID SEC Nº: 8,
nucleótidos 1-974 del ID SEC Nº:
15, y
secuencias contiguas de entre
10-25 nucleótidos derivadas (es decir, que caen
dentro de) de las secuencias anteriores (que son útiles, p. ej.,
como cebadores).
Los polinucleótidos de la invención se pueden
obtener preferiblemente por procedimientos de clonación, p. ej.,
como se describe en: "Current Protocols in Molecular Biology"
(John Wiley and Sons, Inc.). En una realización preferida, el
polinucleótido se clona de, o se produce a partir del ADN genómico
humano o una biblioteca de ADNc del cerebro humano.
La homología de la secuencia de ADN a la que se
ha hecho referencia antes se puede determinar como el grado de
identidad entre dos secuencias que indica una derivación de la
primera secuencia a partir de la segunda. La homología se puede
determinar adecuadamente mediante programas de ordenador conocidos
en la técnica, tales como GAP proporcionado en el paquete de
programas GCG (Needleman, S.B. and Wunsch CD., Journal of
Molecular Biology 1970 48,443-453). Usando GAP
con los siguientes parámetros para la comparación de secuencias de
ADN: penalización de 5,0 por la creación de hueco y penalización de
0,3 por la extensión de hueco, la región codificante de las
secuencias de ADN análogas a las que se ha hecho referencia antes,
presentan un grado de identidad preferiblemente de al menos 70%,
más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%,
más preferiblemente al menos 95%, lo más preferiblemente al menos
99%, con la parte de CDS (codificante) de la secuencia de ADN
mostrada en el ID SEC Nº 1, o la parte de CDS (codificante) de la
secuencia de ADN mostrada en el ID SEC Nº 3, o la parte de CDS
(codificante) de la secuencia de ADN mostrada en el ID SEC Nº 8, la
parte de CDS (codificante) de la secuencia de ADN mostrada en el ID
SEC Nº 15.
La expresión "identidad de secuencia" se
refiere al grado en el que son idénticas dos secuencias de
polinucleótidos en una base de nucleótido a nucleótido a lo largo
de una región particular de comparación. La expresión "porcentaje
de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias
alineadas de forma óptima a lo largo de una región de comparación,
determinando el número de posiciones en las que se encuentran bases
de ácidos nucleicos idénticas (p. ej., A, T, C, G, U o I) en ambas
secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo
el número de posiciones coincidentes entre el número total de
posiciones en la región de comparación (es decir, el tamaño de la
ventana), y multiplicando el resultado por 100, para dar el
porcentaje de la identidad de secuencia. La expresión "identidad
sustancial", tal como se usa en el presente documento, indica una
característica de una secuencia de polinucleótido, en la que el
polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 80 por
ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85 por
ciento de identidad y a menudo 90 a 95 por ciento de identidad de
secuencia, más habitualmente al menos 99 por ciento de identidad de
secuencia comparado con una secuencia de referencia a lo largo de
una región de comparación. Los procedimientos para determinar la
identidad de secuencia son bien conocidos para los expertos en la
materia. Véase, por ejemplo, Needleman y Wunsch J. Mol.
Biol. 1970 48,443-453.
La polinucleótidos de la invención son aquellos
que tienen una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con la
secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 1, la
secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº:3, o la
secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 8, o la
secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 15, o sus
cadenas complementarias, o una subsecuencia de las mismas en
condiciones de restricción al menos media, media/alta o alta, como
se describe con más detalle a continuación.
Las condiciones experimentales adecuadas para
determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una
secuencia de ADN o ARN homóloga, implica la inmersión previa del
filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridar en 5X
SSC (cloruro sódico/citrato sódico; véase, Sambrook y col.;
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989) durante 10 minutos, y
prehibridación del filtro en una solución de 5X SSC, 5X solución de
Denhardt (véase, Sambrook y col; citado antes), SDS al 0,5% y ADN
de esperma de salmón desnaturalizado por ultrasonidos 100 \mug/ml
(véase, Sambrook y col.; citado antes),seguido de
hibridación en la misma solución que contiene una concentración de
10 ng/ml de una sonda con cebador aleatorio (Feinberg A.P. &
Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13),
marcada con ^{32}P-dCTP (actividad específica
> 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aproximadamente
45ºC. Después el filtro se lava dos veces durante 30 minutos en
0,1X SSC, SDS al 0,5% a una temperatura de al menos 60ºC
(condiciones de restricción media), preferiblemente al menos 65ºC
(condiciones de restricción media/alta), más preferiblemente de al
menos 70ºC (condiciones de restricción alta) e incluso más
preferiblemente de al menos 75ºC (condiciones de restricción muy
alta). Las moléculas con las que hibrida la sonda de oligonucleótido
en estas condiciones se pueden detectar usando una película de
rayos X.
El polinucleótido aislado de la invención puede
ser en particular un polinucleótido clonado. Tal como se define en
el presente documento, la expresión "polinucleótido clonado" se
refiere a un polinucleótido o secuencia de ADN clonados de acuerdo
con los procedimientos de clonación estándar actualmente usadas en
ingeniería genética para cambiar de sitio un segmento de ADN, que
puede ser en particular ADNc, es decir, derivado enzimáticamente de
ARN, de su localización natural a un sitio diferente donde será
reproducido. El polinucleótido clonado de la invención puede
codificar cualquiera de los polinucleótidos de NBN descritos en el
presente documento, incluyendo, pero sin limitar, los
polinucleótidos mostrados en los ID SEC Nº: 2, 4-7,
9-12, 16, 34 y 35-48.
La clonación se puede realizar por cualquier vía
adecuada y puede implicar técnicas tales como la tecnología de la
transcriptasa inversa, tecnología de la PCR, y similares, así como
la escisión y aislamiento del segmento de ADN deseado.
El polinucleótido clonado de la invención se
puede denominar alternativamente "construcción de ADN" o
"secuencia de ADN aislada", y puede ser en particular un ADN
complementario (ADNc).
El polinucleótido aislado de la invención se
puede obtener de cualquier fuente adecuada.
En una realización preferida, el polinucleótido
de la invención se clona de, o se produce a partir de una
biblioteca de ADNc, p. ej., de una biblioteca de ADNc de cerebro
fetal o adulto, en particular del cerebro anterior, el metencéfalo,
la corteza, el cuerpo estriado, la amígdala, el cerebelo, el núcleo
caudado, el cuerpo calloso, el hipocampo, el núcleo talámico, el
núcleo subtalámico, el núcleo olfativo, el putamen, la sustancia
negra, los ganglios de la raíz dorsal, el ganglio del trigémino, la
arteria mesentérica superior o el tálamo; de la médula espinal; del
corazón, la placenta; del pulmón; del hígado; del músculo
esquelético; del riñón; del hígado; del páncreas; de los
intestinos; del ojo; de la retina; de la pulpa dentaria; del
folículo del pelo; de la próstata; de la pituitaria; o de la
tráquea.
Las bibliotecas de ADNc comerciales de una
variedad de tejidos, tanto humanos como no humanos, están
disponibles, por ejemplo en Stratagene y Clontech. El
polinucleótido aislado de la invención se puede obtener por
procedimientos estándar, p. ej., los descritos en los ejemplos de
trabajo.
Como se ha indicado antes, un "polipéptido de
neublastina", como se usa en el presente documento, es un
polipéptido que tiene actividad neurotrófica (p. ej., como se
describe en los ejemplos 6, 7, 8 y 9) e incluye los polipéptidos
que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de
homología con los polipéptidos de "neublastina" expuestos en
los AA_{95}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{1}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{97}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{41}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{80}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9 ("tipo
salvaje" prepro), AA_{41}-AA_{140} del ID SEC
Nº: 9 (pro), AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº: 5
(maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del ID SEC Nº: 6
(maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113} del ID SEC Nº:
7 (maduro 113AA), AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº:
10 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del ID SEC
Nº: 11 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113} del ID
SEC Nº: 12 (maduro 113AA), AA_{1}-AA_{224} del
ID SEC Nº: 16 (prepro murino), AA_{1}-AA224 del ID
SEC Nº: 34 (prepro de rata), forma truncada de NBN112 a NBN99 (ID
SEC Nº: 35-48, respectivamente), y variantes y
derivados de cada uno de los anteriores.
Preferiblemente, la secuencia
C-terminal de los polipéptidos de neublastina
identificados antes tiene una secuencia de aminoácidos como se
expone en los AA_{72}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2
(es decir,AA_{107}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9),
más preferiblemente AA_{41}-AA_{105} del ID SEC
Nº: 2 (es decir,AA_{76}-AA_{140} del ID SEC Nº:
9).
Además, se prefiere que el polipéptido de
neublastina retenga los 7 restos de Cys conservados que son
característicos de la familia de GDNF y de la superfamilia de
TGF-beta.
Preferiblemente, el polipéptido de neublastina
tiene una secuencia de aminoácidos con una homología mayor que 85%,
más preferiblemente homología mayor que 90%, más preferiblemente
homología mayor que 95%, lo más preferiblemente homología mayor que
99%, con las secuencias anteriores (es decir,
AA_{95}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{1}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2,
AA_{97}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{41}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº: 4,
AA_{80}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9 ("tipo
salvaje" prepro), AA_{41}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 9 (pro), AA_{1}-AA_{140} del ID SEC Nº:
5 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del ID SEC
Nº: 6 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113} del ID SEC
Nº: 7 (maduro 113AA), AA_{1}-AA_{140} del ID
SEC Nº: 10 (maduro 140AA), AA_{1}-AA_{116} del
ID SEC Nº: 11 (maduro 116AA), AA_{1}-AA_{113}
del ID SEC Nº: 12 (maduro 113AA),
AA_{1}-AA_{224} del ID SEC Nº: 16 (prepro
murino), AA_{1}-AA224 del ID SEC Nº: 34 (prepro
de rata), polipéptidos de neublastina truncados NBN112 a NBN99 (ID
SEC Nº: 35-48, respectivamente), y preferiblemente
cualquiera de los polipéptidos anteriores con una secuencia
C-terminal de los polipéptidos de neublastina
identificados antes tiene una secuencia de aminoácidos como se
expone en los AA_{72}-AA_{105} del ID SEC Nº: 2
(es decir,AA_{107}-AA_{140} del ID SEC Nº: 9),
más preferiblemente AA_{41}-AA_{105} del ID SEC
Nº: 2 (es decir,AA_{76}-AA_{140} del ID SEC Nº:
9) o AA_{191}-AA_{224} de los ID SEC Nº: 16 ó
34.
Además, esta invención contempla aquellos
polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una
homología de al menos 70% con los polipéptidos de "neublastina"
murinos expuestos en los AA_{1}-AA_{224} del ID
SEC Nº: 16, o polipéptidos de neublastina de rata expuestos en los
AA_{1}-AA_{224} del ID SEC Nº: 34.
Entre los polipéptidos preferidos de la
invención, una realización representa la
pre-pro-secuencia (como se expone
en los ID SEC Nº: 2, 4, 9, 16 y 34, respectivamente), la
pro-secuencia (como se expone en los AA_{75}-
AA_{105} del ID SEC Nº: 2, o AA_{41}-AA_{140}
de los ID SEC Nº: 4 y 9, respectivamente), la secuencia madura
(como se expone en los ID SEC Nº: 5, 6, 7, 10, 11 ó 12,
preferiblemente ID SEC Nº: 10, 11, 12), y más preferiblemente las
secuencias truncadas (ID SEC Nº: 35-48) de la
neublastina.
Los polipéptidos de la invención incluyen
variantes de polipéptidos. En el contexto de esta invención, la
expresión "variante de polipéptido" significa un polipéptido (o
proteína) que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de las
secuencias presentadas en los ID SEC Nº: 2, ID SEC Nº: 4, ID SEC Nº:
5, ID SEC Nº: 6, ID SEC Nº: 7, ID SEC Nº: 9, ID SEC Nº: 10, ID SEC
Nº: 11, ID SEC Nº: 12, ID SEC Nº: 16, ID SEC Nº: 34 o ID SEC NºS:
35-48, en uno o más posiciones de aminoácidos.
Dichas variantes de polipéptidos incluyen los polipéptidos
modificados descritos antes, así como sustituciones conservativas,
variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras
especies y polimorfismos.
Como se define en el presente documento, la
expresión "sustituciones conservativas" indica la sustitución
de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar. Por
ejemplo, se esperaría que las sustituciones conservativas de
aminoácidos tuvieran poco o no tuvieran efecto en la actividad
biológica, en particular si representan menos del 10% del número
total de restos en el polipéptido o proteína. Preferiblemente, las
sustituciones conservativas de aminoácidos representan cambios en
menos del 5% de polipéptido o proteína, más preferiblemente menos
de 2% del polipéptido o proteína (p. ej., cuando se calcula de
acuerdo con NBN113, las sustituciones conservativas más preferidas
representarán menos de 3 sustituciones de aminoácidos en la
secuencia de aminoácidos de tipo salvaje). En una realización
particularmente preferida, hay una sola sustitución de aminoácido en
la secuencia, en la que tanto el aminoácido sustituido como el de
sustitución no son cíclicos.
Otros ejemplos de sustituciones particularmente
conservativas incluyen las sustituciones de un resto hidrófobo tal
como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la
sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de
arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por
asparagina, y similares.
La expresión sustitución conservativa también
incluye el uso de un resto de aminoácido sustituido en lugar de un
resto de aminoácido original no sustituido con la condición de que
los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también
inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
Por consiguiente, la expresión "variante de
sustitución conservativa" se refiere a un polipéptido de
neublastina que difiere de un polipéptido de neublastina de tipo
salvaje o de referencia por la presencia de al menos una
sustitución de aminoácido conservativa.
Las modificaciones de una secuencia primaria de
aminoácidos de neublastina pueden dar como resultado proteínas que
tienen actividad sustancialmente equivalente comparadas con el
polipéptido homólogo sin modificar, y por lo tanto se pueden
considerar análogos funcionales de las proteínas originales. Dichas
modificaciones puede ser deliberadas, p. ej., por mutagénesis de
sitio dirigida, o pueden ocurrir de forma espontánea, e incluye
variantes de corte y empalme, isoformas, homólogos de otras
especies, y polimorfismos. De acuerdo con la invención, también se
contemplan dichos análogos funcionales.
Además, las modificaciones de la secuencia
primaria de aminoácidos pueden dar como resultado proteínas que no
retienen la actividad biológica de la proteína original, incluyendo
las formas negativas dominantes, etc. Una proteína negativa
dominante puede interferir con la proteína salvaje mediante la unión
a o la retirada de otra forma de agentes de regulación, tal como
componentes secuencia arriba o secuencia abajo, que normalmente
interaccionan funcionalmente con el polipéptido. De acuerdo con la
invención, también se contemplan dichas formas negativas
dominantes.
Un "péptido señal" es una secuencia de
péptido que dirige un polipéptido recién sintetizado al que está
unido el péptido señal al retículo endoplásmico (ER) para el
posterior proceso postraduccional y distribución.
Un "péptido señal heterólogo", tal como se
usa en el presente documento en el contexto de la neublastina,
significa un péptido señal que no es el péptido señal de la
neublastina humana, sino normalmente el péptido señal de alguna
proteína de mamífero distinta de la neublastina.
Los expertos en la materia reconocerán que la
secuencia de ADN de neublastina humana (ADNc o ADN genómico) o las
secuencias que difieren del ADN de neublastina humana debido a
cambios de codones silenciosos o a cambios de codones que producen
sustituciones conservativas de aminoácidos, se pueden usar para
modificar genéticamente células humanas cultivadas de modo que
sobreexpresen y segreguen la enzima.
Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen polipéptidos quiméricos o polipéptidos de fusión
escindibles en los que otro polipéptido está fusionado al extremo N
o extremo C del polipéptido o un fragmento del mismo. Se puede
producir un polipéptido quimérico por fusión de una secuencia de
ácido nucleico (o una parte de la misma) que codifica otro
polipéptido con una secuencia de ácido nucleico (o parte de la
misma) de la presente invención.
Las técnicas para producir polipéptidos
quiméricos son técnicas estándar. Dichas técnicas normalmente
requieren la unión de secuencias de una forma que estén ambas en el
mismo marco de lectura, y la expresión del polipéptido fusionado
esté bajo el control del mismo o los mismos promotores y
terminador.
Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen formas truncadas del polipéptido de neublastina.
En dichas moléculas truncadas, se han eliminado uno o más
aminoácidos del extremo N o el extremo C, preferiblemente del
extremo N. Los polipéptidos de neublastina truncados incluyen los
polipéptidos humanos designados en el presente documento como
NBN112 (ID SEC Nº: 35), NBN111 (ID SEC Nº: 36), NBN110 (ID SEC Nº:
37), NBN109 (ID SEC Nº: 38), NBN108 (ID SEC Nº: 39), NBN107 (ID SEC
Nº: 40), NBN106 (ID SEC Nº: 41), NBN105 (ID SEC Nº: 42), NBN104 (ID
SEC Nº: 43), NBN103 (ID SEC Nº: 44), NBN102 (ID SEC Nº: 45), NBN101
(ID SEC Nº: 46), NBN100 (ID SEC Nº: 47) y NBN99 (ID SEC Nº: 48), y
los homólogos correspondientes de estos polipéptidos de neublastina
humana truncados, que incluyen pero no se limitan a neublastina de
rata y de ratón.
Por ejemplo, la invención incluye un polipéptido
de neublastina truncado cuyo extremo amino carece de uno o más
aminoácidos amino-terminales de un polipéptido de
neublastina. Es decir, el polipéptido de neublastina truncado
contiene el dominio de siete cisteínas de la neublastina. En algunas
realizaciones, el polipéptido de neublastina truncado incluye una
secuencia de aminoácidos con al menos 70% de homología con los
aminoácidos 12-113 del ID SEC Nº: 12, es
decir,NBN102 (ID SEC Nº: 45). Preferiblemente, el polipéptido de
neublastina truncado es al menos 85% homólogo con los aminoácidos
12-113 del ID SEC Nº: 12. Más preferiblemente, el
polipéptido de neublastina truncado es al menos 95% homologo con
los aminoácidos 12-113 del ID SEC Nº: 12. Lo más
preferiblemente, el polipéptido de neublastina truncado es al menos
99% homólogo con los aminoácidos 12-113 del ID SEC
Nº: 12. Otros ejemplos similares de neublastina truncada incluyen,
por ejemplo, los polipéptidos que incluyen los aminoácidos
42-140 del ID SEC Nº: 9, aminoácidos
113-224 del ID SEC Nº: 16, aminoácidos
113-224 del ID SEC Nº: 34. Los ejemplos específicos
adicionales incluyen, pero no se limitan a NBN99 (ID SEC Nº: 48),
NBN100 (ID SEC Nº: 47), NBN101 (ID SEC Nº: 46), NBN102 (ID SEC Nº:
45), NBN103 (ID SEC Nº: 44), NBN104 (ID SEC Nº: 43), NBN105 (ID SEC
Nº: 42), NBN106 (ID SEC Nº: 41), NBN107 (ID SEC Nº: 40), NBN108 (ID
SEC Nº: 39), NBN109 (ID SEC Nº: 38), NBN110 (ID SEC Nº: 37), NBN111
(ID SEC Nº: 36) y NBN112 (ID SEC Nº: 35) humanos, descritos antes,
u homólogos o derivados de los mismos. Los polipéptidos de NBN
truncados pueden ser sintéticos, expresados a partir construcciones
de ADN clonadas, o resultar de la escisión enzimática de
polipéptidos de NBN maduros.
En realizaciones preferidas, el polipéptido de
neublastina truncado incluye al menos los 85 aminoácidos carboxi
terminales de un polipéptido de neublastina. En realizaciones
preferidas, incluye al menos los 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,
105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 o 112 aminoácidos carboxi
terminales de un polipéptido de neublastina.
En realizaciones preferidas, el polipéptido de
neublastina truncado se une a un polipéptido RET, preferiblemente
cuando el polipéptido RET se expresa en la superficie de una célula
de mamífero, tal como una neurona.
La neublastina truncada se puede preparar usando
la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica un
polipéptido de neublastina truncado usando procedimientos conocidos
en la técnica y secuencias que se proporcionan en el presente
documento.
Alternativamente, el polipéptido de neublastina
truncado se puede obtener proporcionando un polipéptido de
neublastina maduro, tal como NBN113 de ID SEC Nº: 12, y poniendo en
contacto el polipéptido de neublastina maduro con al menos una
proteasa en condiciones suficientes para producir el polipéptido de
neublastina truncado. Preferiblemente, al menos una proteasa es una
exoproteasa, y el contacto del polipéptido de neublastina da como
resultado la formación de un producto de digestión del polipéptido
de neublastina por la exopeptidasa que puede ser digerido más con
una dipeptidil peptidasa. En realizaciones alternativas, la proteasa
es la aminopeptidasa, Endo Lys C o tripsina.
El grado con el que un polipéptido candidato
comparte homología con un polipéptido de neublastina de la invención
se determina como el grado de identidad entre dos secuencias de
aminoácidos. Un nivel alto de identidad de secuencia indica una
probabilidad de que la primera secuencia derive de la segunda
secuencia.
La identidad se determina mediante análisis por
ordenador, tal como, sin limitaciones, el programa de alineamiento
de ordenador ClustalIX (Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F,
Jeanmougin F, & Higgins DG: "The ClustalX windows interface:
flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality
analysis tools"; Nucleic Acids Res. 1997,25 (24):
4876-82), y los parámetros por defecto sugeridos en
el mismo. Usando este programa, la parte madura de un polipéptido
codificado por una secuencia de ADN análoga de la invención presenta
un grado de identidad de al menos 90%, más preferiblemente al menos
95%, más preferiblemente al menos 98%, lo más preferiblemente al
menos 99% con la secuencia de aminoácidos presentada en el presente
documento como ID SEC Nº: 2, ID SEC Nº: 4; ID SEC Nº: 5; ID SEC Nº:
6; ID SEC Nº: 7; ID SEC Nº: 9; ID SEC Nº: 10; ID SEC Nº: 11; ID SEC
Nº: 12, ID SEC Nº: 16, ID SEC Nº: 34, ID SEC Nº: 35, ID SEC Nº: 36,
ID SEC Nº: 37, ID SEC Nº: 38, ID NO: 39; ID SEC Nº: 40; ID SEC Nº:
41; ID SEC Nº: 42, ID SEC Nº: 43, ID SEC Nº: 44; ID SEC Nº: 45; ID
SEC Nº: 46; ID SEC Nº: 47 o ID SEC Nº: 48.
De acuerdo con la determinación de la homología,
se ha confirmado que el polipéptido de neublastina de la invención,
que pertenece a la superfamilia de TGF-\beta, está
relacionado con la subfamilia de GDNF, pero representa un miembro
diferente de esta subfamilia.
El polipéptido de la invención se puede
proporcionar de cualquier forma bioactiva, incluyendo la forma de
pre-pro-proteínas,
pro-proteínas, proteínas maduras, proteínas
glicosiladas, proteínas no glicosiladas, proteínas fosforiladas,
proteínas no fosforiladas, formas truncadas, o cualquier otra
proteína modificada postraduccionalmente. Un polipéptido de
neublastina bioactivo incluye un polipéptido que cuando dimeriza,
solo o en presencia de un cofactor (tal como GFR\alpha3 o RET),
se une a RET, induce la dimerización de RET y autofosforilación de
RET.
El polipéptido de la invención puede ser en
particular un polipéptido N-glicosilado, cuyo
polipéptido preferiblemente está glicosilado en los restos N
indicados en las listas de secuencias.
En una realización preferida, el polipéptido de
la invención tiene una secuencia de aminoácidos presentada como ID
SEC Nº: 9, que tiene un resto de asparagina glicosilado en la
posición 122; la secuencia de aminoácidos presentada como ID SEC
Nº: 10, que tiene un resto de asparagina glicosilado en la posición
122; la secuencia de aminoácidos presentada como ID SEC Nº: 11, que
tiene un resto de asparagina glicosilado en la posición 98; o la
secuencia de aminoácidos presentada como ID SEC Nº: 12, que tiene un
resto de asparagina glicosilado en la posición 95.
Esta invención también contempla proteínas de
fusión de neublastina, tales como fusiones con Ig, como se describe,
por ejemplo en la patente de Estados Unidos 5.434.131, incorporada
en el presente documento por referencia, o fusiones con albúmina
del suero.
En una realización, la invención proporciona un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en el ID
SEC Nº: 2, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 2.
En otra realización, la invención proporciona un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del ID SEC Nº: 4,
o una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 85%,
preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente
al menos aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos
aproximadamente 98%, y más preferiblemente al menos aproximadamente
99% homóloga con la secuencia presentada en el ID SEC Nº: 4.
En una tercera realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
del ID SEC Nº: 5, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 5.
En una cuarta realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 6, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 6.
En una quinta realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 7, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 7.
El polipéptido de neublastina de la invención
incluye variantes alélicas, p. ej., las secuencias de aminoácidos
de los polipéptido de los ID SEC Nº: 5-7, en las que
el primero aa X designa Asn o Thr, y el segundo aa X designa Ala o
Pro.
En una sexta realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 9, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 9.
En una séptima realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
del ID SEC Nº: 10, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 10.
En una octava realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 11, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 11.
En una novena realización, la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 12, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 12.
En una décima realización la invención
proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del
ID SEC Nº: 16, o una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga con la
secuencia presentada en el ID SEC Nº: 16, que es una
pre-pro-neublastina de origen
murino.
En otras realizaciones, la invención proporciona
un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno
cualquiera de los ID SEC Nº: 35-48, o una secuencia
de aminoácidos al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al
menos aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos
aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente
98%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% homóloga
con una cualquiera de las secuencias presentadas en los ID SEC Nº:
35-48.
En otra realización, el polipéptido de la
invención mantiene la huella dactilar de la subfamilia de GDNF, es
decir, los restos de aminoácidos subrayados en la tabla 3, mostrada
en los ejemplos.
En otra realización, la invención proporciona un
polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido capaz de
hibridar en condiciones muy restrictivas con la secuencia de
polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 1, su cadena
complementaria o un subfragmento de la misma. En una realización
preferida, el polipéptido de la invención es codificado por una
secuencia de polinucleótido que es al menos 70% homóloga con la
secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 1. En su
realización más preferida, el polipéptido de la invención es
codificado por la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC
Nº: 1.
En otra realización más, la invención
proporciona un polipéptido nuevo codificado por una secuencia de
polinucleótido capaz de hibridar en condiciones muy restrictivas
con la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 3, su
cadena complementaria o un subfragmento de la misma. En una
realización preferida, el polipéptido de la invención es codificado
por una secuencia de polinucleótido que es al menos 70% homóloga con
la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 3. En su
realización más preferida, el polipéptido de la invención es
codificado por la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC
Nº: 3.
En una realización más preferida, el polipéptido
de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido de neublastina maduro. Incluso más preferiblemente, la
invención incluye la secuencia de aminoácidos de una forma truncada
del polipéptido de neublastina que incluye los 7 restos de cisteína
conservados presentes en la secuencia de aminoácidos de las
proteínas de neublastina.
En otra realización más, la invención
proporciona un polipéptido nuevo codificado por una secuencia de
polinucleótido capaz de hibridar en condiciones muy restrictivas
con la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 8, su
cadena complementaria o un subfragmento de la misma. En una
realización preferida, el polipéptido de la invención es codificado
por una secuencia de polinucleótido que es al menos 70% homóloga con
la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 8. En su
realización más preferida, el polipéptido de la invención es
codificado por la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC
Nº: 8.
En otra realización más, la invención
proporciona un polipéptido nuevo codificado por una secuencia de
polinucleótido capaz de hibridar en condiciones muy restrictivas
con la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 15,
su cadena complementaria o un subfragmento de la misma. En una
realización preferida, el polipéptido de la invención es codificado
por una secuencia de polinucleótido que es al menos 70% homóloga con
la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC Nº: 15. En su
realización más preferida, el polipéptido de la invención es
codificado por la secuencia de polinucleótido presentada como ID SEC
Nº: 15.
El polipéptido de la invención se puede aislar
de células de mamífero, preferiblemente de una célula humana o una
célula de origen murino.
En una realización más preferida, el polipéptido
de la invención se puede aislar de tejido cardiaco humano, de
músculo esquelético humano, de páncreas humano, o de tejido cerebral
humano, en particular del núcleo caudado o del tálamo, o se puede
obtener del ADN de origen mamífero, como se discute con más detalle
más adelante.
Los polipéptidos de neublastina, incluyendo los
polipéptidos de neublastina truncados de la invención, son útiles
para moderar el metabolismo, crecimiento, diferenciación o
supervivencia de un nervio o célula neuronal. En particular, los
polipéptidos de neublastina se usan para tratar o aliviar un
trastorno o enfermedad de un animal vivo, p. ej., un ser humano,
cuyo trastorno o enfermedad son sensibles a la actividad de agentes
neurotróficos. Dichos tratamiento y procedimiento se describen con
más detalles más adelante.
Los polipéptidos de neublastina o fragmentos de
polipéptido de la invención se usan para producir anticuerpos
específicos de neublastina. Tal como se usa en el presente
documento, un "anticuerpo específico de neublastina" es un
anticuerpo, p. ej., un anticuerpo policlonal o un anticuerpo
monoclonal, que es inmunorreactivo frente a un polipéptido de
neublastina o fragmento de polipéptido, o que se une con
especificidad a un epítopo de un polipéptido de neublastina.
La preparación de anticuerpos policlonales y
monoclonales es conocida en la técnica. Los anticuerpos policlonales
se pueden obtener en particular como describen, p. ej., Green y
col.:"Production of Polyclonal Antisera" en Immunochemical
Protocols (Manson, Ed.); Humana Press, 1992, páginas
1-5; Coligan y col.: "Production of Polyclonal
Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters" en Current
Protocols in Immunology. 1992, Sección 2.4.1, y Ed Harlow y
David Lane (Eds.) en "Antibodies; A laboratory manual" Cold
Spring Harbor Lab. Press 1988. Estos protocolos se incorporan en el
presente documento por referencia. Los anticuerpos monoclonales se
pueden obtener en particular como describen, p. ej., Kohler y
Milstein, Nature, 1975,256: 495; Coligan y col., en
Current Protocols in Immunology. 1992, Secciones 2.5.1 -
2.6.7; y Harlow y col., en Antibodies: A Laboratory Manual: Cold
Spring Harbor, Pub., 1988, página 726; cuyos protocolos se
incorporan en el presente documento por referencia.
Brevemente, los anticuerpos monoclonales se
pueden obtener inyectando, p. ej. en un ratón, una composición que
comprende un antígeno, verificando la presencia de producción de
anticuerpos sacando una muestra de suero, sacando el bazo para
obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de
mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas,
seleccionado clones positivos que producen los anticuerpos contra el
antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de
hibridoma.
Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y
purificar de cultivos de hibridoma mediante una variedad de
técnicas bien establecidas, incluyendo la cromatografía de afinidad
con proteína A-Sefarosa, cromatografía por
exclusión de tamaños, y cromatografía de intercambio iónico, véase,
p. ej. Coligan y col. en Current Protocols in Immunology.
1992, Secciones 2.7.1 - 2.7.12, y Secciones 2.9.1 - 2.9.3; y Barnes
y col:"Purification of Immunoglobulin G (IgG)" en Methods
in Molecular Biology: Humana Press, 1992, Vol. 10, páginas
79-104. Los anticuerpos policlonales o monoclonales
opcionalmente se pueden purificar más, p. ej. por unión a y elución
de una matriz a la cual está unido el polipéptido contra el cual se
produjeron los anticuerpos.
Los anticuerpos que se unen al polipéptido de
neublastina de la invención se pueden preparar usando un polipéptido
intacto o fragmentos que contienen péptidos pequeños de interés
como el antígeno de inmunización. El polipéptido usado para
inmunizar un animal se puede obtener por técnicas de ADN
recombinante o por síntesis química, y opcionalmente se puede
conjugar con una proteína transportadora. Las proteínas
transportadoras usadas habitualmente que están químicamente
acopladas al péptido incluyen la hemocianina de lapa californiana
(KLH), tiroglobulina, albúmina de suero bovino (BSA) y toxoide de
tétanos. El péptido acoplado después se puede usar para inmunizar
el animal, que puede ser en particular un ratón, una rata, un
hámster o un conejo.
En una realización, los anticuerpos se producen
usando los siguientes péptidos: Péptido 1: CRPTRYEAVSFMDV
NST (aminoácidos 108-124 del ID SEC Nº: 9); o Péptido 2:ALRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 93-107 del ID SEC Nº: 9). Se describen procedimientos para producir anticuerpos usando estos polipéptidos en el ejemplo 10.
NST (aminoácidos 108-124 del ID SEC Nº: 9); o Péptido 2:ALRPPPGSRPVSQPC (aminoácidos 93-107 del ID SEC Nº: 9). Se describen procedimientos para producir anticuerpos usando estos polipéptidos en el ejemplo 10.
También se generaron anticuerpos policlonales de
conejo contra los siguientes péptidos:
De este grupo, sólo los péptidos R30 y R31,
relativamente cerca del extremo C, reconocían la proteína
desnaturalizada en condiciones reductoras en una transferencia
Western.
También se obtuvieron péptidos derivados de
neublastina adicionales de la proteína NBN, como se detalla más
adelante, que son bucles expuestos en la superficie previstos de
acuerdo con la estructura de GDNF conocida (Eigenbrot and Gerber,
Nat. Struct. Biol., 4, pp. 435-438 (1997)), y
por lo tanto son útiles para la generación de anticuerpos:
En otro aspecto de la invención, se pueden usar
anticuerpos que se unen específicamente a la neublastina o a
péptidos derivados de neublastina, para detectar la presencia de
dichos factores neurotróficos de neublastina en diferentes medios,
y en particular para el diagnóstico de afecciones o enfermedades
asociadas con moléculas de neublastina de la invención. En la
técnica se conocen una variedad de protocolos para dicha detección,
incluyendo ELISA, RIA y FACS.
Los anticuerpos de esta invención también se
pueden usar para bloquear el efecto del factor neurotrófico de
neublastina, y en particular pueden ser anticuerpos
neutralizantes.
Se cultiva una célula que comprende una
secuencia de ADN que codifica un polipéptido de neublastina de la
invención en condiciones que permiten la producción del polipéptido,
seguido de recuperación del polipéptido del medio de cultivo, como
se detalla más adelante. Cuando las células se van a modificar
genéticamente para el propósito de producir un polipéptido de
neublastina, las células se pueden modificar por procedimientos
convencionales o por activación de genes.
De acuerdo con procedimientos convencionales, se
puede introducir una molécula de ADN que contiene una secuencia de
ADNc o ADN genómico de neublastina en una construcción de expresión
y transfectarla en células por procedimientos estándar que
incluyen, pero no se limitan a transfección mediada por liposomas,
polibreno o DEAE-dextrano, electroporación,
precipitación por fosfato de calcio, microinyección, o
microproyectiles de alta velocidad ("biolística").
Alternativamente, se podría usar un sistema que libere ADN mediante
vector vírico. Los virus que se sabe que son útiles para la
transferencia de genes incluyen adenovirus, virus adenoasociados,
lentivirus, herpesvirus, virus de la parotitis, poliovirus,
retrovirus, virus Sindbis y virus vaccinia tal como virus de la
viruela del canario, así como la infección por baculovirus de
células de insecto, en particular células de insecto SfP9.
Alternativamente, las células se pueden
modificar usando un procedimiento de activación de gen ("GA"),
tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.733.761 y
5.750.376, todas incorporadas en el presente documento por
referencia.
Por consiguiente, la expresión "modificado
genéticamente", tal como se usa en el presente documento en
referencia a las células, se entiende que abarca células que
expresan un producto génico particular después de introducir una
molécula de ADN que codifican el producto génico y/o los elementos
reguladores que controlan la expresión de una secuencia codificante
para el producto génico. La molécula de ADN se puede introducir
mediante la técnica de gen dirigido, que permite la incorporación
de la molécula de ADN en un sitio genómico particular.
En otro aspecto la invención proporciona un
vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de
la invención. El vector de expresión recombinante de la invención
puede ser cualquier vector de expresión eucariota adecuado. Los
vectores de expresión recombinantes preferidos son el vector que
contiene el promotor de la ubiquitina pTEJ-8
(FEBS Lett. 1990 267 289-294), y derivados
del mismo, p. ej. pUbi1Z. Un vector de expresión eucariota
disponible en el comercio preferido es p. ej. el vector que contiene
el promotor de virus pcDNA-3 (disponible en
Invitrogen). Otro vector de expresión preferido usa los promotores
temprano de SV40 y tardío principal de adenovirus (derivados de
plásmido pAD2beta; Norton y Coffin, Mol. Cell. Biol. 5: 281
(1985)).
Esta invención también proporciona vectores de
expresión procariotas y genes sintéticos (Syngenes) con optimización
de codones para la expresión procariota. Los genes sintéticos se
construyeron con menor contenido de GC y codones bacterianos
preferidos (p. ej., E. coli). El gen sintético se ha clonado
en dos vectores pET19b y pMJB164, un derivado de pET19b. La
construcción con pET19b se muestra en la figura 14. En esta
construcción, la secuencia que codifica el dominio de NBN113 de la
neublastina se fusiona directamente con una metionina de
iniciación. La construcción con pMJB164 se muestra en la figura
15.
En otro aspecto más la invención proporciona una
producción de células genéticamente manipuladas para que comprendan
la secuencia de polinucleótido aislada de la invención, y/o un
vector de expresión recombinante de la invención. La célula de la
invención se puede manipular genéticamente en particular para
expresar, sobreexpresar o coexpresar de forma transitoria o estable
el polipéptido de la invención. En la técnica se conocen
procedimientos para generar la expresión transitoria y estable.
El polinucleótido de la invención se puede
insertar en un vector de expresión, p. ej. un plásmido, virus u
otro vehículo de expresión, y se puede unir de forma operativa a
secuencias de control de la expresión mediante ligado de una forma
que se logre la expresión de la secuencia codificante en condiciones
compatibles con las secuencias de control de la expresión. Las
secuencias de control de la expresión adecuadas incluyen promotores,
potenciadores, terminadores de la transcripción, codones de inicio,
señales de corte y empalme para intrones, y codones de parada,
todos mantenidos en el marco de lectura correcto del polinucleótido
de la invención para así permitir la traducción adecuada del ARNm.
Las secuencias de control de la expresión también pueden incluir
componentes adicionales tales como secuencias líderes y secuencias
de la pareja de fusión.
El promotor puede ser en particular un promotor
constitutivo o inducible. Cuando se clonan en sistemas bacterianos,
se pueden usar los promotores inducibles tales como pL de
bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido
ptrp-lac). Cuando se clona en sistemas de mamíferos,
se pueden usar los promotores derivados del genoma de células de
mamífero, p. ej., el promotor de la ubiquitina, el promotor TK o el
promotor de metalotioneina, o de virus de mamíferos, p. ej., la
repetición terminal larga de retrovirus, el promotor tardío de
adenovirus o el promotor de 7,5 K del virus vaccinia. También se
pueden usar los promotores obtenidos por ADN recombinante o
técnicas sintéticas para proporcionar la transcripción del
polinucleótido de la invención.
Los vectores de expresión adecuados típicamente
comprenden un origen de expresión, un promotor así como genes
específicos que permiten la selección fenotípica de las células
transformadas, e incluyen vectores tales como el vector de
expresión basado en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg y
col; Gene 1987 56 125), los vectores de expresión
pTEJ-8, pUbi1Z, pcDNA-3 y pMSXND
para la expresión en células de mamíferos (Lee y Nathans, J.
Biol. Chem. 1988 263 3521), vectores derivados de baculovirus
para la expresión en células de insectos, y el vector de expresión
de oocito PTLN (Lorenz C., Pusch M. & Jentsch TJ.:
"Heteromultimeric CLC chloride channels with novel
properties"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 199693
13362-13366).
En una realización preferida, la célula de la
invención es una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero,
p.ej., una célula humana, un oocito o una célula de levadura. La
célula de la invención puede ser, sin limitación, una célula de
riñón embrionario humano (HEK), p. ej., una célula HEK 293, una
célula BHK21, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una
célula de oocito de Xenopus laevis (XLO). En una realización,
la célula de la invención es una célula fúngica, p. ej., una célula
fúngica de filamentos. En otra realización más, la célula es una
célula de insecto, más preferiblemente la célula Af9. Son células de
mamífero adicionales las líneas celulares PC12, HiB5, RN33b,
células progenitoras neurales humanas, y otras células derivadas de
células humanas, en especial células neurales.
Los ejemplos de células primarias o secundarias
incluyen fibroblastos, células epiteliales que incluyen células
epiteliales mamarias e intestinales, células endoteliales, elementos
formados de la sangre incluyendo linfocitos y células de la médula
ósea, células gliales, hepatocitos, queratinocitos, células
musculares, células neurales o precursores de estos tipos de
células. Los ejemplos de líneas celulares inmortalizadas humanas en
el presente procedimiento incluyen, pero no se limitan a células de
melanoma de Bowes (Nº de acceso en ATCC CRL 9607), células Daudi
(Nº de acceso en ATCC CCL 213), células HeLa y células derivadas de
HeLa (Nº de acceso en ATCC CCL 2, CCL 2.1, y CCL 2.2), células
HL-60 (Nº de acceso en ATCC CCL 240), células
HT-1080 (Nº de acceso en ATCC CCL 121), células
Jurkat (Nº de acceso en ATCC TIB 152), células de carcinoma KB (Nº
de acceso en ATCC CCL 17), células de leucemia
K-562 (Nº de acceso en ATCC CCL 243), células de
cáncer de pecho MCF-7 (Nº de acceso en ATCC BTH
22), células MOLT-4 (Nº de acceso en ATCC 1582),
células Namalwa (Nº de acceso en ATCC CRL 1432), células Raji (Nº
de acceso en ATCC CCL 86), células RPMI8226 (Nº de acceso en ATCC
CCL 155), células U-937 (Nº de acceso en ATCC CRL
1593), células 2R4 de sublínea WI-38VA13 (Nº de
acceso en ATCC CLL 75.1), y células de carcinoma de ovario 2780AD
(Van der Blick y col, Cancer Res. 48:
5927-5932, 1988), así como células de
heterohibridoma producidas por fusión de células humanas y células
de otra especie. También se pueden usar cepas secundarias de
fibroblastos humanos, tales como WI-38 (Nº de acceso
en ATCC CCL 75) y MRC-5 (Nº de acceso en ATCC CCL
171).
Cuando la célula de la invención es una célula
eucariota, la incorporación del polinucleótido heterólogo de la
invención se puede llevar a cabo en particular por infección (usando
un vector vírico), por transfección (usando un vector plasmídico),
usando precipitación por fosfato de calcio, microinyección,
electroporación, lipofección u otros procedimientos fisicoquímicos
conocidos en la técnica.
En una realización más preferida, la secuencia
de polinucleótido aislada de la invención, y/o un vector de
expresión recombinante de la invención se transfectan en una célula
huésped de mamífero, una célula progenitora neural, una célula
astrocito, una célula T, una célula de tallo hematopoyético, una
célula que no se divide, o una célula endotelial cerebral, que
comprende al menos una molécula de ADN capaz de mediar la
inmortalización y/o transformación celulares.
La activación de un gen endógeno en una célula
huésped se puede llevar a cabo introduciendo elementos reguladores,
en particular introduciendo un promotor capaz de realizar la
transcripción de un gen endógeno que codifica el polipéptido de
neublastina de la invención.
En otro aspecto la invención proporciona
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz del polipéptido de la invención.
Para usar en terapia, el polipéptido de la
invención se puede administrar de cualquier forma conveniente. En
una realización preferida, el polipéptido de la invención se
incorpora en una composición farmacéutica junto con uno o más
adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes, y la composición
farmacéutica la puede preparar el experto en la materia usando
procedimientos convencionales conocidos en la técnica.
Dichas composiciones farmacéuticas pueden
comprender el polipéptido de la invención, o anticuerpos del mismo.
La composición se puede administrar sola o combinada con uno o más
agentes, fármacos u hormonas distintos.
La composición farmacéutica de esta invención se
puede administrar por cualquier vía adecuada, incluyendo, pero sin
limitar a la vía oral, intravenosa, intramuscular, interarterial,
intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica,
subcutánea, intraperitoneal, intranasal, arterial, tópica,
sublingual o aplicación rectal, bucal, vaginal, intraorbital,
intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular,
intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, transmucosa o por
inhalación.
Los procedimientos de suministro intrapulmonar,
aparatos y preparación de fármacos se describen, por ejemplo, en
las patentes de EE.UU. nº 5.785.049, 5.780.019, y 5.775.320, todas
incorporadas en el presente documento por referencia. La
administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo de la
preparación, o se pueden hacer más continuas por administración
intravenosa o intraperitoneal desde un depósito que es externo (p.
ej., una bolsa IV) o interno (p. ej., un implante biodegradable, un
órgano bioartificial, o una colonia de células de producción de
neublastina implantadas). Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU.
4.407.957, 5.798.113, y 5.800.828, todas incorporadas en el
presente documento por referencia. Los procedimientos y aparatos de
suministro intrapulmonar se describen, por ejemplo, en las patentes
de EE.UU. 5.654.007, 5.780.014, y 5.814.607, todas incorporadas en
el presente documento por referencia.
En particular, la administración de una
neublastina de acuerdo con esta invención se puede lograr usando
cualquier medio de suministro adecuado, incluyendo:
(a) bomba (véase p. ej. Annals of
Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993);
Cancer Research. 44: 1698 (1984), incorporados en el
presente documento por referencia),
(b) microencapsulación (véase, p. ej., las
patentes de Estados Unidos 4.352.883; 4.353.888 y 5.084.350,
incorporadas en el presente documento por referencia),
(c) implantes polímeros de liberación continua
(véase, p. ej., Sabel, patente de Estados Unidos 4.883.666,
incorporada en el presente documento por referencia),
(d) macroencapsulación (véase, p. ej.,patentes
de Estados Unidos 5.284.761, 5.158.881, 4.976.859 y 4.968.733 y
solicitudes de patentes PCT publicadas WO92/19195, WO 95/05452,
todas incorporadas en el presente documento por referencia);
(e) injertos de células desnudas o sin
encapsular en el SNC (véase, p. ej.,patentes de Estados Unidos
5.082.670 y 5.618.531, todas incorporadas en el presente documento
por referencia); o
(f) inyección, subcutánea, intravenosa,
intraarterial, intramuscular o en otro sitio adecuado;
(g) administración oral, en cápsula, líquido,
comprimido, píldora, o formulación de liberación prolongada.
En una realización de la invención, se
suministra un polipéptido de neublastina directamente en el SNC,
preferiblemente en los ventrículos cerebrales, parénquima cerebral,
el espacio intratecal u otra localización del SNC adecuado, más
preferiblemente intratecal.
En otra realización preferida, el presente
polipéptido de neublastina se da por suministro sistémico por
inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección
intravenosa o infusión intravenosa.
Otros sistemas de suministro parenteral útiles
incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato
de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables,
suministro con bomba, suministro de célula encapsulada, suministro
liposómico, inyección suministrada con aguja, inyección sin aguja,
nebulizador, aerosol, electroporación y parche transdérmico.
Se pueden encontrar más detalles sobre las
técnicas para la formulación y administración en la última edición
de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co.,
Easton, PA).
El principio activo se puede administrar en una
o varias dosis al día. Las dosis contempladas como adecuadas
actualmente son entre 0,5 ng de neublastina/kg de peso corporal a
aproximadamente 50 \mug/kg por administración y de
aproximadamente 1,0 ng/kg a aproximadamente 100 \mug/kg diarios.
Cuando se suministran directamente al SNC, la composición
farmacéutica de neublastina debe proporcionar una concentración
local del factor neurotrófico de aproximadamente 5 ng/ml de líquido
cefalorraquídeo ("LCR") a 25 ng/ml de LCR.
La dosis administrada debe ajustarse, por
supuesto, con cuidado a la edad, peso y afección del individuo que
se está tratando, así como la vía de administración, la forma de
dosificación y el régimen, y el resultado deseado, y la
dosificación exacta debe determinarla, por supuesto, el médico.
En otras realizaciones, el polipéptido de
neublastina de la invención se puede administrar por suministro
genético, usando líneas de células y vectores como se describe más
adelante en los procedimientos de tratamiento. Para generar dichas
líneas celulares terapéuticas, el polinucleótido de la invención se
puede insertar en un vector de expresión, p. ej. un plásmido, virus
u otro vehículo de expresión, y unir de forma operativa a las
secuencias del control de la expresión mediante ligado en una forma
que la expresión de la secuencia de codificación se logre en
condiciones compatibles con las secuencias de control de la
expresión. Las secuencias de control de la expresión adecuadas
incluyen promotores, potenciadores, terminadores de la
transcripción, codones de inicio, señales de corte y empalme para
intrones, y codones de parada, todas mantenidas en el marco de
lectura correcto del polinucleótido de la invención, para permitir
así la traducción adecuada del ARNm. Las secuencias de control de
la expresión también pueden incluir componentes adicionales tales
como secuencias líderes y secuencias de parejas de fusión.
El promotor puede ser en particular un promotor
constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos pueden ser
sintéticos, víricos o derivados de genoma de células de mamífero, p.
ej., el promotor de la ubiquitina humana. En una realización
preferida la línea celular terapéutica será una línea celular neural
inmortalizada humana que expresa el polipéptido de la invención.
Para el implante, se contempla el implante entre aproximadamente
10^{5} y 10^{10} células, más preferiblemente 10^{6} a
aproximadamente 10^{8} células.
La presente invención, que se refiere a
polinucleótidos y proteínas, polipéptidos, fragmentos de péptidos o
derivados producidos a partir de los mismos, así como a anticuerpos
dirigidos contra dichas proteínas, péptidos o derivados, se puede
usar para tratar o aliviar un trastorno o enfermedad de un cuerpo
animal vivo, incluyendo un ser humano, cuyo trastorno o enfermedad
es sensible a la actividad de agentes neurotróficos.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden usar directamente, p. ej., mediante composiciones
farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas para tratar un
proceso patológico sensible a los polipéptidos de neublas-
tina.
tina.
El polinucleótido de la invención, incluyendo
las secuencias complementarias del mismo, se puede usar para la
expresión del factor neurotrófico de la invención. Esto se puede
lograr mediante líneas celulares que expresan dichas proteínas,
péptidos o derivados de la invención, o mediante vectores víricos
que codifican dichas proteínas, péptidos o derivados de la
invención, o mediante células huésped que expresan dichas proteínas,
péptidos o derivados. Estas células, vectores y composiciones se
pueden administrar en las zonas objetivo de tratamiento para
afectar a un proceso patológico o trastorno sensible a los
polipéptidos de neublastina.
Se pueden obtener vectores de expresión
adecuados de lentivirus, retrovirus, adenovirus, herpesvirus o virus
vaccinia, o de diferentes plásmidos producidos con bacterias para
usar para suministrar in vivo las secuencias de nucleótidos
a un organismo entero o un órgano, tejido o población celular
objetivos. Otros procedimientos incluyen, pero no se limitan,
transfección con liposomas, electroporación, transfección con
péptidos transportadores que contienen señales nucleares u otras
señales de localización, y suministro de genes por sistemas de
liberación lenta. En otro aspecto más de la invención, las
secuencias de nucleótidos "antisentido" complementarias de los
genes de neublastina o partes de los mismos, se pueden usar para
inhibir o potenciar la expresión de la neublastina.
En otro aspecto más, la invención se refiere a
un procedimiento para tratar o aliviar un trastorno o enfermedad de
un cuerpo animal vivo, incluyendo un ser humano, cuyo trastorno o
enfermedad es sensible a la actividad de los agentes
neurotróficos.
Este trastorno o enfermedad puede ser en
particular daño del sistema nervioso producido por traumatismo,
cirugía, isquemia, infección, reperfusión, enfermedad metabólica,
deficiencia nutricional, tumor maligno o un agente tóxico, o un
proceso genético o idiopático.
El daño puede haberse producido, en particular,
en neuronas sensoriales o células de ganglios retinales, incluyendo
neuronas en los ganglios de la raíz dorsal o en cualquiera de los
siguientes tejidos: los ganglios geniculados, petrosos y nodosos;
el complejo del vestíbulo del oído del nervio craneal VIIIº; el polo
ventrolateral del lóbulo maxilomandibular del ganglio del
trigémino; y el núcleo del trigémino mesencefálico.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención, el trastorno o enfermedad es una enfermedad
neurodegenerativa que implica neuronas lesionadas o traumatizadas,
tales como lesiones traumáticas de nervios periféricos, la médula,
y/o la médula espinal, daño neuronal isquémico cerebral, neuropatía
y en especial neuropatía periférica, traumatismo o lesión de nervio
periférico, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral
aguda, lesión de la médula espinal aguda, tumores del sistema
nervioso, esclerosis múltiple, exposición a neurotoxinas,
enfermedades metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales
y lesión causada por agentes infecciosos, enfermedades
neurodegenerativas incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad
de Huntington, enfermedad de Parkinson, síndromes de
Parkinson-Plus, parálisis supranuclear progresiva
(síndrome de
Steele-Richardson-Olszewski),
atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de
Shy-Drager (atrofia de múltiples sistemas), complejo
parkinsonismo-demencia de Guam, esclerosis lateral
amiotrófica, o cualquier otra enfermedad congénita o
neurodegenerativa, y deterioro de la memoria conectado a la
demencia.
En una realización preferida, se considera el
tratamiento de neuronas del sistema sensorial y/o autonómico. En
otra realización preferida, se contempla el tratamiento de
enfermedades de neuronas motoras tales como la esclerosis lateral
amiotrófica ("ELA") y atrofia muscular espinal. En otra
realización preferida más, se contempla el uso de moléculas de
neublastina de esta invención para potenciar la recuperación de
nervios después de lesión traumática. En una realización, se
contempla el uso de un canal de guía de nervios con una matriz que
contiene polipéptidos de neublastina. Dichos canales de guía de
nervios se describen, p. ej., en la patente de Estados Unidos nº
5.834.029, incorporada en el presente documento por referencia.
En una realización preferida, los polipéptidos y
ácidos nucleicos de esta invención (y las composiciones
farmacéuticas que los contienen) se usan en el tratamiento de
neuropatías periféricas. Entre las neuropatías periféricas
contempladas para el tratamiento con moléculas de esta invención
están las neuropatías inducidas por traumatismo, p. ej., las
causadas por lesión física o estado patológico, daño físico del
cerebro, daño físico de la médula espinal, accidente
cerebrovascular asociado con daño cerebral y trastornos neurológicos
relacionados con neuro-
degeneración.
degeneración.
El tratamiento también contempla neuropatías
inducidas por quimioterapia (tales como las causadas por suministro
de agentes quimioterapéuticos, p. ej., taxol o cisplatino);
neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por
fármacos, neuropatías inducidas por patógenos (p. ej., inducidas por
virus), neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas;
neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas. Véase p. ej. las
patentes de EE.UU. 5.496.804 y 5.916.555, todas incorporadas en el
presente documento por referencia.
También se contempla el tratamiento de
mononeuropatías, mononeuropatías múltiples y polineuropatías,
incluyendo neuropatías axonales y desmielinizantes, usando los
nucleótidos y polipéptidos de neublastina de esta invención.
En otra realización preferida, los polipéptidos
y ácidos nucleicos de esta invención (y composiciones farmacéuticas
que los contienen) se usan en el tratamiento de diferentes
trastornos en los ojos, incluyendo la pérdida de fotorreceptores en
la retina en pacientes aquejados de degeneración macular, retinitis
pigmentosa, glaucoma y enfermedades similares.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para prevenir los cambios degenerativos conectados
con las enfermedades y trastornos anteriores, mediante implante en
el cerebro de mamíferos de vectores o células humanas capaces de
producir una forma biológicamente activa de la neublastina o un
precursor de la neublastina, es decir, una molécula que se puede
convertir fácilmente en una forma biológicamente activa de la
neublastina en el cuerpo, o adicionalmente se pueden encapsular, p.
ej. en membranas semipermeables, células que segregan
neublastina.
Se pueden hacer crecer células adecuadas in
vitro, incluyendo células diseñadas para producir neublastina,
para usar en el trasplante o injerto en el cerebro de mamífero,
incluyendo de ser humano.
En una realización preferida, el gen que
codifica el polipéptido de la invención se transfecta en una línea
celular adecuada, p. ej., en una línea de células de tallo neural de
rata inmortalizadas como HiB5 y RN33b, o en una línea de células
progenitoras neurales inmortalizadas humanas, y la línea celular
resultante se implanta en el cerebro de un cuerpo vivo, incluyendo
un ser humano, para segregar el polipéptido terapéutico de la
invención en el SNC, p. ej., usando vectores de expresión descritos
en la solicitud de patente internacional WO 98/32869.
Se puede usar un ácidos nucleico de neublastina
para determinar si un individuo tiene predisposición a desarrollar
una enfermedad neurológica que resulta de un defecto en el gen de
neublastina, p.ej. un defecto en un alelo de la neublastina, que se
ha adquirido, p. ej., por herencia genética, por desarrollo
embrionario anómalo, o por daño del ADN adquirido. El análisis
puede ser, p. ej., por detección de una deleción(es) o una
mutación(es) puntual(es) en el gen de neublastina, o
por detección de la herencia de dicha predisposición de dichos
defectos genéticos con polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP) específicos, por detección de la presencia o
ausencia de un gen de neublastina normal por hibridación de una
muestra de ácido nucleico del paciente con una sonda(s) de
ácido nucleico específica para el gen de neublastina, y
determinación de la capacidad de la sonda para hibridar con el
ácido nucleico.
En particular, se puede usar un ácido nucleico
de neublastina como una sonda de hibridación. Dichos ensayos de
hibridación se pueden usar para detectar, pronosticar, diagnosticar
o hacer el seguimiento de diferentes afecciones, trastornos o
estados patológicos asociados con los niveles aberrantes de ARNm que
codifica la proteína de neublastina. Se puede construir un ácido
nucleico de neublastina como un "marcador" para los procesos
fisiológicos dependientes del factor neurotrófico neublastina. Estos
procedimientos incluyen, pero no se limitan a procesos fisiológicos
"normales" (p. ej., función neuronal) y procesos patológicos
(p. ej., enfermedad neurodegenerativa). La caracterización de una
subpoblación(es) de pacientes particulares con niveles
aberrantes (es decir, elevados o deficientes) de la proteína
neublastina y/o el ARNm que codifica la neublastina, puede conducir
a nuevas clasificaciones de enfermedades. Por "niveles
aberrantes", como se define en el presente documento, se entiende
un nivel mayor o menor respecto al de una muestra de control o
individuo que no tiene el trastorno determinado por medios
cuantitativos o cualitativos.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos de
neublastina de esta invención también se pueden usar para cribar e
identificar análogos de neublastina, incluyendo moléculas pequeñas
miméticas de neublastina. En una realización contemplada, la
invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto
candidato que induce un efecto biológico mediado por neublastina,
comprendiendo el procedimientos las etapas de proporcionar una
célula de ensayo que cuando se pone en contacto con neublastina es
inducida para expresar un producto detectable, exponer la célula al
compuesto candidato, y detectar el producto detectable. La expresión
del producto detectable indica la capacidad del compuesto candidato
para inducir el efecto biológico mediado por neublastina.
Además, los ácidos nucleicos y polipéptidos de
neublastina de esta invención se puede usar en un chip de ADN o
chips de proteínas, o en programas de ordenador para identificar
nuevas secuencias de genes relacionadas y proteínas codificadas por
las mismas, incluyendo variantes alélicas y polimorfismos de un solo
nucleótido ("SNP"). Dichos procedimientos se describen, p.
ej., en las patentes de Estados Unidos nº 5.795.716; 5.754.524;
5.733.729; 5.800.992; 5.445.934; 5.525.464, todas incorporadas en el
presente documento por referencia.
Procedimiento
1
Se identificó un fragmento de 290 pb en dos
secuencias genómicas de alta capacidad (HTGS) enviadas a GenBank
(nº de acceso AC005038 y AC005051) por su homología con la persefina
humana. A partir de la secuencia de ácido nucleico del fragmento de
290 pb, se sintetizaron dos cebadores específicos de neublastina. El
cebador de la cadena superior ("NBNint.sense") tenía la
secuencia 5'-CCT GGC CAG CCT ACT
GGG-3' (ID SEC Nº: 17). El cebador de la cadena
inferior ("NBNint.antisense") tenía la secuencia
5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' (ID
SEC Nº: 18). Con estos cebadores, se llevaron a cabo reacciones de
PCR en 96 pocillos.
Una placa principal de 96 pocillos, que contenía
ADN plasmídico de 500.000 clones de ADNc, se cargó con
aproximadamente 5000 clones por pocillo. Se utilizó una subplaca de
96 pocillos con solución madre de E. coli DH10B en glicerol,
que contenía 50 clones por pocillo.
Se identificó un ácido nucleico de neublastina
mediante tres rondas de amplificación usando técnicas de reacción
en cadena de la polimerasa ("PCR"); la amplificación aumenta el
número de copias del ácido nucleico en la muestra.
Cribado de la placa principal: Usando la
técnica de cribado de PCR en 96 pocillos describa antes, se cribó
una placa principal de ADNc de cerebro fetal humano con los
cebadores específicos de genes para aislar el ADNc de neublastina
humana.
Se obtuvieron 30 ng de ADNc de cerebro fetal
humano (6 ng/\mul; Origene Technologies) del correspondiente
pocillo de la placa principal y se pusieron en un volumen total de
25 \mul que contenían los siguientes reactivos: 0,2 mM de cada
uno de los dos cebadores específicos de genes mencionados (es decir,
NBNint.sense y NBNint.antisense), 1x tampón de PCR estándar (tampón
V, Advanced Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.); y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/\mul;Advanced Biotechnologies, Reino Unido).
Las reacciones de los ciclos térmicos de la PCR
se llevaron a cabo usando el siguiente procedimiento y condiciones.
El ADN se desnaturalizó inicialmente a 94ºC durante 3 minutos, y
después le siguieron 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante
1 minuto cada uno, reasociación a 55ºC durante 1 minuto, una primera
extensión a 72ºC durante 90 segundos; y una extensión final a 72ºC
durante 5 minutos. Se analizaron los productos de 96 reacciones de
PCR individuales por electroforesis en gel usando un gel de agarosa
al 2% que contenía la tinción de bromuro de etidio. Se encontró que
el producto de la PCR positivo, de 102 pb, visto en un pocillo,
correspondía a una única subplaca de 96 pocillos.
El fragmento de ácido nucleico de 102 pb tenía
la siguiente secuencia (ID SEC Nº: 13):
Cribado de la subplaca: La subplaca de 96
pocillos de cerebro fetal humano se cribó por amplificación mediada
por PCR, poniendo 1 \mul de la solución madre de glicerol del
correspondiente pocillo de la subplaca en un volumen total de 25
\mul que contenía: 0,2 mM de cada uno de los dos cebadores
específicos de genes; 1x tampón de PCR estándar (tampón V, Advanced
Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.); y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/\mul;Advanced Biotechnologies, Reino Unido).
Se usaron las mismas condiciones de ciclos
térmicos de la PCR descritos para el cribado de la placa principal.
Se analizaron 96 reacciones de PCR individuales en un gel de agarosa
al 2% que contenía bromuro de etidio, y se identificó un pocillo
positivo que dio un fragmento de la PCR de 102 pb.
PCR de la colonia: Se diluyó 1 ml de la
solución madre en glicerol del pocillo positivo de la subplaca 1:100
en caldo de Luria (LB). Después se pusieron 1 ml y 10 ml de la
dilución mencionada en dos placas de agar separadas que contenían
caldo de Luria ("LB") y carbenicilina 100 \mug/ml. Las placas
de LB después se incubaron toda la noche a 30ºC. De estas placas se
recogieron 96 colonias en una nueva placa de PCR de 96 pocillos que
contenía: 0,2 mM de cada uno de los dos cebadores específicos de
genes, 1x tampón de PCR estándar (tampón V, Advanced
Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.); y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/\mul;Advanced Biotechnologies, Reino Unido), en un
volumen final de
25 \mul.
25 \mul.
Se usaron las mismas condiciones de ciclos
térmicos de la PCR descritas para el cribado de la placa principal.
Después se analizaron las 96 reacciones de la PCR individuales en un
gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio. Posteriormente
se identificó una colonia positiva que contenía el fragmento de 102
pb.
La secuenciación del plásmido de ADN preparado
de esta colonia positiva puso de manifiesto un ADNc de longitud
entera de 861 pb (ID SEC Nº: 8). El ADNc codificaba una
pre-pro-neublastina (ID SEC Nº: 9).
La secuenciación automática del ADN se llevó a cabo usando el kit
de secuenciación BigDye® terminator cycle (PE Applied Biosystems,
EE.UU.). Los geles de secuenciación se hicieron correr en el ABI
Prism 377 (PE Applied Biosystems, EE.UU.).
Procedimiento
2
Se puede llevar a cabo un procedimiento
adicional de amplificación del ADNc de neublastina de longitud
entera o fragmento de ADNc mediante RACE (amplificación rápida de
extremos de ADNc) y los cebadores específicos de neublastina
NBNint.sense y NBNint.antisense descritos antes, combinados con
cebadores específicos del vector o específicos del adaptador, por
ejemplo usando el kit de amplificación de ADNc de Marathon (Clontech
Laboratories, EE.UU., Nº de cat. K1802-1).
Se puede usar ADNc
Marathon-Ready de cerebro humano (Clontech
Laboratories, EE.UU., nº de catálogo 7400-1) para
amplificar el ADNc de neublastina de longitud entera. Los cebadores
útiles para la amplificación incluyen un cebador de la cadena
superior de neublastina
5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' (ID SEC Nº:
19) ("NBNext.sense"), y un cebador de la cadena inferior de
neublastina 5'-TCCATCACCCACCGGC-3'
(ID SEC Nº: 20) ("NBNext.antisense"), combinados con el
cebador adaptador AP1 incluido en el ADNc
Marathon-Ready. También se usó un cebador
alternativo de la cadena superior
5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3' (ID SEC Nº:
28). También se puede usar un cebador alternativo de la cadena
inferior 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' (ID
SEC Nº: 33). Igualmente también se pueden usar los cebadores
alternativos de la cadena superior de ID SEC Nº: 24 y 26.
Procedimiento
3
Otro procedimiento de clonación del ADNc de
neublastina es mediante cribado de bibliotecas de cerebro fetal o
adulto humano con una o más sondas de neublastina descritas en el
presente documento (e ilustradas en la figura 1). Estas bibliotecas
incluyen: cerebro humano \lambdagt11 (Clontech Laboratories,
EE.UU., nº de cat. HL3002b); o cerebro fetal humano \lambdagt11
(Clontech Laboratories, EE.UU., nº de cat. HL3002b).
Procedimiento
4
Se llevó a cabo un procedimiento de cribado
rápido del gen de neublastina de la siguiente forma. Una placa
principal de 96 pocillos, que contenía ADN plasmídico de 500.000
clones de ADNc, se cargó con aproximadamente 5000 clones por
pocillo. Se usó una subplaca de 96 pocillos con solución madre de
E. coli en glicerol que contenía 50 clones por pocillo. Se
llevaron a cabo 3 rondas de amplificación mediada por PCR con el fin
de identificar un gen de interés (es decir, de neublastina).
Cribado de la placa principal: Una placa
principal de ADNc fetal de ratón se cribó mediante PCR en 96
pocillos usando cebadores específicos de gen para aislar el ADNc de
neublastina de ratón. Se sintetizaron los dos cebadores
siguientes:
(1) cebador C2 de neublastina (NBNint.sense):
5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (ID SEC Nº:
21); y (2) cebador C2as de neublastina (NBNint.antisense):
5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (ID SEC
Nº: 22). Usando estos dos cebadores específicos de gen se
identificó un producto de la PCR positivo de 220 pb. El ácido
nucleico de 220 pb tenía la siguiente secuencia (ID SEC Nº:
14):
Después se llevaron a cabo las reacciones de la
PCR en 96 pocillos de la siguiente forma. Se obtuvieron 30 ng de
ADNc de cerebro fetal de ratón (6 ng/\mul; Origene Technologies)
del correspondiente pocillo de la placa principal y se pusieron en
un volumen total de 25 \mul que también contenía: 0,2 mM de cada
uno de los dos cebadores específicos de gen mencionados (es decir,
el cebador C2 (NBNint.sense) y el cebador C2as (NBNint.antisense)
de neublastina), 1x tampón de PCR estándar (tampón V, Advanced
Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.), y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/\mul;Advanced Biotechnologies, Reino Unido).
Se usaron las siguientes condiciones de ciclos
térmicos de la PCR: una desnaturalización inicial a 94ºC durante 3
minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1
minuto cada uno, reasociación a 55ºC durante 1 minuto, extensión a
72ºC durante 90 segundos; y una extensión final a 72ºC durante 5
minutos. Se analizaron las 96 reacciones de PCR individuales en un
gel de agarosa al 2% que contenía tinción con bromuro de etidio. Se
encontró que el producto de la PCR positivo, de 220 pb, visto en un
pocillo, correspondía a una única subplaca de 96 pocillos. Después
las 96 reacciones de la PCR individuales se analizaron por
electroforesis en gel, en un gel de agarosa al 2% que contenía
tinción de bromuro de etidio. El producto de la PCR positivo de 220
pb que se había identificado correspondía a un único pocillo de la
subplaca de 96 pocillos.
Cribado de la subplaca: La subplaca fetal
de ratón de 96 pocillos se cribó por amplificación mediada por PCR
poniendo 1 \mul de solución madre en glicerol del correspondiente
pocillo de la subplaca en un volumen final total de 25 \mul que
contenía 0,2 mM de cada uno de los dos cebadores específicos de gen
mencionados, 1x tampón de PCR estándar (tampón V, Advanced
Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.); y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/ml;Advanced Biotechnologies, Reino Unido). Los
ciclos térmicos de la PCR se llevaron a cabo de acuerdo con las
condiciones descritas antes para el cribado de la placa
principal.
Después se analizaron las 96 reacciones
individuales de la PCR en un gel de agarosa al 2% que contenía
bromuro de etidio y se identificó un pocillo positivo que produjo
el fragmento de 220 pb.
PCR de la colonia: Se diluyó 1 ml de la
solución madre en glicerol del pocillo positivo de la subplaca 1:100
en caldo de Luria (LB). Después se pusieron 1 ml y 10 ml de la
dilución mencionada en dos placas de LB separadas que contenían
carbenicilina 100 \mug/ml, y se incubaron toda la noche a 30ºC. Se
aislaron un total de 96 colonias y se transfirieron a un placa de
PCR de 96 pocillos que contenía: 0,2 mM de cada uno de los dos
cebadores específicos de gen mencionados, 1x tampón de PCR estándar
(tampón V, Advanced Biotechnologies, Reino Unido), dNTP 0,2 mM
(Amersham-Pharmacia), GC-Melt 0,1 M
(Clontech Laboratories, EE.UU.), y 0,5 unidades de ADN polimerasa
Taq (5 U/\mul;Advanced Biotechnologies, Reino Unido), en un
volumen final de 25 \mul.
Los ciclos térmicos de la PCR se llevaron a cabo
de acuerdo con las condiciones descritas antes (véase "cribado de
la placa principal", más arriba). Se analizaron las 96 reacciones
de la PCR individuales mediante electroforesis en gel, en un gel de
agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio. Se identificó una
colonia positiva por la presencia del fragmento de 220 pb. A partir
de esta colonia positiva se preparó el ADN plasmídico. El clon se
secuenció por secuenciación automática de ADN usando el kit de
secuenciación BigDye® terminator cycle con la ADN polimerasa
AmpliTaq. Los geles de secuenciación se hicieron correr en el
ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, EE.UU.). La secuencia
resultante de este clon puso de manifiesto un ADNc de longitud
completa de 2136 pb (ID SEC Nº: 15). El ADNc incluye un marco de
lectura abierto con la secuencia de aminoácidos prevista mostrada
en el ID SEC Nº: 16, que codifica un polipéptido de
pre-pro-neublastina de ratón.
Como se ha discutido antes, los autores de la
invención identificaron un fragmento de ácido nucleico de 290 pb en
dos clones BAC humanos con entradas de datos de GenBank (con los nº
de acceso AC005038 y AC005051) que tenían regiones de homología con
la persefina y con las secuencias flanqueadoras de la persefina. Los
autores de la invención usaron la secuencia prevista de 861 pb
descrita antes para diseñar cebadores adicionales, con el objetivo
de clonar un ácido nucleico que codificara ácidos nucleicos de
neublastina adicionales usando el software Lasergene (DNAStar,
Inc.). Se usaron dos pares de cebadores para clonar el gen de
neublastina usando reacciones de PCR con el ADN genómico. Los dos
pares de cebadores se ilustran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el par de cebadores nº 1, se amplificó un
fragmento de ADN de 887 pb a partir de una preparación de ADN
genómico humano adquirido en Clontech Laboratories (nº de cat.
6550-1).
Protocolo de la PCR: La PCR se llevó a
cabo usando el sistema de PCR de alta fidelidad Expand^{TM}
(Boehringer Mannheim) con el tampón 1. La mezcla de reacción de la
PCR se complementó con dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% y 17,5 pmol de
cada dNTP en un volumen total de 50 \mul. Los ciclos térmicos se
llevaron a cabo con una etapa previa de desnaturalización a 94ºC
durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de dos etapas a 94ºC durante
10 segundos, y 68ºC durante 1 minuto, respectivamente. Los ciclos
térmicos se terminaron por incubación a 68ºC durante 5 minutos. Los
ciclos térmicos se llevaron a cabo en un termocilador 225 DNA Engine
Tetrad (MJ Research, MA). Los productos de la PCR se analizaron por
electroforesis en gel en agarosa al 2% (FMC) y después se
fotografiaron.
El fragmento de 887 pb amplificado a partir del
ADN genómico humano con el par de cebadores nº 1 se clonó en el
vector pCRII (Invitrogen), y se transformó en células competentes de
E. coli con XL 1-Blue (Stratagene). El
plásmido resultante, denominado neublastina-2 se
secuenció usando Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech). Los
productos de secuenciación se analizaron por electroforesis en un
secuenciador automático ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech).
Se secuenciaron los fragmentos obtenidos por
amplificación por PCR del ADN genómico humano con el segundo par de
cebadores (par de cebadores nº 1, anterior), poniendo de manifiesto
una región adicional de 42 pb en el extremo 3' del cebador del
marco de lectura abierto. La secuencia de longitud entera se analizó
comparándola con las secuencias de ácidos nucleicos de otros
factores neurotróficos, así como por cartografía de las fronteras
exón-intrón usando programas de software para
encontrar genes que identifican uniones de corte y empalme probables
y regiones de alto potencial de codificación, usando el software
Netgene y Gene Mark (Brunak y col., J. Mol. Biol, 220, pp.
49-65 (1991); Borodovsky y col., Nucl. Acids
Res., 23, pp. 3554-62 (1995)). Las fronteras
exón-intrón se confirmaron por el ADNc obtenido del
cribado rápido descrito antes.
Como se ilustra en la figura 7, el gen de
neublastina resultante tiene dos exones separados por un intrón de
70 pb. Juntos, los exones tienen una secuencia de aminoácidos
prevista de un polipéptido de neublastina de longitud entera. El
ADNc previsto (ID SEC Nº: 3) contiene un marco de lectura abierto
(ORF) que codifica 238 restos de aminoácidos (ID SEC Nº: 4). El
clon de neublastina-2 contenía la secuencia
codificante completa de la pro-neublastina. La
secuencia de aminoácidos codificada por el gen mostró una alta
homología con tres proteínas, la persefina, neurturina y GDNF.
Se detectó la expresión del ARN de neublastina
tanto en el tejido nervioso como no nervioso en roedores y en seres
humanos, y en diferentes etapas de desarrollo inmaduro y adulto,
usando las técnicas descritas a continuación.
Procedimiento para detectar la expresión del
ARN de neublastina usando RT-PCR: Se
sintetizaron los siguientes cebadores de acuerdo con la secuencia
de ADN de neublastina identificada como ID SEC Nº: 1: (1) un cebador
C2 de neublastina
5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (ID SEC Nº:
21), y (2) un cebador C2as de neublastina
5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (ID SEC
Nº: 22). Este conjunto de cebadores se usó para amplificar por
RT-PCR un fragmento de ADN a partir de ARNm de
cerebro entero humano adulto y fetal. Entre los fragmentos de ADN
producidos por esta reacción había uno de 220 pb. La identificación
de este fragmento de ADN de 220 pb confirmaba que el gen de
neublastina se expresa en tejido cerebral adulto y fetal. También
se amplificó un fragmento de ADN de 220 pb a partir del ADN
genómico usando estos cebadores.
Las transferencias northern con ARN poliA^{+}
de tejido humano adulto se adquirieron en un proveedor comercial
(Clontech Laboratories, EE.UU.) y se trataron con la sonda de ADNc
de neublastina marcado con ^{32}P. El ADNc de neublastina marcado
se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo
1 anterior.
Preparación de sondas: Un fragmento de
ADN de ácido nucleico de neublastina (nucleótidos
296-819 del ID SEC Nº: 8) se marcó con el kit de
marcaje Redprime II (Amersham; nº de cat. RPN1633) para usar como
una sonda de hibridación, de acuerdo con la recomendación del
fabricante. Brevemente, la muestra de ADN se diluyó a una
concentración de 2,5-25 ng en 45 \mul de tampón de
TE 10 mM (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).
Después el ADN se desnaturalizó calentando la muestra a
95-100ºC durante 5 minutos en un baño de agua
hirviendo, enfriando la muestra rápido poniéndola en hielo durante
5 minutos, y después centrifugándola brevemente para llevar el
contenido a la parte inferior del tubo de reacción. La cantidad
total de ADN desnaturalizado se añadió junto con 5 \mul de
Redviue (^{32}P)dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) en
el tubo de reacción que contenía la solución tamponada de dATP,
dGTP, dTTP, enzima Klenow sin exonucleasa y cebador aleatorio en
forma estabilizada seca. La solución se mezcló pipeteando hacia
arriba y abajo 2 veces, moviendo la punta de la pipeta en círculos
en la solución, y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 10
minutos. La reacción de marcaje se paró por adición de 5 \mul de
EDTA 0,2 M. Para usar como una sonda de hibridación el ADN marcado
se desnaturalizó en dos cadenas individuales calentando la muestra
de ADN a 95-100ºC durante 5 minutos, y después
enfriando instantáneamente la muestra de ADN en hielo durante 5
minutos. El tubo se centrifugó y su contenido se mezcló bien.
Finalmente la sonda de ADN monocatenaria se purificó usando el kit
de Nucleotide Removal (Qiagen).
Técnicas de hibridación: Las
transferencias northern preparadas se adquirieron en un proveedor
comercial ("Multiple Tissue Northern Blots", Clontech
Laboratories, EE.UU., Nº de catálogo 7760-1 y
7769-1) y se hibridaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante usando la sonda de neublastina marcada
con ^{32}P preparada antes. Para la hibridación, se usó solución
ExpressHyb (Clontech Laboratories, EE.UU.), y se usó una
concentración de aproximadamente 3 ng/ml de la sonda marcada. La
solución de ExpressHyb se calentó a 68ºC y después se agitó para
disolver cualquier precipitado. Todas las membranas de transferencia
northern (10x10 cm) se prehibridaron en al menos 5 ml de solución
ExpressHyb a 68ºC durante 30 minutos en un horno de hibridación
Hybaid de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La sonda de
neublastina marcada con ^{32}P se desnaturalizó a
95-100ºC durante 2 minutos y después se enfrió
rápidamente en hielo. Se añadieron 14 \mul de la sonda marcada a 5
ml de solución reciente ExpressHyb, y se mezcló bien. La solución
ExpressHyb usada en la prehibridación se sustituyó distribuyendo
uniformemente sobre las transferencias los 5 ml de solución reciente
ExpressHyb que contenía la sonda de ADN marcada. Las transferencias
se incubaron a 68ºC durante 1 hora en un horno de hibridación
Hybaid. Después de la incubación, las transferencias se aclararon y
se lavaron varias veces con restricción baja (2x tampón SSC que
contenía SDS al 0,05% a temperatura ambiente) seguido de un lavado
de restricción alta (0,1x SSC que contenía SDS al 0,1% a 50ºC) (20x
SSC en NaCl 0,3 M/citrato de Na 0,3 M, pH 7,0). Las transferencias
se expusieron en una película Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia
Biotech Ltd.) a -80ºC usando pantallas intensificadoras.
Los resultados de los experimentos de
hibridación de la transferencia northern se presentan en la fig. 1.
Las fig. 1A (izquierda) y fig. 1B (derecha) son transferencias
northern de ARN poliA^{+} que se trataron con sondas de ADNc de
neublastina marcadas con ^{32}P, como se describe en el Ejemplo 3.
Los marcadores representan polinucleótidos de tamaños de 1,35
kilopares de bases ("kb"), 2,4 kb, 4,4 kb, 7,5 kb y 9,5 kb. La
membrana de la fig. 1A se preparó con ARNm extraído de diferentes
tejidos humanos adultos: A partir de los resultados del análisis de
la hibridación de la transferencia northern, los autores de la
invención concluyeron que el ARNm de neublastina se expresa en
muchos tejidos humanos adultos. El nivel más alto de expresión de
neublastina se detecta en el corazón, en el músculo esquelético y en
el páncreas. La membrana de la fig. 1B se preparó con ARN extraído
de diferentes regiones del cerebro humano adulto. Dentro del cerebro
adulto, el nivel mayor de expresión se ve en el núcleo caudado y en
el tálamo. Un ARNm transcrito de aproximadamente 5 kb era la forma
predominante de ARNm de neublastina expresada en el cerebro.
Se usan las siguientes técnicas para medir la
expresión del ARN de neublastina en tejidos animales, p. ej.
tejidos de roedores, con una sonda antisentido de neublastina.
Preparación de muestras de tejido: Se
sacrificaron ratones preñados (B&K Universal, Estocolmo, Suecia)
por dislocación cervical en el día de gestación 13,5 o 18,5. Se
sacaron los embriones por disección en condiciones estériles, y se
sumergieron inmediatamente en una solución de tampón de fosfato 0,1
M (PB) que contenía paraformaldehído al 4% ("PFA") durante
24-30 horas, y después se sacaron del PFA y se
almacenaron en PBS. El tejido se preparó para la división en
secciones mediante inmersión del tejido en una solución de sacarosa
al 30%, y después insertándolo en TissueTech (O.C.T. Compound,
Sakura Finetek USA, Torrance, CA). Se cortaron 6 series de las
secciones coronal o sagital (12 \mum de cada una) en un criostato
y se motaron descongeladas en portaobjetos de vidrio cargados
positivamente. Se fijaron las cabezas/cerebros neonatales (P1, P7)
siguiendo el mismo protocolo que para las etapas embrionarias, y se
diseccionó el tejido cerebral adulto, se congeló inmediatamente en
hielo, y se cortó en un criostato sin ninguna inserción previa.
Preparación de ribosondas de neublastina:
Se hizo una sonda de ARN de neublastina antisentido (en lo sucesivo
una "ribosonda de neublastina"). Se subclonaron los nucleótidos
1109-1863 de la secuencia de ADNc de neublastina de
ratón (ID SEC Nº: 15) en el vector BlueScript (Stratagene). El
plásmido resultante se cortó en un ADN lineal usando la
endonucleasa de restricción EcoRI. El fragmento EcoRI
de ADN se transcribió in vitro con ARN polimerasa T3 y el
kit de marcaje de ARN con digoxigenina ("DIG") de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim).
Hibridación: Las secciones del criostato
se fijaron durante 10 minutos en PFA al 4%, se trataron durante 5
minutos con 10 mg/ml de proteinasa K, se deshidrataron
secuencialmente en etanol al 70% y al 95% durante 5 y 2 min,
respectivamente, y después se dejaron secar al aire. Se calentó
tampón de hibridación (formamida desionizada al 50%, 10% de una
solución de sulfato de dextrano al 50%, solución de Denhardt al 1%,
ARNt de levadura 250 \mug/ml, NaCl 0,3 M,
Tris-HCl 20 mM (pH 8), EDTA 5 mM, NaPO_{4} 10 mM,
sarcosilo al 1%) que contenía 1 \mug/ml de sonda marcada con DIG,
a 80ºC durante 2 minutos, y se aplicó sobre las secciones. Después
las secciones se cubrieron con Parafilm y se incubaron a 55ºC
durante 16-18 horas.
Al día siguiente las secciones se lavaron con
restricción alta (2x SSC que contenía formamida al 50%) a 55ºC
durante 30 minutos, y después se lavaron con tampón de RNasa y se
incubaron con RNasa A 20 \mug/ml durante 30 minutos a 37ºC. Con
el fin de detectar la sonda marcada con DIG, las secciones se
preincubaron en solución de bloqueo (PBS que contiene
Tween-20 al 0,1% y suero de cabra inactivado por
calor al 10%) durante 1 hora y después se incubaron toda la noche a
4ºC con una dilución 1:5000 de anticuerpo anti-DIG
acoplado con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim). Al día
siguiente, cada sección se lavó 2 horas 4 veces en PBS que contenía
Tween-20 al 0,1%, y después se lavó 10 minutos 2
veces en tampón de NTMT (NaCl 100 mM, Tris-HCl 100
mM (pH 9,5), MgCl_{2} 50 mM, Tween-20 al 0,1%).
Después las secciones se incubaron en sustrato púrpura BM que
contenía levamisol 0,5 mg/ml durante 48 horas. La reacción de color
se paró por lavado en PBS. Las secciones se secaron al aire y se
cubrieron con cubreobjetos con DPX (KEBO-lab,
Suecia).
Los resultados de las reacciones de hibridación
in situ se presentan en la Tabla 1.
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Como se muestra en la Tabla 1, el día
embrionario 13,5 ("E13,5"), la neublastina se expresaba en la
médula espinal y en el metencéfalo, y débilmente en el cerebro
anterior. También se detectó expresión de neublastina en la retina
en desarrollo y en los ganglios sensoriales (ganglios de la raíz
dorsal y ganglios del trigémino (V)). Fuera del sistema nervioso,
se encontró una señal débil en el riñón, el pulmón y el intestino,
que indicaba que la neublastina también se expresa en esos
tejidos.
El día embrionario 18,5 ("E18,5"), la
neublastsina se expresaba de forma más predominante en el ganglio
del trigémino (V). También se detectó la expresión de neublastina
en la retina, el cuerpo estriado y la corteza. Además, se vio
expresión en el primordio dental.
Otra vez con respecto a la tabla 1, se observó
aumento de la expresión de neublastina desde el tiempo E18,5 a los
días 1 y 7 postnatales, en la corteza, el cuerpo estriado y el
ganglio del trigémino (V). La expresión de neublastina era más
predominante en las capas exteriores de la corteza que en las capas
interiores de la corteza. En P7, se encontró expresión en las
mismas estructuras que el día 1, pero se encontró además expresión
de neublastina en el hipocampo, en especial en la circunvolución
dentada y en el cerebelo. En el cerebro murino adulto, la
neublastina se expresaba fuertemente en la circunvolución dentada,
detectándose expresión de neublastina muy baja o en niveles
indetectables en otros tejidos ensayados.
El siguiente experimento describe la hibridación
de tejidos de rata con sonda antisentido de oligodesoxinucleótidos
de neublastina marcados con fosfatasa alcalina.
Preparación de las muestras de tejidos:
Se obtuvieron embriones (E14) de rata de ratas Wistar preñadas
(Mølleg\ring{a}rd, Dinamarca) después de anestesia pentorbital.
Las ratas postnatales (P0, P7, adulta) se sacrificaron por
decapitación. Los cerebros diseccionados y las cabezas enteras se
sumergieron inmediatamente en NaCl al 0,9% frío, se congelaron
enseguida y se dividieron en secciones de 20 \mum en un criostato
(secciones coronal y sagital, 10 series).
Hibridación in situ: Se
hibridaron 2 series de secciones usando una sonda de
oligodesoxinucleótidos antisentido conjugada con fosfatasa alcalina
(AP) (5'-NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG
G-3' (ID SEC Nº: 27), Oligo nº 264675, DNA
Technology, Dinamarca). Esta sonda es complementaria de las bases
1140 a 1169 del ADNc de neublastina de ratón del ID SEC Nº: 15).
Antes de la hibridación, las secciones se
secaron al aire a temperatura ambiente, se calentaron a 55ºC durante
10 min, y después se trataron con etanol al 96% a 4ºC toda la
noche. Las secciones después se secaron al aire y se incubaron en
medio de hibridación (5,0 pmol de sonda/ml) toda la noche a 39ºC
(Finsen y col.,1992. Neurosci. 47: 105-113:
West y col., 1996. J. Comp. Neurol., 370:
11-22).
El tratamiento después de hibridación consistía
en cuatro aclarados de 30 minutos en 1x SSC (NaCl 0,15 M, citrato
de Na 0,015 M) a 55ºC, seguido de tres aclarados de 10 minutos en
Tris-HCl, pH 9,5 a temperatura ambiente antes de
aplicar el revelador de AP. El revelador de AP se preparó
inmediatamente antes de usarlo y contenía azul de nitrotetrazolio
(NBT, Sigma), fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP, Sigma), y tampón de
Tris-HCl-MgCl_{2}, pH 9,5 (Finsen
y col, Neurosci. 1992 47 105-113). El
revelado con AP se produjo en la oscuridad a temperatura durante 48
horas. La reacción de color se paró mediante aclarado de las
secciones en agua destilada. Las secciones se deshidrataron en
acetona graduada, se ablandaron en creosota de
xilen-fenol Allchem, Reino Unido), se limpiaron en
xileno y se cubrieron con un cubreobjetos Eukitt (Bie &
Berntsen, Dinamarca).
Las reacciones de control consistían en (1)
tratar previamente las secciones con RNasa A (50 \mug/ml,
Pharmacia, Suecia) antes de la hibridación; (2) hibridar las
secciones con un exceso de cien veces de sonda sin marcar; y (3)
hibridar las secciones sólo con tampón de hibridación. Los
resultados de las reacciones de hibridación se presentan en la Tabla
2.
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El día embrionario 14 (E14), la neublastina se
expresaba débilmente en embriones de rata en el cerebro anterior,
en el metencéfalo y en la médula espinal. También se detectó ARNm de
neublastina en el ojo (retina), ganglios de la raíz dorsal,
ganglios del trigémino (V) y en los riñones, pulmones, corazón,
hígado e intestinos. En ratas recién nacidas (P0) había expresión
notable de neublastina en la corteza y el cuerpo estriado. También
se detectó expresión de neublastina en el bulbo olfativo y en el
hipocampo. En las ratas de 7 días de edad (P7), la neublastina se
expresaba en la corteza, el cuerpo estriado, el bulbo olfativo y en
el cerebelo. Se observó una señal notable en el hipocampo. En las
ratas adultas, se detectaron niveles muy bajos o indetectables de
expresión de neublastina en la mayoría de las áreas del cerebro. Se
detectaron señales débiles en el núcleo talámico, y se detectó
expresión notable de neublastina en el hipocampo.
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El marco de lectura abierto o región codificante
(CDS), identificada en el ID SEC Nº: 8 codifica el
pre-pro-polipéptido (denominado
"pre-pro-neublastina"). La
secuencia de aminoácidos prevista de este marco de lectura abierto
se muestra en el ID SEC Nº: 9. De acuerdo con el ID SEC Nº: 9 se
identificaron 3 variantes de polipéptidos de neublastina. Estas
variantes incluyen: (i) el polipéptido designado en el presente
documento NBN140, que tiene la secuencia de aminoácidos designada
como ID SEC Nº: 10; (ii) el polipéptido designado en el presente
documento NBN116 que tiene la secuencia de aminoácidos designada
como ID SEC Nº: 11; y (iii) el polipéptido denominado en el
presente documento NBN113, que tiene la secuencia de aminoácidos
designada como ID SEC Nº: 12.
De forma similar, de acuerdo con la región
codificante (CDS) identificada en el ID SEC Nº: 3. que codifica el
pre-pro-polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos (designada como ID SEC Nº: 4), se
identificaron tres variantes de neublastina. Estas variantes
incluyen: (i) el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
designada como ID SEC Nº: 5; (ii) el polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos designada como ID SEC Nº: 6; y (iii) el
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos designada como ID
SEC Nº: 7.
Basándose en un alineamiento de secuencias
múltiples basado en Clustal W (1.75), la neublastina del ID SEC Nº:
9 (línea 2) se alineó con las secuencias de aminoácidos de la
neurturina (ID SEC Nº: 49; línea 1), la persefina (ID SEC Nº: 50;
línea 3) y GDNF (ID SEC Nº: 51, línea 4). Este alineamiento se
muestra en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
A partir del alineamiento de las secuencias de
aminoácidos en la Tabla 3, se puede ver que la neublastina tiene 7
restos de cisteína conservados en posiciones que son conservadas
dentro de la superfamilia de TGF-\beta. En una
realización, el polipéptido de neublastina preferido contiene 7
cisteínas conservadas como en el ID SEC Nº: 2 en las posiciones 8,
35, 39, 72, 73,101 y 103, o como en los ID SEC Nº: 4 y 9 en las
posiciones 43, 70, 74, 107, 108, 136 y 138. Se sabe que estos 7
restos de cisteína conservados dentro de la superfamilia de
TGF-\beta forman tres enlaces disulfuro
intramonómeros (contemplados, p. ej., en el ID SEC Nº: 2 entre los
restos de cisteína 8-73, 35-101, y
39-103, y p. ej.,en los ID SEC Nº: 4 y 9 entre los
restos de cisteína 43-108, 70-136,
y 74-138) y un enlace disulfuro entre monómeros
(contemplado, p. ej.,en el ID SEC Nº: 2 entre los restos de
cisteína 72-72, y p. ej.,en los ID SEC Nº: 4 y 9
entre los restos de cisteína 107-107), los cuales
junto con la región de cadena beta extendida constituyen el patrón
estructural conservado para la superfamilia
TGF-\beta. Véase, p. ej., Daopin y col.,
Proteins 1993, 17,
176-192.
176-192.
De acuerdo con el alineamiento de secuencias, la
neublastina demostró ser un miembro de la subfamilia de GDNF de los
factores neurotróficos (LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP -
SAxxCGC, la huella dactilar de la subfamilia GDNF, subrayada en la
tabla 3).
Los polipéptidos de neublastina truncados
descritos en el presente documento preferiblemente incluyen una
secuencia de polipéptido que abarca los 7 restos de cisteína
conservados en la secuencia de neublastina. Por ejemplo, los
polipéptidos de neublastina truncados preferiblemente incluyen los
aminoácidos 15-113 (una forma de NBN de 99 AA) de
un polipéptido NBN113, o los aminoácidos 12-113 del
polipéptido NBN113 (una forma de NBN de 102 AA). Estas secuencias
de aminoácidos se pueden encontrar, p. ej., en los aminoácidos
42-140 de la secuencia del polipéptido de NBN
humano mostrada en el ID SEC Nº: 9 (polipéptido de NBN de 99 AA; ID
SEC Nº: 48); y los aminoácidos 39-140 del ID SEC
Nº: 9 (polipéptido de NBN de 102 AA; ID SEC Nº: 45),
respectivamente. Las secuencias también se encuentran, p. ej., en
los aminoácidos 126-224 del ID SEC Nº: 34
(polipéptido de NBN de rata de 99 AA) y en los aminoácidos
123-224 del ID SEC Nº: 34 (polipéptido de NBN de
rata de 102 AA). De la misma forma, también están incluidas las
secuencias de neublastina truncada de NBN99, NBN100, NBN101, NBN102,
NBN103, NBN104, NBN105, NBN106, NBN107, NBN108, NBN109, NBN110,
NBN111 y NBN112, definidas
antes.
antes.
Se calculó la homología de la neublastina con
otros miembros de la familia de GDNF, y los resultados se presentan
en la siguiente tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La neublastina se ha producido tanto en células
eucariotas como procariotas, como se describe a continuación.
Vectores de expresión. Se insertó el ADNc
que codifica la neublastina en el vector de expresión eucariota
pUbi1Z. Este vector se generó por clonación del promotor humano UbC
en una versión modificada de pcDNA3.1/Zeo. El pcDNA3.1/Zeo sin
modificar está disponible en el comercio (Invitrogen). El
pcDNA3.1/Zeo modificado es más pequeño que el vector de origen,
porque se han eliminado el gen de la ampicilina (de la posición 3933
a 5015) y una secuencia de la posición 2838 a la 3134. En esta
versión modificada de pcDNA3.1/Zeo, el promotor de CMV se sustituyó
por el promotor UbC de pTEJ-8 (Johansen y col.,
FEBS Lett. 1990 267 289-294), dando
como resultado pUbi1Z.
Expresión en células de mamífero. El
vector pUbi1Z que contenía las secuencias codificantes de
neublastina después se transfectó en la línea celular de mamífero
HiNB5, que es una línea celular neural de rata inmortalizada
(Renfranz y col., Cell, 66, pp. 713-729
(1991)). Se han establecido varias líneas celulares HiB5 que
expresan neublastina de forma estable (determinadas por
RT-PCR). En una de estas líneas celulares estables,
se confirmó la expresión de HiB5pUbi1zNBN22 por hibridación del ARN
total en una transferencia northern con una sonda de neublastina
marcada con ^{32}P. Los resultados de estos estudios se muestran
en la fig. 2. Después se usó HiB5pUbi1zNBN22 como una fuente de
neublastina para algunos estudios de la actividad neurotrófica de la
neublas-
tina.
tina.
La fig. 2 muestra la expresión del ADNc de
neublastina en el clon HiB5pUbi1zNBN22 (es decir, transferencia
northern con sonda de ADNc de neublastina marcado con ^{32}P de la
presente invención como se ha descrito antes). La transferencia se
preparó de ARN total extraído de células transfectadas HiB5, células
HiB5pUbi1zNBN22 y células HiB5pUbi1zGDNF14, respectivamente, como
se indica. Las posiciones de las bandas de ARNr 28S y 18S
correspondientes a 4,1 kb y 1,9 kb, respectivamente, se indican en
la transferencia.
Como se muestra en la fig. 3, los anticuerpos
producidos contra los polipéptidos derivados de neublastina también
reconocían una proteína de aproximadamente 13 kilodaltons
("kD") en medio condicionado del clon HiB5pUbi1z
GDNF14 pero no de las células HiB5 no transfectadas (véase el ejemplo 6).
GDNF14 pero no de las células HiB5 no transfectadas (véase el ejemplo 6).
Se determinó que los pesos moleculares previstos
de los polipéptidos de neublastina no modificados (es decir, que
carecían de modificaciones postraduccionales) NBN140 (ID SEC Nº:
10), NBN116 (ID SEC Nº: 11) y NBN113 (ID SEC Nº: 12) eran 14,7
kilodaltons ("kD"), 12,4 kD y 12,1 kD, respectivamente.
Procedimientos: Se preparó una
transferencia northern con ARN total (10 \mug) a partir de células
HiB5 no transfectadas y el clon HiB5pUbi1zNBN22 por electroforesis
en un gel de agarosa-formaldehído al 0,8% y se
transfirió por adsorción a una membrana de nailon (Duralone,
Stratagene). La transferencia se hibridó y se lavó como se describe
en el ejemplo 3 con una sonda marcada con ^{32}P de 1,3 kb
preparada por marcaje aleatorio que cubre el ID SEC Nº: 8 y
nucleótidos adicionales de 5'UTR y 3'UTR del ADNc de neublastina. La
transferencia se expuso a una película Hyperfilm MP (Amersham) a
-80ºC usando pantallas intensificadoras.
El medio condicionado de HiB5pUbi1zNBN22 o
células Hib5 no transfectadas incubado toda la noche en medio sin
suero complementado con complemento de N2 (Life Technologies; nº de
cat. 17502-048) se concentró y se separó en geles
de poliacrilamida al 15% (Amersham Pharmacia Biotech; nº de cat.
80-1262-01). Las proteínas se
transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech; nº
de cat. RPN-303F) y se bloquearon los sitios de
unión de proteínas no específicos con leche en polvo sin grasa al
5% en PBS con Tween-20 al 0,1%. Las membranas se
incubaron toda la noche con un anticuerpo de neublastina policlonal
(1:1000), seguido de incubación con un anticuerpo IgG
anti-conejo secundario (Amersham Pharmacia Biotech;
nº de cat. NA 934) conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:
2000). La inmunotinción se visualizó usando quimioluminiscencia
potenciada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech; nº de cat. RPN2109) o
ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech; nº de cat. RPN2132) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (Amersham).
Los resultados de estos experimentos se muestran
en la figura 3. La figura 3A y 3B son ilustraciones de la expresión
de la proteína de neublastina en células HiB5 transfectadas. El
medio de toda la noche de células HiB5 no transfectadas (cale 1) o
de un clon de HiB5 estable transfectado con ADNc de neublastina
(calle 2) se concentró como se describe más adelante. Después el
medio se analizó por transferencia Western usando dos anticuerpos
policlonales diferentes, Ab-1 y Ab-2
descritos en el Ejemplo 10, específicos para la neublastina. En el
medio derivado de células transfectadas, se encontró que ambos
anticuerpos reconocían una proteína con un peso molecular de
aproximadamente 15 kDa. Esta proteína no se veía en células HiB5 no
transfectadas.
El ADNc clonado que codifica la neublastina
también se puede insertar en otro vector de expresión eucariota, p.
ej., el vector de expresión eucariota TEJ-8
(Johansen y col, FEBS Lett., 1990.267:
289-294) o pcDNA-3 (Invitrogen), y
el plásmido de expresión resultante se puede transfectar en una
línea celular de mamífero alternativa, p. ej., células de ovario
de hámster chino ("CHO"), las líneas celulares HEK293, COS,
PC12 o RN33b, o una célula de tallo neural humano. Las líneas de
células estables que expresaban neublastina se usaron, p. ej., para
producir la proteína de neublastina.
Construcción del plásmido pJC070.14 Con
el fin de expresar el ADNc de neublastina en las células de ovario
de hámster chino, se insertó un fragmento de ADNc que codificaba la
forma pre-pro de la neublastina humana, en el
vector de expresión de mamífero pEAG347 para generar el plásmido
pJC070.14.pEAG347 que contiene el tándem de promotores temprano de
SV40 y tardío principal de adenovirus (derivados del plásmido
pAD2beta; Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 5: 281
(1985)), un sitio único de clonación NotI, seguido de las señales de
terminación de la transcripción tardía de SV40 y polyA (derivadas
del plásmido pCMVbeta; MacGregor and Caskey, Nucl. Acids.
Res. 17: 2365 (1989)). Además, pEAG347 contiene una cadena
principal plasmídica derivada de pUC19 y una dhfr derivada de
pSV2dhfr para la selección de MTX y amplificación en células CHO
transfectadas.
El plásmido pJC070.14 se generó en dos etapas.
Primero se aisló un fragmento que codificaba la forma
pre-pro de la neublastina humana del plásmido
pUbi1Z-NBN usando la reacción en cadena de la
polimerasa con los oligonucleótidos KD2-824
5'AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG3' (ID SEC Nº: 31),
KD2-825 5'TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC
AGCCGCAGG3' (ID SEC Nº: 32) y PFU polimerasa. El fragmento se clonó
en el sitio Srf-1 de pPCR-Script Amp
SK(+) para generar el plásmido pJC069. En la segunda etapa, se
llevó a cabo una digestión parcial con Not-1 en el
plásmido pJC069 para generar un fragmento de 685 pb (que contiene el
gen de neublastina) que se clonó en el sitio Not-1
del plásmido pEAG347 para generar el plásmido pJC070.14. La
transcripción del gen de neublastina en el plásmido pJC070.14 es
controlada por el promotor tardío principal de adenovirus.
Generación de líneas celulares CHO que
expresan neublastina. Se linearizaron 200 \mug de pJC070.14
por digestión con la endonucleasa de restricción
Mlu-1. Se extrajo el ADN con
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se hizo precipitar
con etanol. El ADN linearizado se volvió a suspender en Hepes 20 mM
pH 7,05, NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, dextrosa
6 mM (HEBS) y se introdujo en células \sim4E7 CHO dukx
Bl(dhfr-) (p23) por electroporación (280 V y 960
\muF). Después de la electroporación, las células se devolvieron
al cultivo en medio de Eagle modificado \alpha+ (MEM)
complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) durante dos días.
Después las células se tripsinizaron y se volvieron a poner en
placas de 100 mm (100.000 células/placa) en
\alpha-MEM (que carecía de ribo- y
desoxirribonucleósidos), complementado con FBS dializado al 10%,
durante 5 días. Posteriormente las células se dividieron a una
densidad de 100.000 células/placa de 100 mm, y se seleccionaron en
metotrexato 200 nM. Se recogieron las colonias resistentes y se
cambiaron a una escala de placas de 6 pocillos; el medio
condicionado de cada clon se cribó usando un ensayo específico para
la neublastina descrito a continuación. Los 12 clones que expresaban
el nivel más alto de neublastina se pasaron a una escala de
matraces T162 y posteriormente se volvieron a ensayar. Como se
muestra en la figura 10, las líneas celulares CHO producían
neublastina en el intervalo de 25 a 50 ng/ml.
Ensayo de complejo ternario para la
neublastina. La presencia de neublastina se evaluó en medio de
líquidos sobrenadantes de línea celular CHO usando una forma
modificada de un ensayo de complejo ternario descrito por Sanicola
y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6238 (1997).
En este ensayo, se puede evaluar la capacidad de
las moléculas de tipo GDNF para mediar la unión entre el dominio
extracelular de RET y diferentes correceptores, GFR\alpha1,
GFR\alpha2 y GFR\alpha3. Se generaron formas solubles de RET y
los correceptores como proteínas de fusión. Se ha descrito una
proteína de fusión entre el dominio extracelular de RET de rata y
la fosfatasa alcalina de placenta (RET-AP) y una
proteína de fusión entre el dominio extracelular de GFR\alpha1 de
rata (descrito en la solicitud publicada WO9744356; 27 de
noviembre, 1997, incorporada en el presente documento por
referencia) y el dominio Fc de la IgG1 humana
(rGFR\alpha1-Ig) (Sanicola y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94: 6238 (1997)).
Para generar una proteína de fusión entre el
dominio extracelular de GFR\alpha3 murino y el dominio Fc de IgG1
humana (mGFR\alpha3-Ig), se ligó un fragmento de
ADN que codifica los aminoácidos 1-359 de RETL3
murino a un fragmento que contiene el dominio Fc de la IgG1 humana
y se clonó en el vector de expresión pEAG347 para generar el
plásmido pGJ144. El plásmido pGJ144 se transfectó en células de
ovario de hámster chino (CHO) para generar una línea celular
estable que producía la proteína de fusión, la cual se purificó en
columna de inmunoafinidad de proteína A-Sefarosa
usando procedimientos estándar. En resumen, si la molécula de tipo
GDF puede mediar la unión del correceptor a RET en este ensayo,
entonces la proteína de fusión RET-AP será retenida
en la placa y se podrá medir la cantidad que es retenida usando un
sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina.
Se recubrieron placas para ELISA Dynex
Microlite-1 (Dynex Technologies) con anticuerpo de
cabra 1 \mug/ml específico para Fc humano en
bicarbonato/carbonato 50 mM, pH 9,6 durante 16 h. Las placas se
vaciaron y se llenaron con 300 \mul de I-block al
1% (Tropix) en TBS/Tween-20 al 0,5% (TBST), durante
1 h. Después de lavar 3 veces con TBST, los pocillos se llenaron
con 100 \mul de rGFR\alpha1-Ig o
mGFR\alpha3-Ig 1 \mug/ml diluido en medio
condicionado de células 293-EBNA que expresan el gen
de fusión RET-AP. Después se añadieron 100 \mul
de medio condicionado de clones de neublastina de CHO al pocillo
superior de una columna de pocillos, y se llevaron a cabo
diluciones seriadas de 2 veces hacia abajo de cada fila de pocillos,
y se incubaron durante 1,5 h a temperatura ambiente. Después las
placas se lavaron tres veces con TBST, y dos veces con Tris 200 mM
pH 9,8, MgCl_{2} 10 mM (tampón de CSPD). Después la solución de
lavado se sustituyó por CSPD 425 \muM (Tropix) en tampón de CSPD
que contenía potenciador de quimioluminiscencia Sapphire 1 mg/ml
(Tropix), y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. El
rendimiento quimioluminiscente se midió usando un luminómetro
Dynatech.
Los experimentos iniciales investigaron si la
neublastina producida por las líneas celulares CHO podía mediar la
unión de GFR\alpha1 o GFR\alpha3 al dominio extracelular de RET.
Como se muestra en la figura 11, el medio condicionado del clon de
células CHO nº 53 produjo una señal fuerte en el ensayo de complejo
ternario cuando se incluyó la proteína de fusión
mGFR\alpha3-Ig, pero no había señal cuando se
incluyó la proteína de fusión rGFR\alpha1-Ig, lo
que indicaba que la neublastina se une a GFR\alpha3 pero no a
GFR\alpha1. Este comportamiento distingue claramente la
neublastina de GDNF; como se muestra en la figura 11, el GDNF se
une a GFR\alpha1 pero no a GFR\alpha3. No se observó señal con
la proteína de fusión del correceptor, cuando se ensayó el medio
condicionado de la línea celular CHO de origen o medio directo.
Con el fin de cuantificar los niveles de
expresión de neublastina en las líneas celulares CHO, se preparó
una curva patrón usando rGFR\alpha1-Ig y GDNF
empezando con una concentración de 1 ng/ml. Después se calcularon
las concentraciones de neublastina de diferentes líneas celulares
CHO usando esta curva patrón; los niveles producidos por 5 líneas
celulares CHO se muestran en la figura 10. Debido a que este cálculo
depende la hipótesis no ensayada de que la afinidad de unión entre
el GDNF y GFR\alpha1 es similar a la afinidad de unión entre la
neublastina y GFR\alpha3, estos niveles son sólo aproximados.
Análisis de neublastina de líquidos
sobrenadantes de líneas celulares CHO. Con el fin de analizar
más la neublastina producida por las líneas celulares CHO, se
extrajo la proteína del medio usando la proteína de fusión
GFR\alpha3-Ig y se analizó por transferencias
western con anticuerpos policlonales producidos contra péptidos de
neublastina.
En el primer experimento, se extrajo la
neublastina con mGFR\alpha3-Ig unido a perlas de
Sefarosa. Se unió mGFR\alpha3-Ig a perlas de
Sefarosa usando las condiciones sugeridas por el fabricante,
Pharmacia Inc. Se añadieron 100 \mul de
mGFR\alpha3-Ig-Sefarosa a muestras
de 1,0 ml de medio condicionado de una línea celular CHO de control
negativo o de la línea celular CHO que produce neublastina nº 16.
Las suspensiones se incubaron durante 2 horas en una plataforma
oscilante. Se centrifugó cada suspensión y se quitó el líquido
sobrenadante seguido de tres lavados con 1,0 ml de HEPES 10 mM, NaCl
100 mM, pH 7,5. Se volvió a suspender cada resina en 100 \mul de
2X tampón de muestra de reducción y se calentó a 100ºC durante 5
minutos. Se aplicaron 20 \mul de líquido sobrenadante de tampón
de muestra y 10 \mul de un patrón de peso molecular (FMC) a cada
pocillo de un gel de SDS-PAGE prefundido al
10-20% (Owl Scientific). Se hizo la electroforesis
del gel a una corriente constante de 40 mA durante 72 minutos.
Para el análisis de transferencia western, la
proteína se electrotransfirió a nitrocelulosa (Schleicher and
Schuell) en un aparato Hofer Scientific en un sistema de tampón de
CAPS 10 mM, metanol al 10%, SDS al 0,05%, pH 11,2 (45 minutos a
corriente constante de 400 mA). Después de la transferencia, se
quitó el filtro de nitrocelulosa de la caja y los marcadores de
peso molecular se visualizaron por tinción con una solución de
Ponseau S al 0,1% en ácido acético al 1% durante 60 segundos. La
membrana se cortó en dos secciones y el exceso de tinte se eliminó
por agitación suave en agua destilada. Las membranas se bloquearon
con leche en polvo sin grasa al 2% en TBS toda la noche a 4ºC. Las
membranas se incubaron individualmente con dos anticuerpos
anti-péptido de neublastina purificados por
afinidad (R30 y R31) con una concentración de 1,0 \mug/ml en leche
en polvo sin grasa al 2% en TBS). Las membranas se lavaron con 3
lavados de 10 minutos en TBS-Tween y se incubaron
en una dilución 1:5000 de conjugado de IgG-HRP
anti-conejo de cabra (Biorad) durante 30 minutos.
Las membranas se lavaron con 3 lavados de 10 minutos de
TBS-Tween y se revelaron con sustrato ECL
(Amersham). Como se muestra en la figura 12, se detectaron bandas
específicas en las proteínas extraídas de la línea celular CHO que
producía neublastina con ambos anticuerpos (calles 2 y 4), cuando
se compararon con las bandas observadas en las proteínas extraídas
de la línea celular de control negativo
(calles 1 y 3).
(calles 1 y 3).
El peso molecular de las especies inferiores es
aproximadamente 13 kD y probablemente representan el dominio maduro
de neublastina, generado después de escisión del dominio pro-. Esta
escisión se podía producir después de los restos de Arg de la
cuarta posición en uno cualquiera de los tres restos de escisión (p.
ej., -RXXR\downarrow-) presentes en la proteína de
pre-pro-neublastina, para generar
cualquiera de las formas de 140 AA, 116 AA o 113 AA, expuestas en
los ID SEC Nº: 10, 11 ó 12, respectivamente. Se determinó que los
pesos moleculares previstos de los polipéptidos de neublastina no
modificados (es decir, que carecen de modificaciones
postraduccionales) NBN140 (ID SEC Nº: 10), NBN116 (ID SEC Nº: 11),
y NBN113 (ID SEC Nº: 12) eran 14,7 kD, 12,4 kD, y 12,1 kD,
respectivamente. Será necesario otro análisis para confirmar la
estructura de esta especie así como de las otras bandas específicas
de neublastina.
En el segundo experimento, la neublastina se
extrajo con hGFRa3-Ig capturado en una placa ELISA.
Para generar una proteína de fusión entre el dominio extracelular
del GFR\alpha3 humano (descrito en la solicitud publicada
WO97/44356; 27 de noviembre, 1997, incorporada en el presente
documento por referencia) y el dominio Fc de la IgG1 humana
(hGFR\alpha3-Ig), se ligó un fragmento de ADN que
codifica los aminoácidos 1-364 de GFR\alpha3
humano con un fragmento que contiene el dominio Fc de la IgG1 humana
y se clonó en el vector de expresión CH269 descrito por Sanicola y
col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6238 (1997)). La
proteína de fusión codificada por este plásmido se expresó de forma
transitoria en células con antígeno nuclear codificado por el virus
293-Epstein-Barr (EBNA) y se
purificó en una columna de inmunoafinidad de Proteína
A-Sefarosa usando procedimientos estándar.
Se recubrieron 6 pocillos de una placa de 96
pocillos toda la noche a 4ºC con IgG anti-humana de
cabra (fragmento específico Fc\gamma; Jackson Immunulogics) con
una concentración de 25 \mug/ml en PBS (300 \mul/pocillo). Los
pocillos se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con 400
\mul de BSA al 1% en PBS. Después de 3 lavados con PBST (PBS +
Tween 20 al 0,05%), se añadieron a cada pocillo 300 \mul de
hGFR\alpha3-Ig (10 \mug/ml en PBS que contenía
BSA al 0,1%). La placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente
y se agitó suavemente (200 golpes/minuto) para maximizar la unión.
Después los pocillos se vaciaron y se lavaron otra vez 3 veces con
PBST. Se añadieron a cada uno de 3 pocillos 250 \mul de medio
condicionado de una línea celular CHO de control negativo o de la
línea celular CHO que producía neublastina nº 25. La placa se incubó
durante 3 h a temperatura ambiente y se agitó suavemente (300
golpes/minuto). Después los pocillos se lavaron 2 veces con PBST.
Se añadieron 25 \mul de tampón de carga de Laemli no reductor al
primer pocillo y la placa se agitó rápidamente durante 5 min para
eluir las proteínas unidas (1300 golpes/min). El contenido se
transfirió al siguiente pocillo y el procedimiento se repitió para
eluir las proteínas unidas en el segundo y tercer pocillo. Después
de añadir \beta-mercaptoetanol (5% final), las
muestras se hirvieron durante 5 minutos y se analizaron por
SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al
10-20%.
Para el análisis de transferencia western, las
proteínas se transfirieron a nitrocelulosa. La membrana se bloqueó
y se trató con una sonda en leche en polvo sin grasa al 5%, PBST y
se lavó en PBST. La neublastina se detectó por
electroquimioluminiscencia después de reacción con anticuerpos
policlonales (R30 y R31) producidos contra dos péptidos de
neublastina (1 \mug/ml) seguido de reacción con anticuerpos de
anti-conejo de cabra conjugados con HRP (BioRad).
Como se muestra en la figura 13, se detectaron 5 bandas específicas
de neublastina en las proteínas extraídas de la línea celular CHO
que producía neublastina (calle 2). Las dos bandas inferiores eran
muy similares a las bandas observadas en la figura 12; otra vez, la
banda inferior probablemente representa el dominio maduro de la
neublastina generada después de escisión del dominio pro.
El análisis posterior (no se muestran los datos)
de las bandas en la figura 13 muestra que la desglicosilación con
PGNasa F de la banda de aproximadamente 18 kD, reduce esta banda a
un tamaño equivalente a la banda más inferior en el gel de la
figura 13. Esto sugiere que la neublastina se puede producir como
una proteína glicosilada en células de mamíferos.
Con el fin de expresar el gen de neublastina en
E. coli, se construyeron genes sintéticos con contenido
inferior de GC y codones de E. coli preferidos. El gen
sintético se clona en dos vectores, pET19b y pMJB164, un derivado
de pET19b. La construcción con pET19b se muestra en la figura 14. En
esta construcción, la secuencia que codifica NBN113 se fusiona
directamente con una metionina de iniciación. Se muestran
construcciones de genes sintéticos adicionales para la NBN en los
ID SEC Nº: 52-54. La construcción con pMJB164 se
muestra en la figura 15. En esta construcción, la NBN113 se fusiona
con un marcador de histidina (es decir, 10 histidinas) separado por
un sitio de escisión de enteroquinasa. Se muestran construcciones de
genes sintéticos adicionales para la NBN fusionados con un marcador
de histidina en los ID SEC Nº: 55-57. La metionina
de iniciación precede al marcador de histidina.
En esta serie de experimentos se evaluó el
efecto del medio condicionado de células HiB5pUbi1zNBN22 que
producen neublastina descritas antes.
Preparación de cultivos: Se
diseccionaron el mesencéfalo ventral o la médula espinal de
embriones E14 de rata en solución salina de Hanks tamponada (HBSS)
fría. Se incubaron trozos de tejido en tripsina al 0,1% esterilizada
por filtración (Worthington) y DNasa al 0,05% (Sigma) en HBSS a
37ºC durante 20 min. Después los trozos de tejido se aclararon 4
veces en HBSS + DNasa al 0,05% y se disociaron usando una pipeta
automática de 1 ml. Después la suspensión se centrifugó a 600 rpm
durante 5 min y el sedimento se volvió a suspender en medio
condicionado de suero (SCM; DMEM con suero ternero fetal al 10%). El
número total de células se evaluó por el procedimiento de exclusión
con tinta azul de tripán con una densidad de 100.000 células/m^{2}
en portaobjetos de cámara de 8 pocillos recubiertos con
poli-L-lisina (Nunc) para evaluar la
supervivencia de neuronas dopaminérgicas o con 200.000
células/m^{2} en placas de 48 pocillos (Nunc) para mediciones de
la actividad de ChAT. Las células se incubaron en SCM en CO_{2}
al 5%/O_{2} al 95% y humedad al 95% a 37ºC durante
24-48 h antes de cambiar a medio sin suero (SFM)
con adición de factores neurotróficos.
Las células para evaluar la supervivencia de las
neuronas dopaminérgicas se dejaron durante 5 días en SFM +
adiciones de factor trófico y después se fijaron durante 5 min en
PFA al 4% y se tiñeron para la tirosina hidroxilada por
inmunohistoquímica.
Las células para la actividad de ChAT se dejaron
durante 3 días con SFM y después se lisaron en HBSS + Triton
X-100 al 0,1% y se congelaron inmediatamente en
hielo seco hasta la medición de la actividad de ChAT.
Adición de factor trófico: Se recogió
medio condicionado de HiB5 no transfectado de control o HiB5 que
producían neublastina (HiB5pUbi1zNBN22) o GDNF
(HiB5pUbi1zGDNF-L17). HiB5pUbi1zNBN22 produce
aproximadamente 20 ng de GDNF/24 horas/10^{5} células determinado
por GDNF-ELISA en medio condicionado recogido de las
células. Las respectivas líneas celulares se incubaron toda la
noche con DMEM + FCS al 1% y el líquido sobrenadante se recogió y
se almacenó a -20ºC hasta su uso. Los líquidos sobrenadantes se
diluyeron 1:50 en SFM cuando se añadieron a las células. Se
trataron pocillos por separado con líquido sobrenadante de control
de HiB5 (1:50) + GDNF recombinante de rata purificado (de 0,03 -
10 ng/ml).
Los resultados de estos experimentos se muestran
en la figura 4. Las figuras 4A-4C son ilustraciones
del efecto de la neublastina, segregada de células HiB5pUbi1zNBN22,
en la supervivencia de neuronas mesencefálicas ventrales,
dopaminérgicas, embrionarias de rata cultivadas y la actividad de
ChAT en neuronas motoras del nervio craneal colinérgico en medio
sin suero como se ha descrito antes en el ejemplo 5.1.
La fig. 4A es una ilustración de la curva de
respuesta a la dosis para GDNF recombinante en la actividad de ChAT
(dpm/hora) medido en DIV5 en cultivos sin suero que se establecieron
inicialmente de mesencéfalos ventrales de E14 (es decir, HiB5; GDNF
0,03 ng/ml; GDNF 0,1 ng/ml; GDNF 0,3 ng/ml; GDNF 1 ng/ml; GDNF 10
ng/ml; GDNF 100 ng/ml).
La fig. 4B es una ilustración de la actividad de
ChAT (dpm/hora) medida en DIV5 en cultivos sin suero que se
establecieron inicialmente de mesencéfalos ventrales de E14. Se
añadieron medios condicionados diluidos de células HiB5pUbi1zNBN22
(neublastina) que producían neublastina o células
HiB5GDNFL-17 que producían GDNF
(GDNFL-17) como se indica en la figura (es decir,
neublastina 1:10; neublastina 1:50; GDNF L-17
1:50).
La fig. 4C es una ilustración del número de
células inmunorreactivas para la tirosina hidroxilasa por pocillo
(Nº de células TH+/pocillo) en DIV7 en cultivos sin suero que se
establecieron inicialmente de mesencéfalos ventrales de rata E14.
Se añadió medio condicionado diluido de células HiB5 no
transfectadas (HiB5) o de células HiB5pUbi1zNBN22 que producían
neublastina (neublastina) o de GDNF recombinante, en diferentes
concentraciones, como se indica en la figura (es decir, HiB5 1:10;
HiB5 1:40; GDNF 0,1 ng/ml; GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml; y
neublastina 1:40).
El medio condicionado de células HiB5
transfectadas con neublastina diluido 1:40 aumenta
significativamente el número de células inmunorreactivas para TH
por pocillo comparado con las células HiB5 de control (no
transfectadas) con una dilución equivalente y una inferior (1:10 y
1:40) (véase, p. ej., la fig. 4B). El aumento de células
inmunorreactivas para TH es comparable con el aumento visto con una
concentración de GDNF máxima (10 ng/ml). Esto indica que la
neublastina segregada al medio tiene un efecto en la supervivencia
de la población de neuronas dopaminérgicas de mesencéfalo ventral
embrionario de rata. En contraste, a diferencia del GDNF segregado
de células HiB5 transfectadas, no se ve efecto del medio
condicionado de células HiB5 transfectadas con neublastina en otra
población neuronal en el mismo cultivo, las neuronas colinérgicas
(véase, p. ej., la fig. 4A).
Este experimento evaluaba el efecto de
cocultivar células HiB5pUbi1zNBN22 que producen neublastina con
cultivos de láminas de mesencéfalos ventrales de embriones
porcinos.
Preparación de los cultivos: Se aislaron
mesencéfalos ventrales (VM) de embriones porcinos (E28; n= 12) en
condiciones estériles, se cortaron en láminas de 400 \mum y se
pusieron en solución salina equilibrada de Gey (GIBCO) enfriada,
con glucosa (6,5 mg/ml). Las láminas de tejido se cultivaron por el
procedimiento de cultivo de interfase desarrollado originalmente
por Stoppini y col. (L. Stoppini, PA. Bucks, D. Mutter, J.
Neurosci. Methods 1991, 37, 173-182).
Brevemente, las láminas se pusieron en membranas
semiporosas (Millipore, 0,3 \mum; 8 láminas/membrana
correspondiente a un VM) puestas como insertos en placas de 6
pocillos (Costar) con medio que contenía suero (Gibco BRL). Cada
pocillo contenía 1 ml de medio (Optimem al 50%, suero de caballo al
25%, solución salina equilibrada de Hank al 25% (todos GIBCO))
complementado con D-glucosa hasta una concentración
final de 25 mM. El día 0, se sembraron 7000 células HiB5pUbi1zNBN22
transfectadas (neublastina) o 7000 células HiB5 no transfectadas
(control) en cada lámina de tejido. Los cocultivos se hicieron
crecer primero en un incubador a 33ºC durante 48 horas, dejando las
células HiB5 inmortalizadas con un oncogén sensible a la temperatura
para proliferar, y después se pusieron en un incubador a 37ºC,
donde las células HiB5 se diferenciaban. El medio se cambió dos
veces por semana. No se usaron antimicóticos ni antibióticos en
ninguna etapa.
Determinación de la dopamina por HPLC: El
día 12 y 21 in vitro, se recogió el medio de cultivo y se
analizó la dopamina usando HPLC con detección electroquímica (W.N.
Slooth, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 1995 60
141-49).
Procesamiento del tejido e
inmunohistoquímica: El día 21, los cultivos se fijaron en
paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato durante 60 min, se
deshidrataron en una solución de sacarosa al 20% durante 24 horas,
se congelaron, se seccionaron en el criostato a 20 \mum (4
series), y se montaron en portaobjetos de microscopio recubiertos
de gelatina. Una serie de secciones se inmunotiñó para la tirosina
hidroxilasa (TH). Brevemente, las secciones se lavaron en solución
salina con tris 0,05 M (TBS, pH 7,4) que contenía Triton
X-100 al 1% durante 3x15 min y se incubaron con
suero bovino fetal al 10% (FBS, Life Technologies) en TBS durante 30
min. Después el tejido se incubó durante 24 horas a 4ºC con
anticuerpo monoclonal anti-TH de ratón (Boehringer
Mannheim) diluido 1:600 en TBS con FBS al 10%. Después de aclarar en
TBS con Triton X-100 al 1% durante 3x 15 min, las
secciones se incubaron durante 60 min con anticuerpo IgG
anti-ratón biotinilado (Amersham) diluido 1:200 en
TBS con FBS al 10%. Después las secciones se lavaron con TBS con
Triton X-100 al 1% (3x 15 min) y se incubaron
durante 60 min con estreptavidina-peroxidasa (Dako)
diluido 1:200 en TBS con FBS al 10%. Después de lavar en TBS (3x 15
min), la actividad de unión se visualizó por tratamiento con
3,3-diaminobencidina al 0,05% (Sigma) en TBS que
contenía H_{2}O_{2} al 0,01%. Finalmente, las secciones se
deshidrataron en alcohol, se aclararon en xileno y se cubrieron con
el cubreobjetos en Eukitt.
Recuentos de células y análisis
morfométrico: Se llevó a cabo la cuantificación de las neuronas
inmunorreactivas para TH-ir usando un microscopio
de campo brillante (Olympus). Sólo se contaron las células que
presentaban una tinción intensa con una estructura celular bien
conservada y un núcleo distinguible. El cálculo se basó en los
recuentos de células en cada cuarto de sección de cultivo usando un
objetivo de x20. El número de células se corrigió para el recuento
doble de acuerdo con la fórmula de Abercrombie (M. Abercrombie,
Anat. Rec. 1946 94 239-47), usando el
diámetro medio de los núcleos en las neuronas TH-ir
(6,6\pm0,2 \mum, n = 30). Se calculó el tamaño de los núcleos
usando un sistema de seguimiento de neuronas (Neurolucida,
MicroBrightField, Inc.).
Los resultados de estos experimentos se muestran
en la fig. 5. Las figuras 5A-5C son ilustraciones
del efecto de la neublastina segregada de células HiB5pUbi1zNBN22
en la función y supervivencia de cultivos de láminas de neuronas
mesencefálicas ventrales dopaminérgicas embrionarias de cerdo
cocultivadas con células HiB5pUbi1zNBN22 (neublastina) o células
HiB5 (control) como se describe abajo.
La fig. 5A y fig. 5B ilustran la liberación de
dopamina al medio en DIV12 (dopamina (pmol/mol) - día 12 y DIV21
(dopamina (pmol/ml) - día 21), respectivamente. La fig. 5C es una
ilustración del número de células inmunorreactivas para la tirosina
hidroxilasa por cultivo (células TH-ir por cultivo)
en DIV21.
El día 12, el análisis de HPLC puso de
manifiesto que el medio de los cocultivos de
HiB5-neublastina contenía 84% más de dopamina que
el medio de los cocultivos de HiB5-C (fig. 5A). El
día 21 la diferencia era de 78% (fig. 5B), y los recuentos de
células mostraron que los cocultivos de
HiB5-neublastina contenían 66% más neuronas
inmunorreactivas para la tirosina hidroxilasa que los cocultivos de
HiB5-C (P<0,05) (fig. 5C). Esto indica que la
neublastina segregada del clon HiB5pUbi1zNBN22 tiene un efecto de
supervivencia potente en las neuronas dopaminérgicas embrionarias
porcinas.
Este ejemplo muestra la actividad neurotrófica
de un polipéptido de neublastina comparado con factores
neurotróficos conocidos.
Se sacrificaron ratones hembra preñados por
dislocación cervical. Los embriones se procesaron para el cultivo
como sigue.
Se usaron agujas de tungsteno afiladas
electrolíticamente para diseccionar los ganglios de la raíz dorsal
de las etapas indicadas de ratones C57/B16 (Mollegaard Breeding,
Dinamarca). Los ganglios embrionarios se incubaron durante 5 min a
37ºC con tripsina al 0,05% (Gibco/BRL) en solución salina
equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Los ganglios
postnatales se trataron con colagenasa/dispasa 1 mg/ml durante 30 a
45 minutos y después tripsina/DNasa al 0,25% durante 15 minutos.
Después de separar la solución de tripsina, los ganglios se lavaron
una vez con 10 ml de DMEM que contenía suero de caballo inactivado
con calor al 10%, y se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur
esmerilada a la llama para dar una sola suspensión de células.
Las células se pusieron en placas de 24 pocillos
(Nunc), que se recubrieron previamente con poliornitina (0,5 mg/ml,
toda la noche) y laminina (20 mg/ml durante 4 h; Gibco/BRL). Las
neuronas se incubaron a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5%
humidificado, en un medio definido que consistía en Hams F14
complementado con glutamina 2 mM, albúmina de suero bovino al
0,35%, progesterona 60 ng/ml, putrescina 16 mg/ml,
L-tiroxina 400 ng/ml, selenito de sodio 38 ng/ml,
triyodo-tironina 340 ng/ml, penicilina 60 mg/ml y
estreptomicina 100 mg/ml.
Después de 48 horas de incubación, las neuronas
se reconocían claramente por su morfología bipolar con ópticas de
contraste de fase. Se evaluó el porcentaje de supervivencia de
neuronas en ausencia o presencia de factores tróficos (añadidos al
medio de cultivo antes de poner las neuronas en placas con 10
ng/ml), o de medio condicionado de las células HiB5pUbi1zNBN22 que
producen neublastina, contando las neuronas en los pocillos a las
48
horas.
horas.
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la fig. 9, en cuya figura:
0 representa el experimento de control (en
ausencia de factores);
1 representa experimentos en presencia de
GDNF;
2 representa experimentos en presencia de
neurturina;
3 representa experimentos en presencia de la
neublastina de la invención;
La fig. 9 presenta datos de experimentos
llevados a cabo en células DRG aisladas de fetos en desarrollo en
diferentes momentos de tiempo designados como sigue:
E12 representa el día embrionario 12;
E16 representa el día embrionario 16;
P0 representa el día de nacimiento;
P7 representa el día 7 después del nacimiento;
y
P15 representa el día 15 después del
nacimiento.
Estos resultados muestran claramente que el
factor neurotrófico de la invención muestra actividades comparables,
o incluso mejores que las de los factores neurotróficos bien
establecidos.
Con el fin de ensayar la capacidad de la
neublastina (neublastina) para proteger las neuronas dopaminérgicas
nigrales del adulto (DA) frente a la degeneración inducida por
6-hidroxidopamina, se usó un modelo de rata de la
enfermedad de Parkinson (Sauer and Oertel, Neuroscience 1994,
59, 401-415) y transferencia de neublastina de gen
lentivírico.
Producción de lentivirus: Para generar un
vector de transferencia lentivírico que codifique neublastina,
pHR'-neublastina, se subclonó un fragmento BamH1 de
1331 pb del ADNc de neublastina en el sitio BamH1/Bg1 II de pSL301
(Invitrogen). A partir de esta construcción se cortó un fragmento
BamH1/Xho1 de 1519 pb y se ligó en el sitio BamH1/Xho1 de pHR' que
lleva un fragmento postraduccional del virus de la hepatitis de la
marmota (Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ: "Woodchuck
hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances
expression of transgenes delivered by retroviral vectors"; J.
Virol. 1999, 73 (4) 2886-2892). Para generar
pHR-GDNF se ligó un fragmento BamH1/Xho1 de 701 pb
de pUbi1z-GDNF en el sitio BamH1/Xho1 de pHR'.
La producción del vector lentivírico está
descrita p. ej. por Zufferey y col. (Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ,
Naldini L, Trono D: "Multiply attenuated lentiviral vector
achieves efficient gene delivery in vivo"; Nat.
Biotechnol. 1997, 15 (9) 871-875). Brevemente,
las construcciones de transferencia y los plásmidos auxiliares
pR8.91 y pMDG se cotransfectaron en células 293T. Los viriones
liberados al medio se recogieron 48 y 72 h después de la
transfección. Para concentrar el virus el medio se centrifugó 1,5 h
a 141.000 g, y el sedimento se disolvió en DMEM. La valoración de
un control que llevaba el gen de la proteína fluorescente verde
("GFP") se determinó que era 10^{8} unidades transformantes
(UT)/ml por la fluorescencia de GFP en células 293T. Se usó una
técnica de transferencia en ranura de ARN (von Schwedler U, Song J,
Aiken C, Trono D: "Vif is crucial for human immunodeficiency
virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells"; J.
Virol. 1993 67 (8) 4945-4955) para determinar la
valoración de partículas víricas. En el líquido sobrenadante de
GDNF y el líquido sobrenadante de neublastina había 10 veces menos
partículas comparados con el líquido sobrenadante de GFP.
Procedimientos quirúrgicos: Todos los
trabajos que implicaban animales se llevaron a cabo de acuerdo con
el conjunto de normas del Comité Ético para el Uso de Animales de
Laboratorio en la Universidad de Lund.
Se usó un total de 21 ratas Sprague Dawley
hembras adultas jóvenes (B&K Universal, Estocolmo, Suecia) y se
alojaron con ciclos de 12 horas de luz:oscuridad con acceso libre a
comida para ratas y agua. El marcaje retrógrado y las lesiones por
6-OHDA se llevaron a cabo 3 semanas antes de la
lesión de acuerdo con Sauer y Oertel [Sauer and Oertel,
Neuroscience 1994 59: 401-415]. Brevemente, a
las ratas con anestesia de equitesina (0,3 ml/100g) se les inyectó
bilateralmente 0,2 \mul de una solución al 2% (disuelto en NaCl
al 0,9%) del trazador retrógrado Fluoro-Gold (FG;
Fluorochrome, Inc., Englewood, CO). Las inyecciones se hicieron
usando una jeringuilla de Hamilton de 2 \mul en las coordenadas:
AP= +0,5 mm; ML= \pm3,4 mm respecto al bregma; DV= -5,0 mm
respecto a la duramadre y la barra de incisión fijada a 0,0 mm.
Además, se inyectaron 0,05 \mul/ml dejando otros 5 min antes de
retirar la aguja.
Catorce días después de las inyecciones de FG,
los animales recibieron un total de 5 depósitos (1 \mul/depósito)
de un vector lentivírico que llevaba el gen de la proteína verde
fluorescente (GFP), neublastina o GDNF. Cuatro de los depósitos
estaban en el cuerpo estriado junto con los dos conductos de la
agujas en las siguientes coordenadas:
AP= +1,0 mm, ML= -2,6 mm, DV_{1} = -5,0 mm DV_{2}= -4,5 mm y AP = 0,0 mm, ML= -3,7 mm, DV_{1}= -5,0 mm DV_{2} =
-4,5 mm. El depósito sobre la sustancia negra se hizo en AP= -5,2 mm, ML= -2,0 mm, DV_{1} = -6,3 mm. La barra dental se fijó en -2,3 mm.
AP= +1,0 mm, ML= -2,6 mm, DV_{1} = -5,0 mm DV_{2}= -4,5 mm y AP = 0,0 mm, ML= -3,7 mm, DV_{1}= -5,0 mm DV_{2} =
-4,5 mm. El depósito sobre la sustancia negra se hizo en AP= -5,2 mm, ML= -2,0 mm, DV_{1} = -6,3 mm. La barra dental se fijó en -2,3 mm.
Veintiún días después del marcaje retrógrado, y
7 días después de las inyecciones lentivíricas los animales se
volvieron a anestesiar con una jeringuilla Hamilton de 10 \mul y
se inyectó un solo depósito de 20 \mug de 6-OHDA
(Sigma; calculado como base libre y disuelta en 3 \mul de solución
salina enfriada con hielo complementada con ácido ascórbico al
0,02%) en el cuerpo estriado derecho en el mismo sitio que los
depósitos de FG. La velocidad de inyección era 1 \mul/min,
dejando otros 3 min antes de retirar la aguja.
Procesamiento del tejido: A los 21 días
después de la inyección de 6-OHDA, los animales se
anestesiaron profundamente con hidrato de cloral y se perfundieron
transcardiacamente con solución salina (pH 7,4; temperatura
ambiente) durante 1 min seguido de 200 ml de solución de
formaldehído enfriada con hielo (paraformaldehído al 4% en tampón
de fosfato 0,1 M, pH 7,4). Se diseccionaron los cerebros y después
se fijaron en el mismo fijador durante 3-4 horas y
después se transfirieron a sacarosa al 25%/tampón de fosfato 0,1 M
durante 48 horas. Se cortaron 5 series de secciones de 40 \mum a
lo largo del cuerpo estriado y la sustancia negra (SN) en un
microtomo de congelación.
Cálculo cuantitativo de las neuronas
dopaminérgicas en la SN: Se calculó el número de FG marcado en
las partes compactas de la SN mediante un observador ciego como se
ha descrito previamente [Sauer and Oertel, Neuroscience 1994
59: 401-415]. Brevemente, se usaron 3 secciones
consecutivas centradas entorno al nivel del núcleo terminal medio
del conducto óptico accesorio (MTN; -5,3 en el atlas de Paxinos y
Watson (1997)) y se contaron todas las neuronas marcadas/teñidas
lateralmente al MT con un aumento de 40x
(n=6-7/grupo). Las neuronas marcadas con FG se
incluyeron si eran fluorescentes brillantes con
epi-iluminación a 330 nm, presentaban un perfil
neuronal y cubrían al menos un proceso neurítico.
En el lado de la lesión en los animales que
recibieron inyecciones de lentivirus que llevaban GFP, el número de
neuronas nigrales positivas para FG se redujo al 18% de las del lado
intacto. En contraste, los animales a los que se inyectó
lenti-neublastina mostraron una protección casi
completa del número de neuronas nigrales positivas para FG (89%).
Era tan eficaz como los animales tratados con
lenti-GDNF donde 87% de las neuronas marcadas de
forma retrógrada permanecían en el lado lesionado. Esto muestra que
la neublastina es un factor de supervivencia potente para las
neuronas dopaminérgicas nigrales de adulto lesionadas, y que es tan
potente como el GDNF.
La fig. 6 es una ilustración del efecto in
vivo de la neublastina producida por lentivirus en neuronas
dopaminérgicas nigrales. Las neuronas de las partes compactas de la
SN, en ratas hembra Sprague Dawley, se marcaron de forma retrógrada
con Fluoro-Gold (FG), 3 semanas antes de una sola
inyección de 6-hidroxildopamina
(6-OHDA) en el cuerpo estriado derecho. Una semana
antes de la inyección de 6-OHDA, los animales
recibieron inyecciones con vectores lentivíricos que expresaban
neublastina (neublastina), GDNF (GDNF) o proteína fluorescente verde
(GFP) como se indica en la figura. Veintiún días después de las
inyecciones de 6-OHDA, se determinó el número de
neuronas marcadas con FG en ambos lados del cuerpo estriado. La
figura muestra el porcentaje (% lesión de FG/intactas) de neuronas
marcadas con FG en el lado lesionado (derecho) frente al lado
intacto (izquierdo) del cuerpo estriado de los tres grupos de
animales.
Para preparar los anticuerpos contra la
neublastina, se inmunizaron 2 conejos con el péptido 1:
CRPTRYEAVSFM
DVNST(aminoácidos 108-124 del ID SEC Nº: 9); o el péptido 2: ALRPPPGSRPVSQPC(aminoácidos 93-107 del ID SEC Nº: 9) conjugados con proteína transportadora a intervalos de 3 semanas. Se inmunizaron 2 conejos por cada péptido la semana 0, 3, 6 y 10, y se recogió sangre las semanas 7 y 11. La segunda extracción de sangre se purificó por afinidad con una columna de afinidad de péptidos. Los anticuerpos se llamaron Ab-1 y Ab-2, de acuerdo con el péptido.
DVNST(aminoácidos 108-124 del ID SEC Nº: 9); o el péptido 2: ALRPPPGSRPVSQPC(aminoácidos 93-107 del ID SEC Nº: 9) conjugados con proteína transportadora a intervalos de 3 semanas. Se inmunizaron 2 conejos por cada péptido la semana 0, 3, 6 y 10, y se recogió sangre las semanas 7 y 11. La segunda extracción de sangre se purificó por afinidad con una columna de afinidad de péptidos. Los anticuerpos se llamaron Ab-1 y Ab-2, de acuerdo con el péptido.
Transferencia western: Se incubaron toda
la noche 2 x 10^{6} células HiB5, transfectadas establemente con
ADNc de neublastina (HiB5pUbi1zNBN22), o células HiB5 no
transfectadas, en medio sin suero con complemento de N_{2}
(GIBCO). El medio se concentró en concentradores pequeños con
membranas de corte de exclusión de 5 kDa (Millipore, Bedford, MA).
Las muestras concentradas se añadieron a 5x tampón de muestra de
Laemmli y se calentaron a 95ºC durante 5 minutos. Las muestras se
separaron por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida en geles de acrilamida al 15% y
se transfirieron a membranas de PVDF. Los sitios de unión de
proteínas residuales se bloquearon con leche en polvo sin grasa al
5% en PBS con Tween-20 al 0,1%. Las membranas se
incubaron toda la noche con anticuerpo de neublastina (1:1000),
seguido de incubación con un anticuerpo IgG
anti-conejo o anti-ratón secundario
conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2000).
La inmunotinción se visualizó usando
quimioluminiscencia potenciada Plus (ECL+) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Amersham). Los resultados de estos
experimentos se muestran en la fig. 3 y ejemplo 5.
Usando técnicas estándar también se produjeron
anticuerpos policlonales de conejo contra los siguientes
péptidos:
Sólo los péptidos R30 y R31, relativamente cerca
del extremo C, reconocían la proteína desnaturalizada en
condiciones reductoras en una transferencia Western.
La secuencia de aminoácidos de la
pre-pro-neublastina de rata se
proporciona en el siguiente ID SEC Nº: 34:
Cada una de las neublastinas truncadas descritas
a continuación se identifica encima de los correspondientes restos
iniciales (letras en negrita en la secuencia anterior). El inicio de
la forma de neublastina de 113 aminoácidos (NBN113) también está
marcada.
Se examinó en las células la actividad biológica
de una forma truncada de neublastina que contenía los 102
aminoácidos carboxi-terminales de neublastina de
rata. La neublastina truncada se generó por digestión de una forma
de 113 aminoácidos de neublastina de rata, que tiene la secuencia de
aminoácidos que contiene los aminoácidos 111-224
(NBN113 de rata, subrayado más arriba) del ID SEC Nº: 34, con una
aminopeptidasa no específica (Sigma, MO) durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después de esta digestión, la neublastina se
sometió a cromatografía por exclusión de tamaños (SEC) para separar
cualesquiera componentes contaminantes de la proteína. El peso
molecular de la neublastina truncada (designada "NBN113
(N-11)") se confirmó por espectrometría de masas
y se determinó que era 10,931 kDa, el peso previsto del polipéptido
de 102 aminoácidos (NBN102). Como control, se trató NBN113 de rata
en paralelo con tampón de enzima (Tris 25 mM pH 8) solo. No se
observó digestión con este control, y se identificó el polipéptido
adecuado de 12,047 kDa.
Se compararon las actividades biológicas de
NBN113, NBN113 tratado con tampón de enzima y NBN113
(N-11) en un ensayo de activación de RET celular
(c-RET). La actividad de la neublastina se
determinó por su capacidad para estimular la fosforilación de
c-RET en células NB41A3-mRL3,
una línea de células de neuroblastoma murino transfectadas
establemente con GFR\alpha3 murino y que expresa RET y
GFR\alpha3. Las células NB41A3-mRL3 se pusieron
en placa en DMEM complementado con FBS al 10% con 2x10^{5} células
por pocillo en placas de 24 pocillos, y se cultivaron durante 18
horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después de quitar el medio y un
lavado de las células con 1 ml de PBS por pocillo, las células se
estimularon con DMEM que contenía NBN113, NBN113 tratado con tampón
de enzima y NBN113 (N-11) durante 10 minutos a 37ºC
y CO_{2} al 5%. Para parar la actividad, se quitó el medio y las
células se lavaron con PBS inmediatamente antes de la lisis con Tris
10 mM, pH 8,0, NP40 al 0,5%, DOC al 0,2%, NaF 50 mM,
Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, y PMSF 1 mM. Después de 1 h de incubación a
4ºC, los lisatos se agitaron mediante pipeteo repetido y se
transfirieron (0,25 ml por pocillo) a una placa ELISA de 96
pocillos recubierta con mAb anti-RET (AA.GE7.3). Los
pocillos se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con
tampón de bloqueo (TBST que contenía 1% de suero de ratón normal y
BSA al 3% en tampón de TBS (Tris 15 mM pH 7,4, NaCl 150 mM) seguido
de 6 lavados con TBST (TBS + Tween 20 al 0,05%) solo.
Se detectó RET fosforilado por incubación (2
horas) del receptor capturado con 4G10 (Upstate Biotechnology, NY)
un anticuerpo de fosfotirosina conjugado con HRP (0,2 \mug por
pocillo). Después de incubación, los pocillos se lavaron 6 veces
con TBST, y la actividad de la HRP se detectó a 450 nm con un ensayo
colorimétrico. Se midieron los valores de absorbancia de los
pocillos tratados con lisato o con tampón de lisis solo, se
corrigieron con el ruido de fondo, y los datos se representaron
gráficamente como función de la concentración de neublastina
presente en la mezcla de activación. Los resultados se muestran en
la fig. 16. Se midieron los valores de absorbancia de los pocillos
tratados con lisato o con tampón de lisis y las señales corregidas
con el ruido de fondo se representaron gráficamente como una función
de la concentración de neublastina.
Estos resultados demuestran que la forma
truncada amino-terminal (102 aminoácidos) de la
neublastina presenta actividad biológica celular que es
indistinguible de la de la forma de neublastina NBN113.
Se examinaron las actividades de los
polipéptidos de neublastina truncados (99 y 106 aminoácidos) en el
ensayo de activación de RET celular, y los resultados se muestran
en la fig. 17. Además de las formas de 99 y 106 aminoácidos, se
incluyeron otras dos moléculas de neublastina en este ensayo para la
comparación: NBN113 de rata, que servía como referencia, y una
muteína de la neublastina de rata de 113 aminoácidos en la que la
arginina de la posición 14 de la secuencia de NBN113 de rata se
sustituía por un resto de lisina ("NBN R14K (N)"). Esta
muteína facilitaba la generación de la forma de 99 aminoácidos que
carecía de 14 aminoácidos amino-terminales ("NBN
R14K (N-14)"), cuando se escindía en este sitio
usando una proteasa específica de lisina (Endo Lys C; WAKO, VA). La
forma de 106 aminoácidos, que carecía de 7 restos de
amino-terminales ("NBN 113
(N-7)"), se generó a partir de NBN113 de rata
por proteolisis parcial con tripsina (Biozyme, San Diego). Todos los
productos truncados se caracterizaron por espectroscopía de masas
como en el ejemplo 11 anterior.
Se examinaron las actividades de NBN113, NBN
R14K (N), NBN R14K (N-14), y NBN113
(N-7) con concentraciones de 0,005 nM a 100 nM,
0,05 nM a 100 nM, 0,006 nM a 114 nM y 0,05 nM a 107 nM,
respectivamente. La actividad se midió como la absorbancia a
A_{450 \ nm} como se describe en el ejemplo 11. Todas las formas
de neublastina presentaban una actividad similar a todas las
concentraciones ensayadas. Estos resultados demuestran que las
formas truncadas de NBN113 de rata que carece de 14 ó 7 restos
amino-terminales son activas como la NBN113 de rata
en el ensayo de activación de KIRA.
El ensayo de activación de KIRA mostrado en la
fig. 18 se llevó a cabo para determinar la actividad biológica de
una forma de neublastina de 104 aminoácidos ("NBN104
(N-9)"). Este polipéptido, que carecía de 9
restos amino-terminales presentes en la molécula de
NBN113 de rata salvaje, se generó tratando la NBN113 de rata
expresada en CHO con tripsina. Como antes, la masa molecular se
confirmó por espectrometría de masas. La actividad de los dos
polipéptidos (NBN104 (N-9) y NBN113) se examinó con
concentraciones de 0,05 nM a 115 nM. La actividad se midió como la
absorbancia a A_{450 \ nm} como se describe en el ejemplo 11. La
actividad de la forma N-9 era al menos tan alta
como la actividad de la NBN113 de rata. Estos resultados demuestran
que una forma truncada (104 aminoácidos) que carece de los 9
aminoácidos amino-terminales del polipéptido NBN113
de rata es al menos tan activa como la NBN113 de rata en el ensayo
de activación de KIRA-ELISA.
La Tabla 5 ilustra la relación entre las
secuencias del polipéptido de
pre-pro-neublastina descrito de la
invención. La línea 1 proporciona el polipéptido del ID SEC Nº: 2,
la línea 2 proporciona el polipéptido del ID SEC Nº: 4, y la línea
3 proporciona el polipéptido del ID SEC Nº: 9. Los 7 restos de
cisteína conservados se designan por los símbolos ("*",
"#", "+" y "|") para indicar los puentes disulfuro
intramoleculares (* con *, # con #, y + con +) e intermoleculares
("|")formados en el ligando de neublastina dimerizado maduro.
El extremo amino de cada uno de los polipéptidos de neublastina
truncados se designa por "o" para NBN112 a NBN99,
respectivamente.
A partir de la descripción detallada anterior de
las realizaciones específicas de la invención, será evidente que se
han descrito composiciones y procedimientos nuevos particulares que
incluyen ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, detección y
tratamiento. Aunque estas realizaciones particulares se han descrito
en el presente documento con detalle, esto se ha hecho a modo de
ejemplo sólo con el propósito de ilustrar. En particular, los
autores de la invención contemplan que una persona experta en la
materia puede hacer de forma rutinaria diferentes sustituciones,
alteraciones y modificaciones. Además, para los expertos en la
materia serán evidentes diferentes modificaciones de la invención
además de las descritas en el presente documento a partir de la
descripción anterior y las figuras que acompañan.
<110> NsGene A/S
\hskip1cm Biogen, Inc.
\hskip1cm Johansen, Teit E.
\hskip1cm Wen-Yee Sah,
Dinah
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos factores neurotróficos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00689-511 PCT (C045
CIP) NBN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Presentada a continuación
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-02-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DANISH 1998 00904
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/092.229
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DANISH 1998 01048
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-08-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/097.774
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-08-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/103.908
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-10-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DANISH 1998 01265
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-10-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> U.S.S.N 09/347.613
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> U.S.S.N 09/804.615
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-03-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (120)..(719)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(119)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (721)..(865)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (120)..(179)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (405)..(719)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (661)..(663)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CARBOHYD: Asparagina glicosilada en
Asn87
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (426)..(623)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID - puente disulfuro
Cys8-Cys73
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (507)..(707)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Cys35-Cysl01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (519)..(713)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Cys39-Cys103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (616)..(619)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro entre
cadenas Cys72-Cys72
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(717)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (718)..(861)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(174)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<22l> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (298)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (370)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<22l> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (379)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (661)..(663)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CARBOHYD: Asparagina glicosilada en
Asn122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (424)..(621)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Cys43-Cys108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (505)..(705)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Cys70-Cys136
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (517)..(711)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Cys74-Cys138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (616)..(618)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro entre
cadenas Cys107-Cys107
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En la que Xaa en la posición 134
designa Asn o Thr, y Xaa en la posición 135 designa Ala o Pro
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En el que Xaa en la posición 110
designa Asn o Thr, y Xaa en la posición 111 designa Ala o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En el que Xaa en la posición 107
designa Asn o Thr, y Xaa en la posición 108 designa Ala o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 861
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (718)..(861)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58).. (174)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (298)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (370)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (379)..(717)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (661)..(663)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CARBOHYD: Asparagina glicosilada en
Asn122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (424)..(621)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Gly43-GlylO8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (505)..(705)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Gly70-Gly136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (517)..(711)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro
Gly74-Gly138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (616)..(618)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DISULFID: puente disulfuro entre
cadenas Gly107-Gly107
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARBOHYD
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (122)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asparagina glicosilada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARBOHYD
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asparagina glicosilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARBOHYD
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (95)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asparagina glicosilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (975)..(1646)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggccagc ctactggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggagaccg cttcgtagcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaacttg gacttgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatcaccc accggc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaccgct ccgacgag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcggtccac ggttctccag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagcccac ctgggtgccc tctttctcc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcacccac cggcaggggc ctctcag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcccatgc ccggcctgat ctcagcccga ggaca
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctggctga ggccgctggc tagtgggact ctgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sonda de hibridación
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<22l> misc_structure
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> en la que n representa un resto de
conjugación que se une a la fosfatasa alcalina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipncaggtggtc cgtggggggc gccaagaccg g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaggagccc atgccc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggaaaaaa gcggccgcca tggaacttgg acttggagg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttttcctt ggcggccgct cagcccaggc agccgcagg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcgagccc tcagcc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen sintético para neublastina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen sintético para neublastina
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: neublastina sintética
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen sintético para HisNeublastina
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen sintético para HisNeublastina
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: HisNeublastina sintética
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Claims (12)
1. Un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos
se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- aminoácidos 37-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 104);
- (b)
- aminoácidos 39-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 102); y
- (c)
- aminoácidos 42-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 99).
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el
que la secuencia de aminoácidos consiste en los aminoácidos
37-140 del ID SEC Nº: 9 (NBN 104).
3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, en
el que el polipéptido está glicosilado.
4. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
5. Un vector que comprende el ácido nucleico de
la reivindicación 4.
6. Una célula huésped transformada con el vector
de la reivindicación 5.
7. La célula huésped de la reivindicación 6, en
la que la célula huésped es una célula de ovario de hámster
chino.
8. Un procedimiento para hacer un polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que
comprende: (a) proporcionar una célula huésped transformada con un
vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones
1-3, (b) cultivar la célula huésped, y (c) recuperar
el polipéptido.
9. Una composición farmacéutica que comprende el
polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones
1-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Uso del polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, para la fabricación de un
medicamento para tratar una neuropatía periférica o dolor
neuropático en un mamífero.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que la
composición se administra sistémicamente.
12. El polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, para usar como un
medicamento.
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