ES2225422T3 - Derivados de hidroxiamida del acido 2-0x0-imidazolin-4-carboxilico que inhiben las metaloproteinas de la matriz. - Google Patents

Derivados de hidroxiamida del acido 2-0x0-imidazolin-4-carboxilico que inhiben las metaloproteinas de la matriz.

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ES2225422T3 ES01301989T ES01301989T ES2225422T3 ES 2225422 T3 ES2225422 T3 ES 2225422T3 ES 01301989 T ES01301989 T ES 01301989T ES 01301989 T ES01301989 T ES 01301989T ES 2225422 T3 ES2225422 T3 ES 2225422T3
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Abstract

Un compuesto según la fórmula (I) **(Fórmula)** o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptable, en la que R1 es arilo de C6-C10, heteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)alquilo de C1-C6, heteroaril(C1-C9)alquilo de C1-C6, aril(C6C10)arilo de C6-C10, heteroaril(C1-C9)arilo de C6-C10, aril(C6-C10)heteroarilo de C1-C9, heteroaril(C1-C9)heteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)oxiarilo de C6-C10, heteroaril(C1-C9)oxi-arilo de C C6-C10, aril(C6-C10)oxiheteroarilo de C1-C9, heteroaril(C1-C9)oxiheteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)oxialquilo de C1-C6, heteroaril(C1-C9)oxialquilo de C1-C6, aril(C6C10)alquil(C1-C6)arilo de C6-C10, heteroaril(C1-C9)alquil(C1-C6)arilo de C6-C10, aril(C6-C10)alquil(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, heteroaril(C1-C9)alquil(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)alcoxi(C1-C6)arilo de C6-C10, heteroaril(C1C9)alcoxi(C1-C6)arilo de C6-C10, aril(C6-C10)alcoxi(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, heteroaril(C1-C9)alcoxi(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)oxialquil(C1-C6)arilo de C6-C10, heteroaril(C1-C9)oxialquil(C1-C6)arilo de C6-C10, aril (C6-C10)oxialquil(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, heteroaril(C1-C9)oxialquil(C1-C6)heteroarilo de C1-C9, aril(C6-C10)aril (C6-C10)alquilo de C1-C6, heteroaril(C1-C9)-aril(C6-C10)alquilo de C1-C6, aril(C6-C10)heteroaril(C1-C9)alquilo de C1C6, heteroaril(C1-C9)heteroaril(C1-C9)alquilo de C1-C6, aril(C6-C10)alcoxi(C1-C6)alquilo de C1-C6, o heteroaril(C1-C9) alcoxi(C1-C6)alquilo de C1-C6, en la que, independientemente, cada uno de los átomos de carbono del anillo de dichos restos de arilo de C6-C10 y heteroarilo de C1-C9 que es capaz de formar un enlace adicional, está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre fluoro, cloro, bromo, alquilo de C1-C6, alcoxi de C1-C6, y perfluoroalquilo de C1-C3, y perfluoroalcoxi de C1-C3; R2 y R3 se seleccionan, cada uno independientemente, entre hidrógeno y alquilo de C1-C6, o tomados juntos forman un anillo de un espirocompuesto de la fórmula **(Fórmula)** en la que X es un enlace, CH2, O, S, NHó N-alquilo de C C1-C6, n es independientemente 1 ó 2, y m es independientemente 1 ó 2; y R4 es hidrógeno o alquilo de C1-C6.

Description

Derivados de hidroxiamida del ácido 2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico que inhiben las metaloproteinasas de la matriz.
Fundamento de la invención
La presente invención se refiere a derivados de hidroxiamidas de ácidos 2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico, a composiciones farmacéuticas que comprenden tales derivados, y al uso de tales derivados en el tratamiento de la artritis, la inflamación, el cáncer y otras enfermedades que se describen más adelante.
Los compuestos de la presente invención son inhibidores de metaloendopeptidasas de cinc, en especial las que pertenecen a las subfamilias de las metcincinas constituidas por las metaloproteinasas de la matriz (denominadas también MMP o matrixinas) y las reprolisinas (conocidas también como adamilsinas) (Rawlings et al., Methods in Enzymology, 248, 183-228 (1995) y Stocker et al., Protein Science, 4, 823-840 (1995)).
La subfamilia de enzimas MMP, contiene actualmente diecisiete miembros (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 y MMP-20). Las MMPs son lo más conocidas por su papel en la regulación del recambio de proteínas de la matriz extracelular y por tanto juegan papeles importantes en procesos fisiológicos normales tales como la reproducción, el desarrollo y la diferenciación. Además, las MMPs son expresadas en muchos estados patológicos en los que tiene lugar un recambio anormal del tejido conjuntivo. Por ejemplo, se ha demostrado que la MMP-13, una enzima con actividad potente en la degradación del colágeno de tipo II (el colágeno principal del cartílago), está sobreexpresada en el cartílago osteoartrítico (Mitchell et al., J. Clin. Invest., 97,761 (1996)). Otras MMPs (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12) están sobreexpresadas también en el cartílago osteoartrítico y es de esperar que la inhibición de alguna o todas estas MMPs retarden o bloqueen la pérdida acelerada del cartílago, típica de las enfermedades de las articulaciones tales como la osteoartritis o la artritis reumatoide.
La sobreexpresión de ciertas metaloproteinasas está asociada, asimismo, con la metástasis de células tumorales. Se opina que tal actividad es esencial para la invasión de tejidos sanos. Es de esperar que la inhibición de la actividad de alguna o todas estas proteinasas limite la propagación de las células malignas. Adicionalmente, ciertas metaloproteinasas son necesarias para la angiogénesis, el proceso mediante el cual, un tumor en crecimiento, por ejemplo, obtiene un suministro adicional de sangre por medio de una nueva vascularización. Por consiguiente, es de esperar que la inhibición de estas enzimas retarde o detenga el crecimiento tumoral.
Es de esperar también que los compuestos de la invención inhiban útilmente clases adicionales de enzimas que juegan papeles importantes en procesos tanto normales como patológicos. Por ejemplo, las reprolisinas de mamífero son conocidas como ADAMs (A Disintegrin And Metalloproteinase)(Una desintegrina y metaloproteinasa) (Wolfberg et al., J. Cell. Biol. 131, 275-278 (1995)) y contienen un dominio de desintegrina además de un dominio similar al de las metaloproteinasas. Hasta la fecha han sido identificadas veintitrés ADAMs distintas. La ADAM-17, conocida también como enzima de conversión del factor alfa de la necrosis tumoral (TACE) es la ADAM mejor conocida.
La ADAM-17 (TACE) es responsable de la escisión del factor alfa de la necrosis tumoral unido a las células (TNF-\alpha, conocido también como caquectina). Se ha reconocido que el TNF-\alpha está implicado en muchas enfermedades infecciosas y autoinmunitarias (W. Friers, FEBS Letters, 285, 199 (1991)). Además, se ha puesto de manifiesto que el TNF-\alpha es el mediador principal de la respuesta inflamatoria observada en la sepsis y el choque séptico. (Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 62 S11 (1992)). Existen dos formas de TNF-\alpha, una proteína de la membrana de tipo II de masa molecular relativa 26.000 (26 kD) y una forma soluble de 17 kD generada a partir de la proteína unida a las células mediante escisión proteolítica específica. La forma soluble de 17 kD del TNF-\alpha es liberada por la célula y está asociada con los efectos nocivos del TNF-\alpha. Esta forma del TNF-\alpha es capaz también de actuar en lugares distantes del sitio de síntesis. Así pues, los inhibidores de la TACE previenen la formación del TNF-\alpha soluble y evitan los efectos nocivos del factor soluble.
En otro ejemplo, la agrecanasa, es una enzima que es importante en la degradación del agrecán del cartílago. Se cree que la agrecanasa es una ADAM. La pérdida de agrecán desde la matriz del cartílago es un factor importante en la progresión de enfermedades articulares tales como la osteoartritis y la artritis reumatoide, y es de esperar que la inhibición de la agrecanasa retarde o bloquee la pérdida de cartílago en tejidos afectados por estas enfermedades.
Otras ADAMs que han mostrado expresión en estados patológicos incluyen la ADAM TS-1 (Kuno et al., J. Biol. Chem., 272, 556-562 (1997)), y las ADAMs 10, 12 y 15 (Wu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 235, 437-442 (1997)). Como conocimiento de la expresión, podrá apreciarse que la asociación de sustratos fisiológicos y enfermedades, de las ADAMs, aumenta el significado total del papel de la inhibición de esta clase de enzimas.
Los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de la artritis (incluyendo la osteoartritis y la artritis reumatoide), la enfermedad intestinal inflamatoria, la enfermedad de Crohn, enfisemas, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad de Alzheimer, la toxicidad por trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, inflamación, hipersensibilidad alérgica por contacto, el cáncer (tal como cánceres de tumores sólidos incluyendo el cáncer de colon, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón y el cáncer de próstata, así como enfermedades malignas hematopoyéticas con inclusión de leucemias y linfomas), ulceración de los tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermólisis ampollosa, osteoporosis, aflojamiento de implantes de articulaciones artificiales, arteriosclerosis (incluyendo la rotura de placas ateroscleróticas), aneurismas aórticos (incluyendo el aneurismo aórtico abdominal y el aneurisma aórtico cerebral), el fallo cardiaco congestivo, el infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, trauma de la cabeza, daños de la médula espinal, trastornos neuro-vegetativos (agudos y crónicos), afecciones autoinmunitarias, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, jaqueca, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, aumento nootrópico o del entendimiento, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de las heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, y sepsis o choque séptico.
Los compuestos de la presente invención son útiles también en el tratamiento de enfermedades en las que la inhibición de MMPs y/o de ADAMs puede proporcionar beneficio terapéutico, tales como las caracterizadas por expresión de metaloproteinasas de la matriz o expresión de ADAM.
Son bien conocidos, según la bibliografía científica, inhibidores de metaloproteinasas de la matriz y de reprolisinas. Específicamente, la publicación de la patente europea 606.046, publicada el 13 de Julio de 1994, alude a ciertos inhibidores heterocíclicos de MMPs. La publicación de los documentos PCT WO 98/08825 y WO 98/08815, ambos publicados el 5 de Marzo de 1998, hacen referencia a ciertos inhibidores de MMPs del tipo de ácidos hidroxámicos cíclicos. La patente de Estados Unidos No. 5.861.510, expedida el 19 de Enero de 1999, alude a ácidos arilsulfonilamino hidroxámicos cíclicos que son útiles como inhibidores de MMPs. La publicación PCT del documento WO 98/34918, publicada el 13 de Agosto de 1988. alude a ácidos hidroxámicos cíclicos incluyendo ciertos compuestos sustituidos con dialquilo que son útiles como inhibidores de MMPs.
Las publicaciones PCR de los documentos WO 96/27583 y WO 98/07697, publicados el 7 de Marzo de 1996 y el 26 de Febrero de 1998, respectivamente, se refieren a ácidos arilsulfonilhidroxámicos. La publicación PCT del documento WO 98/03516, publicado el 29 de Enero de 1998, hace referencia a fosfinatos con actividad de MMP. La publicación PCT 98/33768, publicada el 6 de Agosto de 1998, alude a ácidos arilsulfo-nilaminohidroxámicos sin sustituir en el N. La publicación de la patente europea EP 935.963, publicada el 18 de Agosto de 1999, hace referencia al uso de inhibidores selectivos de la MMP-13 para el tratamiento de la osteoartritis. Los Solicitudes de las patentes de EE.UU. 09/290.022 09/287.930 y 09/287.508, presentadas el 9 de Abril de 1999, el 7 de Abril de 1999 y el 7 de Abril de 1999, respectivamente, se refieren a métodos de preparación de ácidos hidroxámicos. La solicitud de patente provisional de EE.UU. titulada "Selective Inhibitors of Aggrecanase in Osteoarthritis Treatment", presentada el 12 de Agosto de 1999, alude a inhibidores de MMPs, Agrecanasa y TACE, y a métodos adicionales de preparación de ácidos hidroxámicos. La solicitud de patente no provisional de EE.UU. titulada "TACE inhibitors", presentada el 12 de Agosto de 199, se refiere a ácidos hidroxámicos heterocíclicos. El documento WO 99/65867 se refiere a ácidos hidroxámicos con actividad inhibitoria de MMP, agrecanasa y TNF.
Se ha reconocido que diferentes combinaciones de MMPs y ADAMs son expresadas en diferentes estados patológicos. Por ello, pueden preferirse para enfermedades individuales inhibidores con selectividades específicas para ADAMs y/o MMPs individuales. Por ejemplo, la artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria de las articulaciones caracterizada por niveles excesivos de TNF, y la pérdida de constituyentes de la matriz de las articulaciones. En este caso, un compuesto que inhiba la TACE y la agrecanasa así como también MMPs tales como la MMP-13, puede ser la terapia preferida. Por el contrario, en una enfermedad de las articulaciones menos inflamatoria, tal como la osteoartritis, pueden ser preferidos compuestos que inhiban MMPs que degradan la matriz tales como la MMP-13, pero no la TACE.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto según la fórmula (I)
1
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptable, en la que
R^{1} se selecciona entre los grupos que constan de arilo de C_{6}-C_{10}, heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})heteroaril de C_{1}-C_{9}, eteroaril(C_{1}-C_{9})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxiarilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxiarilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})oxiheteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxiheteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxialquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})alquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})alquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxi-alquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})oxialquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})alquilo de C_{1}-C_{6}, y heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})alquilo de C_{1}-C_{6},
en la que, independientemente, cada uno de los átomos de carbono del anillo de dichos restos arilo de C_{6}-C_{10} y hetero-arilo de C_{1}-C_{9} que es capaz de formar un enlace adicional, está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre fluoro, cloro, bromo, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{3} y perfluoroalcoxi de C_{1}-C_{3}.
R^{2} y R^{3} se seleccionan, cada uno independientemente, entre hidrógeno y alquilo de C_{1}-C_{6}, o tomados juntos forman un anillo de un espirocompuesto, de la fórmula
2
en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH o N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es independientemente 1 ó 2, y m es independientemente 1 ó 2; y
R^{4} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}.
En un aspecto preferido de la invención, R^{1} se selecciona entre el grupo que consta de arilo de C_{6}-C_{10}, heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxiarilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxiarilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, y heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}.
En aspectos adicionales de la invención preferidos, R^{1} se selecciona:
(a) entre el grupo que consta de 4-[aril(C_{6}-C_{10})]fenilo, 4-[aril(C_{6}-C_{10})oxi]fenilo y 4-[aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6}]fenilo; o
(b) entre el grupo que consta de 4-[heteroaril(C_{1}-C_{9})]fenilo, 4-[heteroaril(C_{1}-C_{9})oxi]fenilo y 4-[heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})]fenilo.
Ejemplos sumamente preferidos incluyen aquellos en los que R^{1} es 4-(4-fluorofenoxi)fenilo, 4-(4-clorofenoxi)fenilo y 4-(naftalen-2-iloxi)fenilo.
En un aspecto preferido de la invención R^{2} y R^{3}, tomados juntos, forman un anillo de un espirocompuesto, de la fórmula:
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en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH o N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es 1 ó 2, y m es 1 ó 2, de modo que n es el mismo que m.
En un aspecto adicional de la invención preferido, R^{2} y R^{3} se seleccionan entre hidrógeno y alquilo de C_{1}-C_{6}. Según este aspecto de la invención, se prefiere que R^{2} sea el mismo que R^{3}, es decir, R^{2} y R^{3} son cada uno de ellos hidrógeno, o son cada uno de ellos alquilo de C_{1}-C_{6}, de modo que R^{2} es el mismo que R^{3}.
En ejemplos preferidos de la invención R^{4} es alquilo de C_{1}-C_{6}; R^{4} es hidrógeno; y R^{2}, R^{3} y R^{4} son cada uno de ellos hidrógeno.
En una realización de la invención sumamente preferida, el carbono del anillo al que se une R^{4} posee la configuración R. Por consiguiente, se proporcionan compuestos preferidos de la invención conforme a la fórmula (I')
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en la que la preferencia en la selección de los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} es como se ha citado anteriormente respecto a compuestos en los que la configuración estereoespecífica está sin especificar en el átomo de carbono del anillo al que se une R^{4}.
Por tanto, los compuestos de la invención preferidos incluyen:
Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-naftalen-1-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-metoxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[3-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-naftalen-2-ilmetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4'-fluorobifenil-4-ilmetil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-benciloxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico; e
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(2-cloro-4-fluoroben-ciloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico.
Compuestos adicionales de la invención, preferidos, incluyen:
Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-7-oxa-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-4-metil-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-5,5-dimetil-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-5,5-dimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-5,5-dimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-2-oxo-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-4,5,5-trimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-4,5,5-trimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-4-metil-1-[4-(naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-5,5-dimetil-1-[4-(naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(5-fluoropiridin-2-iloxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-(4-piridin-4-ilbencil)imidazolidina-4-carboxílico, e
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-(4-piridilmetil)imidazolidina-4-carboxílico.
El término "alquilo" tal como se emplea en esta memoria, a menos que se indique de otro modo, incluye radicales hidrocarbonados monovalentes saturados que tienen restos lineales, ramificados o cíclicos o sus combinaciones.
El término "alcoxi" tal como se emplea en esta memoria, incluye grupos O-alquilo, en los que "alquilo" es como se ha definido antes.
El término "arilo" tal como se emplea en esta memoria, a menos que se indique de otro modo, incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático de C_{6}-C_{10}, monocíclico o bicíclico, por separación de un hidrógeno, tal como fenilo o naftilo, opcionalmente sustituido con sustituyentes seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{6} (con inclusión de trifluorometilo), alcoxi de C_{1}-C_{6}, perfluoroalcoxi de C_{1}-C_{3} (con inclusión de trifluorometoxi y difluorometoxi) y alquilo de C_{1}-C_{6}. A menos que se indique de otro modo, la selección de cada uno de los sustituyentes opcionales es independiente de la selección de cualesquiera otros sustituyentes opcionales y, preferiblemente, el número de sustituyentes es cero, o está entre 1 y 3.
El término "heteroarilo" tal como aquí se emplea, a menos que se indique de otro modo, incluye un radical orgánico que deriva de un compuesto heterocíclico aromático de C_{1}-C_{9}, monocíclico o bicíclico, por separación de un hidrógeno, tal como piridilo, furilo, pirrolilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, pirimidilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofurilo, isobenzofurilo, benzotienilo, pirazolilo, indolilo, isoindolilo, purinilo, carbazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, benzotiazolilo y benzoxazolilo, opcionalmente sustituido con sustituyentes seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, trifluorometilo, alcoxi de C_{1}-C_{6}, trifluorometoxi, difluorometoxi y alquilo de C_{1}-C_{6}. A menos que se indique de otro modo, la selección de cada sustituyente opcional es independiente de la selección de cualesquiera otros sustituyentes opcionales y, preferiblemente, el número de sustituyentes es cero, o está entre 1 y 2.
"Un sustituyente adecuado" se entiende que significa un grupo funcional química y farmacéuticamente aceptable, es decir, un resto que no niega sustancialmente la actividad inhibitoria de los compuestos de la invención, y/o un resto que aporta propiedades útiles a la producción, almacenamiento o utilización de los compuestos de la invención como compuestos farmacéuticos. Tales sustituyentes adecuados pueden ser determinados por los expertos en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de sustituyentes adecuados incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, grupos alquilo, grupos hidroxi, grupos alquiltio, grupos alcoxi, grupos carboxi, grupos amino, grupos alquil- y dialquilamino, grupos carbamoilo, grupos alquilcarbonilo, grupos alcoxicarbonilo, grupos alquilaminocarbonilo, grupos dialquilaminocarbonilo, grupos arilcarbonilo, grupos ariloxicarbonilo, grupos alquilsulfonilo, grupos arilsulfonilo y semejantes.
El compuesto de fórmula I puede tener centros quirales, y por tanto puede existir en diferentes formas enantiómeras. Esta invención se refiere a todos los isómeros ópticos, tautómeros y estereoisómeros de los compuestos de fórmula I y sus mezclas.
La presente invención se refiere asimismo a las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I. Los ácidos que se usan para preparar las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos básicos de esta invención antes citados, son aquellas que forman sales de adición de ácido no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como las sales hidrocloruro, hidrobromuro, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, acetato, lactato, citrato, citrato ácido, tartrato, bitartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato [es decir, 1,1'-metilen-bis(2-hidroxi-3-naftoato)].
La invención se refiere también a sales de adición de base de fórmula I. Las bases químicas que pueden ser usadas como reactivos para preparar sales de base farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I que tienen naturaleza ácida, son aquellas que forman con tales compuestos sales de base no tóxicas. Tales sales de base no tóxicas incluyen, aun cuando no se limitan, a las derivadas de cationes farmacológicamente aceptables, tales como cationes de metales alcalinos (por ejemplo, potasio y sodio), y cationes de metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio y magnesio), amonio o sales de adición de amina solubles en agua, tales como la N-metilglucamina-(meglumina), y las sales de alcanol(inferior)amonio y otras sales de base de aminas orgánicas farmacéuticamente aceptables.
La invención objeto incluye también compuestos marcados isotópicamente, que son idénticos a los citados en la Fórmula I, excepto el hecho de que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que posee una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o el número másico encontrado habitualmente en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden ser incorporados en compuestos de la invención incluyen isótopos del hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, tales como ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, ^{14}C, ^{15}N, ^{18}O, ^{17}O, ^{31}P, ^{32}P, ^{35}S, ^{18}F, y ^{36}Cl, respectivamente. Los compuestos de la presente invención, sus profármacos y las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos o de dichos profármacos que contienen los isótopos citados y/u otros isótopos u otros átomos, están dentro del alcance de esta invención. Ciertos compuestos de la invención marcados isotópicamente, por ejemplo, aquellos en que están incorporados isótopos radiactivos tales como ^{3}H y ^{14}C, son útiles en la realización de ensayos de distribución de fármacos y/o de distribución en tejidos sustrato. Los isótopos tritiados, es decir, de ^{3}H, y de carbono-14, es decir, ^{14}C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación o aptitud para la detección. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como el deuterio, es decir, ^{2}H, pueden proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, semivida in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos y, por tanto, pueden ser preferidos en determinadas circunstancias. Los compuestos de Fórmula I de esta invención y sus profármacos, marcados isotópicamente, pueden ser preparados, en general, llevando a cabo los procedimientos operatorios descritos en los Esquemas y/o en los Ejemplos y Preparaciones que figuran más adelante, sustituyendo un reactivo sin marcar isotópicamente por un reactivo marcado isotópicamente, fácilmente adquirible.
La presente invención se refiere, asimismo, a una composición farmacéutica para el tratamiento de un estado seleccionado entre el grupo que consta de artritis (con inclusión de osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad de trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer (tal como cánceres de tumores sólidos con inclusión de cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de próstata) y enfermedades malignas hematopoyéticas, incluyendo leucemias y linfomas, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermólisis ampollosa, osteoporosis, aflojamiento de implantes de articulaciones artificiales, arteriosclerosis (incluyendo la rotura de placas ateroscleróticas), aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico abdominal y aneurisma aórtico cerebral), fallo cardiaco congestivo, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, trauma de la cabeza, daño en la médula espinal, trastornos neuro-degenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunitarios, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, jaquecas, depresiones, neuropatías periféricas, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o del conocimiento, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de las heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento de tumores, metástasis tumoral, cicatrices corneales, escleritis, SIDA y sepsis y choque séptico en un mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, eficaz en tales tratamientos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por actividad de metaloproteinasa (preferiblemente la MMP-13) y otras enfermedades caracterizadas por actividad de reprolisina en mamíferos (preferiblemente actividad de Agrecanasa y lo más preferiblemente actividad de Agrecanasa) en un mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable eficaz en tales tratamientos y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica para la inhibición de (a) metaloproteinasas de la matriz u otras metaloproteinasas implicadas en la degradación de la matriz, o (b) una reprolisina de mamífero (tal como agrecanasa o ADAMs TS-1, 10, 12, 15 y 17, lo más preferible la Agrecanasa) en un mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I ó una de sus sales farmacéuticamente aceptable y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a un método de fabricación de un medicamento para tratar un estado seleccionado entre el grupo que consta de artritis (incluyendo osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad de trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer (tal como cánceres de tumores sólidos con inclusión de cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de próstata) y enfermedades malignas hematopoyéticas (incluyendo leucemias y linfomas), ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermólisis ampollosa, osteoporosis, aflojamiento de implantes de articulaciones artificiales, arteriosclerosis (incluyendo la rotura de placas ateroscleróticas) aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico abdominal y aneurisma aórtico cerebral), fallo cardiaco congestivo, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, trauma de la cabeza, daño en la médula espinal, trastornos neuro-degenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunitarios, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, jaquecas, depresiones, neuropatías periféricas, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o del conocimiento, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de las heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento de tumores, metástasis tumoral, cicatrices corneales, escleritis, SIDA, y sepsis y choque séptico en un mamífero, incluyendo el ser humano, usando una cantidad de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, eficaz para tratar uno de tales estados.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por actividad de metaloproteinasa de la matriz (preferiblemente actividad de la MMP-13) y otras enfermedades caracterizadas por actividad de reprolisina de mamífero (preferiblemente actividad de Agrecanasa) en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, eficaz para tratar un estado tal.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para la inhibición de (a) metaloproteinasas de la matriz u otras metaloproteinasas implicadas en la degradación de la matriz, o (b) una reprolisina de mamífero (tal como agrecanasa o TS-1, 10, 12, 15 y 17 de ADAM, preferiblemente la Agrecanasa) en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para inhibir la escisión de TNF-\alpha desde las membranas celulares en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I que inhibe la Agrecanasa.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para tratar la artritis en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un inhibidor de la Agrecanasa, en el que dicho inhibidor de la Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa con preferencia a la MMP-1.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para tratar la artritis en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un inhibidor de la Agrecanasa, en el que dicho inhibidor de la Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa por lo menos diez veces más que la MMP-1.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para tratar la artritis en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un inhibidor de la Agrecanasa, en el que dicho inhibidor de la Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa y la MMP-13 con preferencia a la MMP-1.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para tratar la artritis en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero tal, una cantidad eficaz de un inhibidor de la Agrecanasa, en el que dicho inhibidor de la Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa y la MMP-13, al menos diez veces más que la MMP-1.
La presente invención se refiere también a la fabricación de un medicamento para tratar la artritis en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un inhibidor de Agrecanasa de un ácido hidroxámico, en el que dicho inhibidor de Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa y la MMP-13 con preferencia a la MMP-1.
La presente invención se refiere también al tratamiento de tratamiento de la artritis en un mamífero, que comprende administrar a tal mamífero una cantidad eficaz de un inhibidor de Agrecanasa de un ácido hidroxámico, en el que dicho inhibidor de Agrecanasa inhibe selectivamente la Agrecanasa y la MMP-13 al menos diez veces más que la MMP-1.
El término "tratar", tal como se emplea en esta Memoria, alude a inversión, alivio, inhibición del progreso, o prevención del trastorno o estado al que se aplica tal término, o uno o más síntomas de tal trastorno o estado. El término "tratamiento", tal como se usa en esta Memoria, alude al actor de tratar, según "tratar" se ha definido inmediatamente antes.
Los compuestos de fórmula I que poseen grupos amino, amido, hidroxi o carboxílico libres pueden ser convertidos en profármacos. Los profármacos incluyen compuestos en los que un resto de un aminoácido, o una cadena de un polipéptido de dos o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) restos de aminoácidos están enlazados covalentemente mediante uniones peptídicas a grupos amino, hidroxi o ácido carboxílico libres, de compuestos de fórmula I. Los restos de aminoácidos incluyen los 20 aminoácidos naturales designados comúnmente mediante símbolos de tres letras e incluyen también, 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvalina, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, citrulina, homocisteína, homoserina, ornitina y metionina sulfona. Los profármacos incluyen también compuestos en los que carbonatos, carbamatos, amidas y ésteres de alquilo de los cuales, están enlazados covalentemente a los sustituyentes de fórmula I anteriores mediante el carbono carbonilo de la cadena lateral del profármaco.
Los expertos en la técnica podrán apreciar que los compuestos de la invención son útiles para tratar un conjunto diverso de enfermedades. Los expertos en la técnica podrán apreciar también que cuando se emplean los compuestos de la invención en el tratamiento de una enfermedad específica, los compuestos de la invención pueden combinarse con diversos agentes terapéuticos existentes empleados para tal enfermedad.
Para el tratamiento de la artritis reumatoide, los compuestos de la invención pueden combinarse con agente tales como inhibidores de la TACE, inhibidores del TNA-\alpha tales como anticuerpos monoclonales anti-TNF y moléculas de inmunoglobulina de receptor del TNF (tales como Enbrel®), inhibidores de COX-2 a dosis bajas, metotrexato, lefunimida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u oro parenteral u oral.
Los compuestos de la invención pueden ser usados también en combinación con agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de la osteoartritis. Los agentes adecuados paraser usados en combinación incluyen agentes antiinflamatorios no esteroidales, estándar (en lo sucesivo NSAIDs) tales como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiónicos tales como naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindaco, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina, inhibidores de COX-2 tales como celecoxib y rofecoxib, analgésicos y agentes terapéuticos intraarticulares tales como corticosteroides y ácidos hialurónicos tales como hialgán y sinvisc.
Los compuestos de la presente invención pueden ser usados también en combinación con agentes anticancerosos tales como endostatina y angiostatina o fármacos citotóxicos tales como adriamicina, daunomicina, cis-platino, etoposido, taxol, taxotere y alcaloides tales como vincristina, y antimetabolitos tales como metotrexato.
Los compuestos de la presente invención pueden ser usados también en combinación con agentes cardiovasculares tales como bloqueadores del canal del calcio, agentes de disminución de lípidos, tales como estatinas, fibratos, bloqueadores-beta, inhibidores de Ace, antagonistas del receptor de la Angiotensina-2 e inhibidores de la agregación de plaquetas.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse también en combinación con agentes del CNS tales como antidepresivos (tales como sertralina), fármacos antiparkinsonianos (tales como deprenil, L-dopa, requib, miratex, inhibidores de MAOB tales como selegina y rasagilina, inhibidores de comP tales como Tasmar, inhibidores de A-2, inhibidores de readmisión de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de la nicotina, agonistas de dopamina e inhibidores de la óxido nítrico sintasa neuronal), fármacos anti-Alzheimer tales como donepezilo, tacrina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse también en combinación con agentes contra la osteoporosis tales como roloxifeno, droloxifeno o fosomax, y agentes inmunosupresores tales como FK-506 y rapamicina.
Descripción detallada de la invención
Los esquemas de reacción que siguen ilustran la preparación de los compuestos de la presente invención. A menos que se indique de otro modo, R^{1}, R^{2} y R^{3}, y R^{4} en los esquemas de reacción y la discusión que sigue, se definen como anteriormente.
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Esquema 1
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Condiciones generales de reacción
Con referencia al Esquema 1, los compuestos de la fórmula I pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula II por separación del grupo protector de la hidroxiamida P^{2}, pudiendo ser P^{2} terc-butilo, bencilo, 2-trimetilsililetilo o alilo. El grupo protector preferido es el 2-trimetilsililetilo. Cuando P^{2} es bencilo, la separación del grupo protector de la hidroxiamida se lleva a cabo mediante hidrogenólisis usando paladio catalítico sobre sulfato de bario, en un disolvente polar tal como metanol, a una temperatura de 20ºC aproximadamente. Cuando P^{2} es 2-trimetilsililetilo, la separación del grupo protector de la hidroxiamida se lleva a cabo usando eterato de trifluoruro de boro en un disolvente inerte tal como cloruro de metileno o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno, a una temperatura desde aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente. Cuando P^{3} es terc-butilo, la separación del grupo protector se lleva a cabo usando un ácido fuerte tal como el ácido trifluoroacético en un disolvente inerte tal como cloruro de metileno o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno, a una temperatura desde aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente. Cuando P^{2} es alilo, la separación del grupo protector puede llevarse a cabo por tratamiento con hidruro de tributilestaño y ácido acético en presencia de cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) catalítico.
Con referencia al Esquema 1, los compuestos de la fórmula II pueden prepararse a partir de ácidos carboxílicos de la fórmula III por reacción con un derivado de hidroxilamina de la fórmula P^{2}ONH_{2} en presencia de un agente de activación tal como la 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y el 1-hidroxibenzotriazol en un disolvente aprótico, tal como cloruro de metileno o N,N-dimetilformamida, preferiblemente cloruro de metileno. La reacción se lleva a cabo a una temperatura de 0ºC aproximadamente a 50ºC aproximadamente, de preferencia 20ºC aproximadamente. La hidroxilamina de la fórmula P^{2}ONH_{2} se genera, preferiblemente, in situ partiendo de una forma de sal, tal como el hidrocloruro, en presencia de una base, tal como la trietilamina o la diisopropiletilamina, preferiblemente diisopropiletilamina.
Los compuestos de la fórmula III pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula IV por separación del grupo P^{1} protector del ácido carboxílico, donde P^{1} es metilo, etilo o terc-butilo, preferiblemente terc-butilo. Cuando P^{1} es metilo o etilo, la separación del grupo protector P^{1} se lleva a cabo por reacción con exceso de un hidróxido de un metal, tal como el hidróxido de sodio o el hidróxido de litio, preferiblemente hidróxido de litio, en un disolvente prótico, tal como etanol acuoso, a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 100ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente. En los casos en que la solubilidad de IV sea limitada, puede añadirse tetrahidrofurano a la mezcla de reacción como un disolvente complementario. Cuando P^{1} es terc-butilo, la separación del grupo protector P^{1} se lleva a cabo por tratamiento con un ácido fuerte tal como el ácido clorhídrico o el ácido trifluoroacético, preferiblemente ácido trifluoroacético, en un disolvente inerte tal como cloroformo o cloruro de metileno, preferiblemente cloruro de metileno. La reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente.
Los compuestos de la fórmula IV pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula V por hidrogenación bajo atmósfera de hidrógeno, en presencia de una catalizador, en un disolvente inerte para la reacción. Los catalizadores adecuados incluyen paladio sobre carbón, hidróxido de paladio sobre carbón o negro de paladio, preferiblemente paladio sobre carbón. Los disolventes adecuados incluyen un alcohol tal como etanol o metanol, preferiblemente metanol. La reacción antes citada puede llevarse a cabo a una presión desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atmósferas, preferiblemente 3 atmósferas aproximadamente. Las temperaturas adecuadas para la reacción citada varían desde aproximadamente 20ºC (temperatura ambiente) a aproximadamente 60ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente.
Los compuestos de fórmula V pueden ser preparados a partir de los compuestos de fórmula VI por reacción con una base y un agente de alquilación de la fórmula R^{1}(CH_{2})-X, en la que X es un grupo eliminable tal como Br, I o para-toluenosulfonato. Las bases adecuadas incluyen carbonato de potasio, carbonato de cesio, hexametildisilazida de potasio, o hidruro de sodio, preferiblemente carbonato de potasio. La mezcla de reacción se agita en un disolvente polar tal como acetona, N,N-dimetilformamida, o N-metilpirrolidin-2-ona, a una temperatura desde aproximadamente 0ºC a aproximadamente 50ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente.
Los compuestos de fórmula V en los que R^{4} es alquilo de C_{1}-C_{6} pueden ser obtenidos mediante alquilación de compuestos de la fórmula V en la que R^{4} es hidrógeno. La alquilación se lleva a cabo por reacción de un intermedio de fórmula V en la que R^{4} es hidrógeno, con un haluro de alquilo de la fórmula CH_{3}(CH_{2})_{n}X en la que n es 0 a 5 y X es bromo o yodo. La reacción citada se lleva a cabo en presencia de una base fuerte con impedimento estérico tal como diisopropilamida de litio o hexametildisilazida de litio en el seno de un disolvente inerte tal como éter dietílico o tetrahidrofurano, a una temperatura desde aproximadamente -78ºC a aproximadamente 0ºC, de preferencia -78ºC aproximadamente.
Los compuestos de la fórmula VI pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula VII por reacción con cloroformiato de bencilo, en presencia de una base tal comotrietilamina o diisopropiletilamina, preferiblemente trietilamina, y una cantidad catalítica de 4-dimetilaminopiridina. La reacción citada se lleva a cabo en el seno de un disolvente tal como tetrahidrofurano, cloruro de metileno o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno, a una temperatura desde aproximadamente 0ºC a aproximadamente 20ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente.
Los compuestos de la fórmula VII pueden ser obtenidos a partir de compuestos diamino de la fórmula VIII por reacción con fosgeno, carbonildiimidazol o trifosgeno, preferiblemente trifosgeno, en presencia de una base tal como piridina o trietilamina, preferiblemente trietilamina. La reacción citada se lleva a cabo en el seno de un disolvente tal como tetrahidrofurano, cloruro de metileno o cloroformo, preferiblemente tetrahidrofurano, a una temperatura desde aproximadamente 0ºC a aproximadamente 20ºC, de preferencia 20ºC aproximadamente.
Los compuestos de fórmula VIII en la que R^{1} es metilo o etilo, R^{4} es hidrógeno y R^{2} y R^{3} son, independientemente, alquilo de C_{1}-C_{6}, pueden ser obtenidos a partir de cetonas de la fórmula R^{2}R^{3}CO en la que R^{2} y R^{3} son, independientemente, alquilo de C_{1}-C_{6}. De modo semejante, los compuestos de fórmula VIII en la que P^{1} es metilo o etilo, R^{4} es hidrógeno, y R^{2} y R^{3} tomados juntos forman un anillo de un espirocompuesto de la fórmula
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en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH ó N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es, independientemente, 1 ó 2, y m es, independientemente, 1 ó 2, puede prepararse a partir de cetonas cíclicas de la fórmula (IX) en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH o N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es, independientemente, 1 ó 2, y m es, independientemente, 1 ó 2
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Los procedimientos operatorios son los mismos que los descritos por Schollkopf et al., en el caso de que R^{2} y R^{3} sean metilo (Liebigs Ann. Chem. 611, 1973 y Liebigs Ann. Chem. 1183, 1977).
Los compuestos de fórmula VIII en la que P^{1} es metilo o etilo, y R^{3} y R^{4} son hidrógeno, pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula X:
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en la que R^{3} es alquilo de C_{1}-C_{6}. Los procedimientos operatorios son los mismos que los descritos por Mohan et al., en el caso de que R^{3} sea isopropilo (J. Med. Chem. 34, 2402, 1991). Varios métodos de preparación de compuestos de fórmula IX son conocidos en la bibliografía científica, por ejemplo Shin et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 45, 3595, 1972.
El compuesto de fórmula VI en la que P^{1} es terc-butilo y R^{2}, R^{3} y R^{4} son hidrógeno, es conocidos en la bibliografía científica como el enantiómero S (Shiba et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 41, 2748, 1968). El enantiómero R correspondiente se prepara según se ha descrito para el enantiómero S. usando N-benciloxicarbonil-D-asparagina en lugar de N-benciloxicarbonil-L-asparagina como material de partida.
Los compuestos de la fórmula I que tienen naturaleza básica son capaces de formar una amplia variedad de sales diferentes con diversos ácidos inorgánicos y orgánicos. Aun cuando tales sales deben ser farmacéuticamente aceptables para administrar a animales, con frecuencia es deseable en la práctica aislar inicialmente desde la mezcla de reacción un compuesto de la fórmula I en forma de una sal farmacéuticamente inaceptable, luego, simplemente, convertir ésta última en la base libre por tratamiento con un reactivo alcalino y seguidamente convertir la base libre en una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido de los compuestos básicos de esta invención se preparan fácilmente tratando el compuesto básico con una cantidad sustancialmente equivalente del ácido mineral u orgánico escogido, en el seno de un medio disolvente acuoso o en el seno de un disolvente orgánico adecuado, tal como metanol o etanol. Por evaporación cuidadosa del disolvente, se obtiene la sal sólida deseada.
Los ácidos que se emplean para preparar las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, de los compuestos básicos de esta invención, son aquellos que forman sales de adición de ácido no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como sales hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato o bisulfato, fosfato o fosfato ácido, acetato, lactato, citrato o citrato ácido, tartrato o bitartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanosulfonato y pamoato [es decir, 1,1'-metilen-bis(2-hidroxi-3-naftoato)].
Aquellos compuestos de la fórmula I que tienen naturaleza ácida, son capaces de formar sales de base con diversos cationes farmacológicamente aceptables. Los ejemplos de tales sales incluyen las sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos y, en particular, las sales de sodio y de potasio. Estas sales se preparan todas mediante técnicas convencionales. Las bases químicas que se emplean como reactivos para preparar las sales de base farmacéuticamente aceptables de esta invención, son aquellas que forman sales de base no tóxicas con los compuestos ácidos de fórmula I descritos en esta Memoria. Estas sales de base no tóxicas incluyen las que derivan de cationes farmacológicamente aceptables tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, etc. Estas sales pueden prepararse fácilmente tratando los compuestos ácidos correspondientes con una solución acuosa que contiene los cationes farmacológicamente aceptables deseados, y evaporando luego a sequedad la solución que resulta, preferiblemente a presión reducida. Alternativamente, pueden prepararse mezclando juntas soluciones en alcoholes inferiores de los compuestos ácidos y del alcóxido de metal alcalino deseado, y evaporando después la solución resultante a sequedad del mismo modo que anteriormente. En los dos casos se emplean preferiblemente cantidades estequiométricas de reactivos con objeto de asegurar que la reacción sea completa y los máximos rendimientos de producto.
Para administrar a mamíferos, inclusive el ser humano, para la inhibición de metaloproteinasas de la matriz, para inhibir la producción de factor de la necrosis tumoral (TNF) y, por ejemplo, para la inhibición de reprolisina de mamíferos (preferiblemente la inhibición de agrecanasa), puede emplearse una variedad de una diversidad de vías convencionales incluyendo las vías oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular o subcutánea), bucal, anal y tópica. En general, los compuestos de la invención (conocidos también en lo sucesivo como los compuestos activos) se administrarán en dosis entre aproximadamente 0,1 y 25 mg/kg de peso del sujeto a tratar, por día, preferiblemente desde aproximadamente 0,3 a 5 mg/kg. Preferiblemente, el compuesto activo se administrará oral o parenteralmente. No obstante, alguna variación en la dosis ocurrirá necesariamente, dependiendo del estado del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en una amplia variedad de formas farmacéuticas diferentes; en general, los compuestos de esta invención terapéuticamente eficaces se encuentran presentes en tales formas farmacéuticas en niveles de concentración que varían desde aproximadamente 5,0% a aproximadamente 70% en peso.
Para administración oral, pueden emplearse comprimidos que contienen excipientes diversos tales como celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicálcico y glicina, junto con agentes de desintegración tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, de patata o tapioca), ácido algínico y ciertos silicatos complejos, junto con aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente son con frecuencia muy útiles con fines de obtención de comprimidos agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato sódico y talco. Composiciones sólidas de un tipo similar pueden emplearse asimismo como cargas en cápsulas de gelatina; los materiales preferidos a este respecto incluyen también lactosa o azúcar de leche, así como también polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para administración oral, el ingrediente activo puede mezclarse con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materias colorantes, y, si se desea, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones de los mismos. En el caso de animales, se incluyen ventajosamente en un alimento para animales o en el agua de bebida, en una concentración de 5-5000 ppm, preferiblemente 25 a 500 ppm.
Para administración parenteral (uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso) se prepara habitualmente una solución inyectable estéril del ingrediente activo. Pueden emplearse soluciones de un compuesto terapéutico de la presente invención o bien en aceite de sésamo o en aceite de cacahuete, o en solución acuosa de propilenglicol. Las soluciones acuosas deben ajustarse y tamponarse adecuadamente, de preferencia a un pH mayor que 8, si es necesario, y hacerse isotónico en primer lugar el diluyente líquido. Estas soluciones acuosas son adecuadas con fines de inyección intravenosa. Las soluciones oleosas son adecuadas con fines de inyección intraarticular, intramuscular y subcutánea. La preparación de todas estas soluciones en condiciones estériles se lleva a cabo fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. En el caso de animales, los compuestos pueden ser administrados por vía intramuscular o por vía subcutánea, a niveles de dosis de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, ventajosamente 0,2 a 10 mg/kg/día, dados en una dosis única o hasta en 3 dosis divididas.
Los compuestos activos de la invención pueden formularse también en composiciones para administración por vía rectal, tales como supositorios o enemas de retención, conteniendo, por ejemplo, bases convencionales de supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Para administración intranasal o administración por inhalación, los compuestos activos de la invención se distribuyen convenientemente en la forma de una solución o suspensión desde un recipiente de pulverización por bomba, que es apretado o pulsado por el paciente, o en forma de una presentación de pulverización en aerosol desde un recipiente puesto bajo presión o un nebulizador, con el uso de un agente propulsor adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol puesto bajo presión, la unidad de dosis puede ser determinada proporcionando una válvula que distribuya una cantidad medida. El recipiente puesto bajo presión o nebulizador puede contener una solución o suspensión del compuesto activo. Pueden formularse cápsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para usar en un inhalador o insuflador, conteniendo una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La capacidad de los compuestos de fórmula I o sus sales farmacéuticamente aceptables (a los que se alude en lo sucesivo como los compuestos de la presente invención) para inhibir las metaloproteinasas o reprolisina de mamíferos y, por consiguiente, para demostrar su eficacia para tratar enfermedades caracterizadas por metaloproteinasas o la producción de factor de la necrosis tumoral, se pone de manifiesto mediante los ensayos de valoración in vitro que figuran a continuación.
Ensayos biológicos Inhibición de la producción de TNF soluble
La capacidad de los compuestos o sus sales farmacéuticamente aceptable para inhibir la producción/liberación celular de TNF y, por consiguiente, demostrar su eficacia para tratar enfermedades que implican el desarreglo de TNF, se pone de manifiesto mediante el ensayo in vitro siguiente:
Método para la evaluación de la actividad de la enzima de conversión de TNF\alpha, recombinante 1) Preparación de TACE recombinante
Un fragmento de DNA que codifica la secuencia señal, el prodominio y el dominio catalítico de la TACE (aminoácidos 1-473), fue amplificado por reacción en cadena de la polimerasa usando como molde una colección de cDNA de pulmón humano. El fragmento amplificado fue clonado en el vector pFastBac. La secuencia de DNA de la inserción fue confirmada para ambas cadenas. Un bácmido preparado usando pFastBac en E. coli DH10Bac fue transfectado en células de insecto SF9. Las partículas de virus fueron amplificadas hasta las etapas P^{1}, P^{2}, P^{3}. El virus de F3 fue infectado en células de insecto SF9 y High Five y se cultivó a 27ºC durante 48 horas. Se recogió el medio y se usó para los ensayos y su purificación posterior.
2) Preparación de sustrato fluorescente apagado
Se preparó un sustrato de TNF-\alpha peptídico modelo (LY-Leucina-Alanina-Glutamina-Alanina-Valina-Arginina-Serina-Serina-Lisina(CMTR)-Arginina (LY = Lucifer Yellow; CMTR = 5-carboxitetrametil Rodamina)) y se estimó la concentración por la absorbancia a 560 nm (E_{560}, 60.000 M-1CM-1) según el método de Geoghegan, KF, "Improved method for converting an unmodified peptide to an energy-transfer substrate for a proteinase". Bioconjugate Che, 7, 385-391 (1995). Este péptido incluye el sitio de rotura sobre el pro-TNF que es desdoblado in vivo por la TACE.
3) Reacción enzimática
La reacción, llevada a cabo en una placa de 96 pocillos (Dynatech), estaba compuesta por 70 \mul de solución tampón (Hepes-HCl 25 mM, pH 7,5, más ZnCl_{2} 20 uM), 10 \mul de sustrato fluorescente apagado 100 \muM, 10 \mul de una solución de compuesto de ensayo en DMSO (5%), y una cantidad de enzima r-TACE que puede causar una escisión del 50% en 60 minutos, en un volumen total de 100 \mul. La especificidad de la escisión por la enzima en la unión amídica entre alanina y valina fue verificada mediante HPLC y espectrometría de masas. Las velocidades iniciales de escisión fueron verificadas midiendo el grado de aumento de la fluorescencia a 530 nm (excitación a 409 nm) a lo largo de 30 minutos. El experimento fue controlado del modo siguiente: 1) por la fluorescencia de fondo del sustrato; 2) por la fluorescencia del sustrato totalmente escindido; 3) por el agotamiento o aumento de la fluorescencia a partir de soluciones que contenían el compuesto de ensayo.
Los resultados obtenidos fueron analizados del modo siguiente. Las velocidades procedentes de reacciones "testigo" que no contenían compuesto de ensayo fueron promediadas para establecer el valor de 100%. La velocidad de reacción en presencia de compuesto de ensayo fue comparada con la obtenida en ausencia de compuesto, y tabulada como "tanto por ciento del testigo que no contenía compuesto de ensayo". Los resultados fueron representados gráficamente como "% del testigo" frente al log. de la concentración de compuesto y se determinó el valor en el punto semi-máximo o IC_{50}. La IC_{50} para el ensayo anterior es una medida de la inhibición de la actividad proteólitica de la TACE sobre el TNF-\alpha. El bloqueo de la unión de TNF-\alpha a la TACE tal como se usa aquí es conforme a lo descrito en la patente de EE.UU. nº 5.830.742, expedida el 3 de Noviembre de 1998.
Análisis de monocitos
Se aislaron células mononucleares humanas partiendo de sangre humana anti-coagulada, usando una técnica de separación Ficoll-hypaque de una sola etapa. (2) Las células mononucleares fueron lavadas tres veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con cationes divalentes y resuspendidas a una densidad de 2 x 10^{6}/ml en HBSS que contenía BSA al 1%. Los recuentos diferenciales determinados usando el analizador Abbott Cell Dyn 3500 indicaron que los monocitos variaban en estas preparaciones desde el 17 al 24% de las células totales.
180 m de la suspensión de células fue distribuida en partes alícuotas en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar). Las adiciones de compuestos y LPS (100 ng/ml de concentración final) dieron un volumen final de 200 \mul. Todas las condiciones fueron efectuadas por triplicado. Al cabo de un período de incubación de cuatro horas a 37ºC en un incubador con CO_{2}, humidificado, las placas fueron retiradas y sometidas a centrifugación (10 minutos a aproximadamente 250 x g) y los sobrenadantes fueron separados y analizados para determinar el TNF-\alpha usando el "kit" de ELISA de R y D.
Ensayos de MMP
Inhibidores selectivos de la Colagenasa-3 (metaloproteinasa-13 de la matriz) tal como se emplea en esta Memoria, aluden a agentes que ponen de manifiesto al menos una selectividad 100 veces mayor para la inhibición de la actividad enzimática de la colagenasa-3 respecto a la actividad enzimática de la colagenasa-1 y una potencia de menos de 100 nM según se define por los resultados de IC_{50} de los ensayos de fluorescencia de MMP-13/MMP-1 descritos más adelante. Los inhibidores selectivos de la colagenasa-3 pueden ser identificados explorando los inhibidores de la presente invención mediante los ensayos de fluorescencia de MMP-13/MMP-1 que se describen más adelante y seleccionando aquellos agentes con relaciones IC_{50} de inhibición de MMP-13/MMP-1 de 100 o más y una potencia inferior a 100 nM.
Inhibidores de colagenasa no selectivos, como se emplea en esta memoria, alude a gentes que ponen de manifiesto una selectividad inferior a 100 veces más para la inhibición dela actividad enzimática de la colagenasa-3 sobre la actividad enzimática de la colagenasa-1 o una potencia de más que 100 nM, como se define por los resultados de IC_{50} obtenidos de los ensayos de fluorescencia de MMP-13/MMP-1 descritos más adelante.
La aptitud de los inhibidores de colagenasa para inhibir la actividad de la colagenasa es bien conocida en la técnica. Los ensayos que siguen pueden ser usados para identificar inhibidores de metaloproteinasas de la matriz.
Inhibición de colagenasa humana (MMP-1)
Colagenasa humana recombinante es activada con tripsina utilizando la relación siguiente: 10 \mug de tripsina por 100 \mug de colagenasa. La tripsina y la colagenasa se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se añade un exceso quíntuplo (50 \mug/10 \mug de tripsina) de inhibidor de tripsina de soja.
Se preparan soluciones de reserva (stock) 10 mM de inhibidores en sulfóxido de dimetilo y después se diluyen usando el Esquema siguiente:
10 mM \rightarrow 120 \muM \rightarrow 12 \muM \rightarrow 1,2 \muM \rightarrow 0,12 \muM
Veinticinco microlitros de cada una de las concentraciones se añaden luego por triplicado a pocillos apropiados de una placa de microflúor de 96 pocillos. La concentración final de inhibidor será una dilución 1:4 después de la adición de enzima y sustrato. Se establecen testigos positivos (enzima, sin inhibidor) en los pocillos D1-D6 y blancos (sin enzima ni inhibidores) en los pocillos D7-D12.
Se diluye colagenasa a 400 ng/ml y se añaden luego 25 \mul a los pocillos apropiados de la placa de microflúor. La concentración final de colagenasa en el ensayo es 100 ng/ml.
Se prepara el sustrato (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2}) en forma de una solución de reserva 5 mM en sulfóxido de dimetilo y después se diluye a 20 mM en tampón del ensayo. El ensayo se inicia mediante la adición de 50 \mul de sustrato por pocillo de la placa de microflúor obteniendo una concentración final de 10 \muM.
Se llevaron a cabo lecturas de la fluorescencia (longitud de onda de excitación 360 nm, de emisión 460 nm), en el tiempo 0 y después a intervalos de 20 minutos. El ensayo se efectúa a temperatura ambiente con un tiempo típico de ensayo de 3 horas.
Luego se representa gráficamente la fluorescencia frente al tiempo tanto para el blanco como para las muestras que contienen colagenasa (se obtiene la media de los resultados de determinaciones realizadas por triplicado). Se escoge un punto de tiempo que proporcione una buena señal (el blanco) y que esté sobre la parte lineal de la curva (habitualmente unos 120 minutos) para determinar los valores de IC_{50}. El tiempo cero se usa como blanco para cada uno de los compuestos en cada concentración y estos valores se restan de los resultados obtenidos a los 120 minutos. Los resultados obtenidos se representan gráficamente como concentración de inhibidor frente a % del testigo (fluorescencia del inhibidor dividida por fluorescencia de la colagenasa sola x 100). Las IC_{50} se determinan a partir de la concentración de inhibidor que proporciona una señal que es el 50% de la del testigo.
Si se indica que las IC_{50} son <0,03 \muM, entonces los inhibidores se ensayan a concentraciones de 0,3 \muM, 0,03 \muM, 0,03 \muM y 0,003 \muM.
Inhibición de gelatinasa (MMP-2)
La inhibición de la actividad de gelatinasa se ensaya usando el sustrato Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2} (10 \muM) en las mismas condiciones que la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1).
Gelatinasa de 72kD es activada con APMA 1 mM (acetato p-aminofenilnercúrico) durante 15 horas a 4ºC y se diluye para obtener una concentración final en el ensayo de 100 mg/ml. Los inhibidores se diluyen como para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1) para dar concentraciones finales en el ensayo de 30 \muM, 3 \muM, 0,3 \muM y 0,03 \muM. Cada concentración se hace por triplicado.
Las lecturas de la fluorescencia (longitud de onda de excitación 360 nm, de emisión 460 nm) se toman al tiempo cero y después a intervalos de 20 minutos durante 4 horas.
Se determinan las IC_{50} como para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1). Si se indica que las IC_{50} son inferiores a 0,03 \muM, los inhibidores se ensayan a concentraciones finales de 0,3 \muM, 0,03 \muM, 0,003 \muM y 0,003 \muM.
Inhibición de la actividad de estromelisina (MMP-3)
La inhibición de la actividad de estromelisina se basa en un ensayo espectrofotométrico modificado descrito por Weingarten y Feder (Weingarten, H. y Feder, J., Spectrophotometric Assay for Vertebrate Collagenase, Anal. Biochem. 147, 437-440 (1985)). La hidrólisis del tiopeptólido [Ac-Pro-Leu-Gly-SCH[CH_{2}CH(CH_{3})_{2}]CO-Leu-Gly-OC_{2}H_{5}] que sirve de sustrato, proporciona un fragmento de mercaptano que puede ser observado en presencia de reactivo de Ellman.
Proestromelisina recombinante humana es activada con tripsina usando una relación de 1 \mul de una solución "stock" de tripsina de 10 mg/ml por 26 mg de estromelisina. La tripsina y la estromelisina se incuban a 37ºC durante 15 minutos, seguido de 10 \mul de solución de inhibidor de tripsina de soja de 10 \mug/ml, durante 10 minutos, a 37ºC, para apagar la actividad de la tripsina.
Los ensayos se llevan a cabo en un volumen total de 250 ml de tampón de ensayo (cloruro de sodio 200 mM, MES 50 mM y cloruro de calcio 10 mM, pH 6,0) en placas de microtitulación de 96 pocillos. La estromelisina activada se diluye en tampón de ensayo a 25 \mug/ml. Se prepara el reactivo de Ellman (disulfuro de 3-carboxi-4-nitrofenilo) en forma de una solución de reserva (stock) 1M en dimetilformamida y se diluye a 5 mM en tampón de ensayo con 50 ml por pocillo obteniendo una concentración final 1 mM.
Se preparan soluciones de reserva 10 mM de inhibidores en sulfóxido de dimetilo y se diluyen en serie con tampón de ensayo de tal modo que la adición de 50 \mul a los pocillos apropiados proporcione una concentración final de 3 \muM, 0,3 \muM, 0,003 \muM y 0,0003 \muM. Todas las condiciones son completadas por triplicado.
Una solución de reserva 300 mM, en sulfóxido de dimetilo, del péptido que sirve de sustrato, se diluye a 15 mM con tampón de ensayo y se inicia el ensayo mediante la adición de 50 \mul a cada pocillo para dar una concentración final de sustrato 3 mM. Los blancos están constituidos por el péptido que sirve de sustrato y reactivo de Ellman, sin la enzima. La formación de producto fue verificada a 405 nm con un lector de placas UVmax de Molecular Devices.
Se determinaron los valores de la IC_{50} del mismo modo que para la colagenasa.
Inhibición de la MMP-13
Se activa MMP-13 humana recombinante con APMA 2 mM (acetato p-aminofenilmercúrico) durante 1,5 horas a 37ºC y se diluye a 400 mg/ml en tampón de ensayo (Tris 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 200 mM, cloruro de calcio 5 mM, cloruro de cinc 20 \muM, Brij al 0,02%). Veinticinco microlitros de enzima diluida se añaden por pocillo de una placa de microflúor de 96 pocillos. La enzima se diluye luego en una relación 1:4 en el ensayo mediante la adición de inhibidor y sustrato, obteniendo una concentración final en el ensayo de 100 mg/ml.
Se preparan soluciones de reserva (stock) 10 mM de inhibidores en sulfóxido de dimetilo y luego se diluyen en tampón de ensayo como para el esquema de dilución del inhibidor, para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1): Veinticinco microlitros de cada una de las concentraciones se añade por triplicado a la placa de microflúor. Las concentraciones finales en el ensayo son 30 \muM, 3 \muM, 0,3 \muM y 0,03 \muM.
Se prepara el sustrato (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2}) como para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1) y se añaden 50 ml a cada pocillo para dar una concentración final de ensayo de 10 \muM. Se efectúan lecturas de la fluorescencia (longitud de onda de excitación 360 nm, emisión 450 nm) al tiempo 0 y cada 5 minutos, durante 1 hora.
Los testigos positivos consisten en enzima y sustrato sin inhibidor y los blancos constan de sustrato solamente.
Se determinan las IC_{50} como para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1). Si resulta que las IC_{50} son inferiores a 0,03 \muM, los inhibidores se ensayan entonces a concentraciones finales de 0,3 \muM, 0,03 \muM, 0,003 \muM y 0,0003 \muM.
Ensayo de MMP-13 en película de colágeno
Se radiomarcó colágeno de tipo 1, de rata, con anhídrido acético C^{14} (T.E. Cawston y A.J. Barret, Anal. Biochem:, 99, 340-345 (1979)) y se usó para preparar placas de 96 pocillos que contenían películas de colágeno radiomarcado (Barbara Johson-Wint, Anal. Biochem, 104, 175-181 (1980)). Cuando se añade al pocillo una solución que contiene colagenasa, la enzima escinde el colágeno insoluble que se desenrolla y, por tanto, es solubilizado. La actividad de la colagenasa es directamente proporcional a la cantidad de colágeno solubilizado, determinada por la proporción de radiactividad liberada en el sobrenadante medida en un contador de centelleo estándar. Los inhibidores de colagenasa son, por tanto, compuestos que reducen los recuentos radiactivos liberados con respecto a los testigos sin que se encuentre presente inhibidor alguno. Una realización específica de este ensayo se describe con detalle seguidamente.
Para determinar la selectividad de compuestos para la MMP-13 frente a la MMP-1 usando colágeno como sustrato, se emplea el procedimiento operatorio que sigue. proMMP-13 o proMMP-1, humana, recombinante, se activa según los procedimientos operatorios anteriormente descritos. La MMP-13 ó la MMP-1 activada se diluye a 0,6 ug/ml con tampón (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, ZnCl_{2} 1 uM, Brij-35 0,05%, azida de sodio 0,02%).
Se preparan soluciones de reserva (stock) de compuesto de ensayo (10 mM) en sulfóxido de dimetilo. Se hacen diluciones de los compuestos de ensayo en el tampón de Tris, anterior, a 0,2, 2,0, 20, 200, 2.000 y 20.000 nM.
100 \mul de la dilución apropiada del fármaco y 100 \mul de enzima diluida, se hacen pasar con pipeta a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contienen películas de colágeno marcado con colágeno-^{14}C. La concentración final de enzima es 0,3 \mug/ml mientras que la concentración final de fármaco es 0,1, 1,0, 10, 100, 1.000 nM. Cada una de las concentraciones de fármaco y testigo se analiza por triplicado. También se realizan testigos por triplicado para los casos en que no se encuentre presente enzima y para enzima en ausencia de cualquier compuesto.
Las placas se incuban a 37ºC durante un período de tiempo tal que alrededor del 30 - 50% del colágeno disponible es solubilizado -determinado por recuento de pocillos testigo adicionales en diversos puntos de tiempo. En la mayoría de los casos se requieren alrededor de 9 horas de incubación. Cuando el ensayo ha progresado suficientemente, se separa el sobrenadante procedente de cada pocillo y se somete a recuento en un contador de centelleo. Las cuentas de fondo (determinadas mediante los recuentos en los pocillos sin enzima) se restan de cada muestra y se calcula el % de liberación con respecto a los pocillos con enzima solamente y sin inhibidor. Los valores por triplicado de cada punto son promediados y los resultados se inscriben en una gráfica como tanto por ciento liberado frente a concentración de fármaco. Se determinan las IC_{50} partiendo del punto en el que se obtiene una inhibición del 50% de liberación del colágeno radiomarcado.
Para determinar la identidad de las colagenasas activas en medio acondicionado con cartílago, se llevaron a cabo ensayos usando colágeno como sustrato, medio acondicionado con cartílago conteniendo actividad de colagenasa e inhibidores de selectividad variable. El medio acondicionado con cartílago fue recogido durante el tiempo en el que estaba ocurriendo la degradación del colágeno y por tanto, es representativo de las colagenasas responsables de la rotura del colágeno. Los ensayos fueron llevados a cabo como se ha explicado anteriormente, excepto que en lugar de usar MMP-13 recombinante o MMP-1 recombinante, la fuente de la enzima fue medio acondicionado con cartílago.
Degradación de colágeno de cartílago inducida por IL-1, procedente de cartílago nasal bovino
Este ensayo emplea explantes de cartílago nasal bovino que se utilizan comúnmente para ensayar la eficacia de diversos compuestos para inhibir o bien la degradación de proteoglucanas inducida por IL-1, o bien la degradación de colágeno inducida por IL-1. El cartílago nasal bovino es un tejido muy similar al cartílago articular, es decir, condrocitos rodeados por una matriz que es principalmente colágeno de tipo II y agrecana. El tejido se emplea debido a que: (1) es muy similar al cartílago articular, (2) puede adquirirse con facilidad, (3) es relativamente homogéneo, y (4) se degrada con cinéticas predecibles después de estimulación con IL-1.
Dos variaciones de este ensayo han sido utilizadas para ensayar compuestos. Ambas variaciones proporcionan resultados similares. Las dos variaciones se describen a continuación:
Variación 1
Tres fragmentos de cartílago nasal bovino (de 2 mm de diámetro x 1,5 mm de largo, aproximadamente) se colocan en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se añade luego a cada pocillo un ml de medio sin suero. Se preparan los compuestos en forma de soluciones de reserva (stock) 10 mM en DMSO y después se diluyen apropiadamente en medio sin suero hasta las concentraciones finales, por ejemplo, 50, 500 y 5000 nM. Cada una de las concentraciones se ensaya por triplicado.
Se añade IL-1\alpha humana recombinante (5 ng/ml) (IL-1) a pocillos testigo por triplicado y a cada uno de los pocillos que contienen fármaco. Se establecen también pocillos testigo por triplicado en los que no se han añadido ni fármaco ni IL-1. Se separa el medio y se añade medio de nueva aportación conteniendo IL-1 y las concentraciones de fármaco apropiadas, los días 6, 12, 18 y 24 o cada 3 - 4 días si es necesario. Los medios separados en cada punto de tiempo se guardan a -20ºC para su análisis más tarde. Cuando el cartílago en los pocillos con solamente IL-1 ha sido reabsorbido casi completamente (aproximadamente el día 21), se da por concluido el experimento. Se separa el medio y se guarda. Partes alícuotas (100 ul) procedentes de cada pocillo en cada punto de tiempo se reúnen, se digieren con papaína y luego se analizan para determinar el contenido de hidroxiprolina. La hidroxiprolina obtenida como ruido de fondo (promedio de los pocillos sin IL-1 y sin fármaco) se resta de cada uno de los puntos de resultados y se calcula el promedio para cada triplicado. Los resultados obtenidos de este modo se expresan como tanto por ciento del valor medio de la IL-1 sola y se representan gráficamente. La IC_{50} se determina desde esta gráfica.
Variación 2
El planteamiento experimental es el mismo expuesto anteriormente en la Variación 1, hasta el día 12. El día 12, se separa el medio acondicionado procedente de cada pocillo y se congela. Después se añade a cada pocillo un ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo 0,5 \mug/ml de tripsina, y se continúa la incubación durante 48 horas más a 37ºC. Al cabo de 48 horas de incubación en tripsina, se separa la solución de PBS. Alícuotas (50 \mul) de la solución de PBS/tripsina y los dos puntos de tiempo anteriores (días 6 y 12) se reúnen, se somete a hidrólisis y se determina el contenido de hidroxiprolina. La hidroxiprolina de fondo (media de los pocillos sin IL-1 y sin fármaco), se resta de cada punto de resultado y se calcula el valor medio para cada triplicado. El resultado se expresa luego como el tanto por ciento del valor medio de IL-1 sola y se representa gráficamente. La IC_{50} se determina a partir de esta gráfica. En esta variación, el curso de tiempo del experimento se acorta considerablemente. La adición de tripsina durante 48 horas después de 12 días de estimulación con IL-1 probablemente libera el colágeno de tipo II que ha sido dañado por la actividad de la colagenasa pero que todavía no se ha liberado de la matriz del cartílago. En ausencia de estimulación con IL-1, el tratamiento con tripsina produce solamente niveles de fondo bajos de degradación del colágeno en los explantes de cartílago.
Inhibición de gelatinasa de 92 kD, humana (MMP-9)
La inhibición de gelatinasa de 92 kD (MMP-9) se ensaya usando el sustrato Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH_{2} (10 \muM) en condiciones similares a las anteriormente descritas para la inhibición de la colagenasa humana (MMP-1).
Gelatinasa de 92 kD, humana, recombinante (MMP-9, gelatinasa B) se activa durante 2 horas con acetato p-aminofenilmercúrico 1 mM (procedente de una solución de reserva 100 mM recién preparada, en NaOH 0,2 N), a 37ºC.
Soluciones de reserva 10 mM en sulfóxido de dimetilo, de inhibidores, se diluyen en serie en tampón de ensayo (TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, CaCl_{2} 5 mM, ZnCl_{2} 20 \muM, BRIJ-35 al 0,02% (vol./vol.)) usando el esquema siguiente:
10 mM \rightarrow 120 \muM \rightarrow 12 \muM \rightarrow 1,2 \muM \rightarrow 0,12 \muM
Se hacen otras diluciones, según se necesita, siguiendo este mismo esquema. Se efectúa en cada ensayo un mínimo de cuatro concentraciones de inhibidor para cada uno de los compuestos. Después se añaden 25 \mul de cada concentración a pocillos triplicados de una placa de microflúor, de fondo en U, de 96 pocillos, negra. Como el volumen final del ensayo es 100 \mul, las concentraciones finales de inhibidor son el resultado de otra dilución 1:4 (es decir 30 \muM \rightarrow 3 \muM \rightarrow 0,3 \muM \rightarrow 0,03 \muM, etc). Se preparan también, por triplicado, una blanco (sin enzima ni inhibidor) y un testigo positivo de enzima (con enzima y sin inhibidor).
Se diluye enzima activada a 100 ng/ml en tampón de ensayo, se añaden 25 \mul por pocillo a pocillos apropiados de la microplaca. La concentración final de enzima en el ensayo es 25 ng/ml (0,27 nM).
Una solución de reserva 5 mM en sulfóxido de dimetilo de sustrato (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH_{2}) se diluye en tampón de ensayo a 20 \muM. El ensayo se inicia mediante la adición de 50 \mul de sustrato diluido obteniendo una concentración final de ensayo de 10 \muM de sustrato. En el tiempo 0 se toma inmediatamente una lectura de la fluorescencia (longitud de onda de excitación 320 nm, emisión 390 nm) y después se realizan lecturas cada quince minutos, a temperatura ambiente, con un Lector de placas de muchos pocillos CytoFluor de PerSeptive Biosystems con la ganancia en 90 unidades.
Los valores medios de la fluorescencia de la enzima y el blanco se representan gráficamente frente al tiempo. Se escoge un punto de tiempo preliminar sobre la parte lineal de esta curva para las determinaciones de IC_{50}. El punto de tiempo 0 para cada uno de los compuestos en cada dilución se resta del punto de tiempo posterior y los resultados se expresan luego como tanto por ciento de testigo de enzima (fluorescencia del inhibidor dividida por la fluorescencia de testigo positivo con enzima x 100). Los resultados se representan gráficamente como concentración de inhibidor frente a tanto por ciento de testigo de enzima. Las IC_{50} se definen como la concentración de inhibidor que da una señal que es el 50% de la del testigo positivo de enzima.
Ensayo de Agrecanasa
Condrocitos porcinos primarios procedentes de cartílago de juntura articular se aíslan mediante digestión secuencial con tripsina y colagenasa seguida de digestión con colagenasa durante la noche, y se depositan en placas a 2 x 10^{5} células por porcillo en placas de 48 pocillos con 5 \muCi/ml de ^{35}S (1000 Ci/mmol)azufre en placas revestidas con colágeno de tipo I. Se deja que las células incorporen el marcador en su matriz de proteoglucana (aproximadamente 1 semana) a 37ºC, bajo atmósfera de CO_{2} al 5%.
La noche anterior a la iniciación del ensayo, monocapas de condrocitos se lavan dos veces con DMEM/PSF al 1%/G y luego se dejan incubar en DMEM/FBS al 1%, de nueva aportación, durante la noche.
La mañana siguiente los condrocitos se lavan una vez con DMEM/PSF al 1%/G. El lavado final se deja asentar sobre las placas en el incubador mientras se hacen las diluciones.
Los medios y las diluciones pueden prepararse según se describe en la Tabla que figura a continuación
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Se marcan las placas y solamente se usan los 24 pocillos interiores de la placa. En una de las placas, varias columnas son designadas como IL-1 (sin fármaco) y Testigo (sin IL-1 ni fármaco). Estas columnas testigo se someten a recuento periódicamente para verificar la liberación de ^{35}S-proteoglucana. Se añaden medios testigo y de IL-1 a los pocillos (450 ul) seguido de compuesto (50 ul) para iniciar de este modo el ensayo. Las placas son incubadas a 37ºC con una atmósfera de CO_{2} al 5%.
A una liberación del 40-50% (cuando la CPM procedente de los medios de IL-1 es 4-5 veces la de los medios testigo) determinada mediante recuento de centelleo líquido (LSC) de muestras de los medios, el ensayo se da por terminado (9-12 horas). Se separan los medios de todos los pocillos y se colocan en tubos de centelleo. Se añade el compuesto de centelleo (scintillate) y se adquieren las cuentas radiactivas (LSC). Para solubilizar las capas de células se añaden a cada pocillo 500 ul de tampón de digestión con papaína (Tris 0,2 M , pH 7,0, EDTA 0,5 mM, DTT 5 mM y papaína, 1 mg/ml). Las placas con la solución de digestión se incuban a 60ºC durante la noche. La capa de células se separa de las placas el día siguiente y se coloca en tubos de centelleo. Luego se añade el compuesto de centelleo y las muestras son sometidas a recuento (LSC).
Se determina el tanto por ciento de cuentas liberadas desde el total presente en cada pocillo. Los valores medios de los triplicados se obtienen sustrayendo de cada pocillo el ruido de fondo de cada testigo. El tanto por ciento de inhibición del compuesto se basa sobre muestras de IL-1 como el 0% de inhibición (100% de cuentas en total).
Los compuestos de la presente invención que fueron ensayados tenían una IC_{50} menor que 1 \muM, preferiblemente menor que 50 nM, en uno al menos de los ensayos anteriormente descritos. Los compuestos de la presente invención poseen también una actividad diferente (es decir, son selectivos) para una o más reprolisinas o MMPs. La selectividad, tal como se emplea en esta Memoria, alude a la relación de los resultados inhibitorios de IC_{50} procedentes de dos o más de los protocolos anteriores. Los compuestos de la invención que son selectivos poseen una relación de 10 por lo menos. Los compuestos de la invención que poseen la potencia o selectividad deseada, pueden ser identificados ensayando un compuesto (preferiblemente una molécula pequeña, más preferiblemente un ácido hidroxámico y, lo más preferible, un compuesto de fórmula I) según los protocolos descritos anteriormente y determinando la IC_{50} y las relaciones de selectividad.
Un grupo de compuestos preferidos (más preferiblemente compuestos de la fórmula I) que pueden ser identificados mediante los métodos de la presente invención, incluyen aquellos inhibidores que poseen actividad selectiva frente a la MMP-13 sobre la MMP-1, (preferiblemente una IC_{50} inferior a 500 nM, más preferiblemente 100 nM y, lo más preferible, 50 nM) para la MMP-13 con una selectividad de al menos 10 veces, preferiblemente 40 veces, mayor para la MMP-13 que para la MMP-1.
Preparación de compuestos
Los Ejemplos que siguen ilustran la preparación de los compuestos de la presente invención. Los puntos de fusión están sin corregir. Los datos de NMR se exponen en partes por millón (\delta). Se utilizaron reactivos comerciales sin purificación adicional. La cromatografía se refiere a cromatografía en columna llevada a cabo usando gel de sílice de 32-63 mm, ejecutada bajo condiciones de presión de nitrógeno (cromatografía súbita). La temperatura ambiente se refiere a 20-25ºC. Todas las reacciones no acuosas fueron realizadas bajo atmósfera de nitrógeno por conveniencia y para hacer máximos los rendimientos.
Ejemplo 1 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico a) Éster 1-bencílico, éster 5-terc-butílico del ácido (4R)-3-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-1,5-dicarboxílico
A una solución del éster 1-bencílico, éster 5-terc-butílico del ácido (4R)-oxo-imidazolidina-1,5-dicarboxílico (650 mg, 2,0 mmol) en acetona (10 ml), se añadió K_{2}CO_{3} pulverizado (550 mg) y bromuro de 4-(4-fluorofenoxi)bencilo (1,85 g, 6,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 días y luego se evaporó el disolvente. El residuo se tomó con acetato de etilo y se lavó con agua y salmuera. Después de secar sobre MgSO_{4} se evaporó el disolvente. Se aisló desde el residuo el compuesto del epígrafe (820 mg, 78%) por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con cloroformo.
b) Éster terc-butílico del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
Una solución del éster 1-bencílico, éster 5-terc-butílico del ácido (4R)-3-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-1,5-dicarboxílico ((1,1 g, 2,1 mmol) en metano (100 ml), se hidrogenó con Pd al 10% sobre carbón (110 mg) a una presión de 3 atmósferas, durante 6 horas. Después de separar el catalizador por filtración a través de un filtro de nilón de 0,45 \mum de tamaño de poro, se evaporó el disolvente obteniendo el compuesto del epígrafe (810 mg, 100%) en forma de un sólido amarillo.
c) Ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
Una solución del éster terc-butílico del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico (810 mg, 1,56 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (8 ml), se trató con ácido trifluoroacético (8 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas y se concentró quedando un aceite. El compuesto del epígrafe, un sólido blanco (297 mg, 58%) se recogió por filtración, después de triturar el aceite con una mezcla de éter dietílico y hexano calentada suavemente.
d) (2-Trimetilsilaniletoxi)amida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
A una solución del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico (120 mg, 0,36
mmol) en cloruro de metileno (5 ml), se añadieron sucesivamente
1-hidroxibenzotriazol (73 mg, 0,54 mmol), diisopropiletilamina (0,13 ml, 0,75 mmol), hidrocloruro de O-(2-trimetilsilil-etil)hidroxilamina (92 mg, 0,54 mmol) e hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (104 mg, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y luego se diluyó con cloruro de metileno y agua. La fase orgánica se lavó sucesivamente con solución acuosa de HCl 1M, solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y salmuera. Después de secar sobre MgSO_{4}. la solución se concentró hasta obtener un aceite. El compuesto del epígrafe, un aceite (85 mg, 53%) se aisló por cromatografía sobre gel de sílice y elución con acetato de etilo.
e) Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
A una solución de (2-trimetilsilaniletoxi)amida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico (85 mg, 0,19 mmol) en cloruro de metileno (5 ml), se añadió eterato de trifluoruro de boro (0,073 ml, 0,58 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas y luego se apagó mediante la adición de solución acuosa saturada de NH_{4}Cl. La mezcla se diluyó con agua y acetato de etilo y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró, obteniendo un sólido blanco. Se aisló el compuesto del epígrafe (31 mg, 47%) por recristalización en una mezcla de acetato de etilo y metanol.
^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) : \delta 10,63 (s ancho, 1H), 8,93 (s ancho, 1H), 7,23 - 7,17 (m, 4H), 7,05 - 7,01 (m, ^{2}H), 6,92 (d, J=8,7 Hz, 2 H), 6,76 (s, 1H), 4,22 (d, J=15,2 Hz, 1H), 4,15 (d, J=15,2 Hz, 1H), 3,92 - 3,89 (m, 1H), 3,40 (t aparente, J=9,1 Hz, 1H), 3,15 - 3,12 (m, 1H).
MS m/z 344 (M-1).
Análisis calculado para C_{19}H_{16}FN_{3}O_{4} : C, 59,13; H, 4,67; N, 12,17. Encontrado: C, 58,98; H, 483; N, 12,10.
Ejemplo 2 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-naftalen-1-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 376 (M-1). Análisis calculado para C_{21}H_{19}N_{3}O_{4}: C, 66,83; H, 5,07; N, 11,13. Encontrado: C, 66,75; H, 5,30; N, 11,13.
Ejemplo 3 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(Naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 376 (M-1). Análisis calculado para C_{21}H_{19}N_{3}O_{4} + 0,5 H_{2}O: C, 65,28; H, 5,22; N, 10,87. Encontrado: C, 65,01; H, 5,12; N, 11,28.
Ejemplo 4 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-metoxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
p.f. 130-133ºC. MS m/z 264 (M-1). Análisis calculado para C_{12}H_{15}N_{3}O_{4}: C, 54,33; H, 5,70; N, 15,84. Encontrado: C, 54,24; H, 51,77; N, 15,62.
Ejemplo 5 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[3-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z (M-1). Análisis calculado para C_{19}H_{16}FN_{3}O_{4}: C, 59,13; H, 4,67; N, 12,17. Encontrado: C, 59,24; H, 4,60; N, 12,42.
Ejemplo 6 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-naftalen-2-ilmetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 284 (M-1). Análisis calculado para C_{15}H_{15}N_{3}O_{3}: C, 63,15; H, 5,30; N, 14,73. Encontrado: C, 62,82; H, 5,32; N, 14,49.
Ejemplo 7 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4'-fluorobifenil-4-ilmetil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 328 (M-1). Análisis calculado para C_{17}H_{16}FN_{3}O_{3}+0,5 H_{2}O : C, 60,35; H, 5,06; N, 12,42. Encontrado: C, 60,43; H, 4,99; N, 12,83.
Ejemplo 8 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-benciloxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 340 (M-1). Análisis calculado para C_{18}H_{19}N_{3}O_{4}: C, 63,33; H, 5,61; N, 12,31. Encontrado: C, 63,13; H, 5,62; N, 12,28.
Ejemplo 9 Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(2-cloro-4-fluorobenciloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico
MS m/z 392, 394 (M-1). Análisis calculado para C_{18}H_{17}ClFN_{3}O_{4} + 0,5 H_{2}O: C, 53,67; H, 4,50; N, 10,43. Encontrado: C, 53,78; H, 4,51; N, 10,15.

Claims (18)

1. Un compuesto según la fórmula (I)
10
o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptable, en la que
R^{1} es arilo de C_{6}-C_{10}, heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxiarilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxi-arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})oxiheteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxiheteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxialquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})alquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})alquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})oxialquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquil(C_{1}-C_{6})arilo de C_{6}-C_{10}, aril(C_{6}-C_{10})oxialquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, heteroaril(C_{1}-C_{9})oxialquil(C_{1}-C_{6})heteroarilo de C_{1}-C_{9}, aril(C_{6}-C_{10})aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})-aril(C_{6}-C_{10})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, heteroaril(C_{1}-C_{9})heteroaril(C_{1}-C_{9})alquilo de C_{1}-C_{6}, aril(C_{6}-C_{10})alcoxi(C_{1}-C_{6})alquilo de C_{1}-C_{6}, o heteroaril(C_{1}-C_{9})alcoxi(C_{1}-C_{6})alquilo de C_{1}-C_{6},
en la que, independientemente, cada uno de los átomos de carbono del anillo de dichos restos de arilo de C_{6}-C_{10} y heteroarilo de C_{1}-C_{9} que es capaz de formar un enlace adicional, está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre fluoro, cloro, bromo, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, y perfluoroalquilo de C_{1}-C_{3}, y perfluoroalcoxi de C_{1}-C_{3};
R^{2} y R^{3} se seleccionan, cada uno independientemente, entre hidrógeno y alquilo de C_{1}-C_{6}, o tomados juntos forman un anillo de un espirocompuesto de la fórmula
11
en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH ó N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es independientemente 1 ó 2, y m es independientemente 1 ó 2; y
R^{4} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, de la fórmula (I')
12
3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{2}, R^{3} y R^{4} son hidrógeno.
4. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{4} es hidrógeno.
5. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{4} es alquilo de C_{1}-C_{6}.
6. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{2} y R^{3} son hidrógeno.
7. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{2} y R^{3} son alquilo de C_{1}-C_{6} de modo que R^{2} es el mismo que R^{3}.
8. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{2} y R^{3} tomados juntos forman un anillo de un espirocompuesto de la fórmula
13
en la que X es un enlace, CH_{2}, O, S, NH o N-alquilo de C_{1}-C_{6}, n es 1 ó 2, y m es 1 ó 2, de modo que n es el mismo que m.
9. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{1} es 4-(4-fluorofenoxi)fenilo.
10. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{1} es 4-(4-clorofenoxi)fenilo.
11. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{1} es 4-(naftalen-2-iloxi)fenilo.
12. Un compuesto según la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo que consta de:
Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-naftalen-1-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-metoxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[3-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-naftalen-2-ilmetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4'-fluorobifenil-4-ilmetil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-(4-benciloxibencil)-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico; e
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(2-cloro-4-fluoroben-ciloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico.
13. Un compuesto según la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo que consta de:
Hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-7-oxa-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-4-metil-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-5,5-dimetil-2-oxo-1-[4-(piridin-4-iloxi)bencil]imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-5,5-dimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-5,5-dimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-2-oxo-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-2-oxo-1,3-diazaespiro[4,4]nonano-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-fluorofenoxi)bencil]-4,5,5-trimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(4-clorofenoxi)bencil]-4,5,5-trimetil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-4-metil-1-[4-(naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-5,5-dimetil-1-[4-(naftalen-2-iloxi)bencil]-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-1-[4-(5-fluoropiridin-2-iloxi)bencil]-4-metil-2-oxo-imidazolidina-4-carboxílico;
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-(4-piridin-4-ilbencil)imidazolidina-4-carboxílico, e
hidroxiamida del ácido (4R)-2-oxo-1-(4-piridilmetil)imidazolidina-4-carboxílico.
14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula (I) o una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Un compuesto de la fórmula (I) o una de sus sales, solvatos o composiciones farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 14, respectivamente, para usar como un medicamento.
16. El uso de un compuesto de la fórmula (I), o una de sus sales, solvatos o composiciones farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 14, respectivamente, para fabricar un medicamento para tratar artritis (con inclusión de osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad de trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, inflamación, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermólisis ampollosa, osteoporosis, aflojamiento de implantes de articulaciones artificiales, arteriosclerosis (incluyendo la rotura de placas ateroscleróticas) aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico abdominal y aneurisma aórtico cerebral), fallo cardiaco congestivo, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, trauma de la cabeza, daño en la médula espinal, trastornos neuro-degenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunitarios, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, jaquecas, depresiones, neuropatías periféricas, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o del conocimiento, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de las heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento de tumores, metástasis tumoral, cicatrices corneales, escleritis, SIDA, sepsis o choque séptico.
17. El uso de un compuesto de la fórmula (I), o una de sus sales, solvatos o composiciones farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 14, respectivamente, para fabricar un medicamento para tratar un estado que puede ser tratado mediante la inhibición de metaloproteinasas de la matriz.
18. El uso de un compuesto de la fórmula (I), o una de sus sales, solvatos o composiciones farmacéuticamente aceptables, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 14, respectivamente, para fabricar un medicamento para tratar un estado que puede ser tratado mediante la inhibición de una reprolisina de mamífero.
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