ES2220004T3 - Derivados del acido ciclobutil-ariloxiarilsulfonilaminohidroxamico. - Google Patents
Derivados del acido ciclobutil-ariloxiarilsulfonilaminohidroxamico.Info
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Abstract
UN COMPUESTO DE LA FORMULA EN LA QUE Y REPRESENTA LO DEFINIDO ARRIBA Y ES UTIL EN EL TRATAMIENTO DE LA ARTRITIS O DEL CANCER Y DE OTRAS ENFERMEDADES EN LAS QUE INTERVIENE UNA INHIBICION SELECTIVA DE METALOPROTEINASA - 13 MATRICIAL.
Description
Derivados del ácido
ciclobutil-ariloxiarilsulfonilaminohidroxámico.
La presente invención hace referencia a los
derivados del ácido
ciclobutil-ariloxiarilsulfonilaminohidroxámico, y a
las composiciones farmacéuticas y procedimientos de
tratamiento.
Los compuestos de la presente invención son
inhibidores de metaloendopeptidasas de cinc, especialmente aquellas
pertenecientes a las subfamilias de las metzincinas de la matriz
metaloproteasa (también llamada MMP o matrixina) y reprolisina
(también conocida como adamilsina) (Rawlings y col., Methods in
Enzimology, 248, 183-228 (1995) y Stocker, y
col., Protein Science, 4, 823-840 (1995)).
La subfamilia de enzimas MPP, contiene
actualmente diecisiete miembros (MMP-1,
MMP-2, MMP-3,
MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17,
MMP-18, MMP-19, MMP-20). Las MMP se conocen bien por su papel en regular la renovación de las proteínas de la matriz extracelular y por lo tanto juega papeles importantes en procesos fisiológicos normales tales como la reproducción, el desarrollo y la diferenciación. Además, los MPP se expresan en muchas situaciones patológicas en las cuales se produce un recambio anormal de tejido conectivo. Por ejemplo, MMP-13, una enzima con potente actividad en la degradación del colágeno de tipo II (el colágeno principal en cartílago), ha demostrado sobreexpresarse en cartílago osteoartrítico (Mitchell, y col., J. Clin. Invest., 97, 761 (1996)). Otras MMP (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12) se sobreexpresan también en cartílago osteoartrítico y la inhibición de algunas de estas MMP se espera que ralentice o bloquee la pérdida acelerada de cartílago típica de las enfermedades de las articulaciones tales como osteoartritis o artritis reumatoide.
MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17,
MMP-18, MMP-19, MMP-20). Las MMP se conocen bien por su papel en regular la renovación de las proteínas de la matriz extracelular y por lo tanto juega papeles importantes en procesos fisiológicos normales tales como la reproducción, el desarrollo y la diferenciación. Además, los MPP se expresan en muchas situaciones patológicas en las cuales se produce un recambio anormal de tejido conectivo. Por ejemplo, MMP-13, una enzima con potente actividad en la degradación del colágeno de tipo II (el colágeno principal en cartílago), ha demostrado sobreexpresarse en cartílago osteoartrítico (Mitchell, y col., J. Clin. Invest., 97, 761 (1996)). Otras MMP (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12) se sobreexpresan también en cartílago osteoartrítico y la inhibición de algunas de estas MMP se espera que ralentice o bloquee la pérdida acelerada de cartílago típica de las enfermedades de las articulaciones tales como osteoartritis o artritis reumatoide.
Las reprolisinas de mamíferos se conocen como
ADAM (una desintegrina y metaloproteinasa) (Wolfberg, y col., J.
Cell Biol.., 131, 275-278 (1995)) y contiene un
dominio desintegrina además de un dominio similar a la
metaloproteinasa. Hasta la fecha se han identificado veintitrés
ADAM diferentes.
ADAM-17, también conocidas como
enzima convertasa del factor de necrosis de
tumores-alfa (TACE), es la ADAM mejor conocida.
ADAM-17 (TACE) es responsable de la escisión del
factor de necrosis tumoral-alfa
(TNF-\alpha, también conocido como caquectina) unido a las células. TNF-\alpha se reconoce que está implicado en muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes (W. Friers, FEBS Letters, 285, 199 (1991)). Además, se ha mostrado que TNF-\alpha es el mediador principal de la respuesta inflamatoria vista en la sepsis y el choque séptico (Spooner, y col., Clinical Immunology and Immunopathology, 62, S11 (1992)). Hay dos formas de TNF-\alpha, una proteína de membrana de tipo II de masa molecular relativa de 26.000 (26 kD) y un forma soluble de 17 kD generada a partir de las proteína unida a la célula mediante escisión proteolítica específica. La forma soluble de 17kD de TNF-\alpha se libera por la célula y se asocia con los efectos deletéreos de TNF-\alpha. Esta forma de TNF-\alpha es capaz de actuar en sitios distantes del sitio de síntesis. Así, los inhibidores de TACE impiden la formación de TNF-\alpha soluble e impiden los efectos deletéreos del factor soluble.
(TNF-\alpha, también conocido como caquectina) unido a las células. TNF-\alpha se reconoce que está implicado en muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes (W. Friers, FEBS Letters, 285, 199 (1991)). Además, se ha mostrado que TNF-\alpha es el mediador principal de la respuesta inflamatoria vista en la sepsis y el choque séptico (Spooner, y col., Clinical Immunology and Immunopathology, 62, S11 (1992)). Hay dos formas de TNF-\alpha, una proteína de membrana de tipo II de masa molecular relativa de 26.000 (26 kD) y un forma soluble de 17 kD generada a partir de las proteína unida a la célula mediante escisión proteolítica específica. La forma soluble de 17kD de TNF-\alpha se libera por la célula y se asocia con los efectos deletéreos de TNF-\alpha. Esta forma de TNF-\alpha es capaz de actuar en sitios distantes del sitio de síntesis. Así, los inhibidores de TACE impiden la formación de TNF-\alpha soluble e impiden los efectos deletéreos del factor soluble.
Los compuestos seleccionados de la invención son
potentes inhibidores de la agrecanasa, una enzima importante en la
degradación del agrecano de cartílago. El agrecano se cree que es
también una ADAM. La pérdida de agrecano de la matriz del cartílago
s un factor importante en la progresión de enfermedades de las
articulaciones tales como osteoartritis y artritis reumatoide e se
espera que la inhibición de agrecano ralentice o bloquee las
pérdida de cartílago en estas enfermedades.
Otras ADAM que han mostrado expresión en
situaciones patológicas incluyen ADAMS TS-1 (Kuno
y col., J. Biol.. Chem., 272, 556-562
(1997)), y las ADAM 10, 12 y 15 (Wu, y col., Biochem. Biophys.
Res. Comm., 235, 437-442 (1997)). El
conocimiento de la expresión, los sustratos fisiológicos y la
asociación de las ADAM en enfermedad incrementa que se aprecie el
significado pleno del papel de la inhibición de esta clase de
enzimas.
Las enfermedades en las cuales la inhibición de
MPP y/o ADAM proporcionará beneficios terapéuticos que incluyen:
artritis (incluyendo osteoartritis y artritis reumatoide),
enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn,
enfisema, síndrome de dificultad respiratoria aguda, asma,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer,
toxicidad del transplante de órganos, caquexia, reacciones
alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer (tal como
tumor canceroso sólido incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama,
cáncer de pulmón y cáncer de próstata y procesos malignos
hematopoyéticos incluyendo leucemias y linfomas), ulceración
tisular, restenosis, enfermedad periodontal, epidermolisis bullosa,
osteoporosis, pérdida de implantes artificiales de las
articulaciones, aterosclerosis (incluyendo ruptura de la placa
aterosclerótica), aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico
abdominal y aneurisma aórtico cerebral), insuficiencia cardiaca
congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral,
traumatismo en la cabeza, lesión en la médula espinal, trastornos
neurodegenerativos (agudos o crónicos), trastornos autoinmunes,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña,
depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía cerebral
amiloide, incremento nootrópico o de cognición, esclerosis lateral
amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal,
degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras,
diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis
tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsis, choque
séptico y otras enfermedades caracterizadas por la expresión de
metaloproteasas o ADAM.
Esta invención también se refiere a un
procedimiento de usar los compuestos de la invención en el
tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas en
mamíferos, especialmente humanos, y en las composiciones
farmacéuticas útiles, por lo tanto.
Se reconoce que diferentes combinaciones de MMP y
ADAM se expresan en diferentes situaciones patológicas. Así, los
inhibidores con selectividades específicas para ADAM y/o MMP
individuales se prefieren para enfermedades concretas. Por ejemplo,
la artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria caracterizada
por niveles excesivos de TNF y la pérdida de constituyentes de la
matriz de las articulaciones. En este caso, un compuesto que inhibe
TACE y agrecanasa igual que MPP tal como MMP-13
puede ser la terapia preferida. En contraste, en una enfermedad
articular menos inflamatoria tal como osteoartritis, se prefieren
los compuestos los compuestos que inhiben la degradación de las MMP
de la matriz tal como MMP-13 pero no TACE.
Los presentes inventores han descubierto también
que es posible diseñar inhibidores con actividad diferencial
metaloproteasa. Específicamente, por ejemplo, los inventores han
sido capaces de diseñar moléculas las cuales inhiben selectivamente
la metaloproteasa-13 de la matriz
(MMP-13), preferentemente sobre
MMP-1.
Los inhibidores de las metaloproteasas de la
matriz se conocen bien en la literatura. Específicamente, la
publicación PCT WO 96/33172, publicado en el 24 de octubre, 1996,
se refiere a los ácidos cíclicos arilsulfonamina hidroxámicos que
son útiles como inhibidores de MPP. La patente de los Estados
Unidos 5.672.615, la publicación PCT WO 97/20824, la publicación
PCT WO 98/08825, la publicación PCT WO 98/27069, y la publicación
PCT WO 98/34918, publicada el 13 de agosto, 1998, titulada
"Arylsulfonyl Hydroxamic Acid Derivatives" se refieren todas a
los ácidos hidroxámicos cíclicos que son útiles como inhibidores de
MMP. Las publicaciones PCT WO 96/27583 y WO 98/07697, publicadas el
7 de marzo de 1996 y el 26 de febrero de 1998, respectivamente, se
refieren a lo ácidos arilsulfonilhidroxámicos. La publicación PCT
98/03516, publicada el 29 de enero, 1998, se refiere a fosfinatos
con actividad MMP. La publicación PCT 98/34915, publicada el 13 de
agosto de 1998, titulada
"N-Hydroxy-b-Sulfonyl
Propionamide Derivatives", se refiere a propionilhidroxamidas
útiles como inhibidores de MPP. La publicación PCT WO 98/33768,
publicada el 6 de agosto de 1998, titulada
"N-Hidroxi-b-Sulfonyl
Propionamide Derivatives" se refiere a propionilhidroxamidas
útiles como inhibidores MMP. La publicación PCT WO 98/30566,
publicada el 16 de julio de 1998, titulada "Cyclic Sulfone
Derivatives", se refiere a los ácidos hidroxámicos de sulfona
cíclica como inhibidores de MMP. La solicitud de patente provisional
de los Estados Unidos 60/55208, presentada el 8 de agosto, 1997, se
refiere a ácidos biarilhidroxámicos como inhibidores de MMP. La
solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número
de serie 60/55207, presentada el 8 de agosto de 1997, titulada
"Aryloxyarylsulfonylamino Hidroxamic Acid Derivatives", se
refiere a ácidos ariloxiarilsulfonilhidroxámicos como inhibidores de
MMP. La solicitud provisional de patente de los Estados Unidos
60/62766, presentada el 24 de octubre de 1997, titulada "The use
of MMP-13 Selective Inhibitors For the Treatment of
Osteoarthritis and Other MMP Mediated Disorders", se refiere al
uso de inhibidores de MMP-13 para tratar la
inflamación y otros trastornos. La solicitud de patente provisional
de los Estados Unidos con número de serie 60/68261, presentada el
19 de diciembre, 1997, se refiere al uso de inhibidores de MMP para
tratar angiogénesis y otros trastornos. Cada una de las
publicaciones y solicitudes referidas anteriormente se incorpora por
este medio en su totalidad mediante referencia en su totalidad.
La presente invención se refiere a un compuesto
de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en la
que
R^{1} es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{6}); y
Y es un sustituyente en uno de los átomos de
carbono del anillo fenilo capaz de soportar un enlace adicional,
preferiblemente de 1 a 2 sustituyentes (más preferiblemente un
sustituyente, más preferiblemente un sustituyente en la posición 4)
en el anillo fenilo, seleccionado independientemente de hidrógeno,
fluoro, cloro, trifluorometilo,
alcóxido(C_{1}-C_{6}), trifluorometoxi,
difluorometoxi, y
alquilo(C_{1}-C_{6}).
El termino "alquilo", como se usa en el
presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye
radicales hidrocarburos monovalentes saturados que tienen restos
lineales, ramificados o cíclicos o combinaciones de los mismos.
El término "alcoxi", como se usa en el
presente documento, incluye grupos O-alquilo en los
que "alquilo" es como se ha definido anteriormente.
La presente invención se refiere también a las
sales de adición ácida aceptables de compuestos de fórmula I. Los
ácidos que se usan para preparar las sales de adición ácida
farmacéuticamente aceptables de los compuestos básicos de esta
invención mencionados son aquellos que forman sales de adición
ácida no tóxicos, es decir, sales que contienen aniones
farmacológicamente aceptables, tales como sales de hidrocloruro,
hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato,
fosfato ácido, acetato, lactato, citrato, citrato ácido, tartrato,
bitartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato,
benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato y pamoato [es decir,
1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)].
La invención se refiere también a las sales de
adición básica de fórmula I. Las bases químicas que se pueden usar
como agentes para preparar sales básicas farmacéuticamente
aceptables de aquellos compuestos de fórmula I que son ácidos en la
naturaleza son aquellas que forman sales básicas no tóxicas con
tales compuestos. Tales sales básicas no tóxicas incluyen, pero no
se limitan a, aquellas derivadas de tales cationes farmacéuticamente
aceptables tales como cationes de metales alcalinos (por ejemplo,
potasio y sodio) y cationes de metales alcalinotérreos (por ejemplo,
calcio y magnesio), amonio o sales de adición de aminas solubles en
agua tales como N-metilglucamina-(meglumina), y el
alcanolamonio inferior y otras sales básicas de aminas orgánicas
farmacéuticamente aceptables.
El compuesto de fórmula I puede tener centros
quirales y por lo tanto existir en diferentes formas enantioméricas.
Esta invención se refiere a isómeros ópticos y estereoisómeros de
los compuestos de fórmula I y mezclas de las mismos.
Esta invención también comprende composiciones
farmacéuticas que contienen, y procedimientos de tratamiento o
prevención que comprenden administrar, profármacos de los
compuestos de fórmula I. Compuestos de fórmula I que tienen grupos
libres amino, amido, hidroxi o carboxílicos, se pueden convertir en
profármacos. Los profármacos incluyen compuestos en los que un
residuo aminoácido, o una cadena polipeptídica de dos o más (por
ejemplo, dos, tres o cuatro) residuos aminoácidos los cuales están
unidos covalentemente a través de enlaces peptídicos a grupos libres
amino, hidroxi o carboxílicos de compuestos de fórmula I. Los
residuos aminoácidos incluyen los 20 aminoácidos presentes en la
naturaleza designados comúnmente por símbolos de tres letras e
incluye también 4-hidroxiprolina, hidroxilisina,
demosina, isodemosina, 3-emetilhistidina,
norvalina, beta-alanina, ácido gammaaminobutírico,
citrulina, homocisteína, homoserina, ornitina y metionina sulfona.
Los profármacos incluyen también compuestos en los cuales
carbonatos, carbamatos, amidas, y ésteres de alquilo están
covalentemente unidos a los sustituyentes anteriores de fórmula I a
través del carbono del grupo carbonilo de la cadena lateral del
profármaco. Los profármacos también incluyen compuestos de fórmula I
en los cuales el ácido hidroxámico y el resto del grupo carbonilo
forman un grupo de fórmula
en la que Y es como se define en la
fórmula I y U y V son independientemente carbonilo, metileno,
SO_{2} o SO_{3} y b es un número entero de uno a tres, en el
que cada grupo metileno se sustituye opcionalmente con
hidroxi.
Los compuestos preferidos de fórmula I incluyen
aquellos en los que Y es hidrógeno, fluoro o cloro, preferiblemente
4-fluoro o 4-cloro.
Otros compuestos preferidos de fórmula I incluyen
aquellos en los que R^{1} es hidrógeno.
Los compuestos específicos preferidos de fórmula
I incluyen los siguientes:
éster etílico del ácido
3-[[4-(4-fluorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxi-carbamoilciclobutil)amino]-propiónico,
y
ácido
3-[[4-(4-fluorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxi-carbamoilciclobutil)amino]-propiónico.
Otros compuestos de fórmula I incluyen los
siguientes:
ácido
3-[(1-hidroxicarbamoilciclobutil)-(4-fenoxibencenosulfonil)amino]propiónico,
ácido
3-[[4-(4-clorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoilciclobutil)amino]-propiónico;
éster etílico del ácido
3-[(1-hidroxicarbamoilciclobutil)-(4-fenoxibencenosulfonil)amino]propiónico;
y
éster etílico del ácido
3-[[4-(4-clorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoilciclobutil)amino]-propiónico.
La presente invención se refiere también a la
composición farmacéutica para el tratamiento de una afección
seleccionada del grupo que consta de artritis (incluyendo
osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad inflamatoria del
intestino, enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de dificultad
respiratoria aguda, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica,
enfermedad de Alzheimer, toxicidad del transplante de órganos,
caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica por
contacto, cáncer (tal como tumor canceroso sólido incluyendo cáncer
de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de próstata y
procesos malignos hematopoyéticos incluyendo leucemias y linfomas),
ulceración tisular, restenosis, enfermedad periodontal,
epidermolisis bullosa, osteoporosis, pérdida de implantes
artificiales de las articulaciones, aterosclerosis (incluyendo
ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma aórtico (incluyendo
aneurisma aórtico abdominal y aneurisma aórtico cerebral),
insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía,
isquemia cerebral, traumatismo en la cabeza, lesión en la médula
espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos o crónicos),
trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de
Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor,
angiopatía cerebral amiloide, incremento nootrópico o de cognición,
esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis
ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de
heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento
tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis,
SIDA, sepsis, choque séptico y otras enfermedades caracterizadas
por la actividad metaloprotesa en un mamífero, incluido un humano,
que comprende una cantidad de un compuesto de fórmula I o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo efectiva en tales tratamientos
y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica para la inhibición de (a) metaloprotesas de
matriz u otras metaloproteasas implicadas en la degradación de la
matriz, o (b) una reprolisina de mamífero (tal como agrecanasa o
TS-1 de ADAM, 10, 12, 15 y 17, más preferiblemente
ADAM-17) en un mamífero, incluyendo un humano, que
comprende una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención también se refiere al uso
de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I para la
preparación de un medicamento para tratar una afección seleccionada
del grupo que consiste en artritis (incluyendo osteoartritis y
artritis reumatoide), enfermedad inflamatoria del intestino,
enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de dificultad respiratoria
aguda, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de
Alzheimer, toxicidad del transplante de órganos, caquexia,
reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto,
cáncer (tal como tumor canceroso sólido incluyendo cáncer de colon,
cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de próstata y procesos
malignos hematopoyéticos incluyendo leucemias y linfomas),
ulceración tisular, restenosis, enfermedad periodontal,
epidermolisis bullosa, osteoporosis, pérdida de implantes
artificiales de las articulaciones, aterosclerosis (incluyendo
ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma aórtico (incluyendo
aneurisma aórtico abdominal y aneurisma aórtico cerebral),
insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía,
isquemia cerebral, traumatismo en la cabeza, lesión en la médula
espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos o crónicos),
trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de
Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor,
angiopatía cerebral amiloide, incremento nootrópico o de cognición,
esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis
ocular, daño corneal, degeneración macular, curación anormal de
heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento
tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis,
SIDA, sepsis, choque séptico y otras enfermedades caracterizadas
por actividad metaloproteasa y otras enfermedades caracterizadas por
actividad reprolisina en un mamífero, incluido un humano, que
comprende administrar a dicho mamífero una cantidad de un compuesto
de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
efectiva en el tratamiento de una afección tal.
La presente invención también se refiere al uso
de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I para la
preparación de un medicamento para la inhibición de (a)
metaloproteasas de matriz u otras metaloproteasas implicadas en la
degradación de la matriz, o (b), una reprolisina de mamíferos (tal
como agrecanasa o TS-1, 10, 12, 15 y 17 de ADAM,
preferiblemente ADAM-17) en un mamífero, incluido un
humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad
efectiva de un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo.
Esta invención también comprende composiciones
farmacéuticas que contienen profármacos o compuestos de la fórmula
I. Esta invención comprende también procedimientos para tratar o
prevenir trastornos que pueden tratarse o provenirse por la
inhibición de metaloproteasas de matriz o la inhibición de
reprolisina de mamíferos que comprende administrar profármacos de
compuestos de la fórmula I. Los compuestos de la fórmula I que
tienen grupos libres amino, amido, hidroxi o carboxílicos se pueden
convertir en profármacos. Los profármacos incluyen compuestos en los
que un residuo aminoácido, o una cadena polipeptídica o dos o más
(por ejemplo, dos, tres, o cuatro) residuos aminoácidos los cuales
están covalentemente unidos a través de enlaces peptídicos a grupos
libres amino, hidroxi o ácidos carboxílicos de compuestos de fórmula
I. Los residuos de aminoácido incluyen los 20 aminoácidos que se
dan en la naturaleza designados comúnmente por símbolos de tres
letras e incluyen también, 4-hidroxiprolina,
hidroxilisina, demosina, isodemosina,
3-metilhistidina, norvalina,
beta-alanina, ácido
gamma-amimobutírico, citrulina, homocisteína,
homoserina, ornitina y metionina sulfona. Los profármacos incluyen
también compuestos en los cuales carbonatos, carbamatos, amidas, y
ésteres de alquilo están covalentemente unidos a los sustituyentes
anteriores de fórmula I a través del carbono del grupo carbonilo de
la cadena lateral del profármaco.
Un especialista de habilidad normal en la técnica
apreciará que los compuestos de la invención son útiles para tratar
una colección diversa de enfermedades. Un especialista de habilidad
normal en la técnica apreciará también que cuando se usan los
compuestos de la invención en el tratamiento de una enfermedad
específica que los compuestos de la invención se pueden combinar
con varios agentes terapéuticos existentes usados para esa
enfermedad.
Para el tratamiento de artritis reumatoide, los
compuestos de la invención se pueden combinar con agentes tales
como inhibidores del TNF-\alpha tales como
anticuerpos monoclonales anti-TNF y moléculas
inmunoglobulinas para el receptor de TNF (tales como Enbrel®),
metotrexato de baja dosis, lefunimida, hidroxicloroquina,
d-penicilamina, auranofina u oro oral o
parenteral.
Los compuestos de la invención se pueden usar
también en combinación con los agentes terapéuticos existentes para
el tratamiento de la osteoartritis. Los agentes adecuados para
usarse en combinación incluyen agentes estándar no esteroídicos
antiinflamatorios (subsiguientemente en el presente documento NSAID)
tales como piroxicam, diclofenac, ácidos propiónicos tales como
naproxen, flubiproben, fenoprofen, ketoprofen e ibuprofen,
fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac,
apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales
como aspirina, inhibidores COX-2 tales como
celecoxib y rofecoxib, analgésicos y terapias intracelulares tales
como corticosteroides y ácidos hialurónicos tales como hyalgan y
sinvisco.
Los compuestos de la presente invención se
pueden usar también en combinación con agentes anticancerígenos
tales como endostatina y angiostatina o fármacos citotóxicos tales
como adriamicina, daunomicina, cis-platino,
etopósido, taxol, taxotere y alcaloides, tales como vincristina, y
antimetabolitos tales como metotrexato.
Los compuestos de la presente invención pueden
usarse también en combinación con agentes cardiovasculares tales
como bloqueantes de canales de calcio, agentes que bajan lípidos
tales como estatinas, fibratos, beta-bloqueantes,
inhibidores de ACE, antagonistas del receptor de
angiotensina-2 y inhibidores de agregación de
plaquetas.
Los compuestos de la presente invención pueden
usarse también en combinación con agentes CNS tales como
antidepresivos (tales como sertralina), fármacos antiparkinsonianos
(tales como deprenilo, L-dopa, requip, miratex,
inhibidores MAOB tales como selegina y rasagilina, inhibidores de
comP tales como Tasmar, inhibidores de A-2,
inhibidores de la recaptación de dopamina, antagonistas de NMDA,
agonistas de nicotina, agonistas de dopamina e inhibidores de la
óxido nítrico sintasa neuronal), y fármacos
anti-Alzheimer tales como Aricept, tacrina,
inhibidores de COX-2, propentofilina o
metrifonato.
Los compuestos de la presente invención se pueden
usar también en combinación con agentes de osteoporosis tales
comodroloxifeno o fosomax y agentes inmunosupresores tales como
FK-506 y rapamicina.
Los siguientes esquemas de reacción ilustran la
preparación de los compuestos de la presente invención. A menos que
se indique lo contrario, Y y R^{1} en los esquemas de reacción y
la discusión que sigue se definen como anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
1
\newpage
Esquema 1
(continuación)
El esquema 1 se refiere a la preparación de los
compuestos de la fórmula I. En referencia al esquema 1, los
compuestos de fórmula I se pararan a partir de un compuesto de
fórmula II mediante la eliminación del grupo hidroxilo protector de
amina, en el que R^{16} es bencilo. La eliminación del grupo
protector de hidroxilamina se lleva a cabo mediante hidrogenolisis
del grupo protector bencilo usando paladio catalítico en sulfato de
bario en un disolvente polar a una temperatura de aproximadamente 1
hora a aproximadamente 5 horas, preferiblemente de aproximadamente
3 horas.
El compuesto de fórmula II, en el que R^{16} es
bencilo, se prepara a partir de un compuesto de fórmula III
mediante activación del compuesto de fórmula III seguido por
reacción con bencilhidroxilamina. El compuesto de fórmula III se
activó mediante tratamiento con hexafluorofosfato de
(benzotriazol-1-iloxi)tris(metilamino)
fosfonio en presencia de una base, a temperatura ambiente, en un
disolvente polar. La reacción mencionada se presentó durante un
periodo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas,
preferiblemente durante 1 hora. El compuesto activado derivado de
la fórmula III se convirtió in situ al compuesto de fórmula
II mediante reacción con hidrocloruro de bencilhidroxamina. La
reacción con hidrocloruro de bencilhidroxamina se llevó a cabo
durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 días,
preferiblemente durante 16 horas, a una temperatura de
aproximadamente 40ºC a aproximadamente 80ºC, preferiblemente
aproximadamente 60ºC. Las bases adecuadas incluyen
N-metilmorfolina o diisopropiletilamina,
preferiblemente diisopropiletilamina. Los disolventes adecuados
incluyen N,N-dimetilformamida o
N-metilpirrolidina-2-ona,
preferiblemente N,N-dimetilformamida.
El compuesto de fórmula III se prepara a partir
de un compuesto de fórmula IV, en el que R^{16} es bencilo,
mediante eliminación del grupo protector R^{16} y reducción del
doble enlace de la cadena lateral mediante hidrogenolisis usando
paladio sobre carbono en un disolvente tal como metanol o etanol,
durante un periodo de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente
48 horas, preferiblemente 16 horas, a una temperatura de
aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC, es decir, a temperatura
ambiente.
El compuesto de arilsulfonamino de fórmulas IV,
en el que R^{16} es bencilo, se prepara a partir del
correspondiente compuesto de fórmula V, mediante reacción con un
compuesto de la fórmula HC\equivC-CO_{2}R^{1},
en la que R^{1} es alquilo en presencia de una base, tal como
carbonato de potasio, carbonato de cesio, hexametildisilazida de
potasio, hidruro de sodio, o fluoruro de tetrabutilamonio,
preferiblemente carbonato de cesio. La reacción se agitó en un
disolvente polar, tal como dimetilformamida,
N-metilpirrolidin-2-ona
o t-butanol a temperatura ambiente, durante un
periodo de tiempo entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente
48 horas, preferiblemente aproximadamente 18 horas.
El compuesto de fórmula V, en el que R^{16} es
bencilo, se preparo a partir del correspondiente compuesto de
fórmula VI, mediante reacción con un derivado reactivo funcional de
un compuesto ácido arilsulfónico de la fórmula
en presencia de una base, tal como
trietilamina, y un disolvente polar, tal como tetrahidrofurano,
1,2-dimetoxietano, dimetilformamida, dioxano, agua o
acetonitrilo, preferiblemente dimetilformamida. La mezcla de
reacción se agitó, a temperatura ambiente, durante un periodo de
tiempo entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas,
preferiblemente aproximadamente 60
minutos.
Los compuestos de la fórmula VI se pueden
preparar a partir de compuestos de fórmula VIII mediante tratamiento
con una azida metálica, tal como azida de sodio, en un disolvente
polar, tal como DMF, a temperatura ambiente seguida por la reducción
del intermediario azida de fórmula VII, así formados, mediante
hidrogenolisis sobre paladio en un disolvente alcohólico que
contiene al menos un equivalente de un ácido mineral tal como ácido
clorhídrico. El grupo R^{16} de la fórmula VI se puede convertir a
otros grupos R^{16} refluyendo los compuestos de la fórmula VI
con un exceso del alcohol en tolueno deseado R^{16}OH en
presencia de un equivalente de ácido sulfónico de
p-tolueno.
Los compuestos de fórmula VIII y IX están
comercialmente disponibles o se pueden fabricar mediante
procedimientos bien conocidos por aquellos de habilidad normal en
la técnica.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos ácidos de la invención son sales formadas con bases,
llamadas sales catiónicas, tales como las sales de metales
alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio,
calcio, magnesio, igual que las sales de amonio, trimetilamonio,
dietilamonio, y
tris-(hidroximetil)-metilamonio.
De forma similar las sales de adición ácida, tal
como de ácidos minerales, ácidos orgánicos carboxílicos y ácidos
orgánicos sulfónicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido
metanosulfónico, ácido maleico, están también posiblemente
proporcionando un grupo básico, tal como piridilo, que constituyen
parte de la estructura.
Los compuestos de la fórmula I los cuales son
básicos en la naturaleza son capaces de formar una amplia variedad
de diferentes sales con varios ácidos inorgánicos y orgánicos.
Aunque tales sales pueden ser farmacéuticamente aceptables para
administración a animales, es a menudo deseable en la práctica
aislar inicialmente un compuesto de la fórmula I de la mezcla de
reacción como una sal farmacéuticamente inaceptable y después
simplemente convertir ésta en el compuesto base libe mediante
tratamiento con un reactivo alcalino, y subsiguientemente convertir
la base libre a una sal de adición ácida farmacéuticamente
aceptable. Las sales de adición ácida de los compuestos básicos de
esta invención se preparan adecuadamente tratando el compuesto
básico con una cantidad sustancialmente equivalente del mineral o
ácido orgánico escogido en un medio disolvente acuoso o en un
disolvente orgánico adecuado tal como metanol o etanol. Tras la
evaporación cuidadosa del disolvente, se obtiene la sal sólida
deseada.
Los ácidos que se usan para preparar las sales de
adición ácida farmacéuticamente aceptables de los compuestos
básicos de la invención son aquellos que forman sales de adición
ácida no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones
farmacológicamente aceptables, tales como sales de clorhídrico,
bromhídrico, hidroyoduro, nitrato, sulfato o bisulfato, fosfato o
fosfato ácido, acetato, lactato, citrato o citrato ácido, tartrato
o bitartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato,
benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato y pamoato [es decir,
1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)].
Aquellos compuestos de fórmula I que son también
ácidos en la naturaleza, por ejemplo, donde R^{3} es hidrógeno,
son capaces de formar sales básicas con varios cationes
farmacológicamente aceptables. Ejemplos de estas sales incluyen las
sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, y,
particularmente, las sales de sodio y potasio. Estas sales se
preparan todas mediante técnicas convencionales. Las bases químicas
que se usan como reactivo para preparar las sales de base
farmacéuticamente aceptables de esta invención son aquellas que
forman sales de base no tóxicas con los compuestos ácidos de
fórmula I descritos en el presente documento. Estas sales básicas no
tóxicas incluyen aquellas derivadas de cationes farmacológicamente
aceptables tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, etc. Estas
sales pueden prepararse fácilmente tratando los compuestos ácidos
correspondientes con una disolución acuosa conteniendo los cationes
farmacológicamente aceptables, y después evaporando la disolución
resultante hasta sequedad, preferiblemente bajo presión reducida.
Alternativamente, se pueden preparar también mezclando disoluciones
en alcanoles inferiores de los compuestos ácidos y el alcóxido de
metal alcalino deseado conjuntamente, y después evaporando la
disolución resultante hasta sequedad, preferiblemente de la mismas
manera que antes. En cualquiera de los dos casos, las cantidades
estequiométricas de reactivos se emplean preferiblemente con el fin
de asegurar la completación de la reacción y las máximas
producciones de producto.
La capacidad de los compuestos de fórmula I o sus
sales farmacéuticamente aceptables (de aquí en adelante referidas
como los compuestos MMP-13 selectivos de la
presente invención) para inhibir las metaloproteasas de la matriz,
preferiblemente 2, 9, o 13, más preferiblemente
MMP-13 y, consecuentemente, demostrar su efectividad
para tratar enfermedades caracterizadas por inhibición de la
metaloproteasa de la matriz, se muestra por las siguientes pruebas
de ensayo in vitro.
La colagenasa humana recombinante se activó con
tripsina usando la siguiente razón: 10 \mug de tripsina por 100
\mug de colagenasa. La tripsina y la colagenasa se incubaron a
temperatura ambiente durante 10 minutos, después se añadió un
inhibidor de tripsina de soja en un exceso de cinco veces (50
\mug/10 \mug de tripsina).
Se fabricaron, en dimetilsulfóxido, disoluciones
de reserva de 10 mM de inhibidores y después se diluyeron usando el
siguiente esquema:
10 mM
\longrightarrow 120 \muM \longrightarrow 12 \muM
\longrightarrow 1,2 \muM \longrightarrow 0,12
\muM
Después, se añadieron veinticinco microlitros de
cada concentración por triplicado a los pocillos apropiados de una
placa de microfluorescencia de 96 pocillos. La concentración final
de inhibidor será una dilución 1:4 después de la adición de enzima
y sustrato. Los controles positivos (enzima, ningún inhibidor) se
disponen en los pocillos D1-D6 y los blancos
(ninguna enzima, ningún inhibidor) se disponen en los pocillos
D7-D12.
La colagenasa se diluye a 400 ng/ml y se añaden
entonces 25 \mul a pocillos apropiados de la placa de
microfluorescencia. La concentración final de colagenasa en el
ensayo es de 100 ng/ml.
El sustrato
(DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2})
está elaborado como una reserva de 5 Mm en dimetilsulfóxido y
después se diluyó a 20 mM en el tampón de ensayo. El ensayo se
inició mediante la adición de
50 \mul de sustrato por pocillo de la placa de microfluorescencia para dar una concentración final de 10 \muM.
50 \mul de sustrato por pocillo de la placa de microfluorescencia para dar una concentración final de 10 \muM.
Las lecturas de fluorescencia (excitación a 360
nM, emisión a 460 nm) se tomaron a tiempo 0 y entonces a intervalos
de 20 minutos. El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente con
un típico tiempo de ensayo de tres horas.
Después, se representó fluorescencia frente a
tiempo tanto para el blanco como para las muestras que contienen
colagenasa (los datos se promedian de determinaciones por
triplicado). Un punto temporal que proporciona una buena señal (el
blanco) y que está en una parte lineal de la curva (usualmente
alrededor de 120 minutos) se escoge para determinar los valores de
CI_{50}. El tiempo cero se usa como un blanco para cada compuesto
a cada concentración y estos valores se sustraen de los datos a 120
minutos. Los datos se representan como concentración del inhibidor
frente a % de control (inhibidor de fluorescencia dividido por
fluorescencia de colagenasa sola x 100). Los CI_{50} se
determinaron a partir de la concentración de inhibidor que
proporciona una señal que es el 50% del control.
Si se comunica que CI_{50} es <0,03 entonces
los inhibidores se ensayaron a las concentraciones de 0,3 \muM,
0,03 \muM, 0,03 \muM, y 0,003 \muM.
El MMP-13 recombinante humano se
activó con 2 mM de APMA (acetato p-aminofenil
mercúrico) durante 1,5 horas, a 37ºC y se diluyó a 400 mg/ml en
tampón de ensayo (50 mM de Tris, pH 7,5, 200 mM de cloruro de sodio,
5 mM de cloruro de calcio, 20 \muM de cloruro de cinc, 0,02%
brij). Se añadieron 25 microlitros de enzima diluida por pocillo en
una placa de microfluorescencia de 96 pocillos. La enzima se diluyó
entonces en una razón 1:4 en el ensayo por medio de la adición del
inhibidor y el sustrato para dar una concentración final en el
ensayo de 100 mg/ml.
Se elaboran 10 mM de disoluciones de reserva de
inhibidores en dimetilsulfóxido y después se diluyen en tampón de
ensayo como por el esquema inhibidor de dilución por inhibición de
la colagenasa humana (MMP-1): veinticinco microlitro
de cada concentración se añaden por triplicado a la placa de
microfluorescencia. Las concentraciones finales en el ensayo son 30
\muM, 3 \muM, 0,3 \muM y 0,03 \muM.
El sustrato se prepara
(DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2})
como para inhibición de la colagenasa humana (MMP-1)
y se añaden 50 ml por cada pocillo para dar una concentración final
de cada ensayo de 10 \muM.. Se toman las lecturas de
fluorescencia a tiempo 0 y cada 5 minutos durante 1 hora.
Los controles positivos constan de enzima y
sustrato sin inhibidor y el blanco consta sólo de sustrato.
Se determinaron los CI_{50} de acuerdo con la
inhibición de colagenasa humana (MMP-1). Si se
comunica que los CI_{50} son menores que 0,03 \muM, los
inhibidores se ensayaron después a las concentraciones finales de
0,3 \muM, 0,03 \muM,
0,003 \muM y 0,0003 \muM.
0,003 \muM y 0,0003 \muM.
Los compuestos de la presente invención poseen
una actividad sorprendentemente selectiva contra la
metaloproteasa-13 de la matriz (colagenasa 3) en
comparación con la metaloproteasa-1 de la matriz
(colagenasa 1). Específicamente, compuestos de la fórmula I pueden
ser 100 veces más selectivos para la
metaloproteasa-13 de la matriz (colagenasa 3) que
para la metaloproteasa-1 de la matriz (colagenasa 1)
y tiene CI_{50} de menos de 10 nM frente a la
metaloproteasa-13 de la matriz (colagenasa 3). La
tabla 1 demuestra que los compuestos de la invención poseen una
selectividad inesperada por la inhibición de
MMP-13.
La gelatinasa humana recombinante de 72 kD
(MMP-2 gelatinasa A) se activó durante
16-18 horas con acetato
p-aminofenilmercúrico (a partir de una reserva
preparada recientemente de NaOH 0,2 N) a 4ºC, balanceándola con
cuidado.
Disoluciones de reserva de 10 mM en
dimetilsulfóxido de inhibidores se diluyen en serie en un tampón de
ensayo (50 mM TRIS, pH 7,5, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 20 \muM
ZnCl_{2} y 0,02% BRIJ-35 (vol./vol.)) usando el
siguiente esquema:
10 mM \longrightarrow 120 \muM
\longrightarrow 12 \muM \longrightarrow 1,2 \muM
\longrightarrow 0,12
\muM
Se hacen diluciones adicionales tanto como sea
necesario siguiendo este mismo esquema. Un mínimo de cuatro
concentraciones inhibitorias para cada compuesto se llevan a cabo
en cada ensayo. Se añaden entonces 25 \mul de cada concentración
para triplicar los pocillos de una placa de microfluorescencia
negra de 96 pocillos con el fondo en U. Como el volumen final del
ensayo es de 100 \mul, las concentraciones finales de inhibidor
son el resultado de una dilución adicional 1:4 (es decir 30 \muM
\longrightarrow 3 \muM \longrightarrow 0,3 \muM
\longrightarrow 0,03 \muM, etc.). Se preparan también un blanco
(ninguna enzima, ningún inhibidor) y un control positivo de enzima
(con enzima, ningún inhibidor) por triplicado.
La enzima activada se diluye a 100 ng/ml en
tampón de ensayo, se añaden 25 \mul por pocillo a los pocillos
apropiados de la microplaca. La concentración final de enzima en el
ensayo es de 25 ng/ml (0,34 nM).
Una disolución de reserva de cinco mM en
dimetilsulfóxido de sustrato
(DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2})
se diluye en tampón de ensayo hasta 20 \muM. El ensayo se inició
por adición de 50 \mul de sustrato diluido produciendo una
concentraciónde ensayo final de 10 \muM de sustrato. A tiempo
cero, la lectura de fluorescencia (excitación 320; emisión 390) se
toma inmediatamente y las lecturas subsiguientes se toman cada
quince minutos a temperatura ambiente con un PerSeptive Biosystems
CytoFluor Multi-Well Plate Reader con el aumento a
90 unidades.
La media de valor de fluorescencia de la enzima y
el blanco se representó frente al tiempo. Un tiempo temprano en la
parte lineal de esta curva se eligió para las representaciones de
CI_{50}. El punto temporal cero para cada compuesto a cada
dilución se sustrajo del último punto temporal y los datos
expresados como porcentaje de control de enzimas (inhibidor de
fluorescencia dividido por fluorescencia del control enzimático
positivo x 100). Los datos se representaron como concentración de
inhibidor frente a porcentaje de control enzimático. Los CI_{50}
se definen como la concentración de inhibidor que proporciona una
señal que es el 50% del control enzimático positivo.
La estromelisina recombinante humana
(MMP-3, estromelisina-1) se activó
durante 20-22 horas con 2 mM de acetato
p-aminofenilmercúrico (a partir de una reserva
recientemente preparada de 100 mM en NaOH 0,2 N) a 37ºC.
Las disoluciones de reserva 10 mM en
dimetilsulfóxido se diluyen en serie en tampón de ensayo (50 mM
TRIS, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl_{2} y 0,02%
BRIJ-35 (vol./vol.)) usando el siguiente
esquema:
10 mM
\longrightarrow 120 \muM \longrightarrow 12 \muM
\longrightarrow 1,2 \muM \longrightarrow 0,12
\muM
Se hacen diluciones adicionales tanto como sea
necesario siguiendo este mismo esquema. Un mínimo de cuatro
concentraciones inhibitorias para cada compuesto se llevan a cabo
en cada ensayo. Se añaden entonces 25 \mul de cada concentración
para triplicar los pocillos de una placa de microfluorescencia
negra de 96 pocillos con el fondo en U. Como el volumen final del
ensayo es de 100 \mul, las concentraciones finales de inhibidor
son el resultado de una dilución adicional 1:4 (es decir 30 \muM
\longrightarrow 3 \muM \longrightarrow 0,3 \muM
\longrightarrow 0,03 \muM, etc.). Se preparan también un blanco
(ninguna enzima, ningún inhibidor) y un control positivo de enzima
(con enzima, ningún inhibidor) por triplicado.
La enzima activada se diluye a 200 ng/ml en
tampón de ensayo, se añaden 25 \mul por pocillo a los pocillos
apropiados de la microplaca. La concentración final de enzima en el
ensayo es de 50 ng/ml (0,875 nM).
Una disolución de reserva de diez mM en
dimetilsulfóxido de sustrato
(DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH_{2})
se diluye en tampón de ensayo hasta 6 \muM. El ensayo se inició
mediante adición de 50 \mul de sustrato diluido produciendo una
concentración final del ensayo de 3 \muM. A tiempo cero, la
lectura de fluorescencia (excitación 320; emisión 390) se toma
inmediatamente y las lecturas subsiguientes se toman cada quince
minutos a temperatura ambiente con un PerSeptive Biosystems
CytoFluor Multi-Well Plate Reader con el aumento a
90 unidades.
La media de valor de fluorescencia de la enzima y
el blanco se representó frente al tiempo. Un tiempo temprano en la
parte lineal de esta curva se eligió para las representaciones de
CI_{50}. El punto temporal cero para cada compuesto a cada
dilución se sustrajo del último punto temporal y los datos
expresados como porcentaje de control de enzimas (inhibidor de
fluorescencia dividido por fluorescencia del control enzimático
positivo x 100). Los datos se representaron como concentración de
inhibidor frente a porcentaje de control enzimático. Los CI_{50}
se definen como la concentración de inhibidor que proporciona una
señal que es el 50% del control enzimático positivo.
Alternativamente, la inhibición de la actividad
estromelisina se puede someter a ensayo usando
Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH_{2}
(3 \muM) bajo condiciones similares a las que se dan en la
inhibición de colagenaza humana (MMP-1).
La estromelisina humana se activó durante
20-24 horas a 37ºC con 2 mM de APMA (acetato
p-aminofenilmercúrico) y se diluye para proporcionar
una concentración final en el ensayo de 50 ng/ml. Se diluyen los
inhibidores como para la inhibición de la colagenaza humana
(MMP-1) para proporcionar concentraciones finales en
el ensayo de 30 \muM, 3 \muM, 0,3 \muM, y 0,03 \muM. Cada
concentración se hace por triplicado.
Las lecturas de fluorescencia (excitación 320;
emisión 390) se toman a tiempo cero y después a intervalos de 15
minutos durante 3 horas.
Los valores de CI_{50} se determinan según la
inhibición de la colagenasa humana (MMP-1). Si se
comunica que los CI_{50} son menores que 0,03 \muM, los
inhibidores se ensayaron después a las concentraciones finales de
0,03 \muM, 0,003 \muM y 0,0003 \muM.
Los valores de CI_{50} se determinaron de la
mima manera que para colagenasa.
La capacidad de los compuestos o las sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos para inhibir la
producción de TNF y, consecuentemente, demostrar su efectividad
para tratar enfermedades implicando la producción de TNF se muestra
por el siguiente ensayo in vitro:
Se aislaron células mononucleares humanas a
partir de sangre humana anticoagulada usando una técnica de
separación Ficoll-hypaque. (2) Las células
mononucleares se lavaron tres veces en la solución salina en
equilibrio de Nanks (HBSS) con cationes divalentes y se resuspendió
a una densidad de 2 x 10^{6} /ml en HBSS que contiene 1% de BSA.
Diferentes cuentas determinadas usando el analizador Abbott Cell Dyn
3500 indicaron que los monocitos variaron del 17 al 24% de las
células totales en estas preparaciones.
180 \mul de la suspensión celular se dividieron
en alícuotas en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar). Las
adiciones de los compuestos y LPS (concentración final de 100
ng/ml) proporcionaron un volumen final de 200 \mul. Todas las
condiciones se realizaron por triplicado. Después de una incubación
de 4 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2} humidificado, las
placas se eliminaron y centrifugaron (10 minutos a aproximadamente
250 x g) y los sobrenadantes se eliminaron y ensayaron para TNFa
usando el kit R&D ELISA.
La capacidad de los compuestos o las sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos para inhibir la
liberación celular de TNF-\alpha y,
consecuentemente, demostrar su efectividad para tratar enfermedades
que implica la desregulación de TNF-\alpha
soluble se muestra mediante el siguiente ensayo in vitro:
Un fragmento de DNA que codifica para la
secuencia señal, preprodominio, prodominio y dominio catalítico de
TACE (aminoácidos 1-473), se puede amplificar
mediante reacción en cadena de la polimerasa usando una librería de
cDNA de pulmón humano como una plantilla. El fragmento amplificado
es entonces clonado dentro del vector pFastBac. La secuencia de DNA
del inserto se confirma por ambas cadenas. Un bacmido preparado
usando pFastBac en E. coli DH10Bac se transfectó dentro de
células de insecto SF9. Las partículas virales se amplificaron
después a las fases P1, P2 y P3. Se infectó con el virus P3 se
infectó tanto en Sf9 como en las cinco células altas de insecto y
de deja crecer a 27ºC durante 48 horas. El medio se recoge y usa
para los ensayos y la purificación adicional.
Un modelo peptídico de sustrato
TNF-\alpha (LY-Leucina Alanina
Glutamina Alanina Valina Arginina Serina-Seina
Lisina(CTMR)-Arginina (LY = amarillo Lucifer;
CTMR = carboxitetrametilRodamina)) se preparó y la concentración se
estimó mediante absorbancia a 560 nm (E_{560}, 60.000
M-1CM-1) de acuerdo al
procedimiento de Geoghegan, KF, "Improved method for converting an
unmodified peptide to an energy transfer substrate for a
proteinase", Bioconjugate Chem. 7, 385-391
(1995). Este péptido comprende el sitio de escisión de
pro-TNF el cual se escindió in vivo mediante
TACE.
Un fragmento de DNA que codifica para la
secuencia señal, preprodominio, prodominio y dominio catalítico de
TACE (aminoácidos 1-473), se puede amplificar
mediante reacción en cadena de la polimerasa usando una librería de
cDNA de pulmón humano como una plantilla. El fragmento amplificado
es entonces clonado dentro del vector pFastBac. La secuencia de DNA
del inserto se confirma por ambas cadenas. Un bacmido preparado
usando pFastBac en E. coli DH10Bac se transfectó dentro de
células de insecto SF9. Las partículas virales se amplificaron
después a las fases P1, P2 y P3. Se infectó con el virus P3 se
infectó tanto en Sf9 como en las cinco células altas de insecto y
de deja crecer a 27ºC durante 48 horas. El medio se recoge y usa
para los ensayos y la purificación adicional.
La reacción, llevada a cabo en un placa de 96
pocillos (Dynatech), se comprende de 70 \mul de disolución tampón
(25 mM de Hepes-HCl, pH 7,5, más 20 uM de
ZnCl_{2}), 10 \mul de 100 \muM de sustrato fluorescente
inactivado, 10 \mul de una disolución de DMSO (5%) del compuesto
prueba, y una cantidad de enzima r-TACE la cual
causará un 50% de escisión en 60 minutos - en un volumen total de
100 \mul. La especificidad de la escisión enzimática en el enlace
amida ente alanina y valina se verificó mediante HPLC y
espectrometría de masas. Las tasas iniciales de escisión se someten
a seguimiento midiendo la velocidad de incremento en fluorescencia
a 530 nm (excitación a 409 nm) durante 30 minutos. Los experimentos
se controlan como sigue: 1) por los antecedentes de fluorescencia en
el sustrato; 2) por la fluorescencia o sustrato totalmente
escindido; 3) por inactivación de la fluorescencia o aumento de las
disoluciones que contienen el compuesto prueba.
Los datos se analizaron como sigue. Las tasas de
los compuestos no de prueba que contienen reacciones "control"
se promediaron para establecer el valor del 100%. La velocidad de
reacción en presencia del compuesto prueba se comparó a aquel en
ausencia de compuesto, y se tabuló como "porcentaje de compuesto
no de prueba". Los resultados se representaron como "% de
control" frente al logaritmo de la concentración del compuesto y
la mitad del punto máximo del valor de CI_{50} determinado.
Todos los compuestos de la invención tienen
CI_{50} de menos de 1 \muM, preferiblemente de menos de 50 nM.
Los compuestos más preferidos de la invención son al menos 100
veces menos potentes contra r-MMP-1
que en los ensayos TACE anteriormente mencionados.
Las células humanas mononucleares se aislaron a
partir de sangre humana sometida a los efectos de un anticoagulante
usando una técnica de separación Ficoll-hypaque de
una etapa. (2) Las células mononucleares se lavaron tres veces en
disolución de salina de Hank en el equilibrio (HBSS) con cationes
divalentes y se resuspendieron a una densidad de 2 x 10^{6} /ml
en HBSS que contiene 1% de BSA. Las cuentas diferenciales
determinadas usando el analizador Abbott Cell Dyn 3500 indicaron que
los monocitos variaron del 17 al 24% de las células totales en
estas preparaciones.
180 m de la suspensión de la célula se
dispusieron en alícuotas dentro de placas de 96 pocillos (Costar).
Adiciones de compuestos y LPS (100 ng/ml de concentración final)
dieron un volumen final de 200 \mul. Todas las condiciones se
realizaron por triplicado. Después de cuatro horas de incubación a
37ºC en un incubador con CO_{2} humidificado, las placas se
retiraron y centrifugaron (10 minutos a aproximadamente 250 x g) y
los sobrenadantes se eliminaron y ensayaron para detectar
TNF-\alpha usando el kit R&D ELISA.
Los condrocitos porcinos primarios del cartílago
articular se aislaron mediante digestión secuencial con tripsina y
colagenasa seguida por digestión por colagenaza durante toda una
noche y se plaquearon a 2 x 10^{5} células por pocillo dentro de
placas de 48 pocillos con 5 \muCi/ml ^{35}S (1000 Ci/mmol) de
sulfuro en placas recubiertas de colágeno de tipo I. Se permitió a
las células incorporar etiqueta dentro de la matriz de proteoglicano
(aproximadamente 1 semana) a 37ºC, bajo una atmósfera de 5% de
CO_{2}.
La noche antes de iniciar el ensayo, los
condorcitos en monocapa se lavaron dos veces en DMEM /1% PSF/G y
entonces se permitió incubar en DMEM/1% FBS fresco durante toda una
noche.
A la mañana siguiente los condrocitos se lavan en
DMEM/1% PSF/G. Al lavado final se le permitió establecerse en las
placas en el incubador mientras se realizan diluciones.
Los medios y diluciones pueden hacerse como se
describe en la tabla a continuación.
Las placas se marcan y sólo se usan los 24
pocillos interiores de la placa. Sobre una de las placas, varias
columnas se designaron como IL-1 (ningún fármaco) y
control (nada de IL-1, ningún fármaco). Estas
columnas de control se contaron periódicamente para realizar un
seguimiento de la liberación del proteoglicano de 35 S. El control y
los medios IL-1 se añadieron a los pocillos (450
ul) seguidos por el compuesto (50 ul) de este modo para iniciar el
ensayo. Las placas se incubaron a 37ºC, con una atmósfera con un 5%
de CO_{2}.
A una liberación al 40-50%
(cuando CPM de los medios IL-1 es
4-5 veces la de los medios de control) como se
evalúa mediante contaje de centelleo líquido (LSC) de las muestras
de medios, el ensayo se terminó (9-12 horas). El
medio se retiró de todos los pocillos y se situó en tubos de
centelleo. El centelleo se añadió y las cuentas radiactivas se
adquirieron (LSC). Para solubilizar las capas celulares, se
añadieron a cada pocillo 500 ul de tampón de digestión de papaína
(0,2 M Tris, pH 7,0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, y 1 mg/ml de papaína). Las
placas con disolución de digestión se incubaron a 60ºC durante una
noche. La capa celular se eliminó de las placas el día siguiente y
se situó en tubos de centelleo. Se añadió después el centelleo, y
se contaron las muestras (LSC).
Se determinó el porcentaje de cuentas liberadas
del total presente en cada pocillo. Las muestras de los triplicados
se hicieron con los antecedentes de control sustraídos de cada
pocillo. El porcentaje de inhibición del compuesto se basa en las
muestras IL-1 como inhibición del 0% (100% del
total de cuentas).
Para la administración a seres humanos para la
inhibición de la metaloprotreasa-13 de la matriz o
la producción de factor de necrosis tumoral (TNF), se puede usar una
variedad de rutas convencionales que incluye oralmente,
parenteralmente, o tópicamente. En general, el compuesto activo se
administrará oralmente o parenteralmente a dosificaciones entre
aproximadamente 0,1 y 25 mg/kg de peso corporal del sujeto a
tratarse por día, preferiblemente de aproximadamente 0,3 a
aproximadamente 5 mg/kg. Sin embargo, alguna variación en la
dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la afección del
sujeto que esté siendo tratado. La persona responsable de la
administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada
para el sujeto individual.
Los compuestos de la presente invención e pueden
administrar en una amplia variedad de diferentes formas de
dosificación, en general, los compuestos terapéuticamente efectivos
de esta invención están presentes en tales formas de dosificación a
niveles de concentración oscilando de aproximadamente 5,0% a
aproximadamente 70% en peso.
Para la administración oral, comprimidos que
contienen varios excipientes tales como celulosa microcristalina,
citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicálcico y glicina
se pueden emplear conjuntamente con varios desintegrantes tales como
almidón (y preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), ácido
algínico, y ciertos silicatos complejos, conjuntamente con agentes
de unión de granulación, tales como polivinilpirrolidona, sacarosa,
gelación y goma arábiga. Adicionalmente, los agentes lubricantes
tales como estearato de magnesio, sulfato de lauril sódico y talco
son a menudo muy útiles para los propósitos de comprimir. Las
composiciones sólidas de un tipo similar se pueden emplear también
como agentes de relleno en cápsulas de gelatina; los materiales
preferidos en esta conexión incluyen también lactosa o azúcar de
leche, del mismo modo que polietilenglicoles de alto peso
molecular. Cuando las suspensiones acuosas y/o elixires se desean
para la administración oral, el ingrediente activo se puede combinar
con varios agentes edulcorantes o aromatizantes, materiales
colorantes o tintes, y, si se desea, agentes emulsificantes y/o de
suspensión del mismo modo, conjuntamente con diluyentes tales como
agua, etanol, propilenglicol, glicerina y varias combinaciones
similares de los mismos.
Para la administración parenteral (uso
intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso) se
prepara usualmente una disolución estéril inyectable del
ingrediente activo. Se pueden emplear las disoluciones de un
compuesto terapéutico de la presente invención bien en aceite de
sésamo o bien en aceite de cacahuete o en propilenglicol acuoso.
Estas disoluciones acuosas son adecuadas para propósitos de
inyección intravenosa. Las disoluciones aceitosas son adecuadas para
propósitos de inyección intraarticular, intramuscular, y
subcutánea. La preparación de todas estas disoluciones bajo
condiciones estériles se acompleja fácilmente mediante técnicas
farmacéuticas estándar bien conocidas para aquellos expertos en la
técnica.
Para la administración ocular tópica, la
aplicación directa al ojo afectado se puede emplear en forma de una
formulación como gotas para los ojos, aerosol, geles o pomadas, o
se pueden incorporar en colágeno (tal como
poli-2-hidroxietilmetacrilato y
copolímeros del mismo), o un escudo polimérico hidrofílico. Los
materiales se puede aplicar también como una lente de contacto o un
reservorio de vía local o como una composición subconjuntival.
Para administración intraorbital una disolución
estéril inyectable del ingrediente activo se preparó usualmente. Se
pueden emplear las disoluciones de un compuesto terapéutico de la
presente invención en una disolución o suspensión acuosa (tamaño de
partícula de menos de 10 micrones). Las disoluciones acuosas
deberían ajustarse y tamponarse adecuadamente, preferiblemente a un
pH entre 5 y 8, si es necesario y el diluyente líquido volverse
primero isotónico. Pequeñas cantidades de polímeros se pueden añadir
para incrementar la viscosidad o para la liberación sostenida
(tales como polímeros celulósicos, dextrano polietilenglicol, o
ácido algínico). Estas disoluciones son adecuadas para propósitos
de inyección intraorbital. La preparación de todas estas
disoluciones bajo condiciones estériles se lleva a cabo fácilmente
mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por
aquellos expertos en la técnica. En el caso de los animales, los
compuestos se pueden administrar intraorbitalmente a niveles de
dosificación de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, ventajosamente
de 0,2 a 10 mg/kg/día dados en una dosis única o en hasta tres
dosis divididas.
Los compuestos activos de la invención se pueden
formular también en composiciones rectales tales como supositorios o
enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases convencionales
de supositorios, tales como manteca de cacao u otros
glicéridos.
Para la administración intranasal o
administración por inhalación, los compuestos activos de la
invención se administran convenientemente en forma de una
disolución o suspensión a partir de un contenedor con pulverizador
de bomba que es presionado o bombeado por el paciente o como una
presentación de pulverizador de aerosol desde un contenedor
presurizado o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado,
por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se
puede determinar proporcionando una válvula para administrar una
cantidad medida. El contenedor o nebulizador presurizado puede
contener una disolución o suspensión del compuesto activo. Cápsulas
y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para usar en un
inhalador o insuflador se puede formular conteniendo un polvo mezcla
de un compuesto de la invención y una base adecuada de polvo tal
como lactosa o almidón.
Los siguientes ejemplos ilustran la preparación
de los compuestos de la presente invención. Los puntos de fusión
están sin corregir. Los datos de RMN se notifican en partes por
millón (\delta) y se referencian a la señal de bloqueo de deuterio
del disolvente muestra (deuteriodimetilsulfóxido a menos que se
especifique lo contrario). Los reactivos comerciales se utilizaron
sin purificación adicional. TH se refiere a tetrahidrofurano. DMF
se refiere a N,N-dimetilformamida. Cromatografía se
refiere a una cromatografía en columna diseñada usando
32-63 mm de gel de sílice y ejecutada bajo
condiciones de presión de nitrógeno (cromatografía ultrarrápida).
Temperatura de la habitación o temperatura ambiente se refiere a de
20 a 25ºC. Todas las reacciones no acuosas se ejecutaron bajo una
atmósfera de nitrógeno por conveniencia y para maximizar los
rendimientos. La concentración a presión definida significa que se
usó un evaporador rotatorio.
Se añadieron a un matraz
1-bromociclobutano-1-carboxilato
(5,0 g, 25 mmol), dimetilformamida (120 ml), y azida sódica (2,43 g,
37,5 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2
días, la reacción se en éter y se lavó con agua (3 x 150 ml). La
fase orgánica se eliminó y secó sobre sulfato de magnesio. El
reactivo de secado se eliminó mediante filtración por aspiración y
el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio para dar un
líquido incoloro, 3,69 g, rendimiento 87%.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,29 (t, 3H), 2,00 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 4,22 (q,
2H); IR (puro) 2.109 cm^{-1}.
1-azidociclobutano-1-carboxilato
de etilo (15,98 g, 94 mmol) se hidrógeno sobre un 5% de paladio
sobre carbono (2 g) con ácido clorhídrico concentrado (8 ml) en
etanol (250 ml) a 40 psi a temperatura ambiente. Después de
aproximadamente 3 horas, el catalizador se eliminó por filtración
por aspiración y el disolvente se eliminó mediante evaporador
rotatorio produciendo un sólido blanco, 16,52 g, rendimiento del
97%.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,34(t, 3H), 2,15(m, 1H), 2,30(m, 1H),
2,70(m,2H), 2,80(m,2H), 4,30(q, 2H),
9,05(s a, 2H).
A un matraz se añadió
1-aminociclobutano-1-carboxilato
clorhídrico de etilo (4,97 g, 29,6 mmol), ácido
p-toluenosulfónico (6,27 g, 33 mmol), alcohol
bencílico (83 ml), y tolueno (138 ml). La reacción se sometió a
reflujo mediante evaporador rotatorio. El residuo se recogió en
éter y se situó durante toda una noche en un congelador. El sólido
blanco resultante se recogió y secó, 5,27 g, producción 93%.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,90 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,40 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 5,10 (s,
2H), 7,05 (d, 2H), 7,25 (s a, 5H), 7,70 (d, 2H), 8,50 (s a, 2H);
Espectro de Masas de Ionización Química a Presión Atmosférica: 206
(M^{+}+1).
Se recogió
1-aminociclobutano-1-carboxilato
tosilato de bencilo (27,60 g, 70 mmol) en cloruro de metileno y se
lavó con un exceso de disolución de bicarbonato de sodio saturada.
La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio. El reactivo de
sacado se eliminó por filtración por aspiración y el disolvente se
eliminó mediante evaporador rotatorio., Se añadió al residuo
cloruro de 4-(4-fluorofenoxi)fenilsulfonilo
(20,10 g, 70 mmol), trietilamino (8,48 g, 1,16 ml, 84 mmol), y
dimetilformamida (150 ml), y la reacción se agitó durante toda una
noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con éter y se
lavó con ácido clorhídrico 1N (3 x 150 ml), agua (2 x 200 ml), y
salmuera saturada (1 x 150 ml). La fase orgánica se separó y secó
sobre sulfato de magnesio. El reactivo de secado se eliminó por
filtración por aspiración y el disolvente se eliminó mediante
evaporador rotatorio para dar un sólido marrón claro, 24,45 g. Una
segunda recogida se obtuvo lavando minuciosamente el agente de
secado con cloruro de metileno produciendo después de la
evaporación 4,2 g de un sólido blanco, producción total 90%.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,95 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 5,00 (s, 2H), 6,95 (m, 2H), 7,00 (m,
2H), 7,05 (m, 2H), 7,25 (s a, 3H), 7,30 (m, 2H), 7,35 (m, 2H), 7,75
(d, 2H): Espectro de Masas de Ionización Química a Presión
Atmosférica: 456 (M^{+}+1).
A un matraz se añadió
1-[4-(4-fluorofenoxil)fenilsulfonilamino]ciclobutano-1-carboxilato
de bencilo (10,0 g, 22 mmol), t-BuOH (75 ml),
carbonato de cesio (7,16 g, 22 mmol), y propiolato de etilo (4,31
g, 44 mmol, 4,45 ml, d = 0,968). Después de agitar durante
aproximadamente 1 hora la reacción se vuelve roja oscura. Después de
agitar 5 horas a temperatura ambiente la reacción se diluyó con
tolueno y el carbonato de cesio se filtró mediante filtración en el
vacío. El filtrado se lavó con agua y salmuera y se secó sobre
sulfato de magnesio. El reactivo de secado se eliminó mediante
filtración por aspiración y el disolvente se eliminó mediante
evaporador rotatorio para dar un aceite rojo ladrillo. Esto se
cromatografió (columna de 50 mm; 15% de EtOAc: 85% hexano) para dar
un aceite amarillo, 5,12 g, rendimiento del 42%. Una segunda parte
se obtuvo recromatografiando las reacciones mezcladas produciendo
un aceite amarillo, 2,72 g, rendimiento 22% (rendimiento total
64%).
Espectro de Masas de Ionización Química a Presión
Atmosférica: 554 (M^{+}+1).
Una mezcla de cis y trans
1-{N-(2-etoxicarboniletenil)-N-[4-(4-fluoro-fenoxi)fenilsulfonil]-amino)-ciclobutano-1-carboxilato
de bencilo (11,57 g, 20,9 mmol) se hidrógeno sobre 10% de paladio
sobre carbono en etanol (500 ml) durante aproximadamente 24 horas a
temperatura ambiente a 40 psi. El catalizador se eliminó por
filtración por aspiración y el filtrado hidrogenado como se dijo
anteriormente sobre 10% de paladio en carbono (8 g) durante
aproximadamente 2 días. El catalizador se eliminó por filtración
por aspiración y el disolvente se eliminó medite evaporador
rotatorio para dar un espeso aceite almarillo, 4,48 g, rendimiento
del 46%.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,24 (t, 3H), 1,80 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 2,45 (m, 2H), 2,60 (m,
2H), 2,75 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 4,12 (q, 2H), 7,00 (d, 2H), 7,10
(m, 4H), 7,80 (d, 2H); Espectro de Masas de Ionización Química a
Presión Atmosférica: 456 (M^{+}+1): HPLXC (C18 NovaPak, 30% a 90%
de acetonitrilo/gradiente de agua) 18,6 minutos.
A un matraz se añadió ácido
1-{N-(2-etoxicarboniletil)-N-[4-(4-(4-fluorofenoxi)fenilsulfonil]-amino)ciclobutano-1-carboxílico
(4,48 g, 9,6 mmol), BOP (4,64 g, 10,5 mmol), diisopropiletilamina
(1,37 g, 10,5 mmol = 18 ml @ d = 0,742), y DMF (50 ml). La reacción
se agitó a temperatura ambiente durante tres horas aproximadamente.
A esta mezcla se añadió diisopropiletilamina (2,49 g, 19,2 mmol,
3,35 ml) y O-bencilhidroxilamina \cdot
clorhídrico (1,98 g, 12,48 mmol). Después de agitar durante toda
una noche a temperatura ambiente la reacción se recogió en éter y se
lavó con ácido clorhídrico 1 N (3 x 150 ml), agua (3 x 100 ml), y
salmuera (1 x 200 ml). La fase orgánica se seco sobre sulfato de
magnesio, se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se
cromatografió (20% de acetato de etilo: 80% hexano) para
proporcionar un aceite incoloro espeso, 4,82 g, 88% de
rendimiento.
^{1}H-RMN (CDCl_{3}) \delta
1,23 (t, 3H), 1,60 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 2,20 (m, 2H), 2,55 (m,
4H), 3,45 (m, 2H), 4,08 (q, 2H), 4,97 (s, 2H), 7,00 (d, 2H), 7,10
(m, 4H), 7,25 (m, 3H), 7,35 (m, 2H), 7,75 (d, 2H), 9,70 (s a, 1H);
Espectro de Masas de Ionización Química a Presión Atmosférica: 571
(M^{+}+1).
El
3-{1-[N-benciloxicarbamoil)ciclobutil]-[4-(4-fluorofenoxi)fenilsulfonil]amino}propionato
de etilo (4,8 g, 8,4 mmol) se hidrógeno sobre paladio al 5% en
sulfato de bario (2,5 g) en etanol/acetato de etilo (1;:4) (70 ml)
a 40 psi a temperatura ambiente durante aproximadamente 2,5 horas.
El catalizador se eliminó mediante filtración por aspiración y el
disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio para dar una
espuma blanca, 3,64 g, rendimiento del 90%.
^{1}H-RMN
(DMSO-d6) \delta 1,14 (t, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,40
(m, 4H), 2,65 (m, 2H), 3,40 (m, 2H), 4,00 (q, 2H), 7,05 (d, 2H),
7,20 (m, 2H), 7,25 (m, 2H), 7,75 (d, 2H), 8,90 (s a, 1H), 10,70 (s
a, 1H); Espectro de Masas de Ionización Química a Presión
Atmosférica: 481 (M^{+}+1).
A un matraz se añadió
3-[[4-4-fluorofenoxi)fenilsulfonil]-1-fenilsulfonil]-1-[(N-hidroxicarbamoil)-ciclobutil]amino]propionato
de etilo (3,64 g, 7,6 mmol), etanol (50 ml), hidrato hidróxido de
litio (1,59 g, 38 mmol). Después de agitar durante toda la noche a
temperatura ambiente el disolvente se eliminó mediante evaporador
rotatorio. El residuo se recogió en acetato de etilo y se lavó con
agua (2 x 200 ml) y 1N ácido clorhídrico 1N (2 x 200 ml). La fase
orgánica se eliminó y secó sobre sulfato de magnesio. El agente de
secado se eliminó mediante filtración por aspiración y el disolvente
se eliminó evaporador rotatorio para dar un sólido blanco, 3,37 g,
98% de rendimiento. Esto se recristalizó a partir de acetato de
etilo hexano para dar cristales blancos, 2,23 g, rendimiento de
65%, punto de fusión 168-169ºC.
^{1}H-RMN
(DMSO-d6) \delta 1,60 (m, 2H), 2,35 (m, 4H), 2,55
(m, 2H), 3,35 (m, 2H), 7,00 (d, 2H), 7,20 (m, 2H), 7,25 (m, 2H),
7,75 (d, 2H), 8,85 (s, 1H), 10,65 (s, 1H), 12,25 (s, 1H); Espectro
de Masas de Ionización Química a Presión Atmosférica: 453
(M^{+}+1); HPLC (C18 NovaPak, 30% al 90% de gradiente de
acetonitrilo/agua) 9,9 min.; Anal. Calcd: C, 53,09; H, 4,68: N,
6,19: Encontrado: C, 53,40: H, 4,68: N, 6,20.
Claims (12)
1. Un compuesto de la fórmula
o la sales farmacéuticamente
aceptables del mismo, en la
que
R^{1} es hidrógeno o
alquilo(C_{1}-C_{6}); y
Y es un sustituyente en cualquiera de los átomos
de carbono del anillo fenilo capaz de soportar un enlace adicional,
seleccionado independientemente de fluoro, cloro, trifluorometilo,
alcóxi(C_{1}-C_{6}), trifluorometoxi,
difluorometoxi, y
alquilo(C_{1}-C_{6}).
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que Y es hidrógeno, fluoro o cloro.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que Y es 4-fluoro o
4-cloro.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R^{1} es hidrógeno.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
3, en el que R^{1} es hidrógeno.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que
constituido por:
éster etílico del ácido
3-[[4-(4-fluorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxi-carbamoilciclobutil)amino]-propiónico,
y
ácido
3-[[4-(4-fluorofenoxi)bencenosulfonil]-(1-hidroxi-carbamoilciclobutil)amino]-propiónico.
7. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de una afección seleccionada del grupo constituido por
artritis (incluyendo osteoartritis y artritis reumatoide),
enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn,
enfisema, síndrome de dificultad respiratoria aguda, asma,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer,
toxicidad por transplante de órganos, caquexia, reacciones
alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer (tal como
tumor canceroso sólido incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama,
cáncer de pulmón y cáncer de próstata y procesos malignos
hematopoyéticos incluyendo leucemias y linfomas), ulceración
tisular, restenosis, enfermedad periodontal, epidermolisis bullosa,
osteoporosis, pérdida de implantes artificiales de las
articulaciones, aterosclerosis (incluyendo ruptura de la placa
aterosclerótica), aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico
abdominal y aneurisma aórtico cerebral), insuficiencia cardiaca
congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral,
traumatismo en la cabeza, lesión en la médula espinal, trastornos
neurodegenerativos (agudos o crónicos), trastornos autoinmunes,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña,
depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía cerebral
amiloide, incremento nootrópico o de cognición, esclerosis lateral
amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal,
degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras,
diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis
tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsis, choque
séptico y otras enfermedades caracterizadas por la actividad
metaloprotesa en un mamífero, incluido un humano, que comprende una
cantidad de un compuesto de la reivindicación 1 efectiva en tales
tratamientos y un portador farmacéuticamente aceptable.
8. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de reivindicación 1 para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de una afección seleccionada del grupo
constituido por artritis (incluyendo osteoartritis y artritis
reumatoide), enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de
Crohn, enfisema, síndrome de dificultad respiratoria aguda, asma,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer,
toxicidad por transplante de órganos, caquexia, reacciones
alérgicas, hipersensibilidad alérgica por contacto, cáncer (tal como
tumor canceroso sólido incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama,
cáncer de pulmón y cáncer de próstata y procesos malignos
hematopoyéticos incluyendo leucemias y linfomas), ulceración
tisular, restenosis, enfermedad periodontal, epidermolisis bullosa,
osteoporosis, pérdida de implantes artificiales de las
articulaciones, aterosclerosis (incluyendo ruptura de la placa
aterosclerótica), aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma aórtico
abdominal y aneurisma aórtico cerebral), insuficiencia cardiaca
congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral,
traumatismo en la cabeza, lesión en la médula espinal, trastornos
neurodegenerativos (agudos o crónicos), trastornos autoinmunes,
enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña,
depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía cerebral
amiloide, incremento nootrópico o de cognición, esclerosis lateral
amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, daño corneal,
degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras,
diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis
tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsis y choque
séptico en un mamífero, incluyendo un humano.
9. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de una afección la cual puede tratarse mediante la
inhibición de las metaloproteasas en un mamífero, incluyendo un ser
humano, comprendiendo una cantidad de un compuesto de la
reivindicación 1 efectiva en tal tratamiento y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de una afección la cual se puede tratar mediante la
inhibición de una reprolisina de mamífero en un mamífero,
incluyendo un ser humano, comprendiendo una cantidad de un compuesto
de reivindicación 1 efectiva en tal tratamiento y un portador
farmacéuticamente aceptable.
11. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de la reivindicación 1 para la preparación de un
medicamento para la inhibición de las metaloproteasas de la matriz
en un mamífero, incluyendo un ser humano.
12. El uso de una cantidad efectiva de un
compuesto de la reivindicación 1 para la preparación de un
medicamento para la inhibición de una reprolisina de mamífero en un
mamífero, incluyendo un ser humano.
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