DK175534B1 - Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til dets fremstilling, transformeret vært, fremgangsmåde til dens fremstilling, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid samt pectinlyaser - Google Patents

Description

i DK 175534 B1

Den foreliggende opfindelse vedrører rekombinant DNA-teknologi og tilvejebringer nye DNA-molekyler, som indeholder DNA-sekvenser, der koder for adskillige 5 pectinlyaser fra Aspergillus niger og/eller promotor-, signal- og terminatorsekvenser deraf. De nye DNA-molekyler er nyttige til overproduktionen af pectinlyaserne i Aspergillus og/eller konstruktionen af hybridvektorer, som udtrykker fremmede gener i filament- eller trådsvampe og i 10 andre svampe. Det er nu muligt at producere en enkelt pectinlyase, som ikke er kont amineret med andre pectinlyaser.

Selv om der inden for rekombinant DNA teknologien allerede kendes adskillige polypeptidekspressionssystemer til 15 prokaryotiske og eukaryotiske værter, er der vedvarende behov for nye systemer, som medfører fordele i forhold til de kendte systemer.

I vid udstrækning anvendes den prokaryotiske Escherichia coli-vært og den eukaryotiske gærvært, f.eks.

20 Saccharomyces cerevisiae, til hvilke der er udviklet et stort antal forskellige ekspressionshybridvektorer, for det meste plasmider. Ulemperne ved E. coli-værter er, at de ikke kan glycosylere det dannede polypeptid, og at det fremmede peptid på grund af manglende udskillelse kan 25 akkumulere i værtscellen og forhindre yderligere vækst. Gærværter er i stand til at glycosylere. I lighed med E. coli udskiller de imidlertid ikke polypeptiderne, bortset fra meget små polypeptider, til næringsmediet. I gærceller sker der kun sekretion til det periplasmatiske rum. Højere 30 eukaryotiske værter er mammalske cancerceller, som kan glycosylere og udskille til næringsmediet. Imidlertid er dyrkningen af disse celler meget langsom og dyr, og der er risiko for, at der isoleres oncogene nucleinsyrer med det ønskede peptid, som kan være vanskeligt at befri for de 35 oncogene nucleinsyrer.

I DK 175534 B1 I

I 2 I

I Som følge af behovet for andre værter er også filament- I

svampe, såsom Neurospora crassa, Aspergillus nidulans og I

Aspergillus niger, blevet undersøgt. Sådanne svampe I

5 anvendes allerede i vid udstrækning til industrielle I

formål, men inden for rekombinant ONA teknologien har de I

kun været anvendt i begrænset omfang, hovedsagelig fordi I

H de mangler et passende transformationssystem. I modsætning I

H til Saccharomyces cerevisiae indeholder filament- eller I

10 trådsvampe ikke plasmider, som kunne anvendes til I

indføringen af fremmede gener og fænotypeselektion. Det I

er imidlertid muligt at transformere filamentsvampe med I

fremmede plasmider, som indeholder et selekterbart I

markørgen. Alle de kendte vektorer til filamentsvampe I

15 replicerer ikke autonomt, som det er tilfældet med gær, I

I men integreres i svampekromosomet. Dette sker kun ved en I

meget lav frekvens. På den anden side er det en fordel, at I

I integrativ transformation bevirker, at transformanterne I

mitotisk er meget stabile, selv under ikke-selektive I

I 20 betingelser. Stabil integrering af over hundrede kopier er I

rapporteret. I

I Den første beskrevne vektor til filamentsvampe indeholdt I

I qa-2-genet fra Neurospora crassa som selekterbar markør. I

Dette gen koder for enzymet katabolsk dehydrokinase og kan I

I 25 anvendes til funktionel komplettering af aro-mutanter af I

I N. crassa [M.E. Case, M. Schweizer, S.R. Kushner og N.H. I

I Giles (1979), Procl. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263]. I

I Aro-mutanter kan ikke vokse på minimalmedium uden I

I tilsætning af en aromatisk aminosyre. Transformation af N. I

I 30 crassa med qa-2-vektoren fremkom ved integration af en I

I enkelt kopi af plasmidet i kromosomet. 30% af stabile I

I aro+-integranter bibeholdt det integrerede qa-2-gen bundet I

I til de bakterialle plasmidsekvenser [M.E.Case (1982) i I

I Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (A. I

I 35 Hollander, D. DeMoss, S. Kaplan, J. Konisky, D. Savage og I

I R.S. Wolfe, red.) side 87-100, Plenum]. Denne iagttagelse I

I gjorde det muligt at foretage cotransformation af ikke- I

3 DK 175534 B1 selektive DNA-sekvenser sammen med selektive DNA-sekvenser.

I Aspergillus nidulans, som har en kønnet formering og 5 derfor kan underkastes klassisk gen-manipulation, er der identificeret såvel negative som positive selektionssystemer. Ved at anvende enten heterologt DNA fra N. crassa eller homologt DNA er der opnået funktionel komplettering af A. nidulans pyrG-mutanter ved transfor-10 mation med plasmider, som indeholder pyrG-genet (Ballance et al., BBRC 112, 284, 1983, Tilburn et al. Gene 26, 205, 1983). I andre systemer er mutationer ved trpC- eller argB-stedet kompletteret funktionelt ved transformation med de egnede plasmider [Yelton et al. PNAS 81, 1470,

15 1984, Yelton og J. Timberlake Cell. Biochem. Suppl. 9C

173, 1985 og Johnstone et al. EMBO J. 4, 1307, 1983],

Der er endvidere udviklet et dominant positivt selektionssystem under anvendelse af amdS-genet isoleret fra A. nidulans, som gør det muligt, at A. niger transformeret I 20 dermed vokser på acetamid som eneste nitrogenkilde I (Tilburn et al., Gene 26, 205, 1983, Wernars et al., I Curr. Genet. 9, 361, 1985 og J.M. Kelly et al., EMBO J. 4, I 475, 1985).

I Sammenlignet med N. crassa eller A. nidulans er A. niger I 25 langt den vigtigste organisme. Den anvendes i vid I udstrækning ved den industrielle produktion af enzymer, I f.eks. til anvendelse i fødevareindustrien. A. niger er I forskellig fra A. nidulans med hensyn til sekretions- I kapacitet, idet den udskiller forskellige hydrolytiske I 30 enzymer, f.eks. glucoamylase, α-amylase, pectinase, I cellulase, Ø-glucanase, Ø-galactosidase, naringinase, I pentosanase, syreprotease og lignase, hvoriblandt I glucoamylase- og pectinasekomplekset er de vigtigste.

I DK 175534 B1 I 4 Η Λ. niger har ikke nogen kendt kønnet formering. Mutationer kan derfor ikke indføres via meiotiske rekombinationer.

Ved hjælp af klassiske mutations- og selektionsmetoder er 5 der imidlertid udviklet stærkt forbedrede stammer med hensyn til udskillelsen af hydrolytiske enzymer.

Blandt generne for A. niger-enzymer er kun generne for I glucoamylase (Boel et al. EMBO J. 3, 1581, 1984) og I alkohol- og aldehyddehydrogenase (WO 86/06097) sammen med I 10 deres promotor- og signalsekvenser blevet karakteriseret I og anvendt i transformationsforsøg med henholdsvis A.

nidulans og Ά. niger.

Som selektionsmarkører for A. niger har man anvendt det I heterologe amds-gen (Kelly og Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985)

I 15 og argB-genet (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985, EP

I 184.438 og WO 86/06097), som begge er opnået fra A.

I nidulans.

I A. niger er den vigtigste organisme til den industrielle

I produktion af pectinnedbrydende enzymer. Pectiner er poly- I

I 20 galacturonider med høj molekylvægt (20.000-40.000 D) I bestående af a-l,4-glycosidisk bundne D-galacturonsyre-

polymerer, og de forekommer i naturen som bestanddele af I

celler i højere planter, hvor de er bundet til cellulose-

I molekyler, og hvor de hovedsageligt findes i den primære I

I 25 cellevæg og i midtlamellen. Blandt de største kilder til I

I pectin kan nævnes citron- og appelsinskaller, som inde- I

I holder ca. 30% af dette polysaccharid. Pectinenzymer ned- I

I bryder kulhydratpolymersubstratet enten ved hydrolyse af I

I den a-l,4-glycosidiske binding (polygalacturonase) eller I

I 30 ved transeliminering af den a-4,5-umættede galacturonrest I

I fra pectinmolekylet (andre pectinlyaser). Pectinlysases I

I systematiske navn er pectintranseliminase (EC 4.2.2.10). I

I I A. niger udtrykkes proteinerne i pectinkomplekset ikke I

I konstitutivt. Under inducerende betingelser og under I

DK 175534 B1

5 I

anvendelse af pectin eller nedbrydningsprodukter deraf I

udtrykker A. niger ovennævnte enzymer, herunder PLI, når I

andre carbonkilder, såsom glucose eller saccharose, er I

5 begrænsende. I overfladekulturer har pectinenzymerne I

tendens til at forblive bundet til den ydre cellevæg. I

Stigende pectin- og Ca2+-koncentration i mediet fører til I

fuldstændig sekretion. I

Pectinaser, såsom PLI, anvendes af fødevareindustrien, I

10 hovedsagelig til klaring af frugtsaft. I

I Fra A. niger er to forskellige pectinlyaser, PLI og PLII, I

I blevet oprenset og delvis karakteriseret af F.E.A. Van I

I Houdenhoven (22). PLI indeholder fire mannoserester, I

I hvorimod PLII har to mannoserester og to glucoserester. I

I 15 Enzymerne har forskellig molekylvægt (PLI: 37,5 kD, PLII: I

I 36, kD). Aminosyresekvensen for PLI er blevet bestemt og I

I er anført i EP 88 101397.3. Denne opfindelse var baseret I

I på en partiel strukturbestemmelse af pectinlyase I (PLI), I

I som gjorde det muligt at syntetisere DNA-prober, der koder I

I 20 for relevante dele af proteinet. Ved hjælp af DNA-probeme I

I var det muligt at screene for og isolere DNA, som koder I

I for PLI, til sidst sammen med præ- og postsekvenser deraf, I

I fra et genbibliotek af A. niger. I

I Ved hybridisering af dele af PLI-genet til et genomisk I

I 25 bibliotek fra A. niger er andre PL-gener blevet påvist, I som er genstand for den foreliggende opfindelse. PLI- I strukturgenet med det N-terminale flankeringsområde op- I nået fra A. niger N756 er ved dets N-terminal identisk I med PLD-genet opnået fra A. niger N400. Følgelig er sidst- I 30 nævnte ikke omfattet af den foreliggende opfindelse. Den I omhandlede PLA synes at være en del af den tidligere ren- I sede PL-blanding, som betegnes PLII.

I I det følgende betegnes PLI også PLD, og PLI-strukturgenet I betegnes pelD.

I DK 175534 B1 I i

Opfindelsen angår et rekombinant DNA-molekyle, som er ejen- I

dommeligt ved, at det indeholder en DNA-sekvens, som koder I

I for pectinlyase pelA med den i fig. 10 viste aminosyrese- I

I kvens, pectinlyase pelB med den i fig. 11 viste aminosyre- I

I 5 sekvens, pectinlyase pelC, der kan fås ved ekspression af I

I pelC indeholdt i pGW850 som vist i fig. 3, pélE, der kan I

I fås ved ekspression af pelE indeholdt i pGW880 som vist i I

I fig. 5 {DSM 4392), eller pelF, der kan fås ved ekspression I

I af pelF indeholdt i pGW860 som vist i fig. 6 {DSM 4391) I

I 10 eller et derivat deraf, hvori et derivat betyder et større I

I derivat, herunder flankeringssekvenser, fragmenter af DNA- I

sekvensen eller DNA-sekvenser, som er degenererede i over- I

I ensstemmelse med den genetiske kode, en fremgangsmåde til I

I fremstilling af det rekombinante DNA-molekyle, som er ejen- I

I 15 dommelig ved, at man dyrker en vært transformeret med et I

I DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens, som koder for I

I pectinlyase PLA-, PLB-, PLC-, PLE- eller PLF-ekspressions- I

I systemet eller et derivat deraf og isolerer det ønskede I

I rekombinante DNA-molekyle eller et derivat deraf eller frem- I

I 20 stiller det ved in vitro-syntese, en transformeret vært, I

I som er ejendommelig ved, at den indeholder et rekombinant I

I DNA-molekyle ifølge opfindelsen, en fremgangsmåde til frem- I

I stilling af den transformerede vært, som er ejendommelig I

I ved, at man under transformationsbetingelser behandler en I

I 25 vært med et rekombinante DNA-molekyle ifølge opfindelsen, I

eventuelt sammen med-et selektionsmarkørgen, og selekterer I

transformanterne, en fremgangsmåde til fremstilling af et I

polypeptid, som er ejendommelig ved, at en hybridvektor I

ifølge opfindelsen udtrykkes i en egnet vært, samt pectin- I

30 lyaser, som er ejendommelige ved, at de kan fås ved trans- I

formation af en vært, der ikke er i stand til at udtrykke I

nogen pectinlyase, med et rekombinant DNA-molekyle ifølge I

opfindelsen og isolering af lyaserne. I 1

De nye pectinlyaseekspressionssystemer indeholder DNA- I

sekvenser, der koder for promotorerne, signalsekvenserne, I

strukturgenerne og terminatorerne i de nye pectinlyase- I

gener. De nye pectinlyaser betegnes PLA, PLB, PLC, PLE og I

PLF. I

DK 175534 B1 I

7 I

Nærmere betegnet angår den foreliggende opfindelse kon- I

struktionen af hybridvektorer indeholdende DNA-sekvenser, I

som koder for promotorerne for PLA, PLB, PLC, PLE og PLF, I

eventuelt for signalsekvensen for disse proteiner og I

5 eventuelt for terminatorerne derfor. Disse hybridvektorer I

anvendes til inkorporeringen af gener, der koder for spe- I

cifikke proteiner, og til transformationen af trådsvampe, I

såsom Aspergillus, Penicillium og Cephalosporium. Co- I

transformationer af A. niger med to forskellige plasmider I

10 kan gennemføres, idet ét af plasmiderne vælges blandt de I

nye hybridvektorer ifølge opfindelsen, og det andet er et I

særligt konstrueret selektionsplasmid, som arbejder i I

I forbindelse med en muteret stamme af en filamentsvamp. I

I 15 Opfindelsen angår tillige overproduktionen af de nye I

I pectinlyaser i Aspergillus-arter samt produktionen af de I

I enkelte PL'er, som ikke er kontaminerede med de andre I

I PL'er, eller af forudbestemte kunstige blandinger deraf. I

I 20 Desuden angår opfindelsen produktionen af et hvilket som I

I helst protein, hvis strukturgen kan udtrykkes i nærværelse

I eller under kontrol af de omhandlede rekombinaht PL

I DNA'er.

I 25 Opfindelsen forklares nærmere i den efterfølgende detal- I jerede beskrivelse.

I Rekombinant DNA molekylerne I 30 Nærmere betegnet angår opfindelsen et rekombinant DNA- I molekyle indeholdende en DNA-sekvens, som koder for I ekspressionssystemerne for pectinlyaserne PLA, PLB, PLC, I PLE eller PLF, eller et derivat deraf.

I 35 Ved udtrykket "ekspressionssystem" skal forstås en I DNA-sekvens, som kan udtrykke et polypeptid, og som I indeholder promotoren, signalsekvensen, strukturgenet og I terminatoren.

I DK 175534 B1

I 8 I

Udtrykket "derivat" anvendt i forbindelse med de nye DNA- I

I sekvenser omfatter større derivater med flankeringsse- I

I kvenser, fragmenter af DNA-sekvensen, mutanter, især I

naturligt forekommende mutanter, og DNA-sekvenser, som er I

5 degenererede i overensstemmelse med den genetiske kode. I

I Større derivater af de nye rekombinante DNA-molekyler er I

I sådanne, der kan udskæres fra A. niger-genomet, og som I

indeholder DNA-sekvenserne vist i fig. 1-3, 5 og 6 på I

I 10 tegningen, og som kan findes i et genomisk bibliotek for I

H A. niger N400 opnået ved opdeling af nucleinsyrerne, I

behandling af fragmenterne med et passende restriktions- I

I enzym, f.eks. EcoRl, BamHI eller Hindlll, ligering til en I

egnet vektor, f.eks. λ-fagen og plasmidet pBR322, kloning, I

I 15 f.eks. i E. coli, og udskæring igen med det samme I

restriktionsenzym. Sådanne derivater er f.eks. inserterne I

I af plasmiderne pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 og I

I pGW880 vist på tegningen i fig. 1, 2, 3, 4, 6 og 5. I

2 0 Fragmenter af DNA-sekvensen med formlen I (fig. 10) er I

I sådanne, som findes mellem to restriktionssteder i disse I

plasmider, og som bevarer promotor-, signal-, struktur- I

eller terminatorfunktionerne. I

I 25 Foretrukne fragmenter er fragmenter, som indeholder I

promotorsekvensen, signalsekvensen, strukturgenet for en I

ny PL eller terminatorsekvensen eller en hvilken som helst I

kombination deraf. I

30 Fragmenterne af DNA-sekvensen kan indeholde linkere, som I

bevirker binding til andre DNA-molekyler med godt I

resultat. I

PL-promotorsekvensen findes i DNA-området inden struk- I

35 turgenet og omfatter op til ca. 2000, fortrinsvis op til I

ca. 1000-1400 nucleotider. I pGW820 er promotoren anbragt I

på sekvensen mellem Sall (1240) restriktionsstedet og PstI I

(2420) restriktionsstedet. For promotorsekvensen er I

9 I

DK 175534 B1 I

TATAA-boksene vigtige som RNA-polymerase-genkendelses- I

stederne. På pelA findes TATAA-boksen i position 1221 I

(fig. 10), på pelB i position 951 (fig. 11) og på pelC i I

position 1261 (fig. 12). De korte promotorer fra omkring I

5 TATAA-boksene op til starten for signalsekvenserne har I

I særlig interesse for den ikke-inducerede ekspression af I

I polypeptider. Hvis der kræves pectininduceret ekspression, I

I er sekvenserne før TATAA-boksene nødvendige til regulering I

I af promotorens styrke. Egnede linkere kan være bundet til I

I 10 disse fragmenter. I

I Promotoren for PLI fra A. niger er inducerbar, dvs. I

I ekspressionen af strukturgenet bundet dertil, f.eks. I

I strukturgenet, som koder for en PL eller et hvilket som I

I 15 helst fremmedgen, induceres ved tilsætning af pectin eller I

I pectinnedbrydningsprodukter til mediet. I fravær af pectin I

I og i nærværelse af en tilstrækkelig mængde glucose virker I

I promotoren ikke. Hvis de foranliggende regulatoriske I

I sekvenser mangler, bliver promotoren konstitutiv eller I

I 20 bestemmende. I

I DNA'et, som koder for signalsekvensen, rækker fra enden af I

I promotoren og til begyndelsen af sekvensen, som koder for I

I det modne protein. I PLA og PLB indeholder sigalsekvensen I

I 2 5 ca. 20 aminosyrer., i pelC ca. 18 aminosyrer. Det tilsva- I rende kodende område går i pelA fra ATG-kodonet i position I 1361 ned til PstI-spaltningsstedet ved position 1420, i

I pelB fra position 1134 til mindst position 1119, og i pelC

I fra position 1368 til position 1422.

I 30 I Det fremgår af formlerne I, II og III, at strukturgenerne I for PLA, PLB og PLC indeholder flere introns. Struktur- I generne kan også indeholde egnede linkere.

I 35 Terminatorerne starter med stop-kodonerne, f.eks. TAA, og I kan gå op til et af restriktionsstederne i disse I sekvenser. Terminatorfragmentet indeholder mindst 300 bp I og kan indeholde egnede linkere.

I DK 175534 B1

I 10 I

Egnede linkere til ovennævnte fragmenter har en DNA- I

I sekvens, som passer til restriktionsstedet i det DNA, I

I hvortil fragmentet skal bindes. De kan indeholde et I

forudbestemt restriktionssted. I

I 5 I

I Fragmenter af DNA-sekvensen ifølge opfindelsen er endvi- I

I dere sådanne, som er sammensat af mindre fragmenter, I

I f.eks. sådanne, som indeholder promotoren, promotor- og I

signal- eller struktursekvensen, signal- og struktur I

10 sekvensen eller strukturgenet uden introns og lignende. I

I Mutanter af DNA-sekvensen ifølge opfindelsen er f.eks. I

naturligt forekommende mutanter. Opfindelsen omfatter også I

naturlige eller syntetiske mutanter af signalsekvensen med I

I en lignende eller identisk hydrofobicitetprofil, f.eks. I

I hvori kodonerne for de polære aminosyrer lysin (Κδ+), I

I tyrosin (Y5-) og arginin (Ri + ) er ombyttet med kodons for I

I andre aminosyrer med lignende ladninger, og de hydrofobe I

aminosyrer alanin (A), leucin (L) og threonin (T) er om- I

20 byttet med kodons for andre hydrofobe aminosyrer. Eksem- I

I pelvis kan kodonet for det positivt ladede lysin være I

I ombyttet med et kodon for arginin og omvendt, kodonet for I

I det negativt ladede tyrosin med et kodon for glutamat I

I eller aspartat og/eller kodonet for den ikke-polære, I

I 25 hydrofobe alanin med et vilkårligt af kodonerne for I

I threonin, prolin, valin, isoleucin, leucin, methionin I

eller phenylalanin, og lignende. Andre mutanter er I

I "stille" mutanter, hvori et eller nogle få andre I

nucleotider, f.eks. op til ca. 30, er ombyttet med en I

I 30 eller flere andre nucleotider, hvor de nye kodons koder I

I for den eller de samme aminosyrer. I

I DNA-sekvenser ifølge opfindelsen, som er degenererede, er I

I lige som stille mutanter sådanne, som er degenereret med I

I 35 hensyn til den genetiske kode, idet et ubegrænset antal I

I nucleotider er ombyttet med andre nucleotider uden ændring I

I af den aminosyresekvens, som de koder for. Sådanne I

I degenererede DNA-sekvenser kan være nyttige på grund af I

I deres forskellige restriktionssteder. I

DK 175534 B1 11

Rekombinant DNA-molekyler indeholdende en DNA-sekvens ifølge opfindelsen eller et derivat deraf er især rekom-binante vektorer, der også kaldes hybridvektorer, som indeholder sådanne DNA-sekvenser som inserter. De er 5 egnede til kloning i værter, såsom bakterier, svampe eller dyreceller. Sådanne hybridvektorer er afledt af en vilkårlig vektor, som kan anvendes ved rekombinant DNA-tek-nologi, f.eks. af fager, cosmider, plasmider eller kromosomalt DNA, såsom derivater af fag-X, f.eks. NM 989, 10 eller af fag M13, f.eks. M13mp8 fag-DNA (ref. 15) lineariseret ved spaltning med BamHI, bakteriepiasmider, f.eks. pBR322, pUN121 og pUC18, eller gærplasmider, f.eks. gær-2/t-plasmid, eller endvidere kromosomal-DNA, afledt f.eks. af Aspergillus, f.eks. Aspergillus niger, f.eks. de 15 i EP 184.438 omtalte, eller defekte fager eller defekte plasmider i nærværelse af en hjælperfag eller et hjæl-perplasmid, som tillader replikation af de defekte fager eller plasmider, f.eks. M13(+)KS-vektor i nærværelse af f.eks. M13K07-hjælperfag.

20 I En hybridvektor ifølge opfindelsen indeholder foruden DNA- I sekvenserne ifølge opfindelsen eller et derivat deraf et I replikationssted og eventuelt, afhængigt af typen af DΝΑΙ derivatet, en ekspressionskontrolsekvens, såsom en for- I 25 stærkersekvens, et opstrøms-aktiveringssted, en promotor- I og signalsekvens og/eller et strukturgen, som er for- I skelligt fra de tilsvarende foreliggende A. niger afledte I sekvenser. En sådan forstærkersekvens kan være afledt af I det ekstrakromosomale ribosomale DNA fra Physarium I 30 polycephalum (PCT/EP 8500278), eller den kan være op- I strøms-aktiveringsstedet fra sur phosphatase PH05-genet I (EP-patentansøgning nr. 86.111.820.6) eller PH05-, trp-, I PH05-GAPDH-hybriden (EP-patentansøgning nr. 86 111.820.6) I eller lignende promotorer.

I 35 I Strukturgener ligeret til de omhandlede promotor-, signal- I og/eller terminatorsekvenser er foruden dem, som koder I for pectinlyaser PLA, PLB, PLC, PLE og PLF med eller uden I DK 175534 B1 I 12

introns, også homologe med andre pectinlyasegener, f.eks. I

I PLD- (eller PLI)-genet, eller andre Aspergillus-gener og I

heterologe strukturgener, som stammer fra vira, prokaryo- I

I tiske celler eller eukariotiske celler, og som kan være I

I 5 afledt af genomisk DNA eller fra cDNA fremstillet via · I

I mRNA-vejen eller kan fremstilles syntetisk ad kemisk vej, I

koder for mange forskellige nyttige polypeptider, herunder I

I glcosylerede polypeptider, især som stammer fra højere I

I eukaryotiske organismer, især pattedyr, såsom dyr eller I

I 10 især mennesker, såsom enzymer, der eksempelvis kan I

I anvendes til fremstillingen af næringsmidler og til I

gennemførelsen af enzymatiske reaktioner i kemien, eller I

I polypeptider, som er nyttige og værdifulde til behandling I

I af sygdomme hos mennesker og dyr eller til forebyggelse I

I 15 deraf, f.eks. hormoner, polypeptider med immunmodulerende I

og antivirale egenskaber og antitumoregenskaber, anti- I

stoffer, virusantigener, vacciner, koaguleringsfaktorer, I

fødevarer og lignende. I

20 Eksempler på sådanne heterologe strukturgener er f.eks. I

I sådanne, der koder for hormoner, såsom secretin, thymosin, I

relaxin, calcitonin, det luteiniserende hormon, det I

I parathyroids hormon, adrenocorticotropin, melanocyt- I

I stimulerende hormon, Ø-lipotropin, urogastron eller I

I 25 insulin, vækstfaktorer, såsom epidermal vækstfaktor, I

I insulinlignende vækstfaktor (IGF), f.eks. IGF-I og IGF-II, I

I mastcellevækstfaktor, nervevækstfaktor, glia-afledt I

I nervecellevækstfaktor eller transformerende vækstfaktor I

(TGF), såsom TGF-Ø, væksthormoner, såsom humane eller |

I 30 bovine væksthormoner, interleukin, såsom interleukin-1 I

I eller -2, human makrofagmigreringsinhiberingsfaktor (MIF), I

I interferoner, såsom human α-interferon, f.eks. interferon- I

I αΑ, aB, aD eller aF, β-interferon, 7-interferon eller et I

I hybridinterferon, f.eks. et αΑ-, aD- eller et aB-aD- I

I 35 hybridinterferon, især hybridinterferonet BDBB, protei- I

I naseinhibitorer, såsom aj-antitrypsin, SLPI og lignende, I

I hepatitisvirusantigener, såsom hepatitis-B-virusoverflade- I

I eller -kerneantigen eller hepatitis-A-virusantigen eller I

13 DK 175534 B1 hepatitis-nonA-nonB-antigen, plasminogenaktivatorer, såsom vævsplasminogenaktivator eller urokinase, tumornecrosis-faktor, somatostatin, renin, /3-endorphin, immunglobu-liner, såsom de lette og/eller tunge kæder af immunglo-5 bulin D, E eller G, eller human-mus-hybridimmunglobu-liner, immunglobulinbindingsfaktorer, såsom immunglo-bulin E-bindingsfaktor, calcitonin, humant calcitonin-beslægtet peptid, blodkoaguleringsfaktorer, såsom faktor IX eller faktor Ville, erythropoietin, eglin, såsom eglin 10 C, hirudin, desulfatohirudin, såsom desulfatohirudinva-riant HV1, HV2 eller PA, human superoxiddismutase, viral thymidinkinase, Ø-lactamase og glucoseisomerase. Der foretrækkes gener, som koder for et humant a-interferon eller hybridinterferon, human vævspiaminogenaktivater (t-PA), 15 hepatitis B-virus-overfladeantigen (HBVsAg), insulinlignende vævsfaktor I og II, eglin C og desulfatohirudin, f.eks. variant HV1. I hybridvektorerne ifølge opfindelsen er den omhandlede promotor- og/eller signalsekvens opera-belt bundet til polypeptidkodningsområdet for at sikre 20 effektiv udtrykkelse af polypeptidet.

DNA-molekylerne ifølge opfindelsen kan indeholde selektive markører afhængigt af den vært, som skal transformeres, selekteres og klones. Der kan anvendes et hvilket som 25 helst markørgen, som letter selekteringen af transfor-manter som følge af den fænotypiske ekspression af markøren. Egnede markører er især sådanne, som udtrykker antibiotisk resistens, f.eks. over for tetracyclin eller ampicillin, eller i tilfælde af auxotrofe gærmutanter, 30 gener, som kompletterer værtslæsioner. Tilsvarende gener tilvejebringer eksempelvis resistens mod antibiotikumet cycloheximid eller tilvejebringer prototrofi i en auxotrof gærmutant, f.eks. ura3-, leu2-, his3- eller trpl-genet.

Som markører kan der også anvendes strukturgener, som er 35 forbundet med et autonomt kopierende segment, forudsat at værten, som skal transformeres, er auxotrof for produktet udtrykt af markøren.

I DK 175534 B1 I

I 14 I

I Særlig vigtige er markørgener, som kompletterer A. niger- I

I værtslæsioner, såsom argB-genet, der koder for ornithin- I

I carbamoyltransferase, f.eks. afledt af A. niger eller A. I

I nidulans (EP 184.438), eller A. nidulans-DNA-fragmenter, I

5 som er homologe med N. crassa pyr4-genet (26). I

I Foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfin- I

delse er hybridvektorer, hvori strukturgenet, især det I

heterologe strukturgen, er operativt bundet til promotor- I

I 10 og signalsekvenserne ifølge opfindelsen. Sådanne fore- I

I trukne hybridvektorer er f.eks. pUC19/pelA-IFN AM119. En I

I anden foretrukket hybridvektor er f.eks. M13(+)KS/pelA-IFN I

I AMI19. I

I 15 i en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen er I

I strukturgenet, især det heterologe strukturgen, operativt I

I bundet direkte til promotorsekvenserne ifølge opfindel- I

I sen. Sådanne foretrukne hybridvektorer er f.eks. I

I Ml3(+)KS/pelAAss-IFN AM119. I

I 20 I

I DNA-molekylerne ifølge opfindelsen og derivaterne deraf, I

I herunder fragmenter, kan anvendes til screening af DNA- I

I genbanker eller mRNA for andre lignende DNA'er eller I

I mRNA'er.

I 25 I

I Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant DNA moleky- I

I lerne I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling I

I 30 af et rekombinant DNA-molekyle, som koder for et pectin- I

I lyase PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF ekspressionssystem I

I eller et derivat deraf, ved hvilken en vært transformeret I

I med et DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens, som koder I

I for pectinlyaseekspressionssystemet, eller et derivat I

I 35 deraf dyrkes, og det ønskede rekombinant DNA-molekyle I

I eller derivatet deraf isoleres, eller det fremstilles ved I

I en in vitro-syntese. I

DK 175534 B1 15

Dyrkningen af værterne gennemføres i et konventionelt næringsmedium, som kan være tilsat eller mangle kemiske forbindelser, der muliggør negativ eller positiv selektion af transformanterne, dvs. sådanne værter, som indeholder 5 det ønskede DNA-molekyle sammen med en selektionsmarkør, fra non-transformanterne, dvs. sådanne værter, som mangler det ønskede DNA-molekyle.

Der kan anvendes en hvilken som helst transformerbar vært, 10 som er nyttig til denne teknik, f.eks. bakterier, såsom E. coli, svampe, såsom Saccharomyces cerevisiae, eller især filament- eller trådsvampe, såsom Aspergillus, f.eks. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori og især A. niger. En foretrukket vært er A. niger An8, som er en ny 15 mutant, der mangler pyrA-genet, hvilket beskrives nærmere i det følgende. Transformation af værterne gennemføres under anvendelse af konventionelle fremgangsmåder.

DNA-sekvensen, som koder for PL-ekspressionssystemet, 20 opnås fra en filamentsvamp, som indeholder et sådant system, især fra et genomisk bibliotek deraf eller endvidere via mRNA'et.

I det følgende beskrives fremstillingen af de omhandlede 25 PL-ekspressionssystemer mere detaljeret.

Et genomisk bibliotek kan eksempelvis fremstilles ved partiel spaltning af genomisk DNA fra en A. niger-stamme, f.eks. N756 eller N400, med f.eks. Sau3AI eller Mbol, og 30 kloning af DNA-fragmenteme med høj molekylvægt i en egnet værtsvektor, f.eks. E. coli-plasmid pUNl2l, eller en λ-vektor, f.eks. EMBL4.

En vilkårlig anden A. nigerstamme, som producerer de 135 ønskede PL’er, kan tjene som kilde for det genomiske bibliotek, og ligeledes kan andre egnede vektorer anvendes som recipient for fragmenterne.

I DK 175534 B1 I

I 16 I

I For at opnå et godt resultat ved screeningen af det I

I genomiske bibliotek for DNA-sekvenser, som koder for. I

I PL'er, er det nødvendigt med en hybridiserende DNA-probe. I

I 5 Denne kan være en syntetisk DNA-probe, hvis sekvensen af I

I den ønskede PL er kendt, eller den kan være fra et kendt I

I PL-gen eller dele deraf. Denne første metode anvendes til I

I påvisning af PLI-gener som beskrevet i EP 88.101.397.3. I

I Den anden metode anvendes ved den foreliggende opfindelse. I

10 Da den totale DNA-sekvens i PLI-genet er blevet tilgænge- I

lig, kan DNA-prober, som enten indeholder hele genet eller I

I en vilkårlig del deraf med mindst ca. 14 bp, nu anvendes I

I til screening, hvilket også indbefatter screeningen for I

I mRNA, som koder for PL-systemet. I

15 Til anvendelse ved screening mærkes DNA-proberne radio- I

I aktivt i 5’-enden ved hjælp af kendte fremgangsmåder under I

I avendelse af γ23ρ-ΑΤΡ og T4-kinase. Værtsmikroorganismer, I

I som bærer nucleinsyre ifølge opfindelsen som en insert, I

I identificeres ved hybridisering med den mærkéde DNA-probe I

I 20 på filterkopier af genbiblioteket. I

I Kloner, som viser et hybridiseringsrespons på en eller I

I flere DNA-prober, isoleres og forstærkes. I

I De anvendte hybridiseringsbetingelser kan være mere eller I

I mindre strenge, f.eks. ved simpelthen at vælge forskellige I

I 25 temperaturer, og i kombination med anvendelsen af forskel- I

I lige DNA-prober afledt af PLI (eller PLD)-genet, f.eks. I

I ved at måle de forskellige hybridiseringsresponser på det I

I komplette 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragment, 649 bp BamH/Xhol- I

I fragmentet (N-terminalfragmentet) og 244 bp Xhol/Pstl- I

I 30 fragmentet (C-terminalfragmentet) fra pCG3Bll eller pGW840 I

I (fig. 4), kan klonerne opdeles i forskellige klasser I

I baseret på deres homologigrad (tabel II eller IV). Til I

I sidst identificeres fem X-vektorer (X-PL113, X-PL122, I

I X-PL109, X-PL102 og X-PL116), som begrænses, og subkloner I

I 35 af deres pel-gener fremstillet i pBR322 fører til plas- I

DK 175534 B1 17 mider pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 og pGW880 (fig. 1-3, 5 og 6). De fem gener af disse kloner kaldes henholdsvis pelA, pelB, pelC, pelE og pelF.

5 Generne kan sekvenseres. De fuldstændige sekvenser for pelA, pelB og pelC er repræsenteret ved formlerne I, Il og III (fig. 10, 11 og 12).

En undersøgelse ved hjælp af computer for consensus-sekvenser af exon/intron-splejsningssamlinger samt for 10 interne intron-sekvenser (E. Boel et al. (24) og S.M.

Mount (25)) fører til det postulat, at der lige som i pelD findes fire introns i pelA og pelB (fig. 10 og 11), og at der findes tre introns i pelC (fig. 12).

Plasmiderne pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 og pGW880 15 anvendes til fremstilling af andre rekombinant DNA-molekyler ifølge opfindelsen. Disse andre DNA-molekyler fremstilles på konventionel måde ved at anvende konventionelle restriktionsenzymer, linkere, ligerings-, forstærknings- og isoleringsprocesser. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Eksempelvis begrænses plasmidet pGW820 med Hindlll. 3,9 2 kbp Hindlll-fragmentet underklones i Hindlll-stedet i 3 pBR322. 3,3 kbp BamHl-Hindlll-fragmentet af det dannede 4 plasmid pGW822 indeholdende pelA-genet klones i BamHI- og 5

HinduI-stedet i vektoren pUC19, hvorved der fås en 6

vektor, som betegnes pUC19/pelA. Strukturgenet i pelA

7 udskæres ved spaltning med Sall og Pstl. I det tilbage 8 blevne fragment, som indeholder pelA promotor-, signal- og 9 terminator-sekvenserne, ligeres mellem signal- og 10 terminatorsekvensen et gen, som koder for interferon- 11 hybridet BDBB, ved hjælp af en egnet linker. Det opnåede plasmid betegnes pUC19/pelA-IFN AM119 (fig. 11) og indeholder promotor- og signalsekvensen fra pelA, IFN BDBB-genet og pelA-terminatoren bundet til HindiII-BamHI-fragmentet af pUC19. Dette plasmid cotransformeres med

I DK 175534 B1 I

I 18 I

I pCG59D7 i den uridinauxotrofe A. niger-mutant An8 (DSM I I 3917). Transformanter selekteres i minimalmedium, som I I indeholder arginin og Bacto-Agar og analyseres for I I 5 interferonekspression. I

I Ved en anden udførelsesform for opfindelsen kan signal- I I sekvensen i pelA slettes. Det opnåede plasmid betegnes I I M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 og indeholder promotorsekvensen I I af pelA, I FN BDBB-genet og pelA-términatoren bundet til I I 10 Hindlll-BamHI-fragmentet af Bluescript M13(+)KS-vektoren. I I Dette plasmid cotransformeres med pCG59D7 i den uridin- I I auxotrofe A. niger-mutant An8 (DSM 3917). Transformanter I I selekteres i minimalmedium, som indeholder arginin og I I Bacto-Agar, og analyseres for interferonekspression. I

I 15 Mutanter, som indeholder nye restriktionssteder, kan I I fremstilles f.eks. in vitro ved steddirigeret mutagenese, I I i overensstemmelse med konventionelle fremgangsmåder [se I I oversigtsartiklen af M.J. Zoller og M. Smith, Methods I I Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, I I 20 Science 229, 1193 (1985) eller K. Norris et al., Nucl. I I Acids. Res. 11, 5103 (1983)]. I

I Til opnåelse af højere ekspressionsrater kan en hvilken I I som helst eukaryotisk terminatorsekvens ligeres til enden I I af strukturgenet. I

I 25 Bakterier transformeres på konventionel måde, og transfor- I I manterne identificeres ved hjælp af deres resistens, I I f.eks. mod tetracyclin. I

I Især forstærkes de beskrevne ekspressionsvektorer i egnede I I E. coli-værtsstammer, såsom HB101, transformeres og I I 30 selekteres under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Det I I forstærkede plasmid-DNA isoleres fra bakterierne på I I sædvanlig måde, især som beskrevet af Birnboim og Doly I I (23). I

På tilsvarende måde kan man konstruere andre plasmider med andre homologe eller heterologe gener.

19 DK 175534 B1 DNA-molekyleme ifølge opfindelsen kan også fremstilles 5 ved hjælp af en in vitro-syntese i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder. In vitro-syntesen er især anvendelig til fremstillingen af mindre fragmenter af PL-eks-pressionssystemet, f.eks. DNA-sekvenserne, der koder for promotor- eller signalsekvensen for PL'erne, eller mutan-10 ter deraf.

DNA-molekyler ifølge opfindelsen indeholder en PL-promotor og eventuelt en PL-signalsekvens, et PL-strukturgen, et eventuelt andet heterologt strukturgen og/eller en PL-ter-minator kan også anvendes til at transformere filament-15 svampe, såsom Aspergillus, Penicillium eller Cephalospo-rium, f.eks. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori og især A. niger.

For at kunne selektere de transformerede svampe fra de ikke-transformerede, bærer DNA-molekylerne ifølge opfin-20 delsen en selektionsmarkør, eller svampene er eventuelt cotransformeret med en anden vektor, som indeholder en sådan markør. Som i andre systemer er en sådan selektionsmarkør et ekspressivt strukturgen, hvor det udtrykte polypeptid (et enzym) bevirker resistens mod forbindelser, 25 som er giftige over for tranformanten, eller som kompletterer enzymsystemet hos en mutant, som mangler et sådant essentielt polypeptid. Sådanne markørgener er f.eks. de kendte ga-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- eller argB-gener.

Som beskrevet i EP 88.101.397.3 er der fra det genomiske 30 bibliotek fra A. niger isoleret et nyt markørgen med betegnelsen pyrA, som er beslægtet med og har lignende funktion som pyrG fra A. nidulans og pyr4 fra N. crassa, dvs. producerer enzymet orotidin-5'-phosphatasedecarboxyl-ase. Dette enzym katalyserer decarboxyleringen af orot-

20 I

DK 175534 B1 I

idin-5'-phosphat til uridylsyre (uridin-5’-phosphat) og I

tillige af fluororotsyre til det toksiske fluoruridin. En I

E. coli-klon, som indeholder pyrA-genet, er identificeret I

5 ved hybridisering med 1,1 kb Hindlll-fragmentet af pDJB2 I

(24) indeholdende en del af pyr4-genet. Imidlertid kan der I

anvendes DNA fra et hvilket som helst andet pyr-gen, som I

koder for orotidin-5'-phosphatdecarboxylase. For en posi- I

tiv klon med betegnelsen E. coli B75183/pCG59D7 isoleres I

10 plasmidet pCG59D7 indeholdende pyrA-genet, og det anvendes I

til cotransformation af en A. niger pyrA“-mutant. En sådan I

pyrA"-mutant er defekt i orotidin-51-phosphatasecarboxy- I

lasegenet og er derfor ikke i stand til at producere det I

tilsvarende enzym. En sådan mutant er fremstillet ved at I

15 behandle konidiesporer fra A. niger N756 under muterende I

UV-bestråling, og der udvælges kolonier, som overlever i I

nærværelse af fluororotsyre og uridin. Kolonier, som

overlever i nærværelse af fluororotsyre. og i fravær af I

uridin elimineres. De tilbageblevne uridinkrævende mutan- I

20 ter hører i overensstemmelse med deres evne til at kunne I

transformeres til to komplementeringsgrupper pyrA og pyrB

repræsenteret ved henholdsvis mutant An8 og AnlO. De be- I

handles i form af protoplaster derfra under transforma-

tionsbetingelser med det pyrA indeholdende plasmid I

25 pCG59D7. Det viser sig, at kun An8-kolonieme er transfor- I

meret og indeholder pyrA-genet, hvilket påvises ved hjælp I

af hybridiseringsevnen hos spaltet DNA derfra med DNA fra I

pUN121. I

Opfindelsen omfatter endvidere værter transformeret med I

30 hybridvektorerne ifølge opfindelsen og fremgangsmåder til H

deres fremstilling. Sådanne transformanter er f.eks. bak- I

terier, såsom E. coli, eller filamentsvampe, såsom

Aspergillus, Penicillium eller Cephalosporium, især A. I

nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori eller I

35 fortrinsvis A. niger, f.eks. A. niger An8. Opfindelsen I

angår også en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne

transformanter, ved hvilken en vært behandles under trans- H

DK 175534 B1 21 formationsbetingelser med et rekombinant DNA-molekyle, især en hybridvektor, ifølge opfindelsen, eventuelt sammen med et selektionsmarkørgen, og transformanterne selekte-5 res.

Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af rekombinant DNA'erne eller derivater deraf til fremstillingen af hybridvektorer, som udtrykker nyttige homologe eller heterologe polypeptider. Eksempler på gener, som koder for 10 sådanne nyttige polypeptider, er anført ovenfor.

Desuden angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider, ved hvilken en hybridvektor ifølge opfindelsen udtrykkes i en egnet vært. Om nødvendigt isoleres polypeptidet på konventionel måde. Afhængigt af 15 vektorens konstruktion udtrykkes produkterne eller, hvis der findes en signalsekvens, de udtrykkes og udskilles.

Denne fremgangsmåde omfatter produktionen af nyttige homologe eller heterologe proteiner i en egnet vært, f.eks. Aspergillus-arter, ved dyrkning af en vært 20 transformeret med en ekspressionshybridvektor. Eksempler på gener, som koder for sådanne proteiner, er anført ovenfor.

Det er nu også muligt at producere de enkelte polypeptider PLA, PLB, PLC, PLD, PLE eller PLF, dvs. i ren form og ikke 25 kontamineret med nogen som helst anden PL, hvortil der kan avendes forskellige metoder. Eksempelvis er en fremgangsmåde til produktion af et enkelt polypeptid valgt blandt PLA, PLB, PLC, PLD, PLE og PLF ejendommelig ved, at en vært, som ikke kan udtrykke nogen pectinlyase PL, 30 transformeres med en DNA-ekspressionsvektor, som udtrykker produktet PLA, PLB, PLC, PLD, PLE eller PLF.

En vært, som ikke kan udtrykke nogen pectinlyase PL, er enten en mikroorganisme, som ikke har et tilsvarende gen,

I DK 175534 B1 I

I 22 I

I f.eks. en PL~ Aspergillus-stamme, en anden svamp, som ikke I

I er Aspergillus, eller en hvilken som helst anden eukaryo- I

I tisk eller prokaryotisk mikroorganisme, eller en Aspergil- I

I 5 lus-stamme,, hvis produktion af PL* er er undertrykt i et „I

I passende konditioneret dyrkningsmedium. Eksempelvis kan et I

I enkelt PL-gen udtrykkes under kontrol af glucoamylasepro- I

I motoren i A. niger eller A. awamori under kontrol af I

I PH05-promotoren i S. cerevisiae eller under kontrol af en I

I 10 PL-promotor i en PL” A. niger-stamme. I

I Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under I

I henvisning til tegningen, hvor I

I fig. 1 viser restriktionskortet for pGW820 indeholdende I

I pelA-genet, I

I 15 fig. 2 viser restriktionskortet for pGW830 indeholdende I

I pelB-genet, I

I fig. 3 viser restriktionskortet for pGW850 indeholdende

I pelC-genet, I

I fig. 4 viser restriktionskortet for pGW840 indeholdende I

I 20 pelD-genet, I

I fig. 5 viser restriktionskortet for pGW880 indeholdende I

I pelE-genet, I

I fig. 6 viser restriktionskortet for pGW860 indeholdende

I pelF-genet, I

I 25 fig. 7 viser sekvenseringsstrategien for pelA-genet, I

I fig. 8 viser sekvenseringsstrategien for pelB-genet, I

I fig. 9 viser sekvenseringsstrategien for pelC-genet, I

23 DK 175534 B1 fig. 10 viser sekvensen for DNA-molekylet pelA med formlen I indeholdende genet, som koder for PLA, fig. 11 viser sekvensen for DNA-molekylet pelB med formlen 5 II indeholdende genet, som koder for PLB, fig. 12 viser sekvensen for DNA-molekylet pelC med formlen III indeholdende genet, som koder for PLC, fig. 13 viser homologien på aminosyresekvensniveauet mellem PLD, PLA og PLC, 10 fig. 14 viser konstruktionen af vektoren pUC19/pelA-IFN AM119, som indeholder genet, der koder for hybridinterferonet BDBB, og fig. 15 viser den ikke-kodende streng af en del af pelA-IFN-fusionen på plasmid pelA-IFN AM119 med afsnøret 15 signalsekvens på linie med oligonucleotidprimeren anvendt til sletningsmutagenese af pelA-signalsekvensen.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Der anvendes forølgende forkortelser: 20 Amp ampicillin ATP adenosintriphosphat BSA bovint serumalbumin CIP alkalisk phosphatase fra kalvetarm DNA deoxyribonucleinsyre 25 DTT 1,4-dithiothreitol EDTA ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt EGTA bis-(aminoethyl)-glycolether)N,N,N’,N'-tetra- eddikesyre kbp kilobasepar 30 LMP lavt smeltepunkt - ---- - -----

DK 175534 B1 I

24 I

mOsm milliosmol I

PEG polyethylenglycol I

RNA ribonucleinsyre I

5 opm omdrejninger pr. minut · I

SDS natriumdodecylsulfat I

Tc tetracyclin I

Tris tris(hydroxymethyl)-aminomethan I

V volt I

10 Puffere, medier og reagenser; I

HHA B/g 10 x restriktionsenzympuffer anvendt I

til BamHI-, Bglll-, Hindlll-, Mbol-, I

PstI- og Xhol-spaltninger, indeholden-

de 60 mM Tris-HCl (pH 7,4), 60 mM I

15 /S-mercaptoethanol, 60 mM MgCl2, 500 mM I

NaCl, 0,1% BSA og 0,1% gelatine. I

EcoRI-puffer 5 x restriktionsenzympuffer anvendt I

til EcoRI-spaltninger, indeholdende I

500 mM Tris-HCl (pH 7,2), 25 mM MgCl2, I

20 250 mM NaCl, 0,05% BSA og 0,05% gela- I

tine. I

IPTG 100 mM isopropyl-Ø-thio-galactopyran-

osid (23,8 mg/ml) i H20. I

LC-medium 1% trypticasepepton (BBL), 0,5% gær- I

25 ekstrakt (BBL), 0,8% NaCl, 1 ml Tris- I

HCl pH 7,5 pr. liter. I

Minimalmedium 1,05% K2HPO4, 0,45 KH2PO4, 0,1% I

(NH4)2S04, 0,05% til E. coli natrium- I

citrat. 2H20, 1 mM thiamin-HCl og 0,2% I

30 glucose.

2XTY medium 16 g trypticasepepton (BBL), 10 g gær- ekstrakt og 5 g NaCl pr. liter.

25 DK 175534 B1 TBE-puffer 1 liter indeholder 10,9 g Tris, 5,5 g 5 borsyre, 4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).

TE-puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA

(pH 8,0).

Lav TE-puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA

(pH 8,0).

10 X-gal 2% (5-brom-4-chlor-3-indolyl-0-galact- osid) i dimethylformamid.

SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat.

Minimalmedium 1 liter indeholder 1,5 g KH2PO4, 0,5 g til A. niger KC1, 0,5 g MgS04'7H20, 4,0 g NH4CI, 15 10,0 g glucose, spormængder af FeSC>4,

MnS04, ZnCl2, indstillet på pH 6,5 med NaOH.

Komplet medium minimalmedium plus 0,2% trypticase- til A. niger pepton for (BBL) 0,1% casaminosyrer 20 (Difco), 0,1% gærekstrakt (BBL), 0,05% ribonucleinsyrenatriumsalt fra gær (ICN, Cleveland, USA), 2 ml vitaminopløsning pr. liter.

Vitaminopløsning pr. 100 ml 10 mg thiamin, 100 mg 25 riboflavin, 10 mg panthotensyre, 2 mg biotin, 10 mg p-aminobenzoesyre, 100 mg nicotinamid, 50 mg pyridoxin-HCl.

Til plader størknes alle medier ved tilsætning af 1,5% agar (BBL), til topagar(ose) anvendes 0,7% agar (BBL) 30 eller agarose.

I DK 175534 B1

I 26 I

I PBS pr. liter 0,37 g NaH2P04, 2,7 g I

I Na2HP04, 8,5 g NaCl. I

I PSB 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, . I

I 5 10 mM MgCl2, 0,05% gelatine. I

I LDB 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, I

I 10 mM MgCl2· I

Følgende stammer anvendes: I

I A. niger N400 vildtype I

I 10 A. niger N593 cspA, pyrA I

I A. niger N756 udvalgt til høj produktion af pectin- I

I asekompleksenzymer I

I A. niger AN8 DSM 3817, uridinauxotrof mutant af A. I

I niger N756 I

I 15 E. coli NM539 metB, supE, hsdM+, hsdR“, supF, I

I (P2cox3) I

I E. coli MH1 ara D139, AlacX74, galU, galK, hsr”, I

I hsm+, strA I

I E. coli JM103 Alac-pro, thi, strA, supE, endA, sbcB, I

I 20 hsdR4, F1, traD36, proAB, laclq, ΖΔΜ15 I

I E. coli JM109 A(lac-proAB), recAl, endAl, gyrA96, I

I thi, hsdRl7, supE44, relAl, X“, [F’, I

traD36, proAB, lacl^, ZAM15 ] I

E. coli CJ 236 (dut-1, ung-1, thi-1, relA-l;pCJ105 I

25 (cmr); BIO-RAD muta-Gene M13 in vitro I

mutagenesesæt) I

27 DK 175534 B1 E. coli MV1190 [å(lac-proAB), thi, supE,

å(srl-recA)306::TnlO(tetr) (F':traD36, proAB, lac 1QZAM15)J. Stamme MV1190 er 5 beskrevet i håndbogen til BIO-RAD

MUTA-GENE M13 in vitro mutagenesesæt.

Følgende vektorer anvendes: EMBL4 EMBL4 er en X-ombytningsvektor med en kloningskapacitet på 10 9-23 kbp (Frischauf et al., ref. 2). Den indeholder et flerkloningsområde mellem λ-armene og det ikke-essentielle fyldområde (stufferregion). Dette muliggør gennemførelsen af flere restriktionsenzymspaltninger på en sådan måde, at religering af den såkaldte "stuffer" til vektorarmenne 15 formindskes, da fremmed-DNA’et, som har interesse, er indsat. Vektoren udnytter også Spi-fænotypen til at tilvejebringe en direkte selektion for rekombinanter (Zissler et al., ref. 20).

PCG3B11 20 Dette plasmid er beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning 88.101.397.3, og det indeholder pelD (PLI)-genet fra A. niger N756 klonet i pBR322.

PPL29-5

Dette plasmid er beskrevet i beskrivelsen til europæisk 25 patentansøgning nr. 88.101.397.3, og det indeholder det N-terminale EcoRI-fragment af pelD (PLI)-genet.

PPL35-5

Dette plasmid er beskrevet i beskrivelsen til euopæisk patentansøgning nr. 88.101.3967.3, og det indeholder det 30 C-terminale EcoRI-fragment of pelD (PLI)-genet.

DK 175534 B1 I

28 I

PBR322 I

Plasmid pBR322 bærer gener for resistens mod antibioti- I

kaene ampicillin (ampR) og tetracyclin (tetR). Plasmidet I

5 bærer flere entydige kloningssteder, og nogle af disse I

findes enten i amp- eller tet-genet, således at indsætning I

af klonet DNA fører til antbiotikumfølsomme bakterier. I

PEMBL18 og PEMBL19 I

Disse plasmider er beskrevet af Dente et al. (ref. 7 og I

10 8). I

PGW613 I

Dette plasmid er beskrevet af Goosen et al. (ref. 12). I

M13mp-faq I

M13mpl8- og Ml3mp19-vektorerne (Norrander et al., ref. 21) I

15 er derivater af den enkeltstrengede DNA-bakteriofag M13 og I

er udformet med henblik på at lette DNA-sekvensering ved I

at muliggøre kloning af DNA-fragmenter på et alsidigt

polylinkersted og kloningen af samme restriktionsfragment I

i begge mulige orienteringer. Sekvenser klonet i disse I

20 vektorer kan let anvendes som skabeloner til sekvense- I

ringsreaktioner eller fremstillingen af enkeltstrengede I

prober under anvendelse af standard-oligodeoxynucleo-

tidprimer og Klenow-fragmentet fra E. coli-DNA-polymerase I

I. Vektor-DNA'et bærer E. coli lac-operon-prbmotoren og I

25 den genetiske information for de første 145 aminosyrer i I

Ø-galactosidase. Polylinkersekvenserne indeholdende flere I

restriktionssteder indsættes i lacZ-sekvensen. Polylinke- I

ren bevarer lacZ-aflæsningsstrukturen, og vektoren giver I

allelisk komplettering af en lacZa-værtsstamme, hvorved I

30 der fås blå plaque på plader, som indeholder IPTG og I

X-gal. Rekombinantfager indeholdende inserter, som øde-

lægger aflæsningsstrukturen eller på anden måde interfe- I

rerer med ekspressionen af lacZa-peptidet, fremstår som farveløse plaque.

29 I

DK 175534 B1 I

PCG59D7 I

Dette plasmid er beskrevet i beskrivelsen til europæiask I

patentansøgning nr. 88.101.397.3 og kan fås fra Escheri- I

5 chia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968). Plasmidet indeholder I

pyrA-genet og anvendes til cotransformation af A. niger I

pyr A“-mutanter. I

M13(+)KS (Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA) I

dsDNA-Vektor indeholdende replikationsstartpunktet fra I

10 M13-fag. I nærværelse af en hjælperfag, f.eks. M13K07 I

(ref. 29) eller R408 (ref. 9) repliceres, pakkes og I

frigøres vektorens (+)-streng til mediet. I

I M13K07 I

I Hjælper-M13-fag for M13(+)KS. Beskrevet af Mead et al. I

I 15 (ref. 29). I

I R408 I

I Hjælper-M13-fag for M13(+)KS. Beskrevet af Russel et al. I

I (ref. 9). I

I Eksempel 1. . I

I 20 Konstruktion af et genomisk bibliotek for Aspergillus ni- I ger I Eksempel 1.1: Isolering af DNA med høj molekylvægt fra A.

I niger.

I Konidiesporer fra Aspergillus niger-stamme N400 inokuleres I 25 i 200 ml minimalmedium i en slutsporetæthed på 10^ spo- I rer/ml og rystes i en 1-liter Erlenmeyerkolbe i 24 timer I ved 28°C på et rysteapparat (New Brunswick) ved 300 opm.

I Myceliet høstes ved filtrering under anvendelse af en I Bttchnertragt med "Myracloth", vaskes med kold steril salt- I 30 opløsning, fryses · i flydende nitrogen og opbevares ved I -60eC eller anvendes direkte. Den anvendte metode til iso- I DK 175534 B1 I 30

I lering af DNA til fremstilling af et genomisk bibliotek I

er baseret på fremgangsmåden beskrevet af Yelton et al. I

I (ref. 1). DNA-udbyttet er ca. 50-100 /*g/g mycelium ved I

I 5 denne metode. I

I Til dannelse af biblioteket formales 10 g mycelium i fly- I

I dende nitrogen i portioner af 1 g i et membranfjernelses- I

I apparatur (Braun micro-dismembrator). Det formalede myce- I

I lium overføres til en 1-liter steril Erlenmeyerkolbe, som I

I 10 indeholder 200 ml ekstraktionspuffer (50 mM EDTA, pH 8,5, I

I 0,2% SDS) og 200 μ.1 diethylpyrocarbonat. Blandingen opvar- I

I mes langsomt til stuetemperatur, hvorefter den opvarmes i I

I 20 minutter til 68°C under lejlighedsvis rystning. Suspen- I

I sionen afkøles til stuetemperatur og centrifugeres i 15 I

I 15 minutter ved 12.000 x G. 1/16 rumfang 8 M kaliumacetat- I

I opløsning med pH-værdi 4,2 sættes til supematanten, og I

I blandingen henstår på is i 1 time. Bundfaldet fjernes ved I

I centrifugering i 20 minutter ved 16.000 x G og en tempera- I

tur på 4eC. Nucleinsyrerne fældes fra supematanten ved I

20 inkubering med 0,6 rumfang isopropanol på is i 15 minut- I

ter. Pelletten samles ved centrifugering i 10 minutter I

ved 6.000 x G og 4°C, vaskes med 70%'s ethanol og tørres i I

kort tid. Pelletten suspenderes i 10 ml TE indeholdende 20 I

/ig/ml RNaseA, (Boehringer, Mannheim), og der inkuberes i I

25 15 minutter ved 37eC. DNA'et behandles med nucleasefri I

pronase (1 mg/ml slutkoncentration) (Kochlight, I

Coinbrook) i 1 time ved 37°C. Pronasestamopløsningen i I

TE-puffer indeholder 20 rag/ml enzym, som inkuberes il | time ved 37°C til spaltning af nucleaser. I 1 2 3 4 5 6

8,5 g CsCl opløses i 9 ml DNA-opløsning, der tilsættes 0,2 I

2

ml 10 mg/ml ethidiumbromid, og denne opløsning centrifuge- I

3

res i en Beckman SW41-rotor i 60 timer ved 33.000 opm I

4

eller i en Beckman 50Ti-rotor med såkaldte "quickseal"-rør I

5

i 40 timer ved 45.000 opm. DNA-båndet udtages ved punkte- I

6

ring af røret i siden. Ethidiumbromidet fjernes ved flere I

ganges ekstraktion med vand- og NaCl-mættet isopropanol. I

DK 175534 Bi 31

Der tilsættes 5 rumfang TE, DNA'et ekstraheres med TE-mæt-tet phenol, phenol/chlororoform/isoamylalkohol (25:24:1) og chloroform/isoamylalkohol (24:1). DNA’et fældes ved 5 tilsætning af 0,1 rumfang 3 M natriumacetatopløsning, pH

5,2, 2,5 runfang ethanol og inkubering natten over ved -20eC. Bundfaldet samles ved centrifugering i 1 time ved 30.000 x G og en temperatur på 4°C, hvorpå det vaskes med 70%’s ethanol, tørres og opløses i 400 /il lav TE.

10 Eksempel 1.2: Partiel spaltning af A. niger DNA med Mbol og isolering af fragmenter.

For at bestemme den Mbol-koncentration, som giver den største mængde fragmenter mellem 13,6 og 23 kbp, spaltes 1 /tg portioner af A. niger N400 DNA i den egnede puffer med 15 faldende mængder Mbol (0,5-0,001 enh.) i 1 time ved 37°C i et rumfang på 10 /il. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 1 μΐ 0,25 M EDTA, og prøverne sættes på en 0,6% agarosegel ~ i TBE indeholdende /tg/ml ethidiumbromid. Hensigtsmæssige markører er en blanding af λ-DNA og λ-DNA spaltet med 20 Bglll, som giver bånd på 49, 22,8, 13,6, 9,8 og 2,3 kbp og et ikke-synligt fragment på 0,45 kbp. Den koncentration af Mbol, som er nødvendig for opnåelse af et højt udbytte af de ønskede 13,6-23 kbp-fragmenter, er 0,02 enh.//ig DNA.

200 μg DNA spaltes derfor i et samlet rumfang på 2 ml, og 25 blandingen opdeles i 20 lige store portioner umiddelbart efter enzymtilsætningen. Efter 1 time ved 37eC anbringes spaltningsblandingerne på is, og en 1 /ig prøve køres på en gel til afprøvning af korrekt spaltning. Når resultatet er positivt, tilsættes EDTA til en slutkoncentration på 25 mM 30 til afbrydelse af reaktionen, enzymet inaktiveres ved opvarmning ved 65eC i 10 minutter, hvorefter prøverne hældes sammen, og DNA'et fældes, vaskes, tørres og opløses i 400 μΐ TE.

Det spaltede DNA adskilles natten over på en 0,4% præpa-35 rativ agarosegel (centerhul 120 x 1,5 mm). λ-DNA spaltet

I DK 175534 B1 I I 32 I

med Bglll anvendes som markør til bestemmelse af størrel- I I sen af de partielt spaltede DNA-fragmenter ved elektrofo- I I rese ved 4*C og 40 V (3 V/cm). Gelområdet, som Indeholder I I 5 fragmenter af den rigtige størrelse, udskæres af gelen, og I I DNA'et elektroelueres fra gelen i sterilt dialyserør i 2 I I ml TBE i løbet af 2-3 timer ved 100 V. Strømmen vendes i I I 30 sekunder, og pufferen indeholdende DNA'et opsamles. I I Fragmenterne koncentreres derefter ved fældning med I I 10 ethanol og opløses i 100 μΐ lav TE. I

I Eksempel 1.3: Fremstilling af vektor-DNA og kloning af I I DNA-fragmenter fra A. niger med høj I I molekylvægt i EMBL 4. I

I Det genomiske bibliotek af A. niger stamme N400 konstrue- I I 15 res ind i X-vektoren EMBL4. Vektoren, som har en klonings- I I kapacitet på 9-23 kbp, er beskrevet af Frischauf et al. I I (ref. 2) og Karn et al. (ref. 3) og er købt hos Promega I I Biotech. Inc. For at undgå dobbeltinserter, som stammer I I fra forskellige dele af genomet, anvendes en mindstefrag- I I 20 mentlængde på 13,6 kbp til kloning. I

I 10 /ig X-EMBL4-DNA spaltes fuldstændigt med 50 enh. BamHI i I I den egnede puffer i et rumfang på 100 μΐ i 2 timer ved I I 37°C. Enzymet inaktiveres i 10 minutter ved 65eC. NaCl- I I koncentrationen hæves til 150 mM, og der tilsættes 50 enh. I I 25 Sall og inkuberes ved 37°C i yderligere 2 timer. Efter I I tilsætning af EDTA til 25 mM og inaktivering af enzymet I I (10 min. 65eC) ekstraheres opløsningen med lige store I I rumfang phenol (TE-mættet), phenol/chloroform/isoamyl- I I alkohol (25:24:1), chloroform/isoamylalkohol. Til fjer- I I 30 nelse af de små BamHI/Sall-polylinkerf ragmenter fældes I I DNA'et med 0,6 rumfang isopropanol efter tilsætning af 0,1 I I rumfang 3 M natriumacetat pH 5,2. Efter 15 minutter på is I I og centrifugering i 15 minutter ved 12.000 x G ved en I I temperatur på 4°C vaskes bundfaldet omhyggeligt med 70%'s I I 35 ethanol, tørres og opløses i 40 μΐ lav TE. I

33 DK 175534 B1

Eksempel 1.4; Ligering og in vltro-pakninq (packaging) af genomisk A. niger DNA-fragmenter.

Det er vigtigt, at cos-stederne i vektoren fremstillet 5 ifølge eksempel 1.3 annelleres inden ligeringsreaktionen. Vektoren i 100 mM Tris-HCl pH 7,5 og 10 mM MgClg opvarmes i 10 minutter ved 65°C, hvorpå der ane lieres i 1 time ved 42°C. Ved testligeringer har det vist sig, at et forhold mellem vektor og fragmenter på ca. 1:1 (på vægtbasis) 10 giver maksimum af rekombinanter. Ligeringen gennemføres i 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DDT og 1 mM ATP under anvendelse af 9,5 μg vektor og 10 μg DNA-fragmenter i et samlet rumfang på 100 μΐ. Derefter tilsættes DNA-ligase (BRL) i en koncentration på 0,5 enh./μg DNA, og 15 ligeringsblandingen inkuberes natten over ved 14®C. For at I teste ligeringen køres en prøve af det llgerede DNA på en I agarosegel. Endvidere ligeres 0,5 μg vektor uden tilsæt- I ning af fragmenter i et rumfang på 5 μΐ.

I Ligeringsblandingen med det store rumfang koncentreres ved I 20 fældning med ethanol og opløses i 20 μΐ lav TE inden in I vitro-pakning. In vitro-pakning gennemføres med "Promega I Packagene”-ekstrakter i overensstemmelse med producentens I vejledning under anvendelse af 10 μΐ portioner til pakning I af 1 fig DNA. 1 μg X-cI857 Sam 7 med høj molekylvægt, I 25 leveret med ekstrakterne, pakkes separat til opnåelse af I en kontrol. Efter pakning tilsættes 500 μΐ fag-opløsnings- I puffer (PSB) og 5 μΐ chloroform. Rekombinant fag-stamop- I løsningerne kan opbevares ved 4°C. Det dannede bibliotek I er konstrueret ud fra to separate ligeringsforsøg.

I 30 Eksempel 1.5: Titrering og forstærkning af det genomiske I bibliotek fra A. niger stamme N400.

I Celler af E. coli NM539 dyrkes på LC-medium indeholdende I 0,2% maltose, 10 mM MgS04 og 1 mM CaCl2 til en optisk I tæthed (600 nm) på 1,0. Derefter sættes alikvoter på 0,2

I DK 175534 B1 I

I 34 I

I ml af denne kultur til 0,1 ml af en fag-fortyndingsrække i I

I PSB. Efter adsorption af fagerne i 20 minutter ved 37°C I

I tilsættes 3 ml 0,6% LC-topagar ved en temperatur på 45°C, I

I 5 blandingen udplades på LC-agarplader, og disse inkuberes I

I natten over ved 37eC. Titreringsresultaterne udtrykt som I

antallet af plaque-dannende enheder (pfu) pr. ml fag-sus- I

I pension er 12 x 10^ og 4,2 x 10^ pfu/ml for de to fag- I

I stamopløsninger fremstillet ifølge eksempel 1.4. Efter I

I 10 subtraktion af baggrunden, som beregnes ud fra kon- I

I trolligeringerne uden fragmenter (henholdsvis 17 og 40%), I

I er det absolutte antal rekombinanter 6 x 10^, hvilket er I

I mere end 200 gange genomlængden. I

Til forstærkning af biblioteket anvendes portioner på 80 I

15 μ 1 af de to fag-stamopløsninger til infektion af E. coli I

NM539-celler, som er udpladet i LC-top-agarose på LC-agar- I

I plader, hvorpå der inkuberes natten over ved 37°C. Fageme I

elueres fra agarosen ved forsigtig rystning af pladerne I

I med 5 ml PSB pr. plade i 1 time ved stuetemperatur. PSB I

I 20 samles, centrifugeres i 10 minutter ved 6000 x G til I

I fjernelse af bakterier, og der tilsættes chloroform til en I

I slutkoncentration på 0,5%. De to fag-stamopløsninger, som I

er forstærket i omtrentlig samme grad, blandes derpå (40 I

ml stamopløsning), titreres (8 x 10^ pfu/ml) og opbevares I

25 ved 4°C. I

Eksemepel 2. I

Screening af det genomiske bibliotek fra A. niqer N400 for I

pectinlyase D-genet (pelD) og isolering af genet. I

Eksempel 2.1: Screening af biblioteket. I

30 Til isoleringen af pelD-genet fra X-genombiblioteket op- I

nået som beskrevet i eksempel 1 blandes 2,5 x 10^ fager I

med smeltet LC-topagarose, og der foretages udpladning på I

fem LC-agarplader. Pladerne inkuberes natten over ved 37eC I

35 I

DK 175534 B1 I

og bratafkøles i 2 timer ved 4eC. Af hver plade fremstil- I

les to kopier under anvendelse af plaquehybridiserings- I

metoden ifølge Benton og Davis (ref. 4). Det første filter I

5 (Schleicher og Schflll BA85 eller Millipore HATF 085) I

anbringes oven på pladen i 1 minut, den anden kopi i 2 I

minutter, og kopiernes stilling markeres med tusch. I

Efter fjernelse af filtrene anbringes de i en skål inde- I

holdende 100 ml denatureringsopløsning (1 M NaCl, 0,5 Μ I

10 NaOH) i 1 minut og i 1 minut i 100 ml renatureringsopløs- I

ning (0,5 M Tris/HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl). Derefter over- I

I føres filtrene til en skål indeholdende 3 x SSC (SSC = I

I 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat pH 7,0). Filtrene I

I gnubbes forsigtigt med en behandsket hånd for at fjerne I

I 15 bakterierester, hvorpå de anbringes i en frisk skål I

I indeholdende 3 x SSC, hvori de rystes forsigtigt i 20 I

I minutter ved stuetemperatur. Filtrene aftrykkes på Whatman I

I 3 MM-papir og tørres i 10 minutter ved stuetemperatur. I

I Filtrene opvarmes i et varmeskab på Whatman 3 MM-papir ved I

I 20 80°C i 2 timer. Derefter vaskes de i 0,5 timer i 6 x SSC I

I ved stuetemperatur, hvorpå de overføres til 50 ml forvar- I

I met (56°C) præhybridiseringsblanding, som består af 50 mM I

I Tris/HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS, 0,1% I

I natriumpyrophosphat, 10 x Denhardts (50 x Denhardts = 1% I 25 BSA, Boehringer-fraktion V, 1% polyvinylpyrrolidon -40, 1% I Ficoll 400). Til præhybridiseringsblandingen sættes frisk I 0,1 mg/ml denatureret laksesperm-DNA (Maniatis et al., s.

I 327, ref. 5) og 0,01 mg/ml poly-rA. Præhybridiseringen I gennemføres i 4 timer ved 56eC under forsigtig rystning.

I 30 Proben anvendt til hybridisering er det nick-transiaterede I 3,5 kbp EcoRI-fragment af pPL35-5, som indeholder det I C-terminale område af pelD-genet fra stammen A. niger N756 I (tilgængelig fra E. coli BJ5183/pCG3Bll, DSM 3916, EP ! I 88.101.397.3). Fragmentet er i forvejen isoleret fra en I 35 lavtsmeltende agarosegel, og 0,3 μg af fragmentet er nick- I translateret (Maniatis et al., side 109-112, ref. 5). Det I nick-translaterede DNA denatureres i 10 minutter i et ko- I DK 175534 B1

I 36 I

I gende vandbad, afkøles på is og sættes til 50 ml forvar- I

I met præhybridiseringsblanding. De præhybridiserede filtre I

I overføres ét af gangen til hybridiseringsblandingen. Hy- I

I 5 bridiseringen gennemføres ved 56eC natten over under for- I

I sigtig rystning. Filtrene vaskes ved 56°C i to gange 30 I

I minutter med 0,5 liter 4 x SSC, 0,1% SDS og i 2 gange 30 I

I minutter med 2 x SSC, 0,1% SDS. Filtrene aftrykkes på 3 I

I MM-papir og lufttørres i 1 time. Efter fastgørelse til 3 I

I 10 MM-papir og korrekt mærkning med radioaktivt mærket blæk, I

I dækkes filtrene med "Saran"- folie, hvorpå de autoradio- I

M graferes natten over ved -70eC under anvendelse af Koni- I

M ca-røntgenfilm og Kodak X-Omatic-kassetter med alminde- I

M lige forstærkningsskærme. På denne måde opnås 44 positive I

I 15 signaler fra de fem screenede plader. Positive plaque ud- I

I tages med en steril Pasteur-pipette ved omhyggelig place- I

ring af pladerne på autoradiogrammet på den rigtige måde I

I under anvendelse af blækmarkeringerne. Agarstykkerne, som I

I indeholder de positive plaque, anbringes i 1 ml PSB. Fa- I

I 20 gerne for lov til diffundere fra agar i løbet af 1 time I

I ved stuetemperatur med lejlighedsvis hvirvlning. Agaren og I

I rester af bakterieceller fjernes ved centrifugering i 5 I

I minutter, der tilsættes 10 μΐ chloroform, og fag-stamo- I

I pløsningerne opbevares ved 4°C. De positive kloner beteg- I

25 nes λ-PLl til X-PL44. Da fager udplades i stor tæthed, er I

det nødvendigt at rense positive plaque to gange ved ud- I

pladning i lav tæthed (± 100 fager/plade, 0,1 ml 10^-for- I

tynding af fagstamopløsningen) og gentage hele processen I

med kopiudpladning, hybridisering og udtagning af positi- I

30 ve plaque. I

Eksempel 2.2: Isolering af X-DNA. I

Til isolering af DNA fra rekombinant klonerne forstærkes I

fager først ved infektion af E. coli NM539 med 0,1 ml I

fagstamopløsninger fra rensede kloner som beskrevet i ek- I

35 sempel 1.5, og cellerne udplades i LC-topagarose på LC- I

agarplader. Herved fås plader med sammenflydende lysis af I

37 DK 175534 B1

indikatorbakterierne. 5 ml PSB udspredes over pladerne/ og I

fager elueres i løbet af 2 timer under forsigtig ryst- I

ning. De eluerede fager høstes, cellerester fjernes ved I

5 centrifugering, og der tilsættes chloroform til 1%. Det I

dannede pladelysat opbevares ved 4*C. Det har sædvanligvis I

en titer på ca. 1011 pfu/ml. I

Da isolering i lille målestok fra pladelysatstamopløs- I

ninger og fra væskekulturer i lille målestok (Maniatis et I

10 al., side 65-68, ref. 5) ikke altid resulterer i tilveje- I

bringelse af spalteligt DNA, isoleres fager fra 250 ml. I

lysater. Disse fremstilles ved at dyrke værten E. coli I

NM539 til en O.D.gQO på 0,3 i LC + 0,2% maltose, 10 mM I

MgS04, 1 mM CaCl2, hvorefter der tilsættes ca. lO3·^ pfu af I

15 pladelysatet. Efter yderligere vækst lyseres bakterierne i I

løbet af 4 timer. I

I Til lysaterne sættes RNase og DNase til en slutkoncen- I

I tration på 2 /*g/ml, og lysatet henstår ved stuetemperatur I

I il time. Cellerester fjernes ved centrifugering i 20 I

I 20 minutter ved stuetemperatur og 10.000 x G. 14,8 g NaCl og I

I 25 g PEG 6000 opløses i supernatanten til opnåelse af I

I slutkoncentrationer på 1 M NaCl og 25% (v/r) PEG. Fagerne I

I henstår til udfældning i 1 time på is eller natten over I

I ved 4“C, hvorpå de høstes ved centrifugering i 20 minutter I

I 25 ved 10.000 x G og en temperatur på 4°C. Pellets suspen- I

I deres i 3 ml λ-fortyndingspuffer (LDB = 10 mM Tris-HCl pH I

I 7,5, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl). 2,5 g CsCl opløses i 4 ml I

I fagsuspension, og blandingen anbringes ved hjælp af en I pipette i 5 ml Beckman "quickseal,'-rør, som derpå fyldes I 30 op med den samme koncentration af CsCl i LDB. Rørene I forsegles og centrifugeres natten over i en Beckman VTi I 65,2 rotor ved 50.000 opm og 4eC. Der stikkes hul i siden I af røret til det uklare fagbånd, som er synligt under en I normal lampe. CsCl fjernes ved dialyse i sterile rør mod 2 I 35 liter 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl ved I 4®C i 4 timer. Pufferen skiftes én gang. Fager opsamles i I DK 175534 B1

I 38 I

I sterile Greiner-rør, rumfanget indstilles på 1 ml med I

I dialysepufferen, 50 μΐ 10% SDS, 50 μΐ 0,5 M EDTA pH 8,0 og I

25 μΐ 20 mg/ml nucleasefri pronase tilsættes, og rørene I

5 inkuberes i 1 time ved 37°C. Rumfanget forøges til 3 ml I

I med TE, og denne opløsning ekstraheres med tilsvarende I

I rumfang TE-mættet phenol, phenol/chloroform/isoamylalkohol I

I (25:24:1) og chloroform/isoamylalkohol (24:1). Efter I

I tilsætning af 0,1 rumfang 3 M natriumacetat pH 5,2 og 2,5 I

I 10 rumfang ethanol fældes DNA'et nattes over ved -20eC og I

I samles ved centrifugering i 1 time ved 20.000 x G og en I

I temperatur på 4®C. Pelletten vaskes med 70%'s ethanol, I

I tørres og opløses i 200 μΐ lav TE. Udbyttet af fag-DNA er I

I ca. 200 μg/250 ml lysat. I

I 15 Eksempel 2.3: Restriktionsanalyse af pelD-kloner, I

I Blandt de positive fager udvælges 10 tilfældigt med I

I henblik på yderligere analyse. 1 μg fag-DNA spaltes med 10 I

enh. EcoRI eller Bglll i et rumfang på 20 /il i 2 timer ved I

37°C i de af leverandøren anbefalede puffere. Prøverne I

20 adskilles på en 0,6% agarosegel under anvendelse af 1 μg I

X-CI857 Sam 7 DNA spaltet med Hindlll (X x Hindlll) som I

markører og EMBL4-DNA og pCG3Bll-DNA spaltet med EcoRI som I

kontroller. Gelen fotograferes på en UV-transilluminator I

under anvendelse af Polaroid 667-film (4 sek., blænde 8). I

25 DNA’et overføres til Schleicher og Schtill BA85-nitrocellu- I

losefiltre under anvendelse af fremgangsmåden ifølge I

Southern (1975) som beskrevet af Maniatis, side 382-386 I

(ref. 5). Filtrene hybridiseres med en blanding af I

32p_mærkedé (nick-translaterede) fragmenter af pelD-genet I

30 dækkende hele genet. Disse fragmenter er 2,9 kbp EcoRI- I

fragmentet af pPL29-5 og 3,5 kbp EcoRI-fragmentet af I

pPL35-5. Der anvendes samme hybridiserings- og vaskebe- I

tingelser som beskrevet i eksempel 2.1. I

Båndlængder beregnes ud fra fotografiet og autoradiogram- I

35 merne ved grafisk sammenligning på halvlogaritmisk papir I

39 DK 175534 B1 med de kendte markørbånd. Restriktionskort for klonerne er vist i fig. 1. Kloner X-PL4, -14 og -40 indeholder både 2,9 og 3,5 kbp EcoRI-hybridiseringsfragmenterne som fundet 5 i PCG3B11. X-PL5, -6, -10 og -33 indeholder 3,5 kbp EcoRI-fragmentet sammen med et andet EcoRI-hybridiseringsfrag-ment. Kloner X-PL25 og -28 indeholder 2,9 kbp EcoRI-frag-mentet sammen med et andet hybridiseringsfragment, hvorimod X-PL9 kun indeholder et lille 1,2 kbp EcoRI-10 hybridiseringsfragment. Det komplette 5,0 kbp Bglll-fragment fra pCG3Bll, som indeholder hele pelD-strukturgenet, findes kun i kloner X-PL4, -14 og -40. 3,7 kbp hybridiseringsbåndet, som findes i kloner X-PL5, -6, -10, -14, -33 og -40, men ikke i pCG3Bll, findes efter (down-15 stream) peD-genet i 5,0 kbp fragmentet. Nogle Bglll-hybri-diseringsfragmenter indeholder stadig 1,2 kbp fra vektorens højre arm. Alle klonerne indeholder også ikke-hybri-diserende fragmenter, som er identiske. Da det derfor fremgår, at restriktionsmønstrene for både strukturgenet 20 og genomgivelserne er identiske i alle kloner, kan man deraf slutte, at de stammer fra det samme gen, dvs. pelD-genet fra A. niger stamme N400. Ud fra antallet af udpla-dede kloner og den formodede genomlængde på 3 x 10? bp forventes det for 25.000 kloner med en gennerosnitsin-25 sertlængde på 15 kbp, at der findes mindst 12 pelD-kloner.

Da kun 2 ud af de 10 analyserede kloner er identiske, er I biblioteket mere komplekst end forventet (jf. eksempel 3).

I Eksempel 2.4: Underkloning af pelD-fragmenter.

I 5,0 kbp Bglll-fragmenterne af X-PL4 og pCG3Bll, som inde- I 30 holder pelD-generne fra henholdsvis A. niger N400 og I N756, underklones i BamHI-stedet i plasmid pBR322 (se klo- I ningsvektorer). 4 μg X-PL4 og 2 /tg pCG3Bll spaltes fuld- I stændigt i 20 μΐ med 10 enh. Bglll i 2 timer ved 37°C.

I Fragmenterne adskilles på en 1%'s lavtsmeltende LMP-agaro- I 35 segel (BRL) i TBE + 1 /tg/ml ethidiumbromid ved 50 V. 5,0 I kbp fragmentet udskæres af gelen, fortyndes med 0,4 ml TE, I DK 175534 B1

I 40 I

der tilsættes et tilsvarende rumfang phenol, og blandingen I

opvarmes til 65eC. i 10 minutter til smeltning af agaro- I

I sen. Efter centrifugering i 5 minutter ved 12.000 opm i I

I 5 en Eppendorf 5414S bordcentrifuge, ekstraheres den vandige I

I fase med phenol/chloroform og chloroform, fældes med eth- I

I anol, vaskes og tørres og opløses til sidst i 10 μΐ lav I

I TE. I

I 1 μg pBR322 DNA fremstillet under anvendelse af plasmid- I

I 10 fremstillingsmetoden i stor målestok (Maniatis et al., I

I side 86, ref. 5) og renset ved CsCl-gradientcentrifuge- I

ring, spaltes med 5 enh. BamHl i 2 timer ved 37eC i et I

I rumfang på 20 μΐ. Der tilsættes 2 μΐ 10 x ClP-puffer og I

0,02 enh. CIP, og inkubationen fortsættes i yderligere 30 I

I 15 minutter. EDTA tilsættes til én slutkoncentration på 25 I

I mM, og blandingen opvarmes i 10 minutter ved 65°C. Opløs- I

I ningen fortyndes til 200 μΐ med TE og ekstraheres tre I

I gange med TE-mættet phenol, én gang med phenol/chloroform I

I og én gang med chloroform. Efter fældning med ethanol I

I 20 opløses DNA'et i 50 μΐ lav TE. I

I 100 ng fragment-DNA ligeres med 20 ng vektor-DNA i et I

rumfang på 20 μΐ under de i eksepel 1.4 beskrevne betin- I

gelser. Halvdelen af ligeringsblandingen anvendes til I

I transformering af E. coli MH1-kompetente celler, som er I

I 25 fremstillet ved hjælp af CaCl2_nietoden (Maniatis et al., I

I side 250, ref. 5). Celler udplades på LC-agarpi ader, som I

I indeholder 50 μg/ml ampicillin, og der inkuberes natten I

I over ved 37eC. Transformanter testes for tetracyclinføl- I

I somhed ved udstrygning af kolonier først på LC-plader, I

I 30 som indeholder 20 μg/ml Tc, og derefter på LC + amp-pla- I

I der. Transformanter dyrkes natten over i 5 ml LC + amp I

ved 37°C, og DNA isoleres fra 1,5 ml af kulturen under I

anvendelse af den basiske lyseringsminiprepmetode I

(Maniatis et al., side 368, ref. 5). I

41 DK 175534 B1

Miniprep-DNA'erne spaltes med BamHI og PstI, og fragmenterne analyseres på en 1%'s agarosegel. To plasmider, som stammer fra X-PL4, og som indeholder 5,0 kbp Bglll-frag-5 mentet i modsatte orienteringer, betegnes pGW840 og pGW841. Andre plasmider, som stammer fra pCG3Bll, betegnes pGW870 og pGW871. MHl-cellerne, som indeholder dem, opbevares på glycerol ved -70eC. Plasmid-DNA fra 0,5 liter culturer af disse kloner isoleres i stor målestok (Mania-10 tis et al., side 86, ref. 5), renses ved CsCl-centrifu-I gering, behandles med phenol, fældes med ethanol og oplø- I ses i 400 μΐ lav TE. Udbyttet er ca. 500 pg. Plasmiderne I underkastes restriktionskortlægning. Kortet for plasmid I pGW840 er vist i fig. 2, og det kan ikke skelnes fra I 15 kortet for pGW870. Endvidere er det heller ikke muligt at I skelne plasmiderne pGW841 og pGW871, som indeholder I fragmentet i modsat orientering, fra hinanden, hvilket I indicerer identitet af pelD-generne fra A. niger stamme I N400 og stamme M@N756.

20 Eksempel 3.

I Screening for samt isolering og karakterisering af gener I beslægtet med pelD.

I Eksempel 3.1: Tilvejebringelse af hybridiseringsbetin- I gelser ved analyse af genomiske aftryk af I 25 A. niger N400 PNA.

I 2 μg DNA-prøver af A. niger stamme N400, der er isoleret I som beskrevet i eksempel 1.1, spaltes i et rumfang på 20 I /il i 4 timer ved 37°C under anvendelse af BamHI (BRL) I eller Hindlll (BRL) i HHA B/g-puffer. De spaltede prøver I 30 adskilles ved elektroforese på 0,6%'s agarosegeler ved 40 I V i 18 timer. DNA'et overføres til nitrocellulosefiltre og I ovntørres som beskrevet i eksempel 2.3. (Præ)-hybridise- I ringsopløsninger er identiske til de i eksempel 2.1 be- I skrevne.

I DK 175534 B1 I

I 42 I

I Temperaturen, som anvendes til præhybridisering, er hele tiden den samme som hybridiseringstemperaturen. Det nick- I translaterede 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragment af pGW840, som 5 indeholder kodningsområdet for pelD-genet, har været an-

vendt som probe. Hybridiseringen gennemføres ved for- I

I skellige temperaturer (52, 60 og 68 °C) i 16 timer og 40 I

I timer. Der anvendes følgende to vaskningsbetingelser ved I

I de tre forskellige temperaturer: 2 x 30 min 5 x SSC, 0,1% I

10 SDS efterfulgt af 2 x 30 min 3 x SSC, 0,1% SDS sammenlig- I

net med 4 x 30 min 5 x SSC, 0,1% SDS. Ved 68°C foretages I

også to gange vaskning med 2 x SSC, 0,1% SDS og to gange I

I med 0,2 x SSC, 0,1% SDS. Ved 68‘C og ved anvendelse af 0,2 I

I x SSC vaskninger optræder kun homolog hybridisering. An- I

15 vendeisen af højere saltkoncentrationer bevirker tilsyne- I

I komst af nogle andre svage signaler. Ved 52°C er bag- I

grunden høj og hybridiseringen svag. De bedste betingel- I

I ser for "heterolog" hybridisering findes ved 60DC i 40 I

I timer under anvendelse af vaskningskombination af 5 x SSC I

I 20 og 3 x SSC. Disse betingelser kan yderligere optimeres I

I ved anvende 4 x SSC i kombination med 2 x SSC i stedet for I

I 5 x SSC i kombinantion med 3 x SSC. Signalerne, som optræ- I

I der i disse genomiske aftryk af A. niger N400, når der som I

I probe anvendes 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet af pGW840, I

I 25 er anført i tabel I. I

43 DK 175534 B1

Tabel I

Hybridiseringssignaler i genomisk DNA fra A. niger N400 ved anvendelse af 1,6 kb BamHI/Pstl fra pGW840 som probe.

5 BamHI Hindlll

7.5 stærkt homolog pelD 21,0 kbp stærkt homolog pelD

4.5 kbp stærk 3,9 kbp stærk 4,1 kbp svag 7,1 kbp svagere 18,0 kbp svag 4,4 kbp svag 10 4,6 kbp svag 8,4 kbp meget svag 1,5 kbp meget svag I Eksempel 3.2: Screening af biblioteket.

I 2,5 x 10^ fager fra N400-X biblioteket udplades på 5 pla- I der, og der fremstilles 3 nitrocellulosekopier af hver I 15 plade som beskrevet i eksempel 2.1. (Præ)-hybridiserings- I pufferen er også beskrevet i eksempel 2.1. Den første kopi af hver plade hybridiseres ved 60eC i 40 timer med 1,6 kbp I BamHI/PstI-fragmentet af pGW840 og vaskes to gange ved I denne temperatur i 30 minutter med 4 x SSC, 0,1% SDS og 2 I 20 x 30 min med 2 x SSC, 0,1% SDS som beskrevet i eksempel I 3.1. Disse betingelser betegnes som heterologe betingel-

I ser. Den anden kopi fra hver plade hybridiseres ved 68°C

I med det samme fragment, og der vaskes to gange i 30 mi- I nutter med 2 x SSC, 0,1% SDS og 2 x i 30 minutter med 0,2 I 25 x SSC, 0,1% SDS ved denne temperatur. Disse betingelser I betegnes som homologe betingelser. Den tredje kopi af hver I plade hybridiseres homologt med 0,35 kbp BamHI-fragmentet I fra pGW840, som findes i promotorområdet af pelD direkte i I nabostilling til 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragmentet. Der opnås I DK 175534 B1 I 44

29 plaque, som hybridiserer heterologt, men ikke (eller I

I kun svagt) homologt. Disse betegnes λ-PLlOl til X-PL129. I

I Der opnås 19 plaque, som hybridiserer kraftigt homologt og I

I 5 heterologt med BamHI/Pstl-proben. Disse betegnes X-PL130 I

I til X-PL148 og betragtes som værende pelD-kloner. Blandt I

I disse hybridiserer to kun svagt med 0,35 BamHI-proben I

I (X-PL145 og X-PL146), og de indeholder derfor sandsynlig- I

I vis kun en del af promotorområdet. De andre hybridiserer I

10 stærkt. Der opnås kun 1 klon, som kun hybridiserer med I

I 0,35 kbp BamHI-proben (X-PL149). I

I Alle kloner udtages og renses to gange ved udpladning og I

I heterolog hybridisering med 1,6 kbp BamHI/Pstl-proben. I I

I et andet screeningsforsøg opnås desuden 23 pelD-kloner og I

15 25 andre kloner (X-PL151 til X-PL198). I

I Eksempel 3.3: Karakterisering af λ-kloner ved hjælp af I

I plaquehybridiseringssignal med forskellige I

prober afledt af pelD. I

I dette forsøg foretages en klassificering af de isolerede I

20 kloner ved anvendelse af forskellige dele af det kodende I

område af pelD som probe. Der anvendes x-PLIOl til -130, I

-145, medens X-PL4 anvendes som positiv kontrol. Kloner- I

ne udplades, og der fremstilles kun én kopi, som opdeles i I

seks dele. Dette gennemføres for at udligne forskelle i I

25 hybridiseringsssignal mellem kopier. Separate dele af I

disse kopier hybridiseres såvel homologt som heterologt I

med følgende 32p_mærjc6(3e prober: I

1: det komplette 1,6 kbp BamHI/Pstl-fragment fra pGW840, I

2: 649 bp BamHl/XhoI-fragmentet fra pGW840 (N-terminal I

30 kodningsdel af pelD), I

3: 244 bp Xhol/Pstl-fragmentet fra pGW840 (C-terminal I

kodningsdel af pelD). I

DK 175534 B1 I

45 I

X-PL4, -130 opg -145 samt X-PL101 hybridiserer kraftigt I

med disse prober under homologe og heterologe betingelser I

som forventet for pelD-kloner. Sidstnævnte klon, X-PL101, I

5 findes på kanten af filteret i eksempel 3.2 og er derfor I

ikke betegnet som pelD i den første screening. De netop I

omtalte kloner klassificeres som klasse I (pelD)-kloner. I

X-PL112, -126 og -127 viser sig at være negative ved dette I

forsøg. Alle andre kloner kan opdeles i to andre klasser: I

10 Klasse II hybridiserer heterologt ikke blot med hele I

proben, men også med den N-terminale probe. Homolog hybri- I

disering er kun svag med hele pelD-genet som probe. Klas- I

I se III-kloner hybridiserer slet ikke med den N-terminale I

I probe og heller ikke homologt med hele proben. Den C-ter- I

I 15 minale probe hybridiserer ikke med hverken klasse II- I

I eller klasse III-kloner. På baggrund af disse forsøg kan I

I det konkluderes, at der er mindst to beslægtede gener I

I blandt de isolerede kloner. I

I Til klasse Il-kloner hører: X-PL104, -105, -109, -113, I

I 20 -114, -115, -119, -122, -124, -125, -128 og -129. I

I Klasse III-klonerne er: x-PL102, -103, -106, -107, -108, I -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 og -123.

I Eksempel 3.4: Restriktionsanalyse af de isolerede x-kloner I (klasse I, il).

I 25 Pladelysatstamopløsninger, 250 ml flydende lysater og fag- I DNA-præparationerne i stor målestok fra disse lysater I fremstilles som beskrevet i eksempel 2.2. Dette gennemfø- I res for 24 kloner, af hvilke tre er pelD-kloner (X-PL4, I -130 og -145). Et klon-DNA mistes under DNA-isolering I 30 (X-PL124). DNA’et isoleret fra disse kloner spaltes i 1 I μg-prøver i et samlet rumfang på 20 μΐ med 10 enheder I enzym. Alle kloner spaltes med EcoRI, BamHI, Hindlll, I EcoRI/BamHI, BamHI/HinduI, EcoRI/Hindlll og EcoRI/- I BamHI/Hindlll. Fragmenter adskilles på en 0,6% agarosegel I DK 175534 B1

I 46 I

I og overføres til nitrocellulosefiltre som beskrevet i I

I eksempel 2.3. Aftryk hybridiseres heterologt med 1,6 kbp I

BamHI/Psti-fragmentet af pGW840 som beskrevet i eksempel I

I 5 3.1. To kloner hybridiserer ikke (X-PL112 og X-PL129). I

I Båndlængder beregnes ud fra såvel fotografierne som I

I autoradiogrammerne. Med undtagelse af x-PL113-klonen I

I indeholder alle kloner for mange fragmenter til frem- I

I stilling af et fuldstændigt kort. I

I 10 Det er imidlertid muligt at udlede et kort af hybridise- I

I ringsområdet og ved kombination af data på andre ikke- I

I hybridiserende bånd at bestemme, hvilke kloner der er I

I afledt af det samme gen. Det er klart, at blandt de til- I

I bageblevne analyserede 18 klasse II- og III-kloner findes I

I 15 5 gener. Disse kaldes pelA, pelB, pelC, pelE og pelF. I

I Henføringen af kloner til disse gener er vist i tabel II. I

I Tabel II I

I Henføring af isolerede kloner til forskellige pel-gener I

I (del) betyder, at hybridiseringsbåndet kun delvis I

I 20 forekommer i disse kloner. I

I Klasse Gener x-kloner_ I

I I_pelD PL4, PL130, PL145 (del)_ I

I II pelA PL113, PL104, PL115. PL125 (del)_ I

I pelB PL119, PL122, PL128, PL105 (del)_ I

I 25 _pelC PL109___ I

I III pelE PL116, PL107 (del)_ I

I pelF PL102, PL103, PL110, PL120 I

I _PL121 (del), PL123 (del)_ I

Tabel III

47 DK 175534 B1

Sammenligning af hybridiseringsbånd i kromosomale aftryk og isolerede gener. Båndlængden er anført i kbp.

5 _EcoRl_BamHI Hindlll_

Kromosomal 2,9+3,5 7,5 21,0 homologt signal pelD

+ større 4,3 3,9 stærkeste heterologe bånd signaler 18,0 7,1 Svagere signaler 10 4,4 Svage signaler 8,4 4,6 Svage signaler __4,1_1,5 Svage signaler_ pelD 2,9+3,5 7,5 stort pelA 7,5 4,3 3,9 15 pelB 8,7 stort 7,1 pelC 5,0 stort 4,4 pelE 6,2 8,4 4,6 pelF stort 4,1 1,5+2,8 (meget svagt)

En sammenligning af hybridiseringsfragmentlængderme for de 20 isolerede gener og hybridiseringsfragmentlængderne fra ge-nomiske DNA-aftryk er vist i tabel III. På baggrund af disse data kan det konkluderes, at alle båndende, som hybridiserer i genomiske aftryk, findes i de isolerede kloner, og at der under disse hybridiseringsbetingelser 25 ikke kan isoleres andre beslægtede gener. Plaque-hybridi-seringsreseultaterne (eksempel 3.3) viser, at når man ikke betragter partielle kloner, har hvert gen et specifikt hybridiseringsmønster med de testede prober. Resultaterne er anført i tabel IV.

I DK 175534 B1 I

I 48 I

I Tabel IV I

I Sammenligning af signalstyrke for forskellige gener i I

I homolog og heterolog plaquehybridisering med forskellige I

I 5 pelD-prober i overensstemmelse med forsøget beskrevet i I

eksempel 3.3. Hybridiseringsgraden er udtrykt ved antallet I

I af + tegn. Det homologe pelD-gen hybridiserer ved mindst I

I 10 + tegn, ± betyder meget dårlig hybridisering og - I

I betyder ingen hybridisering. I

I 10 _Heterolog hybridisering Homolog hybridisering I

I Probe helt N-termi- C-termi- helt N-termi- C-termi- I

I _gen nal_nal_gen nal_nal_ I

I pelA ++++ ++++ t +++ ± I

I pelB ++++ ++++ ± + ± I

I 15 pelC +++ ++++ - I

I pelE +++ - - - I

I pelF ++++ t ± _-_-_ I

I Eksempel 3.5: Underkloninq af pelD-beslægtede gener i I

I pBR322. I

I 20 Underkloner af hybridiseringsfragmenterne, som er opnået I

I fra x-kloner beskrevet i eksempel 3.3, dannes i vektoren I

I pBR322, som spaltes med EcoRI, BamHI eller Hindlll, hvorpå I

I den dephosphoryleres. Fragmentisolering fra LMP-agarose- I

I geler, vektorfremstilling, ligering, transformation af E. I

25 coli MH1, miniprep-DNA-isolering og plasmidisolering i I

stor målestok gennemføres alle under anvendelse af Stan-

dardmetoder, som er beskrevet ovenfor i eksempel 2.4. I

Fragmenter ligeres til den rigtige vektor som beskrevet i I

eksempel 24. Transformerede E. coli MHl-celler udplades på I

30 LC + 50 /tg/ml Amp. Transformanter testes for tetracyclin- I

følsomhed. EcoRI-kloner er alle resistente. Miniprep- I

DNA'er spaltes derpå med egnede enzymer til test for de I

49 DK 175534 B1 rigtige inserter og til bestemmelse af orienteringen af fragmenterne. De udvalgte plasmider anføres i nedenstående tabel V. Celler, som indeholder dem, opbevares på glycerol 5 ved -70eC.

Tabel V

Underkloner af pel-gener i pBR322.

Plasmid Gen Fragment Oprindelse Orientering pGW820 pelA 7,5 EcoRI X-PL113 2 10 pGW821 4,3 BamHI 2 pGW822 3,9 HindiII 2 pGW823 7,5 EcoRI 1 pGW824 4,3 BamHI 1 PGW825_3,9 Hindlll_1_ 15 PGW830 pelB 7,1 Hindlll X-PL122_1_ PGW850 pelC 5,0 EcoRI X-PL109 1 PGW851_5,0 EcoRI_ 2_ PGW860 pelF 4,1 BamHI X-PL102_1_ pGW880 pelE 4,6 Hindlll X-PL109 1 20 pGW881_4,6 Hindlll_2______

Plasmiderne pGW820, -830, -850, -860 og -880 underkastes isolering i stor målestok og underkastes restriktionskortlægning. Kort for disse plasmider er vist i fig. 1-6.

Til bestemmelse af genets placering og orientering 25 foretages heterolog hybridisering af Southern blots af plasmidspaltninger med 1,6 kbp BamHI/PstI-fragmentet af pGW840, og identiske aftryk hybridiseres heterologt med et N-terminalt fragment af det samme plasmid, som er 649 bp BamHI/Xhol-fragmentet til kortlægning af pGW820 og -830, 30 og 766 bp BamHI/EcoRI-fragmentet til kortlægning af pGW850 og -860.

I DK 175534 B1 I

I 50 I

I Plasmiderne pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 og pGW880 I

I klones i E. coli HB101 og er den 1. februar 1988 deponeret I

I ved Deutsche Sammlung ftir Mikroorganismen, Mascheroder Weg I

I 5 lb, D-38124 Braunschweig, under deponeringsnumrene I

I henholdsvis 4388, 4389, 4390, 4391 og 4392. I

I Eksempel 4. I

I Sekvensbestemmelse af pelD-, pelA-, pelB- og pelC-genet. I

I Eksempel 4.1; Partiel sekvens af pelD-genet fra A. niger I

I 10 stamme N400 og dets identitet med pell fra I

I A. niger stamme N756. I

I Egnede restriktionsfragmenter isoleres fra pGW840 efter I

I LMP-agarosegelelektroforese som beskrevet i eksempel 2.4. I

I Disse restriktionsfragmenter ligeres til M13mpl8RF- og I

I 15 M13mpl9RF-vektorer i overensstemmelse med BRL M13 klo- I

I nings/dideoxy-sekvenseringinstruktionsbogen (side 26 og I

I 27, ref. 6). Transformation af E. coli JM103, udpladning I

I på minimal X-gal-indikatorpiader og isolering af enkelt- I

I strenget DNA fra rekombinant-fager gennemføres i overens- I

I 20 stemmelse med instruktionerne i samme håndbog (side I

I 29-34). Nogle få kloner sekvenseres under anvendelse af I

I Sanger-dideoxykædetermineringsmetoden som beskrevet på I

I side 38-74 i BRL-håndbogen. I

I Sekvenserne bestemt mellem nucleotider -457 og +100 er I

I 25 identiske med den tilsvarende sekvens af PLI-genet afledt I

I af A. niger N756, som forekommer i plasmid pCG3Bll (EP I

I 88.101.397.3). Sekvensen bestemt fra BamHI ved position I

I -457 op til position 100 omfatter 457 nucleotider af I

I promotorsekvensen, de 57 nucleotider, som koder for

I 30 signalsekvensen, og 43 nucleotider, som koder for de I

I første 13 N-terminale aminosyrer i det modne PLD-protein. I

51 DK 175534 B1

Ud fra identiske restriktionskort for N400 pelD-genet i pGW840 og for N756 pelD i pCG3Bll og de helt identiske N-terminale sekvensdata, antages det, at de to gener er 5 identiske. Det antages derfor, at PLD-proteinet er identisk med førnævnte PLI-protein.

Eksempel 4.2; Sekvensbestemmelse af pelA, pelB og pelC-genet.

Fragmenter af pGW820, pGW830 og pGW850 underklones i \ 10 M13mpl8RF og M13mpl9RF (se eksempel 4.1) eller i plasmiderne pEMBL18 og pEMBL19 (Dente et al., ref. 7, 8).

Der opnås enkeltstrengede DNA'er fra plasmidklonerne ved infektion med hjælperfag R408 (Russel et al., ref. 9).

Exonuclease III-sletningskloner fremstilles af pGW850 ved 15 anvendelse af fremgangsmåden ifølge Henikoff (ref. 28).

3,0 kb Smal-Bglll-fragmentet fra pGW850, hvorpå pelC-genet findes, underklones i pEMBL19. 50 μg af denne klon spaltes med Smal og SacI, og efter ekstraktion med phenol/chloroform og fældning med ethanol foretages spaltning med exo-20 nuclease III. Prøver udtages på forskellige tidspunkter, exonuclease III inaktiveres ved tilsætning af NaCl og EDTA og inkubering ved 70eC i 10 minutter. Udragende ssDNA-en-der fjernes ved hjælp af Sl-nuclease, og de klæbrige ender gøres korte med T4-DNA-polymerase. Efter selvligering og 25 transformation af E. coli JM103 med disse sletningskloner, fås enkeltstrengede DNA'er ved infektion med hjælperfag R408- pGW820 sekvenseres fra PvuII-stedet ved position 1000 indtil Clal-stedet ved position 4175 (se fig.

1). I tilfælde af pGW830 sekvenseres 2274 bp Xhol-fragmen-30 tet (se fig. 2). pGW850 sekvenseres fra EcoRI-stedet ved position 0 til position 3168 (se fig. 3).

Sekvensstrategierne for disse gener er vist i fig. 7, 8 og 9. Flere oligonucleotider syntetiseres under anvendelse af phosphoramiditmetoden ifølge Caruther (ref. 10) og

I DK 175534 B1 I

I 52 I

I under anvendelse af et oligonucleotidsyntetiseringsappa- I

I ratur fra Applied Biosystem (model 380B). Disse oligo- I

I nucleotider anvendes som sekvenseringsprimere, og deres I

I 5 position er vist i fig. 7 og 8. I

I Hele sekvensen for pelA-genet er vist i fig. 9 i retningen I

I 3175 bp sekvensen starter med det første nucleotid I

I i PvuII-stedet ved position 1000 i pGW820 og ender ved det I

I sidste nucleotid i Clal-stedet ved position 4175 i pGW820. I

I 10 pelA-Sekvensen indeholder 1360 nucleotider af promotorom- I

I rådet, 1355 rester af strukturdelen og 360 nucleotider af I

I terminatorområdet. I

I Foran aminosyresekvensen for PLA (se eksempel 6.3) findes I

I en signalsekvens på 20 aminosyrer, som kan udledes af I

I 15 nucleotidsekvensen. I

I met-lys-tyr-ser-thr-ile-phe-ser-ala-ala-ala-ala-val-phe-ala-gly- I

I * * * * * * * I

I SER-ALA-ALA-ALA I

I * * * I

I Homologien med signalsekvensen for pelD-genet angives ved I

I hjælp af en stjerne. Endvidere har de første fem rester i I

I det modne protein den samme aminosyresekvens i pelA og I

I 20 pelD. I

I Hele sekvensen for pelB-genet er vist i fig. 10 i retnin- I

I gen 5 '-»3'. 2774 bp sekvensen starter med det første I

I nucleotid i Xhol-stedet i pGW830 og ender ved det sidste I

I nucleotid i det andet Xhol-sted. I

I 25 pelB-Sekvensen indeholder 1133 nucleotider af promotorom- I

I rådet, 1372 rester af strukturdelen og 268 af terminator- I

I området. pelB-Genet koder for en signalsekvens på mindst I

I 20 aminosyrer. I

53 DK 175534 B1 pelC-Sekvensen omfatter 1367 nucleotider af promotorom rådet, 1340 rester af strukturdelen og 461 af terminator-området. pelC-Genet koder for en signalsekvens på 18 5 aminosyrer.

gelC MET-LYS-VAL-PRO X - X -PHE-LEU-GLN-LEU-LEU-CYS-LEU-ASN-ALA-ALA pelB * * * pel A * * * * pelD * * * * pelC LEU-ALA-SER-ALA pelB * * pelA * * pelD * * *

Homologien med signalsekvensen for pelA-, pelB- og pelD-genet er vist i hver enkelt position med en stjerne. X'erne er indsat for at indordne sekvenserne.

10 Undersøgelse for consensussekvenser for exon/intron- splejsningssamlinger og intern intron-sekvens (Ballance, ref. 11) fører til antagelsen af forekomsten af fire introns i plA-, B- og C-genet. Positionerne for disse introns i kodningsområderne i disse pel-gener er bevaret i 15 den forstand, at de er potentielle fem intronpositioner, men i hvert enkelt gen mangler et andet intron. For pelC-genet antages det imidlertid, at der kun forekommer tre introns. Blandt disse findes kun ét i en position svarende ti positionen for et intron i pelD og pelA 20 (intron 5). Positionerne for disse introns og deres respektive længder er vist i tabel Via.

I DK 175534 B1 I

I 54 I

I Tabel Via I

I Positioner for introns i sekvenserne for pelD, pelA, pelB I

I og pelC. Positionerne refererer til kodningssekvenserne i I

I 5 fig. 10, 11 og 12 og til sekvensen for pelD. I

I gen pelD pelA pelB pelC I

I intron position længde position længde position længde position længde I

I bp bp bp bp I

I 1 202-267 66 Langler 1337-1398 62 mangler I

I 2 410-471 62 1708-1759 52 1543-1598 56 mangler I

I 3 598-660 63' 1886-1933 48 1725-1781 57 mangler I

I 4 mangler nangler .mangler 1853-1930 78 I

I . 5 1446-1502 57 2031-2094 64 jmangler 1998-2062 65 I

I 6 mangler mangler jmangler 2232-2294 63 I

I 7 mangler 2329-2382 54 |2113-2169 57 mangler I

I Længderne af exons mellem introns blandt de fire pel- I

I gener er den samme i disse tilfælde. I fig. 13 er vist de I

I indrettede afledte aminosyresekvenser for PLA, PLB, PLC I

I 10 og PLD. I den N-terminale del af kodningsområderne for I

I pelA, pelB og pelD iagttages ca. 80% homologi på basis af I

I nucleotidsekvenshomologi og over 80% på basis af amino- I

I syresekvenshomologi. Denne procentdel er meget lavere ved I

I pelC. I den C-terminale del af pelA, palB og palD efter 1

I 15 resten 285 i det modne protein (svarende til rest 305 i I

I fig. 13) er homologien i stor udstrækning gået tabt og I

I kommer først igen tæt ved C-terminalen. I

I Bortset fra censensussekvenserne for splejsningssignalet I

I og 5'- og 3'-splejsningsstederne (tabel VIb) findes ingen I

I 20 homologi i disse introns. I

55 DK 175534 B1

Tabel VIb

Sammenligning af consensusintronsekvenser.

intron donor binding- acceptor exon 1 intron del intron exon 2

pelD 1 AAGAC GTGAGTTT..32 GGCTGACC..12..TGCCAG TTTCG

pelB 1 AGAAC GTAGGTCG..32..GCCTAACA...8..ATCCAG CTTCG

pelD 2 ACCTA GTAAGTTG..37..TGCTGACA...3..GGATAG CAACA

pelA 2 GAATA GTATGTCC..29.. ATCTAACT...1..GGATAG CTACA

pelB 2 ACTTA GTATGTTG..31..TGCTGATA...3..GTATAG TGATA

pelD 3 ATCCA GTATGCAT..32..AACTAACC...9..CCACAG GAACA

pelA 3 ATCCA GTAGGTTA..25..CTCTAACG...1..AATCAG GAACA

pelB 3 ATCCA GTGAGTGC..33..TGCTAATA...2..GGCCAG GAACA

pelD 5 TTACT GTAAGTCG..31..CACTAATG... 4..CTTCAG ACTGC

pelA 5 TTACT GTACGTCT..40..AGTTAACA...2..TGACAG ACCGC

pelC 5 GCGAG GTAAGACA..39..CGTTGACT...4..GATTAG ACCTC

pelC 6 CCAGA GTACGTGT ..30.. AACTAACA. .11.. TCACAG ACAAC

pelA 7 ACTGT GTAAGTTG..24..ACCTGACT...8..TTGCAG GTCAA

pelB 7 ACGCC GTATGTCG..28..TACTGACA...7..CTACAG GTGAA

CONSENSUS ----- GTA-GT—..24..—CTAAC-...1.. CAG----- g c 40 t G t 12 T a

De afledte aminosyresekvenser for proteinerne PLA, PLB, 5 PLC og PLD viser i alt 359 rester for de første to proteiner, 360 for PLC og 354 for PLD. Med hensyn til N-gly-cosylering findes et potentielt glycosyleringssted i alle fire proteiner ved position 109 (i det modne protein) (for PLC svarer dette til position 105 i den uordnede se-10 kvens). I PLB findes et andet potentielt sted ved position 232, hvorimod der i PLD findes to andre potentielle

I DK 175534 B1 I

I 55 I

I glycosyleringssteder ved resterne 255 og 329. I

I Eksempel 5. I

I Cotransformation af A. nlger under anvendelse af Å. niger I

I 5 pyrA-genet som selektionsmarkør og de forskellige A. niger I

I pel-gener som cotransformerlngsplasmlder. I

I Eksempel 5.1: Propagering og rensning af plasmider, som I

I anvendes til transformation af A. niger. I

I Alle plasmlder propageres i E. coli stamme MH1, og I

I 10 plasmid-DNA udvindes fra 500 ml kulturer, der er dyrket I

I natten over, som beskrevet af Maniatis et al., side 90-91 I

I (ref. 5). Til 2,5 ml DNA-opløsning i TE, som indeholder op I

I til 1 mg DNA, sættes 2,2 g CsCl og 1 ml ethidiumbromid (10 I

I mg/ml) i vand. Opløsningen anbringes i "quickseal"-rør, I

I 15 som fyldes og lukkes som anbefalet af leverandøren I

I (Beckman). Der foretages centrifugering i en VTi I

I 65,2-rotor ved 20°C i 16 timer ved 45.000 opm. Der fås to

I fluorescerende bånd, som er synlige under ultraviolet lys, I

I og det nederste indeholdende plasmid-DNA isoleres ved I

I 20 punktering af røret i siden. DNA-opløsningen (ca. 1 ml) I

I ekstraheres fem gange med butanol mættet med vand til I

I fjernelse af ethidiumbromid. Derefter fældes DNA'et med I

I ethanol, resuspenderes i TE, ekstraheres én gang med I

I phenol/chloroform og chloroform, hvorpå det atter fældes I

I 25 og opbevares ved -20°C. I

I Plasmidet pGW613, som bærer OMP-decarboxylasegenet (pyrA) I

I på et 5 kbp A. niger DNA-fragment, anvendes til I

I selektering af transf ormanter (Goosen et al., ref 12). I

I Plasmider pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 og I

I 30 pGW880, som er beskrevet i eksempel 3.5, anvendes som I

I cotransformationspiasmider. I

57 DK 175534 B1

Eksempel 5.2: Fremstilling af protoplaster og transformation af den urldinauxitrofe mutant A. niger stamme N593.

5 Stammen A. niger N593 (cspA, pyrA), som er et derivat af moderstammen N400, er opnået ved positiv selektion mod den toksiske analoge 5-fluororotsyre som i gær (Boeke et al., ref. 13) i nærværelse af uridin som beskrevet af Goosen et al. (ref. 12).

10 Flydende minimalmedium tilsat 0,5% gærekstrakt, 0,2% casaminosyrer, 10 mM uridin (Janssen Chimica) og 50 mM glucose inokuleres roed 10^ konidiesporer af A. niger N593 pr. ml, og der inkuberes i 20 timer ved 30°C i et rote-I rende rysteapparat fra New Brunswick. Myceliet høstes ved I 15 filtrering gennem "Miracloth", vaskes med iso-osmotisk I (STS) minimalmedium (STC) med følgende sammensætning: 1,33 I M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2 indstillet I på 1,7 mOsm. 1 g mycelium resuspenderes i 20 ml STC.

I Protoplaster frigøres fra myceliet i løbet af 2 timer ved I 20 tilsætning af 250 mg sterilf iltreret "Novozym 234" (Novo I Industri, Danmark), og blandingen inkuberes ved 30°C i et I rysteapparat ved 95 opm. Protoplasteme isoleres fra I restmyceliet ved filtrering gennem en filtertragt med en I glasuldsprop og renses ved centrifugering (10 min. 2500 I 25 opm), ved dannelse af en pellet og ved resuspension i I STC.

I Til transformation udtages 5 x 10^ protoplaster i 200 μ\, I som inkuberes sammen med 1 μς pGW613 og 10 pg af et af I piasmiderne pGW820, pGWB30, pGW850, pGW860 eller pGW880 I 30 (rumfang mindre en 20 μΐ). Til pGW840 anvendes et forhold

I på 1:3 til 6 μg pGW613. Efter tilsætning af plasmid-DNA

I til protoplasteme tilsættes 50 μΐ PCT (10 mM Tris-HCl pH

7,5, 50 mM CaCl2, 25% PEG 6000), og inkubationsblandingen opbevares på is i 20 minutter.

I DK 175534 B1 I

I 58 I

I Derefter tilsættes yderligere 2 ml PCT, og blandingen I

I inkuberes i yderligere 5 minutter ved stuetemperatur. Til I

I sidst tilsættes 4 ml STC, hvorpå der blandes. Alikvoter på I

I 5 1 ml af denne sluttransformationsopløsning blandes med I

I smeltet isoosmotisk MM top-agar stabiliseret med 0,95 Μ I

I saccharose (indstillet på 1,7 mOsm). Protoplastblandingen I

I udplades straks på agarplader, som indeholder det samme I

I isoosmotiske minimalmedium, og pladerne inkuberes ved I

I 10 30°C. Egnede kontrolforsøg indbefatter protoplaster I

I behandlet på tilsvarende måde, men uden plasmid-DNA og på I

I ustabiliseret minimalmedium med 2,5 mM uridin. I

I Efter 3 dages vækst ved 30°C fremkommer der godt voksende I

I transformanter, som danner sporer (50-150 transforman- I

I 15 teτ/μg pGW613). Desuden fremkommer der et stort antal I

I formentlig mislykkede transformanter. Sporer af de enkelte I

I transformanter udtages og udplades separat på 50 mM I

I glucoseminimalmedium til opnåelse af enkelte kolonier, der I

I anvendes til propagering af sporer til yderligere trans- I

I 20 formantanalyser. I

I I hvert enkelt tilfælde dyrkes mindst ti transformanter på I

I flydende minimalmedium, DNA'et ekstraheres og analyseres I for tilstedeværelse af cotransformerende plasmid-DNA.

I Fungalt DNA isoleres ved en lidt modificeret fremgangs- I

I 25 måde, som anvendes til isolering af plante-RNA (Slater, I

I ref. 14). Mycelium vaskes med saltopløsning, fryses i

I flydende nitrogen, og 0,5 g oplukkes under anvendelse af I

I en mikrodismembrator (Braun). Myceliepulveret ekstraheres I med frisk fremstillet ekstaktionspuffer. Ekstraktionspuf-

I 30 feren fremstilles på følgende måde: 1 ml tri-isopropyl- I

I naphthalensulfonsyre (TNS) 20 mg/ml blandes med 1 ml I

I p-aminosalicylsyre (PAS) (120 mg/ml) og 0,5 ml 5 x I

I RNB-puffer (5 x RNB indeholder 121,1 g Tris, 73,04 g NaCl I

I og 95,1 EGTA i 1 liter, pH 8,5). Efter tilsætning af 1,5 I

I 35 ml phenol ækvilibreres ekstraktionspufferen i 10 minutter I

I ved 55eC. Den varme puffer sættes derpå til myceliepulve- I

59 DK 175534 B1 ret, og suspensionen blandes omhyggeligt i 1 minut under anvendelse af en hvirvelblander. Derefter tilsættes 1 ml chloroform, og der blandes i 1 minut.

5 Ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 x G isoleres den vandige fase, hvorpå der ekstraheres endnu en gang med et tilsvarende rumfang phenol/chloroform (1:1) og derpå to gange med chloroform.

Den vandige fase indeholder både RNA og DNA. DNA’et fældes 10 med 2 rumfang ethanol ved stuetemperatur og samles ved centrifugering i 10 minutter ved 10.000 x G, vaskes to gange ved genopløsning i destilleret sterilt vand og fældning med ethanol. RNA fjernes ved tilsætning af RNase A (20 μg/ml) til slutopløsningen. Ved fremgangsmåden fås 15 DNA med høj molekylvægt (100-200 kbp) i et udbytte på ca.

300 /tg DNA/g mycelium, som yderligere renses ved CsCl/ethidiumbromid-vægtfyldegradientcentrifugering i alt væsentligt som beskrevet af Maniatis et al., side 93 (ref.

5).

20 Spaltning af det kromosomale DNA (2 /ig) gennemføres ved inkubering i 2 timer ved 37eC med EcoRI for pelA (pGW820) og pelC (pGW850) transformanter, HindiII for pelB (pGW830) transformanter, EcoRI eller Bglll for pelD-transformanter.

1 alle tilfælde anvendes i begyndelsen 20 enheder restrik-25 tionsenzym, hvorefter inkuberingen forlænges i yderligere 2 timer ved tilsætning af yderligere 20 enheder af restriktionsenzymerne. Spaltningerne gennemføres i de egnede reaktionspuffere leveret af BRL.

Derefter fraktioneres DNA’et på 0,6% agarosel, aftrykkes 30 på nitrocellulose og hybridiseres i alt væsentligt som beskrevet af Maniatis et al., side 382-386 (ref. 5), idet der anvendes de tilsvarende [α-^^P ]-mærkede prober.

I DK 175534 B1 I

I 60 I

I Der opnås følgende cotransformationsfrekvenser: pGW820 I

I (pelA) 70%, PGW830 (pelB) 70%, pGW840 (pelD) 15% og pGW850 I

I (pelC) 60%. I

I 5 Masseforholdet mellem pGW613 og det cotransformerende I

I plasmid pGW820, pGW830, pGW850 (1:10) og pGW840 (1:3) fø- I

I rer i størsteparten af de iagttagne tilfælde til flerkopi- I

I kromosomalintegration af cotransformationsplasmiderne. I

I Eksempel 5.3: Genomisk analyse af den pelA transformerede I

I 10 A. niger stamme A15. I

I Et antal af de i 5.2 beskrevne flerkopitransformanter ana- I

I lyseres, og analysen af pelA-transformanten Al5 beskrives I

I detaljeret i det følgende. I

I DNA fra A. niger stamme N593 og fra flerkopitransforman- I

I 15 ten pelA stamme Al5 isoleres og analyseres ved hybridise- I

I ring af Southern blot som beskrevet i eksempel 3.1. Som I

I pelA-probe anvendes 7,5 kbp EcoRI-fragmentet (se fig. 3a). I

I I det genomiske aftryk findes et intenst bånd på 7,4 kbp i

I den transformerede stamme A15, hvilket er et resultat af I

I 20 type I- og/eller type Il-integrationer (jf. Hinnen et al., I

I ref. 14a). Der findes også nogle mindre bånd af forskellig I

I længde, som repræsenterer grænsefragmenter af type II- I

I integrationshændelser ved genomlejringer.

I De optiske tætheder for 7,4 kbp EcoRI-båndene i A. niger I

I 25 pelA transformanter A15 og A. niger N593 autoradio- I

I grammerne scannes under anvendelse af et Ultroscan XL I

I (LKB)-apparat. Værdierne korrigeres for små forskelle i

I DNA-koncentrationen mellem N593 og transformanten A15 ved I

I scanning af tæthederne opnået med en anden probe, der I

I 30 hybridiserer med pyruvatkinasegenet, og som forekommer som I

I enkelt kopi i begge stammer. Ud fra disse data beregnes I

I det, at der i pelA-transformanten A15 findes ca. 19 I

I intakte kopier af pelA-genet. I

61 DK 175534 B1

Under anvendelse af Hindlll-insertet fra pGW830 (fig. 3b) som probe indicerer analyse af Southern-blottet af den transformerede stamme Al 5, at der ikke er sket integrering 5 af pelA-sekvenser i pelB-stedet. Ligeledes giver analyse af den transformerede pelB stamme B13, pelC stamme C16 og pelD stamme D12 med de egnede tilsvarende prober kopital på henholdsvis ca. 15, 50 og 10.

Eksempel 5.4: Northern blot-analyse af induceret og ikke-10 induceret mycelium af den pelA-transforme rede A. niger stamme Al5 og af A. niger N400 I 250 ml minimalmedium indeholdende 50 mM glucose eller 1% I (v/r) æblepectin (brown ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, I Bischofszell) inokuleres ved en sporetæthed på 10^ I 15 sporer/ml med sporer af transformant A15 eller sporer af I vildtypestammen N400. Der høstes efter 30 timer vækst ved I 30°C. 2 ml-prøver af dyrkningsmediet udtages også, hvorpå

I det dialyseres mod 2 liter 10 mM natriumphosphatpuffer pH

I 7,0 ved 4°C og opbevares ved -2QeC.

I 20 Nucleinsyrer isoleres fra myceliet som beskrevet i I eksempel 5.2. RNA’et fældes fra den vandige fase efter I ekstraktion med chloroform ved tilsætning af 1/3 rumfang 8 I M LiCl. Opløsningen blandes omhyggeligt og inkuberes I natten over ved 0°C. RNA’et isoleres ved centrifugering I 25 ved 300 opm i 30 minutter under anvendelse af en MSE- I Super-Minor-centrifuge, hvorpå der vaskes én gang med I koldt <-20°C) 2 M LiCl og én gang med koldt (-20*0 96%'s I ethanol. Til sidst opløses RNA’et i destilleret vand ved I en koncentration på ca. 1 mg/ml. Præparationerne er stort I 30 set fri for DNA med et udbytte på 1-2 mg RNA pr. g myce- I lium. Mængder på ca. 10 μ g RNA sættes på denaturerende I formaldehyd 1% agarosegeler i overensstemmelse med I fremgangsmåden iølge Maniatis et al., side 202-203 (ref.

I 5) under anvendelse af Hindlll-spaltet x-DNA eller I 35 RNA-referencen fra BRL som molekylvægtsmarkører. Gelerne

I DK 175534 B1 I

I 62 I

I aftrykkes og opvarmes på "Nytran" (Schleicher og Shilll) I

I som anbefalet af producenten og hybridiseres ved 68°C i 16 I

I timer med 7,4 kbp EcoRI pelA DNA-proben. Hybridiserings- I

I 5 og vaskningsprocesserne gennemføres som beskrevet for I

DNA-hybridisering under homologe betingelser i' eksempel I

I 3.2. I

I Begge A. niger-stammer producerer et pectin-inducerbart I

I mRNA med en længde på ca. 1,6 kbp. Scanning af de to I

10 audioradiogrammers optiske tætheder indicerer en 15-20 I

I ganges intensitetsforskel mellem A15-transformanten og I

I vildtypestammen, hvilket stemmer overens med forøgelsen af I

I kopital betegnet ud fra Southern blot-analysen. I

I Eksempel 5.5: Pectinlyaseproduktion ved hjælp af den I

I 15 transformerede A. niger stamme D12. I

I A. niger pelD-transformanten D12 opnået ifølge eksempel I

I 5.2 dyrkes i en totrinsdyrkningsproces svarende til frem- I

I gangsmåden beskrevet af Hermersdflrfer et al. (27) til I

I fremstillingen af polygalacturonase. Et myceliumlag dannes I

I 20 på toppen af en væskekultur ved at modulere 10^ sporer pr. I

I ml prædyrkningsmedium (PCM) bestående af sukkerroepulp I

I (4%) og NH4NH3 (1%) pH 4,5. Efter en vækstperiode på 5 I

I dage ved 30°C vaskes myceliet dyrket i 30 ml medium med I

I saltopløsning og overføres til 50 ml hoveddyrknings- I

I 25 medium (MCM). Denne kultur dyrkes ved 30eC i et rote- I

I rende rysteapparat ved 100 opm. MCM har følgende sammen- I

I sætning pr. liter medium: glucose (5%), pectil (d.e. I

I 72,8%, 0,1%), NH4NO3 (0,75%), KH2PO4 (0,5%), FeS04-7H20 I

I (0,03%), MgS04 * 7H20 (0,03%), CaC03) (0,03%), NaN03 I

I 30 (0,03%), pH 4,5. I løbet af 24 timer udtages prøver til I

I forskellige tidspunkter og analyseres ved hjælp af SDS I

I polyacrylamidgelelektroforese. Udtrykkeisen af pelD er I

I allerede maksimal efter 7 timers dyrkning. Proteinet H

I migrerer identisk med PLI, der anvendes som reference.

63 DK 175534 B1

Eksempel 5.6; Pectinlyase A-produktion ved hjalp af den transformerede A. niger A15 og ved hjælp af A. niqer N400.

5 De dialyserede kulturfiltrater fra eksempel 5.4 lyofili-seres, resuspenderes i 0,2 ml destilleret vand og underkastes SDS-polyacrylamidgelelektroforese (10%'s geler) under anvendelse af standardfremgangsmåder (Laemmli, ref.

15). De isolerede proteiner overføres til nitrocellulose 10 (Towbin et.al., ref. 16). Aftryk mættes 5 timer ved stuetemperatur med 1% BSA-opløsning i 10 mM Tris-HCl-puffer pH 7,5 med 0,35 M NaCl. Derefter foretages inkubering i 16 timer ved stuetemperatur med polyklonalt antistof (0,1%) udviklet mod to pectinlyaser og renset ifølge van 15 Houdehoven (1975) i 50 ml af den samme puffer indeholdende I 150 mM NaCl, 0,5% BSAm, 1% "Triton" X100, 0,5% deoxycholat I og 0,1% SDS. Aftryk skylles derpå fem gange med 200 ml I PBS, hvorpå der inkuberes med 30 μΐ ged-anti-kanin-IgG- I HRP (Sigma) som 2. antistof pr. 50 ml, og der vaskes atter I 20 fem gange med PBS. Aftrykkene farves til sidst under I anvendelse af 4-chlor-l-naphthol som substrat. 40 mg af I substratet opløses i 0,5 ml 96%’s ethanol og blandes med I 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5 og 30 μΐ .30%'s hydrogen- I peroxid, hvorpå blandingen sættes til aftrykkene.

I 25 Eksempel 5.7: Screening af pelA-transformerede stammer I ved hjælp af farvedannelse på pectinholdige I faste medier.

I Konidier af pelA-transformerede stammer inokuleres ved en I sporetæthed på ca. 40 kolonier pr. petriskål på sterile I 30 papirfiltre (Schlericher og Schflll), som anbringes oven på I 1% agarstørknet minimalmedium indeholdende 0,01% "Triton” I X100 og 1% æblepectin (d.e. 72,8% Obipektin) som carbon- I kilde. Inkuberingsperioden er 72 timer ved 30°C, og der I opnås individuelle kolonier (2-4 mm). Papirfiltrene over- I 35 føres til en anden steril petriskål, og skålen indeholden-

I DK 175534 B1 I

I 64 I

I de mediet farves med mindst 5 ml opløsning af ruthenium- I

I rødt (0,1% v/r) i destilleret vand, hvorpå der inkuberes i I

I 2 timer og derpå vaskes flere gange med destilleret vand I

I 5 til fjernelse af det ikke-adsorberede farvestof. Der an- I

I vendes stort set den af Ried og Collmer (ref. 17) beskrev- I

I ne fremgangsmåde for polygalacturonat til karakterisering I

I af bakteriel pectatlyaseenzymaktiviteter. I

I Transformanter, som overproducerer PLA-protein, påvises I

I 10 ved en forøgelse af diameteren af den farvede ring omrking I

I de enkelte kolonier sammenlignet med moderstammen N400. I

I Eksempel 6. I

I Isolering, rensning og karakterisering af pectinlyase A I

I (PLA) fra A. niger pelA-transformanten Al5. I

I 15 Eksempel 6.1: Dyrkningsbetingelser til fremstilling af I

I pectinlyase A. I

I A. niger pelA-transformanten Al5 beskrevet i eksempel 5 I

I dyrkes på komplet medium i petriskåle i 3 dage ved 28°C I

I til dannelse af konidier. Konidierne høstes fra disse I

I 20 plader ved at suspendere sporerne i 5 ml steril saltop- I

I løsning indeholdende 0,005% "Tween" 80. Suspensionen I

I omrøres kraftigt på et Griffin-rysteapparatur i 20 I

I minutter. Minimalmedium (ref. 21) indeholdende 1% (v/r)

I æblepectin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, I

I 25 Bischoffzell) inokuleres ved en sporetæthed på 10^

I sporer/ml under anvendelse af 250 ml medium i 1 liter I

I siliconebehandlede Erlenmeyerkolber. Myceliet dyrkes i 40 I

I timer ved 30°C under anvendelse af et Gallenkamp roterende I

I rysteapparat ved 200 opm. Efter dyrkning frafiltreres I

I 30 myceliet over "Miracloth" under anvendelse af en Bflchner- I

I tragt. Dyrkningsfiltratet (ref. 21) fortyndes med I

I destilleret vand (ref. 21), filtratets pH-værdi (pH 3,7) I

I indstilles på pH 6,0 under anvendelse af 1 N NaOH-opløs- ning, hvorefter der igen filtreres under anvendelse af

Whatman 1-filtrerpapir.

65 DK 175534 B1

Eksempel 6.2: Rensning af PLA.

5 Det fortyndede dyrkningsfiltrat (4 liter) sættes på en DEAE-"Sepharose" Fast Flow (Pharmacia)-søjle (10 x 2,6 cm), som er forækvilibreret med 20 mM natriumphosphatpuf-fer pH 6,0. Søjlen elueres med den samme puffer, indtil absorbansen ved 280 nm når en værdi, som er mindre end 0,1 10 O.D. Derpå elueres pectinlyaseaktivitet fra søjlen ved anvendelse af en lineær gradient sammensat af 20 mM natriumphosphatpuffer (150 ml) og 20 mM natriumphos-phatpuffer indeholdende 1 M NaCl (150 ml).

I Fraktionerne analyseres for tilstedeværelse af aktiv I 15 pectinlyase under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet I af van Houdenhoven (ref. 18, side 11), idet man anvender I Brown Ribbon-pectin (d.e. 72,8%) som substrat. Aktiviteten I findes omkring en koncentration på 0,43 M NaCl i saltgra- I dienten. Aktive fraktioner hældes sammen og dialyseres to I 20 gange mod 1 liter 20 mM piperazin-HCl-puf fer pH 5,5- I (prøvestørrelse: 45,5 ml).

I I det næste trin opdeles den dialyserede prøve i tre lige I store dele, som underkastes anionbytterkromatografi i tre I særskilte processer under anvendelse af en standard-Phar- I 25 macia MONO Q-kolonne i kombination med Pharmacia PFLC-sy- I stemet. Søjlen er forækvilibreret med 20 mM piperazin-HCl- I puffer pH 5.5. Efter påsætning af enzymprøven elueres I søjlen med den samme puffer ved en flow-rate på 1 ml/min., I indtil man atter når grundlinieabsorbansen. Derefter I 30 anvendes en lineær saltgradient. Når der er tilsat 22 ml I af elueringspufferen til søjlen, nås en slutkoncentration I af NaCl på 0,6 M.

I DK 175534 B1

66 I

I Den aktive fraktion (4,4 ml) samles, fortyndes til 25 ml I

med ækvilibreringspuffer, og kromatograferingsprocessen I

gentages. I

I 5 To fraktioner, som indeholder det aktive enzym (samlet I

I rumfang 3 ml) dialyseres derpå mod en 25 mM piperazin- I

I puffer pH 5.0 og injiceres i 1 ml-portioner på en I

I MONO-P-søjle (Pharmacia), som i forvejen er ækvilibreret I

med den samme puffer. Efter injiceringen dannes en I

10 pH-gradient under anvendelse af en 5%'s opløsning af I

I polypuffer TM 74 (i destilleret vand indstillet på pH 3,0 I

I med 4 N saltsyre). Det aktive enzym (3,2 ml) findes I

omkring pH 3,2. Præparationen dialyseres kraftigt mod 50 I

mM natriumphosphatpuffer pH 6,0 og opbevares ved -20°C. I

I 15 Rensningsresultateme er anført i tabel Vila og er I

I sammenlignet med data for en lignende rensning af I

I pectinlyase produceret af A. niger stamme N400 (tabel I

I Vllb). I

67 I

DK 175534 B1 I

Tabel Vila og Vllb I

Rensning af pectinlyase A fra A. niger pel A N593-trans- I

formant og pectinlyase fra A. niger stamme N400. I

5 Vila I

Trin Rumfang Total Specifik pectin- I

ml aktivi- lyaseaktivitet I

tet (I.E./mg protein) I

(I.E.) I

I 10 DEAE "Sepharose" 45,5 39,8 4,9 I

I MONO Q kromatografi 2,3 19,9 18,4 I (2 x) I MONO P kromatografi 3,2 17,4 28,6 I Vllb vildtype I 15 DEAE "Sepharose" 43,0 10,1 0,9 I MONO. Q kromatografi 1,1 2,5 6,3 I (2 x) .

I MONO P kromatografi 1,4 1,7 10,0 I Proteinkoncentrationerne bestemmes under anvendelse af I 20 BCA-proteinanalysereagenset (Pierce) i overensstemmelse I med producentens anvisninger.

I Sammenlignet med totalaktiviteten for vildtypen er I totalaktiviteten for A. niger N592 transformeret med I pGW820 steget efter rensning ca. 10 gange og den I 25 specifikke aktivitet ca. 3 gange.

I DK 175534 B1 I

I 68 I

I Eksempel 6.3: Aminosyresekvensbestemmelse for den N-terml- I

I nåle del af pectinlyase A. I

500 /tg pectinlyase (PLA), som er renset som beskrevet i I

5 eksempel 6.2, dialyseres tre gange mod 1 liter Millipore- I

I filtreret destilleret vand og lyofiliseres. Aminosyre- I

I sekvenserne bestemmes ved hjælp af et proteinsekvense- I

I ringsapparat fra Applied Biosystems model 470A, som er on I

I line-forbundet med et 120 A PTH analyseapparat, idet man I

I 10 anvender fremgangsmåden beskrevet af Hunkapiller (ref. I

I i7>* I

Følgende N-terminale aminosyresekvens bestemmes for I

I enzymet: I

I val-gly-val-ser-gly-ser-ala-glu-gly-phe-ala-glu-?-val-thh- I

I 15 GLY-GLY-GLY-ASP-ALA. I

I Den således bestemte aminosyresekvens svarer nøjagtigt til I

I sekvensen baseret på nucleotidsekvensen for pelA-genet (se I

I eksempel 4.2). I

I Eksempel 6.4: Pectinlyase A*s egenskaber. I

I 20 Både A. niger stamme N400 og pelA-transformanten Al 5 I

I dyrkes som beskrevet i eksempel 6.1, og enzymet oprenses I

fra dyrkningsfiltraterne under anvendelse af fremgangs- I

måden beskrevet i eksempel 6.2. De således opnåede to I

enzympræparater sammenlignes med pectinlyase II, som er I

25 renset i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge van I

Houdenhoven (ref. 18). I

Ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af I

10%'s geler opnås et enkelt bånd med identisk molekylvægt I

i alle tre tilfælde, idet der i hvert enkelt tilfælde I

30 anvendes 2-5 ^g protein. I

69 DK 175534 B1

Der gennemføres isoelektrisk fokusering under anvendelse af standardfremgangsmåder (se eksempelvis instruktionerne fra Pharmacia, Isoelectric Focussing, 1982). Der an-5 vendes et FSBE-3000 apparat og den tilsvarende strømforsyning ECPS 3000/150 (Pharmacia). Det opnåede PLA er homogent ved isoelektrisk fokusering og har et lavere isoelektrisk punkt (0,2 pH enheder) end PLI I, der af van Houdenhoven (ref. 18) er angivet til at være 3,75. PLI I 10 oprenset fra N400 dyrkningsfiltratet er heterogent ved isoelektrisk fokusering. Hovedbåndet har en position I svarende til PLA-proteinet. To mindre bånd forskydes svagt I mod katoden. I A. niger-flerkopitransformanten A15 mangler I således de mindre enzymformer, som findes i N400.

I 15 En direkte sammenligning af de kinetiske parametre for PLA

I og PLII, som for sidstnævntes vedkommende er bestemt af I van Houdenhoven (ref. 18), under anvendelse af 95%'s I forestret æblepectin som substrat giver identiske Km- og I Vmax-værdier for de to enzymer.

I 20 Eksempel 7.

I Isolering, rensning og karakterisering af pectinlyase D

I (PLD) fra A. niger pelD-transformanten D12 I Eksempel 7.1: Dyrkningsbetingelser til fremstilling af I af pectinlyase D.

I 25 A. niger pelD-transformanten D12 opnået ifølge eksempel I 5.2 dyrkes i starten af under anvendelse den i eksempel I 5.5 beskrevne fremgangsmåde i 300 ml alikvoter. Efter en I vækstperiode på 5 dage i PCM ved 30°C overføres mycelie- I laget til 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 5,0) indehol- I 30 dende 0,1 M natriumchlorid. Ved rystning af myceliet i 150 I ml på et roterende rysteapparat ved 200 opm i 2 timer I afgives størsteparten af pectinlyasen til mediet.

I DK 175534 B1 I 70

I Eksempel 7.2: Rensning af PLD. I

I Efter fjernelse af myceliet ved filtrering sættes enzym- I

I opløsningen til en DEAE-"Sepharose" Fast Flow (Pharma- I

I 5 cia)-søjle (25 x 1,25 cm), som forinden er ækvilibreret I

I med 20 mM natriumphospha tpuf fer (pH 6.0), indeholdende 0,2 I

I M natriumchlorid. Søjlen elueres med den samme puffer, I

I indtil absorbansen med 280 nm når en værdi på mindre end I

I 0,1. Pectinlyaseaktivitet elueres fra søjlen ved anvendel- I

I 10 se af en lineær natriumchloridgradient (0,2-0,7 M) i 20 mM I

I natriumphosphatpuffer (pH 6,0) (800 ml totalt rumfang). I

I Fraktionerne screenes for tilstedeværelse af pectinlyase D I

I ved hjælp af SDS-polyacrylamidgel-elektroforese og Western I

I blotting (Towbin et al., ref. 16) som beskrevet ovenfor i I

I 15 eksempel 5.6. Fraktioner indeholdende pectinlyase D hældes I

sammén og dialyseres mod 20 mM natriumphosphatpuf fer (pH I

I 6,0) indeholdende 0,15 M natriumchlorid og underkastes I

I anionbytterkromatografi under -anvendelse—af—en—s.tandar.d=_ I

I MONO Q-søjle (Pharmacia) i kombination med FPLC-systemet. I

20 Efter påsætningen vaskes søjlen med den samme puffer inden I

anvendelse af en 50 ml lineær natriumchloridgradient i 20 I

mM natriumphosphatpuffer (pH 6,0). Aktive fraktioner hæl- I

des sammen, og alikvoter på 1 ml sættes på en 100 ml "Su- I

perose-12"-gelpermeeringssøjle ækvilibreret i 20 mM na- I

25 triumphosphat (pH 6,0) indeholdende 0,2 M natriumchlorid I

og forbundet til FPLC-systemet. Fraktioner med aktive I

enzymer (fraktionsstørrelse 1 ml) fra GPC-søjlen analyse- I

res ved hjælp af SDS-polyacrylamidgelelektroforese for at I

kontrollere den opnåede pectinlyases renhed. I

DK 175534 B1 I

71 I

Tabel VIII I

Rensning af pectinlyase D fra A. niger pelD-transformant I

D12. I

5 Trin Rumfang Aktivitet Specifik pectin- I

(ml) (I.E.) lyaseaktivitet I

__(I.E./mg protein) I

I Kulturfil- I

I trat 1950 109 0,096 I

I 10 DEAE-"Sepha- I

I rose" FF 103 32,2 5,65 I

I MONO Q og GPC 14,5 10,4 7,5 I

I Eksempel 7,3: Aminosyresekvensbestemmelse for den N-ter- I minele del af pectinlyase D.

I 15 500 /ig pectinlyase D, som er renset som beskrevet ovenfor I i eksempel 6.2, dialyseres tre gange mod 1 liter Milli- I pore-filtreret destilleret vand og lyofiliseres. Amino- I syresekvenser bestemmes ved hjælp af et proteinsekvense- I ringsapparat fra Applied Biosystems model 470a, som er on I 20 line-forbundet med et 120A PTH-analyseapparat, under I anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Hunkapillar I (ref. 19).

I Følgende N-terminale aminosyresekvens bestemmes for I enzymet: I 25 VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PHE-ALA-SER-SER-ALA-

I THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA-THR

I DK 175534 B1 I

I 72 i

I Den bestemte aminosyresekvens svarer nøjagtigt til I

I sekvensen baseret på nucleotidsekvensen for pelD-genet. I

I Eksempel 8. I

I 5 Isolering, rensning og karakterisering af pectlnlyase B I

I (PLB) fra A. niger-transformanten B13. I

I Eksempel 8.1: Dyrkningsbetingelser til fremstilling af I

I peotinlyase B. I

I A. niger pelB-transformanten B13 fremstillet under anven- I

I 10 delse af den ovenfor i eksempel 5.2 beskrevne fremgangs- I

I måde, analyseres med hensyn til flerkopikarakter under I

I anvendelse af fremgangsmåden i eksempel 5.3. Northern I

I blot-analyse gennemført under anvendelse af fremgangsmåden I

I beskrevet i eksempel 5.4 viser, at der dannes et pectin- I

I 15 inducerbart mRNA med en længde på ca. 1,6 kb. Der fore- I

I tages dyrkning i 35 timer ved 30°C i minimalmedium inde- I

I holdende 1% (v/r) citruspectin (d.e. 72,8%) og 1% hvede- I

I klid til dannelse af enzymet under anvendelse af den i I

I eksempel 5.4 beskrevne fremgangsmåde. Endvidere fremstil- I

I 20 les enzymet under anvendelse af et medium sammensat af 4% I

I (v/r) sukkerroepulp og 1% NH4NO3. I

I Eksempel 8.2: Rensning af PLB. I

I Kulturfiltratet fortyndes to gange med destilleret vand, I

I og pH-værdien indstilles på pH 6,0 under anvendelse af 1 N I

I 25 NaOH-opløsning, hvorpå der atter filtreres under anvendel- I

I se af Whatman 1-filtrerpapir. Det fortyndede filtrat (2 I

I liter) sættes derpå til en DEAE-"Sepharose" Fast Flow

I (Pharmacia)-søjle (9 x 3,2 cm), som er ækvilibreret med 50 I

I mM natriumacetatpuffer pH 5,0. En del af pectinlyaseak- I

I 30 tiviteten findes i eluatet, hvilket kan analyseres ved I

I anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af van Houdenhoven I

I (ref. 18, side 11) under anvendelse af Brown Ribbon-pectin I

73 DK 175534 B1 (d.e. 72,8%) eller højforestret pectin (d.e. 94%). Størsteparten af pectinlyaseaktiviteten kan elueres ved anvendelse af en saltgradient. Denne aktivitet forekommer i 5 saltgradienten og viser sig at være identisk med PLA på grundlag af opførslen ved eluering og tilsyneladende molekylvægt på SDS-polyacrylamidgelelektroforese som beskrevet i eksempel 6.

Eluatet fra DEAE Fast Flow-søjlen dialyseres mod destil-10 leret vand og sættes på en MONO S-søjle (Pharmacia), som i forvejen er ækvilibreret med en 20 mM natriumacetatpuffer pH 4,5. Enzymet elueres fra søjlen ved anvendelse I af en 0-1,0 M natriumchloridsal tgradient i den samme I puffer. Enzymet elueres næsten med det samme fra søjlen.

I 15 Aktive fraktioner hældes sammen, og der fortyndes ca. fire I gange med destilleret vand. Ved rekromatografering af I enzymopløsningen fås fraktioner, som på grundlag af I SDS-polyacryrami'dgeTeTéktroforese indeholder-det-rene--—— I PLB-protein.

I 20 Eksempel 8.3: Pectinlyase B*s egenskaber.

I Egenskaberne af det rensede enzym fra pelB-transformanten I B13 ifølge eksempel 8.2 bestemmes og sammenlignes med I egenskaberne af pectinlyase A og D.

I SDS-polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af I 25 10%*s geler resulterer i et enkelt bånd med en tilsyne- I ladende molekylmasse på 39,7 kDa. Under de samme betin-

I gelser er den tilsyneladende molekylmasse for PLA og PLD

I henholdsvis 49,1 kDa og 52,3 kDa.

I Der gennemføres isoelektrisk fokusering som beskrevet i I 30 eksempel 6.4. Det isoelektriske punkt for PLB er 6,0 ved I anvendelse af en pH-gradient mellem pH 3 og 7. Prøven I påføres omtrentlig ved en position svarende til en I pi-værdi på 5,0.

I DK 175534 B1 I

I 74 I

I Det rensede enzym PLB reagerer også med polyklonale I

I antistoffer fremstillet mod PLI og PLII ved testning ved I

I hjælp af Western blot-analyse. Der kan let skelnes mellem I

I 5 PLD, A og B på denne måde ved hjælp af deres tilsynela- I

dende molekylmasseværdier. I

I Eksempel 8.4: Kinetiske egenskaber ved PLB. I

I Enzymet, som er renset under anvendelse af fremgangsmåden I

I i eksempel 8.2, karakteriseres kinetisk. Enzymet kataly- I

I 10 serer en pectinlyasereaktion og er aktivt over et bredt I

I pH-område (pH 5-9/5) ved afprøvning i Mc Ilvaine-puffer (μ I

I =0,5) med forskellige pH-værdier (van Houdenhoven, ref. I

I 18). pH-optimumet er bredt (pH 7,5-8,5). Ved pH 6,0 er I

I aktiviteten ca. 55%, ved pH 9,5 er den stadig 85% af I

I 15 aktiviteten ved pH 8,0. Som substrat kan anvendes såvel I

I højforestret pectin (d.e. 94%) samt pectiner med lavere I

I esterificeringsgrad såsom Brown Ribbon-æblepectin (d.e. I

I 72,8%, Obipektin AG, Bischoffzell). Den højeste aktivitet I

I opnås imidlertid med højforestret pectin. Enzymet reage- I

I 20 rer ikke med polygalacturonat. I

I Pectinlyasereaktionen katalyseret af PLB kan hæmmes ved at I

I sætte EDTA til reaktionsblandingen (der anvendes en slut- I

I koncentration på 3 mM). Enzymet genaktiveres ved tilsæt- I

I ning af overskud af Ca2+-ioner. pelB koder således for en I

I 25 Ca2+-afhængig pectinlyase. Ved 25eC har enzymet et om- I

I trentligt omdannelsestal (turn-over number) på 6500 og en I

I Km-værdi på 2,5 mM, når der som substrat anvendes høj- I

I forestret pectin. Disse værdier er bestemt under anvendel- I

I se af fremgangsmåden ifølge van Houdenhoven (ref. 18) og I

30 under anvendelse af Mc Ilvaine-puffer med pH 8,0 (|i = I

I 0,5). I

75 DK 175534 B1

Eksempel 9.

Ekspression og sekretion af fremroedgener under kontrol af pelA-promotoren♦ 5 3,9 kb Hindlll-fragmentet af plasmid pGW820 underklones i

Hindlll-stedet i pBR322. Plasmid-DNA'et fra ampieillin-resistente transformanter analyseres ved hjælp af restriktionsspaltninger med Hindlll og Sall. En klon, som indeholder pelA-insertet i orientering med uret betegnes 10 som pGW822. Den inducerbare promotor for pelA anvendes til at udtrykke fremmedgener i A. niger. Det komplette pelA-gen findes på plasmid pGW822. Promotoren og pelA-signalsekvensen findes på et 1 kb BamHI-Psti-fragment. PstX-spaltningsstedet ved nucleotidposition 1420 (fig. 10) 15 stemmer overens med 3'-enden af signalsekvensen og kan anvendes til "in frame"-fusionen til kodningssekvensen for et fremmed protein. Transcriptionsstopsignaier for pelA er på et 1,3 kb Sall-HindlII-fragment.

Eksempel 9.1: Underkloning af pelA-genet i vektor pUC19.

20 3,3 kb BamHI-Hindlll-fragmentet af plasmid pGW822 indeholder pelA-genet. Fragmentet klones i vektoren pUC19 (Pharmacia) skåret med BamHI og Hindlll. De rensede fragmenter ligeres. En alikvot af ligeringsblandingen anvendes til at transformere Ca2+-behandlede, kompetente 25 JMl09-celler. Der selekteres for heldig kloning af 3,3 kb BamHI-HindiII-fragmentet i pUC19 på ampicillin-plader i nærværelse af X-gal og IPTG (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, side 52). Der udtages hvide, 30 ampicillin-resistente transformanter. Plasmid-DNA fra disse kolonier analyseres ved hjælp af BamHI-Hindlll-dobbeltspaltninger. En transformant med en korrekt insert betegnes pUC19/pelA. En analog konstruktion med pUC18 fører til pUC18/pelA.

I DK 175534 B1 I 76

I Eksempel 9.2: Ekspression af humant hybridinterferon I

I BDBB under kontrol af pelA-promotoren. I

I 9.2.1: Konstruktion af plasmid pUC19/pelA-IFN AM119 (se I

I 5 fig. 14). I

I Plasmid pUC19/pelA spaltes med Sall. De klæbrige ender af I

I det lineære fragment udfyldes ved en reaktion med Klenow I

I DNA-polymerase 1 (BRL) i nærværelse af 0,1 mM af hen- I

I holdsvis dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 I

I 10 mM MgCl2 i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen I

I afbrydes ved tilsætning af EDTA til en slutkoncentration I

på 12,5 mM. DNA'et fældes med ethanol. Det lineære DNA- I

I fragment spaltes med Pstl. Efter phenol/chloroform- I

I ekstraktion fældes DNA'et med ethanol. I

15 En oligodeoxynucleotidlinker med formlen I

I Pstl Ddel I

I (I) 5'- TGTGATCTGCC -3' I

I (II) 3'- ACGTACACTAGACGGAGT -5' I

I ligeres til Pstl-stedet i det lineariserede plasmid. I

I 20 Linkeren udfylder den forskudte 3'-ende ved Pstl-stedet, I

I som falder sammen med enden af pelA-signalsekvensen, og I

fusionen etableres i struktur til kodningssekvensen for I

interferon BDBB. (I) repræsenterer 51-terminalnucleotid- I

sekvensen for interferon BDBB-genet op til Ddel-restrik- I

25 tionsstedet. I 2 2

pmol af hvert af oligonucleotideme (I) og (II) I

phosphoryleres og annelleres. Det Pstl-skårne I

pUCl9/pelA-plasmid og et 100-dobbelt molært overskud af I

det dobbeltstrengede linker-DNA ligeres i 60 mM Tris-HCl I

30 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DDT og 400 enheder I

T4-DNA-ligase i 16 timer ved 15°C. DNA-ligasen inaktiveres I

77 DK 175534 B1 i 10 minutter ved 85®C. Overskud af linkere fjernes ved fældning i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol.

5 Det store 5 kb fragment isoleres på en præparativ 0,6%'s agarosegel. Fragmentet indeholder pelA-promotoren og signalsekvensen (BamHI-[PstI ]/linker) og pelA-terminatoren ([Sall ]kortende-HindIII) i vektor pUC19.

Plasmid pJDB207/PH05-IFN AM119 (EP 205404) indeholder 10 genet, for hybrid-ά-interferon. BDBB under kontrol af den regulerede promotor for sur gærphosphatase (PH05). Plasmid-DNA'et spaltes med BamHI og Hindlll, og 1,3 kb BamHI-Hindlll-fragmentet, som indeholder PH05-promotoren, I kodningssekvensen for IFN BDBB og PH05-transcriptionsstop- I 15 sekvenserne, isoleres. Fragmentet renses ved kromatografi I på DE52 og fældning med ethanol, hvorpå det yderligere I spaltes med Taql. De klæbrige ender af Taql-restriktions- I fragmenterne udfyldes ved en reaktion med Klenow-DNA-poly-

I merase I (BRL) i nærværelse af 0,1 mM af henholdsvis dCTP

I 20 og dGTP, 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 i 30 minutter I ved stuetemperatur. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af I EDTA til en s lutkoncentration på 12,5 mM. DNA- fragmenterne I fældes med ethanol og spaltes yderligere med Ddel. DNA- I fragmenterne adskilles på en præparativ 0,8%'s agarosegel.

I 25 549 bp DdeI-[ Taql ]kortendefragmentet elektroelueres fra I gelen, renses ved ionbytterkromatografi på DE52 og I fældning med ethanol. DNA-fragmentet resuspenderes i vand I til en koncentration på ca. 0,1 pmol/jtl. 1 0,2 pmol af 549 bp Ddel-[ Taql pcortendefragmentet og 0,1

I 30 pmol af 5 kb vektorfragmentet ligeres i 10 μΐ 60 mM

I Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DDT og 200 I enheder T4-DNA-ligase (Biolabs) i 16 timer ved 15°C. En l I μΐ alikvot af ligeringsblandingen anvendes til transforma- I tion af Ca^+-behandlede, kompetente HBlOl-celler.

I DK 175534 B1 I

I 78 I

I Plasmid-DNA fremstilles ud fra 12 ampicillin-resistente I

I transformerede kolonier og analyseres ved spaltning med I

EcoRI, PvuII, Clal og EcoRI/HindXII. En klon med det I

I 5 forventede restriktionsmønster udvælges. Den korrekte I

I fusion i struktur af pelA-signalsekvensen og den modne I

I kodningssekvens for interferon BDBB bekræftes ved hjælp af I

DNA-sekvensensering. Plasmid-DNA'et fra den udvalgte klon I

I betegnes pUC19/pelA-iFN AM119. I

I 10 En analog konstruktion med pUC18/pelA fører til plasmid I

I pUC18/pelA-IFN AM119. I

I Eksempel 9.2.2: Cotransformation af Aspergillus niger- I

I mutant An8 med pCG59D7 og pUC19/pelA-IFN I

I AMI19. I

I 15 Den uridinauxotrofe mutant An8 (*DSM 3917), beskrevet i EP I

I 88.101.397.3, transformeres med plasmid pCG59D7 til dan- I

I nelse af uridinprototrofer. Sammen med transformations- I

I plasmidet tilsættes det non-selektive plasmid pUC19/pelA- I

I IFN AM119 for at . opnå tilfældige cointegranter ved co- I

I 20 transformation. I

I Konidiesporer af A. niger An8 dyrkes i 4 dage ved 28®C i I

I komplet medium, indtil der er opnået fuldstændig spore- I

I dannelse. 2 x 10® konidiesporer anvendes til inokulering I

I af 200 ml minimalmedium tilsat 1 g/1 arginin og uridin. I

I 25 Efter dyrkning i 20 timer ved 28®C og 180 opm høstes I

myceliet ved filtrering gennem "Miracloth", hvorpå det I

vaskes to gange med 10 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 og I

resuspenderes i 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2, 0,5 mg/ml I

"Novozym" 234 (Novo Industri). Blandingen inkuberes i et I

30 roterende vandbad (30°C, 50 opm), indtil maksimal proto- I

plast-frigørelse kan påvises mikroskopisk (90-120 min.). I

Protoplastsuspensionen filtreres gennem en glasuldsprop i I

en tragt til fjernelse af mycelierester. Protoplasterne I

79 I

DK 175534 B1

samles i en pellet ved forsigtig centrifugering (10 I

minutter, 2000 opm) ved stuetemperatur og vaskes to gange I

med 1 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2· Til sidst resuspenderes I

5 protoplasterne i 200-500 μΐ 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 til en I

koncentration på 1 x 10®/ml. I

Med henblik på transformation inkuberes en alikvot på 200 I

μΐ af protoplastdispersionen med 5 μg pCG59D7 og 10 μg I

pUC19/pelA-IFN AM119-DNA, 50 μΐ PCT (10 mM Tris-HCl pH I

10 7,5, 50 mM CaCl2, 25% . PEG 6000). Inkuberingsbl.andingen I

holdes på is i 20 minutter, hvorpå der tilsættes yder- I

ligere 2 ml PCT, og blandingen inkuberes i yderligere 5 I

minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 4 ml 0,8 M KC1, I

I 50 mM CaCl2, og 1 ml alikvoter af den færdige trans- I

I 15 formationsopløsning blandes med lignin tilsat minimal- I

I agarmedium (minimalmedium + 1 g/1 arginin + 10 g/1 I

I Bacto-Agar (Difco)) stabiliseret med 0,8 M KC1. Blandin- I

I gen hældes straks på agarplader af det samme medium og I

I inkuberes ved 28®C. I

I 20 Efter dyrkning i 2-3 dage ved 28CC fremkommer stabile I

I transformanter som kraftigt voksende og sporedannende I

I kolonier på en baggrundsvækst af mange hundrede små, I

I formentlig fejlslagne transformanter. I

I Eksempel 9.2.3: Ekspression af hybrid-interferon BDBB- I

I 25 genet under kontrol af pelA-promotoren. I

I 37 transformanter fra cotransformationsforsøget (eksempel I

I 9.2.2) udtages og analyseres for interferonekspression.

I Interferonaktivitet bestemmes under anvendelse af frem- I gangsmåden ifølge Amstrong (J.A. Armstrong, Appl.

I 30 Microbiol. 21, 732 (1971)) og under anvendelse af I CCL-23-celler og vesikulær stomatitis virus (VSV) som det I såkaldte "challenge"-virus.

I DK 175534 B1

I 80 I

I Konidiesporer fra transformanter fordyrkes hver for sig i I

50 ml fordyrkningsmedium (Pectin Slow Set L (Unipectin, I

I SA, Redon, Frankrig) 3 g/1, NH4C1 2 g/1, KH2PO4 0,5 g/1, I

I 5 NaCl 0,5 g/1, Mg2S04-7 H20 0,5 g/1, Ca2S04-2 H20 0,5 g/1, I

I pH 7,0). Forkulturen inkuberes i 72 timer ved 250 opm og I

28eC. 10% af forkulturen anvendes til podning af 50 ml I

I hovedkulturmedium (sojabønnemel 20 g/1. Pectin Slow Set 5 I

I g/1). Kulturen dyrkes i 72-96 timer ved 250 opm og 28°C. I

I 10 Prøver udtages til forskellige tidspunkter (hver 20. I

time), cellerne samles til en pellet ved centrifugering og I

I oplukkes ved hjælp af ultralydsbehandling. Supernatant og I

celleekstrakter testes begge for interferonaktivitet som I

I beskrevet ovenfor. Hovedparten af interferonaktiviteten I

I 15 findes udskilt i mediet. I

I Eksempel 10. I

I Konstruktion af plasmid M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119. I

I 2,8 kb ekspressionskassetten af plasmid M13(+)KS/pelAAss- I

I I FN AMI19 omfatter den inducerbare pelA-promøtor, kod- I

I 20 ningssekvensen for hybridinterferon BDBB og pelA-trans- I

I scriptionsterminatoren på Bluescript M13(+)KS-vektoren. I

I Hybridinterferon BDBB udtrykkes og anbringes i værts- I

I cellen. Plasmid M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 af I

pUC18/pelA-lFN AM119 (se eksempel 9.2.1). pelA-Signal- I

25 sekvensen (ss) er afsnøret ved hjælp af steddirigeret I

mutagenese (se fig. 15). Hybrid- interferon udtrykt af I

konstruktionen uden signalsekvens formodes at findes i I

cytosolen. I

Eksempel 10.1: Underkloning af pelA-IFN AMI19-kassetten i I

30 Bluescript M13(+)KS-vektoren. I

Plasmid pUCl8/pelA-IFN AM119 (se eksempel 9.2.1) spaltes I

med BamHI og Hindlll. 2,8 kb BamHI-HindlII-fragmentet I

81 DK 175534 B1 indeholder pelA-promotoren, signalsekvensen, IFK BDBB-kodningssekvensen og pelA-terminatoren. BamHI-Hindlll-fragmentet isoleres og ligeres til Bluescript 5 M13(+)KS (Stratagene)-vektoren, som er skåret med BamHI og

Hindlll. En alikvot af ligeringsblandingen anvendes til transformering af Ca^+-behandlede, kompetente JM109-celler. Der selekteres for heldig kloning af 2,8 kb BamHI-HindiII-fragmentet i M13(+)KS på ampicillin-plader i 10 nærværelse af X-Gal og IPTG. Der udtages 12 hvide, ampicillinresistente kolonier. Plasmid-DNA fra disse kolonier analyseres ved BamHl-Bglll-dobbeltspaltning. En transformant med den korrekte insert betegnes M13(+)KS/pelA-IFN AM119.

I 15 Eksempel 10.2: Udvinding af enkeltstrenqet DNA fra celler I indeholdende Bluescript M13(+)KS-plasmidet.

I DK 175534 B1 H Eksempel 10,3: Sted-dirigeret oligonucleotidmutagenese på enkeltstrenget DNA-skabelon.

Sted-dirigeret sletningsmutagenese gennemføres på den 5 ikke-kodende enkeltstrengede pelA-IFN AMI19-skabelon til B afsnøring af pelA-signalsekvensen (fig. 15).

B Den mutagene primer indeholdende dele af pelA-promotor- B sekvensen inklusive ATG'en (nucleotidposition 1343 til B 1363 i fig. 10) og 21 nucleotider, som koder for amino-

I 10 syrer 1 til 7 i modent XFN BDBB. I

Til mutagenesen phosphoryleres 200 pmol af mutagenise- I

I ringsprimeren i 20 μΐ 50 mM Tris*HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, I

I 5 mM DDT og 0,5 mM ATP under anvendelse af 8 enheder I

I T4-polynucleotidkinase (Boehringer). Efter 1 time ved 37°C I

I 15 afbrydes reaktionen ved opvarmning til 65eC i 10 minutter. I 1

0,2 pmol enkeltstrenget skabelon inkuberes med 10 pmol I

I phosphoryleret mutagen oligodeoxyribonucleotidprimer og 10 I

I pmol universel M13-sekvenseringsprinmer i 30 μΐ 20 mM I

I Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 50 mM NaCl, 1 mM DDT ved I

I 20 80eC i 5 minutter. Opløsningen henstår til langsom I

I afkøling til stuetemperatur i løbet af 30 minutter. Til I

I den annellerede blanding sættes 10 μΐ enzym-dNTP (dATP, I

I dGTP, dCTP, dTTP)-opløsning indeholdende 1 μΐ puffer [0,2 I

I M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2 ], 5 μΐ 2 mM dNTP-blånding, . I

I 25 0,5 μι 20 mM ATP, 1 μΐ 0,2 M DTT, 0,5 μΐ T4-DNA-ligase I

I (Biolabs, 400 enh./μΐ) og 1,2 μΐ Klenow-DNA-polymerase I

I (BRL, 5 enh./μΐ). Blandingen inkuberes ved 15°C i 16 I

I timer. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65°C i 10 I

I minutter. I

I H

I 30 1 μΐ og 3 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til at I

I transformere 0,2 ml kompetente celler af repair-minus-

I stammen E. coli MV1190 [ A(lac-proAB), thi, supE, I

I A(srl-recA)306::Tnl0(tetr) (F*:traD36, proAB, lac I

DK 175534 B1 83

Ι3ΖΔΜ15) ]. Stamme MV1190 er beskrevet i håndbogen til I

BIO-RAD Muta-Gene M13 in vitro-mutagenesesættet. 12 I

ampicillinresistente kolonier udtages. Plasmid-DNA I

5 fremstilles og analyseres ved spaltning med Seal, Heldig I

afsnøring af pelA-signalsekvensen fjerner et Scal-sted. I

Korrekte plasmider lineariseres ved Seal-stedet i I

Bluescript-vektoren. Et plasmid undersøges nærmere. Den I

korrekte forbindelse mellem pelA-promotoren og podnings- I

I 10 sekvensen for hybrid-IFN BDBB med ATG'en indbefattet I

I bekræftes ved DNA-sekvensering. En korrekt konstruktion I

I betegnes M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119. I

I Eksempel 10.4i Cotransformation af A. niger og ekspression I

I af hybridinterferon. I

I 15 Plasmider M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 og pCG59D7 anvendes I

I til cotransformering af A. niger-mutant An8 i overensstem- I

I melse med fremgangsmåden ifølge eksempel 8.2.2. Transfor- I

I manter dyrkes som beskrevet i eksempel 8.2.3. Prøver I

I udtages til forskellige tidspunkter (hver 20. time), I

I 20 cellerne samles ved centrifugering og oplukkes ved I

I behandling med ultralyd. Celleekstrakteime testes for I

I interferonaktivitet (se ovenfor). Hovedparten af inter- I

I feronaktiviteten findes intracellulært. I

I Deponering af mikroorgansimer. I

I 25 Nedenstående mikroorganismer er deponeret under Budapest- I

I konventionens bestemmelser hos Deutsche Sammlung von I Mikroorganismen, Mascheroder Weg lb, D-38124 I Braunschweig.

I DK 175534 B1 I

I 84 I

I Mikroorganismer Depone- Depone- I

I ringsnr. ringsdato I

I Escherichia coli HB 101/pGW 820 DSM 4388 01.02.1988 I

I 5 Escherichia coli HB 101/pGW 830 DSM 4389 01.02.1988 I

I Escherichia coli HB 101/pGW 850 DSM 4390 01.02.1988 I

I Escherichia coli HB 101/pGW 860 DSM 4391 01.02.1988 I

I Escherichia coli HB 101/pGW 880 DSM 4392 01.02.1988 I

85 DK 175534 B1

Referencer 1. Yelton, M.M., Hamer, J.E. and Timberlake, W.E.(1984 Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81, 1470-1474.

2. Frischauf, A.H., Lehrach, H., Poustra, A. and Hurray, N. (1983) J.Mol. Biol. 1_70, 827-842.

3. Karn, J., Brenner, S., Barneff, L. and Cesareni, G. (1980) Proc.

Hati. Acad. Sci. USA J2.* 5172-5176.

4. Benton, W.D. and Davis, R-W. (1977) Science 196, 180-182.

5. Maniatis, T. , Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) in: Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Harbor, Hew York.

6. BRL. Ml3 cloning/dideoxy sequencing instruction manual.

7. Dente, L., Cesareni, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. Acids Res. 11. 1645-1655.

8. Dente, L., Sollazzo, M., Baldari, C., G. Cesareni and R. Cortese. in: DHA Cloning vol. 1. a practical approach ed. D.M. Glover, IRL Press,

Oxford 1985.

9. Russell, M., Kidd, S. and Kelley, M-R. (1986) Gene b5, 333-338.

10. Caruther, M.H. Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments: a laboratory manual, Verlag Chemie (1982).

11. Ballance, D.J. (1986) Yeast 2, 229-236.

12. Goosen, 1., Bloemheuvel, G., Gysler, Ch., de Bier, D.A., van den Broek, H.W.J. and Swart, K. (1987) Current Genetics 11, 499-503.

I DK 175534 B1 I

I 86 I

I 13. Boeke, J.D., Lacroute, F. and Fink, G.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 197. I

I 345-346. I

I 14. Slater, R.J. (1984) in! Methods in Molecular Biology vol. 2 Ed. J.M. I

I Walker, The Humana Press Inc. I

I 14a.Hinnen A., Hicks J.B. 4 Fink G.R. (1978) Proc.. Natl. Acad. Sci.USA I

I 75, 1929-1933. I

I 15. Laemmli, U.K. (1970) Nature 227., 681-682. I

I 16. Tovbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 76. 4350-4354. I

I 17. Ried, J.L. and Collmer, A. (1985) Applied and Environm. Microbiol. I

I 50, 615-622. I

I 18. van Houdenhoven, F.E.A. (1975) Ph.D. Thesis Agricultural University I

I Wageningen, The Netherlands. I

I 19. Hunkapiller, M.W. (1985) PTH Amino Acid Analysis, User Bulletin I

I no. 14 Applied Biosystems. H

I 20. Zissler, J. et al. (1971) in: The Bacteriophage Lambda, Cold Spring

I Harbor Labs, New York, A.D. Hersley editor. I

I 21. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106. I

I 22. F.E.A. von Houdenhoven. Ph.D. Thesius Agricultural University, I

I Wageningen iji Communications Agricultural University Wageningen, I

I The Netherlands 75-13 (1975). I

I 23. Birnboim H.C. & Doly J. (1979). Nucleic Acids Res 7, 1513-1523. I

I 24. Boel E., Hansen M.T., Hjort I., Hoegh I-, Fiil N-P. (1984). I

I EMBO J. 3, 1581-1585.

87 DK 175534 B1 25. Mount S.M. (1982). Nucleic Acids Res.10. 459-472.

26. Ballance D.J. and Turner G. (1985), Gene 36, 321-331.

27. Hermersdorfer H, Leuchtenberger A, Wardsack Ch and Ruttloff H (1907) Influence of culture conditions on mycelial structure and polygalacturonase synthesis of A. niger. J. Basic Microbiol. 27, 309-315.

28. Henikoff, S. (1984) Gerne 28, 351-359.

29. Mead et al., (1986) Protein Engeneering 1, 67.

30. Kunkel et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 485.

Claims (32)

1. Rekombinant DNA-molekyle kendetegnet ved, at det I I indeholder en DNA-sekvens, som koder for pectinlyase pelA I I 5 med den i fig. 10 viste aminosyre sekvens, pectinlyase pelB I I med den i fig. 11 viste aminosyresekvens, pectinlyase pelC, I I der kan fås ved ekspression af pelC indeholdt i pGW850 som I I vist i fig. 3, pelE, der kan fås ved ekspression af pelE I I indeholdt i pGW880 som vist i fig. 5 (DSM 4392), eller pelF, I I 10 der kan fås ved ekspression af pelF indeholdt i pGW860 som I I vist i fig. 6 (DSM 4391) eller et derivat deraf, hvori et I I derivat betyder et større derivat, herunder flankerings- I I sekvenser, fragmenter af DNA-'sekvensen eller DNA-sekvenser, I I som er degenererede i overensstemmelse med den genetiske I I 15 kode. I

2. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at det omfatter promotoren, som er placeret i I I DNA-regionen før strukturgenet og omfatter op til 2000 I I 20 nucleotider, signalsekvensen, som er placeret i DNA-re- I I gionen mellem promotorens slutning og begyndelsen af den I sekvens, der koder for det modne protein, strukturgenet I I eller terminatoren, der begynder med stopcodonet, for et I hvilket som helst af pectinlyasegenerne eller en vilkårlig I I 25 kombination af disse fragmenter. I

3. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens med formlen I I (fig. 10) eller et derivat deraf som defineret i krav 1. I I 30 I

4. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I | tegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens med formlen I II (fig. 11) eller et derivat deraf som defineret i krav I li. I I 35 I 89 DK 175534 B1

5. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er pGW820 (DSM 4388).

6. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendeteg-5 net ved, at det er pGW830 (DSM 4389).

7. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er pGW850 (DSM 4390).

8- Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det er pGW880 (DSM 4392).

9. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det er pGW860 (DSM 4391).

10· Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det indeholder et fragment, der strækker sig mellem to restriktionssteder i plasmid pGW820 (DSM 15 4388), pGW830 (DSM 4389), pGW850 (DSM 4390), pGW880 (DSM 4392) eller pGW860 (DSM 4391) og bibeholder en pectin-lyase-promotor-, -signal-, -struktur- eller -terminator-funktion eller en kombination af sådanne fragmenter.

11. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- 20 tegnet ved, at det indeholder promotorsekvensen af pelA.

12. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det indeholder promotorsekvensen af pelA, pelB, pelC, pelE eller pelF.

13- Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- 25 tegnet ved, at det indeholder signal sekvensen af pelA, pelB, pelC, pelE eller pelF. 1 Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det indeholder PLI-strukturgenet af pelA, pelB, pelC, pelE eller pelF. I DK 175534 B1 I I 90 I I Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at det indeholder PLl-strukturgenet af pelA, I I pelB, pelC, pelE eller pelF uden introns. I I 5 16. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at det indeholder terminatoren af pelA, pelB, I pelC, pelE eller pelF. I I I7· Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I tegnet ved, at det er en rekombinant hybridvektor, som I I 10 indeholder et strukturgen, der er heterologt med Asper- I I gillus niger. I I 18· Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I tegnet ved, at det er en hybridvektor, som indeholder det I I heterologe strukturgen, der koder for hybridinterferonet I I 15 BDBB. I I 19· Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I tegnet ved, at det er hybridvektoren pUC19/pelA-IFN AM119 I I (fig. 14). I

20. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I 20 tegnet ved, at det er den rekombinante hybridvektor I I M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119, der består af den inducerbare I I pelA-promotor, kodningssekvensen for hybridinterferon BDBB I og pelA-transskriptionsterminatoren på Bluescript I I M13(+)KS-vektoren. I I 25 21. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende- I I tegnet ved, at det er hybridvektoren M13(+)KS/pelA-lFN I I AMI19, fremstillet ved skæring af pUC19/pelA-IFN AM119 I I (fig- 14) med BamHI og Hindi 11 og ligering af det I I isolerede fragment til en Bluescript M13(+)KS-vektor, I I 30 skåret med BamHI og Hindlll. I 91 DK 175534 B1

22. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker en vært transformeret med et DNA-molekyle indeholdende en 5 DNA-sekvens, som koder for pectinlyase PLA-, PLB-, PLC-, PLE- eller PLF-ekspressionssystemet eller et derivat deraf og isolerer det ønskede rekombinante DNA-molekyle eller et derivat deraf eller fremstiller det ved in vitro-syntese.

23. Transformeret vært, kendetegnet ved, at den 10 indeholder et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1.

24. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli HB l01/pGW820 (DSM 4388).

25. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli HB 101/pGW830 (DSM 4389).

26. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli HB 101/pGW850 (DSM 4390).

27. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli HB 101/pGW860 (DSM 4391).

28. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet 20 ved, at den er Escherichia coli HB 101/pGW880 (DSM 4392).

29. Transformeret vært ifølge krav 23., kendetegnet ved, at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1 og selektionsmarkørplasmidet pCG59D7 (DSM 3968). 1 2 3 4

30. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet 2 ved, at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transfor 3 meret méd pUC19/pelA-IFN AM119 (fig- 14) og selektions 4 markørplasmidet pCG59D7 (DSM 3968). DK 175534 B1 I

92 I

31. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet I ved, at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transfor- I meret med Ml3(+)KS/pelAAss-IFN AM119 ifølge krav 21 og I 5 selektionsmarkørplasmidet pCG59D7 (DSM 3968). I

32. Transformeret vært ifølge krav 23, kendetegnet I ved, at den er Aspergillus niger An8 (DSM 3917) transfor- I meret med M13(+)KS/pelA-IFN AM119 ifølge krav 22 og I selektionsmarkørplasmidet pCG59D7 (DSM 3968). I

33. Fremgangsmåde til fremstilling af en transfor- I meret vært ifølge krav 23, kendetegnet ved, at man be- I handler en vært under transformationsbetingelser med et I rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, eventuelt sammen I med et selektionsmarkørgen, og selekterer transformanter- I 15 ne. I

34· Fremgangsmåde ifølge krav 33, kendetegnet ved, at I Aspergillus niger An8 cotransformeres med et rekombinant I DNA-molekyle ifølge krav 1 og selektionsmarkørplasmidet I PCG59D7 (DSM 3968). I

35. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypep- I tid, kendetegnet ved, at en hybridvektor ifølge krav 1 I udtrykkes i en egnet vært. I

36. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, I kendetegnet ved, at en hybridvektor ifølge krav 18 udtryk- I 25 kes i en egnet vært. I 1 Fremgangsmåde ifølge krav 36 til overproduktion I af pectinlyaserne PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i Asper- I gillus-arter, kendetegnet ved, at man dyrker en Aspergil- I lus-vært transformeret med en ekspressionshybridvektor til I 30 ekspressionen af pectinlyaserne. I 93 DK 175534 B1

38. Fremgangsmåde ifølge krav 37 til produktion af hybridinterferonet BDBB i Aspergillus-arter, kendetegnet ved, at man dyrker en Aspergillus-vært transformeret med 5 en ekspressionshybridvektor til ekspressionen af hybridinterferonet.

39. Pectinlyaser PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF på ren form, kendetegnet ved, at de kan fås ved transformation af en vært, der ikke er i stand til at udtrykke nogen pectin- 10 lyase, med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1 og isolering af lyaserne.