JPH02167095A - 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 - Google Patents
異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体Info
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- JPH02167095A JPH02167095A JP63103339A JP10333988A JPH02167095A JP H02167095 A JPH02167095 A JP H02167095A JP 63103339 A JP63103339 A JP 63103339A JP 10333988 A JP10333988 A JP 10333988A JP H02167095 A JPH02167095 A JP H02167095A
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔利用分野)
本発明は血清アルブミンシグナルペプチドをコードする
DNA、及びこのDNAを含む組換えDNAを用いるこ
とによる酵母における異種蛋白質の製造方法に関する。
DNA、及びこのDNAを含む組換えDNAを用いるこ
とによる酵母における異種蛋白質の製造方法に関する。
〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕組み換えD
NA技術により、目的蛋白質を組み換え宿主に産生させ
る場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現することに多
くの利点が見出される。
NA技術により、目的蛋白質を組み換え宿主に産生させ
る場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現することに多
くの利点が見出される。
即ち、目的蛋白質が宿主細胞内に直接発現されると宿主
の増殖、生存に不都合な毒性を示す場合、目的蛋白質を
分泌発現することでこの毒性を回避することができる。
の増殖、生存に不都合な毒性を示す場合、目的蛋白質を
分泌発現することでこの毒性を回避することができる。
また、毒性を持たない場合でも、目的蛋白質が宿主細胞
内に多量に蓄積すると宿主の増殖を抑制する場合がある
が、分泌発現ではこれを避けることが可能である。また
、目的蛋白質が宿主細胞内に蓄積するような発現系では
、目的蛋白質が宿主細胞内で変性し、不溶化する現象が
よく見られるが、分?y発現の系ではこれを回避できる
。また、商業的に組み換えDNA技術を用いて目的蛋白
質を生産する場合、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系で
は目的蛋白質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊
液中から目的蛋白質を精製する必要がある。このような
精製では組み)桑え宿主由来の不純物が多く混入し、高
純度の目的蛋白質を得ることが困難である。一方、分泌
発現系で目的蛋白質を生産する場合には、培!!液から
目的蛋白質を精製すればよく、組み換え宿主由来の不純
物の混入は最小限に防ぐことができ、大きなメリットと
なる。また、蛋白質の多くは、糖鎖の付加、ジスルフィ
ド結合の形成、不活性な前駆体蛋白質の限定氷解による
活性化、特定のアミノ酸のリン酸化、カルボキシル化等
の修飾を受けるが、これらの中には各種細胞で共通に備
わった機能もあり、これらの修飾のいくつかは分泌の過
程で生じる。従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する
場合、細胞内に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白
質に近い機能および構造を持った蛋白質の生産が期待さ
れる。
内に多量に蓄積すると宿主の増殖を抑制する場合がある
が、分泌発現ではこれを避けることが可能である。また
、目的蛋白質が宿主細胞内に蓄積するような発現系では
、目的蛋白質が宿主細胞内で変性し、不溶化する現象が
よく見られるが、分?y発現の系ではこれを回避できる
。また、商業的に組み換えDNA技術を用いて目的蛋白
質を生産する場合、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系で
は目的蛋白質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊
液中から目的蛋白質を精製する必要がある。このような
精製では組み)桑え宿主由来の不純物が多く混入し、高
純度の目的蛋白質を得ることが困難である。一方、分泌
発現系で目的蛋白質を生産する場合には、培!!液から
目的蛋白質を精製すればよく、組み換え宿主由来の不純
物の混入は最小限に防ぐことができ、大きなメリットと
なる。また、蛋白質の多くは、糖鎖の付加、ジスルフィ
ド結合の形成、不活性な前駆体蛋白質の限定氷解による
活性化、特定のアミノ酸のリン酸化、カルボキシル化等
の修飾を受けるが、これらの中には各種細胞で共通に備
わった機能もあり、これらの修飾のいくつかは分泌の過
程で生じる。従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する
場合、細胞内に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白
質に近い機能および構造を持った蛋白質の生産が期待さ
れる。
シグナルペプチドの性状についてはい(つかの知見があ
り、そのアミノ酸配列の特徴は以下のようである。N末
端近傍に塩基性アミノ酸が多(、またC末端側のシグナ
ルペプチダーゼに消化される部位近傍には極性を有する
アミノ酸が多く、また、その間は疎水性のアミノ酸が連
続する。N末端近傍の塩基性アミノ酸は、細胞内部表面
のリン脂質と相互作用し、中央部の疎水性アミノ酸の連
続は細胞膜通過に重要な役割を果たし、C末端の極性ア
ミノ酸はシグナルペプチダーゼに消化される時の認識部
位の役割を演していると推定されている。このような特
徴は原核生物から高等動物に到るまで掻めて類似してお
り、共通の蛋白質分泌メカニズムを推定させる。(M、
S、Br1gg5 and L、M。
り、そのアミノ酸配列の特徴は以下のようである。N末
端近傍に塩基性アミノ酸が多(、またC末端側のシグナ
ルペプチダーゼに消化される部位近傍には極性を有する
アミノ酸が多く、また、その間は疎水性のアミノ酸が連
続する。N末端近傍の塩基性アミノ酸は、細胞内部表面
のリン脂質と相互作用し、中央部の疎水性アミノ酸の連
続は細胞膜通過に重要な役割を果たし、C末端の極性ア
ミノ酸はシグナルペプチダーゼに消化される時の認識部
位の役割を演していると推定されている。このような特
徴は原核生物から高等動物に到るまで掻めて類似してお
り、共通の蛋白質分泌メカニズムを推定させる。(M、
S、Br1gg5 and L、M。
Gierasch(1986) Adv、 Prote
in Chem、+3ル109−180;G、von
He1jne (1984) EMBOJ、、 3.2
315−2318)ヒト血清アルブミン蛋白質はプレプ
ロ型蛋白質として遺伝子上にコードされている〔特開昭
62−29985号公報、 A、Dugaiczyk等
(1982) Proc、Natl。
in Chem、+3ル109−180;G、von
He1jne (1984) EMBOJ、、 3.2
315−2318)ヒト血清アルブミン蛋白質はプレプ
ロ型蛋白質として遺伝子上にコードされている〔特開昭
62−29985号公報、 A、Dugaiczyk等
(1982) Proc、Natl。
Acad、Sci、USA、、79.71−75)参照
〕0分泌に必須なシグナルペプチドから成熟ヒト血清ア
ルブミンのN末端近傍のアミノ酸配列、およびそれをコ
ードするDNA配列を第1表に示した。
〕0分泌に必須なシグナルペプチドから成熟ヒト血清ア
ルブミンのN末端近傍のアミノ酸配列、およびそれをコ
ードするDNA配列を第1表に示した。
C以下余白〕
y)
このうち、 18アミノ酸から成るシグナルペプチドは
分泌時に除去され、また、6アミノ酸から成るプロペプ
チドはプロセッシングにより除去されて、Asp−Al
a−His−Lys−5er・−・ のN末端アミノ酸
配列を有し、585アミノ酸から成る成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質となる。
分泌時に除去され、また、6アミノ酸から成るプロペプ
チドはプロセッシングにより除去されて、Asp−Al
a−His−Lys−5er・−・ のN末端アミノ酸
配列を有し、585アミノ酸から成る成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質となる。
ところで、酵母は菌体外プロテアーゼの分泌も少なく、
さらに分泌物にil鎖を付加することもできるという理
由により異種蛋白質の分泌発現にとって優れたものであ
る。
さらに分泌物にil鎖を付加することもできるという理
由により異種蛋白質の分泌発現にとって優れたものであ
る。
しかして、酵母以外の細胞で分泌発現に寄与するシグナ
ルペプチドが、酵母においても機能する例がいくつか報
告されている。例えば、卵白リゾチームシグナルペプチ
ドを用いたヒトリゾチームの酵母における分泌発現(地
神(1987) 8101N1)IIsTRY、 4
LIT−123,) 、植物蛋白質タウマチンのシグ
ナルペプチドを用いたタウマチンの酵母における分泌発
現(L、Edens、 1.Bo+w、^、M、Led
ebosr+J、門BBt、 [、Y、70HH,(:
、visser and C,T、Verrips(1
984) Ce11+、il、629−633)、ヒト
インターフェロンαのシグナルペプチドを用いたヒトイ
ンターフェロンの酵母における分泌発現(R,A、)I
itzeman。
ルペプチドが、酵母においても機能する例がいくつか報
告されている。例えば、卵白リゾチームシグナルペプチ
ドを用いたヒトリゾチームの酵母における分泌発現(地
神(1987) 8101N1)IIsTRY、 4
LIT−123,) 、植物蛋白質タウマチンのシグ
ナルペプチドを用いたタウマチンの酵母における分泌発
現(L、Edens、 1.Bo+w、^、M、Led
ebosr+J、門BBt、 [、Y、70HH,(:
、visser and C,T、Verrips(1
984) Ce11+、il、629−633)、ヒト
インターフェロンαのシグナルペプチドを用いたヒトイ
ンターフェロンの酵母における分泌発現(R,A、)I
itzeman。
D、W、Leung+ L、J、Perry、 11.
J、Kohr+ H,L、LevineandD、V、
Goeddel (1983) 5cience、 A
囲ヨ620−625)などである。
J、Kohr+ H,L、LevineandD、V、
Goeddel (1983) 5cience、 A
囲ヨ620−625)などである。
しかしながら、酵母以外の細胞で本来分泌発現に寄与す
るシグナルペプチドが、酵母においても機能するとはか
ぎらないのが実情である。
るシグナルペプチドが、酵母においても機能するとはか
ぎらないのが実情である。
従って、本発明の目的は酵母から異種蛋白質を効率よく
分泌発現させる方法、当該方法に使用されるベクター、
および当該ベクターにて形質転換された形質転換体壱提
供することである。
分泌発現させる方法、当該方法に使用されるベクター、
および当該ベクターにて形質転換された形質転換体壱提
供することである。
〔課題を解決するための手段]
このような背景のもとに、本発明者らは酵母による蛋白
質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについて研究を
重ねて来たところ、ヒト血清アルブミンのシグナルペプ
チドが酵母におけるシグナルペプチドとしてitするこ
とを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに
至った。
質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについて研究を
重ねて来たところ、ヒト血清アルブミンのシグナルペプ
チドが酵母におけるシグナルペプチドとしてitするこ
とを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに
至った。
即ち、本発明は下記(1)〜(4)に関するものである
。
。
(1)血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子及びその
誘導体。
誘導体。
(2)前記血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子を含
むHAえDNAを用いて形質転換した酵母から異種蛋白
質を分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造
方法。
むHAえDNAを用いて形質転換した酵母から異種蛋白
質を分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造
方法。
(3)前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るDNAを含む酵母を形質転換するための組換えDNA
。
るDNAを含む酵母を形質転換するための組換えDNA
。
(4)前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るDNAを含む組換えDNAにて形質転換された酵母。
るDNAを含む組換えDNAにて形質転換された酵母。
本発明に関する組換えDNAは、血清アルブミンシグナ
ルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、プロモーター、
ターミネータ−およびプラスミドDNA又は染色体DN
Aからなる。
ルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、プロモーター、
ターミネータ−およびプラスミドDNA又は染色体DN
Aからなる。
血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は、例えば哺乳
動物に由来するものが好適に使用される。
動物に由来するものが好適に使用される。
具体的にはヒト由来、ラット由来、ウシ由来のものなど
が用いられる。また、その遺伝子は主要部を残して変異
させたものであってもよい。
が用いられる。また、その遺伝子は主要部を残して変異
させたものであってもよい。
ヒト由来のものとしては、
Me LLysTrpl/a lTh rPhe I
l eSerLeuLeuPheLeuPheSerS
er −AlaTyrSer ラット由来のものとしては、 Me tLysTrpVa 1ThrPheLeuLe
uLeuLeuPhe l 1eserG 1yser
^1aPheser ウシ由来のものとしては、 Me tLysTrpVa lTh rPhe I l
eSerLeuLeuLeuLeuPheSerSe
rAlaTyrSer などのアミノ酸配列で表わされるDNAが例示される。
l eSerLeuLeuPheLeuPheSerS
er −AlaTyrSer ラット由来のものとしては、 Me tLysTrpVa 1ThrPheLeuLe
uLeuLeuPhe l 1eserG 1yser
^1aPheser ウシ由来のものとしては、 Me tLysTrpVa lTh rPhe I l
eSerLeuLeuLeuLeuPheSerSe
rAlaTyrSer などのアミノ酸配列で表わされるDNAが例示される。
当該血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子器よ好まし
くは、ヒト由来のものが使用される。
くは、ヒト由来のものが使用される。
さらに、本シグナルペプチド遺伝子は、一部変更するこ
とによって、より効率的な効果を得ることができ、それ
は次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子からなる。
とによって、より効率的な効果を得ることができ、それ
は次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子からなる。
Me tYTrpVa I ThrPhe I 1eS
erLeuLeuPheLeuPheXsX a X
J J +好ましい組合わせとしては第2表のごときも
のが例示される。
erLeuLeuPheLeuPheXsX a X
J J +好ましい組合わせとしては第2表のごときも
のが例示される。
第2表
血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は上述したアミ
ノ酸配列で表現できるDNA配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通りで
ある。
ノ酸配列で表現できるDNA配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通りで
ある。
八Ia:GCT又はGCC,Cys:TGT、 Asp
:GAC,Glu:GAA。
:GAC,Glu:GAA。
Phe4TC,Gly:GGT、 His:GAC,l
ie:ATT又はATCLys:AAG、 Leu:T
TG、 Met:^TG、 Asn:AAC,Pro:
CCA。
ie:ATT又はATCLys:AAG、 Leu:T
TG、 Met:^TG、 Asn:AAC,Pro:
CCA。
Gln:CAA、 Arg:AGA、 Ser:TCT
又はTCC,Thr:AC?又はACC,Val:GT
T又はGTC,Trp:TGG、 Tyr:TAC本発
明における異種蛋白質としては、ヒト血清アルブミン、
インターフェロン−α、βあるいはT、ウロキナーゼ、
成長ホルモン、インツユリン、各種リンホカイン、h
−AN P、血液凝固第■因子、各種C3F、エリスロ
ボエチンなどが挙げられるが、特に限定されるものでは
ない。
又はTCC,Thr:AC?又はACC,Val:GT
T又はGTC,Trp:TGG、 Tyr:TAC本発
明における異種蛋白質としては、ヒト血清アルブミン、
インターフェロン−α、βあるいはT、ウロキナーゼ、
成長ホルモン、インツユリン、各種リンホカイン、h
−AN P、血液凝固第■因子、各種C3F、エリスロ
ボエチンなどが挙げられるが、特に限定されるものでは
ない。
ヒト血清アルブミンの場合はプレ型、プロ型、プレプロ
型を、ウロキナーゼの場合はプロ型などのいずれであっ
ても産生は可能である。異種蛋白質中特に、成熟型のヒ
ト血清アルブミン遺伝子が好ましい。本発明の特徴の一
つは、シグナル配列と成熟型構造遺伝子、特に成熟型ヒ
ト血清アルブミン遺伝子を直接つないだことにあり、こ
れにより驚異的なアルブミンの産生量を達成したのであ
る。
型を、ウロキナーゼの場合はプロ型などのいずれであっ
ても産生は可能である。異種蛋白質中特に、成熟型のヒ
ト血清アルブミン遺伝子が好ましい。本発明の特徴の一
つは、シグナル配列と成熟型構造遺伝子、特に成熟型ヒ
ト血清アルブミン遺伝子を直接つないだことにあり、こ
れにより驚異的なアルブミンの産生量を達成したのであ
る。
このような異種蛋白質遺伝子は、特開昭62=2998
5号公報(ヒト血清アルブミン)、特開昭61−185
189号公報(インターフェロンα)、特開昭61−1
08397号公報(インターフェロン−T)、特開昭6
0−180591号公報(ウロキナーゼ)などに記載さ
れている。
5号公報(ヒト血清アルブミン)、特開昭61−185
189号公報(インターフェロンα)、特開昭61−1
08397号公報(インターフェロン−T)、特開昭6
0−180591号公報(ウロキナーゼ)などに記載さ
れている。
上述の文献中では、異種蛋白質遺伝子を含むプラスミド
として開示されている。
として開示されている。
本発明の酵母を形質転換するための組換えDNAは、血
清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋白
質遺伝子を自体既知の手段で連結し、さらに自体既知の
手段にてプラスミド又は染色体内に導入し、調製される
。
清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋白
質遺伝子を自体既知の手段で連結し、さらに自体既知の
手段にてプラスミド又は染色体内に導入し、調製される
。
プロモーターおよびターミネータ−は酵母で機能するも
のであれば特に限定されない。
のであれば特に限定されない。
プロモーターとしては、PGKプロモーター(Nucl
eic Ac1d Res、 10 (23)
7791 (1982))、ADHプロモーター(N
ucleic Ac1d Res、IO(23) 77
91(1982)) 、p h o E(5)プロモー
ター(J、Mo1.Biol。
eic Ac1d Res、 10 (23)
7791 (1982))、ADHプロモーター(N
ucleic Ac1d Res、IO(23) 77
91(1982)) 、p h o E(5)プロモー
ター(J、Mo1.Biol。
月穣−(4) 513 (1983)) 、GA L
lプロモーター(Mo1. Ce11. Biol
、 4 (11) 2467 (1984))
、GALIOプロモーター(Mo1. Ce11.
Biol、 、1(11)2467 (1984))
、GAP−DHプロモーター(J。
lプロモーター(Mo1. Ce11. Biol
、 4 (11) 2467 (1984))
、GALIOプロモーター(Mo1. Ce11.
Biol、 、1(11)2467 (1984))
、GAP−DHプロモーター(J。
Riot、 Chew、 2585291 (1983
))などが好適に使用される。特にCALIプロモータ
ーとの組み合わせが好ましい。
))などが好適に使用される。特にCALIプロモータ
ーとの組み合わせが好ましい。
プロモーターは血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子
の上流に位置する。
の上流に位置する。
ターミネータ−としてはphoE(5)ターミネータ−
(Ce11.12.721−732 (1977))、
GAPDHターミネータ−〇、 Biol、 Chef
fi、、 254 9839−9845(1979))
などが好適に使用される。
(Ce11.12.721−732 (1977))、
GAPDHターミネータ−〇、 Biol、 Chef
fi、、 254 9839−9845(1979))
などが好適に使用される。
ターミネータ−は異種蛋白質遺伝子の下流に位置する。
プロモーター、ターミネータ−は各々プラスミドに組み
込まれた形で入手される。
込まれた形で入手される。
プラスミドDNAは酵母中で自律複製可能なものであれ
ば特に限定されない。
ば特に限定されない。
具体的には、pJDB207 (アマージャム社。
製)、ρJDB219(アマ−ジャム社製)などが例示
される。
される。
本発明のmtaえプラスミドは、上述したプラスミド群
から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子−異
種蛋白質遺伝子からなるDNA配列、プロモーターを含
むDNA配列およびターミネータ−を含むDNA配列を
制限酵素により切り出した後に連結(接続)して適当な
プラスミドに組み込むか、または、一方のDNA配列を
切り出した後に他方のプラスミド中に組み込むかのいず
れかの方法により得られる。また、本発明の組換え染色
体は、以下の文献に記載された方法で酵母染色体中にプ
ロモーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、
異種蛋白質遺伝子、ターミネータ−を挿入して得られる
。(Proc、 Nael、^cad、 Sci。
から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子−異
種蛋白質遺伝子からなるDNA配列、プロモーターを含
むDNA配列およびターミネータ−を含むDNA配列を
制限酵素により切り出した後に連結(接続)して適当な
プラスミドに組み込むか、または、一方のDNA配列を
切り出した後に他方のプラスミド中に組み込むかのいず
れかの方法により得られる。また、本発明の組換え染色
体は、以下の文献に記載された方法で酵母染色体中にプ
ロモーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、
異種蛋白質遺伝子、ターミネータ−を挿入して得られる
。(Proc、 Nael、^cad、 Sci。
(口、S、A、)、 ヱ8. 6354−6358
(1981))、 (MethodEnzymol
、、 101 228−245 (1983))その際
、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモーター
、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異種蛋白質
遺伝子、ターミネータ−となるように調製する。
(1981))、 (MethodEnzymol
、、 101 228−245 (1983))その際
、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモーター
、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異種蛋白質
遺伝子、ターミネータ−となるように調製する。
また、選別時のマーカーとして、抗生′!!yJ質〔テ
トラサイタリン、アンピシリン、カナマイシン]耐性遺
伝子あるいは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込む
ことも可能である。
トラサイタリン、アンピシリン、カナマイシン]耐性遺
伝子あるいは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込む
ことも可能である。
この1tAえプラスミドを用いて形質転換体を製作する
方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以下の通りで
ある。
方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以下の通りで
ある。
組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞とし
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラスミ
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サン力ロミセス・セレビシs (Saccharomy
ceScereviSiae) AlI22(ahis
4. leu 2. can l)等が好適に用いら
れる。
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラスミ
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サン力ロミセス・セレビシs (Saccharomy
ceScereviSiae) AlI22(ahis
4. leu 2. can l)等が好適に用いら
れる。
宿主細胞(酵母)の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロポレーション法などによ
り行う。
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロポレーション法などによ
り行う。
必要な形質転換体を選択する。
形質転換株は、宿主細胞の自体公知の培地で培養する。
培地としてはYNB液体培地〔0,7%Yeast N
itrogen Ba5e (Difco社)、2%グ
ルコース〕、およびYPD液体培地(1%イーストエキ
ストラクト(Difco社)、2%ポリペプトン(大五
栄養社)2%グルコース〕などが例示される。
itrogen Ba5e (Difco社)、2%グ
ルコース〕、およびYPD液体培地(1%イーストエキ
ストラクト(Difco社)、2%ポリペプトン(大五
栄養社)2%グルコース〕などが例示される。
培養は、通常15〜43°C(好適には30’C程度)
で20〜100時間程度行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。
で20〜100時間程度行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。
培養後、培養上清を回収し、自体公知の方法、たとえば
アフィニティクロマトグラフィー、分画法などにより異
種蛋白質を精製する。
アフィニティクロマトグラフィー、分画法などにより異
種蛋白質を精製する。
本発明の方法により、目的とする異種蛋白質を分泌発現
で生産することができ、細胞内で蓄積する系に比較して
、より自然な蛋白質に近い機能および構造を有する異種
蛋白質の生産が期待できる。
で生産することができ、細胞内で蓄積する系に比較して
、より自然な蛋白質に近い機能および構造を有する異種
蛋白質の生産が期待できる。
また、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系では目的蛋白質
を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目的
蛋白質を精製する必要があが、本発明の方法によればか
かる精製の必要がない。
を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目的
蛋白質を精製する必要があが、本発明の方法によればか
かる精製の必要がない。
特に蛋白質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについ
て血清アルブミンシグナルペプチドを選択したことによ
り、新たな発現系が確立でき、異種蛋白質の効率的な発
現に対しても有用と考えられる。さらに本発明の系は、
成熟型ヒトアルブミン遺伝子の発現・産生糸において、
約160■/lのアルブミンの産生という驚異的な成果
を得た。
て血清アルブミンシグナルペプチドを選択したことによ
り、新たな発現系が確立でき、異種蛋白質の効率的な発
現に対しても有用と考えられる。さらに本発明の系は、
成熟型ヒトアルブミン遺伝子の発現・産生糸において、
約160■/lのアルブミンの産生という驚異的な成果
を得た。
また、適宜アルブミンシグナル配列を変異(例えば第2
表)することにより、産生させるアルブミンのN末端部
が正確に切断された。
表)することにより、産生させるアルブミンのN末端部
が正確に切断された。
本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。
なお、本発明において多くの技法、反応および分析方法
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造;ニ
ューイングランド バイオラプス(NEB) (New
England Biolabs(NEB))マサチ
ューセッツ、米国ニアマージャム(Amersham)
、英国およびベセスダ リサーチ ラボラトリーズ(B
eLhesda Re5earch Labolato
ries(BRL) ) 、メリーランド、米国から入
手することができる。
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造;ニ
ューイングランド バイオラプス(NEB) (New
England Biolabs(NEB))マサチ
ューセッツ、米国ニアマージャム(Amersham)
、英国およびベセスダ リサーチ ラボラトリーズ(B
eLhesda Re5earch Labolato
ries(BRL) ) 、メリーランド、米国から入
手することができる。
酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハイ
ブリダイゼーション法、電気泳動法およびDNAのゲル
からの回収法は、[モレキュラークローニングJコール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−(rMolecul
er Cloning J Co1d Springt
larbor Laboratory (1982))
に記載されている方法により行った。酵母の形質転換法
は、[メソッド・イン・イースト・ジエネティクス」コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−(rMetho
d 1nYeast Genetics」) (Co
ld Spring l1arbor Labo−ra
tory) (1981)に記載されている方法で行っ
た。
ブリダイゼーション法、電気泳動法およびDNAのゲル
からの回収法は、[モレキュラークローニングJコール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−(rMolecul
er Cloning J Co1d Springt
larbor Laboratory (1982))
に記載されている方法により行った。酵母の形質転換法
は、[メソッド・イン・イースト・ジエネティクス」コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−(rMetho
d 1nYeast Genetics」) (Co
ld Spring l1arbor Labo−ra
tory) (1981)に記載されている方法で行っ
た。
1、酵母GALI 、 10プロモーターのクローニン
グ1−1.酵母染色体DNAライブラリーの作製酵母サ
ツカロミセスセレビシェGRF18 PH080cir
’株(特開昭61−268184号)の染色体DNAを
R,Cryer等の方法(R,Cryer et al
、(1975)門ethodεnzys+o1.+[+
39)で抽出精製した。
グ1−1.酵母染色体DNAライブラリーの作製酵母サ
ツカロミセスセレビシェGRF18 PH080cir
’株(特開昭61−268184号)の染色体DNAを
R,Cryer等の方法(R,Cryer et al
、(1975)門ethodεnzys+o1.+[+
39)で抽出精製した。
M、Johnson and R,W、Davrs (
M、Johnson and l?、W。
M、Johnson and l?、W。
Davis (1984) Mo1.Ce11.Bio
l、、 4.1440−1448.)によれば、酵母G
ALI 、 10プロモーター領域は酵母染色体上にあ
り制限酵素EcoRI及びXba lで消化すると約1
kbのDNA断片として得られる。
l、、 4.1440−1448.)によれば、酵母G
ALI 、 10プロモーター領域は酵母染色体上にあ
り制限酵素EcoRI及びXba lで消化すると約1
kbのDNA断片として得られる。
そこで上記のように抽出精製した酵母染色体DNAをE
coRl及びXba Iで消化し、電気泳動により約1
kbのDNA断片を単離した。これをEcoR1及び
Xba l消化し、子牛小腸由来アルカリホスファター
ゼ(CIP)で5゛末端のリン酸基を除いたプラスミド
pUc19 (ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製
)と混合し、ライゲーシッンキソト(宝酒造社製)で連
結した。これを大腸菌ニジエリシアコリJM109コン
ピテントセルに導入した。トランスフォーマントを0.
004χX−gal (5−broa+o−4ch1o
ro−3−indolyl−β−Lh ioga la
c tos ide )及び1mMIPTG (iso
propyl−β、D−thiogalactopyr
anoside)含有YTアガープレート(ポリペプト
ン8g、イーストエキストラクト5g、塩化ナトリウム
5gを水に溶解し、1!としだ後12gの寒天束を加え
てオートクレーブ滅菌後、プラスチックシャーレに分注
、固化する。 X−gal、 IPTGはオートクレー
ブ後、培地が冷えてから添加する。)に塗布し、37”
C1−夜培養した。白色及び青色のコロニーが出現する
が、このうちDNAインサートを有するlac Z遺伝
子欠損の白色コロニーのみを100個ずつ40μgir
dアンピシリン含有しアガープレート(トリスペース0
.62g、ポリペプトン10g、イーストエキストラク
ト5g、塩化ナトリウム5gを水に熔解し、12とした
後12gの寒天束を加えてオートクレーブ滅菌し、プラ
スチックシャーレに分注、固化する。アンピシリンはオ
ートクレーブ後、培地が冷えてから添加する。)に滅菌
した爪楊枝にて接種した。このLアガープレートを37
°C1−夜培養した。このような方法で、約5000個
から成るライブラリーを作製した。形成したコロニーを
ニトロセルロースフィルターに移し、0.5門水酸化ナ
トリウム−1,51’l塩化ナトリウムから成る溶液に
浸しDNAを変性させ、次いで1.5M塩化ナトリウム
−0,5M)リス−塩酸、 pH7,5から成る溶液で
中和した。大腸菌の残渣を2xSSC(0,3M塩化ナ
トリウム−0,03Mクエン酸ナトリウム、pH7,0
)で洗浄、除去しフィルターを風乾後、更に80°C1
2時間減圧乾燥した。
coRl及びXba Iで消化し、電気泳動により約1
kbのDNA断片を単離した。これをEcoR1及び
Xba l消化し、子牛小腸由来アルカリホスファター
ゼ(CIP)で5゛末端のリン酸基を除いたプラスミド
pUc19 (ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製
)と混合し、ライゲーシッンキソト(宝酒造社製)で連
結した。これを大腸菌ニジエリシアコリJM109コン
ピテントセルに導入した。トランスフォーマントを0.
004χX−gal (5−broa+o−4ch1o
ro−3−indolyl−β−Lh ioga la
c tos ide )及び1mMIPTG (iso
propyl−β、D−thiogalactopyr
anoside)含有YTアガープレート(ポリペプト
ン8g、イーストエキストラクト5g、塩化ナトリウム
5gを水に溶解し、1!としだ後12gの寒天束を加え
てオートクレーブ滅菌後、プラスチックシャーレに分注
、固化する。 X−gal、 IPTGはオートクレー
ブ後、培地が冷えてから添加する。)に塗布し、37”
C1−夜培養した。白色及び青色のコロニーが出現する
が、このうちDNAインサートを有するlac Z遺伝
子欠損の白色コロニーのみを100個ずつ40μgir
dアンピシリン含有しアガープレート(トリスペース0
.62g、ポリペプトン10g、イーストエキストラク
ト5g、塩化ナトリウム5gを水に熔解し、12とした
後12gの寒天束を加えてオートクレーブ滅菌し、プラ
スチックシャーレに分注、固化する。アンピシリンはオ
ートクレーブ後、培地が冷えてから添加する。)に滅菌
した爪楊枝にて接種した。このLアガープレートを37
°C1−夜培養した。このような方法で、約5000個
から成るライブラリーを作製した。形成したコロニーを
ニトロセルロースフィルターに移し、0.5門水酸化ナ
トリウム−1,51’l塩化ナトリウムから成る溶液に
浸しDNAを変性させ、次いで1.5M塩化ナトリウム
−0,5M)リス−塩酸、 pH7,5から成る溶液で
中和した。大腸菌の残渣を2xSSC(0,3M塩化ナ
トリウム−0,03Mクエン酸ナトリウム、pH7,0
)で洗浄、除去しフィルターを風乾後、更に80°C1
2時間減圧乾燥した。
1−2.プローブの作製
GALL、10プロモーターをコードする遺伝子の塩基
配列の一部をアプライドバイオシステム社製DNA合成
装置モデル381Aを用い、ホスホアミダイト法にて合
成した。その配列を以下に示す。
配列の一部をアプライドバイオシステム社製DNA合成
装置モデル381Aを用い、ホスホアミダイト法にて合
成した。その配列を以下に示す。
5’−CTCTATACTTTAACGTCAAG −
3’これを7M尿素−20χポリアクリルアミドゲルで
電気泳動し、精製した。精製したDNA配列の5“末端
を、[T −”P] ATP及びT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて放射能ラベルした。 合成りNA 1
0 pmoles、 [y−”P] ATP 250
μci、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ8ユニットを
用いた反応により3tpで末端ラベルされた合成りNA
プローブが、2 x 10’ CpOI (セレンコ
フコウント)得られた。合成りNAプローブの精製はN
ENSORB20(デュポン社製)を用いて行った。
3’これを7M尿素−20χポリアクリルアミドゲルで
電気泳動し、精製した。精製したDNA配列の5“末端
を、[T −”P] ATP及びT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて放射能ラベルした。 合成りNA 1
0 pmoles、 [y−”P] ATP 250
μci、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ8ユニットを
用いた反応により3tpで末端ラベルされた合成りNA
プローブが、2 x 10’ CpOI (セレンコ
フコウント)得られた。合成りNAプローブの精製はN
ENSORB20(デュポン社製)を用いて行った。
1−3. GALI、toプロモーターのスクリーニン
グ1−1項でDNAを固定したニトロセルロースフィル
ターを10枚ずつ一組にしてビニール袋に入れ、以下の
処理をした。6 x SSC,0,1X SO5,及び
100°C15分間加熱後氷上で冷却したサケ***DN
A20μg/Idから成るプレハイブリダイゼーション
溶液10 dをビニール袋に入れ、シール後、40℃。
グ1−1項でDNAを固定したニトロセルロースフィル
ターを10枚ずつ一組にしてビニール袋に入れ、以下の
処理をした。6 x SSC,0,1X SO5,及び
100°C15分間加熱後氷上で冷却したサケ***DN
A20μg/Idから成るプレハイブリダイゼーション
溶液10 dをビニール袋に入れ、シール後、40℃。
3時間インキュベートした。プレハイブリダイゼーショ
ン液を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶l夜lO−を
入れて、40°C1−夜インキユベートした。
ン液を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶l夜lO−を
入れて、40°C1−夜インキユベートした。
ハイブリダイゼーション溶液の組成は6 x SSC。
0.1χS05.100μg/Idサケ***DNA、
?、5 x 10’CpIl/−の!p−プローブとし
た。インキュベート・終了後、フィルターをビーカーに
移し、6 x 5SCO,1χSDSで50”C,30
分間、2 x SSC,0,1χSOSで50”C,3
0分間、2 x SSC,0,1χSOSで50°C,
30分間、最後に0.1 x SSC,0,1χSDS
で50’C,30分間の順に洗浄した。洗浄したフィル
ターは風乾し、100−200 cp−のマークをスポ
ットした後オートラジオグラフィーした。その結果、2
個のポジティブクローンが得られた。このうちの1クロ
ーンを40gg/aJiアンピシリン含有スーパーブロ
ス(バタトトリプトン12g、イーストエキストラクト
24g、グリセロール5Idを水に溶解し900Idと
してオートクレーブ滅菌したA?&、及びリン酸2水素
カリウム3.81g、 リン酸l水素カリウム12.
5 gを水に溶解し10(ldとしてオートクレーブ滅
菌したB?aを9:Hv/v)の割合で混合したもの)
中37°C1−夜振盪培養し、アルカリSDS法にてプ
ラスミドDNAを抽出精製した。このプラスミドD N
A (pGALll、図1)について−部塩基配列を
ダイデオキシ法にて調べたところ、報告されている配列
(M、Johnston and R,W、Davis
(1984) Mo1. Ce11.Biol、、4.
1440−1448.)と一致した。 pGALllは
EcoR1部位からXba 1部位の方向にGALIプ
ロモーター、逆の方向にGALIOプロモーターを有し
ている。
?、5 x 10’CpIl/−の!p−プローブとし
た。インキュベート・終了後、フィルターをビーカーに
移し、6 x 5SCO,1χSDSで50”C,30
分間、2 x SSC,0,1χSOSで50”C,3
0分間、2 x SSC,0,1χSOSで50°C,
30分間、最後に0.1 x SSC,0,1χSDS
で50’C,30分間の順に洗浄した。洗浄したフィル
ターは風乾し、100−200 cp−のマークをスポ
ットした後オートラジオグラフィーした。その結果、2
個のポジティブクローンが得られた。このうちの1クロ
ーンを40gg/aJiアンピシリン含有スーパーブロ
ス(バタトトリプトン12g、イーストエキストラクト
24g、グリセロール5Idを水に溶解し900Idと
してオートクレーブ滅菌したA?&、及びリン酸2水素
カリウム3.81g、 リン酸l水素カリウム12.
5 gを水に溶解し10(ldとしてオートクレーブ滅
菌したB?aを9:Hv/v)の割合で混合したもの)
中37°C1−夜振盪培養し、アルカリSDS法にてプ
ラスミドDNAを抽出精製した。このプラスミドD N
A (pGALll、図1)について−部塩基配列を
ダイデオキシ法にて調べたところ、報告されている配列
(M、Johnston and R,W、Davis
(1984) Mo1. Ce11.Biol、、4.
1440−1448.)と一致した。 pGALllは
EcoR1部位からXba 1部位の方向にGALIプ
ロモーター、逆の方向にGALIOプロモーターを有し
ている。
1−4. pGALll Xba 1部位の[lam8
1部位への変換pGALll上のプロモーター配列を、
シグナルペプチド及びヒト血清アルブミン蛍白質をコー
ドするDNA配列と連結する場合に、Xba 1部位を
介する事はヒト血清アルブミン遺伝子上にXba 1部
位が存在するので不都合である。そこで、Xba 1部
位をBam1l I部位に変換した。pGALllをX
ba 1消化後、dGTP、 dATP、 dTTP、
dCTP存在下、大腸菌由来DNAポリメラーゼI、
クレノウ断片により付着末端を修復した。このDNA断
片に5°末端がリン酸化されたBamHIリンカ−、C
GGATCCGを加え、T4 DNAリガーゼにより連
結した。これをBamHIで消化後、再度T4 [IN
A リガーゼにより連結し大腸菌ニジエリシアコリ I
I 8101に導入した。
1部位への変換pGALll上のプロモーター配列を、
シグナルペプチド及びヒト血清アルブミン蛍白質をコー
ドするDNA配列と連結する場合に、Xba 1部位を
介する事はヒト血清アルブミン遺伝子上にXba 1部
位が存在するので不都合である。そこで、Xba 1部
位をBam1l I部位に変換した。pGALllをX
ba 1消化後、dGTP、 dATP、 dTTP、
dCTP存在下、大腸菌由来DNAポリメラーゼI、
クレノウ断片により付着末端を修復した。このDNA断
片に5°末端がリン酸化されたBamHIリンカ−、C
GGATCCGを加え、T4 DNAリガーゼにより連
結した。これをBamHIで消化後、再度T4 [IN
A リガーゼにより連結し大腸菌ニジエリシアコリ I
I 8101に導入した。
得られたトランスフォーマントより図1に示したプラス
ミドpGALI2を有するクローンを得た。
ミドpGALI2を有するクローンを得た。
pGAL12をEcoRr及びF3amHIで消化する
事により、約1kbのDNA断片としてGALL及びG
ALIOプロモーターを単離できる。
事により、約1kbのDNA断片としてGALL及びG
ALIOプロモーターを単離できる。
2、酵母pho5ターミネータ−を有する大腸菌・酵母
シャトルベクターpP丁20作製 特開昭62−151183号公報に述べられた酵母サツ
カロミセスセレビシェρho5遺伝子をコードしたプラ
スミドpAP5を制限酵素5au3A I及びPstl
で消化し、約370 bpのpho5ターミネータ−を
コードしたDNA断片を電気泳動で単離した(図2)。
シャトルベクターpP丁20作製 特開昭62−151183号公報に述べられた酵母サツ
カロミセスセレビシェρho5遺伝子をコードしたプラ
スミドpAP5を制限酵素5au3A I及びPstl
で消化し、約370 bpのpho5ターミネータ−を
コードしたDNA断片を電気泳動で単離した(図2)。
市販のプラスミドpUc9をBan+)l I及びPs
tfで消化し、アルカリホスファターゼで処理後、上記
370 bp断片と連結した。 370 bp断片の5
au3A I切断部位の塩基配列は GATCC・・・・ G ・・・・ であり、これはBal1l(r付着末端と連結するとB
am)1 1部位が再生される。従って、上記連結反応
で得られたプラスミドpPT1をBamHI及びPst
Eで消化する事により、あるいはBag)l I及
び11ind mで消化する事により370bpのph
o5ターミネークーを有するDNA断片が得られる(図
2)。
tfで消化し、アルカリホスファターゼで処理後、上記
370 bp断片と連結した。 370 bp断片の5
au3A I切断部位の塩基配列は GATCC・・・・ G ・・・・ であり、これはBal1l(r付着末端と連結するとB
am)1 1部位が再生される。従って、上記連結反応
で得られたプラスミドpPT1をBamHI及びPst
Eで消化する事により、あるいはBag)l I及
び11ind mで消化する事により370bpのph
o5ターミネークーを有するDNA断片が得られる(図
2)。
市販のシャトルベクターpJDB201 (図3)は大
腸菌及び酵母中で自律複製が可能である。これをBam
tl IおよびHrnd IIIで消化後、アルカリホ
スファターゼ処理した。PPTlをBaa)l I及び
旧ndlllで消化後、約370 bpのρho5ター
ミネーターを有するDNA断片を電気泳動で単離し、上
記pJ[1B207 と連結した。得られたトランスフ
ォーマントより、図3に示したプラスミドpPT2を有
するクローンを得た。pPT2はpho5ターミネータ
−を有する大腸菌・酵母シャトルベクターであり、大腸
菌においてはβラクタマーゼによるアンピシリン耐性の
マーカー、酵母においてはロイシン栄養要求性を補うマ
ーカーをそれぞれ有している。
腸菌及び酵母中で自律複製が可能である。これをBam
tl IおよびHrnd IIIで消化後、アルカリホ
スファターゼ処理した。PPTlをBaa)l I及び
旧ndlllで消化後、約370 bpのρho5ター
ミネーターを有するDNA断片を電気泳動で単離し、上
記pJ[1B207 と連結した。得られたトランスフ
ォーマントより、図3に示したプラスミドpPT2を有
するクローンを得た。pPT2はpho5ターミネータ
−を有する大腸菌・酵母シャトルベクターであり、大腸
菌においてはβラクタマーゼによるアンピシリン耐性の
マーカー、酵母においてはロイシン栄養要求性を補うマ
ーカーをそれぞれ有している。
3、ヒト血清アルブミン遺伝子
ヒト血清アルブミンをコードするDNA配列は特開昭6
2−29985に述べられたプラスミドpcx4oi(
図4.5)に由来し、以下のように誘導した。
2−29985に述べられたプラスミドpcx4oi(
図4.5)に由来し、以下のように誘導した。
プラスミドpGX401を制限酵素Xba I及び旧n
d [[で消化し、ヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ
酸配列C末端側2571eu、、 58%18.及び3
“非翻訳領域をコードする、約750 bp(7) D
N A断片(DNA2)を電気泳動で単離した。市販
のプラスミドPUC19をXba I及びHind I
[[で消化し更にアルカリホスファターゼで処理し、5
゛末端のリン酸基を除去した後、T4 DNAリガーゼ
により1IsA2と連結した。
d [[で消化し、ヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ
酸配列C末端側2571eu、、 58%18.及び3
“非翻訳領域をコードする、約750 bp(7) D
N A断片(DNA2)を電気泳動で単離した。市販
のプラスミドPUC19をXba I及びHind I
[[で消化し更にアルカリホスファターゼで処理し、5
゛末端のリン酸基を除去した後、T4 DNAリガーゼ
により1IsA2と連結した。
これを大腸菌ニジエリシアコリ)IBIOIに導入し、
得られたトランスフォーマントより図6に示したプラス
ミドpHsA2を有するクローンを得た。
得られたトランスフォーマントより図6に示したプラス
ミドpHsA2を有するクローンを得た。
pGX4旧をDra I及びXba Iで消化し、約1
kbのDNA断片を電気泳動で単離した。このDNA
断片はヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ酸配列N末端
側+zlys、% S”ThrをコードするDNA配列
である。
kbのDNA断片を電気泳動で単離した。このDNA
断片はヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ酸配列N末端
側+zlys、% S”ThrをコードするDNA配列
である。
アプライドバイオシステム社製DNA合成機モデル38
1Aを用いてホスホアミダイト法にて成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質のアミノ酸配列N末端Asp〜”Pheを
コードする以下のDNA配列を合成した。
1Aを用いてホスホアミダイト法にて成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質のアミノ酸配列N末端Asp〜”Pheを
コードする以下のDNA配列を合成した。
Asp Ala His Lys Ser Glu V
al Ala His Arg PheTCGACGC
A CACAAG AGT GAG GTT
GCT CAT CGG TTTG CGT
GTG TTCTCA CTCCAA CG
A GTA GCCAAAアスパラギン酸(Asp
)をコードするコドンはpGX401ではGATであっ
たが、ここではGACとした。
al Ala His Arg PheTCGACGC
A CACAAG AGT GAG GTT
GCT CAT CGG TTTG CGT
GTG TTCTCA CTCCAA CG
A GTA GCCAAAアスパラギン酸(Asp
)をコードするコドンはpGX401ではGATであっ
たが、ここではGACとした。
その結果、上記合成りNAを前記pGX401由来の約
1kb DNA断片と連結後、pUc19のSal l
−Xba 1部位に挿入するとSal1部位が再生さ
れる。しかも、11incllで消化すれば成熟ヒト血
清アルブミンのN末端’Aspから始まるアミノ酸配列
をコードしたDNA配列が得られる。
1kb DNA断片と連結後、pUc19のSal l
−Xba 1部位に挿入するとSal1部位が再生さ
れる。しかも、11incllで消化すれば成熟ヒト血
清アルブミンのN末端’Aspから始まるアミノ酸配列
をコードしたDNA配列が得られる。
上記合成りNAの5゛末端をATP及びT4ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化し、上記pGX401を
Dra I及びXba Iで消化し電気泳動で単離した
約1kbのDNA断片と74 DNA リガーゼで連結
した。これを大腸菌ニジエリシアコリ HBIOIに導
入し、得られたトランスフォーマントから、図7に示し
たプラスミドpHsA1を有するクローンを得た。
オチドキナーゼによりリン酸化し、上記pGX401を
Dra I及びXba Iで消化し電気泳動で単離した
約1kbのDNA断片と74 DNA リガーゼで連結
した。これを大腸菌ニジエリシアコリ HBIOIに導
入し、得られたトランスフォーマントから、図7に示し
たプラスミドpHsA1を有するクローンを得た。
4、酵母にヒト血清アルブミンを分泌発現させる為のプ
ラスミドDNAの作製 ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドをコードする第
3表のようなりNA配列をアプライドバイオシステム社
製DNA合成機モデル381^を用いホスフォアミダイ
ト法にて合成した。
ラスミドDNAの作製 ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドをコードする第
3表のようなりNA配列をアプライドバイオシステム社
製DNA合成機モデル381^を用いホスフォアミダイ
ト法にて合成した。
また、同様に−17,−5,−4,−3,−2,−1の
部位を各々LysまたはArgまたは旧S、^1aまた
はPro。
部位を各々LysまたはArgまたは旧S、^1aまた
はPro。
LysまたはGly、 ValまたはCyS+ Trp
またはSer。
またはSer。
^1aまたはcryをコードするDNA配列も合成した
。具体例は第2表に示した。これら天然型のアミノ酸を
変更させたアミノ酸をコードするDNA配列を導入した
場合、後述するアルブミンの生産において、産生量を落
とすことなくN末の切断部が、より正値なアルブミンの
発現分泌が達成できた。
。具体例は第2表に示した。これら天然型のアミノ酸を
変更させたアミノ酸をコードするDNA配列を導入した
場合、後述するアルブミンの生産において、産生量を落
とすことなくN末の切断部が、より正値なアルブミンの
発現分泌が達成できた。
上記合成りNAの51末端をATP及びT4ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した。一方、pH5Al
をXba r及びHinc[Iで消化しヒト血清アルブ
ミン蛋白質のN末端側をコードする約1kbのDNA断
片HSAIを電気泳動で単離した。上記リン酸化した合
成りNAとH5AIを混合し、↑4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて連結し、更にXba[及びBam1l
Iで消化した。 pH3A2をXba I及びBa5H
Eで消化後、アルカリホスファターゼで処理した。
オチドキナーゼによりリン酸化した。一方、pH5Al
をXba r及びHinc[Iで消化しヒト血清アルブ
ミン蛋白質のN末端側をコードする約1kbのDNA断
片HSAIを電気泳動で単離した。上記リン酸化した合
成りNAとH5AIを混合し、↑4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて連結し、更にXba[及びBam1l
Iで消化した。 pH3A2をXba I及びBa5H
Eで消化後、アルカリホスファターゼで処理した。
これらのDNAを混合し、T4 DNAリガーゼで連結
後、大腸菌ニジエリシアコリ88101 コンピテント
セルに導入した。得られたトランスフォーマントのうち
、図8に示したプラスミドρNHOOIを有するクロー
ンを得た。
後、大腸菌ニジエリシアコリ88101 コンピテント
セルに導入した。得られたトランスフォーマントのうち
、図8に示したプラスミドρNHOOIを有するクロー
ンを得た。
pNIloolをEcoRI及びBawl Iで消化後
、アルカリホスファターゼで処理した。pGAL12を
EcoRl及びBamHIで消化後、電気泳動によりG
ALIプロモーターを有する1 kbのDNA断片を単
離し、上記処理をしたpNIIoolと混合し、T4
DNAリガーゼにより連結した。得られたトランスフォ
ーマントより、図9に示したプラスミド9NII007
を有するクローンを得た。pNHOO7はGALIプロ
モーター下流にヒト血清アルブミンシグナルペプチドを
コードするDNA配列、及びその直後に成熟ヒト血清ア
ルブミン蛋白質をコードするDNA配列、及びその直後
のヒト血清アルブミンcDNA由来3゜非翻訳領域がp
Uc19のEcoRr−Hindl[1部位に挿入され
たプラスミドDNAである。
、アルカリホスファターゼで処理した。pGAL12を
EcoRl及びBamHIで消化後、電気泳動によりG
ALIプロモーターを有する1 kbのDNA断片を単
離し、上記処理をしたpNIIoolと混合し、T4
DNAリガーゼにより連結した。得られたトランスフォ
ーマントより、図9に示したプラスミド9NII007
を有するクローンを得た。pNHOO7はGALIプロ
モーター下流にヒト血清アルブミンシグナルペプチドを
コードするDNA配列、及びその直後に成熟ヒト血清ア
ルブミン蛋白質をコードするDNA配列、及びその直後
のヒト血清アルブミンcDNA由来3゜非翻訳領域がp
Uc19のEcoRr−Hindl[1部位に挿入され
たプラスミドDNAである。
pNIIo07をBcoRI及び旧ndIIIで消化し
、電気泳動により2.7 kbのGALI プロモータ
ー、シグナルペプチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質
、非翻訳領域をコードしたDNA断片を単離した。又、
pPT2をBamHI消化し、更にアルカリホスファタ
ーゼで処理した。これと上記2.7 kb DNA断片
を混合し、dATP、 dGTP、 dTTP、及びd
CTP存在下、DNAポリメラーゼ1.フレノウ断片に
て付着末端を修復した。更に、↑4 DNAリガーゼに
より連結し、大腸菌ニジエリシアコリ IIBIOIに
導入した。
、電気泳動により2.7 kbのGALI プロモータ
ー、シグナルペプチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質
、非翻訳領域をコードしたDNA断片を単離した。又、
pPT2をBamHI消化し、更にアルカリホスファタ
ーゼで処理した。これと上記2.7 kb DNA断片
を混合し、dATP、 dGTP、 dTTP、及びd
CTP存在下、DNAポリメラーゼ1.フレノウ断片に
て付着末端を修復した。更に、↑4 DNAリガーゼに
より連結し、大腸菌ニジエリシアコリ IIBIOIに
導入した。
得られたトランスフォーマントより、図1Oに示したプ
ラスミドpNI+008を有するクローンを得た。
ラスミドpNI+008を有するクローンを得た。
pNHOO8は大腸菌及び酵母中で自律増殖可能なプラ
スミドで、酵母において機能するGALIプロモーター
の支配下にヒト血清アルブミンシグナルペブチドとそれ
に続いて成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするD
NA配列を有している。更に、ρN)1008は大腸菌
においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及び酵母
においてロイシン栄養要求性を補う遺伝子を有しており
、これらの遺伝子はトランスフォーマントの選択マーカ
ーとして使用可能である。
スミドで、酵母において機能するGALIプロモーター
の支配下にヒト血清アルブミンシグナルペブチドとそれ
に続いて成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするD
NA配列を有している。更に、ρN)1008は大腸菌
においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及び酵母
においてロイシン栄養要求性を補う遺伝子を有しており
、これらの遺伝子はトランスフォーマントの選択マーカ
ーとして使用可能である。
5、プラスミドpNHOO8の酵母への導入とヒト血清
アルブミンの分泌発現 5−1プラスミドpNHOO8の酵母への導入ヒト血清
アルブミン分泌発現用プラスミドpNH008ヲ酵母サ
ツカロミセスセレビシェAH22(Proc、 Na1
1. Acad、 Sci、 USA 75.1929
−1933(1978))に以下の方法により導入した
。
アルブミンの分泌発現 5−1プラスミドpNHOO8の酵母への導入ヒト血清
アルブミン分泌発現用プラスミドpNH008ヲ酵母サ
ツカロミセスセレビシェAH22(Proc、 Na1
1. Acad、 Sci、 USA 75.1929
−1933(1978))に以下の方法により導入した
。
YPDメディウム(イーストエキストラクト10g。
バタトベプトン20 gを水に溶解し900 mとした
後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した
20χグルコース100dと混合した。)50戒中30
°C1−夜振盪培養したサツカロミセスセレビシェAH
22を遠心し、得られた細胞を水20m1に懸/!!i
i後、再度遠心して細胞を得た。これを10dの50
iMジチオスレイトール、1.2Mソルビトール、 2
5 IIIMEDTA、 pH8,5に懸濁し、30°
Cで10分分間中かに振盪した。遠心により細胞を集め
、1.2 Mソルビトール10Idに懸濁し、再度遠心
により細胞を集めた。細胞をIO−の1.2 Mソルビ
トールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞をlO
−の0.2髄g/dザイモリアーゼ100T、 1.2
−ソルビトール、 10mM EDTA、 0.11ク
エン酸ナトリウム、 pH5,8に懸濁後、30’Cで
1時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、1.2M
ソルビトール、次いで10 mM塩化カルシウム、 1
.2 Mソルビトール各10 mlで洗浄し、遠心で細
胞を集めた。
後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した
20χグルコース100dと混合した。)50戒中30
°C1−夜振盪培養したサツカロミセスセレビシェAH
22を遠心し、得られた細胞を水20m1に懸/!!i
i後、再度遠心して細胞を得た。これを10dの50
iMジチオスレイトール、1.2Mソルビトール、 2
5 IIIMEDTA、 pH8,5に懸濁し、30°
Cで10分分間中かに振盪した。遠心により細胞を集め
、1.2 Mソルビトール10Idに懸濁し、再度遠心
により細胞を集めた。細胞をIO−の1.2 Mソルビ
トールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞をlO
−の0.2髄g/dザイモリアーゼ100T、 1.2
−ソルビトール、 10mM EDTA、 0.11ク
エン酸ナトリウム、 pH5,8に懸濁後、30’Cで
1時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、1.2M
ソルビトール、次いで10 mM塩化カルシウム、 1
.2 Mソルビトール各10 mlで洗浄し、遠心で細
胞を集めた。
細胞を1−の10 mM塩化カルシウム、 1.2 M
ソルビトールに懸濁した。懸濁液100μlを滅菌試験
管にとり、5μlc5μg)のpNHOO8と混合し1
.室温に15分間静置した。更に、1.2−の20χポ
リエチレングリコール4000.10 s+M塩化カル
シウム、 10 mM トリス−塩酸、 pn 7.
5を加え穏やかに混合後、室温で20分間静置した。遠
心で細胞を集め、0.1−の1.2Mソルビトール、
10mM塩化カルシウム含有YPDメディウムに懸濁し
、30°Cで30分分間中かに振盪した。懸濁液1.5
.10.20.及び50μlをそれぞれ45°Cに保温
したIO−の1.2Mソルビトール、3χノープルアガ
ー、2χグルコース、0.7χイ一ストナイト口ジエン
ベースに懸濁し、1.211ソルビトール、3χバクト
アガー2χグルコース、0.7χイ一ストナイト口ジェ
ンヘースから成るプレートに拡げた。 プレートが固化
したら、30’Cで3日間静置培養した。形成したコロ
ニーを爪楊枝で採取し、3H1の0.7χイ一ストナイ
ト口ジェンベース、2χグルコースに懸濁後、30°C
で2日間振盪培養した。そのうちの1,5−を遠心し、
細胞を集め3dのvPGメディウム(イーストエキスト
ラクト 10 g、バタトペプトン20gを水に溶解し
900−とした後オートクレーブ滅菌し、別にオートク
レーブ滅菌した20χガラクトース10(ldと混合し
た。)に懸濁し、30℃で振盪培養した。培養上清のヒ
ト血清アルブミン濃度をRPHA法(EP特許第122
620号)にて測定したところ、1日日で最高IOμg
/atのヒト血清アルブミンが検出された。
ソルビトールに懸濁した。懸濁液100μlを滅菌試験
管にとり、5μlc5μg)のpNHOO8と混合し1
.室温に15分間静置した。更に、1.2−の20χポ
リエチレングリコール4000.10 s+M塩化カル
シウム、 10 mM トリス−塩酸、 pn 7.
5を加え穏やかに混合後、室温で20分間静置した。遠
心で細胞を集め、0.1−の1.2Mソルビトール、
10mM塩化カルシウム含有YPDメディウムに懸濁し
、30°Cで30分分間中かに振盪した。懸濁液1.5
.10.20.及び50μlをそれぞれ45°Cに保温
したIO−の1.2Mソルビトール、3χノープルアガ
ー、2χグルコース、0.7χイ一ストナイト口ジエン
ベースに懸濁し、1.211ソルビトール、3χバクト
アガー2χグルコース、0.7χイ一ストナイト口ジェ
ンヘースから成るプレートに拡げた。 プレートが固化
したら、30’Cで3日間静置培養した。形成したコロ
ニーを爪楊枝で採取し、3H1の0.7χイ一ストナイ
ト口ジェンベース、2χグルコースに懸濁後、30°C
で2日間振盪培養した。そのうちの1,5−を遠心し、
細胞を集め3dのvPGメディウム(イーストエキスト
ラクト 10 g、バタトペプトン20gを水に溶解し
900−とした後オートクレーブ滅菌し、別にオートク
レーブ滅菌した20χガラクトース10(ldと混合し
た。)に懸濁し、30℃で振盪培養した。培養上清のヒ
ト血清アルブミン濃度をRPHA法(EP特許第122
620号)にて測定したところ、1日日で最高IOμg
/atのヒト血清アルブミンが検出された。
5−2.ヒト血清アルブミン分泌発現酵母の培養5−1
項で述べたρNHOO8で形質転換されヒト血清アルブ
ミン蛋白質を分泌発現する酵母サツカロミセスセレビシ
ェAH22を以下のように培養した。
項で述べたρNHOO8で形質転換されヒト血清アルブ
ミン蛋白質を分泌発現する酵母サツカロミセスセレビシ
ェAH22を以下のように培養した。
0.7χイ一ストナイト口ジェンベース、2χグルコー
ス33χバクトアガーから成るプレートで生育した上記
組み換え酵母を白金耳で採取し、50m1lの0.7χ
イ一ストナイト口ジエンベース、2χグルコースから成
るYNBメディウムに接種し、30°Cで2日間培養し
た。これを、更に500 mのYNBメディウムに全量
接種し、30°Cで2日間培養した。
ス33χバクトアガーから成るプレートで生育した上記
組み換え酵母を白金耳で採取し、50m1lの0.7χ
イ一ストナイト口ジエンベース、2χグルコースから成
るYNBメディウムに接種し、30°Cで2日間培養し
た。これを、更に500 mのYNBメディウムに全量
接種し、30°Cで2日間培養した。
遠心により細胞を集め、500dのYPGメディウムに
懸濁し、30°Cで振盪培養した。0.3.6.24.
48時間毎に培養液の一部を採取し、遠心で培養上清を
得、RPHA法にて培養液中に分泌されたヒト血清アル
ブミン濃度を測定した。その結果、培養開始3時間目か
ら僅かにヒト血清アルブミンの分泌発現が検出され、6
時間目で0.25■/l、24時間目で20mg/j!
、48時間目で160mg、lのヒト血清アルブミンの
分泌発現が検出された。
懸濁し、30°Cで振盪培養した。0.3.6.24.
48時間毎に培養液の一部を採取し、遠心で培養上清を
得、RPHA法にて培養液中に分泌されたヒト血清アル
ブミン濃度を測定した。その結果、培養開始3時間目か
ら僅かにヒト血清アルブミンの分泌発現が検出され、6
時間目で0.25■/l、24時間目で20mg/j!
、48時間目で160mg、lのヒト血清アルブミンの
分泌発現が検出された。
図1はGALI、10プロモーターを有するプラスミド
pGAL11からpGAL12を構築する手順を示す。 図2はpho5遺伝子全体を有するプラスミドpAps
とpUc9から、pho5ターミネータ−だけを有する
pPTlを構築する手順を示す。 図3はpho5ターミネータ−を有するプラスミドとp
JDB207からpPT2を構築する手順を示す。 図4および5はプレプロヒト血清アルブミン遺伝子を有
すプラスミドpGX401の制限酵素地図を示す。 図6はプラスミドpGX401とpUc9からヒト血清
アルブミン遺伝子C末端側を有するpH3A2を構築す
る手順を示す。 図7はプラスミドpGX401とρυC9からヒト血清
アルブミン遺伝子N末端側を有するTlll5AIを構
築する手順を示す。 図8は、pH5A1 、pHsA2および合成したシグ
ナルペプチド遺伝子からシグナルペプチド遺伝子および
成熟ヒト血清アルブミン遺伝子を有するプラスミドpN
I1001を構築する手順を示す。 図9はpN+1001とpGAL12から、GaLlプ
ロモーターシグナルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清
アルブミン遺伝子を有するプラスミドpNHOO7を構
築する手順を示す。 図10はpNHOO7とpPT2から、GALIプロモ
ーターシグナルペプチド遺伝子、成熟ヒト血清アルブミ
ン遺伝子およびpho5ターミネータ−を有するプラス
ミドpNII008を構築する手順を示す。 目 手続(市正書(自発) 昭和63年9月14日 1、事件の表示 昭和63年特許願第103339号 2、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えDNA、形質転換体 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名(名称) 株式会社 ミドリ十字 4代理人■541 住所 大阪市東区平野町4丁目56番地(場末ビル) Ta (06) 227−1156 5、補正の対象 簡単な説明」の欄および「図面」 6、補正の内容 (1)明細書第39頁第5行の次行に以下の記載を加入
する。 「実験例 ヒト血清アルブミン(以下、H3Aという)シグナルペ
プチド遺伝子および成熟型)ISA遺伝子からなるプラ
スミド(pHHOO8)と、プレプロISA遺伝子(H
5^シグナルペプチド遺伝子(プレ配列)、ISAプロ
配列および成熟型ISA遺伝子を存する〕からなるプラ
スミド(pNl1006)を用いてH3A発現量を比較
した。 (pNHOO6の調製) 実施例において、プレプロll5A遺伝子を有するプラ
スミドpGX401からプレプロll5A遺伝子全体を
切り出す(実施例では成熟型)1sA遺伝子のみを切り
出した)以外はほぼ実施例に準じて行い、GALIOプ
ロモーター、ll5Aシグナルペプチド遺伝子、ll5
Aプロ配列、成熟型+15A遺伝子およびpho5ター
ミネータ−を有するISA発現用プラスミドpNHOO
6を構築した。詳細を以下に示す。 1 、 pNII004の構築 GALIプロモーター/GALIOプロモーターを有す
るpGAL12 (3,7kb)およびpLlc19
(2,7kb)からGALlOプロモーターを有するp
Nllo04 (2,7kb)を構築した。 (+) pGAL12をEcoRlおよびKpn I
で消化してGALIOプロモーター断片(690bp)
を回収(2)合成リンカ− をカイネーション処理 (3) (i ) (2)の合成リンカ−と(1)の断
片を混合(ii) T4DN八リガーゼ処理 (ij ) BamHIおよびXba Iで消化(4)
(i ) pLIc19をBaIIIHIおよびXb
a Iで消化(ii)アルカリホスファターゼ処理 (5) (i ) (3)の断片と(4)のベクターを
混合(ii) T4 DNAリガーゼ処理 2、 pNII005の構築 pNII004およびプレプC)IIsA遺伝子を有す
るPGX401(6,3kb)から、GALIOプロモ
ーター−プレプロll5A遺伝子を有するpNHOO5
(4,5kb)を構築した。 (1) pGX401を旧ndl[[およびBstE
I[で消化してブレブOH5A遺伝子断片(1,8kb
)を回収(21(i ) pNl+004を旧nd[I
IおよびBstEIIで消化(11)アルカリホスファ
ターゼ処理 (3) (i ) (2)の断片と(3)のベクターを
混合(ii) T4 DNAリガーゼ処理 3、 pNIIo06の構築 pNHOO5およびpho5ターミネータ−を有するp
PT2(7,3kb)から、GALIOプロモーター−
プレプロH5A遺伝子=pho5ターミネータ−を有す
るpNHOO6(10kb)を構築した。 (1) pNHOO5をBamH+およびtlind
l[Iで消化してGALIOプロモーター−プレプロl
5A遺伝子断片(2,7kb)を回収 (2) (i ) pPT2をBawl Iで消化(i
i)アルカリホスファターゼ処理 (3) (i ) (1)の断片と(2)のベクターを
混合(ii) dNTPおよびフレノウ断片を添加し、
1)NAポリメラーゼIで処理 (iii) 74 ONへりガーゼ処理(酵母への導入
と発現) 実施例に準じて行った。 (結果) 両プラスミドを用いた場合のH5A発現量(■/l)を
第1表に示す。 第1表 Time(hr) 0 24スミドp
NHOO5を構築する手順を示す。 図B ハpNIloO5トpPT2カラ、GAL107
’ l:l −T−−タブレプロヒト血清アルブミン遺
伝子およびρho5ターミネーターを有するプラスミド
pN11006を構築する手順を示す、」 (3)図面の図Aおよび図Bを別紙の通り加入する。 115A (mg/ l ) 00.0039
0.0625 115A(ag/f) 0 20 16
0(2)明細書第40頁第14行の次行に以下の記載を
加入する。 r図Aは7” ラス:、 t’ pGAL12とpUc
19がらGALIOプロモーターを有するプラスミドp
NI+004を構築した後に、pN11004とpGX
401がらGALIOプロモータープレプロヒト血清ア
ルブミン遺伝子を有するプラ」 手続補正書 1゜事件の表示 昭和63年特許願第103339号 2、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えDNA、形質転換体 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市中央区今橋−丁目3番3号(平成1年2月
13日住居表示変更実施)氏名(名称) 株式会社 ミ
ドリ十字 4、代理人 ■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(場末ビル) Ta (06) 227−1156 6、補正の対象 昭和63年9月14日提出の手続補正書の補正の内容の
欄 7、補正の内容 (+) 昭和63年9月14日提出の手続補正書(以
下、原補正書という)第5真下から第4行に「図Aはプ
ラスミド」とあるのを[第11図はプラスミド」と補正
する。 0) 原補正書第6頁第2行に「図Bは」とあるのを「
第12図は」と補正する。 (3)原補正書第6頁第6行〜最下行に「(3) 図
面の図Aおよび図Bを別紙の通り加入する。」とあるの
を r(3)図面の第11図および第12図を別紙の通り加
入する。」と補正する。 (4) 別紙の通り、原補正書に添付の図Aを第11
図に、図Bを第12図に差し替える。
pGAL11からpGAL12を構築する手順を示す。 図2はpho5遺伝子全体を有するプラスミドpAps
とpUc9から、pho5ターミネータ−だけを有する
pPTlを構築する手順を示す。 図3はpho5ターミネータ−を有するプラスミドとp
JDB207からpPT2を構築する手順を示す。 図4および5はプレプロヒト血清アルブミン遺伝子を有
すプラスミドpGX401の制限酵素地図を示す。 図6はプラスミドpGX401とpUc9からヒト血清
アルブミン遺伝子C末端側を有するpH3A2を構築す
る手順を示す。 図7はプラスミドpGX401とρυC9からヒト血清
アルブミン遺伝子N末端側を有するTlll5AIを構
築する手順を示す。 図8は、pH5A1 、pHsA2および合成したシグ
ナルペプチド遺伝子からシグナルペプチド遺伝子および
成熟ヒト血清アルブミン遺伝子を有するプラスミドpN
I1001を構築する手順を示す。 図9はpN+1001とpGAL12から、GaLlプ
ロモーターシグナルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清
アルブミン遺伝子を有するプラスミドpNHOO7を構
築する手順を示す。 図10はpNHOO7とpPT2から、GALIプロモ
ーターシグナルペプチド遺伝子、成熟ヒト血清アルブミ
ン遺伝子およびpho5ターミネータ−を有するプラス
ミドpNII008を構築する手順を示す。 目 手続(市正書(自発) 昭和63年9月14日 1、事件の表示 昭和63年特許願第103339号 2、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えDNA、形質転換体 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名(名称) 株式会社 ミドリ十字 4代理人■541 住所 大阪市東区平野町4丁目56番地(場末ビル) Ta (06) 227−1156 5、補正の対象 簡単な説明」の欄および「図面」 6、補正の内容 (1)明細書第39頁第5行の次行に以下の記載を加入
する。 「実験例 ヒト血清アルブミン(以下、H3Aという)シグナルペ
プチド遺伝子および成熟型)ISA遺伝子からなるプラ
スミド(pHHOO8)と、プレプロISA遺伝子(H
5^シグナルペプチド遺伝子(プレ配列)、ISAプロ
配列および成熟型ISA遺伝子を存する〕からなるプラ
スミド(pNl1006)を用いてH3A発現量を比較
した。 (pNHOO6の調製) 実施例において、プレプロll5A遺伝子を有するプラ
スミドpGX401からプレプロll5A遺伝子全体を
切り出す(実施例では成熟型)1sA遺伝子のみを切り
出した)以外はほぼ実施例に準じて行い、GALIOプ
ロモーター、ll5Aシグナルペプチド遺伝子、ll5
Aプロ配列、成熟型+15A遺伝子およびpho5ター
ミネータ−を有するISA発現用プラスミドpNHOO
6を構築した。詳細を以下に示す。 1 、 pNII004の構築 GALIプロモーター/GALIOプロモーターを有す
るpGAL12 (3,7kb)およびpLlc19
(2,7kb)からGALlOプロモーターを有するp
Nllo04 (2,7kb)を構築した。 (+) pGAL12をEcoRlおよびKpn I
で消化してGALIOプロモーター断片(690bp)
を回収(2)合成リンカ− をカイネーション処理 (3) (i ) (2)の合成リンカ−と(1)の断
片を混合(ii) T4DN八リガーゼ処理 (ij ) BamHIおよびXba Iで消化(4)
(i ) pLIc19をBaIIIHIおよびXb
a Iで消化(ii)アルカリホスファターゼ処理 (5) (i ) (3)の断片と(4)のベクターを
混合(ii) T4 DNAリガーゼ処理 2、 pNII005の構築 pNII004およびプレプC)IIsA遺伝子を有す
るPGX401(6,3kb)から、GALIOプロモ
ーター−プレプロll5A遺伝子を有するpNHOO5
(4,5kb)を構築した。 (1) pGX401を旧ndl[[およびBstE
I[で消化してブレブOH5A遺伝子断片(1,8kb
)を回収(21(i ) pNl+004を旧nd[I
IおよびBstEIIで消化(11)アルカリホスファ
ターゼ処理 (3) (i ) (2)の断片と(3)のベクターを
混合(ii) T4 DNAリガーゼ処理 3、 pNIIo06の構築 pNHOO5およびpho5ターミネータ−を有するp
PT2(7,3kb)から、GALIOプロモーター−
プレプロH5A遺伝子=pho5ターミネータ−を有す
るpNHOO6(10kb)を構築した。 (1) pNHOO5をBamH+およびtlind
l[Iで消化してGALIOプロモーター−プレプロl
5A遺伝子断片(2,7kb)を回収 (2) (i ) pPT2をBawl Iで消化(i
i)アルカリホスファターゼ処理 (3) (i ) (1)の断片と(2)のベクターを
混合(ii) dNTPおよびフレノウ断片を添加し、
1)NAポリメラーゼIで処理 (iii) 74 ONへりガーゼ処理(酵母への導入
と発現) 実施例に準じて行った。 (結果) 両プラスミドを用いた場合のH5A発現量(■/l)を
第1表に示す。 第1表 Time(hr) 0 24スミドp
NHOO5を構築する手順を示す。 図B ハpNIloO5トpPT2カラ、GAL107
’ l:l −T−−タブレプロヒト血清アルブミン遺
伝子およびρho5ターミネーターを有するプラスミド
pN11006を構築する手順を示す、」 (3)図面の図Aおよび図Bを別紙の通り加入する。 115A (mg/ l ) 00.0039
0.0625 115A(ag/f) 0 20 16
0(2)明細書第40頁第14行の次行に以下の記載を
加入する。 r図Aは7” ラス:、 t’ pGAL12とpUc
19がらGALIOプロモーターを有するプラスミドp
NI+004を構築した後に、pN11004とpGX
401がらGALIOプロモータープレプロヒト血清ア
ルブミン遺伝子を有するプラ」 手続補正書 1゜事件の表示 昭和63年特許願第103339号 2、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えDNA、形質転換体 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市中央区今橋−丁目3番3号(平成1年2月
13日住居表示変更実施)氏名(名称) 株式会社 ミ
ドリ十字 4、代理人 ■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(場末ビル) Ta (06) 227−1156 6、補正の対象 昭和63年9月14日提出の手続補正書の補正の内容の
欄 7、補正の内容 (+) 昭和63年9月14日提出の手続補正書(以
下、原補正書という)第5真下から第4行に「図Aはプ
ラスミド」とあるのを[第11図はプラスミド」と補正
する。 0) 原補正書第6頁第2行に「図Bは」とあるのを「
第12図は」と補正する。 (3)原補正書第6頁第6行〜最下行に「(3) 図
面の図Aおよび図Bを別紙の通り加入する。」とあるの
を r(3)図面の第11図および第12図を別紙の通り加
入する。」と補正する。 (4) 別紙の通り、原補正書に添付の図Aを第11
図に、図Bを第12図に差し替える。
Claims (8)
- (1)血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子を含む組
換えDNAを用いて形質転換した酵母から異種蛋白質を
分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法
。 - (2)血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子が以下の
アミノ酸配列で表わされる請求項(1)記載の製造方法
。 【アミノ酸配列があります】 〔X_5:Ala又はPro又はSer X_4:Lys又はGly又はSer X_3:Ala又はVal又はCys X_2:Tyr又はTrp又はSer X_1:Ser又はAla又はGly Y:Lys又はArg又はHis〕 - (3)異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、成熟型
ヒト血清アルブミン遺伝子とシグナルペプチド遺伝子を
直接結合したことを特徴とする請求項(1)又は(2)
記載の製造方法。 - (4)以下のアミノ酸配列で示されるアルブミンシグナ
ル遺伝子。 【アミノ酸配列があります】 〔X_5:Ala又はPro又はSer X_4:Lys又はGly又はSer X_3:Ala又はVal又はCys X_2:Tyr又はTrp又はSer X_1:Ser又はAla又はGly Y:Lys又はArg又はHis〕 - (5)血清アルブミンシグナルペプチドをコードするD
NAを含む組換えDNA。 - (6)血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子が請求項
(4)記載の遺伝子である請求項(5)記載のDNA。 - (7)異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、成熟型
ヒト血清アルブミン遺伝子とシグナルペプチド遺伝子を
直接結合したことを特徴とする請求項(5)又は(6)
記載のDNA。 - (8)請求項(5)又は(6)又は(7)記載のDNA
によって形質転換された酵母。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30667487 | 1987-12-02 | ||
JP63-45605 | 1988-02-26 | ||
JP4560588 | 1988-02-26 | ||
JP62-306674 | 1988-02-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02167095A true JPH02167095A (ja) | 1990-06-27 |
JP2791418B2 JP2791418B2 (ja) | 1998-08-27 |
Family
ID=26385625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63103339A Expired - Lifetime JP2791418B2 (ja) | 1987-12-02 | 1988-04-26 | 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 |
Country Status (7)
Country | Link |
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US (1) | US5503993A (ja) |
EP (1) | EP0319641B1 (ja) |
JP (1) | JP2791418B2 (ja) |
KR (1) | KR970005250B1 (ja) |
CA (1) | CA1326217C (ja) |
DE (1) | DE3884356T2 (ja) |
ES (1) | ES2059428T3 (ja) |
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WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび/または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
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JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
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