DE68913846T2

DE68913846T2 - Expressionssystem.

Info

Publication number: DE68913846T2
Application number: DE68913846T
Authority: DE
Inventors: Jutta Dr Heim; Bernd Dr Meyhack; Jacob Prof Visser
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1988-07-28
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: DE68913846T3; DK370989A; FI104637B; DK175534B1; EP0353188B1; HU212832B; DE68913846D1; ES2063162T3; NO893063L; PT91286A; CA1338859C; FI893541A0; IE892447L; JPH03108487A; IL91111A0; NZ230077A; EP0353188B2; FI893541A; NO302899B1; AU3906289A

Description

Gebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und bietet neue DNA- Moleküle, die DNA-Sequenzen, die für verschiedene Pektinlyasen von Aspergillus niger und/oder die Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen davon codieren, umfassen. Die neuen DNA-Moleküle sind für die Überproduktion der Pektinlyasen in Aspergillus und/oder die Konstruktion von Hybridvektoren, die Fremdgene in fädigen und anderen Pilzen exprimieren, nützlich. Es ist jetzt möglich, eine einzelne Pektinlyase herzustellen, die nicht durch andere Pektinlyasen verunreinigt ist.

Hintergrund der Erfindung:

Obgleich in der Gentechnik zahlreiche Polypeptid-Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Wirte bereits bekannt sind, besteht ständig Bedarf an neuen Systemen, die gegenüber herkömmlichen Systemen Vorteile bieten.
Der prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaryotische Wirt Hefe, z.B. Saccharomyces cerevisiae, für die eine große Anzahl verschiedener Expressionshybridvektoren, hauptsächlich Plasmide, entwickelt wurden, werden in sehr großem Umfang verwendet. Die Nachteile von E.coli-Wirten bestehen darin, daß sie das gebildete Polypeptid nicht glycosylieren können und daß wegen mangelnder Sekretion das Fremdpeptid in der Wirtszelle akkumulieren und weiteres Wachstum verhindern kann. Die Hefewirte glycosylieren, aber sie sezernieren, wie E.coli, die Polypeptide - außer sehr kleine - nicht in das Nährmedium. Hefen sezernieren nur in den periplasmatischen Raum. Höhere eukaryotische Wirte sind Krebszellen von Säugern, die zur Glycosylierung befähigt sind und in das Nährmedium sezernieren, deren Kultivierung aber sehr langsam und teuer ist und bei denen die Gefahr besteht, daß onkogene Nucleinsäuren zusammen mit dem gewünschten Peptid isoliert werden, welches dann nicht davon befreit werden kann.
Aufgrund des Bedarfes an anderen Wirten wurden auch fädige Pilze, wie Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, untersucht. Solche Pilze werden für industrielle Zwecke bereits in großem Maßstab verwendet, ihre Verwendung in der Gentechnik hinkte jedoch nach, hauptsächlich, weil es an einem geeigneten Transformationssystem fehlte. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten fädige Pilze keine Plasmide, die für das Einführen von Fremdgenen und Phänotyp-Selektion verwendet werden könnten. Es ist jedoch möglich, fädige Pilze mit Fremdplasmiden zu transformieren, die ein selektierbares Markergen enthalten. Alle Vektoren, die bisher für fädige Pilze beschrieben wurden, replizieren nicht autonom, wie das die von Hefen tun, sondern werden in das Pilzchromosom integriert. Dieser Umstand tritt nur in sehr geringer Frequenz auf. Andererseits macht integrative Transformation die Transformanten vorteilhafterweise mitotisch sehr stabil, selbst unter nicht-selektiven Bedingungen. Über stabile Integration von mehr als 100 Kopien wurde berichtet.
Der erste für fädige Pilze beschriebene Vektor enthielt das qa-2-Gen von Neurospora crassa als selektierbaren Marker. Dieses Gen codiert für das Enzym katabole Dehydroquinase und kann für funktionelle Komplementation von aro-Mutanten von N. crassa verwendet werden [Case M.E., Schweizer M., Kushner S.R. und Giles N.H. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263]. Aro-Mutanten sind nicht in der Lage, auf Minimalmedium ohne Ergänzung durch aromatische Aminosäure zu wachsen. Die Transformation von N. crassa durch den qa-2-Vektor erfolgte durch Integration einer einzelnen Kopie des Plasmids in das Chromosom. 30% stabile Aro&spplus;-Integranten behielten das integrierte qa-2-Gen noch an die bakteriellen Plasmid-Sequenzen gebunden [Case M.E. (1982) in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollander A., DeMoss D., Kaplan S., Konisky J., Savage D. und Wolle R.S., Hrsg.), S. 87-100, Plenum]. Diese Beobachtung machte die Cotransformation nicht-selektiver DNA-Sequenzen zusammen mit selektiven zu einer machbaren Aufgabe.
In Aspergillus nidulans, der einen sexuellen Zyklus hat und daher klassischen genetischen Manipulationen zugänglich ist, wurden sowohl positive als auch negative Selektionssysteme identifiziert. Entweder unter Verwendung heterologer DNA aus N. crassa oder homologer DNA wurde funktionelle Komplementation von A. nidulans pyrG-Mutanten durch Transformation mit das pyrG-Gen enthaltenden Plasmiden erhalten (Ballance u.a., BBRC 112 284 1983; Tilburn u.a., Gene 26 205 1983). In anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Ort funktionell komplementiert durch Transformation mit den passenden Plasmiden [Yelton u.a., PNAS 81, 1470, 1984; Yelton und Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C 173, 1985; Johnstone u.a., EMBO J. 4,1307,1983].
Ein dominantes positives Selektionssystem wurde auch entwickelt, indem man sich das aus A. nidulans isolierte amdS-Gen zunutze machte, welches damit transformierten A. niger befähigt, auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen (Tilburn u.a., Gene 26, 205, 1983; Wernars u.a., Curr. Genet. 9,361, 1985; Kelly, J.M. u.a., EMBO J. 4,475, 1985).
Verglichen mit N. crassa oder A. nidulans ist A. niger bei weitem der wichtigere Organismus. Er wird in großem Umfang bei der industriellen Herstellung von Enzymen verwendet, z.B. zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie. A. niger unterscheidet sich von A. nidulans durch die sekretorischen Fähigkeiten dahingehend, daß er eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme sezerniert, z.B. Glucoamylase, -Amylase, Pektinase, Cellulase, β-Glucanase, β-Galactosidase, Naringinase, Pentosanase, saure Protease und Lignase, wobei der Glucoamylase- und Pektinase-Komplex die wichtigsten sind.
A. niger hat keinen bekannten sexuellen Zyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt werden. Durch klassische Mutations- und Selektionsmethoden wurden jedoch umfassende Stammverbesserungen bei der Sekretion hydrolytischer Enzyme erzielt. Von den Genen von A.niger-Enzymen wurden nur die von Glucoamylase (Boel u.a., EMBO J. 3, 1581, 1984) und Alkohol-und Aldehyddehydrogenase (WO 86/06097) zusammen mit ihren Promotor- und Signalsequenzen charakterisiert und in Transformationsvgersuchen mit A. nidulans bzw. A. niger verwendet.
Als Selektionsmarker für A. niger wurden das heterologe amdS-Gen (Kelly und Hynes, EMBO 3. 4, 475, 1985) und das argB-Gen (Buxton u.a., Gene 37, 207, 1985; EP 184 438; WO 86/06097) verwendet, die beide aus A. nidulans erhalten wurden.
A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Herstellung von Pektin abbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalacturonide mit hohem Molekulargewicht (20000-40000 D) aus α-1,4-glycosidisch gebundenen D-Galacturonsäure-Polymeren und kommen in der Natur als Bestandteile höherer Pflanzenzellen vor, wo sie an Cellulosemoleküle gebunden sind und wo sie hauptsächlich in der Primärzellwand und der Mittellamelle gefunden werden. Unter den reichsten Pektinquellen sind Zitronen- und Orangenschale, die etwa 30 % dieses Polysaccharids enthalten. Pektische Enzyme bauen das Kohlenhydratpolymersubstrat entweder durch Hydrolyse der α-1,4-glycosidischen Bindung (Polygalacturonase) oder durch Transelimination des α-4,5-ungesättigten galacturonsauren Restes aus dem Pektinmolekül (verschiedene Pektinlyasen) ab. Der systematische Name von Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC 4.2.2.10).
In A. niger werden die Proteine des pektischen Komplexes nicht konstitutiv exprimiert. Unter induzierenden Bedingungen bei Verwendung von Pektin oder Abbauprodukten davon exprimiert A. niger die genannten Enzyme, einschließlich PLI, wenn andere Kohlenstoffquellen wie Glucose oder Saccharose limitierend sind. In Oberflächenkulturen neigen die pektischen Enzyme dazu, mit der äußeren Zellwand assoziiert zu bleiben. Steigende Pektin- und Ca²&spplus;-Konzentration im Medium führt zu vollständiger Sekretion.
Pektinasen, wie PLI, werden von der Nahrungsmittelindustrie hauptsächlich zur Klärung von Fruchtsäften verwendet.
Aus A. niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise charakterisiert (F.E.A. Van Houdenhoven (22)). PLI enthält vier Reste Mannose, während PLII jeweils zwei Reste Mannose und Glucose enthält. Die Enzyme haben verschiedene Molekulargewichte (PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). Die Aminosäuresequenz von PLI wurde bestimmt und ist in EP 88 101 397.3 geoffenbart. Diese Erfindung basiert auf einer partiellen Strukturbestimmung von Pektinlyase I (PLI), die die Synthese von DNA-Sonden erlaubte, die für relevante Teile des Proteins codieren. Mit Hilfe der DNA-Sonden war es möglich, hinsichtlich der für PLI codierenden DNA durchzumustern und sie schließlich zusammen mit Prä- und Postsequenzen davon aus einer Genbibliothek von A. niger zu isolieren.
Durch Hybridisierung von Teilen des PLI-Gens zu einer genomischen Bibliothek von A. niger wurden weitere PL-Gene detektiert, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind. Das PLI- Strukturgen mit der N-Terminus flankierenden Region, das aus A. niger N756 erhalten wird, ist am N-Terminus identisch mit dem PLD-Gen, das aus A. niger N400 erhalten wird. Folglich ist letzteres nicht Teil der gegenständlichen Erfindung. Das vorliegende PLA scheint ein Teil des zuvor gereinigten PL-Gemischs mit der Bezeichnung PLII zu sein.
Im folgenden wird PLI auch als PLD bezeichnet, und das Strukturgen wird als pelD bezeichnet.
Gegenstände der Erfindung: Gegenstände der Erfindung sind rekombinante DNA-Moleküle, die DNA-Sequenzen enthalten, die für neue Pektinlyase-Expressionssysteme codieren, und Derivate davon, wie die Strukturgene der Pektinlyasen und entsprechende Regulationssequenzen, z.B. Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen, und Hybridvektoren, die entsprechende DNAs enthalten, einschließlich der Hybridvektoren mit für homologe oder heterologe Polypeptide codierender DNA, Wirte, speziell fädige Pilze, z.B. Aspergillus-Wirte, die mit diesen Vektoren transformiert wurden, Verfahren zur Herstellung der rekombinanten DNA-Moleküle und der Wirte und die Verwendung der rekombinanten DNA-Moleküle zur Herstellung neuer Expressionssysteme. Ein weiterer Gegenstand ist die Herstellung von Polypeptiden mit Hilfe der genannten DNAs und der genannten Wirte.
Die neuen Pektinlyase-Expressionssysteme umfassen DNA-Sequenzen, die für Promotoren, die Signalsequenzen, die Strukturgene und die Terminatoren der neuen Pektinlyase-Gene codieren. Die neuen Pektinlyasen werden PLA, PLB, PLC, PLE und PLF genannt.
Mehr im besonderen ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Konstruktion von Hybridvektoren, umfassend DNA-Sequenzen, die für die Promotoren von PLA, PLB, PLC, PLE und PLF codieren, gegebenenfalls für die Signalsequenz dieser Proteine und gegebenenfalls für deren Terminatoren. Diese Hybridvektoren werden für das Einbringen von für spezielle Proteine codierenden Genen und für die Transformation fädiger Pilze, wie Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium, verwendet. Die Cotransformation von A. niger mit zwei verschiedenen Plasmiden kann durchgeführt werden, wobei eines der Plasmide aus der aus den neuen erfindungsgemäßen Hybridvektoren bestehenden Gruppe ausgewählt wird und das andere ein speziell konstruiertes Selektionsplasmid ist, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines fädigen Pilzes arbeitet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Überproduktion der neuen Pektinlyasen in Aspergillus-Spezies und die Produktion der einzelnen PLs, die nicht mit anderen PLs verunreinigt sind, oder eines vorbestimmten künstlichen Gemischs davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters die Produktion irgendeines Proteins, dessen Strukturgen in Gegenwart oder unter der Kontrolle der vorliegenden rekombinanten PL-DNAs exprimiert werden kann.
Die verschiedenen Erfindungsgegenstände gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung deutlicher hervor.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die rekombinanten DNA-Moleküle:

Mehr im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine für die Expressionssysteme der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF codierende DNA-Sequenz enthält, oder ein Derivat davon.
Der Ausdruck "Expressionssystem" bedeutet eine DNA-Sequenz, die befähigt ist, ein Polypeptid zu exprimieren, und umfaßt den Promotor, die Signalsequenz, das Strukturgen und den Terminator.
Der Ausdruck "Derivat", wenn er in Verbindung mit den neuen DNA-Sequenzen verwendet wird, soll größere Derivate mit flankierenden Sequenzen, Fragmente der DNA-Sequenz, Mutanten, speziell natürlich vorkommende Mutanten und gemäß dem genetischen Code degenerierte DNA-Sequenzen einschließen.
Größere Derivate der neuen rekombinanten DNA-Moleküle sind die, die aus dem A. niger-Genom ausgeschnitten werden können und die in den Fig. 1 bis 3, 5 und 6 dargelegten DNA-Sequenzen umfassen, wie sie in einer genomischen Bank von A. niger N400 gefunden werden, die erhalten wird durch Fragmentierung der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z.B. EcoRI, BamHI oder HindIII, Ligieren in einen geeigneten Vektor, z.B. Lambda-Phage und Plasmid pBR322, Klonieren, z.B. in E.coli, und erneutes Ausschneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym. Solche Derivate sind z.B. die Inserts der Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 und pGW880, die in den Fig. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 gezeigt werden.
Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I (Fig. 9) sind die, die sich zwischen zwei Restriktionsorten dieser Plasmide erstrecken und die Promotor-, Signal-, Struktur- oder Terminatorfunktionen beibehalten.
Bevorzugte Fragmente sind die, die die Promotorsequenz, die Signalsequenz, das Strukturgen eines neuen PL oder die Terminatorsequenz oder irgendeine Kombination davon enthalten.
Die Fragmente der DNA-Sequenz können Linker enthalten, die für die erfolgreiche Verbindung mit anderen DNA-Molekülen sorgen.
Die PL-Promotorsequenz befindet sich in der DNA-Region vor dem Strukturgen und umfaßt bis zu etwa 2000, vorzugsweise bis zu etwa 1000 bis 1400 Nucleotide. In pGW820 befindet sich der Promotor auf der Sequenz zwischen dem Sall- (1240) und dem PstI-Restriktionsort (2420). Für die Promotorsequenz sind die TATAA-Boxen wichtig als RNA-Polymerase-Erkennungsstellen. Auf pelA befindet sich die TATAA-Box an der Position 1221 (Fig. 10), auf pelB an der Position 951 (Fig. 11) und auf pelC an der Position 1261 (Fig. 12). Die kurzen Promotoren von etwa den TATAA-Boxen bis zum Start der Signalsequenzen sind von besonderem Interesse für die nicht-induzierte Expression von Polypeptiden. Wenn Pektin- indu zierte Expression erforderlich ist, sind die Sequenzen stromaufwärts von den TATAA-Boxen für die Regulierung der Promotorstärke notwendig. Geeignete Linker können an diese Fragmente gebunden sein.
Der Promotor von PLI von A. niger ist induzierbar, d.h. die Expression des daran gebundenen Strukturgens, z.B. das für ein PL codierende Strukturgen oder irgendein Fremdgen, wird durch Zugabe von Pektin oder Pektinabbauprodukte zum Medium induziert. In Abwesenheit von Pektin und Gegenwart von ausreichend Glucose, arbeitet der Promotor nicht. Wenn die Upstream-Regulationsseguenzen abwesend sind, wird der Promotor konstitutiv.
Die für die Signalsequenz codierende DNA erstreckt sich zwischen dem Ende des Promotors und dem Beginn der für das reife Protein codierenden Sequenz. In PLA und PLB enthält die Signalsequenz etwa 20 Aminosäuren, in pelC etwa 18 Aminosäuren. Die entsprechende codierende Region erstreckt sich in pelA vom ATG-Codon an der Position 1361 hinunter zur PstI-Spaltstelle an der Position 1420, in pelB von der Position 1134 bis zumindest Position 1191 und in pelC von der Position 1368 zur Position 1422.
Wie aus den Formeln I, II und III ersichtlich ist, enthalten die Strukturgene von PLA, PLB und PLC mehrere Introns. Das Strukturgen kann auch geeignete Linker enthalten.
Die Terminatoren starten mit den Stopcodons, z.B. TAA, und können sich bis zu einem der Restriktionsorte innerhalb dieser Sequenz erstrecken. Das Terminatorfragment enthält zumindest 300 bp und kann geeignete Linker enthalten.
Geeignete Linker zu den obigen Fragmenten haben eine DNA-Sequenz, die in den Restriktionsort der DNA paßt, mit der das Fragment verknüpft werden soll. Sie können einen vorbestimmten Restriktionsort enthalten.
Erfindungsgemäße Fragmente der DNA-Sequenz sind auch solche, die aus kleineren Fragmenten bestehen, z.B. die, die den Promotor, den Promotor und die Signal- oder Struktursequenz, die Signal- und die Struktursequenz oder das Strukturgen ohne Introns enthalten, und dergleichen.
Mutanten der DNA-Sequenz gemäß dieser Erfindung sind z.B. natürlich vorkommende Mutanten. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten der Signalsequenz mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z.B. worin die Codons für die polaren Aminosäuren Lysin (Kδ+), Tyrosin (Yδ-) und Arginin (Rδ+) durch Codons für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht werden und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und Threonin (T) durch Codons für andere hydrophobe Aminosäuren ersetzt werden. Beispielsweise das Codon für das positiv geladene Lysin kann durch ein Codon für Arginin ersetzt werden und umgekehrt, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nicht-polare, hydrophobe Alanin durch irgendeines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin, und dergleichen. Andere Mutationen sind "stille Mutationen", in denen ein oder einige wenige andere Nucleotide, z.B. bis zu etwa 30, durch ein oder mehrere andere Nucleotide ersetzt sind, wobei die neuen Codons für die gleiche(n) Aminosäure(n) codieren.
Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die degeneriert sind, sind, wie stille Mutationen, solche, die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes insofern degeneriert sind, als eine unbeschränkte Zahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt ist, ohne daß sich die Aminosäuresequenz ändert, die sie codieren. Solche degenerierten DNA-Sequenzen können wegen ihrer unterschiedlichen Restriktionsorte nützlich sein.
Rekombinante DNA-Moleküle, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein Derivat davon enthalten, sind speziell rekombinante Vektoren, alternativ dazu auch Hybridvektoren genannt. die solche DNA-Sequenzen als Inserts enthalten. Sie sind für die Klonierung in Wirten, z.B. Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, nützlich. Solche Hybridvektoren sind von irgendeinem auf dem Gebiet der Gentechnik nützlichen Vektor abgeleitet, wie von Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivate von Phage λ, z.B. NM 989, oder Phage M13, z.B. M13mp8 Phagen-DNA (Literaturstelle 15), linearisiert durch BamHI-Verdauung, bakterielle Plasmide, z.B. pBR322, puN121, pUC18, oder Hefeplasmide, z.ß. Hefe 2µ-Plasmid, oder auch chromosomale DNA, abgeleitet z.B. aus Aspergillus, z.B. A. niger, z.B. die aus EP 184 438, oder Defektphagen oder Defektplasmide in Gegenwart eines Helferphagen oder eines Helferplasmids, wodurch Replikation der Defektphagen oder Plasmide ermöglicht wird, z.B. M13(+)KS-Vektor in Gegenwart von z. B. M13KO7-Helferphage.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor enthält zusätzlich zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder einem Derivat davon einen Replikationsort und gegebenenfalls, je nach der Art des DNA-Derivats, eine Expressionskontrollsequenz, wie eine Enhancer-Sequenz, Upstream Aktivierungsstelle, eine Promotor- und Signalsequenz und/oder ein Strukturgen, das von den entsprechenden vorhandenen A. niger-abgeleiteten Sequenzen verschieden ist. Eine solche Enhancer-Sequenz kann von extrachromosomaler ribosomaler DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) abgeleitet sein oder sie kann die Upstream-Aktivierungsstelle aus dem saure Phosphatase-PHO5-Gen (EP Anm. Nr. 86 111 820.6) oder das PHO5, trp, PHO5-GADPH-Hybrid (EP Anm. Nr. 86 111 820.6) oder dergleichen Promotor sein.
Strukturgene, die an die vorliegenden Promotor-, Signal- und/oder Terminatorsequenzen ligiert sind, sind neben denen, die für Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE und PLF codieren, mit oder ohne Introns, auch homologe andere Pektinlyase-Gene, z.B. das PLD- (oder PLI-) Gen, oder andere Aspergillus-Gene und heterologe Strukturgene, die aus Viren, prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen stammen und die abgeleitet sein können von genomischer DNA oder cDNA, die über den mRNA-Weg hergestellt wurde, oder chemisch synthetisiert sein können, die für eine große Auswahl nützlicher Polypeptide codieren, darunter glycosylierte Polypeptide, insbesondere höheren eukaryotischen, speziell Säugerursprungs, wie tierischen oder insbesondere menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, die beispielsweise zur Herstellung von Nährstoffen und zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in der Chemie verwendet werden können, oder Polypeptide, die für die Behandlung oder Prävention menschlicher oder tierischer Krankheiten nützlich sind, z.B. Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, antiviralen und tumorhemmenden Eigenschaften, Antikörper, virale Antigene, lmpfstoffe, Gerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergleichen.
Beispiele für solche heterologen Strukturgene sind z.B. die, die codieren für Hormone, wie Sekretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, melanocytenstimulierendes Hormon, β-Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermalen Wachstumsfaktor, Insulin-verwandten Wachstumsfaktor (IGF), z.B. IGF-I und IGF-II, Mastzellen-Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Glia-abgeleiteten Nervenzellenwachstumsfaktor, oder transformierenden Wachstumsfaktor (TGF),wie TGFβ, Wachstumshormone, wie humane oder bovine Wachstumshormone, Interleukin, wie Interleukin-1 oder -2, Human-Makrophagenmigrations-Hemmfaktor (MIF), Interferone, wie Human-α-Interferon, z.B. Interferon-αA, αB, αD oder αF, β-Interferon, γ-Interferon oder ein Hybrid-Interferon, z.B. ein αA-αD- oder ein αB-αD-Hybrid-Interferon, speziell das Hybrid-Interferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie α&sub1;-Antitrypsin, SLPI und dergleichen, Hepatitisvirus-Antigene, wie Hepatitis B-Virus-Oberflächen- oder -Core-Antigen oder Hepatitis A-Virus-Antigen oder Hepatitis nonA- nonB-Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie Gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrose-Faktor, Somatostatin, Renin, β-Endorphin, Immunglobuline, wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunglobulin D, E oder G, oder Human-Maus-Hybrid-Immunglobuline, Immunglobulin-Bindungsfaktoren, wie Immunglobulin E-Bindungsfaktor, Calcitonin, zu Human-Calcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudin Variante HV1, HV2 oder PA, Human-Superoxid-Dismutase, viraleThymidinkinase, β-Lactamase, Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die, die für ein Human-α-Interferon oder Hybrid-Interferon, Human-Gewebsplasminogenaktivator (t-PA), Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAg), Insulin-verwandten Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, z.B. Variante HV1, codieren. In den erfindungsgemäßen Hybridvektoren ist der vorliegende Promotor und/oder die Signalsequenz operabel mit der das Polypeptid codierenden Region verbunden, um die wirksame Expression des Polypeptids sicherzustellen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können Selektionsmarker enthalten, die von dem Wirt abhängen, der transformiert, selektiert und kloniert werden soll. Es kann jedwedes Markergen verwendet werden, das die Selektion von Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind speziell die, die antibiotische Resistenz exprimieren, z.B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder, im Falle auxotropher Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen z.B. Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder bieten Prototrophie bei einer auxotrophen Hefemutante, z.B. das ura3-, leu2-, his3- oder trp1-Gen. Es ist auch möglich, als Marker Strukturgene zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, wodurch der zu transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist.
Von besonderem Interesse sind Markergene, die A. niger-Wirtsläsionen komplementieren, wie das argB-Gen, das für die Ornithin-Carbamoyl-Transferase codiert, z.B. aus A. niger oder A. nidulans (EP 184 438) stammend, oder A. nidulans-DNA-Fragmente, die zum N. crassa pyr4-Gen (26) homolog sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, in denen das Strukturgen, speziell das heterologe Strukturgen, operativ mit den erfindungsgemäßen Promotor- und Signalsequenzen verknüpft ist. Ein solcher bevorzugter Hybridvektor ist z.B. pUC19/pelA-lFN AM119. Ein anderer bevorzugter Hybridvektoristz.B. M13(+)KS/pelA-IFN AM119. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Strukturgen, vorzugsweise das heterologe Strukturgen, operativ direkt mit den erfindungsgemäßen Promotorsequenzen verbunden. Ein solcher bevorzugter Hybridvektor ist z.B. M13(+)KS/pelAΔss-lFN AM119.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle und deren Derivate einschließlich der Fragmente können für das Screening von DNA-Genbanken oder mRNA hinsichtlich weiterer ähnlicher DNAs oder mRNAs verwendet werden.

Verfahren zur Herstellung der rekombinanten DNA-Moleküle:

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das für ein Pektinlyase PLA-, PLB-, PLC-, PLE- oder PLF-Expressionssystem codiert, oder eines Derivats davon, umfassend das Kultivieren eines Wirts, der mit einem eine für das Pektinlyase-Expressionssystem codierende DNA-Sequenz enthaltenden DNA-Molekül oder einem Fragment davon transformiert wurde, und Isolierung des gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls oder des Derivals davon, oder Herstellung durch in vitro-Synthese.
Das Kultivieren des Wirts erfolgt in einem herkömmlichen Nährmedium, das ergänzt durch oder befreit von chemischen Verbindungen sein kann, die negative oder positive Selektion der Transformanten, d.h. solcher Wirte, die das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, von den Nicht-Transformanten, d.h. solchen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt, erlauben.
Es können alle auf dem Gebiet nützlichen transformierbaren Wirte verwendet werden, z.B. Bakterien, wie E.coli, Pilze, wie Saccharomyces cerevisiae, oder insbesondere fädige Pilze, wie Aspergillus, z.B. A.nidulans, A.oryzae, A.carbonarius, A.awamori und speziell A. niger. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger An8, eine neue Mutante, der das pyrA-Gen fehlt, wie hier später beschrieben werden wird. Die Transformation der Wirte erfolgt nach herkömmlichen Methoden.
Die für das PL-Expressionssystem codierende DNA-Sequenz wird von einem fädigen Pilz, der ein solches System enthält, insbesondere aus einer genomischen Bank davon, oder über die mRNA erhalten.
Im folgenden wird die Herstellung des gegenständlichen PL-Expressionssystems detaillierter beschrieben.
Eine genomische Bank kann z.B. durch partielle Verdauung von genomischer DNA eines A. niger- Stammes, z.B. N756 oder N400, mit z.B. Sau3Al oder Mbol und Klonierung der DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht in einem geeigneten Wirtsvektor, z.B. E.coli-Plasmid pUN121 oder einem Lambdavektor, z.B. EMBL4, hergestellt werden. Jeder andere A. niger-Stamm, der die gewünschten PLs produziert, kann als Quelle für die genomische Bank dienen, und ebenso können andere geeignete Vektoren als Rezipienten für die Fragmente verwendet werden.
Um die genomische Bank hinsichtlich der für PLs codierenden DNA-Sequenzen erfolgreich durchzumustern, ist eine hybridisierende DNA-Sonde erforderlich. Das kann eine synthetische DNA- Sonde sein, wenn die Sequenz des gewünschten PL bekannt ist, oder aus einem bekannten PL-Gen oder Teilen davon. Die erste Vorgangsweise wurde angewendet, um das PLI-Gen wie in EP 88 101 387.3 beschrieben zu finden. Die zweite Vorgangsweise wurde in der vorliegenden Erfindung angewendet. Da die gesamte DNA-Sequenz des PLI-Gens verfügbar wurde, können nun das gesamte Gen oder irgendeinen Teil davon mit zumindest etwa 14 bp enthaltende DNA-Sonden für das Screening verwendet werden, das auch das Screening hinsichtlich für das PL-System codierender mRNA einschließt.
Für Zwecke des Screenings werden die DNA-Sonden nach auf dem Gebiet bekannten Methoden unter Verwendung von γ³²P-ATP und T4-Kinase 5'-radioaktiv markiert. Wirtsmikroorganismen, die erfindungsgemäße Nucleinsäuren als Insert tragen, werden durch Hybridisierung mit der markierten DNA-Sonde auf Filter-Repliken der Genbibliothek identifiziert.
Klone, die auf eine oder mehrere DNA-Sonden eine Hybridisierungsreaktion zeigen, werden isoliert und amplifiziert.
Die verwendeten Hybridisierungsbedingungen können mehr oder weniger streng sein, z.B. indem man einfach verschiedene Temperaturen wählt, und in Kombination mit der Verwendung verschiedener DNA-Sonden, die vom PLI- (oder PLD-)Gen abgeleitet sind, z.B. durch Messung der verschiedenen Hybridisierungsreaktionen auf das vollständige 1,6 kbp BamHI/PstI-Fragment, das 649 bp BamHI/Xhol-Fragment (das N-Terminus-Fragment) und das 244 bp Xhol/PstI-Fragment (das C-Terminus-Fragment) von pCG3B11 oder pGW840 (Fig. 4), können die Klone in verschiedene Klassen eingeteilt werden, basierend auf dem Grad der Homologie (Tabelle II oder IV). Fünf λ-Vektoren (λ-PL113, λ-PL122, λ-PL109, λ-PL102 und λ-PL116) wurden schließlich identifiziert, restringiert und Subklone ihrer pel-Gene in pBR322 hergestellt, was zu den Plasmiden pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 (Fig. 1 bis 3, 5 und 6) führt. Die fünf Gene dieser Klone werden pelA, pelB, pelC, pelE bzw. pelF genannt.
Die Gene können sequenziert werden. Die vollen Sequenzen von pelA, pelB und pelC werden durch die Formeln I, II und III (Fig. 10, 11 und 12) dargestellt.
Eine computergestützte Suche nach Consensus-Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie Intron-internen Sequenzen (Boel E. u.a. (24) und Mount S.M. (25)) führt dazu, daß man, wie in pelD, die Gegenwart von vier Introns in pelA und pelB (Fig. 10 und 11) und von drei Introns in pelC postuliert.
Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 werden verwendet, um andere erfindungsgemäße rekombinante DNA-Moleküle herzustellen. Solche andere DNA-Moleküle werden auf herkömmliche Weise durch Anwendung herkömmlicher Restriktionsenzyme, Linker, Ligations-, Amplifikations- und Isolierungsverfahren hergestellt.
Beispielsweise wird das Plasmid pGW820 mit HindIII restringiert. Das 3,9 kbp HindIII-Fragment wird in den HindIII-Ort von pBR322 subkloniert. Das 3,3 kbp BamHI-HindIII-Fragment des erhaltenen Plasmids pGW822, das das pelA-Gen enthält, wird in den BamHI- und HindIII-Ort des Vektors pUC19 kloniert, um einen pUC19/pelA genannten Vektor zu ergeben. Das Strukturgen von pelA wird durch Verdauung mit Sall und PstI ausgeschnitten. In das verbleibende Fragment, das pelA Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen enthält, wird zwischen der Signal- und der Terminatorsequenz ein für das Interferonhybrid BDBB codierendes Gen mit Hilfe eines geeigneten Linkers ligiert. Das erhaltene Plasmid wird pUC19/pelA-IFN AM119 (Fig. 11) genannt und enthält die Promotor- und Signalsequenz von pelA, das IFN BDBB-Gen und den pelA-Terminator an das HindIII-BamHI-Fragment von pUC19 gebunden. Dieses Plasmid wird mit pCG59D7 in Uridin-auxotrophe A. niger-Mutante An8 (DSM 3917) cotransformiert. Transformanten werden in einem Arginin und Bacto-Agar enthaltenden Minimalmedium selektiert und auf die Interferon-Expression hin analysiert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Signalsequenz von pelA deletiert werden. Das erhaltene Plasmid wird M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119 genannt und enthält die Promotorsequenz von pelA, das IFN BDBB-Gen und den pelA-Terminator an das HindIII-BamHI-Fragment des Bluescript M13(+)KS-Vektors gebunden. Dieses Plasmid wird mit PCG59D7 in die Uridin-auxotrophe A. niger-Mutante An8 (DSM 3917) cotransformiert. Die Transformanten werden in einem Arginin und Bacto-Agar enthaltenden Minimalmedium selektiert und auf die Interferon-Expression hin analysiert.
Es können neue Restriktionsorte enthaltende Mutanten hergestellt werden, z.B. in vitro durch ortsgerichtete Mutagenese nach herkömmlichen Methoden [siehe Übersichtsartikel von M.J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein und D. Shortle, Science 229, 1193(1985) oder K. Norris u.a., Nucl. Acids Res. 11,5103 (1983)].
Für höhere Expressionsraten kann jedwede eukaryotische Terminatorsequenz an das Ende des Strukturgens ligiert werden.
Bakterien werden nach einer herkömmlichen Methode transformiert und die Transformanten aufgrund ihrer Resistenz z.B. gegen Tetracyclin identifiziert.
Insbesondere werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB 101, amplifiziert, transformiert und selektiert nach auf dem Gebiet üblichen Methoden.
Die amplifizierte Plasmid-DNA wird aus den Bakterien nach herkömmlichen Methoden isoliert, insbesondere wie von Birnboim & Doly (23) beschrieben.
Auf ähnliche Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterogenen Genen konstruiert werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können auch durch in vitro-Synthese nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden. Die in vitro-Synthese ist speziell für die Herstellung kleinerer Fragmente des PL-Expressionssystems anwendbar, z.B. die DNA-Sequenzen, die für die Promotor- oder Signalsequenz der PLs codieren, oder Mutanten davon.
Erfindungsgemäße DNA-Moleküle, die einen PL-Promotor umfassen und wahlweise eine PL-Signalsequenz, ein PL-Strukturgen, irgendein anderes heterologes Strukturgen und/oder einen PL-Terminator, können auch verwendet werden, um fädige Pilze, wie Aspergillus. Penicillium oder Cephalosporium, z.B. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und speziell A.niger, zu transformieren.
Um die Selektion der transformierten von den nicht-transformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle einen Selektionsmarker oder, alternativ dazu, die Fungi werden mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, cotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen für den Transformanten toxische Verbindungen bietet oder der das Enzymsystem einer Mutante vervollständigt, der ein solches essentielles Polypeptid fehlt. Solche Genmarker sind z.B. die bekannten ga-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.
Wie in EP 88 101 397.3 beschrieben, wurde ein neues Markergen mit dem Namen pyrA aus der genomischen Bank von A. niger isoliert, das verwandt ist mit und eine ähnliche Funktion hat wie pyrG von A. nidulans und pyr4 von N. crassa, nämlich die Produktion des Enzyms Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'- phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch die von Fluor-orotsäure zum toxischen Fluoruridin. Ein das pyrA-Gen enthaltender E. coli-Klon wurde durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb HindIII-Fragment von pDJB2 (24), das einen Teil des pyr4-Gens enthält, identifiziert, es kann jedoch DNA von irgendeinem anderen pyr-Gen, das für Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase codiert, verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E. coli B75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7, das das pyrA-Gen umfaßt, isoliert und für die Cotransformation einer A. niger pyrA&supmin;-Mutante verwendet. Einer solchen pyrA&supmin;-Mutante fehlt das Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase-Gen, und daher ist sie nicht in der Lage das entsprechende Enzym zu produzieren. Eine solche Mutante wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N756 unter mutierender UV-Strahlung hergestellt, und in Gegenwart von Fluor-orotsäure und Uridin überlebende Kolonien wurden ausgewählt. In Gegenwart von Fluor-orotsäure und Abwesenheit von Uridin überlebende Kolonien werden eliminiert. Die verbleibenden Uridin benötigenden Mutanten gehören gemäß ihrer Fähigkeit transformierbar zu sein zu zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An10 repräsentiert werden. Sie werden in Form von Protoplasten davon unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 behandelt. Es zeigte sich, daß nur die An8-Kolonien transformiert waren und das pyrA-Gen enthalten, wie durch die Hybridisierungsfähigkeit von verdauter DNA davon mit DNA von pUN 121 bewiesen wird.
Die Erfindung betrifft weiters mit den erfindungsgemäßen Hybridvektoren transformierte Wirte und Verfahren zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind z.B. Bakterien, wie E.coli, oder fädige Pilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporum, insbesondere A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori oder vorzugsweise A. niger, z.B. A. niger An8. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung solcher Transformanten, umfassend die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül, speziell einem Hybridvektor, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und Selektion der Transformanten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNAs oder eines Derivats davon für die Herstellung von Hybridvektoren, die nützliche homologe oder heterologe Polypeptide exprimieren. Beispiele für Gene, die für solche nützlichen Polypeptide codieren, wurden hier vorher angeführt.
Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßer Hybridvektor in einem geeigneten Wirt exprimiert wird. Wenn es erforderlich ist, wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit von der Konstruktion des Vektors werden die Produkte exprimiert oder, wenn eine Signalsequenz anwesend ist, exprimiert und sezerniert.
Dieses Verfahren umfaßt die Herstellung nützlicher homologer oder heterologer Proteine in einem geeigneten Wirt, z.B. Aspergillus-Spezies, durch Kultivieren eines mit einem Expressionshybridvektor transformierten Wirts. Beispiele für Gene, die solche Proteine codieren, wurden hier zuvor angeführt.
Es ist jetzt auch möglich, die einzelnen Polypeptide PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLF herzustellen, das bedeutet in reiner Form, nicht verunreinigt durch anderes PL, wobei verschiedene Methoden angewendet werden können. Z.B. ist ein Verfahren zur Herstellung eines einzelnen Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PLA, PLB, PLC, PLD, PLE und PLF, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirt, der nicht zur Expression von Pektinlyase PL befähigt ist, mit einem DNA-Expressionsvektor transformiert wird, der das Produkt PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLF exprimiert.
Ein nicht zur Expression irgendeiner Pektinlyase PL befähigter Wirt ist entweder ein Mikroorganismus, der kein entsprechendes Gen aufweist, z.B. ein PL&supmin;-Aspergillus-Stamm, ein anderer Nicht-Aspergillus-Pilz oder irgendein anderer eukaryotischer oder prokaryotischer Mikroorganismus oder ein Aspergillus-Stamm, dessen Produktion von PLs in einem geeignet konditionierten Wachstumsmedium suprimiert ist. Beispielsweise kann ein einzelnes PL-Gen unter der Kontrolle des Glucoamylase-Promotors A. niger oder A. awamori, unter der Kontrolle des PHO5-Promotors in S. cerevisiae oder unter der Kontrolle eines PL-Promotors in einem PL&supmin;-A. niger- Stamm exprimiert werden.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte von pGW820, das das pelA- Gen enthält; Fig. 2 zeigt die Restriktionskarte von pGW830, das das pelB-Gen enthält; Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte von pGW850, das das pelC-Gen enthält; Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte von pGW840, das das pelD-Gen enthält; Fig. 5 zeigt die Restriktionskarte von pGW880, das das pelE-Gen enthält; Fig. 6 zeigt die Restriktionskarte von pGW860, das das PelF-Gen enthält; Fig. 7 zeigt die Sequenzierungsstrategige für das pelA-Gen; Fig. 8 zeigt die Sequenzierungsstrategige für das pelB-Gen; Fig. 9 zeigt die Sequenzierungsstrategie für das pelC-Gen; Fig. 10 zeigt die Sequenz des DNA-Moleküls pelA, das die Formel I hat, das das für PLA codierende Gen enthält; Fig. 11 zeigt die Sequenz des DNA-Moleküls pelB, das die Formel II hat, das das fur PLB codierende Gen enthält; Fig. 12 zeigt die Sequenz des DNA-Moleküls pelC, das die Formel III hat, das das für PLC codierende Gen enthält; Fig. 13 zeigt die Homologie auf dem Aminosäuresequenz-Niveau zwischen PLD, PLA und PLC; Fig. 14 zeigt die Konstruktion des Vektors pUC19/pelA-IFN AM119, der das für das Hybridinterferon BDBB codierende Gen enthält; Fig. 15 zeigt den nichtcodierenden Strang eines Teils der pelA-IFN-Fusion an Plasmid pelA-IFN AM119 mit per Loop herausgenommener Signalsequenz, angeordnet mit dem Oligonucleotid-Primer, der für die Deletionsmutagenese der pelA-Signalsequenz verwendet wurde.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, sollen sie jedoch in keiner Weise einschränken.

Die Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

Amp: Ampicillin; ATP: Adenosintriphosphat; BSA: Rinderserumalbumin; CIP: alkalische Kälberdarmphosphatase; DNA: Desoxyribonucleinsäure; DTT: 1,4-Dithiothreitol; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz; EGTA: Bis-(aminoethyl)-glycolether-N,N,N',N'-tetraessigsäure; kbp: Kilobasenpaar; LMP: niedrig schmelzend; mOsm: Milliosmol; PEG: Polyethylenglycol; RNA: Ribonucleinsäure; rpm: Umdrehungen pro Minute; SDS: Natriumdodecylsulfat; Tc: Tetracyclin; Tris: Tris(hydroxymethyl)-aminomethan; U: Einheiten; V: Volt.

Puffer, Medien, Reagenzien:

HHA B/g: 10× Restriktionsenzympuffer, für BamHI-, BgIII-, HindIII-, Mbol-, PstI- und Xhol- Verdaue verwendet, 60 mM Tris-HCl (pH 7,4), 60 mM β-Mercaptoethanol, 60 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl, 0,1 % BSA, 0,1 % Gelatine enthaltend.
EcoRI-Puffer: 5× Restriktionsenzympuffer, der für EcoRI-Verdaue verwendet wird, der 500 mM Tris-HCl (pH 7,2), 25 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl, 0,05 % BSA, 0,05 % Gelatine enthält.
IPTG: 100 mM Isopropyl-β-thio-galactopyranosid (23,8 mg/ml) in H&sub2;O.
LC-Medium: 1 % Trypticase-Pepton (BBL), 0,5 % Hefeextrakt (BBL), 0,8 % NaCl, 1 ml Tris-HCl pH 7,5 pro Liter.
Minimalmedium: 1,05 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,45 KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,05 % für E.coli Natriumcitrat.2H&sub2;O, 1 mM MgSO&sub4;, 1 mM Thiamin-HCl, 0,2 % Glucose.
2XTY-Medium: pro Liter 16 g Trypticase-Pepton (BBL), 10g Hefeextrakt, 5g NaCl.
TBE-Puffer: 1 Liter enthält 10,8 g Tris, 5,5 g Borsäure, 4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0).
Low-TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA (pH 8,0).
X-Gal: 2 % 5-Binm-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid in Dimethylformamid. SSC: 0,15M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat.
Minimalmedium für A. niger: 1 Liter enthält 1,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 4,0 g NH&sub4;Cl, 10,0 g Glucose, Spuren FeSO&sub4;, MnSO&sub4;, ZnCI2, mit NaOH auf pH 6,5 eingestellt.
Komplettmedium für A. niger: Minimalmedium plus 0,2 % Trypticase-Pepton für (BBL) 0,1 % Casaminosäuren (Difco), 0,1 % Hefeextrakt (BBL), 0,05 % Ribonucleinsäure-Natriumsalz aus Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 ml Vitaminlösung pro Liter.
Vitaminlösung: pro 100 ml 10 mg Thiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Panthotensäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure, 100 mg Nicotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCl.
Für Platten werden alle Medien durch Zugabe von 1,5 % Agar (BBL) verfestigt, für Top- Agar(ose) werden 0,7 % Agar (BBL) oder Agarose (Seakem) verwendet.
PBS: pro Liter 0,37 g NaH&sub2;PO&sub4;, 2,7 g Na&sub2;HPO&sub4;, 8,5 g NaCl.
PSB: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;.
LDB: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;.

Die folgenden Stämme werden verwendet:

A. niger: N400 Wildtyp.
A. niger N593: cspA, pyrA.
A.niger N756: ausgewählt für Hochproduktion von Pektinase-Komplex-Enzymen.
A.niger An8: DSM 3917, Uridin-auxotrophe Mutante von A. niger N756.
E.coli NM539: metB, supE, hsdM&spplus;, hsdR&supmin;, supF, (P2cox3).
E.coli MH1: ara D139, ΔlacX74, galU, galK, hsr&supmin;, hsm&spplus;, strA.
E.coli JM103: Δlac-pro, thi, strA, supE, endA, sbcB hsdR4, F¹, traD36, proAB, laclq, ZΔM15.
E.coli JM109: Δ(lac-proAB), recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44 relA1, λ&supmin;, [F', traD36, proAB, laclq, ZΔM15].
E.coli CJ236: (dut-1,ung-1,thi-1,relA-1; pCJ105(Cmr); BIO-RAD Muta-Gene M13 in vitro Mutagenese-Kit).
E.coli MV1190: [Δ(lac-proAB), thi, supE, Δ(sr1-recA)306::Tn10(tetr) (F':traD36, proAB, lac lqZΔM15)]. Stamm MV1190 wird im Manual für das BIO-RAD MUTA-GENE M13 in vitro Mutagenese-Kit beschrieben.

Die folgenden Vektoren werden verwendet:

EMBL4: EMBL4 ist ein Lambda-Substitutionsvektor mit einer Klonierungskapazität von 9-23 kbp (Frischauf u.a., Lit.-St. 2). Er enthält eine multiple Klonierungsregion zwischen den Lambda- Armen und der nicht-essentiellen Stuffer-Region. Das ermöglicht, daß mehrfache Restriktionsenzymverdauungen derart durchgeführt werden, daß Religation des Stuffers zu den Vektorarmen reduziert wird, wenn das interessierende Fremdgen inseriert wird. Dieser Vektor nützt auch den Spi-Phänotyp, um direkte Selektion auf Rekombinanten zu bieten (Zissler u.a., Lit.-St. 20).
pCG3B11: Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88 101 397.3 beschrieben, es enthält das pelD- (PLI-)Gen von A. niger N756 in pBR322 kloniert.
pPL29-5: Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88 101 397.3 beschrieben, es enthält das N-terminale EcoRI-Fragment des pelD- (PLI-)Gens.
pPL35-5: Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88 101 397.3 beschrieben, es enthält das C-terminale EcoRI-Fragment des pelD- (PLI-)Gens.
pBR322: Das Plasmid pBR322 trägt Gene für die Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin (ampR) und Tetracyclin (tetR). Das Plasmid trägt verschiedene einzelne Klonierungsstellen, von denen sich einige im amp- oder tet-Gen befinden, so daß Insertion von klonierter DNA zu Antibiotikum-empfindlichen Bakterien führt.
pEMBL18 und pEMBL19: Diese Plasmide wurden von Dente u.a. (Lit.-St. 7, 8) beschrieben.
pGW613: Dieses Plasmid wurde von Goosen u.a. (Lit.-St. 12) beschrieben.
M13mp-Phage: Die Vektoren M13mp18 und M13mp19 (Norrander u.a., Lit.-St. 21) sind Derivate der einzelsträngigen DNA Bakteriophagen M13 und werden bestimmt, die DNA-Sequenzierung zu erleichtern, indem die Klonierung von DNA-Fragmenten an einer vielseitigen Polylinker-Stelle und die Klonierung des gleichen Restriktionsfragments in beiden möglichen Orientierungen ermöglicht wird. In diese Vektoren klonierte Sequenzen können leicht als Matrizen für Sequenzierungsreaktionen oder die Herstellung einzelsträngiger Sonden unter Verwendung von Standard-Oligodesoxyribonucleotid-Primer und Klenow-Fragment der E.coli-DNA-Polymerase I verwendet werden. Die Vektor-DNA trägt den E.coli-lac-Operon-Promotor und die genetische Information der ersten 145 Aminosäuren von β-Galactosidase. Die Polylinker-Sequenzen, die multiple Restriktionsorte enthalten, werden in die lacZ-Sequenz inseriert. Der Polylinker behält den lacZ-Leserahmen, und der Vektor gibt allelische Komplementation eines LacZα-Wirtsstammes, wobei sich blaue Plaques auf IPTG und X-Gal enthaltenden Platten ergeben. Rekombinante Phagen, die Inserts enthalten, die den Leserahmen zerstören oder anders die Expression des lacZα-Peptids stören, werden als farblose Plaques erhalten.
pCG 59D7: Dieses Plasmid wird in EP 88 101 397.3 beschrieben und kann aus Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) erhalten werden. Das Plasmid umfaßt das pyrA-Gen und wird für die Cotransformation von A.niger pyrA&supmin;-Mutanten verwendet.
M13(+)KS(Bluescript) (STRATAGENE, San Diego, CA, USA): dsDNA-Vektor, umfassend den Replikationsursprung von M13-Phage. In Gegenwart eines Helferphagen, z.B. M13K07 (Lit.-St. 29) oder R408 (Lit.-St. 9) wird der (+)-Strang des Vektors repliziert, verpackt und in das Medium freigesetzt.
M13 K07; Helfer-M13-Phage für M13(+)KS. Von Mead u.a. (Lit.-St. 29) beschrieben. R408: Helfer-M13-Phage für M13(+)KS. Beschrieben von Russell u.a. (Lit.-St. 9).

Beispiel 1: Konstruktion einer genomischen Bank von Aspergillus niger:

Beispiel 1.1: Isolierung von DNA mit hohem Molekulargewicht aus A. niger:

Konidiosporen des Aspergillus niger-Stammes N400 werden in 200 ml Minimalmedium in einer Endsporendichte von 10&sup6; Sporen/ml geimpft und in 1-1-Erlenmeyern 24 h bei 28ºC bei 300 UpM unter Verwendung einer New Brunswick Umlaufschüttelmaschine geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtration unter Verwendung eines Büchnertrichters mit Myracloth geerntet, mit kalter steriler Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -60ºC gelagert oder sofort verwendet. Das zur Isolierung der DNA herangezogene Verfahren zur Herstellung der genomischen Bank basiert auf der von Yelton u.a. (Lit.-St. 1) beschriebenen Vorgangsweise. Die DNA-Ausbeute beträgt bei dieser Methode etwa 50-100µg/g Myzel.
Für die Konstruktion der Bank werden 10 g Myzel in flüssigem Stickstoff in 1-g-Portionen in einem Braun Micro-Dismembrator gemahlen. Das gemahlene Myzel wird in einen sterilen 1 l-Erlenmeyer transferiert, der 200 ml Extraktionspuffer (50 mM EDTA pH 8,5, 0,2 % SDS) und 200 ul Diethylpyrocarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dann 20 min auf 68ºC erhitzt, während gelegentlich geschüttelt wird. Die Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und 15 min bei 12000 × g zentrifugiert. 1/16 Volumen einer 8 M Kaliumacetatlösung pH 4,2 wird zu dem Überstand hinzugefügt, und man läßt das Gemisch 1 h auf Eis. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (20 min; 16000 × g; 4ºC) entfernt. Die Nucleinsäuren werden aus dem Überstand durch 15 min Inkubation mit 0,6 Volumina Isopropanol auf Eis ausgefällt. Das Pellet wird durch Zentrifugieren (10 min; 6000 × g; 4ºC) gesammelt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10 ml TE, das 20 µg/ml RNase A (Boehringer, Mannheim) enthält, suspendiert und 15 min bei 37ºC inkubiert. Die DNA wird mit Nuclease-freier Pronase (1 mg/ml Endkonzentration) (Kochlight, Coinbrook) 1 h bei 37ºC behandelt. Die Pronase-Vorratslösung in TE-Puffer enthält 20 mg/ml Enzym, das 1 h bei 37ºC inkubiert wird, um Nucleasen zu verdauen.
8,5 g CsCl werden in 9 ml DNA-Lösung gelöst, 0,2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid werden zugesetzt, und diese Lösung wird entweder in einem Beckman SW41-Rotor 60 h bei 33000 UpM oder in einem Beckman 50Ti-Rotor mit Schnellverschluβ-Röhrchen 40 h bei 45000 UpM zentrifugiert. Die DNA-Bande wird durch seitliches Anstechen des Röhrchens gesammelt. Ethidiumbromid wird durch mehrfache Extraktion Wasser- und NaCl-gesättigtem Isopropanol entfernt. 5 Volumina TE werden zugesetzt, die DNA wird mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 extrahiert. Die DNA wird durch Zugabe von 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat pH 5,2, 2,5 Volumina Ethanol und Inkubation über Nacht bei -20ºC ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (1 h, 30000 × g; 4ºC) gesammelt, mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400µl Low-TE gelöst.

Beispiel 1.2: Partielle Verdauung von A. niger-DNA mit Mbol und Isolierung von Fragmenten:

Um auf die Mbol-Konzentration zu testen, die die größte Menge an Fragmenten zwischen 13,6 und 23 kbp ergibt, werden 1 µg-Portionen von A. niger N400-DNA in einem geeigneten Puffer mit abnehmenden Mengen Mbol (0,5 - 0,001 U) 1 h bei 37ºC in einem Volumen von 10 ul verdaut. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 µl 0,25 M EDTA gestoppt, und die Proben werden auf 0,6 % Agarosegel in TBE gebracht, das 1 µg/ml Ethidiumbromid enthält. Geeignete Marker sind ein Gemisch von Lambda-DNA und Lambda-DNA, die mit BgIII verdaut wurde, wobei sich Banden von 49, 22,8,13,6, 9,8, 2,3 kbp und ein nicht-sichtbares Fragment von 0,45 kbp ergeben. Die Mbol-Konzentration, die für eine hohe Ausbeute der gewünschten 13,6-23 kbp-Fragmente erforderlich ist, beträgt 0,02 U/µg DNA. Folglich werden 200 µg DNA in einem Gesamtvolumen von 2 ml verdaut, und in 20 Portionen gleicher Größe sofort nach Zugabe des Enzyms geteilt. Nach 1 h bei 37ºC werden die Verdaue auf Eis gebracht, und man läßt eine 1-µg-Probe auf einem Gel laufen, um auf entsprechende Verdauung zu prüfen. Wenn das Ergebnis positiv ist, wird EDTA zu einer Endkonzentration von 25 mM zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, das Enzym wird 10 min bei 65ºC Wärme-inaktiviert, Proben werden gepoolt und die DNA ausgefällt, gewaschen, getrocknet und in 400µl TE gelöst.
Die fragmentierte DNA wird über Nacht auf einem 0,4%igen präparativen Agarosegel (Mittelvertiefung 120×1,5 mm) getrennt. Mit BgIII verdaute Lambda-DNA wird als Marker verwendet, um die Größe der teilweise verdauten DNA-Fragmente bei Elektrophorese bei 4ºC und 40 V (3 V/cm) zu bestimmen. Die Gelregion, die Fragmente korrekter Größe enthält, wird aus dem Gel geschnitten, und die DNA wird aus dem Gel in einem sterilen Dialyseschlauch in 2 ml TBE während 2-3 h bei 100 V elektroeluiert. Der Strom wird 30 s umgedreht, und der die DNA enthaltende Puffer wird gesammelt. Die Fragmente werden dann durch Ethanolfällung konzentriert und in 100 ul Low-TE gelöst.

Beispiel 1.3: Herstellung von Vektor-DNA und Klonierung von DNA-Fragmenten mit hohem Molekulargewicht von A. niger in EMBL 4.

Die genomische Bank des A. niger-Stammes N400 wird in den Lambda-Vektor EMBL4 konstruiert. Der Vektor, der eine Klonierungskapazität von 9-23 kbp aufweist, wird von Frischauf u.a. (Lit.-St. 2) und Karn u.a. (Lit.-St. 3) beschrieben und wurde von Promega Biotech Inc. erworben. Um Doppelinserts, die aus verschiedenen Teilen des Genoms stammen, zu vermeiden, haben wir eine minimale Fragmentlänge von 13,6 kbp für die Klonierung verwendet.
10 µg Lambda EMBL4-DNA wird vollständig mit 50 Einheiten BamHI in einem passenden Puffer in einem Volumen von 100 µl 2 h bei 37ºC verdaut. Das Enzym wird 10 min bei 65ºC inaktiviert. Die NaCl-Konzentration wird auf 150 mM erhöht, und 50 Einheiten Sall werden zugesetzt, und die Inkubation bei 37ºC schreitet weitere 2 h fort. Nach der Zugabe von EDTA zu 25 mM und Inaktivierung des Enzyms (10 min, 65ºC) wird die Lösung mit gleichen Volumina Phenol (TE-gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1, Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Um die kleinen BamHI/Sall-Polylinker-Fragmente zu eliminieren, wird die DNA mit 0,6 Volumina Isopropanol nach Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat pH 5,2 ausgefällt. Nach 15 min auf Eis und 15 min Zentrifugation bei 12000×γ und 4ºC wird der Niederschlag gründlich mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 40 µl Low-TE gelöst.

Beispiel 1.4: Ligation und in vitro-Verpackung von genomischen A.niger-DNA-Fragmenten.

Es ist essentiell, daß die cos-Stellen des nach Beispiel 1.3 hergestellten Vektors vor der Ligationsreaktion hybridisiert werden. Der Vektor in 100 mM Tris-HCl pH 7,5 und 10 mM MgCl&sub2; wird 10 min auf 65ºC erhitzt und dann 1 h bei 42ºC hybridisiert. Bei Testligationen findet man, daß ein Verhältnis von Vektor zu Fragmenten von ungefähr 1:1 (auf das Gewicht bezogen) ein Maximum an Rekombinanten ergibt. Die Ligation erfolgt in 50 mM Tris HCl pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP unter Verwendung von 9,5 µg Vektor und 10 µg DNA-Fragmenten in einem Gesamtvolumen von 100µl. Dann wird DNA-Ligase (BRL) in einer Konzentration von 0,5 U/µg DNA zugesetzt, und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 14ºC inkubiert. Der Test auf die Ligation einer Probe der ligierten DNA läuft auf einem Agarosegel. Es wird auch eine Menge von 0,5 µg Vektor ohne Zugabe von Fragmenten in einem 5 µl-Volumen ligiert.
Das Ligationsgemisch mit dem großen Volumen wird durch Ethanolfällung konzentriert und in 20 µl Low-TE vor der in vitro-Verpackung gelöst. Die in vitro-Verpackung erfolgt mit Promega Packagene-Extrakten nach der Anleitung des Herstellers unter Verwendung von 10 µl-Portionen, um 1 µg DNA zu verpacken. Von dem Lambda cl857 Sam 7 mit hohem Molekulargewicht, das mit den Extrakten geliefert wird, wird 1 ug extra verpackt, um eine Kontrollprobe zu bieten. Nach der Verpackung werden 500 pg Phagenlösungsputfer (PSB) zugesetzt und 5 µl Chloroform. Die rekombinanten Phagen-Vorräte können bei 4ºC gelagert werden. Die erhaltene Bank wurde aus zwei separaten Ligationsexperimenten konstruiert.

Beispiel 1.5: Titration und Amplifikation der A. niger-Stamm N400-genomischen Bank.

Zellen von E. coli NM539 werden auf LC-Medium, das 0,2% Maltose, 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM CaCl&sub2; enthält, zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 gezüchtet. Dann werden Aliquote von 0,2 ml dieser Kultur zu 0,1 ml einer Phagen-Verdünnungsreihe in PSB zugesetzt. Nach 20 min Adsorption der Phagen bei 37ºC werden 3 ml 0,6%iger LC-Top-Agar von 45ºC zugesetzt, das Gemisch auf LC-Agar-Platten plattiert und diese über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Titrationsergebnisse ausgedrückt als Zahl der plaquebildenden Einheiten (pfu) pro ml Phagensuspension sind 12×10&sup5; und 4,2×10&sup5; pfu/ml für die beiden nach Beispiel 1.4 hergestellten Phagenvorräte. Nach Subtraktion des Untergrunds, der aus den Kontrolligationen ohne Fragmente (17 % bzw. 40 %) errechnet wird, ist die absolute Anzahl der Rekombinanten 6×10&sup5;, was über 200 Mal die Genomlänge ist.
Um die Bank zu amplifizieren, werden 80 µl beider Phagenvorräte verwendet, um E.coli NM539-Zellen zu infizieren, die in LC-Top-Agarose auf LC-Agarplatten plattiert und dann über Nacht bei 37ºC inkubiert werden. Die Phagen werden aus der Agarose eluiert, indem man die Platten leicht mit 5 ml PSB pro Platte 1 h bei Raumtemperatur schüttelt. Der PSB wird gesammelt, zentrifugiert (10 min bei 6000×g), um Bakterien zu entfernen, und Chloroform wird zugesetzt (0,5 % Endkonzentration). Beide Phagenvorräte, die etwa im gleichen Ausmaß amplifiziert sind, werden dann gemischt (40 ml Vorrat), titriert (8×10&sup9; pfu/ml) und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2: Screening der genomischen Bank von A. niger N400 auf das Pektinlyase D-Gen (pelD) und Isolierung des Gens.

Beispiel 2.2: Screening der Bank.

Für die Isolierung des pelD-Gens aus der Lambda-genomischen Bank, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, werden 2,5×10&sup4; Phagen mit verflüssigter LC-Top-Agarose gemischt und auf 5 LC-Agarplatten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert und 2 h bei 4ºC gekühlt. Von jeder Platte werden 2 Reliken nach der Plague-Hybridisierungsmethode von Benton und Davis (Lit.-St. 4) hergestellt. Das erste Filter (Schleicher und Schüll BA85 oder Millipore HATF 085) wird 1 min auf die Platte gebracht, die zweite Replik 2 min, und die Position der Repliken wird mit Tusche markiert.
Nach Entfernung der Filter werden sie 1 min in eine 100 ml Denaturierungslösung (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) enthaltende Schale gebracht und 1 min in 100 ml Renaturierungslösung (0,5 M Tris/HCl pH 7,5,1,5 M NaCl). Dann werden die Filter in eine 3×SSC (SSC=0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat pH 7,0) enthaltende Schale gebracht. Die Filter werden leicht mit einer behandschuhten Hand abgerieben, um bakteriellen Detritus zu entfernen, in eine frische Schale transferiert, die 3xSSC enthält, und 20 min bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Die Filter werden dann auf Whatman 3 MM-Papier geblottet und 10 min bei Raumtemperatur getrocknet. Die Filter werden auf 3 Whatman MM-Papier in einem Ofen bei 80ºC 2 h gebacken. Anschließend werden die 0,5 h in 6×SSC bei Raumtemperatur gewaschen und dann in 50 ml eines vorgewärmten (56ºC) Prähybridisierungsgemischs transferiert, das aus 50 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 10 × Denhardt's (50 × Denhardt's=1 % BSA, Boehringer Fraktion V; 1 % Polyvinylpyrrolidon -40; 1 % Ficoll 400) besteht. Dem Prähybridisierungsgemisch setzt man frisch zu: 0,1 mg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA (Maniatis u.a., S. 327; Lit.-St. 5) und 0,01 mg/ml Poly-rA. Prähybridisierung erfolgt 4 h bei 56ºC unter leichtem Schütteln. Die für die Hybridisierung verwendete Sonde ist das nick-translatierte 3,5 kbp-EcoRI-Fragment von pPL35-5, das die C-terminale Region des pelD-Gens des A. niger N756-Stammes (erhältlich aus E. coli BJ5183/pCG3B11, DSM 3916, EP 88 101 397.3) enthält. Das Fragment wird vorher aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel isoliert, und 0,3 µg des Fragments werden nick-translatiert (Maniatis u.a., S. 109-112; Lit.-St. 5). Die nick-translatierte DNA wird 10 min in einem siedenden Wasserbad denaturiert, auf Eis gekühlt und zu 50 ml vorgewärmtem Prähybridisierungsgemisch zugesetzt. Die prähybridisierten Filter werden eines nach dem anderen in das Hybridisierungsgemisch transferiert. Die Hybridisierung erfolgt bei 56ºC über Nacht unter leichtem Schütteln. Die Filter werden bei 56ºC gewaschen: 2 × 30 min mit 0.5 l 4 × SSC, 0,1 % SDS und 2 × 30 min mit 2 × SSC, 0,1 % SDS. Die Filter werden auf 3 MM-Papier geblottet und 1 h durch Luft getrocknet. Nachdem sie auf 3 MM-Papier befestigt wurden und nach geeigneter Markierung mit radioaktiv markierter Tinte werden die Filter mit "Saran wrap" bedeckt und über Nacht bei -70ºC unter Verwendung von Konika Röntgenfilmen und Kodak X-Omatic-Kassetten mit regulären Verstärkungsfolien autoradiographiert. Auf diese Art werden 44 positive Signale von den 5 durchgemusterten Platten erhalten. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteurpipette herausgenommen, indem man die Platten sorgfältig auf die richtige Art und Weise auf das Autoradiogramm plaziert, wobei die Tintenmarker verwendet werden. Die die positiven Plaques enthaltenden Agarstücke werden in 1 ml PSB gebracht. Man läßt die Phagen 1 h bei Raumtemperatur unter gelegentlichem "Vonexen aus dem Agar diffundieren. Der Agar und Bakterienzelldetritus werden durch 5 min Zentrifugieren entfernt, 10 µl Chloroform zugesetzt und die Phagen-Vorratslösungen bei 4ºC gelagert. Die positiven Klone werden λ-PL1 bis λ-PL44 genannt. Da Phagen in hoher Dichte plattiert werden, müssen die positiven Plaques zweimal durch Plattieren bei niedriger Dichte (± 100 Phagen/Platte; 0,1 ml 10³-Verdünnung des Phagenvorrats) und Wiederholung der gesamten Replika-Plattierung, Hybridisierung und Herausnehmen der positiven Plaques gereinigt werden.

Beispiel 2.2: Isolierung von Lambda-DNA.

Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, werden zuerst Phagen amplifiziert, indem man E. coli NM539 mit 0,1 ml Phagenvorrat aus gereinigten Klonen, wie in Beispiel 1.5 beschrieben, infiziert und die Zellen in LC-Top-Agarose auf LC-Agarplatten plattiert. Das ergibt Platten mit konfluenter Lysis der Indikatorbakterien. 5 ml PSB werden über die Platten gestrichen, und Phagen werden während 2 h unter leichtem Schütteln eluiert. Die eluierten Phagen werden geerntet, Zelldetritus durch Zentrifugieren entfernt, und Chloroform wird zu 1 % zugesetzt. Das resultierende Plattenlysat wird bei 4ºC gelagert. Es hat üblicherweise einen Titer von 10¹¹ pfu/ml.
Da Isolierungsmethoden in kleinem Maßstab aus Plattenlysat-Vorratslösungen und aus Flüssigkulturen im kleinen Maßstab (Maniatis u.a., S. 65-68, Lit.-St. 5) uns nicht immer verdaubare DNA in die Hände geben, werden Phagen aus 250 ml Lysaten isoliert. Diese werden hergestellt, indem man den Wirt E. coli NM539 zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3 in LC + 0,2 % Maltose 10 mM MgSO&sub4;, 1 mM CaCl&sub2; wachsen läßt und dann ungefähr 10¹&sup0; pfu des Plattenlysats zusetzt. Beim weiteren Wachstum lysieren die Bakterien innerhalb von 4 h.
RNase und DNase werden den Lysaten zu einer Endkonzentration von 2 µg/ml zugesetzt, und man läßt das Lysat 1 h bei Raumtemperatur. Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (20 min, Raumtemperatur, 10000×g) entfernt. 14,8 g NaCl und 25 g PEG6000 werden in dem Überstand gelöst, um Endkonzentrationen von 1 M NaCl und 25 % (w/v) PEG zu erhalten. Man läßt die Phagen zur Ausfällung 1 h auf Eis oder über Nacht bei 4ºC und erntet sie durch Zentrifugieren (20 min, 10000×g, 4ºC). Die Pellets werden in 3 ml Lambda-Verdünnungspuffer (LDB=10 mM Tris/HCl pH 7.5, 20 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) suspendiert. 2,5 g CaCl werden in 4 ml Phagensuspension gelöst, und das Gemisch wird in 5 ml Beckman Schnellverschluβ-Röhrchen pipettiert, die dann mit der gleichen Konzentration CsCl in LDB aufgefüllt werden. Die Röhrchen werden verschlossen und über Nacht in einem Beckman VTi 65,2 Rotor bei 50000 UpM und 4ºC zentrifugiert. Die trübe Phagenbande, die unter einer normalen Lampe sichtbar ist, wird von der Seite des Röhrchens punktiert. CsCl wird durch Dialyse in einem sterilen Schlauch gegen 2 l 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl 4 h bei 4ºC entfernt. Der Puffer wird einmal gewechselt. Die Phagen werden in sterilen Greiner-Röhrchen gesammelt, das Volumen wird auf 1 ml eingestellt mit dem Dialysepuffer, 50 µl 10 % SDS, 50 µl 0,5 M EDTA pH 8,0 und 25 µl 20 mg/ml Nucleasefreie Pronase werden zugesetzt und die Röhrchen 1 h bei 37ºC inkubiert. Das Volumen wird mit TE auf 3 ml erhöht, und diese Lösung wird mit gleichen Volumina TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 extrahiert. Nach Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol wird die DNA über Nacht bei -20ºC ausgefällt und durch Zentrifugieren (1 h, 20000 × g, 4ºC) gesammelt. Das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 µl Low-TE gelöst. Die Ausbeute an Phagen-DNA beträgt etwa 200µg/250 ml Lysat.

Beispiel 2.3: Restriktionsanalvse der pelD-Klone.

Aus den positiven Phagen wurden 10 zufällig für die weitere Analyse ausgewählt. 1 µg Phagen-DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI oder BgIII in einem Volumen von 20 µl 2 h bei 37ºC in den vom Lieferanten empfohlenen Puffern verdaut. Die Proben werden auf 0,6%igem Agarosegel unter Verwendung von 1 µg Lambda cl857 Sam 7 DNA, verdaut mit HindIII (Lambda × HindIII), als Marker und EMBL4 DNA und pCG3B11 DNA, verdaut mit EcoRI, als Kontrollen getrennt. Das Gel wird auf einem UV-Transilluminator unter Verwendung von Polaroid 667-Filmen (4s, Diaphragma 8) photographiert. Die DNA wird auf Schleicher und Schüll BA85 Nitrocellulose-Filter nach der Methode von Southern (1975) wie von Maniatis, S. 382-386 (Lit.-St. 5) beschrieben transferiert. Die Filter werden mit einem Gemisch von 32P-markierten (nick-translatierten) Fragmenten des pelD-Gens, die das ganze Gen abdecken, hybridisiert. Diese Fragmente sind das 2,9 kbp EcoRI-Fragment von pPL29-5 und das 3,5 kbp EcoRI-Fragment von pPL35-5. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.
Die Bandenlängen werden aus der Photographie und Autoradiogrammen durch graphischen Vergleich auf halblogarithmischem Papier mit den bekannten Markerbanden berechnet. Die Restriktionskarten der Klone werden in Fig. 1 angegeben. Die Klone λ-PL4, -14 und -40 enthalten das 2,9- und das 3,5 kbp-EcoRI hybridisierende Fragment, wie in pCG3B11 gefunden. λ-PL5, -6, -10 und -33 enthalten das 3,5 kbp EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden EcoRI-Fragment. Die Klone λ-PL26 und -28 enthalten das 2,9 kbp EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden Fragment, während λ-PL9 nur das kleine 1,2 kbp hybridisierende EcoRI-Fragment enthält. Das vollständige 5,0 kbp BgIII-Fragment von pCG3B11, das das gesamte pelD-Strukturgen enthält, ist nur in den Klonen λ-PL4, -14 und -40 enthalten. Die 3,7 kbp-Hybridisierungsbande, die in den Klonen λ-PL5, -6, -10, -14, -33 und -40, aber nicht in pCG3B11 vorhanden ist, ist stromabwärts des pelD-Gens im 5,0 kbp-Fragment lokalisiert. Einige hybridisierende BgIII-Fragmente enthalten noch 1,2 kbp des rechten Arms des Vektors. Alle Klone enthalten auch nichthybridisierende Fragmente, die identisch sind. Da es also scheint, daß die Restriktionsmuster für das Strukturgen und die Genumgebung in allen Klonen identisch sind, wird geschlossen, daß sie aus dem gleichen Gen, nämlich dem pelD-Gen des A. niger-Stammes N400 stammen. Aus der Zahl der plattierten Klone und der angenommenen Genomlänge von 3×10&sup7; bp erwartet man, für 25000 Klone mit einer durchschnittlichen Insertlänge von 15 kbp zumindest 12 pelD-Klone zu finden. Da nur 2 der 10 analysierten Klone identisch sind, ist die Komplexität der Bank noch größer als vermutet (vgl. Beispiel 3).

Beispiel 2.4: Subklonierung von pelD-Fragmenten.

Die 5,0 kbp BgIII-Fragmente von λ-PL4 und pCG3B11, die die pelD-Gene von A.niger N400 bzw. N756 enthalten, werden in den BamHI-Ort von Plasmid pBR322 kloniert (siehe Klonierungsvektoren). 4 Pg λ-PL4 und 2 pg pCG3B11 werden vollständig in 20 µl mit 10 U BgIII 2 h bei 37ºC verdaut. Die Fragmente werden auf 1% niedrig schmelzendem LMP-Agarosegel (BRL) in TBE + 1 Pg/ml Ethidiumbromid bei 50 V getrennt. Das 5,0 kbp-Fragment wird aus dem Gel geschnitten, mit 0,4 ml TE verdünnt, es wird ein gleiches Volumen Phenol zugesetzt und das Gemisch wird 10 min auf 65ºC erhitzt, um die Agarose zu schmelzen. Nach 5 min Zentrifugieren bei 12000 UpM in einer Eppendorf 5414S Tischzentrifuge wird die wäßrige Phase mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, gewaschen, getrocknet und schließlich in 10µl Low-TE gelöst.
1 µg pBR322-DNA, die nach der Methode der Plasmidherstellung im großen Maßstab (Maniatis u.a., S. 86, Lit.-St. 5) hergestellt und durch CsCl-Gradienten-Zentrifugation gereinigt wurde, wird mit 5 U BamHI 2 h bei 37ºC in einem Volumen von 20 µl verdaut. 2 µl 10×CIP-Puffer und 0,02 Einheiten CIP werden zugesetzt und die Inkubation 30 min fortgesetzt. EDTA wird zu einer Endkonzentration von 25 mM zugesetzt und das Gemisch 10 min auf 65ºC erhitzt. Die Lösung wird auf 200 µl mit TE verdünnt und dreimal mit TE-gesättigtem Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach der Ethanol-Fällung wird die DNA in 50µlLow-TE gelöst.
100 ng Fragment-DNA werden mit 20 ng Vektor-DNA in einem Volumen von 20 µl unter den in Beispiel 1.4 beschriebenen Bedingungen ligiert. Die Hälfte des Ligationsgemischs wird verwendet, um kompetente E. coli MH1-Zellen zu transformieren, die nach der CaCl&sub2;-Methode (Maniatis u.a., S. 250; Lit.-St. 5) hergestellt wurden. Die Zellen werden auf LC-Agarplatten plattiert, die 50 ug/ml Ampicillin enthalten, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Transformanten werden auf die Tetracyclin-Empfindlichkeit geprüft, indem man Kolonien zuerst auf 20 µg/ml Tc enthaltende LC-Platten streicht und dann auf LC+amp-Platten. Die Transformanten werden über Nacht in 5 ml LC+amp bei 37ºC wachsen gelassen, und DNA wird aus 1,5 ml der Kultur isoliert, wobei die alkalische Lyse-Miniprep-Methode (Maniatis u.a., S. 368, Lit.-St. 5) herangezogen wird.
Die Miniprep-DNAs werden mit BamHI und PstI verdaut und die Fragmente auf 1 %-Agarosegel analysiert. Zwei Plasmide, die aus λ-PL4 stammen, die das 5,0 kbp BgIII-Fragment in entgegengesetzter Orientierung enthalten, werden als pGW840 und pGW841 bezeichnet. Weitere Plasmide, die aus pCG3B11 stammen, werden als pGW870 und pGW871 bezeichnet. Die MH1-Zellen, die sie beherbergen, werden auf Glycerol bei -70ºC gehalten. Plasmid-DNA von 0,5 l Kulturen dieser Klone wird in großem Maßstab isoliert (Maniatis u.a., S. 86, Ut.-St. 5), durch CsCl-Zentrifugation gereinigt, phenolisiert, Ethanol-gefällt und in 400 µl Low-TE gelöst. Die Ausbeute beträgt ungefähr 500 µg. Die Plasmide werden einer Restriktionskartierung unterworfen. Die Karte für das Plasmid pGW840 wird in Fig. 2 gezeigt und ist von pGW870 ununterscheidbar. Auch die Plasmide pGW841 und pGW871, die das Fragment in der entgegengesetzten Orientierung enthalten, sind ununterscheidbar, was die Identität der pelD-Gene aus A.nier-Stamm N400 und N756 anzeigt.

Beispiel 3: Screening auf, Isolierung und Charakterisierung von mit pelD verwandten Genen.

Beispiel 3.1: Festlegung der Hybridisierungsbedingungen durch Analyse genomischer Blots von A. niger N400-DNA.

2 µg DNA-Proben von A. niger-Stamm N400, wie im Beispiel 1.1 beschrieben isoliert, werden in einem Volumen von 20 µl 4 h bei 37ºC unter Verwendung von BamHI (BRL) oder HindIII (BRL) in HHA B/g-Puffer verdaut. Die verdauten Proben werden elektrophoretisch auf 0,6%-Agarosegelen bei 40 V 18 h getrennt. Die DNA wird auf Nitrocellulosefilter transferiert und wie im Beispiel 2.3 beschrieben gebacken. (Prä)-Hybridisierungslösungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.
Die für die Prähybridisierung angewendete Temperatur ist immer gleich der Hybridisierungstemperatur. Das nick-translatierte 1,6 kbp BamHI/PstI-Fragment von pGW840, das die codierende Region des pelD-Gens enthält, wurde als Sonde verwendet. Die Hybridisierung erfolgt bei verschiedenen Temperaturen (52, 60 und 68ºC) 16 und 40 h lang. Die folgenden zwei Waschbedingungen werden bei den drei verschiedenen Temperaturen angewendet: 2×30 min 5×SSC, 0,1 % SDS gefolgt von 2×30 min 3×SSC, 0,1 % SDS verglichen mit 4×30 min 5×SSC, 0,1 % SDS. Bei 68ºC ist auch zweimaliges Waschen mit 2×SSC, 0,1 % SDS und zweimal mit 0,2×SSC, 0,1 % SDS eingeschlossen. Bei 68ºC unter Verwendung von 0,2×SSC-Waschungen, erfolgt nur homologe Hybridisierung. Die Verwendung höherer Salzkonzentrationen führt zum Auftreten einiger anderer schwacher Signale. Bei 52ºC ist der Hintergrund hoch und die Hybridisierung schwach. Die besten Bedingungen, die für "heterologe" Hybridisierung gefunden wurden, sind 60ºC, 40 h, unter Anwendung der Waschkombinationen 5×SSC und 3×SSC. Das kann weiter durch Verwendung von 4×SSC in Kombination mit 2×SSC anstelle von 5×SSC in Kombination mit 3×SSC optimiert werden. Die Signale, die in diesen genomischen Blots von A. niger N400 bei Verwendung des 1,6 kbp BamHI/PstI-Fragmentes von pGW840 als Sonde gesehen werden, werden in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I. Hybridisierungssignale in genomischer DNA von A. niger N400, als Sonde das 1,6 kbp BamHI/PstI von pGW840. BamHI HindIII stark homolog stark schwach schwächer sehr schwach

Beispiel 3.2: Screening der Bank.

2,5×10&sup4; Phagen aus der N400 Lambda-Bank werden auf 5 Platten plattiert, und es werden 3 Nitrocellulose-Repliken von jeder Platte gemacht, wie im Beispiel 2.1 beschrieben. Der (Prä-)Hybridisierungspuffer wird ebenfalls im Beispiel 2.1 beschrieben. Die erste Replik von jeder Platte wird bei 60ºC 40 h mit dem 1,6 kbp-BamHI/PstI- Fragment von pGW840 hybridisiert und zweimal bei dieser Temperatur 30 min mit 4×SSC, 0,1 % SDS und zweimal 30 min mit 2×SSC, 0,1 % SDS wie im Beispiel 3.1 beschrieben gewaschen. Diese Bedingungen werden als heterologe Bedingungen bezeichnet. Die zweite Replik von jeder Platte wird bei 68ºC mit dem gleichen Fragment hybridisiert, Waschen zweimal 30 min mit 2×SSC, 0,1 % SDS und zweimal 30 min mit 0,2×SSC, 0,1 % SDS bei dieser Temperatur. Diese Bedingungen werden als homologe Bedingungen bezeichnet. Die dritte Replik von jeder Platte wird homolog mit dem 0,35 kbp BamHI-Fragment von pGW840 hybridisiert, das sich in der Promotor-Region von pelD direkt benachbart zum 1.6 kbp BamHI/PstI-Fragment befindet. Es werden 29 Plaques erhalten, die heterolog hybridisieren, aber nicht (oder sehr schwach) homolog. Diese werden mit λ-PL100 bis λ-PL129 bezeichnet. Es werden 19 Plaques erhalten, die stark homolog und heterolog mit der BamHI/PstI-Sonde hybridisieren. Diese werden als λ-PL130 bis λ-PL148 bezeichnet und für pelD-Klone gehalten. Von diesen hybridisieren zwei nur schwach mit der 0,35 BamHI-Sonde (λ-PL145 und λ-PL146), daher enthalten sie wahrscheinlich nur einen Teil der Promotor-Region. Die anderen hybridisieren stark. Es wird nur 1 Klon erhalten, der nur mit der 0,35 kbp BamHI- Sonde (λ-PL149) hybridisiert.
Es werden alle Klone herausgenommen und zweimal durch Plattieren und heterologe Hybridisierung mit der 1.6 kbp-BamHI/PstI-Sonde gereinigt. In einem zweiten Screening-Experiment wurden zusätzlich 23 pelD-Klone und 25 andere Klone erhalten (λ-PL151 bis λ-PL198).

Beispiel 3.3: Charakterisierung von Lambda-Klonen durch das Plague-Hybridisierungssignal mit verschiedenen Sonden, die von pelD abgeleitet sind.

In diesem Experiment wird eine Klassifizierung der isolierten Klone durch Verwendung verschiedener Teile der codierenden Region von pelD als Sonde beschrieben. Eingeschlossen sind λ-PL101 bis -130, -145, während λ-PL4 als positive Kontrolle verwendet wird. Die Klone werden ausplattiert, und es wird nur eine Replik gemacht, die in 6 Teile geteilt wird. Das soll Unterschiede im Hybridisierungssignal zwischen Repliken ausschließen. Separate Teile der Repliken werden sowohl heterolog als auch homolog mit den folgenden 32P-markierten Sonden hybridisiert:
1. das vollständige 1,6 kbp BamHI/PstI-Fragment aus pGW840; 2. das 649 bp BamHI/Xhol-Fragment von pGW840 (N-terminaler codierender Teil von pelD); 3. das 244 bp Xhol/PstI-Fragment von pGW840 (C-terminaler codierender Teil von pelD).
λ-PL4, -130 und -145 sowie λ-PL101 hybridisieren unter homologen und heterologen Bedingun gen stark mit diesen Sonden, wie das für pelD-Klone erwartet wird. Der letztere Klon, λ-PL101, ist an der Kante eines Filters im Beispiel 3.2 lokalisiert und daher im ersten Screening nicht als pelD gezählt. Die eben erwähnten Klone werden als Klasse I (pelD)-Klone klassifiziert. Bei λ-PL112, -126 und -127 stellt sich heraus, daß sie in diesem Experiment negativ sind. Alle anderen Klone können in zwei andere Klassen unterteilt werden: Klasse II hybridisiert heterolog, nicht nur mit der ganzen Sonde, sondern auch mit der N-terminalen Sonde. Homologe Hybridisierung ist mit dem ganzen pelD-Gen als Sonde nur schwach. Die Klone der Klasse III hybridisieren nicht mit der N-terminalen Sonde und auch nicht homolog mit der ganzen Sonde. Die C-terminale Sonde hybridisiert nicht mit Klonen der Klasse II und Klasse III. Aus diesen Experimenten schließen wir, daß es zumindest 2 verwandte Gene unter den isolierten Klonen gibt.
Zu den Klonen der Klasse II gehören: λ-PL104, -105, -109, -113, -114, -115, -119, -122, -124, -125,-128und -129.
Die Klasse III-Klone sind λ-PL102, -103, -106, -107, -108, -110, -111, -116, -117, -118, -120, -121 und -123.

Beispiel 3.4: Restriktionsanalyse der isolierten Lambda-Klone (Klasse I, II).

Plattenlysat- Vorratslösungen, 250 ml flüssige Lysate und Phagen-DNA-Zubereitungen im großen Maßstab aus diesen Lysaten werden wie im Beispiel 2.2 beschrieben hergestellt. Dies erfolgt für 24 Klone, von denen 3 pelD-Klone (λ-PL4, -130, -145) sind. Eine Klon-DNA geht während der DNA-Isolierung verloren (λ-PL124). Die aus diesen Klonen isolierte DNA wird in 1 Pg-Proben in insgesamt 20 µl mit 10 Einheiten Enzym verdaut. Alle Klone werden mit EcoRI, BamHI, HindIII, EcoRI/BamHI, BamHI/HindIII, EcoRI/HindIII und EcoRI/BamHI/HindIII verdaut. Fragmente werden auf einem 0,6%-Agarosegel getrennt und wie im Beispiel 2.3 beschrieben auf Nitrocellulosefilter transferiert. Blots werden heterolog mit dem 1,6 kbp-BamHI/PstI-Fragment von pGW840 wie im Beispiel 3.1 beschrieben hybridisiert. Zwei Klone hybridisieren nicht (λ-PL112 und λ-PL129). Die Bandenlängen werden aus den Photographien und den Autoradiogrammen berechnet. Außer dem λ-PL113-Klon enthalten alle Klone zu viele Fragmente, um eine vollständige Karte abzuleiten.
Es ist jedoch möglich, eine Karte der hybridisierenden Region abzuleiten und, durch Kombination von Daten über andere nicht-hybridisierende Bande, festzulegen, welche Klone vom gleichen Gen abgeleitet sind. Es ist klar, daß unter den verbleibenden analysierten 18 Klonen der Klassen II und III Gene anwesend sind. Diese werden pelA, pelB, pelC, pelE und pelF genannt. Die Zuordnung von Klonen zu diesen Genen wird in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II: Zuordnung isolierter Klone zu verschiedenen pel-Genen, (part) bedeutet, daß die hybridisierenden Banden nur partiell in diesen Klonen vorhanden sind. Klasse Gen λ-Klone (part) Tabelle III: Vergleich hybridisierender Banden in chromosomalen Blots und isolierten Genen. Die Bandenlänge in kbp. EcoRI BamHI HindIII Chromosomal &spplus;größere Banden groß Homologes Signal pelD Stärkste heterologe Signale Schwächere Signale Schwache Signale 1,5+2,8 (sehr schwach)
Ein Vergleich der Längen der hybridisierenden Fragmente der isolierten Gene und der Längen der hybridisierenden Fragmente aus genomischen DNA-Blots wird in Tabelle III gezeigt. Aus diesen Daten wird geschlossen, daß alle Banden, die in genomischen Blots hybridisieren, in den isolierten Klonen vorliegen und daß unter diesen Hybridisierungsbedingungen keine anderen verwandten Gene isoliert werden können. Die Ergebnisse der Plague-Hybridisierung (Beispiel 3.3) zeigen, daß - ohne Berücksichtigung partieller Klone - jedes Gen ein spezifisches Hybridisierungsmuster mit den getesteten Sonden aufweist. Das wird in Tabelle IV zusammengefaßt. Tabelle IV: Vergleich der Signalstärke verschiedener Gene in homologer und heterologer Plaque-Hybridisierung mit verschiedenen pelD-Sonden gemäß dem in Beispiel 3.3 beschriebenen Experiment. Der Hybridisierungsgrad wird durch die Zahl der +-Zeichen ausgedrückt. Das homologe pelD-Gen hybridisiert mit zumindest 10 +-Zeichen; ± sehr schwache Hybridisierung; - keine Hybridisierung. heterologe Hybridisierung homologe Hybridisierung Sonde ganzes Gen N-Term. C-Term.

Beispiel 3.5: Subklonierung von mit pelD verwandten Genen in pBR322.

Subklone der hybridisierenden Fragmente, die aus λ-Klonen erhalten werden - beschdeben in Beispiel 3.3 - werden im Vektor pBR322 gemacht, der durch EcoRI, BamHI oder HindIII verdaut und anschließend dephosphoryliert wird. Fragmentisolierung aus LMP-Agarosegelen, Vektorherstellung, Ligation, Transformation von E.coli MH1, Miniprep-DNA-Isolierung und Plasmidisolierung im großen Maßstab erfolgen unter Anwendung von Standardmethoden, die im Beispiel 2.4 beschrieben wurden.
Fragmente werden in den passenden Vektor wie im Beispiel 2.4 beschrieben ligiert. Transformierte E.coli MH1-Zellen werden auf LC+50 µg/ml Amp plattiert. Transformanten werden auf Tetracyclin-Empfindlichkeit getestet. Die EcoRI-Klone sind alle resistent. Miniprep-DNAs werden dann mit passenden Enzymen verdaut, um auf die richtigen Inserts zu prüfen und die Orientierung der Fragmente zu bestimmen. Die Plasmide, die ausgewählt wurden, sind in Tabelle V zusammengefaßt. Zellen. die sie beherbergen, werden auf Glycerol bei -70ºC gelagert. Tabelle V: Subklone von pel-Genen in pBR322. Plasmid Gen Fragment Ursprung Orientierung EcoRI BamHI HindIII
Die Plasmide pGW820, -830, -850, -860 und -880 wurden in großem Maßstab isoliert und Restriktionskartierung unterworfen. Karten dieser Plasmide zeigen die Fig. 1 bis 6.
Um die Genlokalisierung und die Orientierung zu bestimmen, werden Southern-Blots von Plasmidverdauen heterolog mit dem 1,6 kbp-BamHI/PstI-Fragment von pGW840 hybridisiert, und identische Blots werden heterolog mit einem N-terminalen Fragment des gleichen Plasmids hybridisiert, welches das 649 bp-BamHI/Xhol-Fragment für die Kartierung von pGW820 und -830 und das 766 bp-BamHI/EcoRI-Fragment für pGW850 und -860 ist.
Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 wurden in E.coli HB101 kloniert und am 1. Februar 1988 bei "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen", Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, hinterlegt. Sie erhielten die DSM-Nummern 4388, 4389, 4390, 4391 bzw. 4392.

Beispiel 4: Sequenzbestimmung des pelD-. pelA-, pelB- und pelC-Gens.

Beispiel 4.1: Partielle Sequenz des pelD-Gens aus dem A. niger-Stamm N400 und seine Identität mit pel I aus dem A. niger-Stamm N756.

Es werden geeignete Restriktionsfragmente aus pGW840 nach LMP-Agarose-Gelelektrophorese wie im Beispiel 2.4 beschrieben isoliert. Diese werden in M 13mp18RF- und M13mp19RF-Vektoren nach dem "BRL M13 cloning/dideoxy sequencing instruction manual" (S. 26. 27; Lit.-St. 6) ligiert. Transformation von E.coli JM103, Plattierung auf Minimal-X-gal-Indikatorplatten und Isolierung einzelsträngiger DNA aus rekombinanten Phagen erfolgen nach der Anleitung im gleichen Manual (S. 29-34). Einige Klone werden nach der Sanger-Didesoxy-Kettenabbruchmethode sequenziert, die auf S. 38-74 des BRL-Manuals beschrieben wird.
Die zwischen den Nucleotiden -457 und +100 bestimmten Sequenzen sind identisch mit der entsprechenden Sequenz des PLI-Gens, das aus A. niger N756 abgeleitet ist und in Plasmid pCG3B11 vorhanden ist (EP 88 101 397.3). Die aus dem BamHI an der Position -457 bis zur Position +100 bestimmte Sequenz umfaßt 457 Nucleotide der Promotorsequenz, die 57 Nucleotide, die die Signalsequenz codieren, und 43 Nucleotide, die die ersten 13 N-terminalen Aminosäuren des reifen PLD-Proteins codieren.
Aus identischen Restriktionskarten des N400 pelD-Gens in pGW840 und des N756 pelD in pCG3B11 und den vollkommen identischen N-terminalen Sequenzdaten wird angenommen, daß beide Gene identisch sind. Folglich wird angenommen, daß das PLD-Protein mit dem früheren PLI-Protein identisch ist.

Beispiel 4.2: Sequenzbestimmung der pelA-, pelB- und pelC-Gene.

Fragmente von pGW820, pGW830 und pGW850 werden in M13mp18RF und M13mp19RF (siehe Beispiel 4.1) oder in die Plasmide pEMBL18 und pEMBL19 (Dente u.a., Lit.-St. 7, 8) subkloniert. Einzelsträngige DNAs der Plasmidklone werden durch Infektion mit dem Helferphagen R408 erhalten (Russell u.a., Lit.-St. 9).
Exonuclease III-Deletionsklone wurden von pGW850 nach der Methode von Henikoff (Lit.-St. 28) hergestellt. Das 3,0 kbp Smal-BgIII-Fragment von pGW850, auf dem sich das pelC-Gen befindet, wird in pEMBL19 subkloniert. 50 µg dieses Klons werden mit Smal und Sacl verdaut und nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung mit Exonuclease III verdaut. In verschiedenen Zeitintervallen werden Proben genommen, die Exonuclease III wird durch Zugabe von NaCl und EDTA und 10 min Inkubation bei 70ºC inaktiviert. Überhängende ssDNA-Enden werden durch S1-Nuclease entfernt und die klebrigen Enden mit T4-DNA-Polymerase stumpf gemacht. Nach Selbstligation und Transformation von E. coli JM103 mit diesen Deletionsklonen werden einzelsträngige DNAs durch Infektion mit dem Helferphagen R408 erhalten. pGW820 wird von der Pvull- Stelle an der Position 1000 bis zur Clal-Stelle an der Position 4175 (siehe Fig. 1) sequenziert. Im Falle von pGW830 wird das 2774 bp-Xhol-Fragment sequenziert (siehe Fig. 2). pGW850 wird von der EcoRI-Stelle an der Position 0 bis zur Position 3168 (siehe Fig. 3) sequenziert.
Die Sequenzstrategien für diese Gene werden in Fig. 7, 8 und 9 gezeigt. Verschiedene Oligonucleotide werden unter Ahwendung der Phosphoramidit-Methode von Caruthers (Lit.-St. 10) unter Verwendung eines Applied Biosystem (Modell 380B) Oligonucleotid-Synthesegeräts synthetisiert. Sie werden als Sequenzierprimer zugesetzt, und ihre Position wird in Fig. 7 und 8 gezeigt.
Die gesamte Sequenz des pelA-Gens wird in Fig. 9 in der 5'T3'-Richtung angegeben. Die 3175 bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nucleotid der Pvull-Stelle an der Position 1000 in pGW820 und endet beim letzten Nucleotid der Clal-Stelle an der Position 4175 in pGW820.
Die pelA-Sequenz umfaßt 1360 Nucleotide der Promotorregion, 1355 Reste des Strukturteiles und 360 Nucleotide der Terminatorregion.
Der Aminosäuresequenz von PLA (siehe Beispiel 6.3) geht eine Signalsequenz von 20 Aminosäuren voraus, wie man aus der Nucleotidsequenz schließen kann.
Die Homologie mit der Signalsequenz des pelD-Gens wird durch einen Stern angezeigt. Auch die ersten fünf Reste des reifen Proteins haben die gleiche Aminosäuresequenz in pelA und pelD.
Die gesamte Sequenz des pelB-Gens wird in Fig. 10 angegeben, ebenfalls in Richtung 5'T3'. Die 2774 bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nucleotid der Xhol-Stelle in pGW830 und endet mit dem letzten Nucleotid der zweiten Xhol-Stelle.
Die pelB-Sequenz umfaßt 1133 Nucleotide der Promotorregion, 1373 Reste des Strukturteiles und 268 der Terminatorregion. Das pelB-Gen codiert für eine Signalsequenz von zumindest 20 Aminosäuren.
Die pelC-Sequenz umfaßt 1367 Nucleotide der Promotorregion, 1340 Reste des Strukturteiles und 461 der Terminatorregion. Das pelC-Gen codiert für eine Signalsequenz von 18 Aminosäuren.
Die Homologie mit der Signalsequenz des pelA-, pelB- und pelD-Gens wird an jeder Position mit einem Stern angezeigt. Die X sind für die Anordnung der Sequenzen inkludiert.
Die Suche nach Consensus-Sequenzen für fungöse Exon/Intron-Spleißverbindungen und Intron-interne Sequenzen (Ballance, Lit.-St. 11) führt uns dazu, die Gegenwart von vier Introns im pelA-, B- und C-Gen zu postulieren. Die Positionen, an denen sich die Introns innerhalb der codierenden Regionen dieser pel-Gene befinden, werden in dem Sinn beibehalten, daß potentiell fünf Intron-Positionen vorliegen, aber in jedem Gen ein anderes Intron fehlt. Für das pelC- Gen werden jedoch nur drei Introns postuliert. Von diesen wird nur eines in einer Position gefunden, die der Position eines Introns in pelD und pelA (Intron 5) entspricht. Die Positionen dieser Introns und ihre jeweiligen Längen werden in Tabelle VIa zusammengefaßt. Tabelle VIa: Positionen von Introns in den Sequenzen von pelD, pelA, pelB und pelC. Die Positionen beziehen sich auf die codierenden Sequenzen in Fig. 10, 11 und 12 und auf die Sequenz von pelD. Gen Intron Position Länge,bp nicht vorhanden
Die Längen der Exons zwischen Introns unter den pel-Genen ist in diesen Fällen gleich. In der Fig. 13 werden die angeordneten abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PLA, PLB, PLC und PLD gezeigt. Im N-terminalen Teil der codierenden Regionen von pelA, pelB und pelD wird ungefähr 80% Homologie auf Basis der Nucleotidsequenzhomologie und über 80% auf Basis der Aminosäuresequenzhomologie beobachtet. Dieser Prozentsatz ist bei ºC viel niedriger. Im C-terminalen Teil von pelA, pelB und pelD jenseits des Restes 285 des reifen Proteins (dem Rest 305 in Fig. 13 entsprechend) ist die Homologie in großem Ausmaß verloren und kommt erst nahe dem C-Terminus wieder.
Außer den Consensus-Sequenzen des Spleiβ-Signals und der 5,- und 3'-Spleißstellen (Tabelle VIb) findet sich keine Homologie in den Introns. Tabelle VIb: Vergleich von Consensus-Intron-Sequenzen. Intron Donor Lariat Akzeptor Exon CONSENSUS
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Proteine PLA, PLB, PLC und PLD zeigen insgesamt 359 Reste für die ersten beiden Proteine. 360 für PLC und 354 für PLD. In bezug auf N-Glycosylierung liegt ein potentieller Glycosylierungsort in allen vier Proteinen an der Position 109 (im reifen Protein) (für PLC entspricht dies Position 105 in der nicht-angeordneten Sequenz) vor. In PLB ist eine zweite potentielle Stelle an der Position 232 vorhanden, während in PLD zwei andere potentielle Glycosylierungsorte an den Resten 255 und 329 vorliegen.

Beispiel 5: Cotransformation von A. niger unter Verwendung des A. niger-pyrA-Gens als Selektionsmarker und der verschiedenen A. niger-pel-Gene als cotransformierende Plasmide.

Beispiel 5.1: Propagierung und Reinigung von zur Transformation von A. niger verwendeten Plasmiden.

Alle Plasmide werden im E.coli-Stamm MH1 propagiert, und Plasmid-DNA wird aus 500 ml Übernachtkulturen wie von Maniatis u.a. (S. 90-91, Lit.-St. 5) beschrieben gewonnen. Zu 2,5 ml DNA-Lösung in TE, die bis zu 1 mg DNA enthält, werden 2,2 g CsCl und 1 ml Ethidiumbromid (10 mg/ml in Wasser) zugesetzt. Die Lösung wird in Schnellverschluβ-Röhrchen gebracht, die gefüllt und verschlossen werden, wie das der Lieferant (Beckman) empfiehlt. Zentrifugieren erfolgt in einem VTi 65,2 Rotor bei 20ºC 16 h bei 45000 UpM. Von den beiden unter UV- Licht sichtbaren fluoreszierenden Banden, wird die untere, die Ptasmid-DNA enthält, durch seitliches Anstechen des Röhrchens isoliert. Die DNA-Lösung (ungefähr 1 ml) wird 5 Mal mit Wasser-gesättigtem Butanol extrahiert, um Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird die DNA durch Ethanol ausgefällt, in TE resuspendiert, einmal mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, erneut ausgefällt und bei -20ºC gelagert.
Das Plasmid pGW6 13, das das OMP- Decarboxylase-Gen (pyrA) auf einem 5 kbp A. niger- DNA-Fragment enthält, wird verwendet, um Transformanten zu selektieren (Goosen u.a., Lit.-St. 12). Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 und pGW880, die im Beispiel 3.5 beschrieben werden, werden als cotransformierende Plasmide verwendet.

Beispiel 5.2: Herstetlung von Protoplasten und Transformation des Uridin-auxotrophen mutierten A. niger-Stammes N593.

Der A. niger-Stamm N593 (cspA, pyrA), der ein Derivat des Elternstammes N400 ist, wurde durch positive Selektion gegen die toxische analoge 5-Fluor-orotsäure wie in Hefe (Boeke u.a., Lit.-St. 13) in Gegenwart von Uridin wie von Goosen u.a. (Lit.-St. 12) beschrieben erhalten.
Flüssiges Minimalmedium, das mit 0,5 % Hefeextrakt, 0,2 Casaminosäuren, 10 mM Uridin (Janssen Chimica) und 50 mM Glucose ergänzt ist, wird mit 10&sup6; Konidiosporen von A. niger N593 pro ml geimpft und 20 h bei 30ºC in einem New Brunswick Orbitalschüttler inkubiert. Myzel wird durch Filtration durch Miracloth geerntet, mit isoosmotischem (STS) Minimalmedium (STC) der folgenden Zusammensetzung gewaschen: 1,33 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl&sub2;, eingestellt auf 1,7 mOsm. Eine Menge von 1 g Myzel wird in 20 ml STC erneut suspendiert. Innerhalb von 2 h werden aus dem Myzet Protoplasten durch Zugabe von 250 mg Filter-sterilisiertem Novozym 234 (Novo Industries, Dänemark) und Inkubieren des Gemischs bei 30ºC in einer Schüttelvorrichtung bei 95 UpM freigesetzt. Die Protoplasten werden vom restlichen Myzel durch Filtration unter Verwendung eines Trichters mit einem Glaswolle-Stopfen abgetrennt und durch Zentrifugieren (10 min, 2500 UpM) durch Pelletieren und erneutes Suspendieren in STC gereinigt.
Für die Transformation nimmt man 5×10&sup6; Protoplasten in 200 µl, die dann zusammen mit 1 µg pGW613 und 10 µg eines der folgenden Plasmide inkubiert werden: pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 oder pGW880 (Volumen weniger als 20 µl). Für pGW840 nimmt man ein Verhältnis von 1:3, wobei 6µg pGW613 genommen werden. Nach der Zugabe von Plasmid-DNA zu den Protoplasten werden 50µl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5,50 mM CaCl&sub2;, 25% PEG6000) zugesetzt, und das Inkubationsgemisch wird 20 min auf Eis gehalten.
Dann werden weitere 2 ml PCT zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich werden 4 ml STC zugesetzt und gemischt. Aliquote von 1 ml dieser Endtransformationslösung werden mit 4 ml verflüssigtem isoosmotischem MM-Top-Agar, stabilisiert durch 0,95 M Saccharose (eingestellt auf 1,7 mOsm), gemischt. Das Protoplastengemisch wird sofort auf das gleiche isoosmotische Minimalmedium enthaltende Agarplatten plattiert, und diese werden bei 30ºC inkubiert. Entsprechende Kontrollversuche schtießen ähntich behandelte Protoplasten ohne Plasmid-DNA und auf nicht-stabilisiertem Minimalmedium mit 2,5 mM Uridin ein.
Nach 3 Tagen Wachstum bei 30ºC erscheinen gut wachsende Transformanten, die sporulieren (50-150 Transformanten/µg pGW613). Daneben tritt eine große Anzahl vermutlich abortiver Transformanten auf. Sporen individueller Transformanten werden genommen und separat auf 50 mM Glucose-Minimalmedium ausplattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten, die zum Vermehren von Sporen für weitere Transformantenanalyse verwendet werden.
In jedem Fall werden zumindest 10 Transformanten auf flüssigem Minimalmedium kultiviert die DNA wird extrahiert und auf die Gegenwart cotransformierender Plasmid-DNA analysiert. Pilz- DNA wird nach einer leicht modifizierten Methode, die zur Isolierung von Pflanzen-RNA verwendet wird (Slater, Lit.-St. 14), isoliert. Myzel wird mit Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren, und 0,5 g werden unter Verwendung eines Microdismembrators (Braun) zerbrochen. Das Myzelpulver wird mit frisch zubereitetem Extraktionspuffer extrahiert. Der Extraktionspuffer wird wie folgt hergestellt: 1 ml Triisopropylnaphthalinsulfonsäure (TNS) 20 mg/ml werden mit 1 ml p-Aminosalicylsäure (PAS) (120 mg/ml) und 0,5 ml 5×RNB-Puffer (5×RNB enthält 121,1 g Tris, 73,04 g NaCl und 95,1 EGTA in 1 l, pH 8,5) gemischt. Nach der Zugabe von 1,5 ml Phenol wird der Extraktionspuffer 10 min bei 55ºC äquilibriert. Der warme Puffer wird dann zu dem Myzelpulver zugegeben, und die Suspension wird 1 min unter Verwendung eines Vortex-Mischers gründlich gemischt. Dann wird 1 ml Chloroform zugesetzt und 1 min gemischt.
Durch Zentrifugieren (10 min, 10000×g) wird die wäßrige Phase abgetrennt und noch einmal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) und dann zweimal mit Chloroform extrahiert.
Die wäßrige Phase enthält RNA und DNA. Die DNA wird mit 2 Volk Ethanol bei Raumtemperatur ausgefällt und durch Zentrifugieren (10 min, 10000×g) abgetrennt, zweimal durch Auflösen in destilliertem sterilem Wasser und Wiederausfällen mit Ethanol gewaschen. RNA wird durch Zusetzen von RNase A (20 ug/ml) zur Endlösung entfernt. Die Vorgangsweise führt zu DNA mit hohem Molekulargewicht (100-200 kbp) mit einer Ausbeute von etwa 300 µg DNA/g Myzel, die weiter durch CsCl/Ethidiumbromid-Dichtegradienten-Zentrifugation im wesentlichen nach Maniatis u.a. (S. 93; Lit.-St. 5) gereinigt wird.
Verdaue der chromosomaten DNA (2 µg) erfolgen durch 2 h Inkubieren bei 37ºC mit EcoRI für pelA- (pGW820) und pelC- (pGW850) Transformanten, HindIII für pelB- (pGW830) Transformanten, EcoRI oder BgIII für pelD-Transformanten. In allen Fällen werden anfangs 20 U Restriktionsenzym verwendet, wonach die Inkubation weitere 2 h wieder durch Zugabe von 20 U Restriktionsenzyme verlängert wird. Die Verdauungen werden in geeigneten Reaktionspuffern, die von BRL geliefert werden, durchgeführt.
Dann wird die DNA auf 0,6 %-Agarose fraktioniert, auf Nitrocellulose geblottet und im wesentlichen nach Maniatis u.a. (Lit.-St. 5), S. 382-386, unter Verwendung der entsprechenden [α-³²P]-markierten Sonden hybridisiert.
Die folgende Cotransformationshäufigkeit wird gefunden: pGW820 (pelA) 70%; pGW830 (pelB) 70%; pGW840 (pelD) 15%; pGW850 (pelC) 60%.
Das Massenverhältnis von pGW613 zum cotransformierenden Plasmid pGW820, pGW830, pGW850 (1:10) und pGW840 (1:3) führt in der Mehrzahl der beobachteten Fälle zu chromosomaler Multicopy-Integration der cotransformierenden Plasmide.

Beispiel 5.3: Genomische Analyse des pelA-transformierten A. niger-Stammes A15.

Eine Anzahl von der in 5.2 beschriebenen Multicopy-Transformanten wurde analysiert, und die Analyse des pelA-Transformanten A15 wird als detailliertes Beispiel angeführt.
DNA des A. niger-Stammes N593 und des Multicopy-Transformanten pelA-Stammes A15 wird isoliert und durch Hybridisierung von Southern-Blots wie in Beispiel 3.1 beschrieben analysiert.
Als pelA-Sonde wird das 7,5 kbp EcoRI-Fragment verwendet (siehe Fig. 3a). In dem genomischen Blot findet sich eine intensive Bande von 7,4 kbp in dem transformierten Stamm A15, die aus Typ I und/oder Typ II-Integrationsereignissen (s. Hinnen u.a., Lt.-St. 14a) stammt. Es werden auch kleinere Banden verschiedener Längen gefunden, die Randfragmente von Typ II-Integrationsereignissen von Umordnungen darstellen.
Die optischen Dichten der 7,4 kbp EcoRI-Banden in den A. niger pelA-Transformanten A15- und A.niger N593-Autoradiogrammen werden unter Verwendung eines Ultroscan XL (LKB) gescannt. Die Werte werden für leichte Differenzen in der DNA-Konzentration zwischen N593 und dem Transformanten A15 durch Scannen der erhaltenen Dichten mit einer zweiten Sonde, die mit dem Pyruvatkinase-Gen hybridisiert, das als einzelne Kopie in beiden Stämmen vorhanden ist, korrigiert. Aus diesen Daten wird berechnet, daß im pelA-Transformanten A15 ungefähr 19 intakte Kopien des pelA-Gens vorhanden sind.
Bei Verwendung des HindIII-Inserts pGW830 (Fig. 3b) als Sonde zeigt Analyse des Southern- Blot des transformierten Stammes A15, daß Integration von pelA-Sequenzen am pelB-Lokus nicht aufgetreten ist. Ebenso gibt die Analyse des transformierten pelB-Stammes B13, des pelC-Stammes C16 und des pelD-Stammes D12 mit den entsprechenden geeigneten Sonden Kopienzahlen von ungefähr 15, 50 und 10.

Beispiel 5.4: Northern Blot-Analyse von induziertem und nicht-induziertem Myzel des pelA- transformierten A. niger-Stammes A15 und von A. niger N400.

Minimalmedium (250 ml), das 50 mM Glucose oder 1 % (w/v) Apfelpektin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, Bischofszell) enthält, wird bei einer Sporendichte von 10&sup6; Sporen/ml mit Sporen von Transformanten A15 oder Sporen des Wildtyp-Stammes N400 inokuliert, nach 30 h Wachstum bei 30ºC geerntet. Proben des Kulturmediums (2 ml) werden ebenfalls gesammelt, gegen 2 l 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 bei 4ºC dialysiert und bei -20ºC gelagert.
Nucleinsäuren werden aus dem Myzel wie im Beispiel 5.2 beschrieben isoliert. Die RNA wird aus der wäßrigen Phase nach Chloroform-Extraktion durch Zugabe von 1/3 Volumen 8 M LiCl ausgefällt. Die Lösung wird gründlich gemischt und über Nacht bei 0ºC inkubiert. Die RNA wird durch Zentrifugieren (300 UpM, 30 min) unter Verwendung einer MSE Super-Minor-Zentrifuge abgetrennt, dann einmal mit kaltem (-20ºC) 2 M LiCl und einmal mit kaltem (-20ºC) 96%igem Ethanol gewaschen. Schließlich wird die RNA in destilliertem Wasser bei einer Konzentration von etwa 1 mg/ml gelöst. Die Zubereitungen sind im wesentlichen frei von DNA, mit einer Ausbeute von 1-2 mg RNA pro g Myzel. Mengen von ungefähr 10 ug RNA läßt man auf denaturierendem Formaldehyd 1%-Agarosegelen nach Maniatis u.a. (S. 202-203; Lit.-St. 5) unter Verwendung von HindlII-verdauter Lambda-DNA oder RNA-"ladder" von BRL als Molekulargewichtsmarker laufen. Die Gele werden geblottet und auf Nytran (Schleicher und Schuelt) gebacken, wie das vom Hersteller empfohlen wird, und 16 h bei 68ºC mit der 7,4 kbp EcoRI-pelA-DNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung und Waschung erfolgt wie für die DNA-Hybridisierung unter homologen Bedingungen beschrieben nach Beispiel 3.2.
Beide A. niger-Stämme produzieren Pektin-induzierbare mRNA mit einer Länge von ungefähr 1,6 kbp. Scanning der optischen Dichten der beiden Autoradiogramme zeigt eine 15-20fache Differenz in der Intensität zwischen dem A15-Transformanten und dem Wildtypstamm, was mit dem Anstieg der Kopienzahl korreliert, der aus der Southern-Blot-Analyse berechnet wurde.

Beispiel 5.5: Pektinlyaseproduktion durch den transformierten A. niger-Stamm D12.

Der A. niger-pelD-Transformant D12, der nach Beispiel 5.2 erhalten wird, wird in einer 2-Schritt-Kultivierungsmethode gezüchtet, die ähnlich der von Hermersdörfer u.a. (27) für die Produktion von Polygalacturonase beschriebenen Vorgangsweise ist. Auf einer Flüssigkultur wird eine Myzelschicht durch Modulieren von 10&sup6; Sporen pro ml von Präkultivierungsmedium (Pre Cultivation Medium, PCM), das aus Zuckerrübenpulpe (4%) und NH&sub4;NO&sub3; (1%) pH 4,5 besteht, gebildet. Nach 5 Tagen Wachstumsperiode bei 30ºC wird das in 30 ml Medium gezüchtete Myzel mit Kochsalzlösung gewaschen und in 50 ml Hauptkultivierungsmedium (Main Cultivation Medium, MCM) transferiert. Diese Kultur läßt man bei 30ºC in einem Orbitalschüttler bei 100 UpM wachsen.
Die Zusammensetzung von MCM ist pro Liter Medium: Glucose (5%), Pektin (d.e. 72,8%; 0,1%), NH&sub4;NO&sub3; (0,75%), KH&sub2;PO&sub4; (0,5%), FeSO&sub4;.7H&sub2;O (0,03%), MgSO&sub4;.7H&sub2;O (0,03%), CaCO&sub3; (0,03%), NaNO&sub3; (0,03%) pH 4,5. Während 24 h wurden in verschiedenen Zeitintervallen Proben genommen und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Expression von pelD ist schon innerhalb von 7 h Kultivierung maximal. Das Protein migriert identisch mit PLI, das als Referenz verwendet wird.

Beispiel 5.6: Pektinlyase A-Produktion durch den transformierten A. niger-Stamm A15 und durch A. niger N400.

Die dialysierten Kulturfiltrate (Beispiel 5.4) werden lyophilisiert, in 0,2 ml destilliertem Wasser resuspendiert und unter Anwendung von Standardmethoden (Laemmli, Lit.-St. 15) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10%ige Gele) unterworfen. Die getrennten Proteine werden auf Nitrocellulose transferiert (Towbin u.a., Lit.-St. 16). Blots werden 5 h bei Raumtemperatur mit 1%iger BSA-Lösung in 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 mit 0,35 mM NaCl gesättigt. Dem folgt 16 h Inkubation bei Raumtemperatur mit polyklonalen Antikörpern (0,1%), hervorgebracht gegen zwei Pektinlyasen, die nach van Houdenhoven (1975) in 50 ml des gleichen Puffers, der 150 mM NaCl, 0,5% BSAm 1% Triton X100, 0,5% Desoxycholat und 0,1% SDS enthält, gereinigt wurden. Blots werden dann 5 Mal mit 200 ml PBS gespült, ehe man mit 30 µl Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Sigma) als 2. Antikörper pro 50 ml inkubiert und wieder 5 Mal mit PBS wäscht. Die Blots werden schließlich unter Verwendung von 4-Chlor-1-naphthol als Substrat gefärbt. 40 mg Substrat werden in 0,5 ml 96%igem Ethanol gelöst und mit 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 30 µl 30%igem Wasserstoffperoxid gemischt und dann den Blots zugesetzt.

Beispiel 5.7: Screening von pelA-transformierten Stämmen durch Halo-Bildung auf Pektin enthaltenden festen Medien.

Konidien von pelA-transformierten Stämmen werden bei einer Sporendichte von ungefähr 40 Kolonien pro Petrischale auf sterile Papierfilter geimpft (Schleicher und Schuell), die auf 1% Agar-verfestigtes Minimalmedium gebracht werden, das 0,01% Triton-X100 und Apfelpektin (1%, d.e. 72,8%, Obipektin) als Kohlenstoffquelle enthält. Die Inkubationsdauer beträgt 72 h bei 30ºC, was zu individuellen Kolonien (2-4 mm) führt. Das Papierfilter wird in eine andere sterile Petrischale transferiert, und die Medium enthaltende Schale wird mit mindestens 5 ml Rutheniumrot-Lösung (0,1 % w/v) in destilliertem Wasser angefärbt, 2 h inkubiert und dann mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um nicht-adsorbierten Farbstoff zu entfernen, wobei man im wesentlichen die von Ried und Collmer (Lit.-St. 17) beschriebene Vorgangsweise für Polygalacturonat zur Charakterisierung von bakteriellen Pektatlyase- Enzymaktivitäten einhält.
PLA Protein überproduzierende Transformanten werden durch einen Anstieg des Halo-Durchmessers um die individuellen Kolonien im Vergleich zum Elternstamm N400 nachgewiesen.

Beispiel 6: Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase A (PLA) aus dem A. niger pelA-Transformanten A15.

Beispiel 6.1: Kulturbedingungen zur Herstellung von Pektinlyase A.

Der in Beispiel 5 beschriebene A. niger pelA-Transformant A15 wird auf Komplettmedium in Petrischalen 3 Tage bei 28ºC gezüchtet, um Konidien zu produzieren. Die Konidien werden von diesen Platten geerntet, indem man die Sporen in 5 ml steriler Kochsalzlösung suspendiert, die 0,005% Tween 80 enthält. Die Suspension wird auf einem Griffin-Schüttler 20 min stark bewegt. Minimalmedium (Lit.-St. 21), das 1 % (w/v) Apfelpektin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%; Obipektin AG, Bischofszelt) enthält, wird bei einer Sporendichte von 10&sup6; Sporen/ml unter Verwendung von 250 ml Medium in 1 l siliconisierten Erlenmeyerkolben inokuliert. Das Myzel wird 40 h bei 30ºC unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbitatschüttlers bei 200 UpM gezüchtet. Nach Kultivierung wird das Myzel durch Filtration über Miracloth unter Verwendung eines Büchnertrichters entfernt. Das Kulturfiltrat (Lit.-St. 21) wird mit destilliertem Wasser verdünnt (Lit.-St. 21), der pH-Wert des Filtrats (3,7) unter Verwendung von 1 N NaOH auf 6,0 gebracht und dann wieder unter Verwendung eines Whatman 1-Filterpapiers filtriert.

Beispiel 6.2: Reinigung von PLA.

Das verdünnte Kulturfiltrat (4 l) bringt man auf eine DEAE- Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia) (10 cm × 2,6 cm), prä-äquilibriert mit 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Extinktion bei 280 nm einen Wert von < 0,1 O.D. erreicht. Pektinlyase-Aktivität wird dann durch Anwendung eines linearen Gradienten aus 20 mM Natriumphosphatpuffer (150 ml) und 20 mM Natriumphosphatpuffer, der 1 M NaCl enthält, (150 ml) aus der Säule eluiert.
Fraktionen werden auf die Gegenwart von aktiver Pektinlyase nach der von van Houdenhoven (Lit.-St. 18, S. 11) beschriebenen Methode geprüft, wobei Brown Ribbon-Pektin (d.e. 72,8%) als Substrat verwendet wird. Die Aktivität erscheint etwa bei einer Konzentration von 0,43 M NaCl im Salzgradienten. Aktive Fraktionen werden dann gepoolt und zweimal gegen 1 l 20 mM Piperazin-HCl-Puffer pH 5,5 (Probengröße: 45,5 ml) dialysiert.
Im nächsten Schritt wird die dialysierte Probe in 3 Teile gleicher Größe geteilt, die in drei separaten Durchgängen unter Verwendung einer Standard Pharmacia MONO Q-Säule in Kombination mit dem Pharmacia FPLC-System einerAnionenaustausch-Chromatographie unterworfen werden.
Die Säule wird mit 20 mM Piperazin-HCl-Puffer pH 5,5 prä-äquilibriert. Nach der Beladung mit der Enzymprobe wird die Säule mit dem gleichen Puffer bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert, bis wieder die Extinktion der Basislinie erreicht ist. Dann wird ein linearer Salzgradient angewendet. Innerhalb von 22 ml des auf die Säule aufgebrachten Elutionspuffers wird eine Endkonzentration von 0,6 M NaCl erreicht.
Die aktiven Fraktionen (4,4 ml) werden gesammelt. auf 25 ml unter Verwendung von Äquilibrierungspuffer verdünnt, und die gleiche chromatographische Verfahrensweise wird wiederholt.
Dann werden zwei das aktive Enzym (Gesamtvolumen 3 ml) enthaltende Fraktionen gegen einen 25 mM Piperazin-Puffer pH 5,0 dialysiert und in 1 ml-Portionen auf eine MONO P-Säule (Pharmacia) gebracht, die mit dem gleichen Puffer prä-äquilibriert wurde. Nach den Injektionen wird ein pH-Gradient unter Verwendung einer 5%igen Lösung von Polypuffer TM74 (in destilliertem Wasser, das mit 4 N HCl auf pH 3,0 gesetzt wurde) gebildet. Das aktive Enzym (3,2 ml) erscheint um pH 3,2 herum. Die Zubereitung wird ausgedehnt gegen 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,0 dialysiert und bei -20ºC gelagert. Die Ergebnisse der Reinigung werden in der Tabelle VIIa zusammengefaßt und mit den Daten einer ähnlichen Reinigung für Pektinlyase, die vom A. niger- Stamm N400 (Tabelle VIIb) produziert wird, verglichen. Tabelle VIIa und VIIb: Reinigungsschema von Pektinlyase A aus dem A. niger pelA-N593-Transformanten und Pektinlyase aus dem A. niger-Stamm N400. Schritt Volumen ml Gesamtaktivität (I.U.) Spezifische Pektinlyase-Aktivität (I.U./mg Protein) DEAE Sepharose MONO O Chromatographie (2x) MONO P Chromatographie Wildtyp
Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Reagens (Pierce) nach der Anleitung des Herstellers bestimmt.
Im Vergleich zur Wildtyp-Gesamtaktivität ist die Gesamtaktivität des A. niger N592, der mit pGW820 transformiert wurde, nach Reinigung etwa 10mal höher, die spezifische Aktivität etwa 3mal.

Beispiel 6.3: Bestimmung der Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von Pektinlyase A.

500 µg Pektinlyase (PLA), die nach Beispiel 6.2 gereinigt wurde, werden dreimal gegen 1 l Millipore-gefiltertes destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Aminosäuresequenzen werden mit einem Applied Biosystems Modell 470A Proteinsequenator, der on-line mit einem 120 A PTH Analysator verbunden ist, nach der von Hunkapiller (Lit.-St. 17) beschriebenen Methode bestimmt.
Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz wird für das Enzym bestimmt:
Die so bestimmte Aminosäuresequenz entspricht genau derjenigen, die auf der Nucleotidsequenz des pelA-Gens basiert (siehe Beispiel 4.2).
Beispiel 6.4: Eigenschaften von Pektinlyase A. Der A. niger-Stamm N400 und der pelA-Transformant A15 werden wie im Beispiel 6.1 beschrieben kultiviert, und das Enzym wird aus dem Kulturfiltrat nach der Vorgangsweise von Beispiel 6.2 gereinigt. Die so erhaltenen beiden Enzymzubereitungen wurden mit Pektinlyase II, die nach van Houdenhoven (Lit.-St. 18) gereinigt wurde, verglichen.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 10%-Gelen führt zu einer einzelnen Bande identischen Molekulargewichts in allen drei Fällen, wobei in jedem Fall 1-5 ug Protein aufgebracht werden. Isoelektrische Fokussierung wurde unter Anwendung von Standardmethoden (siehe z.B. Gebrauchsanweisung von Pharmacia, Isoelectric focussing, 1982) durchgeführt. Es wurden ein FSBE-3000 Apparat und die entsprechende Spannungsversorgung ECPS 3000/150 (Pharmacia) verwendet. Das erhaltene PLA ist bei isoelektrischer Fokussierung homogen und hat einen niedrigeren isoelektrischen Punkt (0,2 pH-Einheiten) als PLII, der nach van Houdenhoven (Lit.-St. 18) 3,75 ist. Das aus dem N400-Kulturfiltrat gereinigte PLII ist bei isoelektrischer Fokussierung heterogen.
Die Hauptbande entspricht in der Position dem PLA-Protein. Zwei kleinere Banden sind leicht gegen die Kathode verschoben. In dem A. niger-Multicopy-Transformanten A15 fehlen also die geringeren Enzymformen, die man in N400 sieht.
Ein direkter Vergleich der kinetischen Parameter von PLA und PLII, die im letzteren Fall von van Houdenhoven (Lit.-St. 18) festgelegt wurden, wobei 95% verestertes Apfelpektin als Substrat verwendet wurde, zeigt für beide Enzyme identische Km- und Vmax-Werte.

Beispiel 7: Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase D (PLD) aus dem A. niger pelD-Transformantgen D12.

Beispiel 7.1: Kulturbedingungen zur Herstellung von Pektinlyase D.

Der A. niger pelD-Transformant D12, der nach Beispiel 5.2 erhalten wird, wird anfangs nach Beispiel 5.5 gezüchtet, in 300-ml-Aliquoten. Nach einer Wachstumsperiode von 5 Tagen in PCM bei 30ºC wird die Myzelmatte in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M Natriumchlorid enthält, transferiert. Durch Schütteln des Myzels in 150 ml auf einem Orbitalschüttler bei 200 UpM, 2 h lang, wird das meiste der Pektinlyase in das Medium freigesetzt.

Beispiel 7.2: Reinigung von PLD.

Nach der Entfernung des Myzels durch Filtration wird die Enzymlösung auf eine DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule (25 cm × 1,25 cm) (Pharmacia) aufgebracht, die mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,2 M Natriumchlorid enthielt, prä-äquilibriert wurde. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Extinktion bei 280 nm einen Wert (0,1 erreicht. Pektinlyase-Aktivität wird aus der Säule durch Anwendung eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (0,2 bis 0,7 M) in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) (800 ml Gesamtvolumen) eluiert. Die Fraktionen werden auf die Anwesenheit von Pektinlyase D durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotting (Towbin u.a., Lit.-St. 16) wie im Beispiel 5.6 beschrieben durchgemustert. Pektinlyase D enthaltende Fraktionen werden gepoolt und gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,15 M Natriumchlorid enthält, dialysiert und unter Verwendung einer Standard-MONO Q-Säule von Pharmacia in Kombination mit dem FPLC- System einer Anionenaustausch-Chromatographie unterworfen. Nach der Beladung wird die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, ehe man einen 50 ml linearen Natriumchlorid-Gradienten in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) anwendet. Aktive Fraktionen werden gesammelt und Aliquote von 1 ml auf eine 100 ml Superose-12-Gelpermeationssäulge aufgebracht, die mit 20 mM Natriumphosphat (pH 6,0), das 0,2 M Natriumchlorid enthält, äquilibriert wurde und mit dem FPLC-System verbunden ist. Aktive Enzymfraktionen (jeweils 1 ml), die aus der GPC-Säule erhalten werden, werden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, um die Reinheit der erhaltenen Pektinlyase zu prüfen. Tabelle VIII: Reinigungsschema von Pektinlyase D aus A. niger pelD-Transformant D12. Schritt Volumen (ml) Aktivität (I.U.) Spezifische Pektinlyase-Aktivität (I.U./mg Protein) Kulturfiltrat DEAE-Sepharose FF MONO Q und GPC

Beispiel 7.3: Bestimmung der Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von Pektinlyase D.

500 µg Pektinlyase D, nach Beispiel 6.2 gereinigt, werden dreimal gegen 1 l Millipore-gefiltertes destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Aminosäuresequenzen werden mit einem Applied Biosystems Modell 470A-Proteinsequenator, der on-line mit einem 120A PTH-Analysator verbunden ist, nach der von Hunkapiller (Lit.-St. 19) beschriebenen Methode bestimmt.
Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz wird für das Enzym bestimmt:
Die bestimmte Aminosäuresequenz entspricht genau derjenigen, die auf der Nucleotidsequenz des pelD-Gens basiert.

Beispiel 8: Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase B (PLB) aus dem A. niger-Transformanten B13.

Beispiel 8.1: Kulturbedingungen für die Herstellung von Pektinlyase B.

Der A.niger-Transformant B13, der nach Beispiel 5.2 erhalten wurde, wird gemäß Beispiel 5.3 auf seinen Multicopy- Charakter untersucht. Northern-Blot-Analyse nach der im Beispiel 5.4 beschriebenen Vorgangsweise zeigt, daß eine Pektin-induzierbare mRNA mit einer Länge von ungefähr 1,6 kb produziert wird. 35 h Wachstum bei 30ºC in 1 % (w/v) Zitrusfrucht-Pektin (d.e. 72,8%) und 1% Weizenkleie enthaltendem Minimalmedium wird angewendet, um das Enzym wie in Beispiel 5.4 beschrieben zu produzieren. Das Enzym wird auch unter Verwendung eines aus 4% (w/v) Zuckerrübenpulpe und 1% NH&sub4;HO&sub3; bestehenden Mediums produziert.

Beispiel 8.2: Reinigung von PLB.

Das Kulturfiltrat wird zweifach mit destilliertem Wasser verdünnt und der pH-Wert mit 1 N NaOH auf pH 6,0 gebracht, dann erneut unter Verwendung von Whatman 1-Filterpapier filtriert. Das verdünnte Filtrat (2 l) wird dann auf eine DEAD-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia) (9 cm × 3,2 cm) aufgebracht, die mit 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 prä-äquilibriert ist. Ein Teil der Pektinlyase-Aktivität liegt im Eluat vor, wie man nach der von van Houdenhoven (Lit.-St. 18, S. 11) beschriebenen Methode unter Verwendung von Brown Ribbon Pektin (d.e. 72,8%) oder hoch verestertem Pektin (d.e. 94%) prüfen kann. Die Hauptmenge der Pektinlyase-Aktivität kann durch Anwendung eines Salzgradienten eluiert werden. Diese Aktivität erscheint im Salzgradienten und ist mit PLA auf der Basis des Elutionsverhaltens und des scheinbaren Molekulargewichts auf SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie im Beispiel 6 beschrieben identisch.
Das Eluat aus der DEAE Fast Flow-Säule wird gegen destillientes Wasser dialysiert und auf eine MONO S-Säule (Pharmacia) aufgebracht, die zuvor mit einem 20 mM Natriumacetatpuffer pH 4,5 äguilibriert wurde. Das Enzym wird aus der Säule durch Anwendung eines 0-1,0 M Natriumchlorid-Salzgradienten im gleichen Puffer eluiert. Das Enzym wird fast sofort aus der Säule eluiert. Aktive Fraktionen werden gepoolt und dann ungefähr vierfach mit destilliertem Wasser verdünnt. Erneute Chromatographie der Enzymlösung führt zu Fraktionen, die auf der Basis von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese das reine PLB-Protein enthalten.

Beispiel 8.3: Eigenschaften von Pektinlyase B.

Die Eigenschaften des nach Beispiel 8.2 aus dem pelB-Transformanten B13 gereinigien Enzyms werden bestimmt und mit Pektinlyase A und D verglichen.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 10%-Gelen führt zu einer einzelnen Bande mit einer scheinbaren Molekülmasse von 39,7 kDa. Unter den gleichen Bedingungen sind die scheinbaren Molekülmassen von PLA und PLD 49,1 kDa bzw. 52,3 kDa.
Isoelektrische Fokussierung wird wie im Beispiel 6.4 beschrieben durchgeführt. Der isoelektrische Punkt von PLB ist 6,0, wobei ein pH-Gradient von pH 3 bis 7 verwendet wird. Die Probe wird ungefähr an den einem pl von 5,0 entsprechenden Punkt aufgebracht.
Das gereinigte Enzym ist auch mit polyklonafen Antikörpern reaktiv, die gegen PLI und PLII zubereitet wurden, wie durch Western-Blot-Analyse geprüft wird. PLD, A und B können auf diese Art leicht nach ihren scheinbaren Molekülmassewerten unterschieden werden.

Beispiel 8.4: Kinetische Eigenschaften von PLB.

Das nach Beispiel 8.2 gereinigte Enzym wird kinetisch charakterisiert. Das Enzym katalysiert eine Pektinlyasereaktion und ist über einen weiten pH-Bereich (pH 5-9,5) aktiv, wie in McIlvaine-Puffer (µ=0,5) mit verschiedenen pH-Werten (van Houdenhoven, Lit.-St. 18) geprüft wird. Das pH-Optimum ist breit (pH 7,5-8,5). Bei pH 6,0 beträgt die Aktivität ungefähr 55%; bei pH 9,5 sind das noch 85% der Aktivität bei pH 8,0. Sowohl hoch verestertes Pektin (d.e. 94%) als auch Pektine mit niedrigerem Veresterungsgrad wie Brown Ribbon Apfelpektin (d.e. 72,8%; Obipektin AG, Bischofszell) können als Substrat verwendet werden. Die höchste Aktivität wird jedoch mit hoch verestertem Pektin erhalten. Das Enzym reagiert nicht mit Polygalacturonat.
Die durch PLB katalysierte Pektinlyasereaktion kann durch Zusetzen von EDTA zum Reaktionsgemisch (3 mM Endkonzentration wird verwendet) gehemmt werden; das Enzym wird durch Zugabe eines Überschusses an Ca²&spplus;-Ionen reaktiviert. pelB codiert also für Ca²&spplus;-abhängige Pektinlyase. Bei 25ºC hat das Enzym eine ungefähre Wechselzahl von 6500 und einen Km-Wert von 2,5 mM, wenn hoch verestertes Pektin als Substrat verwendet wird. Diese Werte werden nach der Vorgangsweise von van Houdenhoven (Lit.-St. 18) unter Verwendung eines McIlvaine-Puffers mit pH 8,0 (µ=0,5) bestimmt.

Beispiel 9: Expression und Sekretion von Fremdgenen unter der Kontrolle des pelA-Promotors.

Das 3,9 kb HindIII-Fragment von Plasmid pGW820 wird in den HindIII-Ort von pBR322 subkloniert. Die Plasmid-DNA von Ampicillin-resistenten Transformanten wird durch HindIII- und Sall-Restriktionsverdaue analysiert. Ein Klon, der das pelA-Insert in Orientierung im Uhrzeigersinn enthält, wird als pGW822 bezeichnet. Der induzierbare Promotor von pelA wird verwendet, um Fremdgene in A. niger zu exprimieren. Das vollständige pelA-Gen ist auf Plasmid pGW822 vorhanden. Der Promotor und die pelA-Signatsequenz sind auf einem 1 kb BamHt- PstI-Fragment. Die PstI-Spaltstelle an der Nucleotid-Position 1420 (Fig. 10) koinzidiert mit dem 3'-Ende der Signalsequenz und kann für die Fusion im Leserahmen zur codierenden Sequenz eines Fremdproteins verwendet werden. Die Transkriptionsterminationssignale von pelA sind auf einem 1,3 kb Sall-HindIII-Fragment.

Beispiel 9.1: Subklonierung des pelA-Gens in den Vektor pUC19.

Das 3,3 kb BamHI-HindIII-Fragment von Plasmid pGW822 enthält das pelA-Gen. Das Fragment wird in den Vektor pUC19 (Pharmacia), der mit BamHI und HindIII geschnitten wird, kloniert. Die gereinigten Fragmente werden ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird zum Transformieren mit Ca²&spplus; behandelter kompetenter JM109-Zellen verwendet. Erfolgreiche Klonierung des 3,3 kb BamHI-HindIII-Fragments in pUC19 wird auf Ampicillin-Platten in Gegenwart von X-Gal und IPTG (T. Maniatis u.a. in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 52) selektiert. Weiße, Ampicillin-resistente Transformanten werden herausgenommen. Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamHI/HindIII-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit einem korrekten Insert wird als pUC19/pelA bezeichnet. Die analoge Konstruktion mit pUC18 führt zu pUC1 8/pelA.

Beispiel 9.2; Expression von Human-Hybridinterferon BDBB unter der Kontrolle des pelA-Promotors.

9.2.1: Konstruktion des Plasmids pUC19/pelA-IFN AM119 (siehe Fig. 14).

Das Plasmid pUC19/pelA wird mit Sall verdaut. Die klebrigen Enden des Fragments werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) in Gegenwart von jeweils 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 60 mM Tris.HCl pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 30 min bei Raumtemperatur, gefüllt. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 mM gestoppt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt. Das lineare DNA-Fragment wird mit PstI verdaut. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion wird die DNA mit Ethanol gefällt.
Ein Oligodesoxynucleotid-Linker der Formel
wird an die PstI-Stelle des linearisierten Plasmids ligiert. Der Linker füllt das 3'-zurückgesetzte Ende der PstI-Stelle, die mit dem Ende der pelA-Signalsequenz koinzidiert und die Fusion im Leserahmen mit der codierenden Sequenz von Interferon BDBB festlegt. (I) stellt die 5'-terminale Nucleotidsequenz des Interferon BDBB-Gens bis zum Ddel-Restriktionsort dar.
Jeweils 200 pmol der Oligonucleotide (I) und (II) werden phosphoryliert und hybridisiert.
Das PStI-geschnittene pUC19/pelA-Plasmid und ein 100facher molarer Überschuß doppelsträngiger Linker-DNA werden in 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP, 5 mM DTT und 400 Einheiten T4-DNA-Ligase 16 h bei 15ºC ligiert. Die DNA-Ligase wird durch 10 min bei 85ºC inaktiviert. Die überschüssigen Linker werden durch Ausfällen in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat pH 6,0 und 0,54 Vol. Isopropanol entfernt.
Das große 5 kb-Fragment wird auf einem präparativen 0.6%-Agarosegel isoliert. Das Fragment umfaßt die pelA-Promotor- und -Signalsequenz (BamHI-[PstI]/Linker) und den pelA-Terminator ([Sall]stumpf-HindIII) im Vektor pUC19.
Das Plasmid pJDB207/PHO5-IFN AMI 19 (EP 205404) enthält das Gen für Hybrid-α-Interferon BDBB unter der Kontrolle des regulierten Promotors der sauren Hefe-Phosphatase (PHO5). Die Plasmid-DNA wird mit BamHI und HindIII verdaut, das 1,3 kb BamHI-HindIII-Fragment wird isoliert, das den PHO5-Promotor, die codierende Sequenz von IFN BDBB und die PHO5-Transkriptionsterminationssequenzen enthält. Das Fragment wird durch DE52-Chromatographie und Ethanol-Fällung gereinigt und weiter mit Taql verdaut. Die klebrigen Enden der Taql-Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) in Gegenwart von jeweils 0,1 mM dCTP und dGTP, 60 mM Tris.HCl pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 30 min bei Raumtemperatur, gefüllt. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 mM gestoppt. Die DNA-Fragmente werden Ethanol-gefällt und weiter mit Ddel verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem präparativen 0,8%-Agarosegel getrennt. Das 549 bp Ddel-[Taql]stumpf-Fragment wird aus dem Gel elektroeluiert, durch DE52-Ionenaustausch-Chromatographie und Ethanol-Fällung gereinigt. Das DNA-Fragment wird in H&sub2;O bei in einer Konzentration von etwa 0,1 pmol/µl suspendiert.
0,2 pmol des 549 bp Ddel-[Taql]stumpf-Fragments und 0,1 pmol des 5 kb-Vektorfragments werden in 10 µl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT und 200 Einheiten T4-DNA-Ligase (Biolabs) 16 h bei 15ºC ligiert. Ein 1-µl-Aliquot des Ligationsgemischs wird zum Transformieren mit Ca²&spplus; behandelter kompetenter HB101-Zellen verwendet.
Plasmid-DNA wird aus 12 Ampicillin-resistenten transformierten Kolonien präpariert und durch Verdauung mit EcoRI, Pvull, Clal und EcoRI/HindIII analysiert. Ein Klon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird selektiert. Die korrekte Fusion im Leserahmen von pelA-Signalsequenz und der reifen codierenden Sequenz von Interferon BDBB wird durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Plasmid-DNA des selektierten Klons wird puCl9/petA-IFN AM119 genannt. Eine analoge Konstruktion mit pUC18/pelA führt zum Plasmid pUC18/pelA-IFN AM119.

Beispiel 9.2.2: Cotransformation der Aspergillus niger-Mutante An8 mit pCG59D7 und pUC19/pelA-IFN AM119.

Die Uridin-auxotrophe Mutante An8 ( DSM 3917, in EP 88 101 397.3 geoffenbart) wird mit dem Plasmid pCG59D7 transformiert, um Uridin-Prototrophe zu erhalten. Zusammen mit dem transformierenden Plasmid wird das nicht-selektive Plasmid pUC19/petA-IFN AM119 zugesetzt, um statistische Cointegranten bei Cotransformation zu ergeben.
Konidiosporen von A. niger An8 werden 4 Tage bei 28ºC in Komplettmedium gezüchtet, bis sie vollständig sporuliert sind. 2.10&sup8; Konidiosporen werden verwendet, um 200 ml mit 1 g/l Arginin und Uridin ergänztes Minimalmedium anzuimpfen.
Nach 20 h Wachstum bei 28ºC und 180 UpM wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen und in 20 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2;, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) erneut suspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30ºC, 50 UpM) inkubiert, bis maximale Protoplastenfreisetzung mikroskopisch nachgewiesen werden kann (90-120 min). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um Myzel-Zelltrümmer zu entfernen. Die Protoplasten werden durch mildes Zentrifugieren (10 min, 2000 UpM) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200-500µl 0.8M KCl, 50 mM CaCl&sub2; suspendiert, um eine Konzentration von 1×10&sup8;/ml zu ergeben.
Für die Transformation wird eine 200-µl-Aliquote der Protoplastendispersion mit 5 µg pCG59D7 und 10µg pUC/pelA-IFN AM119 DNA, 50µl PCT (10 mM Tris.HCl pH 7,5.50 mM CaCl&sub2;, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird 20 min auf Eis gehalten, weitere 2 ml PCT werden zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl&sub2; werden zugesetzt, und 1-ml-Aliquote der Endtransformationslösung werden mit lignifiziertem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)), stabilisiert mit 0,8 M KCl, gemischt. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten des gleichen Mediums gegossen und bei 28ºC inkubiert.
Nach 2-3 Tagen Wachstum bei 28ºC scheinen stabile Transformanten als heftig wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untergrund von vielen hundert kleinen, vermutlich abortiven Transformanten auf.

Beispiel 9.2.3: Expression des Hybrid-Interferon BDBB-Gens unter der Kontrolle des pelA-Promotors.

37 Transformanten des Cotransformationsexperiments (Beispiel 9.2.2) werden herausgenommen und auf die Interferon-Expression analysiert. Die Interferonaktivität wird nach der Vorgangsweise von Armstrong (J.A. Armstrong, Appl. Microbiol 21 732 (1971)) unter Verwendung von Human-CCL-23-Zellen und vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) als Provokationsvirus bestimmt.
Konidiosporen von Transformanten werden individuell in 50 ml Vorkulturmedium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Frankreich) 3 g/1, NH&sub4;Cl 2 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg&sub2;SO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l, Ca&sub2;SO&sub4;.2H&sub2;O 0,5 g/l, pH 7,0) vorkultiviert. Die Vorkultur wird 72 h bei 250 UpM und 28ºC inkubiert. 10% der Vorkultur werden verwendet, um 50 ml Hauptkulturmedium (Sojamehl 20 g/l, Pectin Slow Set 5 g/l) anzuimpfen. Man läßt die Kultur 72-96 h bei 250 UpM und 28ºC wachsen. Zu verschiedenen Zeiten (alle 20 h) werden Proben genommen, die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und durch Uttraschallaufschluß aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden wie oben beschrieben auf Interferonaktivität geprüft. Die Hauptmenge der Interferonaktivität findet sich ins Medium sezerniert.

Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119.

Die 2,8 kb Expressionskassette des Plasmids M13(+)KS/pelAass-IFN AM119 umfaßt den induzierbaren pelA-Promotor, die codierende Sequenz des Hybrid-Interferons BDBB und den pelA-Transkriptionsterminator auf dem Bluescript M13(+)KS-Vektor. Das Hybrid-Interferon BDBB wird exprimiert und in der Wirtszelle lokalisiert. Das Plasmid M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119 ist abgeleitet von pUC18/pelA-IFN AM119 (siehe Beispiel 9.2.1). Die pelA-Signalsequenz (ss) wird durch ortsgerichtete Mutagenese über Loop-Bildung herausgenommen (siehe Fig. 15). Man erwartet, daß das aus dem Konstrukt ohne Signalsequenz exprimierte Hybrid-Interferon im Zytosol lokalisiert ist.

Beispiel 10.1: Subklonierung der pelA-lFN AM119-Kassette in den Bluescript M13(+)KS-Vektor.

Das Plasmid pUC18/pelA-lFN AM119 (siehe Beispiel 9.2.1) wird mit BamHI und HindIII verdaut. Das 2,8 kb BamHI-Hindltl-Fragment enthält den pelA-Promotor, Signalsequenz, die IFN BDBB codierende Sequenz und den pelA Terminator. Das BamHI-HindIII-Fragment wird isoliert und in den Bluescript M13(+)KS (Stratagene)-Vektor, geschnitten mit BamHI und HindIII, ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird verwendet, um mit Ca²&spplus; behandelte kompetente JM109-Zellen zu transformieren. Erfolgreiche Klonierung des 2,8 kb BamHI-HindIII-Fragments in M13(+)KS wird auf Ampicillin-Platten in Gegenwart von X-Gal und IPTG selektiert. 12 weiße, Ampicillinresistente Kolonien werden herausgenommen. Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamHI/BgIII-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit dem korrekten Insert wird als M13(+)KS/pelA-IFN AM 119 bezeichnet.

Beispiel 10.2: Gewinnung einzelsträngiger DNA aus das Bluescript M13(+)KS-Plasmid enthaltenden Zellen.

Das Plasmid M13(+)KS/pelA-IFN AM119 wird verwendet, um den kompetenten E. coli- Stamm CJ236 (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ105(Cmr); BIO-RAD Muta-Gene M1 3 in vitro Mutagenese-Kit) zu transformieren. Dieser Stamm erlaubt das Einbringen von Uracil in DNA. Man züchtet CJ236 in 10 ml LB-Medium, das 100 mg/I Ampicillin enthätt. Bei einem OD600 von 0,5 werden die Zellen mit dem Phagen M13K07 (Mead u.a., Lit.-St. 29) bei einer Infektionsmuttiptizität von 50 superinfiziert. Nach einer Stunde bei 37ºC wird Kanamycin (50 mg/l) zugesetzt, und die Kultur wird 5 bis 6 Stunden bei 37ºC auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Der nicht-codierende Strang in bezug auf das pelA-IFN AM119-Insert des Plasmids M13(+)KS/pelA-IFN AM119 wird synthetisiert, verpackt und in das Medium freigesetzt. Einzelsträngige DNA wird aus dem Kulturüberstand nach Kunkel u.a. (Lit.-St. 30) präpariert.

Beispiel 10.3: Ortsgerichtete Oligonucleotid-Mutagenese auf der einzelsträngigen DNA-Matrize.

Ortsgerichtete Deletionsmutagenese wird auf der nicht-codierenden einzelsträngigen pelA-IFN AM119-Matrize durchgeführt, um die pelA-Signalsequenz durch Loop-Bildung herauszunehmen (Fig. 15).
Der mutagene Primer umfaßt einen Teil der pelA-Promotorsequenz einschließlich ATG (Nucleotidposition 1343 bis 1363 in Fig. 10) und 21 Nucleotide, die für die Aminosäuren 1 bis 7 von reifem IFN BDBB codieren.
Für die Mutagenese werden 200 pmol des mutagenen Primers in 20 µl 50 mM Tris.HCl pH 7,5,10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 0,5 mM ATP unter Verwendung von 8 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Boehringer) phosphoryliert. Nach 1 h bei 37ºC wird die Reaktion durch 10 min Erhitzen auf 65ºC gestoppt.
0,2 pmol einzelsträngige Matrize werden mit 10 pmol phosphoryliertem mutagenem Oligodesoxyribonucleotid-Primer und 10 pmol Universal-M13-Sequenzierprimer in 30 µl 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT bei 80ºC 5 min inkubiert. Man läßt die Lösung langsam über eine Dauer von 30 min auf Raumtemperatur abkühlen. Zu dem hybridisierten Gemisch werden 10 µl Enzym-dNTP-Lösung (dATP, dGTP, dCTP, dTrP), die 1 µl Puffer [0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl&sub2;], 5µl 2 mM dNTP-Gemisch, 0,5 µl 20 mM ATP, 1 µl 0,2 M DTT, 0,5 µl T4-DNA-Ligase (Bio-Iabs, 400 U/µl) und 1,2 µl Klenow-DNA-Polymerase (BRL, 5 U/µl) enthält, zugesetzt. Das Gemisch wird 16 h bei 15ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch 10 min Inkubieren bei 65ºC gestoppt.
1 µl und 3 µl des Ligationsgemischs werden verwendet, um 0,2 ml kompetente Zellen des repair-minus-Stammes E.coli MV1190 [A(lac-prnAB), thi, supE, Δ(sr1 -rnecA)306::Tn10(tetr) (F':traD36, proAB, lac IqZΔM15)] zu transformieren. Der Stamm MV1190 wird im Manual für das BIO-RAD MUTA-GENE M13 in vitro Mutagenese-Kit beschrieben. 12 Ampicillin-resistente Kolonien werden herausgenommen. Die Plasmid-DNA wird präpariert und durch Scal-Verdauung analysiert.
Erfolgreiches Herausnehmen der pelA-Signalsequenz über Loop-Bildung entfernt eine Scal-Stelle. Korrekte Plasmide werden an der Scal-Stelle im Bluescript-Vektor linearisiert. Ein Plasmid wird weiter anatysiert. Die korrekte Verbindung zwischen dem pelA-Promotor und der codierenden Sequenz für Hybrid-IFN BDBB unter Einschluß des ATG wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Ein korrektes Konstrukt wird als M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119 bezeichnet.

Beispiel 10.4: Cotransformation von A. niger und Expression von Hybrid-Interferon.

Die Plasmide M13(+)KS/pelAΔss-IFN AM119 und pCG59D7 werden zum Cotransformieren der A. niger-Mutante An8 nach Beispiel 8.2.2 verwendet. Die Transformanten werden wie im Beispiel 8.2.3 beschrieben kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 h) werden Proben genommen, die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschallaufschluß aufgebrochen. Die Zellextrakte werden auf Interferonaktivität (s. oben) geprüft. Die Hauptmenge der Interferonaktivität findet man intrazellulär.

Hinterlegung von Mikroorganismen:

Die folgenden Mikroorganismen wurden nach dem Budapester Vertrag bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen", Grisebachstr. 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt: Mikroorganismen Hinterlegungs-Nr. Datum der Hinterlegung Escherichia coli HB 101/pGW 820 Escherichia coli HB 101/pGW 830 Escherichia coIi HB 101/pGW 850 Escherichia coli HB 101/pGW 860 Escherichia coli HB 101/pGW 880 Februar

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Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die für Pektinlyase pelA (Fig. 10), Pektinlyase pelB (Fig. 11), Pektinlyase pelC (Fig. 12), pelE, erhältlich durch Expression von in pGW880 (Fig. 5, DSM 4392) enthaltenem pelE, oder pelF, erhältlich durch Expression von in pGW860 (Fig. 6, DSM 4391) enthaltenem pelF, codiert, oder ein Derivat davon, wobei ein Derivat ein größeres Derivat einschließlich flankierender Sequenzen, Fragmente der genannten DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen, die nach dem genetischen Code degeneriert sind, bezeichnet.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend den Promotor, der sich in der DNA- Region vor dem Strukturgen befindet und bis zu 2000 Nucleotide umfaßt; die Signalsequenz, die sich in der DNA-Region zwischen dem Ende des Promotors und dem Anfang der für das reife Protein codierenden Sequenz befindet; das Strukturgen; oder den Terminator, der mit dem Stopcodon beginnt, von irgendeinem der Pektinlyase-Gene oder irgendeine Kombination dieser Fragmente.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel I (Fig. 10) oder ein Derivat davon wie im Anspruch 1 definiert.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel II (Fig. 11) oder ein Derivat davon wie im Anspruch 1 definiert.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel III (Fig. 12) oder ein Derivat davon wie im Anspruch 1 definiert.

6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das pGW820 (DSM 4388) ist.

7. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das pGW830 (DSM 4389) ist.

8. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das pGW850 (DSM 4390) ist.

9. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das pGW880 (DSM 4392) ist.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das pGW860 (DSM 4391) ist.

11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein Fragment umfaßt, das sich zwischen zwei Restriktionsorten des Plasmids pGW820 (DSM 4388), pGW830 (DSM 4389), pGW850 (DSM 4390), pGW880 (DSM 4392) oder pGW860 (DSM 4391> erstreckt und Pektinlyase-Promotor-, Signal-, Struktur- oder Terminatorfunktion beibehält, oder eine Kombination solcher Fragmente.

12. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das die Promotorsequenz von pelA umfaßt.

13. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das die Promotorsequenz von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF umfaßt.

14. Rekombinantes DNA-Moleküt nach Anspruch 1, das die Signalsequenz von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF umfaßt.

15. Rekombinantes DNA-Moleküt nach Anspruch 1, das das PLI-Strukturgen von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF umfaßt.

16. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1. das das PLI-Strukturgen von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF ohne die Introns umfaßt.

17. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das den Terminator von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF umfaßt.

18. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein rekombinanter Hybridvektor ist, der ein zu Aspergillus niger heterologes Strukturgen umfaßt.

19. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches ein Hybridvektor ist, der das heterologe Strukturgen umfaßt, das für das Hybrid-Interferon BDBB codiert.

20. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches der rekombinante Hybridvektor pUC19/pelA-IFNAM119 (Fig. 14) ist.

21. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches der rekombinante Hybridvektor M13(+)KS/pelAAss-IFN AM119 ist, bestehend aus dem induzierbaren pelA-Promotor, der codierenden Sequenz von Hybrid-Interferon BDBB und dem pelA-Transkriptionsterminator auf dem Blue script M13(+)KS-Vektor.

22. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches der Hybridvektor M13(+)KS/pelA-IFN AM119 ist, erhalten durch Verdauung von pUC19/pelA-IFN AM119 (Fig. 14) mit BamHI und HindIII und Ligation des isolierten Fragments an einen Bluescript M13(+)KS-Vektor, geschnitten mit BamHI und HindIII.

23. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach Anspruch 1, umfassend das Kultivieren eines Wirts, der mit einem DNA-Molekül transformiert ist, das eine DNA-Sequenz enthält, die für das Pektinlyase PLA-, PLB-, PLC-, PLE- oder PLF-Expressionssystem codiert, oder ein Derivat davon, und Isolierung des gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls oder des Derivates davon, oder seine Herstellung durch in vitro-Synthese.

24. Transformierter Wirt, der ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthält.

25. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Escherichia coli HB 101/pGW820 (DSM 4388) ist.

26. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Escherichia coli HB 101/pGW830 (DSM 4389) ist.

27. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Escherichia coli HB 101/pGW850 (DSM 4390) ist.

28. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Escherichia coli HB 101/pGW860 (DSM 4391) ist.

29. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Escherichia coli HB 101/pGW880 (DSM 4392) ist.

30. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Aspergillus niger An8 (DSM 3917) ist, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 und Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

31. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Aspergillus niger An8 (DSM 3917) ist, transformiert mit pUC19/pelA-IFN AM119 (Fig. 14) und Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

32. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Aspergillus niger An8 (DSM 3917) ist, transformiert mit M13(+)KS/petAΔss-IFN AM119 nach Anspruch 21 und Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

33. Transformierter Wirt nach Anspruch 24, der Aspergillus niger An8 (DSM 3917) ist, transformiert mit M13(+)KS/pelA-IFN AM119 nach Anspruch 22 und Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7 (DSM 3968).

34. Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts nach Anspruch 24, umfassend die Behandlung eines solchen Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und Selektion der Transformanten.

35. Verfahren nach Anspruch 34, worin Aspergillus niger An8 mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 und dem Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7 (DSM 3968) cotransformiert wird.

36. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor nach Anspruch 1 in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.

37. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor nach Anspruch 18 in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.

38. Verfahren nach Anspruch 36 zur Überproduktion der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF in Aspergitlus-Spezies, umfassend das Kultivieren eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybridvektor für die Expression der Pektinlyasen transformiert ist.

39. Verfahren nach Anspruch 37 zur Herstellung des Hybrid-Interferons BDBB in Aspergillus- Spezies, umfassend das Kultivieren eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybridvektor für die Expression des Hybrid-Interferons transformiert ist.

40. Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF in reiner Form, erhältlich durch Transformation eines Wirts, der zur Expression einer Pektinlyase nicht befähigt ist, mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 und Isolierung der Pektinlyasen.