JPH0638762A - エンドキチナーゼ活性をもつタンパク質をコード化する組換えｄｎａ - Google Patents

エンドキチナーゼ活性をもつタンパク質をコード化する組換えｄｎａ

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JPH0638762A
JPH0638762A JP4238550A JP23855092A JPH0638762A JP H0638762 A JPH0638762 A JP H0638762A JP 4238550 A JP4238550 A JP 4238550A JP 23855092 A JP23855092 A JP 23855092A JP H0638762 A JPH0638762 A JP H0638762A
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ピエール−ルイ・ブレゾー
Richard Legoux
リシャール・ルグー
Jean-Jacques Leguay
ジャン−ジャック・ルゲ
Michel Schneider
ミシェル・シュナイダー
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Societe National Elf Aquitaine
Elf Sanofi SA
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 この発明は、エンドキチナーゼ活性をもつ新
規タンパク質またはそれの前駆体をコード化する新規組
換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを含む細菌、イースト菌
または菌類、この組換えＤＮＡを含む植物細胞、植物ま
たは植物の部分、特に植物種子、この遺伝子による形質
転換を含む段階を含む、植物を菌および細菌などの病原
菌、および節足動物、特に昆虫類、および線虫に耐性に
する方法、この新規タンパク質およびその製造方法を提
供するものである。 【構成】 配列（ａ１）を含む、エンドキチナーゼ活性
をもつタンパク質またはその前駆体をコード化する組換
えＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、エンドキチナーゼ活
性をもつ新規タンパク質またはそれの前駆体をコード化
する新規組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを含む細菌、
イースト菌または菌類、この組換えＤＮＡを含む植物細
胞、植物または植物の部分、特に植物種子、この遺伝子
による形質転換を含む段階を含む、植物を菌および細菌
などの病原菌、および節足動物、特に昆虫類、および線
虫に耐性にする方法、この新規タンパク質およびその製
造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】栽培
植物は、菌および細菌などの病原菌、および節足動物、
特に昆虫、および線虫による被害を受け、それらは収穫
の減少の主な原因である。現在、これらの病原菌を抑制
する主な方法は、殺菌または殺細菌活性をもつ化学物質
を使用することである。植物はこれらの攻撃に対して様
々な防御機構によって自然に反応するが、それらはあい
にく一般に遅れて起ったり、十分に有効であるには弱か
ったりすることが現在公知である。これらの機構の１つ
には、キチナーゼＥＣ３．２．１．１４（Ａ．トッパン
（Ｔｏｐｐａｎ）ら、１９８２年、アグロノミー（Ａｇ
ｒｏｎｏｍｉｅ）、２巻、８２９−８３４頁）と呼ばれ
る酵素の誘導が含まれる。この誘導は、エチレンのよう
な物質によって人工的に刺激され得、その結果、対象植
物の病原菌に対する耐性を増す（ボラー（Ｂｏｌｌｅ
ｒ）Ｔ．，１９８８年、オックスフォード・サーベイズ
・オブ・プラント・モルキュラー・アンド・セル・バイ
オロジー（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｕｒｖｅｙｓ ｏｆ Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）、５巻、１４５−１７４頁）。
【０００３】キチンは、β−１，４連鎖によって結合さ
れたＮ−アセチルグルコサミン単位から成る直鎖多糖ポ
リマーである。このポリマーは、ほとんどの病原菌の
壁、節足動物、特に昆虫の骨格、線虫の卵および包嚢の
外皮中にある構造化合物である。キチナーゼと呼ばれる
酵素類は、キチンを分解することができる。それらはキ
チンを攻撃する型によって定義される２つの異なる群に
分けることができる。即ち、鎖の非還元末端にあるＮ−
アセチルグルコサミン単位を除去することができるエキ
ソキチナーゼ類および、鎖を分断することができ、イン
ビトロの菌糸体の菌糸の成長を阻害することができる唯
一のキチナーゼ類であるエンドキチナーゼである（ロバ
ーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）Ｗ．Ｋ．ら、１９８８年、ゼネ
ラル・ミクロバイオロジー（Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．）、１３４巻、１６９−１７６頁）。エキソ型から
なる既知の細菌キチナーゼと対照的に、既知の植物キチ
ナーゼ類の大多数は、エンド型のものである（ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ）Ｗ．Ｋ．ら、１９８８年、ゼネラル
・ミクロバイオロジー（Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．）、１３４巻、１６９−１７６頁）。
【０００４】細菌エキソキチナーゼをコード化するＤＮ
Ａ配列は既に単離され、クローン化されている（ジョー
ンズ（Ｊｏｎｅｓ）Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら、１９８６年、ＥＭ
ＢＯＪ．、５巻、４６７−４７３頁、およびズンドハイ
ム（Ｓｕｎｄｈｅｉｍ）Ｌ．ら、１９８８年、フィジオ
ロジカル・モルキュラー・プラント・パソロジー（Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｐｌａｎｔ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．）、３３巻、４８３−４９１頁）。米国特許出願第
４７５１０８１号は、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のキチナーゼを
コード化する完全な遺伝子の単離およびクローン化、お
よびこの遺伝子による細菌シュードモナス・フルオルセ
ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ）ＮＺ１３０およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＭＫ２８０の形質転
換を記載している。これらの形質転換された細菌は、細
菌の培養培地中に拡散されたコロイド状のキチンをほん
の少し分解することができる。ハープスター（Ｈａｒｐ
ｓｔｅｒ）Ｍ．Ｈ．ら、１９８９年、ヌクレイック・ア
シッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、１７
巻、５３９５頁の研究は、観察される低い分解効果を説
明する、このエキソキチナーゼの遺伝子コードを示して
いる（表２、前記文献の１３および１４段参照）。ジョ
ーンズ（Ｊｏｎｅｓ）Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら、による発表、
（１９８８年）、モルキュラー・ジーン・ジェネテイク
ス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、２１２巻、５３
６−５４２頁は、様々な植物プロモーターの制御の下で
の、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のエキソキチナーゼのコード化部
分を含むキメラの遺伝子をもつアグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）によるタバコの形質転換について述
べている。前記の書類には、このエキソキチナーゼの発
現によって病原菌耐性が増加することは示されていな
い。ある植物のエンドキチナーゼ類をコード化するゲノ
ムＤＮＡおよび／または相補的ＤＮＡ配列もまた、単離
され、クローン化される（ブログリー （Ｂｒｏｇｌｉ
ｅ）Ｋ．Ｅ．、１９８６年、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８３巻、６８２０−
６８２４頁、およびヘドリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ）Ｓ．
Ａ．、１９８８年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、８６巻、１８２−１８６
頁）。
【０００５】国際特許出願９０／０７００１は、強力な
プロモーターの制御の下での豆のファセオルス・ブルガ
リス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のエン
ドキチナーゼの相補的ＤＮＡをもつプラスミドの形成、
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｕｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の補助に
よる形質転換、形質転換されたタバコの再生、菌類リゾ
クトニア・ソラーニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌ
ａｎｉ）および再生された植物のボトリチス・シネリア
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）への耐性の増加
を示す実験、この遺伝子の補助による、豆のキチナーゼ
を発現する遺伝子伝達トマトの生産、非形質転換コルザ
植物に比べて増大したキチナーゼ活性をもつ遺伝子伝達
コルザ植物の生産を記載している。糸状菌のキチナーゼ
をコード化するゲノムＤＮＡおよび／または相補的ＤＮ
Ａ配列は、これまでに単離されていない。糸状菌の部分
的に単離され、確認されたキチナーゼは、アファノクラ
ジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｋｌａｄｉｕｍａｌｂ
ｕｍ）のエンドキチナーゼである（クンツ（ｋｕｎｔ
ｚ）、１９９１年−ドクトラル・シーシズ・アトゥ・ザ
・ユニベルシテ・ドゥ・Ｐ．エ・Ｍ．キュリー−パリ
（Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｐ．ｅｔ Ｍ．Ｃｕｒｉｅ
−Ｐａｒｉｓ））。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明は、エンドキチ
ナーゼ活性をもつタンパク質またはその前駆体をコード
化する新規組換えＤＮＡ、下記のアミノ酸配列（ａｌ） 配列番号１
【化１０】
【化１１】 または配列（ａｌ）との高度の相同性をもつ配列を含む
エンドキチナーゼ活性をもつタンパク質に関するもので
ある。
【０００７】ここで高度の相同性は、ニードルマン・ア
ンド・ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎ
ｓｃｈ）、１９７０年、ジャーナル・オブ・モルキュラ
ー・オブ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、
４８巻、４４３−４５３頁の最適配列整列法による最高
相同配列における少なくとも６０％および好ましくは８
０％のアミノ酸配列の相同（アミノ酸の総数に対する同
種アミノ酸の割合）を表わす。この方法は、特にウィス
コンシン大学のＵＷＧＣＧソフトウエア：ドゥブルー
ら、１９８４年、ヌクリア・アシド・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、１２巻、８７１１−８７２１頁
−オプションＧＡＰ。
【０００８】配列（ａｌ）に最も近いキチナーゼの既知
のペプチド配列は、約３３％の相同をもつセラチア・マ
ルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓ）（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら、１９
８６年、ＥＭＢＯ Ｊ．、５巻、４６７−４７３頁）の
配列である（クンツ（Ｋｕｎｔｚ）、１９９１年 ドク
トラル・シージズ−ユニベルシテ・ド・Ｐ・エ・Ｍ・キ
ュリー、パリ）、このキチナーゼは、エキソキチナーゼ
である。
【０００９】組換えＤＮＡを、植物または前記タンパク
質を発現する植物または植物の１部の病原菌耐性を増大
させる目的、または真核生物細胞、特に、例えばサッカ
ロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌、または例え
ばクリホネクトリア・パラシチカ（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃ
ｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｋａ）のような糸状菌など
の子嚢菌類、植物細胞、または例えば大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの原核微生物の補助に
よりこのタンパク質を製造する目的をもって、エンドキ
チナーゼ活性をもつこのタンパク質の発現のために使用
することができる。
【００１０】この組換えＤＮＡは、好ましくは、配列
（ａｌ）をコード化する配列または配列（ａｌ）と高度
の相同性をもつ配列の上流のシグナル配列を含む。この
シグナル配列の機能は、宿主細胞に従って選ばれるが、
タンパク質が細胞質から外に出されることを可能にす
る。
【００１１】例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）などの原核微生物における発現のために、
このシグナル配列は、原核微生物によって外に出された
タンパク質の天然の前駆体から由来する配列（例えばシ
グナルペプチドＯｍｐＡ（グライエブ（Ｇｈｒａｙｅ
ｂ）ら、ＥＭＢＯ ジャーナル、３巻、２４３７−２４
４２頁）またはアルカリ性ホスファターゼ（Ｊ．バクト
（Ｂａｃｔ）、１９８３年、１５４巻、３６６−３７４
頁）、または真核生物の前駆体に由来する非内因性配列
（例えばヒト成長ホルモンの天然の前駆体の１つのシグ
ナルペプチド）、または合成シグナルペプチド（例えば
フランス特許出願第２６３６６４３号に記載されている
もの）の配列であり得る。
【００１２】例えば酵母菌サッカロミケス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
または糸状菌クリホネクトリア・パラシチカ（Ｃｒｙｐ
ｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）などの子
嚢菌類のような真核生物細胞における発現のために、こ
のシグナル配列は好ましくはこれらの細胞により分泌さ
れるタンパク質の天然の前駆体に由来する配列である。
例えば酵母菌には、インベルターゼ（ヨーロッパ特許出
願第０１２３２８９号）の天然前駆体またはフェロモン
・アルファー（デンマーク特許出願第２４８４／８４
号）の天然前駆体、または、クリホネクトリア・パラシ
チカ（Ｃｒｙｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｋ
ａ）には、配列 配列番号９
【化１２】 のヨーロッパ特許出願第４７５８４２号記載のエンドチ
アペプシンのプレプロ配列の天然前駆体である。
【００１３】植物細胞における発現のために、使用され
るシグナル配列は、例えばトマトエンドキチナーゼ
（Ｍ．デュラン（Ｄｕｒａｎｔ）によるドクトラル・シ
ーシズ・イン・サイエンシズ−スペシャルティ：プラン
ト・モルキュラー・バイオロジー、（Ｄｏｃｔｏｒａｌ
Ｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ − ｓｐｅ
ｃｉａｌｔｙ： ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂ
ｉｏｌｏｇｙ）、１９８６年、ユニベルシテ・ドゥ・パ
リ・シュド（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｐａｒｉｓ
Ｓｕｄ））の下記の配列 配列番号１０
【化１３】 または下記の配列（ａ５） 配列番号３
【化１４】 を有する豆エンドキチナーゼ（ブログリクＫ．Ｅ．ら、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)、83, 6
820−6824））などの、放出されることが既知の植物細
胞タンパク質のシグナルペプチドをコード化する配列で
あるかまたは下記の配列（ａ２） 配列番号２
【化１５】 のシグナルペプチドをコード化するシグナル配列であ
る。適当ならば、シグナル配列によりコード化されるシ
グナルペプチドが、１つ以上のアミノ酸、特に下記の配
列（ａ３）のペプチドによりコード化されるタンパク質
中の配列（ａｌ）から分離されることが可能である。 配列番号４
【化１６】
【００１４】アミノ酸配列（ａｌ）、（ａ２）および
（ａ３）は、例えば下記のヌクレオチド配列（Ｎａ
ｌ）、（Ｎａ２）および（Ｎａ３）によってコード化さ
れ得る。 配列番号５ （Ｎａ１）：
【化１７】 配列番号６ （Ｎａ２）：
【化１８】 配列番号７ （Ｎａ３）：
【化１９】 アミノ酸配列（ａ５）は、例えば下記のヌクレオチド配
列（Ｎａ５）によってコード化され得る。 配列番号８
【化２０】
【００１５】この発明はさらに、前記で定義された組換
えＤＮＡを発現するための単位に関するものであり、こ
の単位は発現ベクターと呼ばれるベクターによって有利
に行なわれる。原核微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉａ ｃｏｌｉ）における発現のために、組換えＤＮＡ
は、特に有効なプロモーター、その後発現される遺伝子
の上流のリボソーム結合部位、および発現される遺伝子
の下流の有効な転写終止配列が挿入されなければならな
い。この単位はまた、選択標識を含むかまたは（例えば
これら２つの単位を担持する発現ベクターの補助によ
り）選択標識を発現するための単位として同時に宿主細
胞に導入されなければならない。これら全ての配列は、
宿主細胞に従って選択されねばならない。
【００１６】子嚢菌類などの真核生物細胞における発現
のために、この発明の発現単位は、その発現に必要な方
法とともに前記で定義された組換えＤＮＡを含む。
【００１７】例えばサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など
のイースト菌のような子嚢菌中の発現のために、組換え
ＤＮＡを一方は有効なプロモーターと認められる配列、
他方は転写ターミネーターの間に挿入することが必要で
ある。発現単位は選択標識を運ぶかまたは選択標識と同
時に宿主細胞に導入される。この選択標識は、好ましく
は、組換えＤＮＡを多数の複製、それらのゲノムまたは
多複製ベクターのどちらかに組み込んだそれらの細胞を
選択することを可能にする、栄養要求性標識（受容菌細
胞の突然変異を補足する）である。
【００１８】例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ポ
ドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ（Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはクリホネクトリア（Ｃｒｙ
ｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）などの糸状菌のような子嚢菌細
胞における発現のために、この発明の発現単位は、その
発現のために必要な方法とともに前記で定義された組換
えＤＮＡおよび、適当ならば、選択標識および／または
低分子重合体の配列をもつ。事実、当該ＤＮＡと同じ単
位かまたは別の単位上にある選択標識の助けを借りて当
該ＤＮＡを組込んだ形質転換体を選択するのは可能であ
る。これら２つの単位は次に同時形質転換によって導入
される。この発明の組換えＤＮＡは、糸状菌のゲノムに
組み込まれるかまたはこのＤＮＡの複製および分配を可
能にする配列によって染色体外型で保存され得る。
【００１９】植物細胞中の発現のために、植物中の有効
なプロモーターおよび有効なターミネーターの間に前記
で定義された組換えＤＮＡを挿入することが必要であ
る。
【００２０】プロモーターは好ましくは、例えばカリフ
ラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、また
は、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−
オキシゲナーゼの小サブユニットのプロモーターなどの
特定の組織または器官発現を制御するプロモーターなど
の強力な構成プロモーターであり、これは優先的に葉
中、特に中温生物の組織に発現する（クールマイヤー
（Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ）ら、１９８７年、アニュアル
・レビュー・オブ・プラント・フィジオロジー（Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、３８
巻、２２１−２５７頁）。例えば種子におけるまたは植
物の発達の特定の段階での発現を制御する特異的プロモ
ーターかまたは熱衝撃、切傷または植物と寄生虫の相互
作用の後誘導され得るプロモーター（クールマイヤー
（Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ）ら、１９８７年、前掲）を、
組換えＤＮＡの発現をこれらの状態中に求めるならば、
使用する事も可能である。
【００２１】植物遺伝子または、例えばアグロバクテリ
ウム・ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼのタ
ーミネーターなどの植物中に発現される遺伝子から単離
され得るポリアデニル化部位を含むターミネーター配列
を使用する。
【００２２】この発明はさらに、前記で定義された組換
えＤＮＡをその複製およびその発現に必要な方法ととも
に含む、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）種などの細菌、例えばサッカロミケス・セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）などの酵母菌、例えばクリホネクトリア・パラシチ
カ（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃ
ａ）またはフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）などの糸状菌に関するもの
である。この細菌、この酵母菌またはこの糸状菌は、エ
ンドキチナーゼ活性をもつタンパク質の製造に使用され
得る。
【００２３】この発明はさらに、前記で定義された組換
えＤＮＡおよびその複製を可能にする方法を含み、従っ
てこの組換えＤＮＡをクローン化するのに使用され得
る、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）種などの細菌、およびその複製を可能にするこの関
連のＤＮＡを含み、従って植物細胞を形質転換するのに
使用され得る、例えばアグロバクテリウム・リゾゲネス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ
ｓ）種およびアグロバクテリウム・ツメファキエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）種の１つから、植物に遺伝子物質の転移によって感
染させることができる細菌に関するものである。前記組
換えＤＮＡによる植物細胞の形質転換もまた、花粉管法
（ゾンクサン・ルオ（Ｚｈｏｎｇｘｕｎ Ｌｕｏ）ら、
プラント・モルキュラー・バイオロジカル・レポート
（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．）、１
９８８年、６巻、１６５−１７６頁）および発芽種子の
直接形質転換（テーパー（Ｔｏｅｐｆｅｒ）Ｒ．ら、１
９８９年、ザ・プラント・セル（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ）、１巻、１３３−１３９頁）などの別の生物
学的方法によるかまたはポリエチレングリコール、エレ
クトロポレーション（キストー（Ｃｈｉｓｔｏｕ）Ｐ．
ら、１９８７年、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４巻、３６６２−３６９９
頁）およびマイクロプロジェクタイルズによる衝撃（ク
ライン（Ｋｌｅｉｎ）Ｔ．Ｍ．ら、１９８８年、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、
８５巻、８５０２−８５０５頁）などの物理的方法によ
って実施され得る。
【００２４】この発明はさらに、その発現に必要な方法
とともに前記で定義された組換えＤＮＡにより形質転換
される植物細胞に関するものである。この植物細胞は、
例えばとうもろこし、大豆、さとうだいこん、小麦、大
麦、けし、せいようあぶらな、ひまわり、アルファルフ
ァおよびもろこしなどの主要穀物、バラ、カーネーショ
ン、ガーベラ、などの花、人参、トマト、レタス、チコ
リ、ピメント、メロン、およびキャベツなどの野菜に由
来し得る。特に価値ある種は、せいようあぶらなブラシ
カ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ひまわ
りヘリアンサス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａ
ｎｎｕｕｓ）およびタバコ ニコチアナ・タバクム（Ｎ
ｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である。
【００２５】１つまたは２、３の細胞に係わる形質転換
段階の後、カルスを生じるこれらの形質転換された細胞
の増殖段階があり、これは器官形成または胚形成過程に
よって形質転換された植物を生産し得る。
【００２６】従って、この発明はさらに、その発現に必
要な方法とともに前記で定義された組換えＤＮＡを含む
植物または植物の１部に関するものである。特に価値あ
る植物の部分は、特に種を蒔き、埋め、または穴に植え
た後に、完全に新しい植物を形成することができるか、
または種子の生産の可能な部分である。そのような部分
は、例えば、穀物、種子、切り枝、つるなどである。こ
れらの植物は、前記の種属のいずれか１つ、より具体的
にはニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｈｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）、ヘリアンサス・アヌウス（Ｈｅｌｉａ
ｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）およびブラシカ・ナプス
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）であり得る。
【００２７】この発明はさらに、この組換えＤＮＡによ
る植物細胞の形質転換段階の後、形質転換された細胞の
複製段階および植物の再生段階を含む、植物病原菌およ
び細菌、および節足動物、特に昆虫、および線虫などの
寄生虫に耐性のある植物を得る方法に関するものであ
る。植物細胞の形質転換段階は、好ましくはインビトロ
で、当該組換えＤＮＡを組み込んだアグロバクテリウム
（即ちアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属の細菌）の助けを借りて行なわれる。
【００２８】この発明はさらに、前記で定義された方法
を使って得られる病原菌耐性植物に関するものである。
この発明はさらに、新規な植物変種を創る選択プログラ
ムにおけるジエネトリックスとして、それの発現に必要
な方法とともに前記で定義された組換えＤＮＡを含む、
植物の使用に関するものである。この発明はさらに、前
記で定義された組換えＤＮＡの補助によって得られるエ
ンドキチナーゼ活性をもつ新規タンパク質に関するもの
である。このタンパク質は好ましくは配列（ａｌ）また
は配列（ａｌ）と高度の相同性をもつ配列を含む。それ
は３９ ±３または４１±３ｋＤａという見かけ上の分
子量をもつことが有利である。それはグリコシル化を可
能にする細胞中に発現されればＮ−グリコシル化され得
る。
【００２９】このタンパク質は、例えば真菌症（mycose
s）などの病気の処置のための新規の薬の有効主成分と
して重要である。この発明はさらに、植物細胞、植物カ
ルス、前記で定義された組換えＤＮＡを含む植物または
植物の部分を栽培し、それらを分離し、このタンパク質
を単離し精製することを含むこのタンパク質の製造方法
に関する。
【００３０】この発明は実験結果およびその論考を含
む、セクションに分けられた下記の記述によってより明
白に理解されるだろう。これらのセクションのいくつか
はこの発明を実施するという目的をもって行なわれた実
験に関するものであり、他はこの発明の実施例に関する
が、これは無論純粋にこの発明を説明するためにのみ挙
げられている。当技術の熟練者に既知である、下記の技
術は、１９８９年にニュー・ヨークのコールド・スプリ
ング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）により出版されたサムブルッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「モルキュラー・クローニ
ング： ア・ラボラトリー・マニュアル」（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）の研究に詳細が総て説明
されている。
【００３１】下記の記述は、Ｆig.１から５を参照する
ことによってより明白に理解されるだろう。Ｆig.１
は、アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌ
ａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）のキチナーゼをコード化する全
長相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列および翻訳されたタ
ンパク質のペプチド配列を示し、プレペプチド配列とプ
ロペプチド配列の間の開裂部位、およびプロペプチド配
列と成熟タンパク質の間の開裂部位は、ペプチド配列の
下の矢印によって表わされ、次の構築に使用される様々
な制限部位がヌクレオチド上の断続的な斜線で示され、
潜在的Ｎ−グリコシル化部位にアンダーラインが引かれ
ている。Ｆig.２はアファノクラジウム（Ａｐｈａｎｏ
ｃｌａｄｉｕｍ）のキチナーゼをコードするゲノムＤＮ
Ａのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質のペ
プチド配列を示すが、介在配列のヌクレオチドは小文字
で示されている。Ｆig.３は成熟タンパク質のペプチド
配列を示す。Ｆig.４および５はそれぞれＢａｍＨＩお
よびＳａｃＩ制限部位によって区切られた、プラスミド
ｐＢＲ６ｌおよびｐＢＲ６２（植物細胞における発現の
ためのベクター）中のＡ．アルブムの各キチナーゼのコ
ード化配列を示す。
【００３２】セクション１：アファノクラジウム アル
ブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）のキチ
ナーゼに対する抗体の製造 ａ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼの精製 糸状菌アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃ
ｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼを下記のよう
にアファノクラジウム・アルブム（Ａ．ａｌｂｕｍ）培
養培地から均質（homogeneity）になるまで精製した。
使用されるアファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎ
ｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の菌種は、バッサー
（Ｖａｓｓｅｕｒ）ら、１９９０年、ジャーナル・オブ
・ゼネラル・ミクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．）、１３６巻、１２号、２５６１−２５
６８頁に記載されているプロトコールに従る野生型菌株
ＥＴＨＭ４８３の紫外線突然変異誘発によって得られる
キチナーゼＥ3 の過剰生産性突然変異体である。この菌
株は、フォラー（Ｆｏｒｒｅｒ）Ｈ．Ｒ．、フィトパソ
ロジー（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．）Ｚ．、８８巻、（１９
７７年）３０６頁に記載されている条件下のマルト寒天
培地上で培養した。この培養からとられたフラグメント
を、１％のキチン（スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖ
ａ）Ａ．Ｋ．ら、エクスペリエンチア（Ｅｘｐｅｒｉｅ
ｎｔｉａ）、４１巻、（１９８５年）、１６１２−１６
１３年）を含む液状培養培地に接種するのに使用した。
タンパク質を、合成ポリマー（ファルマシアのモノＳ）
に基づく陽イオン交換カラム上のファルマシアのＦＰＬ
Ｃ技法による液体クロマトグラフィーおよび下記のプロ
トコールによる架橋アガロース上の排除クロマトグラフ
ィー（分子ふるいクロマトグラフィー）により培養培地
から精製する。
【００３３】段階１ 培養培地をポリエチレングリコールに対して４０倍に濃
縮し（カルボワックス２０Ｍ − トゥザールとマティ
ニョン（Ｔｏｕｚａｒｔ ｅｔ Ｍａｔｉｇｎｏｎ）、
４℃で１晩かかってｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝溶
液１００ミリモルに対して透析する。タンパク質の全重
量をブラッドフォード法（ブラッドフォード（Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ）Ｍ．Ｍ．、１９７６年、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、７２巻、２４８−２５４頁）により
測定する。
【００３４】段階２ つぎに濃縮培養培地をファルマシアのＦＰＬＣ技法によ
る合成ポリマーによるイオン交換カラム（ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のモノＳカラム）上のクロマト
グラフィーにより分留する。１０ミリモルのｐＨ５．２
の酢酸ナトリウム緩衝溶液中で予め希釈された抽出物
を、ｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液１０ミリモルで
平衡にされたモノＳカラム（ＨＲ５／５）上に置く。カ
ラム上に保持されたタンパク質を１０から５００ｍＭの
ｐＨ５．２の酢酸ナトリウムの直線勾配により溶離す
る。
【００３５】段階３ アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄ
ｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼを含む留分をセント
リコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０膜（アミコン）によ
り濃縮する。タンパク質の精製を架橋アガロース上の排
除クロマトグラフィーによって続け、溶離をｐＨ５．２
の５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液で行なう。各段階
で、キチナーゼをその分子量（ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）の存在下で１２．５％のポリアクリルアミド
ゲル上の電気泳動−銀で発色）が測定され、その酵素活
性がトリチウム標識キチンを基質として使用する下記の
放射化学的方法（モラノ（Ｍｏｌａｎｏ）ら、（１９７
７年）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、８３巻、６４８−６５６頁）
によって測定される。精製を完了すると、４１±３ｋＤ
ａの見かけの分子量をもつタンパク質を単離するが、そ
れはエンドキチナーゼ活性をもつ（Ｃ．クンツ（Ｋｕｎ
ｔｚ）による論文、ピエール＆マリー・キュリー大学
（Ｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ＭａｒｒｉｅＣｕｒｉｅ）、１
９９１年）。このタンパク質は、トリチウムを使用する
下記の放射化学的方法により測定するキチン分解活性を
もつ。
【００３６】ｂ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐ
ｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼの
確認 ｂ１．アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃ
ｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼの酵素活性の
測定 キチナーゼのエンドキチナーゼ活性を、基質（トリチウ
ム化キチン）から酵素によって分離されたモノマーまた
はオリゴマーの量を評価することが可能である放射化学
的方法によって測定する。モラノ（Ｍｏｌａｎｏ）らに
よって記載されているこの方法（１９７７年、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、８３巻、６４８−６５６頁）を下に要約する。
比活性０．５８ＭＢｑ／ｍｌのトリチウム化キチン５０
μｌを１０μｌの容量のタンパク質抽出物に加える。最
終容量をｐＨ５．０の０.２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で
３００μｌに調整する。３０℃で９０分のインキュベー
ションの後、キチン加水分解反応を１００μｌの２０％
トリクロロ酢酸で止める。次に試験管を１２０００ｇで
１０分間遠心分離する。キチンの可溶性オリゴマーを含
む上澄みの１００μｌ部を除去し、対応する放射能を、
５ｍｌのシンチレート化混合物の存在下で液体シンチレ
ーションにより測定する。比キチン分解活性（chitinol
ytic activity）をｄｐｍ／μｇタンパク質で示す。
【００３７】ｂ２．アファノクラジウム・アルブム（Ａ
ｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼ
のアミノ末端配列の測定 単離されたタンパク質のアミノ末端を下記のように配列
した。処置されるサンプルをＰＶＤＦ（ポリビニリデン
ジフルオリド）フィルター上に置き、それを各分解周
期に合わせて、 形成されたフェニルチオヒダントイン誘
導体を連続的に分析する、クロマトグラフ（アプライド
・バイオシステムズのモデル４３０）を備えたタンパク
質配列器（モデル４７０Ａ、アプライド・バイオシステ
ムズ・ＵＳＡ）に導入する。測定されたアミノ末端配列
は、下記のものである。 配列番号１１
【化２１】
【００３８】ｃ）ポリクローナル抗体の製造 免疫血清を製造するために、ラビットに５００μｌのフ
ロインドの完全アジュバント中の２５μｇの精製キチナ
ーゼを注射した。フロインドの不完全アジュバント（５
００μｌ）中の３本の２５μｇの追加免疫投与を３週間
間隔で行った。免疫血清を、最後の注射の３週間後に採
った。この免疫血清は特異的にアファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の
キチナーゼを認識する。それは、後者のタンパク質が特
にウエスタン・ブロッティング・技法（第８節に書かれ
た）によって、下記の条件下に培養されたアファノクラ
ジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌ
ｂｕｍ）菌株の全タンパク質抽出物から検出することを
可能にする。
【００３９】セクション２： アファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の
相補的ＤＮＡライブラリーの構築 ａ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）から抽出したメッセンジャー
ＲＮＡの製造 １％のキチンの存在下で培地上で２日間培養された前記
アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄ
ｉｕｍ ａｌｂｕｍ）菌株の菌糸体の全ＲＮＡをロジマ
ン（Ｌｏｇｅｍａｎ）ら、アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、１９８７年、１６３巻、１６−２０頁の方法
により抽出した。菌糸体を濾過により培養培地から分離
し、無菌水で洗浄し、つぎに液体窒素中の乳鉢の中で粉
砕する。次に全ＲＮＡをロジマン（Ｌｏｇｅｍａｎ）
ら、（前掲）の推薦に従って塩酸グアニジン法によって
抽出する。エタノール沈澱段階の後、全ＲＮＡを緩衝溶
液中に溶解する。ポリ（Ａ）+メッセンジャーＲＮＡを
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前掲）により記
載されたオリゴ（ｄＴ）セルロースのカラム上の２回の
クロマトグラフィーサイクルの後、単離した。メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を２６０ｎｍで分光測光法に
より定量する。
【００４０】ｂ）相補的ＤＮＡの合成 相補的ＤＮＡをプロメガ社（Ｃ２１００参照）の「リボ
クローンｃＤＮＡ合成システム」キットの助けによって
供給者の説明に従って合成した。このキットは、オカヤ
マら、１９８２年、モルキュラー・セルアー・バイオロ
ジー（Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、２
巻、１６１−１７０頁に記載され、ギブラー・アンド・
ホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ）、
１９８３年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５巻、２６３−２
６９頁により修正された方法を使用しているが、これは
完全ｃＤＮＡの合成とクローン化に便宜的である。相補
的ＤＮＡを、アメルシャム社（ｃＤＮＡクローン化シス
テムキット、商品番号ＲＰＮ１２８０）のクローン化シ
ステムの手順に従ってＥｃｏＲＩ部位でベクターλｇｔ
ｌｌにクローン化した。次に組換え体の数を、菌株大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（サムブルック（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ）ら、前掲）の細菌の芽胞嚢膜（tapetum）
上に得られた溶菌プレートを数えることによって評価し
た。約１０5のクローンを得たが、その８０％は組換え
クローンである。
【００４１】セクション３： アファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）のメ
ッセンジャーＲＮＡから構築された相補的ＤＮＡライブ
ラリーの免疫スクリーニング ベクターλｇｔｌｌにおけるライブラリーの構築によ
り、このライブラリーを構築するのに使用されたｍＲＮ
Ａによりコード化されたタンパク質の形態でクローン化
されたｃＤＮＡを発現することが可能になる。この合成
は、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰ
ＴＧ）での誘導後起る。次に合成されたタンパク質は、
目的とするタンパク質に対するあらかじめ得られた抗体
によって認識することができる（セクション１）。クロ
ーンを、当技術の熟練者に既知であり、例えばサムブル
ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（前掲）により記載された
プロトコールに従って同定し、単離することができる。
【００４２】ライブラリーを、溶菌プレートを形成する
ことができる１０4粒子を含むファージのけんだく液を
用いて菌株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０の感染に
より増幅する。この段階を直径９０ｍｍのペトリ皿中で
実施する。インキュベーションを４２℃で１６時間実施
し、１０7倍の増幅を可能にする。次に増幅されたライ
ブラリーを、溶菌プレートを形成することができる１０
5粒子の密度で菌株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０
の細菌の芽胞嚢膜上に塗布する。細菌を、直径１５０ｍ
ｍの５枚のペトリ皿に塗布し、４２℃で５時間インキュ
ベートする。ＩＰＴＧ（１０ミリモル）を含浸させたセ
ルロースフィルター（シュライハー・アンド・シューエ
ル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌ
ｌ）、ＢＡ ８５）を皿の表面に置き、３７℃で５時間
ゲロース培地と接触させておく。次にそれを２番目のフ
ィルターに置き換え、それを１６時間同じ培地に置いて
おく。フィルターをＴＮＴ緩衝液（１０ｍＭ トリス、
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイー
ン）中の１０％の粉乳から成るいわゆる遮断緩衝液（bl
ocking buffer）で３０分間処置し、前記の抗血清をイ
ンキュベートし、ＴＮＴ培地中で１／１００に希釈す
る。インキュベーションおよびアルカリホスホターゼで
発色させるためのプロトコールは、プロメガ社の「プロ
トブロット免疫スクリーニングシステム」照会番号Ｓ３
７１０に書かれているものである。正クローンは、発色
後青紫色に見える。
【００４３】次に陽性溶菌プレート即ちキチナーゼを合
成するクローンに対応するものを、ペトリ皿上で同定
し、バクテリオファージを、前記の一次スクリーニング
と厳密に同じ方法で成された二次免疫スクリーニングの
方法によって精製のために除去する。７種のハイブリダ
イゼーション群に対応する１７のクローンを得た。約２
３０ｂｐの９クローンを含む１つのハイブリダイゼーシ
ョン群は、特に強力な信号を生み出す。ＣＨ３Ｃと呼ば
れる、これらのクローンのうちの１つを残りの研究のた
めに保持した。ＣＨ３ＣクローンのＤＮＡ配列をデオキ
シリボヌクレオチド法（サンガー（ＳＡｎｇｅｒ）ら、
１９７７年、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１４巻、５４６３−５４６７頁）に従
って測定した。このクローンは、サイズが小さすぎるた
め、「全長」相補的ＤＮＡは含んでいない。
【００４４】セクション４： アファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）ゲノ
ムＤＮＡライブラリーの構成 ａ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の全ＤＮＡの包膜および製造 全ＤＮＡをダブシ（Ｄａｂｏｕｓｓｉ）ら、カレント・
ゼネティクス（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．）、（１９８９
年）、１５巻、４５３−４５６頁の方法により製造す
る。次にアファノクラジウム・アルブム（Ａ．ａｌｂｕ
ｍ）のＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで１部消化し、シ
ョ糖勾配の大きさに応じて分画する。１２と２０ｋｂの
間の大きさのフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位で開裂後
のファージＥＭＢＬ４に挿入した。ファージ粒子におけ
る包膜を、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社の「ｃ
ＤＮＡクローン化システム」キット（照会番号ＲＰＮ１
２８０）を使用してインビトロで行ない、形質転換を大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＬＥ２９２（サムブルック
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲）の細菌の芽胞嚢膜上で
おこなう。ライブラリーは、１．２ｘ１０6プレートの
大きさをもち、５０％の組換えファージを有する。
【００４５】ｂ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐ
ｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のゲノムライブ
ラリーのスクリーニング ｂ１．フィルター上のレプリカの製造 当技術の熟練者に既知の技法に従る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＮＭ５３９（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）
ら、前掲）菌株の感染によるライブラリーの増幅後、１
０5ファージを１皿につき溶菌プレートを形成し得る２
００００粒子の密度で菌株ＮＭ５３９の細菌の芽胞嚢膜
上に塗布する。インキュベーションを３７℃で１６時間
する。皿を冷却し、２つのレプリカを、皿の上に２つの
ナイロンフィルター（ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ、
アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、照会番号ＲＰＮ２
０３Ｎ）を連続して置くことにより作る。第１のフィル
ターを４５秒間、第２のフィルターを９０秒間、溶菌プ
レートに接触させておく。膜上のレプリカを、ＤＮＡを
上に向けて、ＮａＯＨ ０．５Ｍ、ＮａＣｌ １．５Ｍ
の成分の変性溶液で飽和された１枚のワットマン３ＭＭ
濾紙上に、７分間置くが、これはＤＮＡの固定を可能に
する。次に膜上のレプリカを、ＮａＣｌ１．５モル、ｐ
Ｈ７．４のトリス−ＨＣｌ ０．５Ｍの成分をもつ中和
液で飽和したワットマン３ＭＭの２枚目に３分間置く。
続いて膜上のレプリカを、２倍の標準食塩緩衝液（Ｎａ
Ｃｌ ０．３０Ｍ、クエン酸ナトリウム ０．０３０
Ｍ）中に浸し、次に大気中でＤＮＡを上向きに固定した
側面で乾燥する。
【００４６】ｂ２．正クローンを同定するのに使用され
る放射性ブローブの製造およびレプリカのハイブリダイ
ゼーション 使用されるプローブは、前記（セクション３）で得られ
たＣＨ３ＣクローンのＤＮＡであり、その中で１００ｎ
ｇのＤＮＡをベーリンガー・マンハイム ＧｍｂＨ
（照会番号１００４７６０）の標識キットを製造者の推
薦に従って使って無作為標識（無作為プライミング）に
よりｄｃＴｐα32ｐ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）で標識す
る。得られる比活性は、ＤＮＡの１ｘ１０9ｄｐｍ／μ
ｇである。膜上のレプリカを６５℃で１時間、６ ｘ
ＳＳＣ（標準食塩クエン酸溶液）、５ ｘ デンハート
溶液、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）およ
び１００μｇ／ｍｌの音波処理された鮭の***のＤＮＡ
の組成の緩衝液中でプレハイブリダイズする。 膜上の
レプリカを、同じ緩衝液で１６時間、前記で製造された
プローブでハイブリダイズし、次に２ ｘ ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ緩衝液中で２０℃で２０分間、次に２
ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液中で６５℃で４０分
間、最後に０．２ ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液
中で６５℃で４０分間洗浄し、その後乾燥し、オートラ
ジオグラフする。簡潔に言えば、２０ｘＳＳＣ緩衝液は
１７５．３ｇ／ｌのＮａＣｌおよび８８．２ｇ／ｌのク
エン酸ナトリウムを含み、数滴の１０ＮのＮａＯＨでｐ
Ｈ７に調整する。１０ｘデンハート溶液は、５００ｍｌ
の最終容量につき１ｇのフィコール４００、１ｇのポリ
ビニルピロリドンおよび１ｇのウシ血清アルブミンを含
む。５個のファージを３段階で精製した。それらのうち
４個は制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩにつき同一の消化プロフィールをもつ。
【００４７】ｂ３．キチナーゼをコード化するアファノ
クラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ
ａｌｂｕｍ）の遺伝子を含むフラグメントのクローン化
および配列化 これら４個のファージのうちの１個のＤＮＡを酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化した。得られた制限フラグメントを１％の
寒天ゲル上で電気泳動によって分離した。ＤＮＡを、サ
ザン・ブロッティング法（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ）、Ｅ．Ｍ．（１９７５年）、ジャーナル・オブ・モ
ルキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）、９８巻、５０３−５１７頁）によるナイロンフ
ィルター（ハイボンドＮ+、アメルシャム）に移し、ｄ
ｃＴＰα32ｐ（セクション４ ｂ２参照）で標識された
ＣＨ３ＣクローンのＤＮＡでハイブリダイズした。つぎ
に膜を洗浄し、アメルシャムにより推薦されたプロトコ
ールに従って展開し、ＸＡＲフィルム（コダック）でオ
ートラジオグラフした。単一帯上の非常に強力なハイブ
リダイゼーションシグナルを検出する。このＤＮＡフラ
グメントの大きさを約７ｋｂと推定する。フラグメント
ｆＢＬ１と呼ばれるこのフラグメントを、「プラント・
モルキュラー・バイオロジー・マニュアル（Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）」、ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）ら、クルアー・アカ
デミック・プレス（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）、１９８８年、に記載されている方法に従っ
た電気泳動のあと電気溶出により単離し、配位子をＢａ
ｍＨＩ部位で開裂したベクターｐＵＣ１３に結合し、脱
リン酸化する（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、
照会番号２７−４９６９−０１）。得られたプラスミド
をプラスミドｐＢＬ１と呼ぶ。ベクターを、サムブルッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲によって記載されてい
るプロトコールに従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｄ
Ｈ５ αＦ’）に導入する。得られたクローンをＢＬ１
と呼ぶ。
【００４８】配列決定 当技術の熟練者に既知の技術に従った２本鎖ＤＮＡの製
造後、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、照会番号
２７−１ ６８２−０１の「Ｔ7配列決定キット」の助
けによって７ｋｂの挿入の部分をジデオキシリボヌクレ
オチド法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ）、１４巻、５４６３−５４６７頁、１９７
７年）に従って配列決定した。使用されるプライマー
は、精製タンパク質のアミノ末端配列から翻訳された配
列に対応する、オリゴヌクレオチド混合物Ｎ1と呼ばれ
る下式のオリゴヌクレオチド混合物である（セクション
１参照）。この混合物をバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ４６００）装置の助けにより化学合成によって得
た。 配列番号１２
【化２２】 （Ｉはイノシンを表わす）
【００４９】鎖の残りを配列することができるように、
他のプライマーを、これらの第１のプライマーによって
得られた配列から翻訳した。相補的鎖の配列を逆方向の
プライマーを合成することによって得た。それによっ
て、セクション７で述べる、Fig.２に示された配列を確
認することが可能になった。
【００５０】セクション5 アファノクラジウム・アル
ブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）のキチ
ナーゼの全長相補的ＤＮＡの製造 ａ）相補的ＤＮＡライブラリーの構築 セクション２と同様に単離されたメッセンジャーＲＮＡ
をベクターｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシアから販売されて
いる）中の相補的ＤＮＡライブラリーを製造するのに使
用した。このベクターは、特別の制限部位を含むポリリ
ンカーを含むプラスミドである。使用されるクローン化
技法は、カプト（Ｃａｐｕｔ）ら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、１９８
６年、８３巻、１６７０−１６７４頁によって記載され
ているものである。この方法は、一方でＰｓｔＩでベク
ターを消化し、ポリｄＣテイルをプロツベラント３’端
に添加し、次に生成したプラスミドをＢａｍＨＩで消化
することから成る。ベクターに対応するフラグメントを
セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア）のカラムで精製
する。したがって、それは、１方の端にポリｄＣテイ
ル、もう１方にＢａｍＨＩ型の粘着末端を含む。他方、
メッセンジャーＲＮＡを、 配列番号１３
【化２３】 の配列をもつプライマーから出発する逆転写に処す。す
なわち、その５’末端で、ｃＤＮＡはＢａｍＨＩ接着端
に相補的な配列ＧＡＴＣをもつ。
【００５１】逆転写酵素の働きによって得られたＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリドをアルカリ加水分解に処し、それに
よってＲＮＡを除去することが可能になる。つぎに１本
鎖相補的ＤＮＡを、セファロースＣＬ４Ｂのカラムで２
サイクル精製し、ポリｄＧｓを３’端で添加するために
末端転移酵素で処置をする。相補的ＤＮＡを一本鎖型
で、前記のように製造されたベクターに挿入する。プラ
イマーに相補的な、アダプターと呼ばれる２番目のオリ
ゴヌクレオチドが、相補的ＤＮＡの５’端でＢａｍＨＩ
粘着端を発生させるのに必要である。ベクター、相補的
ＤＮＡおよびアダプターのハイブリダイゼーションの
後、組換え分子をファージＴ４のリガーゼの働きによっ
てアニーリングする。次に１本鎖領域をファージＴ４の
ＤＮＡポリメラーゼによって２本鎖領域に作りあげる。
できたプラスミドのプールを菌株ＭＣ１０６１（カサバ
ダン（Ｃａｓａｂａｄａｎ）、シュー・アンド・コーエ
ン（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔ．） （１９８０
年）、１４３巻、９９７１−９９８０頁）を形質転換す
るのに使用し、組換え細菌をアンピシリン耐性を用いて
選択する。
【００５２】ｂ）ライブラリーのスクリーニング 標識プローブの製造 ＣＨ３Ｃ相補的ＤＮＡクローンの配列から翻訳された３
プローブおよびＢＬ１ゲノムＤＮＡクローン（セクショ
ン４）をバイオサーチ４６００ＤＮＡ合成器の助けによ
って合成した。プローブは下記のものである。 配列番号１４
【化２４】 配列番号１５
【化２５】 配列番号１６
【化２６】 それらはそれぞれ、アファノクラジウム・アルブム（Ａ
ｐｈａｎｏｃａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼの
配列のコード化の、出発点、真ん中および下流に位置す
る配列をコードする。プローブを、ペルオキシダーゼと
カップリングさせることによって標識する。
【００５３】アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａ
ｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼの相補
的ＤＮＡを含むコロニーのハイブリダイゼーションおよ
び検出 約１０００００のコロニーを、グランスタイン・アンド
・ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅ
ｓｓ）（１９７５年、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）（ＵＳＡ）、７２巻、３９６
１頁）によって開発された自然の位置でのハイブリダイ
ゼーション技術によってスクリーンする。約１００００
の細菌を１０個のペトリ皿上に塗布し、単離されたコロ
ニーを得る。３７℃で２４時間のインキュベーションの
後、各皿を２枚のハイボンドＮ+ナイロンフィルター
（アメルシャム）上に複製し、各フィルターを３つのプ
ローブで処置する。膜上の複製を、コロニーを上に向け
て、ＮａＯＨ ０．５Ｍ、ＮａＣｌ １．５Ｍの組成を
もつ溶液を飽和させた１枚のワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）３ＭＭ上に５分間置き、次に膜を、ＮａＣｌ １．
５Ｍ、トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．００．５モルの組成を
もつ中和溶液上に５分間置く。次に複製を、２ ｘ Ｓ
ＳＣ溶液（標準食塩−クエン酸緩衝液）（ＮａＣｌ
０．３０モル、クエン酸ナトリウム液０．０３０モル）
に浸す。膜上のレプリカを、各膜につき２０ｍｌの割合
のトリス−ＨＣｌ １０ミルモル ｐＨ８．０、ＥＤＴ
Ａ １０ミリモル、ＮａＣｌ ５０ミリモル、ＳＤＳ
０．１％、の組成の溶液中のプロテイナーゼＫ（ベーリ
ンガー・マンハイムＧｍｂＨ）１００μｇ／ｍｌで処置
する。インキュベーションを３７℃で３０分間、振とう
させながら行なう。膜上のレプリカを再び２ ｘ ＳＳ
Ｃ溶液に浸し、細菌残分を商標キム・ワイプス（Ｋｉｍ
Ｗｉｐｅｓ）でそっとこすることによって部分的に除
去する。次に膜を、ＮａＯＨの０．４Ｍ溶液中で５分間
処置し、２ｘ ＳＳＣ溶液中でさっとすすぎ、各皿に２
つの膜上レプリカを得た。
【００５４】フィルターを、プレハイブリダイゼーショ
ンのために０．１％ＳＤＳ、６ ｘＳＳＣ、１０ ｘ
デンハートおよび１００μｇ／ｍｌの変性の起った音波
処理された鮭の***のＤＮＡ（シグマ）を含む緩衝液中
に置く。プレハイブリダイゼーションの温度は４２℃で
持続時間は６時間である。ハイブリダイゼーションをペ
ルオキシダーゼで標識した３つのプローブの混合物６０
ｎｇ／ｍｌを加えることによって４２℃で１６時間行な
う。膜を２ ｘ ＳＳＣ溶液＋０．１％ＳＤＳ中で２２
℃で５分を２回、次に３０分洗浄し、その後０．１ ｘ
ＳＳＣ溶液＋０．１％ＳＤＳ中で４２℃で１５分の洗
浄を２回、最後に２２℃で２ ｘ ＳＳＣ溶液中で３分
間の洗浄をする。展開をアメルシャム（照会番号ＲＰＮ
２１１０）のＥＣＬキットの助けを借りて、エキソマト
ＡＲフィルム（コダック）を使った製造者のプロトコー
ルに従って実施する。３５コロニーが３プローブの混合
物での非常に強いハイブリダイゼーションを示した。こ
れらの３５コロニーのうち１５個のプラスミドＤＮＡを
調製し、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し
た。１％アガロースゲル上の電気泳動の後、二重消化に
よって１５例のうち４例で約１．６ｋｂの大きさをもつ
フラグメントを分離することが可能になる。
【００５５】セクション６： アファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍａｌｂｕｍ）のキ
チナーゼの全長相補的ＤＮＡの配列の測定 １．６ｋｂのフラグメントの１個をファージＭ１３の複
製型のＤＮＡに再クローン化した。１．６ｋｂのフラグ
メントを含むＭ１３クローンのＤＮＡを、１連の重複Ｍ
１３クローンを生成させるためにエキソヌクレアーゼで
消化した（ＩＢＩの「サイクロンＩ・バイオシステム」
法）。前記クローンをジデオキシリボヌクレオチド法
（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７年、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳ
Ａ、１４巻、５４６３−５４６７頁）により配列させ
た。 ａ）アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌ
ａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナーゼのｃＤＮＡ配列
の分析 下記の記述は、Fig.１の助けによって、より明白に理解
されるだろう。この配列は、１２．５％のポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動によって観察されるタンパク質
のみかけの分子量に適合する単一解放読み取り枠（停止
コドンによって妨害されない）を含む。配列は９７位の
ＡＴＧコドンで出発し、１３６６位のＴＡＡ停止コドン
で終止し、約４６ｋＤａの分子量をもつ４２３個のアミ
ノ酸のタンパク質をコードする。
【００５６】キチナーゼはシグナルペプチドの存在を要
する、菌細胞によって天然に分泌され得るタンパク質で
あるので、シグナルペプチドが当業界の熟練者達に期待
されている。ウィスコンシン大学のＵＷＧＣＧソフトウ
ェア、ドゥブルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、１９８４
年、Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．、１２巻、８７１１−８
７２１頁−オプション： Ｇ．フォン ハイン（Ｖｏｎ
Ｈｅｉｊｎｅ）、１９８６年Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅ
ｓ．、１４巻、４８３−４９０頁の方法によるシグナル
ペプチドの検索、はこの配列中に真核生物または原核生
物細胞により認識されたシグナルペプチドをコード化す
る部分、即ち、プレヌクレオチド配列（ヌクレオチド９
７で出発し、ヌクレオチド１６２で終止する）と呼ばれ
る下記の配列（Ｎａ２）、 配列番号６
【化２７】 下記の配列（ａ２）をもつ２２のアミノ酸のシグナルペ
プチドをコード化する部分 配列番号２
【化２８】 を予言している。
【００５７】前記のシグナルペプチドをコード化する配
列と成熟タンパク質をコード化する配列の間には、ヌク
レオチド１６３で出発し、ヌクレオチド１９８で終止す
るプロ−ヌクレオチドと呼ばれる下記のヌクレオチド配
列（Ｎａ３）があり、 配列番号７
【化２９】 プローペプチド配列とよばれる下記のペプチド配列（ａ
３）をコード化する。 配列番号１７
【化３０】 したがって、アファノクラジウム・アルブム（Ａｐｈａ
ｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の成熟キチナーゼを
コード化する配列の上流には、下記のプレプロ−ペプチ
ド配列（ａ４）をコード化する配列がある。 配列番号１８
【化３１】
【００５８】成熟タンパク質は、セクション１で測定さ
れたアミノ末端配列（ｂ１）で出発する約４２．８ｋＤ
ａの分子量をもつ３８９個のアミノ酸のタンパク質であ
る。観察された約４１±３ｋＤａの見かけの分子量は、
実験誤差の範囲内で、相補的ＤＮＡから翻訳されたタン
パク質の４２．８ｋＤａの計算された分子量に対応して
いる。このタンパク質は、２個の潜在的Ｎ−グリコシル
化部位（Fig.１の下線部）を有する。
【００５９】ペプチド配列（ａｌ）と他の既知のペプチ
ド配列との比較 シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）ら、１９９０年、プラント・
モルキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）、１４巻、３５７−３６８頁で定義された
Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ類植物キチナーゼおよびバシルス
・シルキュランズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａ
ｎｓ）、セラチア・マルチェセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびストレプトマイシス・
エリスラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔ
ｈｒａｅｕｓ）の細菌キチナーゼとの比較をした。比較
は、ウィスコンシン大学のＵＷＧＣＧソフトウエア、ド
ゥブルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、１９８４年、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．、１２巻、８７１１−８７２１頁、
オプションＧＡＰの助けによって行なった。このアルゴ
リズム法は、あらゆる可能な直列を考慮し、同じアミノ
酸の最大数を対合させ、 １列になった配列におけるホー
ルの数が最小になる直列を創作するものである。 アフ
ァノクラジウム・アルブム（Ａ．ａｌｂｕｍ）の相補的
ＤＮＡから翻訳された配列（ａ１）に最も近いペプチド
配列は、約３３％の相同をもったセラチア・マルセスセ
ンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ジ
ョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら、１９８６年、
ＥＭＢＯ Ｊ．、５巻、４６７−４７３頁）のキチナー
ゼのものである。後者のキチナーゼは、エキソキチナー
ゼ（クンツ（Ｋｕｎｔｚ）、１９９９１年、博士論文−
Ｐ．＆ Ｍ．大学、パリ（Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓ
ｉｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｐ．ｅｔＭ．Ｃｕ
ｒｉｅ、Ｐａｒｉｓ））である。
【００６０】セクション７： アファノクラジウム・ア
ルブム（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）の
キチナーゼのゲノムＤＮＡ配列の分析 下記の記述は、Fig.２の助けによってより明白に理解さ
れるだろう。Fig.１のｃＤＮＡ配列とのこの配列の直線
は、この遺伝子がクローン化相補的ＤＮＡと同じペプチ
ド配列をコードしていることを示し、３個の小イントロ
ンを示した。配列は１２６位のＡＴＧコドンで出発し、
１５５２位のＴＡＡ停止コドンで終止する。最初のイン
トロンは２６６位で出発し、３２０位で終止する。２番
目のイントロンは、４２０位で出発し、４７２位で終止
する。３番目のイントロンは、５２３位で出発し、５７
１位で終止する。この配列は、４２３個のアミノ酸のタ
ンパク質をコードする。
【００６１】セクション８：フザリウム・オキシスポル
ム（Fusarium oxysporum）中アファノクラジウム・アル
ブム（Aphanocladium album）のキチナーゼの発現 硝酸塩レダクターゼのマイナス（nia-）発現型の線状真
菌フザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．メロニス（me
lonis）の受容株の相補性に基づくコトランスフォーメ
ーションは、アスペルギヌス・ニドゥランス（Aspergil
lus nidulans）の硝酸塩レダクターゼをコード化する遺
伝子を担持するプラスミドおよびアファノクラジウム・
アルブムのキチナーゼのゲノムＤＮＡを担持する上記の
プラスミドpＢＬ１を混合して行われる。形質転換細胞
の選択は、硝酸塩の原料を含む培地上で行ない、硝酸塩
レダクターゼ遺伝子をとり込んだ形質転換細胞のみが延
命および発育するのを可能にする。これらの形質転換細
胞のいくつかは、ｆＢＬ１断片をもとり込んでいる。キ
チナーゼ活性を発現する形質転換細胞はそれらの二重形
質転換細胞間で検出される。
【００６２】ａ）フザリウム・オキシスポルムの形質転
換 Ｆ．オキシスポルム ｆ．ｓｐ．メロニスの受容株は、
ダボッシィ等、１９８９年、、第１５巻、カレント・ジ
ェネティックス（Curr. Genet.）、４５３−４５６頁に
より開示された株Ｆｏｍ１５０ nia９である。１１ｋ
ｂのＳａｕ３Ａ断片上に担持されたアスペルギルス・ニ
ドオラスの硝酸塩レダクターゼのコード化ｎｉａｄ遺伝
子は、ｐＵＣ１９由来のプラスミドｐＦＢ３９へ挿入さ
れる。Ｆ．オキシスポルムの形質転換細胞に使用された
このプラスミドはｐＡＮ３０１と名付けられる。その構
築はマラジエル等、１９８４年、ジーン（Gene）、第７
８巻、１４７〜１５６頁に開示される。コトランスフォ
ーメーションはプラスミドｐＡＮ３０１および上記のプ
ラスミドｐＢＬ１の１／１比の混合物を使用して行われ
る。Ｆ．オキシスポルムのプロトプラストの形質転換を
確実にするために使用された実験条件および硝酸塩上で
の形質転換細胞の選択は、ランジン Ｔ．等、（１９９
０年）、カレント・ジェネティックス（Curr. Gene
t.）、第１７巻、３１３〜３１９頁に開示される。Ｔｒ
５，Ｔｒ６，Ｔｒ７およびＴｒ８と称される４種のコト
ランスファーマントはこの方法により得られた。
【００６３】ｂ）フザリウム・オキシスポルムのコトラ
ンスフォーマントによるアファノクラジウム・アルブム
のキチナーゼの発現 ウエスタンブロット法による分析は下記の方法でそれら
の４種のコトランスフォーマントに対して行われた。培
養培地のタンパク質を、ポリエチレングリコール（カル
ボワックス２０Ｍ−トウザール・エ・マテイニヨン）に
対照して濃縮し、抽出物をｐＨ５の０.２Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液で連続して透析し、ついで以下： −０.１２５Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ６.８ −４％ ドデシル硫酸ナトリウム −２０％ グリセリン −０.００２％ ブロモフェノールブルー −１０％ β−メルカプトエタノール の組成の１００℃で１０分間加熱された充填緩衝液で希
釈する。可溶化タンパク質１０μgをラエミリ（ラエミ
リ、ネーチャー（Nature）、第２２７巻、１９７０年、
６８０〜６８５頁）により開示されたプロトコールに従
ってＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上に置く。
電気泳動後、ゲルのタンパク質をＨ．トービン等、プロ
シーディングス・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A）、第７６巻、１９７９年、４３５０〜４３５４頁の
技術に従って電気転移して固定化膜（ＰＶＤＦで製造さ
れた）に移送する。
【００６４】免疫検出は、下記の工程を含むプロトコー
ルにより行う： −タンパク質をすくなくとも２時間３７℃で３％ゼラチ
ン溶液中でインキュベートして移送したＰＶＤＦ膜の飽
和 −０.０５％トウィーン２０界面活性剤を含むリン酸緩
衝化食塩水での３回の洗浄 −リン酸緩衝化食塩水で１／１０,０００に希釈された
あらかじめ製造された免疫血清（アファノクラジウム・
アルブムのキチナーゼを認識するポリクローナル抗体を
含む）の存在下でのインキュベーション −０.０５％トウィーン２０界面活性剤を含むリン酸緩
衝化食塩水での３回の洗浄 抗原−抗体混合物を、ついで製造業者の指導書に従って
アマシャム社製のＲＰＮ２３キット（ブロッテイング検
出キット）を使用してアルカリホスファターゼ結合スト
レプトアビデン−ビオチン系により展開する。コトラン
スフォーマントＴｒ８およびＴｒ７において、得られた
ブロットは、セクション１で得られたＡ．アルブムの精
製キチナーゼとして同じ見掛け分子量を有する約４１±
３ＫＤａのタンパク質の存在を示し、コントロール株に
は存在しない。コトランスフォーマントＴｒ５およびＴ
ｒ６の非発現は、おそらく転写され得ない部分への組換
え遺伝子の挿入により起こる。
【００６５】Ｆ．オキシスポルムの野生型株（コントロ
ール）のキチナーゼ活性およびコトランスフフォーマン
トＴｒ７とＴｒ８のキチナーゼ活性は、セクション１の
段落（ｂ）に要約されるモラノト等の放射化学的方法
（１９７７年、アナリティカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.），第７２巻、２４８〜３５４頁）に
より測定される。結果は以下の第（Ｉ）表にまとめられ
る。Ａ．アルブムのキチナーゼを最適に発現するコトラ
ンスフォーマントＴｒ８の培養培地が、コントロール株
と比較して、２５〜３０倍まで特異的キチン性活性にお
いて増大することが判明する。更に、抗−Ａ．アルブム
キチナーゼ抗体を加える（セクション１で製造された）
とき、コトランスフォーマントＴｒ８およびＴｒ７の細
胞外キチナーゼの活性は減少する。
【００６６】
【表１】 第１表 Ａ．アルブムのキチナーゼを発現するコトランスフォーマントＴｒ８およびＴｒ ７の特異的キチン性活性およびコントロール株の特異的キチン性活性の比較 特異的キチン性活性(タンパク質ｄｐｍ/μg) コントロール株 Ｔｒ８ Ｔｒ７ 実験１ ５２ １４９３ ４０２ 実験２ ８３ ２０１９ ７６０ 実験３ ８３ １３５ １５７ ＊それらの株各々において、独立培養濾液の２種のタン
パク質の抽出物を製造し、それらのキチン性活性をモラ
ノ等の放射化学的方法により独立して３回測定した；表
に示した値はそれらの３個の測定値の平均を示す。実験
１は第１抽出物で得られた値であり、実験２は第２抽出
物で得られた値である。実験３は、セクション２で製造
された抗キチナーゼ血清中１.５時間インキュベートさ
れた後、第１抽出物で得られた値である。
【００６７】セクション９：エシエリキア・コリ（Ｅ．
coli）中アファノクラジウム・アルブムの成熟キチナー
ゼの発現 ａ）中間プラスミドｐＥＭＲ６８０の構築 特にＰｓｔＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部分を担持す
るポリリンカーを含むプラスミドｐＵＣ１８（クローン
テック）をエンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＳａｌＩ
で切断して解く。複製起点を担持するＰｓｔＩ−Ｓａｌ
Ｉ断片を精製する。制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで
のｃＤＮＡの切断（セクション６およびＦig.１、参
照）は、約１２５０個の塩基対のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断
片を産生する。この断片はアガロースゲル上で精製さ
れ、ついでＴ４ポリメラーゼ（ＳａｌＩおよびｈｏＩは
結合を通じて消失する）で上記のＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断
片と結合された。結合混合物はエシエリキア・コリＲＲ
Ｉ株を形質転換するのに使用される。得られたプラスミ
ドはプラスミドｐＥＭＲ６８０と称する。このプラスミ
ドは、アファノクラジウム・アルブムのプレプロ−キチ
ナーゼコード化ｃＤＮＡの５’部分中に不完全断片を含
む。４７種の塩基対はＰｓｔＩ部分と翻訳開始を標識す
るＡＴＧコドン間で欠けている。
【００６８】ｂ）エシエリキア・コリ中の発現ベクター
の構築：プラスミドｐＥＭＲ６８２ 酵素ＡｃｃＩでのプラスミドｐＥＭＲ６８０の部分加水
分解および酵素ＢａｍＨＩでの全加水分解は約１１００
ｂｐの断片の遊離を可能にする。この断片はＡ．アルブ
ムの成熟キチナーゼのコード化配列の３’部分をコード
化する（Ｆig.１、参照）。以下の配列（Ｎｔ１）： 配列番号１９
【化３２】 の合成オリゴヌクレオチドはＡ．アルブムの成熟キチナ
ーゼ５'末端の再構築を可能にする。成熟タンパク質
（ＧＧＴによりコード化された）の配列の第１のアミノ
酸の前にはＡＴＧ翻訳開始コドンを担持するＮｄｅＩ部
位の粘着性末端が先行する。
【００６９】プラスミドｐＡＲ３０４０（スチュディア
ーＦ．Ｕ．等、１９８９年、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（J. Mol.Biol.）、第１８９巻、
１１３〜１３０頁）は、エシエリキア・コリ中およびア
ンピシリン耐性コード化遺伝子中の複製起点およびファ
ージＴ７の１０個の遺伝子を担持するＤＮＡ断片および
そのプロモーターおよびそのタミネーターを含むｐＢＲ
３２２断片を担持する。１０個の遺伝子は、制限酵素Ｎ
ｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより認識される配列と結合し
ているので目的の他の遺伝子と容易に置き換え得る。プ
ラスミドｐＡＲ３０４０は酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨ
Ｉで加水分解され、エシエリキア・コリおよびアンピシ
リン耐性遺伝子中複製の起点およびファージＴｒ７の１
０個の遺伝子のプロモーターおよびタミネーターを担持
する断片は精製される。配列（Ｎｔ１）のオリゴヌクレ
オチド、プラスミドｐＥＭＲ６８０の１１００ｂｐ断片
およびプラスミドｐＡＲ３０４０の断片の結合による組
立ては、結合混合物のエシエリキア・コリＲＲＩ株中へ
の形質転換後、プラスミドｐＥＭＲ６８２と称するプラ
スミドを産生する。
【００７０】 ｃ）エシエリキア・コリ中成熟キチナーゼの発現 ファージＴ７の１０個の遺伝子のプロモーターはエシエ
リキア・コリのＲＡＮポリメラーゼにより認識されな
い。従って、ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２株と称するプラス
ミドｐＥＭＲ６８２を担持するエシエリキア・コリＲＲ
Ｉ株にファージＴ７の１０個の遺伝子のプロモーターを
認識するＲＮＡポリメラーゼを与えることが必要であ
る。この操作を行うために選択される方法は、ファージ
Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼコード化遺伝子をそのゲノム
中に担持する組換えファージＣＥ６（スチュディアー
等、上掲）の使用である。
【００７１】−ＣＥ６ファージのストックの構築 従来当技術の熟練者に公知であるこの実験は、サンブル
ック等、上掲により開示される。懸濁物が１ファージ／
６細菌からなるように、酵母抽出物５ｇ、バクトトリプ
トン１０ｇ、ＮaＣl５ｇ、１０ｍＭ ＭgＳＯ4および０.
４％マルトースを含む培地中培養される細菌ＥＤ８７３
９の１００μlをファージＣＥ６で感染することを含
む。この懸濁物を上記の同じ組成に寒天７ｇ／ｌを補っ
たトップアガーと称する培養株の３ｍｌを混合する。５
０℃に保たれた混合物を温度、寒天１５ｇ／ｌを補った
同じ培地を含むペトリ皿上に置く。３７℃で一夜インキ
ュベーション後、ゲロースをファージを含む溶解プレー
トで覆う。トップアガーをかき出し、１０ｍＭ ＭgＳＯ
4３ｍｌ／ペトリ皿と１時間室温で混合してファージを
溶出する。混合物をついで１０分間１５,０００ｇで遠
心分離し、上清は２・２10ファージ／上清ｍｌの濃度で
ファージを含み、ファージストックと称する。ファージ
ストックを４℃で保つ。
【００７２】−キチナーゼの発現 ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２株は、寒天を含有しないこと除
いてファージストックを製造するのに使用される培地と
同じ組成の培地中で培養される。振盪しながら３７℃で
インキュベーション後、この培地を同じ培地で５０倍に
希釈し、３７℃でインキュベートして１０9細胞／ｍｌ
（ＯＤ＝１）の細胞密度を得る。混合物が１０ファージ
／細菌からなるようにファージを培養に加える。混合物
を２時間４２℃でインキュベートする。細菌性残渣をつ
いで１０分間１５,０００ｇで遠心分離して得る。
【００７３】ｄ）製造されたキチナーゼの分析 −ポリアクリルアミドゲル ６０ｎｍで測定された最適密度０.２に達した培養株１
ｍｌ由来の細菌性残渣を下記の組成の緩衝液で懸濁す
る：０.１２５ｍＭトリス−ＨＣl ｐＨ６.８、４％ド
デシル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０.００２
％ブロモフェノールブルーおよび１０％β−メルカプト
エタノール。混合物を細菌の溶解およびタンパク質の可
溶化を可能にする沸騰水中に１０分間浸す。ついで混合
物をサイズマーカーおよびセクション１で得られたＡ．
アルブムの精製キチナーゼの存在下１２.５％ポリアク
リルアミドゲル（ラエミリＵ.Ｋ.、１９７０年、ネイチ
ャー（Nature）、第２２７巻、６８０〜６８５頁）上で
電気泳動にかける。ゲルを脱色し、あらかじめクマシー
ブルーで染色後、コントロールとして使用し、同じ条件
下で処理されたＲＲＩ／ｐＢＲ３２２株に対する総タン
パク質の約２０％を示す別のバンドがＲＲＩ／ｐＥＭＲ
６８２株において存在することが判明する。このバンド
は約３９±３ｋＤａの見掛け分子量を有し、セクション
１で得られたＡ．アルブムの精製キチナーゼの見掛け分
子量よりわずかに少ない。
【００７４】−イムノブロッティング 上記の段落に記載された電気泳動条件を保つ。ゲルはク
マシーブルーで染色されない、しかしタンパク質はトゥ
ービン等、１９７９年、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンシズ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA）、第７６巻、４３５０〜４３５４
頁に記載の方法に従ってニトロセルロースフィルターに
移送し、および免疫検出はセクション８に記載のプロト
コールに従って行われる。得られたブロットは、別のタ
ンパク質が約３９±３ｋＤａの見掛け分子量を有し、セ
クション１で単離されたＡ．アルブムのキチナーゼより
わずかに少ないことを示す。ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２に
存在し、コントロール株に不在であるこのタンパク質は
Ａ．アルブムのキチナーゼに対して作られた抗体により
認識される。
【００７５】 −エシエリキア・コリ中キチン分解活性の検出 ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２株の抽出物のキチン性活性およ
びコントロール株のキチン性活性はセクション１の段落
ｂ１で要約されるモラノト等の放射化学的方法により測
定される。下記の第ＩＩ表にまとめられる結果は、ＲＲ
Ｉ／ｐＥＭＲ６８２株はコントロール株とは異なりキチ
ン性活性を有することを示す。
【表２】 第ＩＩ表 ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２株および総タンパク質１０μgを含むＯＤ＝１でのタン パク質抽出物のコントロール株のキチン性活性の比較（ブレッドフォード法によ り測定された量） キチン性活性（タンパク質ｄｐｍ／μg） コントロール株 ＲＲＩ／ｐＥＭＲ６８２株 第１実験 １２８ ２６０ 第２実験 １４５ １１５０ 第３実験 １３０ ４１０ 第４実験 １８５ ６００ 第５実験 １９５ ５６４ 第６実験 １２０ ５８３
【００７６】セクション１０： 酵母中アルファクラジ
ウム・アルブムのキチナーゼの発現およびフェロモンα
の単一ベプチドによる分泌 ａ）アファノクラジウム・アルブムの成熟キチナーゼの
発現のためのベクターであるプラスミドｐＥＭＲ６９８
の構築 プラスミドｐＥＭＲ５８３はヨーロッパ特許０２７３８
００に開示されている。特に、エシエリキア・コリおよ
びアンピシリン耐性遺伝子中複製起点を担持するプラス
ミドｐＢＲ３２２の断片、酵母中複製されるプラスミド
２μの断片、およびロイシンの栄養素要求性を補う遺伝
子およびＧａｌ７−ＡＤＨ2ハイブッリドプロモータ
ー、フェロモンα、成熟ＩＬ−８のコード化配列および
ターミネーターを含むＩＬ−８発現カッセトを含む。
【００７７】プラスミドｐＥＭＲは酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＢａｍＨＩで加水分解され、ラージＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片は精製される；この断片は酵母中で
必要な発現系を担持する。それは組み立てられ、プラス
ミドｐＥＭＲ５８３由来のラージＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片欠損Ｓ．セレビシアエのフェロモンαのプレ
プロ領域の３’配列およびＡｃｃＩ−ＢａｍＨＩ断片欠
損Ａ．アルブムの成熟キチナーゼの５’末端を再構築す
るセクション９記載のプラスミドｐＥＭＲ６８０由来の
ＡｃｃＩ−ＢａｍＨＩおよび下記； 配列番号２０（Ｎｔ２）
【化３３】 の配列合成ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｃｃＩオリゴヌクレオチ
ドと結合する。結合混合物はエシエリキア・コリＲＲＩ
株の形質転換に使用された。プラスミドｐＥＭＲ６９８
が得られる。
【００７８】ｂ）ロイシンの原栄養性の選択によるプラ
スミドｐＥＭＲ６９８によるＥＭＹ７６１酵母菌株の形
質転換 ＥＭＹ７６１株は、当技術の熟練者に周知のように、Ｆ
Ｌ１００株（ＡＴＣＣに２８３８３番号のもと寄託され
た）から得られたｕｒａ株およびＥ．Ｗ．ジョーンズ、
１９８７年、ジェネティック、第８５巻、２３頁に開示
される２０Ｂ１２株（Ｍａｔα、ｔｒｐ１，ｐｅｐ４）
とこの株の連続的交配によるＧＲＦ１８株由来の酵母菌
株Ｍａｔα、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｈｉｓ３およびｇａ
ｌである。この株はＣＮＣＭに１９９０年１２月２７日
Ｉ１０２２の番号のもと寄託された株のプラスミドの熟
成より得られ得る。使用された形質転換技術はベッグス
等により開示された技術の変形である（ベッグス等、
（１９７８年）、ネーチャー、第２７５巻、１０４〜１
０９頁）。酵母菌を浸透圧安定剤、即ち１Ｍ濃度のソル
ビトールの存在中原形質化処置をすることを含む。
【００７９】正確な形質転換プロトコールを詳細に以下
に示す： ａ）液体ＹＰＧ培地２００ｍｌ（下記の第ＩＩＩ表）を
約５×１０6細胞培養株を静止期に接種し、この方法で
接種された培養株を一夜３０℃で振盪する。 ｂ）培養物が約１０7細胞／ｍｌに達したとき、細胞を
４０００ｒｐｍ５分間遠心分離にかけ、残渣を１Ｍソル
ビトールで洗浄する。 ｃ）細胞を２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭヂチオト
レイトールを含む１Ｍソルビトール溶液５ｍｌに懸濁
し、１０分間３０℃でインキュベートする。 ｄ）細胞を１Ｍソルビトール１０ｍｌで１回洗浄し、ソ
ルビトール２０ｍｌ中に懸濁する。チモリアーゼ−１０
０Ｔ（アルソバクター・ルテウス（Arthobacter luteu
s）培養上清をアフィニティーカラム上での部分精製に
より得られ、β−１，３−グルカン−ラニナリペンタヒ
ドラーゼを含む製品、セイカガク・コウギョウによる市
販品）を最終濃度２０μg／ｍｌになるまで加え、懸濁
液を室温で約１５分間インキュベートする。
【００８０】ｅ）細胞をＹＰＧソルビトール培地と称す
る培地（以下の第ＩＩＩ表、参照）を含むソルビトール
２０ｍｌ中再懸濁し、２０分間３０℃で静かに振盪しな
がらインキュベートする。 ｆ）懸濁液を３分間２５００ｒｐｍで遠心分離にかけ
る。 ｇ）細胞を形質転換緩衝液（ソルビトール１Ｍ、トリス
-ＨＣl ｐＨ７.５ １０ｍＭおよびＣaＣl2 １０ｍＭ）
９ｍｌ中に再懸濁する。 ｈ）プラスミドｐＥＭＲ６９８のＤＮＡ溶液５μl（約
５μg）である細胞０.１ｍｌを加え、得られた懸濁液を
１０〜１５分間室温で放置する。 ｉ）以下の溶液１ｍｌを加える；ポリエチレングリコー
ルＰＥＧ４０００ ２０％、トリス-ＨＣl ｐＨ７.５
１０ｍＭおよびＣaＣl2 １０ｍＭ． ｊ）ｉ）で得られた懸濁液０.１ｍｌを前もって溶解し
たロイシン無含有固体再生培地を含む管に注入し、約４
５℃で液体を保つ。懸濁液をロイシン無含有固体再生培
地１５ｍｌの固体化相を含むペトリ皿に注入する。 ｋ）ｊ）工程をｉ）で得られた細胞懸濁液の残部を用い
て繰り返す。形質転換は３日後に現れ始める。維持され
た形質転換細胞をＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９８と称す
る。
【００８１】
【表３】 第ＩＩＩ表 セクション１０および１１で使用された主な培地 −ロイシン無含有固体培地 アミノ酸を含まない酵母窒素ベース、（ギフコ社製）６．７ｇ アデニン２０ｍｇ ウラシル２０ｍｇ ｌ−トリプトファン２０ｍｇ ｌ−ヒスチジン２０ｍｇ ｌ−アルギニン２０ｍｇ ｌ−メチオニン２０ｍｇ ｌ−チロシン３０ｍｇ ｌ−イソロイシン３０ｍｇ ｌ−リジン３０ｍｇ ｌ−フェニルアラニン５０ｍｇ ｌ−グルタミン酸１００ｍｇ ｌ−バリン１５０ｍｇ ｌ−ロイシン４００ｍｇ グルコース２０ｇ 寒天２０ｇ
【００８２】成分を蒸留水中に混合する。蒸留水で最終
容量１ｌにする。１２０℃で１５分間高圧滅菌する。高
圧滅菌後、ｌ−トレオニン２００ｍｇおよびアスパラギ
ン酸１００ｍｇを加える。 −ロイシン無含有固体再生培地 寒天２０ｇの代わりに３０ｇを混合し、混合物にソルビ
トール１８２ｇを加える以外はロイシン無含有培地の組
成を使用する。 −ロイシン無含有液体培地 寒天を省く以外は、ロイシン無含有固体培地の組成を使
用する。１５分間１２０℃で高圧滅菌する。高圧滅菌
後、ｌ−トレオニン２００ｍｇおよびｌ−アスパラギン
酸１００ｍｇを加える。 −液体ＹＰ培地 酵母抽出物１０ｇ（ディフコ社製バクト−酵母抽出物） ペプトン２０ｇ（ディフコ社製バクト−ペプトン抽出
物） 蒸留水中に成分を混合する。蒸留水で最終容量１ｌにす
る。１５分間１２０℃で高圧滅菌する。 −液体ＹＰＧ培地 液体ＹＰ培地の組成を使用し、高圧滅菌後、２０ｇ／ｌ
の濃度にグルコースを加える。 −ＹＰエタノール／グリセリン／ガラクトース培地 液体ＹＰ培地の組成を使用する。高圧滅菌後、１００％
エタノール１０ｍｌ、グリセリン３０ｇおよびガラクト
ース３０ｇを加える。
【００８３】ｃ）ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９８株によ
るＡ.アルブム（Ａ.album）のキチナーゼの発現 予備的な培養物を以下の組成の培地中で製造する：液体
ＹＰ培地１.４％、グルコース３％、ヒスチジン５０μg
／ｍｌおよびウラシル５０μg／ｍｌ。２４時間後、培
養物を遠心分離にかけ、残渣を以下の組成の培地４０ｍ
ｌ中に取る：液体ＹＰ培地１.４％、エタノール１％、
カサミノ酸１％、ウラシル１００μg／ｍｌ、グリセリ
ン３％およびガラクトース１％。
【００８４】ｄ）培養物中タンパク質の分析 −サンプルの製造 ２４時間培養後、ｃ）中で培養された細胞を２０分間遠
心分離にかけ、上清を集めた。デオキシコレート２ｍｇ
／ｍｌを含む５０％トリクロロ酢酸を上清１０ｍｌに加
えた。混合物を＋４℃で３０分間保ち、ついで３０分間
遠心分離にかけた。残渣を冷アセトン（＋４℃）約１ｍ
ｌ中に取り、３０分間再び遠心分離する。乾燥後、残渣
をトリス−ＨＣl ０.１２５Ｍ ｐＨ６.８、ＳＤＳ４
％、ブロモフェノールブルー０.００２％、グリセリン
２０％およびβ−メルカプトエタノール１０％を含むい
わゆる負荷（loading）緩衝液約２０μl中に取る（ラエ
ミリ（１９７０年）により開示されたプロトコールに従
って）。残渣を１５分間煮沸により可溶化し、ついで１
０Ｎ水酸化ナトリウムを加えて中和する。
【００８５】変性ＳＤＳゲル中電気泳動によるタンパク
質の分析はセクション９ｄ）に記載の方法により行なわ
れる。得られたプロフィルは、ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ
６９８株に存在しおよびコントロール株（非形質転換株
ＥＭＹ７６１）に存在しない付加広範囲バンドを示す。
このバンドは３６〜４６ｋＤａの分子量を有する。この
バンドの幅はたぶん２種の潜在的Ｎ−糖付加部位（Ｆi
g.１参照）を有するタンパク質の糖付加の異なる度合か
ら生じるものである。ウエスタンブロットはこのタンパ
ク質はアファノクラジウム・アルブム（Aphanocladium
album）のキチナーゼに対して作られる抗体により認識
されることを示す。
【００８６】ｅ）サッカロマイセス・セレビジア(Sacch
aromyces cerevisiae)培養上清中キチン分解活性の検出 ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９８株およびコントロール株
の培養上清の抽出物のキチン分解活性はセクション１の
段落ｂ１に要約されるモラノズ放射化学的方法（１９７
７年、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Bi
ochem.）、第８３巻、６４８〜６５６頁）により測定さ
れる。結果は第ＩＶ表にまとめられ、プラスミドｐＥＭ
Ｒ６９８により形質転換された株の培養上清のキチン分
解活性がコントロール株の培養上清のものより強いこと
を示す。
【００８７】
【表４】 第ＩＶ表 ダイアフィルトーレションにより濃縮され、総タンパク質（ブッラドフォード法 により測定された量）１０μgを含む培養上清の抽出物につき酵母菌株ＥＭＹ７ ６１／ｐＥＭＲ６９８およびコントロール株のキチン分解活性、各値は４個の別 個の測定値の平均値である キチン分解活性（ｄｐｍ／μgタンパク質） 対照株 ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９８株 実験１ １５６ ７３０ 実験２ ２７０ ５６０ 実験３ １２０ ７５０
【００８８】セクション１１：酵母中Ａ.アルブム（A.
album）のキチナーゼの発現およびそれ自身のシグナル
ペプチドでの促進による分泌 ａ）プラスミドｐＥＭＲ６９７、アファノクラジウム・
アルブム（Aphanocladium album）のプロプロ−キチナ
ーゼの発現のためのベクターの構築 プラスミドｐＥＭＲ４７３は、ヨーロッパ特許出願０４
０８４６１に開示されている。特に、エシエリキア・コ
リ（E. coli.）の複製の起点を担持するプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の断片およびアンピシリン耐性遺伝子、酵母中
複製をもたらすプラスミドの断片２μおよびロイシンの
栄養要求を補足する遺伝子、およびＧａｌ７−ＡＤＨ2
ハイブリッドプロモーター、Ａ．フラブス（A. flavu
s）の尿酸オキシダーゼをコード化する配列およびター
ミネーターを含むアスペルギヌス・フラブスの尿酸オキ
シダーゼの発現のためのカッセトもまた含む。
【００８９】プラスミドｐＥＭＲ４７３は部分的にＣｌ
ａＩおよび完全にＢａｍＨＩで加水分解される。精製さ
れたラージＢａｍＩ−ＣｌａＩ断片は尿酸オキシダーゼ
コード化遺伝子が除去している全プラスミドである。こ
の断片は、配列（Ｎｔ３）の合成オリゴヌクレオチド、
これは尿酸オキシダーセの相補性ＤＮＡの非コード化
３’末端、Ａ．アルブムのキチナーゼのプレプロ−配列
の５’末端およびｐＥＭＲ６８０のＰｓｔ−ＢａｍＨＩ
断片を接合を可能にし、Ａ．アルブムのキチナーゼのコ
ード化配列の３’部分を担持する、の存在下で結合され
る結合混合物はエシエリキア・コリ（Ｅ. coli.）ＲＲ
Ｉを形質転換するのに使用される。得られたプラスミド
はｐＥＭＲ６９７である。 配列番号２１（Ｎｔ３）
【化３４】
【００９０】ｂ）ロイシンの原栄養性の選択によるプラ
スミドｐＥＭＲ６９７によるＥＭＹ７６１酵母菌株の形
質転換 セクション１０ｂ）参照。 形質転換細胞はＥＭＹ４６１／ｐＥＭＲ６９７と称す
る。 ｃ）ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９７株の培養 セクション１０ｃ）参照。 ｄ）培養倍地中タンパク質存在の分析 セクション１０ｄ）参照。 ｅ）サッカロマイセス・セレビジア（Saccharomyces ce
revisiae）中のキチン性活性の検出 セクション１０ｅ）参照。 結果を下記の第V表にまとめる。
【００９１】
【表５】 第V表 キチン分解活性および総タンパク質１０μgを含む培養上清の抽出物について酵 母菌株ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９７とのコントロール株の比較 （ブラフォードズ法により測定される量） キチン分解活性（ｄｐｍ／μgタンパク質） コントロール株 ＥＭＹ７６１／ｐＥＭＲ６９７株 実験１ １５６ ６２４ 実験２ ２７０ ２８１９ 実験３ １２０ ３５０
【００９２】セクション１２：植物細胞中アファノクラ
ジウム・アルブム（Aphanocladium album）のキチナー
ゼの発現のための２種のベクターの構築 ａ）シグナルペプチドが先行するＡ.アルブムの成熟キ
チナーゼコード化遺伝子の製造 構築１：Ａ．アルブムのプレプロ−キチナーゼコード化
遺伝子 Ａ.アルブムのプレプロ−キチナーゼのコード化配列を
担持する相補的ＤＮＡはセクション１１に記載のよう
に、制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩでベクターｐＥ
ＭＲ６９７の切断して得られた。得られた断片を低融解
アガロースゲルで電気泳動により精製した。この断片
は、アファノクラジウム・アルブムのプレプロ−キチナ
ーゼの相補的ＤＮＡのコード化配列を担持し、開始ＡＴ
ＧはＣｌａＩ部分を担持する１１ｂｐ断片が先行してい
る。この断片は、一方では、ＢａｍＨＩ部分を再構築す
るためにＢａｍＨＩ部分を５’末端におよびＣｌａＩ部
分を３’末端に担持した下記の配列（Ｎｔ４）のオリゴ
ヌクレオチドと５’末端で結合され、および他の一方
は、ＳａｃＩ部分を再構築するために、５’末端で粘着
性部分およびＢａｍＨＩ部分および３’末端でＳａｃＩ
部分を担持する以下の配列（Ｎｔ５）のオリゴヌクレオ
チドと３’末端で結合している。得られた断片は、５’
末端でＢａｍＨＩ部位および３’末端でＳａｃＩ部位で
区切られたアファノクラジウム・アルブムのプレプロ−
キチナーゼの相補性ＤＮＡのコード化配列を含む。これ
らの２個の部位は、ついでプロモーターおよびターミネ
ーターで挿入されるであろう。
【００９３】使用されたオリゴヌクレオチドの配列を以
下に記載し、制限部分を括弧内に示す。 配列番号２２ （Ｎｔ４）
【化３５】 配列番号２３（Ｎｔ５） ＢａｍＨＩと一致
【化３６】 結合はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行なわれる。
【００９４】構築２：豆キチナーゼのシグナルペプチド
が先行するアファノクラジウムの成熟キチナーゼのコー
ド化遺伝子 アファノクラジウム・アルブムの成熟キチナーゼのコー
ド化配列の部分を担持する相補的ＤＮＡは、セクショク
ン９記載のように、プラスミドｐＥＭＲ６８０からエン
ドヌクレアーゼＡｃｃＩおよびＢａｍＨＩで部分分解し
て得られた。最初の２３塩基対を除いてＡ．アルブムの
成熟キチナーゼのコード化部分を含む約１１００塩基対
の得られた断片は、一方では下記の配列（Ｎｔ６）のオ
リゴヌクレオチドと５’末端で、およびもう一方で配列
（Ｎｔ５）オリゴヌクレオチドと３’末端で結合されて
いる。オリゴヌクレオチド（Ｎｔ６）は、５’末端でＢ
ａｍＨＩ部分、豆キチナーゼのシグナルペプチドをコー
ド化する配列（ブログリＫ.Ｅ.等、１９８６年、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.）、第８３巻、６８２０−
６８２４頁）、Ａ．アルブムの成熟キチナーゼから欠損
している最初の２３塩基対および３’末端でのＡｃｃＩ
部分を含む。得られた断片はアファノクラジウム・アル
ブムの成熟キチナーゼのコード化配列を含み、これは豆
キチナーゼのシグナルペプチドのコード化配列に融合
し、順に５’末端でＢａｍＨＩ部分および３’末端でＡ
ａｃＩ部分により区切られている。
【００９５】使用されたオリゴヌクレオチドの配列（Ｎ
ｔ６）を下記に掲げ、制限部位を括弧内に示す。 配列番号２４（Ｎｔ６） （ＢａｍＨＩ）
【化３７】
【００９６】ヌクレオチド配列の下に示される豆キチナ
ーゼのシグナルペプチドコード化配列（Ｎｔ６）の部分
および上記のシグナルペプチドの推論されるアミノ酸配
列は以下に示される： 配列番号２５
【化３８】 ｂ）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓを含むプロ
モーターを含むプロモーター配列の製造 ３５Ｓプロモーターを含む約９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片は、エンドヌークレアーゼＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断され、続いてアガロース
ゲル上で電気泳動にかけ、プラスミド（ｐＢＩ１２１）
から分離される。この断片は再びＨｉｎｄＩＩで切断さ
れる。ＢａｍＨＩ部位を担持する約４１０ｂｐの断片は
ＨｉｎｄＩＩＩのリンカーの存在下Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で処理される（ＨｉｎｄＩＩＩ部分を含む合成配列）。
エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断およびアガロ
ースゲル上での電気泳動後、生じたＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約４２０ｂｐ）は、単離され、精製され
る。
【００９７】ｃ）アグロバクテリウム・トゥメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンタ
ーゼ（nopaline synthase；ＮＯＳ）のターミネーター
を含むターミネーター配列の製造 ノパリンシンターゼのターミネーターを含む約２５０ｂ
ｐの断片が、制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで切
断、ついでアガロースゲル上での電気泳動によりプラス
ミドｐＢＩ１２１（クローンテック）から単離される。
【００９８】二元性ベクターｐＢＩＮ１９へのクローニ
ング Ｔ４ＤＮＡリガーゼはプロモーター配列（セクション１
２ｂ）、参照）、構築１および２のキチナーゼ相補性Ｄ
ＮＡのコード化配列およびターミネーター配列（セクシ
ョン１２ｂ参照）をエンドヌークレアーゼＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＥｃｏＲＩで開かれた二元性ベクターｐＢＩＮ
１９へ結合するのに使用された。このベクターは２種の
カナマイシン耐性遺伝子を担持し、一方は細菌中発現可
能であり、他の一方は、完全組換え遺伝子のすぐ上流に
位置し（ビーバン、１９８４年、ニュークレイック・ア
ッシズ・リサーチ（Nucl. Ac. Res.）、第１２巻、８７
１１〜８７２１頁）、植物細胞への転換が可能である。
カナマイシン耐性遺伝子は選択マーカーとして形質転換
の工程および形質転換された植物の子孫の分析に使用さ
れるであろう。得られたベクターは、もし構築１を含む
なら、プラスミドｐＢＲ６１と称し、もし構築２を含む
なら、プラスミドｐＢＲ６２と称する。完全組換え遺伝
子のヌクレオチド配列はプラスミドｐＢＲ６１およびｐ
ＢＲ６２の各々を配列化することにより証明された。Ｂ
ａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部分により区切られたこの
遺伝子のコード化配列は、ｐＢＲ６１についてＦig.４
にプラスミドおよびｐＢＲ６２についてプラスミドＦi
g.５に示される。これらのプラスミドはＥ・コリＪＭ１
０９株（ストレタジーン）へクローンされる。
【００９９】セクション１３：アグロバクテリウム・ト
ゥメファシエンスへのアファノクラジウム・アルブムの
キチナーゼコード化遺伝子を含むプラスミトｐＢＲ６１
およびｐＢＲ６２の転換 ａ）アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobac
terium tumefaciens)への転換 この転換は、以下に記載されたようにベクターｐＢＲ６
１またはｐＢＲ６２を含むイ・コリＪＭ１０９株（サン
ブロック等、上掲）および可動化プラスミドｐＲＫ２０
１３（Ｓ．Ｍ．フィガルスキー等、１９７９年、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・ユーエスエー（Proc. Ntl. Acad.Sci．USA）、第
７６巻、１６４８〜１６５２頁）を含むエシエリキア・
コリ（Ｅcoli.）ＨＢ１０１で補足されるアグロバクテ
リウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefacie
ns)ＬＢＡ４４０４株（クローンテック）間で三親接合
して以下のように行われる。プラスミｐＰＢＲ６１また
はｐＢＲ６２を含むイ・コリＪＭ１０９株および可動化
プラスミドｐＲＫ２０１３を含むイ・コリＨＢ１０１株
（クローンテック）はカナマイシン２５ｍｇ／ｌの存在
下ルリア培地（ギブコ）中３７℃で培養される。
【０１００】アグロバクテリウム・トゥメファジエンス
(Agrobacterium tumefaciens)ＬＢＡ４４０４はリファ
ンピシン１００ｍｇ／ｌ（この抗生物質に耐性である）
の存在下ルリア培地（ギブコ）中２８℃で培養される；
３種の培養物各々の２００μlを混合し、ルリア培地を
含むゲロース上にプレートされ、一夜２８℃でインキュ
ベートされる。細菌をついでルリア培地５ｍｌ中に再懸
濁し、アリコートを最小ゲロース培地（プラント・モレ
キュラー・バイオロジー・マニュアルに記載される、ゲ
ルビン等、キューエル・アカデミック・プレス、１９８
８年）を含むペトリ皿上にリファンピシン１００ｍｇ／
ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌ存在中に置く。プラ
スミドｐＢＲ６１またはプラスミドｐＢＲ６２を融合し
たアグロバクテリウム・トゥメファジエンスのこれらの
コロニーのみがそれらの条件下（イ・コリ株はそれらの
条件下成育できない。）で成育する。上記のコロニーは
その複製が可能な状況でキチナーゼの組換え遺伝子を含
む。
【０１０１】両方の抗生物質に対する選択されたコロニ
ーの耐性は連続して２回の同じ選択培地上コロニーの継
代培養により証明される。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンス中キナーゼの組換え遺伝子の存在は、総Ｄ
ＮＡ製造であるサザンブロット法（細胞の溶解、上記で
引用された文献中ゲルビンにより記載されたプロトコー
ルに従ってフェノール／クロロホルム混合液の抽出によ
るＤＮＡの精製、制限酵素での精製ＤＮＡの切断、アガ
ロースゲル上での電気泳動、膜への転換および当技術の
熟練者に公知の技術によるハイブリッド形成）により証
明される。
【０１０２】ｂ）アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ag
robacterium rhizogenes）への転換 この転換は、ゲルッヒ等、（１９８７年）、モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティック（Mol.Gen.Ge
net.）、第２０６巻、３８２頁に開示されたアグロバク
テリウム・リゾゲネスＡ４株を用いて、ａ）に記載のア
グロバクテリウム・トゥメファシエンスへの転換と同様
の方法で行われる。
【０１０３】 セクション１４：形質転換されたタバコ草の製造 インビトロで培養されたタバコ ニコチニアナ・タバク
ム（Nicotiana tabacum）は当技術（ホルシュＲ．Ｂ．
等、１９８５年、サイエンス(Science)、第２２７巻、
１２２９〜１２３１頁）の熟練者に公知であり、その主
な工程が下記に説明されるホルシュ等の製法に従って、
プラスミドｐＢＲ６１またはｐＢＲ６２を含むアグロバ
クテリウム・トゥメファシエンスで感染させた。タバコ
Ｎ．タバクム（病原性真菌に感受性のウイスコンシン
ハバナ３８変種）の純粋培養植物の葉のディスクスは
プラスミドｐＢＲ６１またはｐＢＲ６２を含むＡ．トゥ
メファシエンス（Ａ．tumefaciens）の培養中でインキ
ュベートする。ワットマン紙で除水したディスクスはペ
トリ皿中培養培地に移し、形質転換細胞を倍増し、カル
スを得、ついで再生された植物を得た。
【０１０４】セクション１５：形質転換されたタバコカ
ルスおよび植物葉中Ａ．アルブムのキチナーゼの発現の
検出 ａ）形質転換されたタバコの粗タンパク質抽出物の製造 組織の断片（カルスまたは植物葉）を液体窒素中凍結
し、粉末にし、−２０℃で放置する。粉末をｐＨ５.２
の０.１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液の存在下４℃で抽出
し、１００００ｇで遠心分離にかける。総タンパク質を
上澄においてブラッフォーズ法（ブラッソフォード Ｍ.
Ｍ.、１９７６年、アナリティカル・バイオケミストリ
ー（anal. Biochem.）、第７２巻、２４８〜２５頁）に
従って決定する。
【０１０５】ｂ）イムノブッロティング（ウエスタンブ
ロット）による組換えキチナーゼの検出 種々の形質転換されたカルス（または植物葉）および形
質転換されていないカルス（または植物葉）（コントロ
ール）の粗タンパク質の抽出物は、当技術の熟練者に公
知であり、トゥービン等、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー
（Proc. Ntl. Acad. Sci. USA）、第７６巻、１９７９
年、４３５０〜４３５４頁に記載され、以下の工程： −（ラエミリ、，Ｕ．Ｋ．ラエミリ、ネーチャー(Natur
e)、第２２７巻、１９７０年、６８９〜６８５頁により
開示されたプロトコールに従って）トリス−ＨＣｌ
０．１２５Ｍ ｐＨ６．８、ＳＤＳ ４％、ブロモフェ
ノールブルー ０．００２％、グリセリン２０％および
β−メルカプトエタノール １０％を含む、充填緩衝液
と称する緩衝液中１００℃１０分間加熱による変性； −ラエミリ（上掲）により開示されたプロトコールに従
って可溶化物中に含まれる種々のタンパク質の電気泳動
分離； −ゲル中に含まれる上記のタンパク質のＰＶＤＦ膜への
電気転換（Ｈ．トゥービン等、プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acd. Sci. USA）、第７６巻、１９７
９年、４３５０〜４３５４頁の方法に従って）。 を含むウエスタンブロットに付される。
【０１０６】免疫検出は、以下の工程： −タンパク質が少なくとも２時間３７℃で３％ゼラチン
溶液中インキュベートして転換されたＰＶＤＦ膜の飽
和； −０．０５％トウィーン２０洗浄剤を含むリン酸緩衝化
食塩水での３回の洗浄 −リン酸緩衝化食塩水で１／１００００に希釈され、あ
らかじめ製造された免疫血清（組換えタンパク質を認識
するポリクローナル抗体を含む）の存在下のインキュベ
ーション（１時間３７℃）； −０．０５％トウィーン２０洗浄剤を含むリン酸緩衝化
食塩水での３回の洗浄。 を含むプロトコールに従って行われる。抗原−抗体複合
体は、ついで製造者の指示に従ってアマシャム社製ＲＰ
Ｎ２３キット（ブロティング検出キット）を使用してア
ルカリホスファターゼで接合したストレプタビデン−ビ
オチン系によって展開する。得られたブロットは、プラ
スミドｐＢＲ６１およびｐＢＲ６２の各々により形質転
換されたタバコカルスおよび植物葉の約４１±３ｋＤａ
の見掛け分子量を有するタンパク質の存在を示し、コン
トールカルスおよび植物葉には存在しない。このタンパ
ク質は、セクション１で得られたＡ．アルブムの精製キ
チナーゼと同じ見掛け分子量を有する。
【０１０７】 ｃ）組換えキチナーゼのキチン分解活性の検出 プラスミドｐＢＲ６１およびｐＢＲ６２の各々により形
質転換されたタバコカルスおよび植物葉の５種の粗タン
パク質抽出物および形質転換されていないタバコカルス
および植物葉の５種の粗タンパク質抽出物のキチン活性
は、セクション１ｂ１に開示されたモラノ等の放射化学
的方法により測定される。内在性のキチン活性に関し
て、組換えキチナーゼのキチン活性を示す簡単な方法
は、特に後者を抗体で不活性化することおよび抽出物の
総キチン分解活性において落下を観察することである。
これらの粗抽出物１０μｌを５分間室温でＡ．アルブム
（セクション１ｃで製造された）のキチナーゼに対して
作られたポリクローナル抗体の１μｌと接触させる。こ
れらの粗製の抽出物／抗体の混合物のキチン分解活性は
モラノ等の放射化学的方法によっても測定される（セク
ション１ｂ）、参照）。
【０１０８】プラスミドｐＢＲ６１およびｐＢＲ６２の
各々により形質転換されたタバコカルスおよび植物葉の
粗タンパク質の抽出物のキチン分解活性は形質転換され
ていないカルスおよび植物葉の等量の抽出物のそれより
有意に高い。Ａ．アルブムのキチナーゼに対する抗体の
存在下インキュベート後、プラスミドｐＢＲ６１および
ｐＢＲ６２の各々により形質転換されたタバコカルスお
よび植物葉の抽出物活性は増大するが、コントロールで
あるカルスおよび植物葉の抽出物の活性は影響されな
い。従って、タバコ中に発現されたＡ．アルブムの組換
えキチナーゼはキチン分解活性を有する。
【０１０９】ｄ）組換え過多キチナーゼの精製およびそ
のアミノ末端配列の決定 ｄ１）組換え型キチナーゼの精製 組換え型タンパク質は、プラスミドｐＢＲ６１およびｐ
ＢＲ６２各々により形質転換されたタバコ葉の粗タンパ
ク質抽出物から硫酸アンモニウムでの沈澱により、つい
で以下のプロトコールに従って架橋アガロース上で合成
ポリマーをベースとするカチオン交換カラム上でファル
マシアのＦＰＬＣ技術により液体クロマトグラフィーに
かけて精製した。
【０１１０】組換え型キチナーゼの精製のプロトコール 工程１：タンパク質抽出物を硫酸アンモニウム（６０％
飽和溶液）で沈澱する。沈澱させたタンパク質を遠心分
離（１５，０００ｇ、３０分）にかけて回収し、ついで
緩衝溶液（１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５.２）
に可溶化し、ｐＨ５.２の１００ｍＭ酢酸アンモニア緩
衝溶液で４℃で一夜透析する。手続前すぐに、タンパク
質抽出物の緩衝液の濃度は、使用の準備がされたミニカ
ラム（ファルマシアＰＤ１０）を通して１０ｍＭにす
る。 工程２：タンパク質抽出物をついで合成ポリマーをベー
スとするイオン交換カラム（ファルマシア製モノＳカラ
ム）上でファルマシアのＦＰＬＣ技術により液体クロマ
トグラフィーにかけて精製する。ｐＨ５.２の１０ｍＭ
酢酸アンモニウム緩衝溶液で平衡化されたモノＳカラム
に入れる。カラムに保たれたタンパク質を１０〜５００
ｍＭ酢酸アンモニウムの直線勾配により溶出する。各工
程において、キチナーゼを分子量（銀を有するＳＤＳ展
開剤の存在下ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動
法）、イムノブロット（セクション８ｂ、参照）および
セクション１のｂ１に記載された放射化学的方法により
測定される活性により同定する。
【０１１１】 ｄ２）組換え型キチナーゼのアミノ末端配列の決定試験 上記のプロトコールに従って組換え型キチナーゼの精製
後、アミノ末端の配列決定を実施した。処理すべきサン
プルを、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル上での
電気泳動後、ＨＣl．トゥービン等、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、（１９７９
年）、４３５０〜４３５４頁、により開示された方法に
従って電気伝達してＰＶＤＦ（ポリビニルデンジフルオ
リド）フィルターの表面上に置く。フィルターを、クロ
マトグラフ（アプライド・バイオシステムズ製モデル４
３０）を備えたタンパク質シークエンサー（モデル４７
０Ａ、アプライド・バイオシステムズ（アメリカ合衆
国）による市販品）に入れ、各々の分解サイクル後生成
したフェニルチオヒダントン誘導体を連続して分析す
る。以下の末端配列をプラスミドｐＢＲ６１およびｐＢ
Ｒ６２により形質転換されたタバコ葉から得られた組換
え型タンパク質について得る。 配列番号２６
【化３９】 従って、シグナルタンパク質の切断は予期された部位に
起こる。
【０１１２】 セクション１６：形質転換されたナタネの製造 形質転換はＰ．ゲルッヒ等のプロトコールに従って行わ
れる（Ｐ．ゲルッヒ等、１９８７年、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol. Gen. Gene
t.）、第２０６巻、３８２頁）。異なる培地がペリテエ
ール等により開示される（ペリテエール等、１９８３
年、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Mol. Gen. Genet.）、１９１〜２４４頁）。それ
らの組成物を以下で説明する（第ＶＩ表）。 ａ）形質転換された根の製造 幹切片を約１ｍの高さのナタネ（グラシカ・ナプス春変
種フルトール、ウエスターおよび冬変種）の先端から取
る。これらの切片は表面を殺菌し、殺菌水に浸け、約
１.５ｃｍの長さの切片に切り、培地Ａを含む管内に置
く。この切片の末端をプラスミドｐＢＲ６１またはｐＢ
Ｒ６２を含むアグロバイテリウム・リンゲネス（Agarob
acterium rhizogenes）株の懸濁液に置くことにより接
種する。形質転換された根は、１ないし２週間後、幹切
片に現れ、それらを取り、ゲロース（１５ｇ／ｌ）を含
み、５００μｇのセフォタキシム／ｍｌを補足した培地
Ｂ上に置く。
【０１１３】ｂ）形質転換された植物の製造 根の断片を１５日間２，４−ジクロロフェノキシ酢酸３
ｍｇ／ｌを含む培地Ｄでインキュベートし、ついで芽を
誘発するためにＲＣＣ培地に置く根付かせた植物をつい
で培地ＦおよびＧに芽の転換により得る（以下の第ＶＩ
表）。
【表６】
【表７】
【表８】
【０１１４】セクション１７：形質転換されたナタネ根
中Ａ．アルブムのキチナーゼの発現の検出 ａ）ナタネ根を形質転換された粗タンパク質の抽出物の
製造 抽出物はセクション１５ａ）に示されるように製造され
た。
【０１１５】ｂ）イムノブロッティング（ウエスタンブ
ロット）により組換えキチナーゼの検出 適用されたプロトコールはセクション１５ｂ）にすでに
記載されたものである。得られたブロットは、約４１±
３ｋＤａの見掛けの分子量を有するタンパク質を示し、
プラスミドｐＢＲ６１またはプラスミドｐＢＲ６２によ
り形質転換された根に存在し、コントロールとして使用
された形質転換されていない根の抽出物には存在しな
い。このタンパク質は、セクション１で得られたＡ．ア
ルブムの精製された天然キチナーゼと同じ見掛け分子量
を有する。
【０１１６】 ｃ）組換えキチナーゼのキチン分解活性の検出 形質転換されたナタネ根の５種の粗タンパク質抽出物お
よび形質転換されていない根の５種の粗抽出物はセクシ
ョン１ｂ１に記載されたモラノ等の放射化学法により測
定される。内在性のキチン分解活性に関して、組換えキ
チナーゼのキチン分解活性を示す簡単な方法は抗体で後
者を不活性化し、抽出物のキチン分解活性において落下
を観察することである。これらの粗抽出物１０μｌを５
分間室温でＡ．アルブム（セクション１ｃで製造され
た）のキチナーゼに対して作られたポリクローナル抗体
の１μｌを接触させる。これらの粗製の抽出物／抗体の
混合物のキチン分解活性はモラノ等の放射化学的方法に
よってもまた測定される（セクション１ｂ、参照）。
【０１１７】形質転換された根の粗タンパク質の抽出物
のキチン分解活性は形質転換されていない根の等量の抽
出物のそれより有意に高い。Ａ．アルブムのキチナーゼ
に対する抗体の存在中インキュベート後、形質転換され
た根の抽出物の活性は増大するが、形質転換されていな
い根の抽出物の活性は修飾されていない。従って、ナタ
ネ中発現されたＡ．アルブムの組換えキチナーゼはキチ
ン分解活性を有する。
【０１１８】配列の長さ：３８９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 クローン：エンドキチナーゼ活性を有する蛋白質 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： 配列
【化４０】
【化４１】
【０１１９】配列の長さ：８９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：プレプロエンドチアペプシンのシグナルペプ
チド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： 配列
【化４２】
【０１２０】配列の長さ：２４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：シグナルペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： 配列
【化４３】
【０１２１】配列の長さ：２２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：シグナルペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： 配列
【化４４】
【０１２２】配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： 配列
【化４５】
【０１２３】配列の長さ：１１６７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： 配列
【化４６】
【０１２４】配列の長さ：６６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： 配列
【化４７】
【０１２５】配列の長さ：３６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： 配列
【化４８】
【０１２６】配列の長さ：１４０５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：97..198 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：１９９．．１３６５ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：97..1365 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： 配列
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【０１２７】配列の長さ：４２３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： 配列
【化５２】
【化５３】
【０１２８】配列の長さ：１７０１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（genomic） 配列の特徴： 特徴を表す記号：intron 存在位置：266..320 他の情報：／数＝１ 特徴を表す記号：intron 存在位置：420..472 他の情報：／数＝２ 特徴を表す記号：intron 存在位置：523..571 他の情報：／数＝３ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：join(126..265,321,419,473,522,572..155
1） 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：126..227 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：join(228..265,321,419,473,522,572..155
1） 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： 配列
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【０１２９】配列の長さ：４２３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： 配列
【化５７】
【化５８】
【０１３０】配列の長さ：１３６４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３： 配列
【化５９】
【０１３１】配列の長さ：１３２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４： 配列
【化６０】
【０１３２】配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：３ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：９ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１８ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５： 配列
【化６１】
【０１３３】配列の長さ：８塩基対 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６： 配列
【化６２】
【０１３４】配列の長さ：１２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７： 配列
【化６３】
【０１３５】配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８： 配列
【化６４】
【０１３６】配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９： 配列
【化６５】
【０１３７】配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０： 配列
【化６６】
【０１３８】配列の長さ：３４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１： 配列
【化６７】
【０１３９】配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２： 配列
【化６８】
【０１４０】配列の長さ：３８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３： 配列
【化６９】
【０１４１】配列の長さ：５８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４： 配列
【化７０】
【０１４２】配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５： 配列
【化７１】
【０１４３】配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６： 配列
【化７２】
【０１４４】配列の長さ：１０９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７： 配列
【化７３】
【０１４５】配列の長さ：２７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８： 配列
【化７４】
【０１４６】配列番号：５−１ 配列の長さ：８１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９： 配列
【化７５】
【０１４７】
【配列表】
【０１４８】配列番号：１ 配列の長さ：３８９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 クローン：エンドキチナーゼ活性を有する蛋白質 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： 配列 Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｙｒ １ ５
１０ １５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ ２０ ２５
３０ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ３５ ４０
４５ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｒｐ ５０ ５５
６０ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ １００ １０５
１１０ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ １１５ １２０
１２５ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ １３０ １３５
１４０ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ １８０ １８５
１９０ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ １９５ ２００
２０５ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｎ ２１０ ２１５
２２０ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｍｅｔ ２４５
２５０ ２５５ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ２６０ ２６５
２７０ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｒｐ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｙｒ ２７５ ２８０
２８５ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ ２９０ ２９５
３００ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ ３２５
３３０ ３３５ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ３４０ ３４５
３５０ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ ３５５ ３６０
３６５ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ ３７０ ３７５
３８０ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ ３８５
【０１４９】配列番号：２ 配列の長さ：２２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：シグナルペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： 配列 Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln 1 5 10 15 Ala Val Thr Ala Leu Ala 20
【０１５０】配列番号：３ 配列の長さ：２７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８： 配列 Met Lys Lys Asn Arg Met Met Met Met Ile Trp Ser Val Gly Val Val 1 5 10 15 Trp Met Leu Leu Leu Val Gly Gly Ser Tyr Gly 20 25
【０１５１】配列番号：４ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： 配列 Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu Lys Arg 1 5 10
【０１５２】配列番号：５ 配列の長さ：１１６７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： 配列 GGTAGTGGTT TTGCAAATGC CGTCTACTTC ACCAACTGGG GCATTTATGG CCGCAACTTC 60 CAGCCTGCCG ACCTTCCTGC CTCGGAGATT ACTCACGTAC TCTACTCCTT CATGAATGTC 120 CGCGCAGATG GCACCATCTT TTCCGGTGAT ACCTATGCCG ACTACGAGAA GCACTACGCT 180 GGTGACTCTT GGAACGATGT GGGCACGAAC GCTTACGGTT GTGTTAAGCA ACTTTATCTT 240 CTCAAGAAGC AGAACCGCAA CATGAAGGTG ATGCTGTCGA TTGGTGGTTG GACATGGTCT 300 ACCAACTTCC CCGCTGCCGC CAGCTCGGCT GCTACCCGAA AGACTTTTGC TCAGTCTGCT 360 GTTGGCTTCA TGAAGGACTG GGGTTTCGAC GGTATTGATA TCGACTGGGA GTACCCCGCC 420 GATGCCACTC AGGCTCAGAA TATGGTTCTC TTGCTACAGG CTGTCCGCAG TGAGCTCGAC 480 TCCTACGCTG CCCAGTACGC CAAGGGTCAC CACTTCCTGC TTTCAATTGC CGCCCCTGCT 540 GGACCTGACA ATTATAACAA GCTGAAGTTT GCTGAGCTTG GCAAGGTTCT CGATTACATT 600 AACCTCATGG CTTACGATTA CGCTGGATCT TGGAGCAACT ACACTGGCCA CGATGCCAAC 660 ATATACGCAA ACCCGCAGAA CCCCAACGCC ACCCCTTACA ACACGGACGA TGCTGTCCAG 720 GCCTATATCA ACGGCGGCGT CCCTGCCAAC AAGATCGTCC TTGGTATGCC AATCTACGGC 780 CGATCCTTCC AGCAAACCGA GGGTATCGGT AAGCCTTACA ATGGTATTGG CTCTGGTAGC 840 TGGGAGAACG GTATCTGGGA CTACAAGGCT CTCCCCAAGG CTGGTGCCAC CGTCAAGTGC 900 GACGATACCG CCAAGGGATG CTACAGCTAC GATCCAAGCA CTAAGGAGCT TATTTCTTTC 960 GATACGCCGG CTATGATCAG CACCAAAGTT AGCTGGCTCA AGGGCAAGGG CCTTGGCGGC 1020 AGCATGTTCT GGGAGGCTTC TGCCGACAAG AAGGGCTCGG ACTCTCTTAT TAGCACCAGC 1080 CACCAAGGTC TCGGTAGCCA GGACAGCACT CAGAACTACC TCGACTACCC TAACTCCAAG 1140 TACGACAACA TCAAGAAGGG CATGAAC 1167
【０１５３】配列番号：６ 配列の長さ：６６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： 配列 ATGTTGAGCT TTGTCAAAAA GTCGATCGCC TTGGTGGCGG CCCTGCAGGC GGTCACTGCC 60 CTGGCC 66
【０１５４】配列番号：７ 配列の長さ：３６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： 配列 ACGCCAATCT CCAGTGAAGC TGGTGTTGAG AAGCGC 36
【０１５５】配列番号：８ 配列の長さ：８１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 クローン：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８をコードする配列 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９： 配列 ATGAAGAAGA ATAGGATGAT GATGATGATA TGGAGCGTAG GAGTGGTGTG GATGCTGTTG 60 TTGGTTGGAG GAAGCTACGG A 81
【０１５６】配列番号：９ 配列の長さ：８９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：プレプロエンドチアペプシンのシグナルペプ
チド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： 配列 Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gln His Val Gly Ile Pro Val Asn 20 25 30 Ala Ser Pro Glu Val Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gln Val Arg 35 40 45 Asn Pro Asn Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Val Lys Lys Thr Tyr 50 55 60 Leu Lys Tyr Gly Val Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Val Gln 65 70 75 80 Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu Arg 85
【０１５７】配列番号：１０ 配列の長さ：２４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：シグナルペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： 配列 Ｍｅｔ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ ２０
【０１５８】配列番号：１１ 配列 Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｙｒ １ ５
１０ １５ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｌａ ２０
【０１５９】配列番号：１２ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：３ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：９ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１５ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：３ 他の情報：／注＝Ｎ＝イノシン 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５： 配列 GGI TTT/C GCI AAT/C GCI GTI TAT/C TTT/C AC Gly Phe Ala Asn Ala Val Tyr Phe
【０１６０】配列番号：１３ 配列の長さ：１２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７： 配列 GATCCGGGCC CT
【０１６１】配列番号：１４ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８： 配列 (1)5' CAAATGCCGTCTACTTCACC 3'
【０１６２】配列番号：１５ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９： 配列 (2)5' CCTCATGGCT TACGATTACG 3'
【０１６３】配列番号：１６ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０： 配列 (3)5' TCCAACCTCG AGCATCAATC 3'
【０１６４】配列番号：１７
【０１６５】配列番号：１８ 配列の長さ：３４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 クローン：ペプチド 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１： 配列 Met Leu Ser Phe Val Lys Lys Ser Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln 1 5 10 15 Ala Val Thr Ala Leu Ala Thr Pro Ile Ser Ser Glu Ala Gly Val Glu 20 25 30 Lys Arg
【０１６６】配列番号：１９ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：
【０１６７】配列番号：２０ 配列の長さ：３８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３： 配列 AGC TTG GAT AAA AGA GGT AGT GGT TTT GCA AAT GCC GT AC CTA TTT TCT CCA TCA CCA AAA CGT TTA CGG CAG A (AccI)
【０１６８】配列番号：２１ 配列の長さ：５８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４： 配列 CGA TAT ACA CAA TGT TGA GCT TTG TCA AAA AGT CGA T ATA TGT GTT ACA ACT CGA AAC AGT TTT TCA GCT TCG CCT TGG TGG CGG CCC TGC A AGC GGA ACC ACC GCC GGG
【０１６９】配列番号：２２ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：
【０１７０】配列番号：２３ 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：
【０１７１】配列番号：２４ 配列の長さ：１０９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７： 配列 GATCCATGAA GAAGAATAGG ATGATGATGA TGATATGGAG CGTAGGAGTG GTGTGGATGC 60 1--------+ ---------+ ---------+ ---------+ ---------+ ---------+ GTACTT CTTCTTATCC TACTACTACT ACTATACCTC GCATCCTCAC CACACCTACG TGTTGTTGGT TGGAGGAAGC TACGGAGGTA GTGGTTTTGC AAATGCCGT 109 61--------+ ---------+ ---------+ ---------+ --------- ACAACAACCA ACCTCCTTCG ATGCCTCCAT CACCAAAACG TTTACGGCAG A (AccI)
【０１７２】 配列番号：２５ 配列 ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ
ＡＴＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ４８ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ ＴＧＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ
ＴＡＣ ＧＧＡ ８１ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｔｙｒ Ｇｌｙ
【０１７３】配列番号：２６ 配列 Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａ
ｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ １ 5 １０
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆｉｇ．１：アファノクラジウム・アルブム
（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のキチナ
ーゼをコード化する全長相補的ＤＮＡのヌクレオチド配
列および翻訳されたタンパク質のペプチド配列を示す。
【図２】 Fig.１（つづき）
【図３】 Fig.２：アファノクラジウム（Ａｐｈａｎｏ
ｃｌａｄｉｕｍ）のキチナーゼをコードするゲノムＤＮ
Ａのヌクレオチド配列および翻訳されたタンパク質のペ
プチド配列を示す。
【図４】 Fig.２（つづき１）
【図５】 Fig.２（つづき２）
【図６】 Fig.３：成熟アファノクラジウム・アルブム
のエンドキチナーゼのペプチド配列を示す。
【図７】 Fig.４：ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位
によって区切られた、プラスミドｐＢＲ６ｌ中のＡ.ア
ルブムの各キチナーゼのコード化配列を示す。
【図８】 Fig.４（つづき）
【図９】 Fig.５：ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位
によって区切られた、プラスミドｐＢＲ６２中のＡ.ア
ルブムの各キチナーゼのコード化配列を示す。
【図１０】 Fig.５（つづき）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 591067727 ソシエテ・ナショナル・エルフ・アキテー ヌ ＳＯＣＩＥＴＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ Ｅ ＬＦＡＱＵＩＴＡＩＮＥ フランス92400クールブヴォワ、ラ・デフ ァンス６、プラース・ド・ラ・クポル２番 トゥール・エルフ (72)発明者 ピエール−ルイ・ブレゾー フランス94800ビルジフ、アレ・レンブラ ント２番 (72)発明者 リシャール・ルグー フランス31460ル・ファジェ、アン・マナ ール（番地の表示なし) (72)発明者 ジャン−ジャック・ルゲ フランス75012パリ、リュ・ドゥ・リヨン 22番 (72)発明者 ミシェル・シュナイダー フランス31000トゥールーズ、リュ・モン タルディ26番

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の配列（ａ１）： 配列番号１ 【化１】 【化２】 を含む、エンドキチナーゼ活性をもつタンパク質または
    その前駆体をコード化する組換えＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 配列（ａ１）の上流にシグナル配列を含
    む、請求項１記載の組換えＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 シグナル配列が、下記の配列（ａ２）： 配列番号２ 【化３】 を有するシグナルペプチドをコード化する配列である、
    請求項２記載の組換えＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 シグナル配列をコード化するシグナルペ
    プチドが下記の配列（ａ３）： 配列番号４ 【化４】 を有するペプチドによって、コード化タンパク質の配列
    （ａ１）から分離されている、請求項２または３記載の
    組換えＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 シグナル配列が、下記の配列（ａ５）： 配列番号３ 【化５】 を有するシグナルペプチドをコード化する配列である、
    請求項２記載の組換えＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ
    プロモーターを含むプロモーター配列を含む、請求項１
    〜５のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 アグロバクテリウム・ツメファシエンス
    （Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ
    のターミネーターを含むターミネーター配列を含む、請
    求項１〜６記載のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 アミノ酸配列（ａ１）をコード化するヌ
    クレオチド配列が、下記の配列（Ｎａ１）： 配列番号５ 【化６】 である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組換えＤＮ
    Ａ。
  9. 【請求項９】 アミノ酸配列（ａ２）をコード化するヌ
    クレオチド配列が、下記の配列（Ｎａ２）： 配列番号６ 【化７】 である、請求項３または４記載の組換えＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 アミノ酸配列（ａ３）をコード化する
    ヌクレオチド配列が、下記の配列（Ｎａ３）： 配列番号７ 【化８】 である、請求項４記載の組換えＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 アミノ酸配列（ａ５）をコード化する
    ヌクレオチド配列が、下記の配列（Ｎａ５）： 配列番号８ 【化９】 である、請求項５記載の組換えＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜４記載のいずれか１項記載
    の組換えＤＮＡおよびその複製およびその発現に必要な
    手段を含む細菌。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜４記載のいずれか１項記載
    の組換えＤＮＡおよびその複製およびその発現に必要な
    手段を含む酵母。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜４記載のいずれか１項記載
    の組換えＤＮＡおよびその複製およびその発現に必要な
    手段を含む糸状菌。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１１記載のいずれか１項記
    載の組換えＤＮＡおよびその発現に必要な手段が形質転
    換された植物細胞。
  16. 【請求項１６】 ニコチアナ・タバクム（Nicotiana ta
    bacum）、ヘリアンタス・アヌウス（Helianthus annuu
    s）およびブラシカ・ナプス（Brassica napus）のいず
    れか１種に属する、請求項１５記載の植物細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１１記載のいずれか１種記
    載の組換えＤＮＡおよびその発現に必要な手段を含む植
    物、または植物の部分。
  18. 【請求項１８】 ニコチアナ・タバクム（Nicotiana ta
    bacum）、ヘリアンタス・アヌウス（Helianthus annuu
    s）およびブラシカ・ナプス（Brassica napus）のいず
    れか１種に属する、請求項１７記載の植物、または植物
    の部分。
  19. 【請求項１９】 完全な新規植物を形成し、または種子
    を生産し得る、請求項１７または１８記載の植物、また
    は植物の部分。
  20. 【請求項２０】 種子である、請求項１９記載の植物の
    部分。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜１１記載のいずれか１項記
    載の組換えＤＮＡを用いて得られるエンドキチナーゼ活
    性を有するタンパク質。
  22. 【請求項２２】 配列（ａ１）または配列（ａ１）と高
    い相同性を有する配列を含む、請求項２１記載のタンパ
    ク質。
  23. 【請求項２３】 見掛け分子量４１±３ｋＤａを有す
    る、請求項２１または２２記載のタンパク質。
  24. 【請求項２４】 Ｎ−グリコシル化されている、請求項
    ２１〜２３記載のいずれか１項記載のタンパク質。
  25. 【請求項２５】 見掛け分子量３９±３ｋＤａを有す
    る、請求項２１または２２記載のタンパク質。
  26. 【請求項２６】 請求項２１または２２記載のタンパク
    質の製造方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項
    記載の組換えＤＮＡおよびその発現に必要な手段を含
    む、植物細胞、植物カルス、植物または植物の部分を培
    養し、溶解し、上記タンパク質を分離し、精製すること
    を特徴とする方法。
JP4238550A 1991-09-06 1992-09-07 エンドキチナーゼ活性をもつタンパク質をコード化する組換えｄｎａ Pending JPH0638762A (ja)

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