DE69833015T2

DE69833015T2 - Mehrfach substituierte proteasevarianten mit geänderten nettoladung für die verwendung in detergentien

Info

Publication number: DE69833015T2
Application number: DE69833015T
Authority: DE
Inventors: J. Ayrookaran POULOSE; Volker Schellenberger; T. James KELLIS; Christian Paech; Joanne Nadherny; P. Donald NAKI; M. Robert CALDWELL; D. Katherine COLLIER
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2018-10-24
Also published as: CN102021159A; CA2307638C; ES2241180T3; ATE417099T1; EP1398367A1; AU1199499A; BR9813260A; ES2319470T3; US20030119690A1; KR20010031372A; CN100558871C; CZ301469B6; CN1597898A; AR052354A2; EP1025194B2; DE69839677D1; HUP0104539A3; JP2001520045A; AR052453A2; NO20001900D0

Description

Verwandte Anmeldungen
Die Anmeldung ist eine Teilfortsetzungsanmeldung („Continuation-in-part"-Anmeldung) der „United States Patent Application" 08/956,323, eingereicht am 23. Oktober 1998, der „United States Patent Application" 08/956,564, eingereicht am 23. Oktober 1998, und der „United States Patent Application" 08/956,324, eingereicht am 23. Oktober 1998, die allesamt hiermit in ihrer Gänze in diese Unterlagen aufgenommen werden.
Hintergrund der Erfindung
Serinproteasen sind eine Untergruppe von Carbonylhydrolasen. Sie umfassen eine vielgestaltige Klasse von Enzymen mit einem breiten Spektrum von Spezifitäten und biologischen Funktionen. Stroud, R., Sci. Amer., 131: 74–88. Trotz ihrer funktionalen Unterschiedlichkeit ist die katalytische Maschinerie von Serinproteasen durch wenigstens zwei genetisch unterschiedliche Familien von Enzymen genutzt worden: 1) die Subtilisine und 2) die aus Säugetieren stammenden, mit Chymotrypsin verwandten Serinproteasen und die homologen bakteriellen Serinproteasen (z.B. Trypsin und S. gresius-Trypsin). Diese beiden Familien von Serinproteasen zeigen bemerkenswert ähnliche Katalysemechanismen. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331–358. Obwohl die Primärstruktur keine Verwandtschaft zeigt, bringt darüber hinaus die Tertiärstruktur dieser beiden Enzymfamilien eine konservierte katalytische Triade von Aminosäuren, bestehend aus Serin, Histidin und Aspartat, zusammen.
Subtilisine sind Serinproteasen (MG ungef. 27.500), die in großen Mengen aus einer großen Vielzahl von Bacillus-Spezies und anderen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Proteinsequenz von Subtilisin ist aus wenigstens neun unterschiedlichen Spezies von Bacillus bestimmt worden. Markland, F. S., et al., (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364: 1537–1540. Es ist über die dreidimensionale Kristallstruktur von Subtilisinen aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis und mehreren natürlichen Varianten von B. lentus berichtet worden. Diese Untersuchungen zeigen, dass, obwohl Subtilisin genetisch keine Verwandtschaft mit den Serinproteasen aus Säugetieren aufweist, dieses eine ähnliche Struktur des aktiven Zentrums aufweist. Die Röntgenkristallstrukturen von Subtilisin, welches kovalent gebundene Peptidinhibitoren (Robertus, J. D., et al., (1972), Biochemistrv, 11: 2439–2449) oder Produktkomplexe (Robertus, J. D., et al., (1976), J. Biol. Chem., 251, 1097–1103) enthält, haben ebenfalls Informationen über das aktive Zentrum und die mutmaßliche Substratbindungsspalte von Subtilisin geliefert. Zusätzlich ist für Subtilisin über eine große Anzahl von kinetischen und chemischen Modifikationsuntersuchungen berichtet worden; Svendsen; B. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41: 237–291; Markland, F. S., a.a.O.) wie auch wenigstens ein Bericht, in welchem die Seitenkette des Methionins an Rest 222 von Subtilisin durch Wasserstoffperoxid in Methioninsulfoxid umgewandelt worden ist (Stauffer, D. C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244: 5333–5338), und es ist umfassende ortsspezifische Mutagenese ausgeführt worden (Wells und Estell (1988) TIBS 13: 291–297).
Bei der Entwicklung einer Proteasevariante für eine Verwendung in einer Waschmittelformulierung ist ein üblicher Punkt die Verschiedenartigkeit von Waschbedingungen einschließlich variierender Waschmittelformulierungen, unter bzw. in welchen eine Proteasevariante verwendet werden könnte. Beispielsweise weisen Waschmittelformulierungen, die in unterschiedlichen Gebieten verwendet werden, unterschiedliche Konzentrationen von ihren relevanten Komponenten, die im Waschwasser vorhanden sind, auf. Beispielsweise liegen bei einem europäischen Waschmittelsystem typisch ungefähr 4500–5000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vor, während bei einem japanischen Waschmittelsystem typischerweise ungefähr 667 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorliegen. In Nordamerika, insbesondere den Vereinigten Staaten, liegen bei einem Waschmittelsystem typisch ungefähr 975 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vor. Überraschenderweise ist ein Verfahren für die rationale Gestaltung einer Proteasevariante für eine Verwendung in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration, einem System mit hoher Waschmittelkonzentration und/oder einem System mit mittlerer Waschmittelkonzentration wie auch für eine Verwendung in Systemen mit allen drei Arten von Waschmittelkonzentrationen entwickelt worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit eines Subtilisins in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration, welches weniger als 800 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, bereit, welches umfasst:

a) Substituieren eines Aminosäurerests an einer oder mehreren Positionen in einem Vorläufer-Subtilisin, um eine Subtilisin-Variante herzustellen, wobei die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit dem Vorläufer negativer oder weniger positiv zu machen; und
b) Testen der Variante in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration, welches weniger als 800 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, indem die Fähigkeit des Vorläufers und der Variante, einen Fleck zu entfernen, verglichen wird.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit eines Subtilisins in einem System mit hoher Waschmittelkonzentration, welches mehr als 2000 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, bereit, welches umfasst:

a) Substituieren eines Aminosäurerests an einer oder mehreren Positionen in einem Vorläufer-Subtilisin, um eine Subtilisin-Variante herzustellen, wobei die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit dem Vorläufer positiver oder weniger negativ zu machen; und
b) Testen der Variante in einem System mit hoher Waschmittelkonzentration, welches mehr als 2000 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, indem die Fähigkeit des Vorläufers und der Variante, einen Fleck zu entfernen, verglichen wird.

Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer Waschmittelzusammensetzung bereitgestellt, welches umfasst, nachdem man die Leistungsfähigkeit eines Subtilisins durch Herstellen einer Subtilisin-Variante durch ein Verfahren der Erfindung verbessert hat, die Subtilisin-Variante zu einer pulverförmigen oder flüssigen Waschmittelzusammensetzung mit einem pH zwischen 6,5 und 12,0 in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 5 Gew.-% zu formulieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–C zeigen die DNA- und Aminosäuresequenz für Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin und eine partielle Restriktionskarte dieses Gens.
Die 2 zeigt die konservierten Aminosäurereste unter Subtilisinen aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' und Bacillus lentus (Wildtyp).
Die 3A und 3B zeigen die Aminosäuresequenz von vier Subtilisinen. Die obere Zeile stellt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (manchmal auch als Subtilisin BPN' bezeichnet) dar. Die zweite Zeile zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus B. subtilis. Die dritte Zeile zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus B. licheniformis. Die vierte Zeile zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus lentus (in PCT WO 89/06276) auch als Subtilisin 309 bezeichnet). Das Symbol * bezeichnet das Fehlen von speziellen Aminosäureresten verglichen mit Subtilisin BPN'.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben festgehalten, haben bestimmte Geographien bestimmte Waschbedingungen und verwenden als solche unterschiedliche Arten von Waschmitteln. Beispielsweise verwendet Japan ein System mit niedriger Waschmittelkonzentration, während Europa ein System mit hoher Waschmittelkonzentration verwendet. Wie zuvor diskutiert, verwenden die Vereinigten Staaten ein System mit mittlerer Waschmittelkonzentration. Wir haben festgestellt, dass in diesen unterschiedlichen Waschmittelformulierungen unterschiedliche Proteasevarianten optimal funktionieren.
Wir haben festgestellt, dass, um eine Proteasevariante herzustellen, die in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration wirksamer ist, es erforderlich ist, einen oder mehrere positiv geladene(n) Rest(e) entweder durch einen oder mehrere negativ geladene(n) Rest(e) oder einen oder mehrere neutrale(n) Rest(e) und/oder einen oder mehrere neutrale(n) Rest(e) durch einen oder mehrere negativ geladene(n) Rest(e) zu ersetzen. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass, um eine Proteasevariante herzustellen, die in einem System mit hoher Waschmittelkonzentration wirksamer ist, es erforderlich ist, einen oder mehrere negativ geladene(n) Rest(e) entweder durch einen oder mehrere positiv geladene(n) Rest(e) oder einen oder mehrere neutrale(n) Rest(e) und/oder einen oder mehrere neutrale(n) Rest(e) durch einen oder mehrere positiv geladene(n) Rest(e) zu ersetzen.
Die elektrostatische Ladung, die eine jegliche ionisierbare Aminosäureseitenkette mit einer sauren oder basischen Funktion in wässriger Lösung annimmt, ist eine Funktion des pH. Die sauren Reste Glu und Asp verlieren in einem Gleichgewichtsprozess zwischen pH 3 und 6 ein Proton durch Dissoziation und erwerben dadurch eine negative Ladung. Auf eine ähnliche Weise deprotonieren His, Lys und Arg schrittweise zwischen pH 5 und 8, pH 8,5 und 11,5 bzw. pH 11 und 14, wodurch sie eine positive Ladung verlieren. Das Proton von Tyr-OH dissoziiert zunehmend zwischen pH 8,5 und 11,5, wodurch Tyr eine negative Ladung erwirbt. Der Dissoziationsbereich für den Carboxyterminus ist pH 1 bis 4, was eine negative Ladung ergibt, und für den Aminoterminus beträgt er pH 8 bis 11, begleitet durch den Verlust einer positiven Ladung. Die hier angegebenen Dissoziationsbereiche für Aminosäureseitenketten sind Durchschnittswerte für viele Proteine, es ist aber bekannt, dass sie durch ungewöhnliche strukturelle Konfigurationen in einigen Proteinen beeinflusst werden.
Die kumulative Wirkung aller Ladungen bestimmt, ob ein Protein bei einem gegebenen pH eine positive oder negative Nettoladung hat. Der pH, bei welchem positive und negative Ladungen gleich wirksam sind und einem Protein einen elektrostatisch neutralen Status verleihen, wird als der isoelektrische Punkt (pl) bezeichnet. Ein Protein wird Ladung verlieren oder hinzugewinnen, wenn der pH verschoben wird oder wenn eine Aminosäure mit einem ionisierbaren Seitenkettenrest hinzugefügt oder entfernt wird. Eine Zunahme der positiven Nettoladung kann entweder durch Ersetzen eines Rests, der bei einem gegebenen pH negativ geladen ist, durch einen ungeladenen oder einen positiv geladenen Rest, was zu einer formalen Ladungsveränderung von +1 bzw. +2 führt, erzielt werden. Beim Ersetzen eines ungeladenen Seitenkettenrests durch einen, der bei dem gegebenen pH protoniert ist, würde die formale Ladungsveränderung +1 betragen. In ähnlicher Weise kann die negative Nettoladung erhöht werden, indem positiv und ungeladene Seitenketten durch bei dem Beobachtungs-pH negativ geladene Seitenketten ersetzt werden, und eine formale Zunahme der negativen Ladung um –1 bzw. –2 erzielt werden.
Ein System mit niedriger Waschmittelkonzentration umfasst Waschmittel, in welchen weniger als ungefähr 800 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind. Japanische Waschmittel werden typisch als Systeme mit niedriger Waschmittelkonzentration angesehen, da bei ihnen ungefähr 667 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind.
Eine mittlere Waschmittelkonzentration umfasst Waschmittel, wo zwischen ungefähr 800 ppm und ungefähr 2000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind. Nordamerikanische Waschmittel werden im Allgemeinen als Systeme mit mittlerer Waschmittelkonzentration angesehen, da bei ihnen ungefähr 975 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind. In Brasilien sind ungefähr 1500 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden.
Ein System mit hoher Waschmittelkonzentration umfasst Waschmittel, wo mehr als ungefähr 2000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind. Europäische Waschmittel werden im Allgemeinen als Systeme mit hoher Waschmittelkonzentration angesehen, da bei ihnen ungefähr 4500–5000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind.
Lateinamerikanische Waschmittel sind im Allgemeinen Waschmittel mit hoher Seifenlaugen- und Phosphat-Builder-Konzentration und das Spektrum von Waschmitteln, das in Lateinamerika verwendet wird, kann sowohl unter die mittleren als auch die hohen Waschmittelkonzentrationen fallen, da sie von 1500 ppm bis 6000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser reichen. Wie oben erwähnt, sind in Brasilien typisch ungefähr 1500 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden. Jedoch können andere Geographien mit Waschmitteln mit hoher Seifenlaugen- und Phosphat-Builder-Konzentration, die nicht auf andere lateinamerikanische Länder beschränkt sind, Systeme mit hoher Waschmittelkonzentration aufweisen, bei welchen bis zu ungefähr 6000 ppm Waschmittelkomponenten im Waschwasser vorhanden sind.
Im Licht des Vorangegangen ist es offensichtlich, dass Konzentrationen von Waschmittelzusammensetzungen in typischen Waschlösungen auf der ganzen Welt von weniger als ungefähr 800 ppm Waschmittelzusammensetzung („Geographien mit niedriger Waschmittelkonzentration"), beispielsweise ungefähr 667 ppm in Japan, bis zu zwischen ungefähr 800 ppm und ungefähr 2000 ppm („Geographien mit mittlerer Waschmittelkonzentration"), beispielsweise ungefähr 975 ppm in den Vereinigten Staaten und ungefähr 1500 ppm in Brasilien, bis zu mehr als ungefähr 2000 ppm („Geographien mit hoher Waschmittelkonzentration"), beispielsweise ungefähr 4500 ppm bis ungefähr 5000 ppm in Europa und ungefähr 6000 ppm in Geographien mit hoher Seifenlaugen- und Phosphat-Builder-Konzentration, variieren.
Die Konzentrationen der typischen Waschlösungen werden empirisch bestimmt. Beispielsweise ist in den Vereinigten Staaten in einer typischen Waschmaschine ein Volumen von ungefähr 64,4 l Waschlösung enthalten. Um eine Konzentration von ungefähr 975 ppm Waschmittel innerhalb der Waschlösung zu erhalten, müssen dementsprechend ungefähr 62,79 g Waschmittelzusammensetzung zu den 64,4 l Waschlösung hinzugegeben werden. Diese Menge ist die typische Menge, die durch den Verbraucher unter Verwendung des mit dem Waschmittel bereitgestellten Messbechers in das Waschwasser abgemessen wird.
Proteasen sind Carbonylhydrolasen, die im Allgemeinen so wirken, dass sie Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Wie hier verwendet, bedeutet „Protease" eine in der Natur vorkommende Protease oder eine rekombinante Protease. Der Begriff „Protease" wird austauschbar mit dem Begriff „Subtilisin" verwendet mit der Ausnahme, wo der Kontext etwas anderes erfordert. Subtilisine werden nachfolgend detaillierter beschrieben.
Die Erfindung macht Verwendung von Proteaseenzymen, die nicht in der Natur vorkommende Proteasevarianten sind, welche eine unterschiedliche proteolytische Aktivität, Stabilität, Substratspezifität, ein unterschiedliches pH-Profil und/oder unterschiedliche Leistungseigenschaften verglichen mit dem Vorläufer, von welchem die Aminosäuresequenz der Variante abgeleitet ist, aufweisen. Speziell haben solche Proteasevarianten eine Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht gefunden wird, welche durch Substitution einer Mehrzahl von Aminosäureresten einer Vorläufer-Protease durch unterschiedliche Aminosäuren abgeleitet ist. Die Vorläufer-Protease kann eine in der Natur vorkommende Protease oder eine rekombinante Protease sein.
Die hier nützlichen Proteasevarianten umfassen die Substitution einer jeglichen der neunzehn in der Natur vorkommenden L-Aminosäuren an den bezeichneten Aminosäurerest-Positionen. Solche Substitutionen können in einem jeglichen Vorläufer-Subtilisin (prokaryotisch, eukaryotisch u.s.w.) vorgenommen werden. In der gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Aminosäuren mittels der üblichen Ein- und Drei-Buchstaben-Codes Bezug genommen. Solche Codes werden in Dale, M. W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Anhang B, angegeben.
Die hier nützlichen Proteasevarianten sind Subtilisin-Varianten und sind vorzugsweise von einem Bacillus-Subtilisin abgeleitet. Mehr bevorzugt sind die Proteasevarianten von Bacillus lentus-Subtilisin und/oder Subtilisin 309 abgeleitet.
Subtilisine sind bakterielle oder pilzliche Proteasen, die im Allgemeinen so wirken, dass sie Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden spalten. Wie hier verwendet, bedeutet „Subtilisin" ein in der Natur vorkommendes Subtilisin oder ein rekombinantes Subtilisin. Es ist bekannt, dass durch verschiedene mikrobielle Spezies eine Reihe von in der Natur vorkommenden Subtilisinen produziert und oftmals sekretiert wird. Aminosäuresequenzen der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Jedoch zeigen die Subtilisine in dieser Reihe die gleiche oder eine ähnliche Art von proteolytischer Aktivität. Diese Klasse von Serinproteasen weist eine gemeinsame Aminosäuresequenz auf, welche eine katalytische Triade definiert, welche diese von der mit Chymotrypsin verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und die mit Chymotrypsin verwandten Serinproteasen weisen beide eine katalytische Triade, umfassend Aspartat, Histidin und Serin, auf. In den mit Subtilisin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, gelesen vom Aminozum Carboxyterminus, Aspartat-Histidin-Serin. In den mit Chymotrypsin verwandten Proteasen ist die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Dementsprechend bezieht sich Subtilisin hier auf eine Serinprotease, welche die katalytische Triade von mit Subtilisin verwandten Proteinen aufweist. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Subtilisine, die in 3 hier angegeben werden. Allgemein und für die Zwecke der Erfindung entspricht die Nummerierung der Aminosäuren in Proteasen den Nummern, die der Sequenz des reifen Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins, die in 1 angegeben ist, zugewiesen worden sind.
„Rekombinantes Subtilisin" oder „rekombinante Protease" bezieht sich auf ein Subtilisin oder eine Protease, in welchem bzw. welcher die das Subtilisin kodierende DNA-Sequenz so modifiziert ist, dass eine abgewandelte (oder mutierte) DNA-Sequenz, die die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz kodiert, erzeugt wird. Geeignete Verfahren, um eine solche Modifizierung herzustellen, und die mit jenen, die hier offenbart werden, kombiniert werden können, umfassen jene, die in dem U.S.-Patent RE 34,608, U.S.-Patent 5,204,015 und dem U.S.-Patent 5,185,258, dem U.S.-Patent 5,700,676, U.S.-Patent 5,801,038 und U.S.-Patent 5,763,257 offenbart werden.
„Nicht-humane" Subtilisine und die diese kodierende DNA können aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele von prokaryotischen Organismen umfassen gramnegative Organismen, wie E. coli oder Pseudomonas, und grampositive Bakterien, wie Micrococcus oder Bacillus. Beispiele von eukaryotischen Organismen, ausgehend von welchen Subtilisin und dessen Gene erhalten werden können, umfassen Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, Pilze, wie Aspergillus-Sp.
Eine „Proteasevariante" weist eine Aminosäuresequenz auf, die von der Aminosäuresequenz einer „Vorläufer-Protease" abgeleitet ist. Die Vorläufer-Proteasen umfassen in der Natur vorkommende Proteasen und rekombinante Proteasen. Die Aminosäuresequenz der Proteasevariante ist von der Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease durch die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz „abgeleitet". Eine solche Modifizierung ist eine solche der „Vorläufer-DNA-Sequenz", die die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease kodiert, anstelle einer Manipulation des Vorläufer-Proteaseenzyms per se. Geeignete Verfahren für eine solche Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen Verfahren, die hier offenbart werden, wie auch Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind (siehe beispielsweise EP 0 328 299 , WO 89/06279 und die U.S.-Patente und Anmeldungen, auf die hier bereits verwiesen worden ist).
Diese Aminosäurepositionsnummern beziehen sich auf jene, die der Sequenz des reifen Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins, die in 1 aufgeführt ist, zugewiesen worden sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Mutation dieses speziellen Subtilisins beschränkt, sondern erstreckt sich auf Vorläufer-Proteasen, welche Aminosäurereste an Positionen, die zu den jeweiligen angegebenen Resten in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin „äquivalent" sind, enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Vorläufer-Protease Bacillus lentus-Subtilisin und die Substitutionen werden an den äquivalenten Aminosäurerestpositionen in B. lentus, welche jenen, die oben aufgelistet sind, entsprechen, vorgenommen.
Eine Position eines Rests (einer Aminosäure) einer Vorläufer-Protease ist äquivalent zu einem Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, wenn sie entweder homolog (d.h. entsprechend hinsichtlich der Position in entweder der Primär- oder Tertiärstruktur) oder analog zu einem speziellen Rest oder Abschnitt jenes Rest in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (d.h. mit dem gleichen oder einem ähnlichen funktionalen Vermögen, zu rekombinieren, zu reagieren oder chemisch zu Wechselwirken) ist.
Um eine Homologie hinsichtlich der Primärstruktur zu ermitteln, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-Protease direkt mit der Primärsequenz des Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisins und insbesondere mit einem Satz von Resten, welche bekanntermaßen in Subtilisinen, für welche die Sequenz bekannt ist, unveränderlich sind, verglichen. Beispielsweise zeigt 2 hier die konservierten Reste, wie sie zwischen B. amyloliquefaciens-Subtilisin und B. lentus-Subtilisin vorliegen. Nach dem „alignment" (gegenseitige Ausrichtung anhand von Homologie) der konservierten Reste, wobei notwendige Insertionen und Deletionen, um das „alignment" aufrechtzuerhalten, zugelassen werden, (d.h. wobei die Eliminierung von konservierten Resten durch willkürliche Deletion und Insertion vermieden wird), werden die Reste, die zu bestimmten Aminosäuren in der Primärsequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent sind, definiert. Ein „alignment" von konservierten Resten sollte vorzugsweise 100% von solchen Resten bewahren. Jedoch ist ein „alignment" von mehr als 75% oder sogar von nur bis zu 50% der konservierten Reste ebenfalls adäquat, um äquivalente Reste zu definieren. Eine Konservierung der katalytischen Triade, Asp32IHis64/Ser221, sollte aufrechterhalten werden. Siezen et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 719–737 zeigen das „alignment" einer großen Anzahl von Serinproteasen. Siezen et al. beziehen sich auf die Einstufung als Subtilasen oder Subtilisin-artige Serinproteasen.
Beispielsweise sind in 3 die Aminosäuresequenzen von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) und Bacillus lentus gegeneinander in Form eines „alignment" ausgerichtet, um das maximale Ausmaß an Homologie zwischen Aminosäuresequenzen bereitzustellen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, dass es eine Anzahl von konservierten Resten gibt, die in jeder Sequenz enthalten ist. Diese konservierten Reste (wie zwischen BPN' und B. lentus) sind in 2 angegeben.
Diese konservierten Reste können folglich verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäurereste von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Subtilisinen, wie Subtilisin aus Bacillus lentus (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 089106279, veröffentlicht am 13. Juli 1989), dem hier bevorzugten Protease-Vorläuferenzym, oder dem als PB92 bezeichneten Subtilisin ( EP 0 328 299 ), welches zu dem bevorzugten Bacillus lentus-Subtilisin hochgradig homolog ist, zu definieren. Die Aminosäuresequenzen von bestimmten von diesen Subtilisinen sind in den 3A und 3B gegenüber der Sequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in Form eines „alignment" ausgerichtet, um die maximale Homologie von konservierten Resten herzustellen. Wie ersehen werden kann, gibt es verglichen mit Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin eine Anzahl von Deletionen in der Sequenz von Bacillus lentus. So ist beispielsweise die äquivalente Aminosäure für Val165 in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin in den anderen Subtilisinen Isoleucin für B. lentus und B. licheniformis.
„Äquivalente Reste" können auch definiert werden, indem Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur für eine Vorläufer-Protease, deren Tertiärstruktur durch Röntgenkristallographie bestimmt worden ist, bestimmt wird. Äquivalente Reste sind als jene definiert, bei welchen die Atomkoordinaten von zwei oder mehreren der Hauptkettenatome eines bestimmten Aminosäurerests der Vorläufer-Protease und von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin (N gegenüber N, CA gegenüber CA, C gegenüber C und Ogegenüber O) nach dem „alignment" innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm liegen. Ein „alignment" wird erzielt, nachdem das beste Modell so orientiert und positioniert worden ist, dass es die maximale Überlappung von Atomkoordinaten von Nicht-Wasserstoff-Proteinatomen der fraglichen Protease gegenüber dem Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin ergibt. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, welches den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Beugungsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung ergibt.
Äquivalente Reste, die zu einem speziellen Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin funktional analog sind, sind als jene Aminosäuren der Vorläufer-Protease definiert, die eine solche Konformation annehmen können, dass sie in einer definierten und einem speziellen Rest von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin zugeschriebenen Weise die Proteinstruktur, Substratbindung oder Katalyse entweder verändern, modifizieren oder hierzu einen Beitrag liefern. Ferner sind sie jene Reste der Vorläufer-Protease (für welche eine Tertiärstruktur durch Röntgenkristallographie erhalten worden ist), die eine analoge Position in dem Ausmaß einnehmen, dass, obwohl die Hauptkettenatome des gegebenen Rests möglicherweise die Kriterien von Äquivalenz auf der Grundlage des Einnehmens einer homologen Position nicht erfüllen, die Atomkoordinaten von wenigstens zwei der Seitenkettenatome des Rests innerhalb von 0,13 nm zu den entsprechenden Seitenkettenatomen von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin liegen. Die Koordinaten der dreidimensionalen Struktur von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin sind in der EPA-Veröffentlichung Nr. 0 251 446 (äquivalent zu dem U.S.-Patent 5,182,204, dessen Offenbarung in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) aufgeführt und können, wie oben erläutert, verwendet werden, um äquivalente Reste auf der Ebene der Tertiärstruktur zu bestimmen.
Einige der für eine Substitution identifizierten Reste sind konservierte Reste, wohingegen andere dies nicht sind. Im Falle von Resten, die nicht konserviert sind, ist die Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren auf Substitutionen beschränkt, die eine Variante erzeugen, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die einer, die in der Natur gefunden wird, nicht entspricht. Im Falle von konservierten Resten sollten solche Substitutionen nicht zu einer in der Natur vorkommenden Sequenz führen. Die Proteasevarianten der Erfindung umfassen die reifen Formen von Proteasevarianten wie auch die Pro- und Präpro-Formen von solchen Proteasevarianten. Die Präpro-Formen sind die bevorzugte Konstruktion, da dies die Expression, Sekretion und Reifung der Proteasevarianten erleichtert.
„Prosequenz" bezieht sich auf eine an den N-terminalen Abschnitt der reifen Form einer Protease gebundene Sequenz von Aminosäuren, die, wenn sie entfernt worden ist, zu dem Auftreten der „reifen" Form der Protease führt. Viele proteolytische Enzyme werden in der Natur als translationale Proenzym-Produkte gefunden und werden in Abwesenheit einer posttranslationalen Prozessierung auf diese Weise exprimiert. Eine bevorzugte Prosequenz für das Herstellen von Proteasevarianten ist die mutmaßliche Prosequenz von Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin, obwohl andere Protease-Prosequenzen verwendet werden können.
Eine „Signalsequenz" oder „Präsequenz" bezieht sich auf eine jegliche, an den N-terminalen Abschnitt einer Protease oder an den N-terminalen Abschnitt einer Proprotease gebundene Sequenz von Aminosäuren, die an der Sekretion der reifen oder Pro-Formen der Protease teilnehmen kann. Diese Definition der Signalsequenz ist eine funktionale, wobei gemeint ist, dass alle jene durch den N-terminalen Abschnitt des Proteasegens kodierten Aminosäuresequenzen, die an der Bewirkung der Sekretion von Protease unter nativen Bedingungen teilnehmen, mit umfasst werden. Die Erfindung nutzt solche Sequenzen aus, um die Sekretion der Proteasevarianten, wie hier definiert, zu bewirken. Eine mögliche Signalsequenz umfasst die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz aus Bacillus subtilis-Subtilisin, welche mit dem Rest der Signalsequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) fusioniert sind.
Eine „Präpro"-Form einer Proteasevariante besteht aus der reifen Form der Protease, welche eine Prosequenz, welche operativ (funktional) mit dem Aminoterminus der Protease verknüpft ist, und eine „Prä"- oder „Signal"sequenz, welche operativ (funktional) mit dem Aminoterminus der Prosequenz verknüpft ist, aufweist.
„Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, welches eine DNA-Sequenz enthält, welche operativ (funktional) mit einer geeigneten Kontrollsequenz, welche in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken, verknüpft ist. Solche Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor, um die Transkription zu bewirken, eine optionale Operatorsequenz, um eine solche Transkription zu kontrollieren, eine geeignete mRNA-Ribosomenbindungsstellen (mRNA-RBS) kodierende Sequenz und Sequenzen, die die Beendigung von Transkription und Translation kontrollieren. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach ein potentielles genomisches Insert sein. Ist ein geeigneter Wirt einmal damit transformiert, kann der Vektor unabhängig von dem Wirtsgenom sich replizieren und funktionieren oder kann in einigen Fällen sich in das Genom selbst integrieren. Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen werden „Plasmid" und „Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Form von Vektor darstellt. Die Erfindung soll jedoch solche anderen Formen von Expressionsvektoren mit umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und die in diesem Fachgebiet bekannt sind oder werden.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten „Wirtszellen" sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise durch die Verfahren, die in dem U.S.-Patent RE 34,606 offenbart worden sind, manipuliert worden sind, um diese unfähig zu machen, enzymatisch aktive Endoprotease zu sekretieren. Eine bevorzugte Wirtszelle für die Expression von Protease ist der Bacillus-Stamm BG2036, der hinsichtlich enzymatisch aktiver neutraler Protease und alkalischer Protease (Subtilisin) defizient ist. Die Konstruktion des Stamms BG2036 wird detailliert in dem U.S.-Patent 5,264,366 beschrieben. Andere Wirtszellen für die Expression von Protease umfassen Bacillus subtilis I168 (auch beschrieben in dem U.S.-Patent RE 34,606 und dem U.S.-Patent 5,264,366, deren Offenbarung in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird) wie auch einen jeglichen geeigneten Bacillus-Stamm, wie B. licheniformis, B. lentus u.s.w.
Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die unter Verwendung von Techniken der in vitro-DNA-Rekombination konstruiert worden sind. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren, welche die Proteasevarianten kodieren oder die gewünschte Proteasevariante exprimieren. In dem Falle von Vektoren, die die Prä- oder Präpro-Formen der Proteasevariante kodieren, werden solche Varianten, wenn sie exprimiert werden, typisch aus der Wirtszelle in das Wirtszellmedium sekretiert.
„Operativ verknüpft" („funktional verknüpft"), wenn dies die Beziehung zwischen zwei DNA-Regionen beschreibt, bedeutet einfach, dass sie funktional zueinander in Beziehung stehen. Beispielsweise ist eine Präsequenz operativ mit einem Peptid verknüpft, wenn sie als eine Signalsequenz wirkt, indem sie an der Sekretion der reifen Form des Proteins teilnimmt, was höchstwahrscheinlich eine Abspaltung der Signalsequenz mit umfasst. Ein Promotor ist operativ mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) ist operativ mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so angeordnet ist, dass sie die Translation erlaubt.
Die die in der Natur vorkommende Vorläufer-Protease kodierenden Gene können gemäß den allgemeinen Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, erhalten werden. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Synthetisieren von markierten Sonden, welche mutmaßliche Sequenzen, welche Regionen der Protease von Interesse kodieren, aufweisen, das Herstellen von genomischen Bibliotheken aus die Protease exprimierenden Organismen und das Screenen der Bibliotheken auf das Gen von Interesse durch Hybridisierung mit den Sonden. Positiv hybridisierende Klone werden dann kartiert und sequenziert.
Die klonierte Protease wird dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, um die Protease zu exprimieren. Das Proteasegen wird dann in ein Plasmid mit hoher Kopienzahl ligiert. Das Plasmid repliziert sich in Wirten in dem Sinne, dass es die wohlbekannten Elemente enthält, die für die Plasmidreplikation erforderlich sind: einen mit dem fraglichen Gen operativ verknüpften Promotor (der als der eigene homologe Promotor des Gens bereitgestellt werden kann, sofern dieser durch den Wirt erkannt, d.h. transkribiert wird), eine Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsregion (erforderlich für die Stabilität der durch den Wirt ausgehend von dem Proteasegen in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen transkribierten mRNA), die exogen ist oder durch die endogene Terminatorregion des Proteasegens bereitgestellt wird, und wünschenswerterweise ein der Selektion dienendes Gen, wie ein Antibiotikumresistenzgen, welches die kontinuierliche Aufrechterhaltung von Plasmid-infizierten Wirtszellen in Kultur durch Kultivierung in Antibiotikum enthaltenden Medien ermöglicht. Plasmide mit hoher Kopienzahl enthalten auch einen Replikationsstartpunkt für den Wirt, wodurch ermöglicht wird, dass große Anzahlen von Plasmiden im Zytoplasma ohne chromosomale Beschränkungen erzeugt werden. Es liegt hier jedoch innerhalb des Umfangs, eine Mehrzahl von Kopien des Proteasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen, die hinsichtlich einer homologen Rekombination besonders anfällig sind, vereinfacht.
Das Gen kann ein natürliches B. lentus-Gen sein. Alternativ kann ein synthetisches Gen, welches eine in der Natur vorkommende oder mutierte Vorläufer-Protease kodiert, hergestellt werden. In einem solchen Ansatz wird die DNA- und/oder Aminosäuresequenz der Vorläufer-Protease bestimmt. Danach wird eine Mehrzahl von überlappenden synthetischen einzelsträngigen DNA-Fragmenten synthetisiert, die nach Hybridisierung und Ligation eine synthetische DNA, welche die Vorläufer-Protease kodiert, produzieren. Ein Beispiel einer synthetischen Genkonstruktion wird in Beispiel 3 des U.S.-Patents 5,204,015, deren Offenbarung in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen wird, erläutert.
Ist das in der Natur vorkommende oder synthetische Vorläufer-Protease-Gen einmal kloniert, wird eine Anzahl von Modifizierungen vorgenommen, um die Verwendung des Gens über die Synthese der in der Natur vorkommenden Vorläufer-Protease hinaus zu erhöhen. Solche Modifizierungen umfassen die Produktion von rekombinanten Proteasen, wie in dem U.S.-Patent RE 34,606 und der EPA-Veröffentlichung Nr. 0 251 446 offenbart, und die Produktion von Proteasevarianten, die hier beschrieben werden.
Das folgende Kassetten-Mutagenese-Verfahren kann verwendet werden, um die Konstruktion der Proteasevarianten der Erfindung zu vereinfachen, obwohl andere Verfahren verwendet werden können. Als erstes wird das die Protease kodierende, in der Natur vorkommende Gen erhalten und vollständig oder teilweise sequenziert. Dann wird die Sequenz hinsichtlich einer Stelle, an welcher gewünscht wird, eine Mutation (Deletion, Insertion oder Substitution) von einer oder mehreren Aminosäuren in dem kodierten Enzym vorzunehmen, geprüft. Die diese Stelle flankierenden Sequenzen werden hinsichtlich der Anwesenheit von Restriktionsstellen für das Ersetzen eines kurzen Abschnitts des Gens durch einen Oligonukleotid-Pool, der bei einer Expression verschiedene Mutanten kodieren wird, ausgewertet. Solche Restriktionsstellen sind vorzugsweise nur einmal vorkommende Stellen innerhalb des Proteasegens, um das Ersetzen des Genabschnitts zu vereinfachen. Es kann jedoch eine jegliche geeignete Restriktionsstelle, die in dem Proteasegen nicht übermäßig redundant ist, verwendet werden, vorausgesetzt, die durch Restriktionsverdau erzeugten Genfragmente können in korrekter Abfolge erneut zusammengefügt werden. Wenn Restriktionsstellen nicht an Positionen innerhalb eines geeigneten Abstands von der ausgewählten Stelle (10 bis 15 Nukleotide) vorhanden sind, werden solche Stellen durch Substituieren von Nukleotiden in dem Gen auf eine solche Weise, dass weder das Leseraster noch die kodierten Aminosäuren in dem endgültigen Konstrukt verändert werden, erzeugt. Eine Mutation des Gens, um dessen Sequenz zu verändern, damit diese mit der gewünschten Sequenz übereinstimmt, wird durch M13-Primerverlängerung gemäß allgemein bekannten Verfahren bewerkstelligt. Die Aufgabe einer Lokalisierung von geeigneten flankierenden Regionen und des Auswertens der benötigten Veränderungen, um zu zwei geeigneten Restriktionsstellensequenzen zu gelangen, wird durch die Redundanz des genetischen Codes, eine Restriktionsenzymkarte des Gens und die große Anzahl von unterschiedlichen Restriktionsenzymen zur Routine gemacht. Es ist anzumerken, dass, wenn eine geeignete flankierende Restriktionsstelle verfügbar ist, das obige Verfahren nur in Verbindung mit der flankierenden Region, die eine solche Stelle nicht enthält, verwendet werden muss.
Ist die in der Natur vorkommende oder synthetische DNA einmal kloniert, werden die die zu mutierenden Positionen flankierenden Restriktionsstellen mit den erkennenden Restriktionsenzymen verdaut und eine Mehrzahl von zu den Endtermini komplementären Oligonukleotid-Kassetten wird in das Gen ligiert. Die Mutagenese wird durch dieses Verfahren vereinfacht, da alle Oligonukleotide so synthetisiert werden können, dass sie die gleichen Restriktionsstellen aufweisen, und es sind keine synthetischen Linker erforderlich, um die Restriktionsstellen zu erzeugen.
Wie hier verwendet, wird proteolytische Aktivität als die Hydrolyserate von Peptidbindungen pro Milligramm aktives Enzym definiert. Für die Messung von proteolytischer Aktivität existieren viele wohlbekannte Verfahren (K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineerinq/Biotechnology, A. Fiechter, Hrsg., 1988). Zusätzlich zu oder als Alternative zu einer modifizierten proteolytischen Aktivität können die abgewandelten Enzyme der Erfindung andere modifizierte Eigenschaften, wie K_m, k_cat, k_cat/K_m-Verhältnis und/oder modifizierte Substratspezifität und/oder ein modifiziertes pH-Aktivitätsprofil aufweisen. Diese Enzyme können für das jeweilige Substrat, von welchem antizipiert wird, dass es vorhanden ist, beispielsweise bei der Herstellung von Peptiden oder für hydrolytische Prozesse, wie Wäscherei-Anwendungen, maßgeschneidert werden.
Unter einem Aspekt der Erfindung besteht das Ziel darin, eine abgewandelte Protease bereitzustellen, die verglichen mit der Vorläufer-Protease eine veränderte proteolytische Aktivität aufweist, da eine Erhöhung einer solchen Aktivität (numerisch höher) die Verwendung des Enzyms, um effizienter auf ein Zielsubstrat einzuwirken, ermöglicht. Auch von Interesse sind abgewandelte Enzyme, die verglichen mit dem Vorläufer eine veränderte thermische Stabilität und/oder veränderte Substratspezifität aufweisen. In einigen Fällen kann eine niedrigere proteolytische Aktivität wünschenswert sein; beispielsweise würde eine Abnahme der proteolytischen Aktivität nützlich sein, wenn die synthetische Aktivität der Proteasen gewünscht wird (wie beispielsweise für das Synthetisieren von Peptiden). Es kann erwünscht sein, diese proteolytische Aktivität, die in der Lage ist, das Produkt einer solchen Synthese zu zerstören, zu verringern. Im Gegensatz dazu kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, die proteolytische Aktivität des abgewandelten Enzyms gegenüber dessen Vorläufer zu erhöhen. Zusätzlich können Erhöhungen oder Verringerungen (Veränderung) der Stabilität der Variante, ob alkalische oder thermische Stabilität, wünschenswert sein. Erhöhungen oder Verringerungen von k_cat, K_m, oder k_cat/K_m sind spezifisch für das Substrat, das verwendet wird, um diese kinetischen Parameter zu bestimmen.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung ist festgestellt worden, dass Proteasevarianten, die Substitutionen der Aminosäuren an einer oder mehreren Restpositionen derart aufweisen, dass die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit einer Vorläufer-Protease negativer oder weniger positiv zu machen, bei einer niedrigen Waschmittelkonzentration wirksamer sind als eine Vorläufer-Protease.
Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung ist festgestellt worden, dass Proteasevarianten, die Substitutionen der Aminosäuren an einer oder mehreren Restpositionen derart aufweisen, dass die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit einer Vorläufer-Protease positiver oder weniger negativ zu machen, bei einer hohen Waschmittelkonzentration wirksamer sind als eine Vorläufer-Protease.
Diese Substitutionen werden vorzugsweise bei Bacillus lentus-Subtilisin (rekombinant oder vom nativen Typ) vorgenommen, obwohl die Substitutionen bei einer jeglichen Bacillus-Protease, vorzugsweise Bacillus-Subtilisinen vorgenommen werden können.
Basierend auf den mit den abgewandelten Proteasen erhaltenen Screening-Ergebnissen, sind die angegebenen Mutationen in Bacillus amyloliquefaciens-Subtilisin wichtig für die proteolytische Aktivität, die Leistungsfähigkeit und/oder die Stabilität dieser Enzyme und die Reinigungs- oder Wascheigenschaften solcher abgewandelten Enzyme.
Die beschriebenen Proteasevarianten sind nützlich bei der Formulierung von Waschmittelzusammensetzungen. Eine Anzahl von bekannten Verbindungen sind geeignete grenzflächenaktive Verbindungen, die in Zusammensetzungen, die solche Proteasemutanten umfassen, nützlich sind. Diese umfassen nichtionische, anionische, kationische oder zwitterionische Tenside, wie sie in U.S. 4,404,128 von Barry J. Anderson und U.S. 4,261,868 von Jiri Flora et al. offenbart werden. Eine geeignete Waschmittelformulierung ist jene, die in Beispiel 7 des U.S.-Patents 5,204,015 (welches zuvor durch Bezugnahme aufgenommen worden ist) beschrieben wird. Das Fachgebiet ist mit den verschiedenen Formulierungen, die als Reinigungszusammensetzungen verwendet werden können, vertraut.
Die beschriebenen Varianten zeigen verbesserte Leistungsfähigkeit in einer Waschmittelzusammensetzung (verglichen mit dem Vorläufer). Wie hier verwendet, ist eine verbesserte Leistungsfähigkeit in einem Waschmittel als eine verbesserte Reinigung von bestimmten, gegenüber Enzymen empfindlichen Flecken, wie Gras oder Blut, wie sie durch eine übliche Auswertung nach einem Standard-Waschzyklus bestimmt wird, definiert.
Proteasen können zu bekannten pulverförmigen und flüssigen Waschmitteln mit einem pH zwischen 6,5 und 12,0 mit Konzentrationen von ungefähr 0,01 bis ungefähr 5 Gew.-% (vorzugsweise 0,1% bis 5%) formuliert werden. Diese Waschmittel-Reinigungszusammensetzungen können auch andere Enzyme, wie bekannte Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Lipasen oder Endoglycosidasen, wie auch Builder und Stabilisatoren umfassen.
Das Hinzufügen von Proteasen zu herkömmlichen Reinigungszusammensetzungen erzeugt keinerlei spezielle Einschränkungen hinsichtlich der Verwendung. In anderen Worten sind eine jegliche Temperatur und ein jeglicher pH, die für das Waschmittel geeignet sind, auch für die vorliegenden Zusammensetzungen geeignet, solange der pH innerhalb des obigen Bereichs liegt und die Temperatur unterhalb der Denaturierungstemperatur der beschriebenen Protease liegt. Zusätzlich können Proteasen in einer Reinigungszusammensetzung ohne Tenside, wieder entweder allein oder in Kombination mit Buildern und Stabilisatoren, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch Reinigungszusammensetzungen, die Proteasevarianten enthalten. Die Reinigungszusammensetzungen können zusätzlich Zusatzstoffe, die in Reinigungszusammensetzungen üblicherweise verwendet werden, enthalten. Diese können ausgewählt werden aus Bleichmitteln, grenzflächenaktiven Substanzen, Buildern, Enzymen und Bleichkatalysatoren, sind aber nicht darauf beschränkt. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet würde es leicht ersichtlich sein, welche Zusatzstoffe für eine Aufnahme in die Zusammensetzungen geeignet sind. Die hier bereitgestellte Liste ist keinesfalls erschöpfend und sollte nur als Beispiele von geeigneten Zusatzstoffen aufgefasst werden. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet wird es ebenfalls leicht ersichtlich sein, nur jene Zusatzstoffe zu verwenden, die mit den Enzymen und anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung, beispielsweise dem Tensid, verträglich sind.
Sofern vorhanden, beträgt die Zusatzstoffmenge, die in der Reinigungszusammensetzung vorhanden ist, ungefähr 0,01% bis ungefähr 99,9%, vorzugsweise ungefähr 1% bis ungefähr 95%, mehr bevorzugt ungefähr 1% bis ungefähr 80%.
Eine durch die Verfahren der Erfindung hergestellte Waschmittelzusammensetzung kann verwendet werden, um beispielsweise Seide oder Wolle zu behandeln, wie in Veröffentlichungen, wie RD 216,034; EP 134,267, US 4,533,359; und EP 344,259 beschrieben.
Das Folgende wird beispielhaft aufgeführt und soll nicht als eine Beschränkung hinsichtlich des Umfangs der Ansprüche aufgefasst werden.
Beispiel 1
Es wurde eine große Anzahl von Proteasevarianten unter Verwendung von Verfahren, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, hergestellt und gereinigt. Alle Mutationen erfolgten an Bacillus lentus GG36-Subtilisin.
Die hergestellten Proteasevarianten wurden hinsichtlich Leistungsfähigkeit bei zwei Arten von Waschmittel- und Waschbedingungen unter Verwendung eines Mikrostreifen („microswatch")-Assays, der in „An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition", U.S.-Serial Nr. 60/068,796 beschrieben wird, getestet.
Die Tabellen 1–13 listen die in dem Assay getesteten abgewandelten Proteasen und die Ergebnisse eines Testens in zwei unterschiedlichen Waschmitteln auf. Alle Werte sind als Vergleich mit der ersten in der Tabelle gezeigten Protease angegeben (d.h. ein Wert von 1,32 zeigt eine Fähigkeit an, 132% des Flecks herauszulösen, im Gegensatz zu den 100% der ersten Variante in der Tabelle).
Spalte A zeigt die Ladungsdifferenz einer Variante. Für Spalte B war das Waschmittel 0,67 g/l filtriertes Ariel Ultra (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) in einer Lösung, welche 3 „grains" (194,4 mg) pro Gallone gemischte Ca²⁺/Mg²⁺-Härte enthielt, und es wurde 0,3 ppm Enzym in jeder Vertiefung bei 25°C verwendet (Waschmittelsystem mit niedriger Konzentration). Für Spalte C war das Waschmittel 3,38 g/l filtriertes Ariel Futur (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) in einer Lösung, welche 15 „grains" (972 mg) pro Gallone gemischte Ca²⁺/Mg²⁺-Härte enthielt, und es wurde 0,3 ppm Enzym in jeder Vertiefung bei 40°C verwendet (Waschmittelsystem mit hoher Konzentration).
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Beispiel 2
Es wurden die folgenden Proteasevarianten hergestellt und getestet, wie in Beispiel 1 aufgeführt.
Die Varianten in Tabelle 14 sind Proteasevarianten, die beide Arten von Substitutionen aufweisen: jene, die die Ladung an einer Position verändern, um die Ladung im Vergleich zu B. lentus-GG36 negativer oder weniger positiv zu machen, und jene, die die Ladung an einer Position verändern, um die Ladung im Vergleich zu B. lentus-GG36 positiver oder weniger negativ zu machen, wie auch neutrale Substitutionen, die die Ladung bei einer gegebenen Position eines Rests nicht beeinflussen. Dies erzeugt Proteasevarianten, die sowohl in Systemen mit niedriger Waschmittelkonzentration (Spalte A; 0,67 g/l filtirtes Ariel Ultra(Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) in einer Lösung, welche 3 „grains" (194,4 mg) pro Gallone gemischte Ca²⁺/Mg²⁺-Härte enthielt, und es wurde 0,3 ppm Enzym in jeder Vertiefung bei 25°C verwendet) als auch in Systemen mit hoher Waschmittelkonzentration (Spalte B; 3,38 g/l filtriertes Ariel Futur (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, USA) in einer Lösung, welche 15 „grains" (972 mg) pro Gallone gemischte Ca²⁺/Mg²⁺-Härte enthielt, und es wurde 0,3 ppm Enzym in jeder Vertiefung bei 40°C verwendet) eine bessere Leistung als ein Standard zeigten.

Claims

Verfahren zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit eines Subtilisins in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration, welches weniger als 800 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, umfassend: a) Substituieren eines Aminosäurerests an einer oder mehreren Positionen in einem Vorläufer-Subtilisin, um eine Subtilisin-Variante herzustellen, wobei die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit dem Vorläufer negativer oder weniger positiv zu machen; und b) Testen der Variante in einem System mit niedriger Waschmittelkonzentration, welches weniger als 800 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, indem die Fähigkeit des Vorläufers und der Variante, einen Fleck zu entfernen, verglichen wird.
Verfahren zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit eines Subtilisins in einem System mit hoher Waschmittelkonzentration, welches mehr als 2000 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, umfassend: a) Substituieren eines Aminosäurerests an einer oder mehreren Positionen in einem Vorläufer-Subtilisin, um eine Subtilisin-Variante herzustellen, wobei die Substitution die Ladung an jener Position verändert, um die Ladung verglichen mit dem Vorläufer positiver oder weniger negativ zu machen; und b) Testen der Variante in einem System mit hoher Waschmittelkonzentration, welches mehr als 2000 ppm Waschmittelkomponenten, die in dem Waschwasser vorhanden sind, aufweist, indem die Fähigkeit des Vorläufers und der Variante, einen Fleck zu entfernen, verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Vorläufer ein Bacillus-Subtilisin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Vorläufer Bacillus lentus-Subtilisin ist.
Verfahren zur Herstellung einer Waschmittelzusammensetzung, welches umfasst, nachdem man die Leistungsfähigkeit eines Subtilisins durch Herstellen einer Subtilisin- Variante durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 verbessert hat, die Subtilisin-Variante zu einer pulverförmigen oder flüssigen Waschmittelzusammensetzung mit einem pH zwischen 6,5 und 12,0 in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 5 Gew.-% zu formulieren.