CN112662652A

CN112662652A - 一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体

Info

Publication number: CN112662652A
Application number: CN202110072841.3A
Authority: CN
Inventors: 李玉; 路福平; 刘逸寒; 李家霖; 杨子璇; 王兴吉; 李庆刚; 刘文龙
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-01-20
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明主要利用易错PCR技术对来源于克劳氏芽胞杆菌的碱性蛋白酶进行了定向改造，获得了一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQID NO：4所示。相同条件下，本发明突变体的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力分别是野生型的91.97％和65.84％，该蛋白酶在皮革工业中具有较高的应用价值。

Description

一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体及其应用。

背景技术

蛋白酶是一种具有复杂结构与功能的水解酶，能够裂解肽键产生短肽或氨基酸。按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为三种类型：酸性蛋白酶，最适pH为2.0～5.0，主要来源于真菌；中性蛋白酶，最适pH为7.0，主要来源于植物的；碱性蛋白酶，最适pH为8.0及以上，主要来源于微生物。蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一，销售额占所有酶制剂销售量的60％以上，在洗涤剂、医药、食品、皮革、丝绸、摄影等领域有着广泛的应用。

在皮革工业中，脱毛是皮革加工的主要步骤，即去除皮革上的毛发、表皮、非胶原蛋白和其他粘合物质。传统的脱毛工艺使用的是硫化钠，产生的大量含硫废弃物导致了严重的污染问题，此外，在制革鞣前准备中，大量的化工材料添加也造成了严重的环境隐患。目前，使用酶制剂代替化学品来进行清洁化生产的相关应用在制革中正受到越来越多的关注。然而，由于传统蛋白酶中的胶原降解蛋白酶活力较强，在应用过程中对皮胶原易造成损伤，导致松面、烂面等现象出现，极大的降低了经济效益，因此造成了蛋白酶在皮革工业中的应用局限性。因此，开发一种更适合皮革加工的蛋白酶能够提高在使用过程中的安全性，具有较高的应用需求与实践价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明主要利用易错PCR技术对来源于克劳氏芽胞杆菌的碱性蛋白酶进行了定向改造，获得了一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶，该蛋白酶在皮革工业中具有较高的应用价值。

本发明目的之一是，提供一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明目的之二是，提供编码所述碱性蛋白酶突变体的基因。

在本发明一种具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明目的之三是，提供包含所述碱性蛋白酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。

在本发明一种具体实施方式中，所述载体是pWB980。

本发明目的之四是，提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的碱性蛋白酶突变体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌。

在本发明一种具体实施方式中，所述宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218(生物保藏信息已公开于专利CN105087448B)。

在本发明另一具体实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600。

本发明目的之五是，提供本发明所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸，并且，其相比野生型具有降低的胶原降解酶活力。

本发明目的之六是，提供制备本发明所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述碱性蛋白酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将碱性蛋白酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。

有益效果：

本发明通过易错PCR技术获得的碱性蛋白酶突变体，通过基因工程技术在芽孢杆菌表达***中进行了重组和表达，相同条件下，本发明突变体的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力分别是野生型的91.97％和65.84％，与野生型的碱性蛋白酶活力相当的同时对胶原的降解活力显著降低，在皮革工业中具有更高的应用价值。

附图说明

图1：实施例中野生型碱性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图；其中：M为DNA Marker，1为alk基因。

图2：实施例中野生型与突变体的酶活力对比。

图3：实施例中野生型与突变体的温度稳定性对比。

图4：实施例中野生型与突变体的pH稳定性对比。

图5：实施例中野生型与突变体的纯化蛋白电泳验证。

图6：本发明碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、碱性蛋白酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Gly95Glu，表示第95位的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的甘氨酸Gly替换成谷氨酸Glu，位置的编号对应于SEQ ID NO：2中碱性蛋白酶的氨基酸序列编号。如Gly95Glu/Gly258Met，表示第95位和第258位的氨基酸都发生了突变。

在本发明中，alk表示野生型碱性蛋白酶的基因序列，即原始序列(如SEQ ID NO：1所示)，alkm则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)；ALK表示野生型碱性蛋白酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，ALKM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：

碱性蛋白酶	碱基	氨基酸
			ALK	第537-539位为GGG、第1026-1028位为GGA	Gly95、Gly258
ALKM	第537-539位为GAG、第1026-1028位为ATG	Gly95Glu/Gly258Met

本发明技术方案概述如下：

通过易错PCR技术，对亲本克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)来源的野生型碱性蛋白酶alk基因序列进行随机突变，获得了一个突变体基因alkm。将突变体基因与质粒pWB980进行相同双酶切并连接获得重组载体，转入枯草芽孢杆菌宿主WB600中，最终电转到解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中进行表达，纯化蛋白并验证其酶活力，获得了一种相比野生型胶原降解活力显著降低的碱性蛋白酶突变体。

本发明所用培养基及酶活测定方法：

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

SP-A盐溶液：(NH4)₂SO₄ 4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，柠檬酸钠2g/L；

SP-B盐溶液：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L；

SPI(200mL)：SP-A盐溶液98mL，SP-B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂ 6mL；

100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：

LBS培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L；

复苏培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，甘露醇6.92246g/L。

本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

本发明胶原降解酶活力的测定：

采用茚三酮比色法，即I型胶原(可溶)为底物，以甘氨酸为标准物。

样品的准备：取1mL用蒸馏水稀释后酶液放入试管中，加入1mL 5mg/mL I型胶原溶液，混合均匀，40℃水浴中准确加热10min后，立即加入2mL、0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应，取2mL反应液，12000×g离心1min，取1mL上清用茚三酮比色法测定上清中的甘氨酸含量(μg/mL)。每一样品设3次重复，结果取平均数。

对照品的准备：与样品的准备方法相同，区别在于试管中的酶液先加入三氯乙酸溶液使酶失活后，再加入I型胶原溶液。

其中，酶液和酪蛋白溶液混合之前，两种溶液均在40℃水浴中预热2min以上。

胶原蛋白酶酶活力计算公式：酶活力＝g/t×v×n

式中，g为样品中的甘氨酸重量(μg)；t为反应时间(min)；n为酶液稀释倍数；v为反应液体积(mL)。

酶活力定义：在40℃条件下每毫升酶液在每min内水解I型胶原产生1μg甘氨酸的酶量(U/mL)。

实施例1：野生型碱性蛋白酶alk重组菌株的构建

1.1合成并扩增野生型碱性蛋白酶基因alk

根据GenBank：FJ940727.1获得克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因alk的野生型序列(如SEQ ID NO：1所示)，委托生物公司合成其序列，并通过PCR进行扩增，引物序列如下：

引物P1：F 5’-CCCAAGCTTATGAGGAGGGAACCGAATGAAG-3’

引物P2：R 5’-CGCGGATCCTTATTGATTAGCGTGTTGCCGC-3’

以P1和P2作为上、下游引物，以alk的野生型基因为模板进行扩增；

其扩增的反应体系为：

上游引物P1	1.5μL
		下游引物P2	1.5μL
DNA模板	2.0μL
		PrimerStar酶	25μL
ddH<sub>2</sub>O	20μL

扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：56℃45s；延伸：72℃2min；反应30个循环；延伸：72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共1184bp(如图1所示)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型碱性蛋白酶基因，即alk。

1.2表达载体的线性化

提取pWB980质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经HindIII和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。

1.3将经HindIII和BamHI双酶切的目标片段(alk)和载体片段连接形成重组质粒pWB980-alk，将重组质粒转化进枯草芽孢杆菌WB600中，经测序验证序列如SEQ ID NO：1。

实施例2：利用易错PCR方法获得碱性蛋白酶突变体

2.1基于易错PCR技术进行随机突变，构建新型碱性蛋白酶，设计引物如下：

引物P1：F 5’-CCCAAGCTTATGAGGAGGGAACCGAATGAAG-3’

引物P2：R 5’-CGCGGATCCTTATTGATTAGCGTGTTGCCGC-3’

在易错PCR反应体系中，以P1和P2作为上下游引物，以野生型碱性蛋白酶基因alk为模板，进行易错PCR。

其扩增的反应体系为：

10×PCR缓冲液(无Mg<sup>2+</sup>)	10μL
		dATP	0.2μL
dGTP	0.2μL
		dCTP	1.0μL
dTTP	1.0μL
		引物P1	1.5μL
引物P2	1.5μL
		野生型碱性蛋白酶基因	1.0μL
Taq DNA聚合酶	1.0μL
		Mg<sup>2+</sup>(7mM)	28μL
Mn<sup>2+</sup>(0.15mM)	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	52.6μL

扩增条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min反应30个循环；72℃延伸10min。

2.2将获得的碱性蛋白酶突变体基因分别克隆入表达载体pWB980中，得到若干重组质粒pWB980-alkmx，并化转入枯草芽胞杆菌WB600中，将重组质粒pWB980-alk和pWB980-alkmx转化解淀粉芽胞杆菌中，获得能表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株。

实施例3：碱性蛋白酶突变体的筛选

3.1 96孔深孔板初筛

将实施例2获得的重组菌株接种于卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(50μg/mL卡那霉素抗性)，37℃、220r/min振荡培养12h，之后以2％的接种量接种于96孔深孔板，37℃、600r/min振荡培养48h，即可制备获得碱性蛋白酶酶液。

分别测定上述酶液的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力，将所有突变体的酶活与野生型碱性蛋白酶酶活比较，最终筛选到1株胶原降解活力显著低于野生型的菌株。

3.2摇瓶复筛、纯化及酶活性研究

将上述重组菌株接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜发酵培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，将分别包含alk和alkm基因的重组解淀粉芽胞杆菌菌株在50mL补充有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中以220rpm和37℃条件下培养48h。培养液离心后取上清液使用70％饱和度的硫酸铵进行盐析。形成的沉淀使用MES缓冲液(20mmol/L,pH 7.0；缓冲液A)透析，保留液在缓冲液A预平衡的CM–Sephadex色谱柱(2.5×20cm)上进行离子交换层析，使用含有0～1mol/L NaCl的缓冲液A对蛋白质进行线性梯度洗脱。将含有蛋白酶活性的洗脱液加到用缓冲液A预平衡的Superdex G-75凝胶柱(1.6×80cm)上。然后用缓冲液A(0.5ml min-1)洗脱纯化后的蛋白质。测定进行超滤纯化后的酶液的碱性蛋白酶活力和胶原降解活力，得到一种碱性蛋白酶活力和胶原降解活力分别是野生型的91.97％和65.84％的突变体(酶活力对比如图2所示)。将超滤纯化后的酶液在不同温度及pH下孵育20h，测定其残余碱性蛋白酶活力，结果分别如图3、图4所示，该碱性蛋白酶突变体的最适温度为40℃，最适PH值为10。

实施例4：碱性蛋白酶突变体序列的确定

将上述菌株提取碱性蛋白酶基因序列，并进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，扩增得到了碱性蛋白酶突变体基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该编码基因命名为alkm。

将上述获得的碱性蛋白酶alkm的氨基酸序列分别与野生型碱性蛋白酶alk的氨基酸序列SEQ ID NO：1进行对比分析，结果显示：与野生型碱性蛋白酶alk相比，碱性蛋白酶alkm的第95位氨基酸由Gly突变为Glu，第258位氨基酸由Gly突变为Met(如图6所示)。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学、山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种胶原降解活力降低的碱性蛋白酶突变体

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)

<400> 1

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtgtgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaggggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcgttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaaacgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgct aa 1062

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 3

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtgtgcaagc cccagctgcc 300

cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360

actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420

caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480

attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attagaggcg 540

agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600

atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660

gttaatagcg cgacttctag aggcgttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720

ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780

aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840

gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaaacgg tacatcgatg 900

gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960

aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020

tatatgagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgct aa 1062

<210> 4

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Glu Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Met Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccaagctta tgaggaggga accgaatgaa g 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcggatcct tattgattag cgtgttgccg c 31

Claims

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。

2.编码权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的基因。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。

5.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是pWB980。

6.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

7.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸，并且，所述突变体相比野生型具有降低的胶原降解酶活力。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述突变体的碱性蛋白酶活力和胶原降解酶活力分别是野生型的91.97％和65.84％。

9.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将如SEQ ID NO：3所示的碱性蛋白酶突变体基因与线性化pWB980载体经HindIII和BamHI双酶切、连接，得到重组载体；

(2)所述重组载体转化入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，得到重组菌株；

(3)表达所述重组菌株，从表达产物中纯化获得碱性蛋白酶突变体。