DE69829878T2 - Kohlenhydratoxidase sowie verwendung derselben beim backen - Google Patents

Kohlenhydratoxidase sowie verwendung derselben beim backen Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Kohlenhydratoxidase und ihre Verwendung, z.B. beim Backen.
  • BESCHREIBUNG DES RELEVANTEN STANDS DER TECHNIK
  • Es ist bekannt, bei dem Prozess des Brotbackens Brot-verbessernde und/oder Teig-verbessernde Zusätze zu dem Brotteig zuzufügen, deren Wirkung unter anderem sowohl in einem/r verbesserten Textur, Volumen, Geschmack und Frische des Brotes wie auch verbesserter maschineller Bearbeitbarkeit und Stabilität des Teiges resultiert.
  • Teig-„Verbesserer" zum Stärken des Glutens und Verbessern der rheologischen und Bearbeitungseigenschaften des Teiges sind in der Industrie gut bekannt und werden seit langer Zeit verwendet. Nicht spezifische Oxidantien wie z.B. Iodate, Peroxide, Ascorbinsäure, Kaliumbromat und Azodicarbonamid haben eine Gluten-stärkende Wirkung. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Verbesserer die Bildung von Interprotein-Bindungen induzieren, die das Gluten, und hierdurch den Teig, stärken.
  • Es ist auch bekannt, Glucoseoxidase zu verwenden, um Gluten zu stärken und die rheologischen und Bearbeitungseigenschaften des Teiges zu verbessern. So offenbart US 2,783,150 die Verwendung von Glucoseoxidase im Mehl, um die Teigstärke sowie die Textur und das Erscheinungsbild des gebackenen Brots zu verbessern. EP 321 811 und EP 338 452 offenbaren die Verwendung von Glucoseoxidase in Kombination mit anderen Enzymen (Sulfhydryloxidase, Hemicellulase, Cellulase) beim Backen. Allerdings ist die Wirksamkeit von Gucoseoxidase als ein Teig- und/oder Brot-verbessernder Zusatz aufgrund des im Allgemeinen niedrigen Glucosegehalts in den Getreidemehlen, die zur Herstellung von gebackenen Produkten verwendet werden, begrenzt.
  • Daher besteht ein Interesse an der Identifizierung von Oxidoreduktasen, die auf andere Substrate als Glucose wirken. WO 96/39851 offenbart die Verwendung einer Hexoseoxidase, die in der Lage ist, D-Glucose und einige andere reduzierende Zucker, einschließlich Maltose, Lactose, Galactose, Xylose, Arabinose und Cellobiose zu ihren entsprechenden Lactonen mit anschließender Hydrolyse zu den entsprechenden Aldobionsäuren zu oxidieren. WO 97/22257 offenbart die Verwendung einer Pyranoseoxidase beim Backen. Das Enzym katalysiert die Oxidation einiger Monosaccharide an Position C2 bei gleichzeitiger Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Obwohl Glucose in seiner Pyranoseform tendenziell das bevorzugte Substrat darstellt, ist das Enzym in der Lage, andere Substrate, z.B. Furanosen, wie z.B. Xylose, zu oxidieren.
  • Obwohl Enzyme, die die Oxidation von Glucose und anderen Zuckern direkt in die entsprechende Aldonsäure katalysieren, in der Natur weit verbreitet zu sein scheinen, sind die meisten der bekannten Zuckeroxidasen spezifisch für Monosaccharide. Eine Oligosaccharidoxidase, die aus einer Weizenvollkornmehlkultur eines aus Erde isolierten Acremonium strictum Stamms T1 isoliert und gereinigt wurde, wurde von Lin et al. (1991, Biochim. Biophys. Acta 1118: 41–47) beschrieben. Das Enzym besitzt die Fähigkeit, Oligosaccharide mit einem Glucoserest an dem reduzierenden Ende zu oxidieren. Das Enzym zeigt gegenüber Maltose, Lactose, Cellubiose und Maltooligosacchariden, die aus bis zu sieben Glucoseeinheiten zusammengesetzt sind, Reaktivität. JP-A-5-84074 offenbart die Verwendung des Enzyms als ein analytisches Reagens.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder haben eine neue Kohlenhydratoxidase mit der Fähigkeit gefunden, Maltodextrine und Cellodextrine effizienter als Glucose zu oxidieren. Die neue Oxidase kann aus Microdochium, insbesondere M. nivale, erhalten werden. Die Erfinder haben einen solchen Stamm als M. nivale CBS 100236 isoliert und hinterlegt. Die Aminosäuresequenz der neuen Kohlenhydratoxidase hat eine sehr geringe Homologie (< 20% Identität) mit bekannten Aminosäuresequenzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Kohlenhyrdatoxidase zur Verfügung, die in der Lage ist, reduzierende Oligosaccharide mit einem Glucoserest am reduzierenden Ende zu oxidieren, und die:
    • a) das Polypeptid ist, das von der Kohlenhyratoxidase-kodierenden DNA-Sequenz kodiert wird, die in Plasmid pCR2.1-TOPO kloniert wurde, welches in Escherichia coli NRRL B-30034 vorhanden ist, oder
    • b) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens 80% Identität mit der in SEQ ID NR. 2 gezeigten Sequenz aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kohlenhydratoxidase aus einem Stamm von N. nivale, vorzugsweise dem Stamm N. nivale, CBS 100236, erhältlich.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresequenz bereit, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die diese Kohlenhydratoxidase kodiert.
  • Diese Nukleinsäuresequenz umfasst:
    • a) die Kohlenhydratoxidase-kodierende DNA-Sequenz, die in Plasmid pCR2.1-TOPO kloniert wurde, welches in Escherichia coli NRRL B-30034 vorhanden ist, oder
    • b) eine DNA-Sequenz, die mindestens 80% Identität mit der in den Positionen 67–1550 von SEQ ID NR. 1 gezeigten DNA-Sequenz aufweist.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt bereit, das die zuvor definierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der Kohlenhydratoxidase in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Expressionsvektor, der dieses Nukleinsäurekonstrukt, einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale umfasst.
  • Eine rekombinante Wirtszelle umfassend dieses Nukleinsäurekonstrukt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Herstellen einer Kohlenhydratoxidase bereit, das das Kultivieren dieser rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression der Kohlenhydratoxidase zuträglich sind, und das Gewinnen der Kohlenhydratoxidase umfasst.
  • In einem noch weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung der Kohlenhydratoxidase zum Herstellen eines Teiges und/oder eines gebackenen Produktes, das aus einem Teig hergestellt ist, und die Verwendung der Kohlenhydratoxidase, um ein Oligosaccharid mit einem Glucoserest am reduzierenden Ende zu der entsprechenden Säure zu oxidieren.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1 bis 3 stellen die Plasmide pBANe15, pEJG33 bzw. pEJG35 dar. Einzelheiten sind in den Beispielen angegeben.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Verwendung der Kohlenhydratoxidase beim Backen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Zugabe der Kohlenhydratoxidase zu einem Teig bereit. Die Kohlenhydratoxidase kann in Form eines Teig- und/oder Brot-verbessernden Zusatzes, wie unten beschrieben, zugefügt werden.
  • Die Kohlenhydratoxidase wird im Allgemeinen in einer Menge zugefügt, die zur Bereitstellung eines messbaren Effekts auf mindestens eine interessierende Eigenschaft des Teigs und/oder des gebackenen Produkts wirksam ist. Der Brot-verbessernde und/oder Teig-verbessernde Zusatz wird im Allgemeinen in den Teig in einer Menge eingeschlossen, die 0,01 bis 5%, insbesondere 0,1 bis 3%, entspricht. Das Enzym wird typischerweise in einer Menge zugefügt, die 0,01 bis 100 mg Enzymprotein pro kg Mehl, vorzugsweise 0,1 bis 25 mg pro kg, weiter bevorzugt 0,1 bis 10 mg pro kg, und am meisten bevorzugt 0,5 bis 5 mg pro kg entspricht.
  • Der Spiegel an Oligosacchariden im Teig kann durch Zugabe einer Amylase, die Stärke hydrolysiert, um als ein Hauptprodukt Oligosaccharide zu bilden, z.B. eine Bacillus stearothermophilus maltogene alpha-Amylase (kommerziell erhältlich als Novamyl®), eine Aspergillus oryzae alpha-Amylase (kommerziell erhältlich als Fungamyl®) oder eine beta-Amylase, erhöht werden.
  • Die Verwendung der Oligosaccharidoxidase kann sowohl in einem erhöhten Volumen und einer verbesserten Krumenstruktur und Weichheit des gebackenen Produktes wie auch einer erhöhten Stärke, Stabilität und reduzierten Klebrigkeit des Teiges resultieren, was so zu einer verbesserten maschinellen Bearbeitbarkeit führt. Die Wirkung kann zusätzlich oder als eine Folge einer Gluten-stärkenden Wirkung, die unten diskutiert wird, auftreten. Die Wirkung auf den Teig kann besonders vorteilhaft sein, wenn ein Mehl geringer Güte verwendet wird. Die verbesserte maschinelle Bearbeitbarkeit ist besonders wichtig im Zusammenhang mit einem Teig, der industriell verarbeitet werden soll.
  • Die Teigstabilität ist eine der wichtigsten Eigenschaften eines Backteigs und sie ist für Anwendungen sowohl im großen als auch im kleinen Maßstab wichtig. Ein stabiler, oder starker, Teig ist zu größerer Toleranz hinsichtlich Mischungszeit, Gärdauer und Maschinenvibrationen während des Teigtransports in der Lage, wohingegen ein schwacher, oder weniger stabiler, Teig weniger tolerant gegenüber diesen Behandlungen ist. Während Mehl mit einem hohen Glutengehalt und einer guten Glutenqualität zu einem starken Teig beiträgt, resultiert ein Mehl, welches einen geringen Proteingehalt enthält, oder Mehl mit schlechter Glutenqualität in einem schwachen Teig. Folglich resultiert ein starker Teig, der überlegene rheologische und Bearbeitungseigenschaften hat, aus einem Mehl, das ein starkes Glutennetzwerk enthält.
  • Die Oligosaccharidoxidase kann zu jeder Mischung an Teigsubstanzen, zu dem Teig, oder zu jeder Substanz, die in den Teig aufgenommen werden soll, zugefügt werden; das heißt, die Oligosaccharidoxidase kann in jedem Schritt der Teigherstellung zugefügt werden und sie kann in ein, zwei oder mehreren Schritten zugefügt werden, wo geeignet und unter Vermeidung der Aussetzung des Enzyms gegenüber starken Chemikalien oder Bedingungen, bei denen es inaktiviert werden könnte.
  • Substratspezifität
  • Die Kohlenhydratoxidase hat eine höhere Aktivität auf ein Maltooligosaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 6 (insbesondere Maltose, Maltotriose oder Maltotetraose) als auf Glucose bei einer Substratkonzentration von 10 mM oder weniger. Der Vergleich kann bei einer Substratkonzentration von 1 mM oder weniger durchgeführt werden und die Aktivität auf Maltotetraose ist vorzugsweise doppelt so hoch wie die Aktivität auf Glucose. Die Kohlenhydratoxidase kann eine oxidierende Aktivität auf Maltodextrine- oder Cellodextrine-Maltotetraose haben, die mindestens doppelt so hoch ist wie die oxidierende Aktivität auf Glucose bei einer Substratkonzentration von 0,83 mM.
  • Solche Substratkonzentrationen sind stellvertretend für die Konzentration in typischen Teigen, die nach den üblichen Backgepflogenheiten hergestellt werden. Daher wurde z.B. in einem aus Teig hergestellten Extrakt festgestellt, dass die Konzentration von Maltose 4,1 mM betrug, was 41 mMolen/kg Teig, der aus einer 1:10 Extraktion für 1 Stunde bei 40°C wie von Poulsen, C., et al. (1996, Cereal Chem., 75: 51–57) beschrieben erhalten wurde, entspricht. Es wurde weiterhin erwähnt, dass die Menge von extrahierbarer Maltose höher sein könnte, wenn ausreichend endogene amylolytische Aktivität (z.B. beta-Amylase) in dem Teig vorhanden wäre, oder endogene amylolytische Enzyme zu dem Teig oder Mehl zugefügt würden, was häufig gemacht wird. WO 96/39851 offenbart in ähnlicher Weise, dass Maltose in Teig mit einem Spiegel von 1,4% (Gew./Gew.) vorhanden ist. Daher kann die Menge an verfügbarem Substrat, z.B. Maltose, in Abhängigkeit von sowohl dem Mehltyp und der Mehlmenge, dem Rezept, dem Mischungs- und Fermentationsverfahren wie auch von der Gegenwart anderer Zusätze differieren.
  • Bei pH 6 und 50 mM hat die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale die folgenden Präferenzen (absteigende Reihenfolge): Cellobiose > Maltose > Glucose > Xylose > Lactose. Auf Basis von Michaelis-Menten-Kinetiken sind die apparenten Km-Werte für die folgenden Substrate: 59 mM (Cellobiose), 11 mM (Maltose), 42 mM (Glucose); Vmax ist für Glucose und Maltose ähnlich. Daher zeigt die Oxidase eine Präferenz für Maltose gegenüber Glucose, insbesondere bei niedrigen Substratkonzentrationen (unter 10 mM).
  • Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale ist in der Lage, Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad (DP; degree of polymerization) von DP2–DP5 bei einer Substratkonzentration von 0,83 mM mit einer höheren Geschwindigkeit als das entsprechende Monosaccharid zu oxidieren. Daher kann das Enzym sowohl Maltodextrine als auch Cellodextrine, bei denen die Monosaccharid-Einheiten durch alpha-1,4- bzw. beta-1,4-glycosidische Bindungen verknüpft sind, mit einer höheren Geschwindigkeit als Glucose hydrolysieren. Die Kohlenhydratoxidase kann alle Cellodextrine mit DP2–DP5 gleich gut und auf einem ungefähr 10-fach höheren Niveau als das Monosaccharid Glucose hydrolysieren. Mit Maltodextrinen als Substrat bewegt sich die Aktivität der Kohlenhydratoxidase von 1 ½-fach höher für Maltohexaose bis fast 5-fach höher für Maltotetraose als für das Monosaccharid.
  • Kohlenhydratoxidase-Eigenschaften
  • Die Kohlenhydratoxidase ist vorzugsweise aktiv und stabil bei einem pH im Bereich von 5–7, z.B. mit mehr als 40% Aktivität in diesem Bereich und am meisten bevorzugt mit einer optimalen Aktivität in diesem Bereich. Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale hat eine optimale Aktivität bei ungefähr pH 6 und zeigt eine Aktivität, die mindestens 80% (relativ zur maximalen Aktivität) im pH-Bereich 5 bis 7 beträgt. Bei 40°C ist sie im pH-Bereich 4 bis 9 stabil, aber bei pH 3 instabil.
  • Die Kohlenhydratoxidase ist vorzugsweise aktiv und stabil bei 20 bis 45°C, z.B. mit mehr als 50% Aktivität in diesem Bereich und am meisten bevorzugt mit einer optimalen Aktivität in diesem Bereich. Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale hat eine optimale Aktivität bei ungefähr 40°C und zeigt mindestens 70% Aktivität (relativ zur maximalen Aktivität) im Bereich von 30–60°C: Bei pH 6 ist sie bis 60°C stabil, aber bei 70°C instabil. Sie hat eine Denaturierungstemperatur von 73°C.
  • Die Kohlenhydratoxidase ist in der Lage, reduzierende Oligosaccharide mit einem Glucoserest am reduzierenden Ende zu oxidieren. Sie oxidiert den Glucoserest an der 1-Position, um die entsprechende Säure zu bilden. Daher oxidiert sie Maltose, um Maltobionsäure zu bilden und Lactose um Lactobionsäure zu bilden.
  • Die Kohlenhydratoxidase-Aktivität kann isoliert sein, z.B. im Wesentlichen frei von anderen, Nicht-Kohlenhydratoxidase-Polypeptiden, z.B. mehr als 80% rein und weiter bevorzugt mehr als 90% rein auf einer Proteinbasis, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
  • Die Kohlenhydratoxidase aus M nivale hat eine Molekulargewicht von ungefähr 52 kDa, wie durch SDS-PAGE bestimmt, und einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,9. Sie zeigt mit Elektronenakzeptoren wie Kaliumferricyanid, Methylen-Blau, Benzoquinon und 2,6-Dichlorphenol-Indophenol (DCPIP) Dehydrogenase als Nebenaktivität.
  • Quellen für Kohlenhydratoxidase
  • Die Kohlenhydratoxidase kann aus Mikroorganismen von Xylariales; insbesondere mitospore Xylariales wie dem Genus Microdochium, vorzugsweise der Spezies M. nivale erhalten werden. Solche Stämme sind leicht in Kultursammlungen wie der „American Type Culture Collection (ATCC)", der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) und dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) öffentlich erhältlich.
  • Der Genus Microdochium ist in Microdochium Syd (Samuels und Hallett, 1983, TBMS 81: 473) beschrieben. Einige Stämme von Microdochium sind zuvor unter den Synonymen Gerlachia, G. nivalis, G. oryzae, Fusarium nivale oder Rynchosporium oryzae beschrieben worden. Sie sind weiter beschrieben durch Monographella (Hyponectr) fide (Müller, 1977, Rev. Mycol. 41: 129).
  • Ein bevorzugter Stamm ist M. nivale, NN008551. Es wurde aus einer natürlichen Quelle isoliert, die in Indien entnommen wurde und gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 4. Dezember 1997 bei dem „Centraalbureau voor Schimmelcultures" unter der Zugangsnummer CBS 100236 hinterlegt.
  • Die Erfinder haben das Gen, das die Kohlenhydratoxidase kodiert, aus M. nivale CBS 100236 isoliert und in E. coli insertiert. Der E coli Stamm, der das Gen beherbergt, wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 12. Juni 1998 bei der „Agricultural Research Service Collection" (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL, hinterlegt und mit NRRL B-30034 bezeichnet.
  • Zusätzliches Enzym
  • Die Kohlenhydratoxidase kann zu dem Teig als einziges Enzym zugegeben werden oder sie kann in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Enzymen verwendet werden. Das zusätzliche Enzym kann eine Amylase (z.B. wie oben beschrieben), eine Cyclodextringlucanotransferase, eine Peptidase, insbesondere eine Exopeptidase, eine Transglutaminase, eine Lipase, eine Phospholipase, eine Cellulase, eine Hemicellulase, insbesondere eine Pentosanase, wie z.B. Xylanase, eine Protease, eine Protein-Disulfidisomerase, z.B. eine Protein-Disulfidisomerase wie in WO 95/00636 offenbart, eine Glycosyltransferase und eine Oxidoreduktase, z.B. eine Peroxidase, eine Laccase, eine Glucoseoxidase, eine Pyranoseoxidase, eine Lipoxigenase, eine L-Aminosäureoxidase oder eine zusätzliche Kohlenhydratoxidase und ähnliche sein.
  • Das zusätzliche Enzym kann jeden Ursprungs sein, einschließlich von einem Säuger und einer Pflanze, und vorzugsweise mikrobiellen (Bakterien, Hefe oder Pilze) Ursprungs sein und kann durch im Stand der Technik gewöhnlich verwendete Techniken erhalten werden.
  • Die Amylase kann aus einem Bakterium oder einem Pilz stammen, insbesondere von einem Stamm von Aspergillus, vorzugsweise einem Stamm von A. niger oder A. oryzae oder von einem Stamm von Bacillus. Einige Beispiele sind alpha-Amylase, z.B. aus Bacillus amyloliquefaciens, und Amyloglucosidase, z.B. aus A. niger. Kommerzielle Produkte schließen BAN und AMG (Produkte von Novo Nordisk A/S, Dänemark) Grindamyl A 1000 oder A 5000 (erhältlich von Grindsted Products, Dänemark) und Amylase H und Amylase P (Produkte von Gist-Brocades, Niederlande) ein.
  • Die Protease kann Neutrase (erhältlich von Novo Nordisk A/S, Dänemark) sein.
  • Die Lipase kann aus einem Stamm von Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus oder Pseudomonas, insbesondere aus T. lanuginosus (H. lanuginosa, EP 305,216 ), Rhizomucor miehei ( EP 238,023 ), C. antarctica (z.B. Lipase A oder Lipase B, beschrieben in WO 88/02775), A. niger, Rhizopus delemar oder Rhizopus arrhizus oder P. cepacia ( EP 214,761 und WO 89/01032) stammen.
  • Teig
  • Der Teig ist im Allgemeinen ein Mehlteig, der Weizenschrot oder Weizenmehl und/oder andere Typen von Schrot, Mehl oder Stärke, wie z.B. Maismehl, Maisstärke, Roggenschrot, Roggenmehl, Hafermehl, Haferschrot, Sojamehl, Hirseschrot, Hirsemehl, Reisstärke, Reismehl, Kartoffelschrot, Kartoffelmehl oder Kartoffelstärke umfasst.
  • Der Teig kann frisch, gefroren oder vorgebacken sein.
  • Der Teig ist normalerweise ein Sauerteig oder ein Teig, der einer Ansäuerung unterzogen wurde. Der Teig kann auf verschiedene Weisen angesäuert sein, z.B. durch Zugabe chemischer Säuerungsmittel, z.B. Natriumbicarbonat, oder durch Zugabe von einem Sauerteig (fermentierender Teig), aber es ist bevorzugt, den Teig durch Zugabe einer geeigneten Hefekultur, wie z.B. einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) z.B. einem kommerziell erhältlicher Stamm von S. cerevisiae, anzusäuern.
  • Der Teig kann auch andere übliche Teigzutaten umfassen, z.B.: Proteine, wie z.B. Milch oder Milchpulver, Gluten und Soja; Eier (entweder ganze Eier, Eigelb oder Eiweiß); Fett, wie granuliertes Fett oder Öl; ein Oxidans, wie z.B. Ascorbinsäure, Kaliumbromat, Kaliumiodat, Azodicarbonamid (ADA) oder Ammoniumpersulfat; ein Reduktionsmittel, wie z.B. L-Cystein; einen Zucker; ein Salz, wie z.B. Natriumchlorid, Kalziumacetat, Natriumsulfat oder Kalziumsulfat. Der Teig kann weiterhin einen Emulgator wie z.B. Mono- oder Diglyceride, Diacetylweinsäureester von Mono- oder Diglyceriden, Zuckerester von Fettsäuren, Polyglycerinester von Fettsäuren, Milchsäureester von Monoglyceriden, Essigsäureester von Monoglyceriden, Polyoxyethylenstearate, Phospholipide, Lecithin und Lysolecithin umfassen.
  • Der Teig kann ein Nudelteig, vorzugsweise hergestellt aus Hartweizenmehl oder einem Mehl vergleichbarer Qualität, sein. Die Kohlenhydratoxidase kann, wenn sie bei der Herstellung von Pasta oder Nudeln verwendet wird, zu einer Stärkung der Glutenstruktur führen und dadurch eine Reduktion der Klebrigkeit des Teiges, eine Erhöhung der Teigstärke und ein Teigprodukt mit verbesserter Textur bereitstellen.
  • Gebackenes Produkt
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann für jede Art eines aus Teig hergestellten gebackenen Produkts, entweder mit weichem oder knusprigem Charakter, von weißem, hellem oder dunklem Typ, verwendet werden. Beispiele sind Brot (insbesondere Weiß-, Vollkorn- oder Roggenbrot), typischerweise in Form von Laiben oder Brötchen, Brot vom Typ eines französischen Baguettes, Pitabrot, Tortillas, Kuchen, Pfannkuchen, Kekse, Kleingebäck, Muffins, Mürbeteigkrusten, Knäckebrot, gedämpftes Brot, Pizza und ähnliche.
  • Vormischung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Vormischung, z.B. in Form einer Mehlzusammensetzung, eines Teiges und/oder gebackener, aus Teig hergestellter Produkte, in welchem/r/n die Vormischung die Kohlenhydratoxidase und gegebenenfalls andere, wie oben spezifizierte Enzyme umfasst. Die Vormischung kann durch Mischen des/der relevanten Enzyme) mit einem geeigneten Träger wie Mehl, Stärke, einem Zucker oder einem Salz hergestellt werden. Die Vormischung kann andere Teig-verbessernde und/oder Brot-verbessernde Zusätze, wie z.B. einen jeden der oben genannten Zusätze, einschließlich der Enzyme, enthalten.
  • Teig- und/oder Brot-verbessernde Zusätze
  • Die Kohlenhydratoxidase kann als ein Teig- und/oder Brot-verbessernder Zusatz in Form eines Granulates oder gepressten Pulvers bereitgestellt werden. Der Teig- und/oder Brot-verbessernde Zusatz hat vorzugsweise eine enge Partikelgrößenverteilung mit mehr als 95% (des Gewichts) der Partikel im Bereich von 25 bis 500 μm.
  • Granulate und gepresste Pulver können durch konventionelle Verfahren, z.B. durch Sprühen der Amylase auf einen Träger in einem Flüssigbett-Granulator hergestellt werden. Der Träger kann aus partikulären Kernen mit einer geeigneten Partikelgröße bestehen. Der Träger kann löslich oder unlöslich, z.B. ein Salz (wie z.B. NaCl oder Natriumsulfat), ein Zucker (wie z.B. Saccharose oder Lactose), ein Zuckeralkohol (wie z.B. Sorbit), Stärke, Reis, Maisgrieß oder Soja sein.
  • Aminosäuresequenzen
  • Die Kohlenhydratoxidase kann ein Polypeptid sein, das von Microdochium nivale CBS 100236 hergestellt wird, hat eine wie in SEQ ID NR. 2 gezeigte Aminosäuresequenz, oder wird von einem in E. coli NRRL B-30034 vorhandenen Gen kodiert; oder sie kann ein Analog hiervon sein. Das Analog hat mindestens 80% Identität.
  • Die in SEQ ID NR. 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat weniger als 20% Identität mit bekannten Sequenzen. Sie ist zu 13,6% identisch mit der Aminosäuresequenz eines Reticulinoxidasevorläufers aus kalifornischer Mohnblume (GenPept Zugangsnummer 2897944) und zu 17,8% identisch mit der Aminosäuresequenz einer 6-Hydroxy-D-Nikotinoxidase aus Arthrobacter oxidans (GenPept Zugangsnummer 122805).
  • Eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids kann unter Verwendung von Standardverfahren zum Erhalten und Sequenzieren von Peptiden bestimmt werden, z.B. wie durch Findlay und Geisow, Hrsg., Protein Sequencing – A Practical Approach, 1989, IRL Press, beschrieben. Ein Vergleich mit den Aminosäuresequenzen des Stands der Technik hat gezeigt, dass SEQ ID NR. 2 nur eine geringe Homologie (< 20%) zu jeder Aminosäuresequenz des Stands der Technik hat.
  • Das Polypeptid kann eine Variante mit einer Aminosäuresequenz sein, die sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als zwei Aminosäuren und weiter bevorzugt nicht mehr als eine Aminosäure unterscheidet.
  • Die Kohlenhydratoxidase kann mindestens eine Teilsequenz umfassen, die die N-terminale Aminosäuresequenz, gezeigt bei Positionen 1–24 von SEQ ID NR. 2, oder die internen Sequenzen, gezeigt bei Positionen 229–266, 249–271, 303–322, 336–347, 383–404, 405–414 und 420–440 von SEQ ID NR. 2 ist. Alternativ kann die Kohlenhydratoxidase vorzugsweise mindestens 90% und weiter bevorzugt mindestens 97% sein, was die Aktivität der Kohlenhydratoxidase (hierin mit „homologe Kohlenhydratoxidase" bezeichnet) und der allelen Formen und Fragmente hiervon qualitativ erhält, wobei die Fragmente die Kohlenhydratoxidase-Aktivität behalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die homologe Kohlenhydratoxidase eine Aminosäuresequenz, die sich durch fünf Aminosäuren, vorzugsweise durch vier Aminosäuren, mehr bevorzugt durch drei Aminosäuren, sogar mehr bevorzugt durch zwei Aminosäuren und am meisten bevorzugt durch eine Aminosäure von mindestens einer dieser Aminosäure-Teilsequenzen unterscheidet.
  • Die Aminosäuresequenz der homologen Kohlenhydratoxidase kann sich von jeder der Aminosäure-Teilsequenzen durch eine Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäurereste und/oder der Substitution einer oder mehrerer Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste unterscheiden. Die Aminosäure-Austausche sind vorzugsweise von unbedeutender Natur, d. h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die die Tertiärstruktur und/oder Aktivität der Kohlenhydratoxidase nicht signifikant beeinflussen. Unbedeutende Aminosäure-Austausche können auch kleine Deletionen, typischerweise von 1 bis ungefähr 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxyterminale Verlängerungen, wie z.B. ein aminoterminaler Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten; oder eine kleine Verlängerung, die die Reinigung durch Veränderung der Nettoladung oder einer anderen Funktion erleichtern, wie z.B. einen Polyhistidin-Abschnitt, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne, einschließen.
  • Beispiele von konservativen Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z.B. Arginin, Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (wie z.B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (wie z.B. Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie z.B. Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischen Aminosäuren (wie z.B. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie z.B. Glycin, Alanin, Serin und Threonin). Aminosäure-Substitutionen, die im Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht verändern, sind im Stand der Technik bekannt und beschrieben, z.B. von H. Neurath und R. L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, wie auch diese in umgekehrter Richtung.
  • Nukleinsäuresequenzen
  • Die Erfindung stellt eine Nukleinsäuresequenz bereit, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine Kohlenhydratoxidase kodiert. Die Kohlenhydratoxidase-kodierende Nukleinsäuresequenz kann umfassen:
    • a) den Kohlenhydratoxidase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, der in ein Plasmid kloniert wurde, welches in Escherichia coli NRRL B-30034 vorhanden ist, oder
    • b) die DNA-Sequenz, die mindestens 80% Identität mit der in den Positionen 67–1550 von SEQ ID NR. 1 gezeigten, aufweist.
  • Das Maß der Identität kann ungefähr 90%, vorzugsweise ungefähr 95%, und am meisten bevorzugt ungefähr 97% betragen.
  • Die DNA-Sequenz, die die Kohlenhydratoxidase kodiert, kann aus jeder Zelle oder jedem Mikroorganismus isoliert werden, die/der die fragliche Kohlenhydratoxidase produziert, wobei verschiedene, im Stand der Technik gut bekannte Verfahren verwendet werden können, um die Nukleinsäuresequenz aus ihrer natürlichen Umgebung an eine andere Stelle, wo sie reproduziert werden wird, zu überführen.
  • Der die Kohlenhydratoxidase oxidierende Bereich der Nukleinsäuresequenz, die in CBS 100236 beherbergt ist, oder Subsequenzen hiervon, können verwendet werden, um eine Oligonukleotidprobe zur Isolierung homologer Gene, die Kohlenhydratoxidasen aus anderen Stämmen verschiedener Genera oder Spezies kodieren nach im Stand der Technik gut bekannten Verfahren zu entwickeln. Folglich kann eine genomische oder cDNA-Bibliothek, die aus solchen anderen Organismen hergestellt wird, auf DNA gescreent werden, die mit solchen Proben nach einem Standard-Southern-Blot-Verfahren hybridisiert, um das entsprechende Gen hierin zu identifizieren und isolieren. Solche Proben können wesentlich kürzer als die gesamte Sequenz sein, aber sie sollten mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und am meisten bevorzugt mindestens 40 Nukleotide in der Länge umfassen. Längere Proben, vorzugsweise nicht mehr als 1200 Nukleotide in der Länge, können auch verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Proben können verwendet werden. Die Proben werden typischerweise zum Nachweisen des entsprechenden Gens markiert (z.B. mit 32P, 3H, Biotin oder Avidin). Gemäß der vorliegenden Erfindung können bevorzugte Proben auf Basis von SEQ ID NR. 1 konstruiert werden.
  • Genomische oder eine andere DNA aus solchen anderen Organismen können durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder andere, im Stand der Technik bekannte Trennverfahren getrennt werden. DNA aus Bibliotheken oder aufgetrennte DNA kann auf Nitrocellulose oder andere geeignete Trägermaterialien überführt und auf ihnen immobilisiert werden. Um Klone oder DNA zu identifizieren, die mit Nukleinsäuresequenzen für die Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung, die in CBS 100236 beherbergt ist, zu identifizieren, wird das Trägermaterial in einem Southern-Blot verwendet, in welchem das Trägermaterial schließlich dreimal für 30 Minuten jeweils unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2% SDS bei vorzugsweise nicht mehr als 40°C, weiter bevorzugt nicht mehr als 45°C, weiter bevorzugt nicht mehr als 50°C, weiter bevorzugt nicht mehr als 55°C, sogar noch mehr bevorzugt nicht mehr als 60°C, insbesondere nicht mehr als 65°C gewaschen wird. Die Moleküle, mit denen die Oligonukleotidprobe unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
  • Die isolierten Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, mit einer Oligonukleotidprobe zu hybridisieren, die mit der Nukleinsäuresequenz für die Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung, die in CBS 100236 beherbergt ist, ihrem komplementären Strang, oder einer Subsequenz hybridisiert, können aus Mikroorganismen eines jeden Genus, z.B. aus einer Bakterien- oder Pilzquelle, erhalten werden.
  • Die Kohlenhydratoxidase kann erhalten werden aus (oder ist endogen in) einer gegebenen mikrobiellen Quelle. Daher kann die Kohlenhydratoxidase durch den Organismus der Quelle oder durch eine Zelle, in welcher ein Gen aus dieser Quelle eingeführt wurde, hergestellt wurde.
  • Darüber hinaus können homologe Gene identifiziert und aus anderen Quellen, einschließlich Mikroorganismen, die aus der Natur (z.B. Erde, Kompost, Wasser etc.) unter Verwendung der oben genannten Proben isoliert wurden, erhalten werden. Techniken zum Isolieren von Mikroorganismen aus natürlichen Fundorten sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Nukleinsäuresequenz kann dann durch Screenen einer genomischen oder cDNA-Bibliothek eines anderen Mikroorganismus in ähnlicher Weise abgeleitet werden.
  • Nachdem eine Nukleinsäuresequenz mit der/den oben beschriebenen Probe(n) nachgewiesen wurde, kann die Sequenz durch Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren isoliert oder kloniert werden (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra). Die bekannten Techniken, die zur Isolierung oder Klonierung einer Nukleinsäuresequenz verwendet werden, schließen die Isolation aus genomischer DNA, die Herstellung aus cDNA oder eine Kombination hiervon ein. Das Klonieren der Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung aus solcher genomischer DNA kann z.B. unter Verwendung der gut bekannten Polymeraskettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer, beispielsweise wie in US 4,683,202 oder bei R. K. Saika et al. (1988, Science 239: 487–491) beschrieben, bewirkt werden. Siehe auch beispielsweise Innis, et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Die Nukleinsäuresequenz kann aus einem Organismus, der die Kohlenhydratoxidase produziert, oder einem anderen oder verwandten Organismus, kloniert werden, und daher kann sie beispielsweise eine Allel- oder Spezies-Variante des die Kohlenhydratoxidase kodierenden Bereichs der Nukleinsäuresequenz sein.
  • Alternativ kann die das Enzym kodierende DNA-Sequenz synthetisch durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoamidit-Verfahren, welches von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers (1981, Tetrahedron Letters 22: 1859–1869) beschrieben wurde, oder das von Matthes et al. (1984, The EMBO J. 3: 801–805) beschriebene Verfahren hergestellt werden. Bei dem zuvor genannten Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesegerät, synthetisiert, gereinigt, annealt, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert.
  • Eine Modifikation der die Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz kann zur Synthese einer Kohlenhydratoxidase, die im Wesentlichen ähnlich zu der Kohlenhydratoxidase ist, erforderlich sein. Der Ausdruck „im Wesentlichen ähnlich" zu der Kohlenhydratoxidase bezieht sich auf nicht natürlich vorkommende Formen der Kohlenhydratoxidase. Diese Kohlenhydratoxidase kann sich durch eine gewisse technische Veränderung der aus der natürlichen Quelle isolierten Kohlenhydratoxidase unterscheiden. Zum Beispiel kann es von Interesse sein, Varianten der Kohlenhydratoxidase zu synthetisieren, wobei die Varianten sich durch Verwendung von beispielsweise ortsspezifischer Mutagenese in der spezifischen Aktivität, Thermostabilität, oxidativen Stabilität, dem pH-Optimum oder Ähnlichem unterscheiden. Die analoge Sequenz kann auf Basis des die Kohlenhydratoxidase kodierenden Bereichs der Nukleinsäuresesequenz für die Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung, die in CBS 100236 beherbergt ist, einer Subsequenz hiervon und/oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der Kohlenhydratoxidase, welche von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, führen, was aber der Kodonverwendung des Wirtsorganismus, der zur Herstellung des Enzyms beabsichtigt ist, entspricht, oder durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen, konstruiert werden. Für eine allgemeine Beschreibung der Nukleotidsubstitution siehe z.B. Ford, et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95–107.
  • Solche Substitutionen können außerhalb von Bereichen vorgenommen werden, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind und noch in einer aktiven Kohlenhydratoxidase resultieren. Aminosäurereste, die für die Aktivität der Kohlenhydratoxidase, die durch die isolierte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, essenziell sind und daher vorzugsweise nicht Gegenstand von Substitutionen sind, können gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z.B. ortsspezifischer Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085) identifiziert werden. Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen bei jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre Proteaseaktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch Analyse der Kristallstruktur, die durch solche Techniken, wie Kernspinresonanzanalyse, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung, bestimmt werden (siehe z.B. de Vos, et al., 1992, Science 255: 306–312; Smith, et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver, et al., 1992, FEBS Letters 309: 59–64).
  • Die Kohlenhydratoxidase kann ein Fusionspolypeptid sein, in welchem ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder Fragments hiervon fusioniert ist. Ein Fusionspolypeptid wird durch Fusion einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils hiervon), welche ein anderes Polypeptid kodiert, an eine Nukleinsäuresequenz (oder einen Teil hiervon) der vorliegenden Erfindung hergestellt. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind im Stand der Technik bekannt und schließen das Ligieren der kodierenden Sequenzen, die Polypeptide kodieren, ein, so dass sie im Leserahmen sind und so dass die Expression des Fusionspolypeptids unter der Kontrolle des/der gleichen Promotors/en und Terminators ist.
  • Noch ein weiteres Verfahren zum Identifizieren von Kohlenhydratoxidase-kodierenden Klonen würde das Insertieren von genomischen DNA-Fragmenten in einen Expressionsvektor, wie z.B. ein Plasmid, das Transformieren Kohlenhydratoxidasenegativer Bakterien mit der resultierenden genomischen DNA-Bibliothek und danach das Ausplattieren der transformierten Bakterien auf Agar, enthaltend ein Substat für die Kohlenhydratoxidase, wodurch den Klonen die Expression der zu identifizierenden Kohlenhydratoxidase erlaubt ist, beinhalten.
  • Schließlich kann die DNA-Sequenz von gemischtem genomischem und synthetischem Ursprung, gemischtem synthetischem und cDNA-Ursprung oder gemischtem genomischen und cDNA-Ursprung sein, hergestellt nach Standardtechniken durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs, wie geeignet, wobei die Fragemente den verschiedenen Abschnitten der gesamten DNA-Sequenz entsprechen.
  • Identität der Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen
  • Die Polypeptididentität, auf die sich diese Beschreibung mit den Ansprüchen bezieht, wird als Maß der Identität zwischen zwei Sequenzen bestimmt, welche eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Identität kann in geeigneter Weise nach dem Verfahren, das in Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–45, beschrieben ist, mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptidsequenzvergleich bestimmt werden: GAP creation penalty 3,0 und GAP extension penalty 0,1. Die Bestimmung kann mittels eines bekannten Computerprogramms, wie z.B. GAP, welches in dem GCG-Programmpaket (Programmhandbuch für das Wisconsin-Paket, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) zur Verfügung gestellt wird, durchgeführt werden.
  • Alternativ kann das Maß der Identität durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151–153) unter Verwendung der LASERGENETM MEGALIGNTM Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden mehrfachen Alignment-Parametern bestimmt werden: Gap penalty 10 und Gap length penalty 10. Die paarweisen Alignment-Parameter betrugen Ktuple = 1, gap penalty = 3, windows = 5 und diagonals = 5.
  • Der reife Bereich eines analogen Polypeptids kann ein Maß der Identität von vorzugsweise mindestens 90%, speziell mindestens 95% mit der Sequenz der oben beschriebenen Kohlenhydratoxidase zeigen.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Maß der Identität zweier Nukleinsäuresequenzen durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151–153) mit einer Identitätstabelle, einem gap penalty von 10 und einem gap length penalty von 10 bestimmt.
  • Herstellung der Kohlenhydratoxidase
  • Die Kohlenhydratoxidase kann durch aerobe Kultivierung eines transformierten Wirtsorganismus, der die geeignete genetische Information enthält, aus dem oben genannten Stamm hergestellt werden. Solche Transformanten können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren wie oben beschrieben hergestellt und kultiviert werden.
  • Nukleinsäurekonstrukte
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, welche funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verbunden ist, die die Expression der kodierenden, Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen zusammen passen, steuern.
  • Das Nukleinsäurekonstrukt kann ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, sein, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wurde oder das so modifiziert wurde, dass es Nukleinsäureabschnitte enthält, die kombiniert und nebeneinander in einer Weise positioniert wurden, die sonst nicht in der Natur existieren würde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann eine Expressionscassette sein, wenn das Nukleinsäurekonstrukt alle die Kontrollsequenzen enthält, die zur Expression einer kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung benötigt werden. Die kodierende Sequenz kann eine Sequenz sein, die in mRNA transkribiert und in eine Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Kontrollsequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden im Allgemeinen durch ein Translationsstartkodon ATG am 5'-Ende und ein Translationsstoppkodon am 3'-Ende bestimmt Eine kodierende Sequenz kann einschließen, ohne darauf begrenzt zu sein, DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen.
  • Eine isolierte Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auf eine Vielzahl von Arten manipuliert werden, um für die Expression der Kohlenhydratoxidase zu sorgen. Die Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor der Insertion in einen Vektor kann in Abhängigkeit von dem Expressionsvektor wünschenswert oder notwendig sein. Die Techniken zum Modifizieren von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Klonierungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Die Kontrollsequenzen können alle Bestandteile einschließen, die zur Expression der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz notwendig oder vorteilhaft sind. Jede Kontrollsequenz kann zu der die Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz nativ oder fremd sein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, ohne darauf begrenzt zu sein, einen Leader, einen Promotor, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator. Die Kontrollsequenzen schließen zumindest einen Promotor sowie Transkriptions- und Translations-Stoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können mit Linkem für Zwecke der Einführung spezifischer Restriktionsschnittstellen bereitgestellt werden, welche die Ligation von Kontrollsequenzen mit dem kodierenden Bereich der eine Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz erleichtern.
  • Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz sein, eine Nukleinsäuresequenz, die von der Wirtszelle für die Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird. Die Promotorsequenz enthält Transkriptionskontrollsequenzen, die die Expression der Kohlenhydratoxidase vermitteln. Der Promotor kann jede Nukleinsäuresequenz sein, die in der Wirtszelle der Wahl Transkriptionsaktivität zeigt und kann aus Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Kohlenhydratoxidase entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodieren.
  • Beispiele von geeigneten Promotoren zum Steuern der Transkription des Nukleinsäurekonstrukts der vorliegenden Erfindung, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind die Promotoren, die erhalten wurden aus dem E. coli lac-Operon, dem Streptomyces coelicolor Agarase-Gen (dagA), dem Bacillus subtilis Levansucrase-Gen (sacB), dem Bacillus licheniformis alpha-Amylase-Gen (amyL), dem Bacillus stearothermophilus Gen der maltogenen Amylase (amyM), dem Bacillus amyloliquefaciens alpha-Amylase-Gen (amyQ, dem Bacillus licheniformis Penicillinase-Gen (penP), den Bacillus subtilis xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen beta-Lactamase-Gen (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731), wie auch dem tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25). Weitere Promotoren sind beschrieben in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; und in Sambrook et al., 1989, supra.
  • Zur Transkription in einem Pilzwirt schließen Beispiele verwendbarer Promotoren jene ein, die aus dem Gen erhältlich sind, das Aspergillus oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei Asparaginproteinase, A. niger neutrale a-Amylase, A. niger saure stabile a-Amylase, A. niger Glucoamylase, Rhizomucor miehei Lipase, A. oryzae alkalische Protease, A. oryzae Triosephosphat-Isomerase und A. nidulans Acetamidase kodiert.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminator-Sequenz sein, eine Sequenz, die von der Wirtszelle der Wahl zur Terminierung der Transkription erkannt wird. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Ende der die Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verknüpft. Jeder Terminator, der in der Wirtszelle der Wahl funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz sein, ein nicht-translatierter Bereich einer mRNA, der für die Translation durch die Wirtszelle wichtig ist. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Ende der die Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verknüpft. Jede Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionsfähig ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Kontrollsequenz kann auch ein ein Signalpeptid kodierender Bereich sein, der für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem Aminoterminus der Kohlenhydratoxidase verbunden ist, das die exprimierte Kohlenhydratoxidase in den sekretorischen Weg der Zelle steuern kann. Der das Signalpeptid kodierende Bereich kann für die Kohlenhydratoxidase nativ sein oder er kann aus fremden Quellen erhalten werden. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann inhärent einen Signalpeptid-kodierenden Bereich enthalten, der natürlicherweise im Translationsleserahmen mit dem Abschnitt des kodierenden Bereichs, der die sekretierte Kohlenhydratoxidase kodiert, verbunden ist. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz ein Signalpeptid enthalten, das einen Bereich kodiert, der für den Teil der kodierenden Sequenz fremd ist, die die sekretierte Kohlenhydratoxidase kodiert. Der fremde Signalpeptid-kodierende Bereich kann benötigt werden, wenn die kodierende Sequenz normalerweise keinen Signalpeptid-kodierenden Bereich enthält. Alternativ kann der fremde Signalpeptid-kodierende Bereich einfach den natürlichen Signalpeptid-kodierenden Bereich ersetzen, um eine verstärkte Sekretion der Kohlenhyratoxidase im Vergleich zum natürlichen Signalpeptid-kodierenden Bereich, der normalerweise mit der kodierenden Sequenz verbunden ist, zu erhalten. Jeder Signalpeptid-kodierende Bereich, der in der Lage ist, die exprimierte Kohlenhydratoxidase in den sekretorischen Weg der Wirtszelle der Wahl zu lenken, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Ein wirksamer Signalpeptid-kodierender Bereich für eine bakterielle Wirtszelle, insbesondere Bacillus, ist der Signalpeptid-kodierdende Bereich, welcher aus dem Gen der maltogenen Amylase aus Bacillus NCIB 11837, dem Bacillus stearothermophilus alpha-Amylase-Gen, dem Bacillus licheniformis Subtilisin-Gen, dem Bacillus licheniformis beta-Lactamase-Gen, den Bacillus stearothermophilus neutralen Proteasegenen (nprT, nprS, nprM) und dem Bacillus subtilis prsA-Gen erhalten wird. Weitere Signalpeptide sind von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109–137 beschrieben.
  • Expressionsvektoren
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale enthalten. Verschiedene Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen, die oben beschrieben sind, können zusammengefügt werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere passende Restriktionsschnittstellen einschließen kann, um eine Insertion oder Substitution der die Kohlenhydratoxidase kodierenden Nukleinsäuresequenz an solchen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch Insertieren der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäurekonstrukts, welches die Sequenz umfasst, in einem zur Expression geeigneten Vektor exprimiert werden. Bei der Schaffung des Expressionsvektors ist die kodierende Sequenz in dem Vektor so lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionsfähig mit zur Expression, und möglicherweise Sekretion, geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft ist.
  • Der Expressionsvektor kann in Eukaryoten eine Polyadenylierungssequenz umfassen, die funktionsfähig mit der die Kohlenhydratoxidase kodierenden DNA-Sequenz verknüpft ist. Terminations- und Polyadenylierungssequenzen können geeigneterweise aus der gleichen Quelle wie der Promotor stammen.
  • Der rekombinante Expressionsvektor kann jeder Vektor sein, der geeigneterweise rekombinanten DNA-Verfahrensweisen unterzogen werden kann, und die Expression der Nukleinsäuresequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle, in welche der Vektor eingeführt werden soll, abhängen. Die Vektoren können linear oder geschlossene zirkuläre Plasmide sein. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation erfolgt, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom, sein. Der Vektor kann ein jegliches Mittel sein, das die Selbstreplikation sicherstellt. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt ist, sich in das Genom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches er integriert wurde, repliziert wird. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid, zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide, die zusammen die Gesamt-DNA enthalten, die in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden soll, oder ein Transposon sein.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die eine einfache Selektion auf transformierte Zellen erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt eine Biozidresistenz, Resistenz gegen Schwermetalle, Prototrophie für Auxotrophe und Ähnliches bereitstellt. Beispiele für bakterielle selektierbare Marker sind die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikaresistenz wie z.B. Ampicillin-, Kanamycin-, Erythromycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz verleihen. Darüber hinaus kann die Selektion durch eine Cotransformation z.B. wie in WO 91/09129 durchgeführt werden, wo der selektierbare Marker auf einem getrennten Vektor ist.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten ein Element(e), das die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellgenom oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig von dem Genom der Zelle erlaubt.
  • Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in das Wirtszellgenom integriert werden, wenn sie in die Wirtszelle eingeführt sind. Zur Integration kann der Vektor auf die die Kohlenhydratoxidase kodierende Nukleinsäuresequenz oder andere Elemente des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe Rekombination angewiesen sein. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an einer spezifischen Stelle im Chromosom integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einer präzisen Stelle zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Zahl von Nukleinsäuren, wie z.B. 100 bis 1.500 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 1.500 Basenpaare und am meisten bevorzugt 800 bis 1.500 Basenpaare enthalten, die zu der entsprechenden Zielsequenz hoch-homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können eine jede Sequenz sein, die zu der Zielsequenz im Genom der Zelle homolog ist. Darüber hinaus können die Integrationselemente nichtkodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen sein.
  • Zur autonomen Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung umfassen, der es dem Vektor ermöglicht, sich autonom in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Beispiele von bakteriellen Replikationsursprüngen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, die die Replikation in E. coli erlauben und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, die die Replikation in Bacillus erlauben. Der Replikationsursprung kann einer mit einer Mutation sein, um seine Funktion in einer Bacilluszelle temperatursensitiv zu machen (siehe z.B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
  • Mehr als eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz, die eine Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in die Wirtszelle eingeführt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Stabile Amplifikation der Nukleinsäuresequenz kann durch Integration mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren und Selektionieren auf Transformanten erhalten werden. Ein geeignetes Verfahren zum Erreichen der Amplifikation von genomischen Sequenzen ist in WO 94/14968 beschrieben.
  • Verfahren, die zur Konstruktion von Vektoren geeignet sind, die eine Kohlenhydratoxidase kodieren und jeweils den Promotor, Terminator und andere Elemente enthalten, sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., supra).
  • Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression der Kohlenhydratoxidase relativ zum Wachstum der Wirtszelle erlauben. Beispiele für regulatorische Systeme sind jene, die die Expression des Gens, das an- oder ausgeschaltet werden soll, in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich des Vorhandenseins einer regulatorischen Verbindung, bewirken. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen würden die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme einschließen. Andere Beispiele von regulatorischen Sequenzen sind solche, die die Genamplifikation erlauben. In diesen Fällen würde die die Kohlenhydratoxidase kodierende Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einer Regulatorsequenz verknüpft werden.
  • Während eine intrazelluläre Expression in gewisser Hinsicht vorteilhaft sein könnte, z.B. bei Verwendung von bestimmten Bakterien als Wirtszellen, ist es im Allgemeinen bevorzugt, dass die exprimierte Kohlenhydratoxidase extrazellulär sezerniert wird.
  • Wirtszellen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, die entweder ein DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor, wie oben beschrieben, umfassen, welche vorteilhafterweise zur rekombinanten Herstellung der Kohlenhydratoxidase verwendet werden. Die Wirtszelle kann jeder Abkömmling einer Elternzelle sein, der aufgrund von Mutationen, die während der Replikation auftreten, nicht identisch mit der Elternzelle ist. Die Zelle ist vorzugsweise mit einem Vektor transformiert, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, gefolgt von einer Integration des Vektors in das Wirtschromosom. „Transformation" bedeutet das Einführen eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, in eine Wirtszelle, so dass der Vektor als chromosomal integrierter oder als ein selbstreplizierender extrachromosomaler Vektor erhalten bleibt. Die Integration gilt allgemein als ein Vorteil, da die Nukleinsäuresequenz mit höherer. Wahrscheinlichkeit stabil in der Zelle erhalten bleibt. Die Integration des Vektors in das Wirtschromosom tritt durch homologe oder nicht-homologe Rekombination, wie oben beschrieben, auf.
  • Die Wahl der Wirtszelle wird in einem großen Ausmaß von dem Gen, das die Kohlenhydratoxidase kodiert, und seiner Quelle abhängen. Die Wirtszelle kann eine Zelle eines höheren Organismus, wie z.B. eines Säugers oder eines Insekts, sein, aber vorzugsweise ist sie eine mikrobielle Zelle, z.B. eine Bakterien- oder eine Pilzzelle (einschließlich Hefe).
  • Beispiele für geeignete Bakterienzellen sind grampositive Bakterien, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, eine Bacilluszelle, z.B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Streptomyces-Zelle, z.B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien wie z.B. E. coli und Pseudomonas sp. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Zelle von Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis.
  • Die Transformation einer bakteriellen Wirtszelle kann z.B. durch Protoplasten-Transformation (siehe z.B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111–115), durch Verwendung kompetenter Zellen (siehe z.B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), durch Elektroporation (siehe z.B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6: 742–751) oder durch Konjugation (siehe z.B. Koehler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771–5278) bewirkt werden.
  • Die Wirtszelle kann auch ein Eukaryont sein, wie z.B. eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Pilzzelle. Verwendbare Säugerzellen schließen Ovarienzellen chinesischer Hamster (Chinese hamster ovary (CHO)), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nieren-(baby hamster kidney (BHK))-Zellen, COS-Zellen oder eine Reihe anderer immortalisierter Zelllinien, die z.B. von der „American Type Culture Collection" erhältlich sind, ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. „Pilz", wie hierin verwendet, schließt die Stämme Ascomyceten, Basidomyceten, Chytridiomyceten und Zygomyceten (wie definiert durch Hawksworth et al., Ainsworth und Bisby's Dictionary of The Fungi, 8. Ausgabe, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), wie auch die Oomyceten (wie zitiert in Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171) und alle mitosporen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Repräsentative Gruppen der Ascomyceten schließen z.B. ein Neurospora, Eupenicillium (= Penicillium), Emericella (= Aspergillus), Eurotium (= Aspergillus) und die oben aufgelisteten echten Hefen. Beispiele für Basidiomyceten schließen Pilze im engeren Sinne, Roste und Brände ein. Repräsentative Gruppen der Chytridiomyceten schließen z.B. ein Allomyces, Blastocladiella, Coelomomyces und Wasserpilze. Repräsentative Gruppen der Oomyceten schließen z.B. ein Saprolegniomyceten Wasserpilze (Wasserschimmelpilz) wie z.B. Achlya. Beispiele für mitospore Pilze schließen Aspergillus, Penicillium, Candida und Alternaria ein. Repräsentative Gruppen von Zygomyceten schließen z.B. ein Rhizopus und Mucor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzwirtszelle eine Hefezelle. „Hefe", wie hierin verwendet, schließt ascosporogene Hefe (Endomycetales), basidiosporogene Hefe und zu den Fungi Imperfecti gehörende Hefen (Blastomyceten). Die ascosporogenen Hefen können in die Familien Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae aufgeteilt werden. Die letztgenannten umfassen vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (z.B. Genus Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae ( z.B. die Genera Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die basidiosporogenen Hefen schließen die Genera Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella ein. Die zu den Fungi Imperfecti gehörenden Hefen werden in zwei Familien eingeteilt, Sporobolomycetaceae (z.B. Genera Sorobolomyces und Bullera) und Cryptococcaceae (z.B. Genus Candida). Die Hefe kann sein wie beschrieben in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. und Davenport, R. R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium Folge Nr. 9, 1980). Die Biologie von Hefen und Manipulation der Hefegenetik sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe z.B. Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B. J. und Stopani, A. O. M., Hrsg., 2. Auflage, 1987; The Yeasts, Rose, A. H. und Harrison, J. S., Hrsg. 2. Auflage, 1987; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., Hrsg., 1981).
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Zelle einer Spezies von Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia oder Yarowia.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Kluyveromyces lactis Zelle. In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführurgsform ist die Hefewirtszelle eine Yarowia lipolytica Zelle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzwirtszelle eine filamentöse Pilzzelle. „Filamentöse Pilze" schließen alle filamentösen Formen der Untergruppe Eumycetes und Oomycetes (wie bei Hawksworth et al., 1995, supra definiert) ein. Die filamentösen Pilze sind durch eine vegetative Mycelwand charakterisiert, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden zusammengesetzt ist. Vegetatives Wachstum wird durch Hyphenverlängerung erreicht und der Kohlenstoffkatabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum von Hefen, wie z.B. Saccharomyces cerevisiae, durch Knospung eines einzelligen Thallus und der Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle einer Spezies von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Aspergillus awamori, Apergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium sambucinum, Fusarium sulphureum oder Fusarium venenatum Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Humicola insolens oder Humicola lanuginosa Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Mucor miehei Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Myceliophthora thermofilum Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Neurospora crassa Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Penicillium purpurogenum Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Thielavia terrestris Zelle. In einer anderen, am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Trichodermazelle eine Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride Zelle.
  • Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das in einer an sich bekannten Weise Protoplastenformation, Transformation der Protoplasten und Regeneration der Zellwand einbezieht. Geeignete Verfahrensweisen zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Science USA 81: 1470–1474, beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Fusarium-Spezies ist in Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in der parallel anhängigen US mit der laufenden Nummer 08/269449 beschrieben. Die Hefe kann unter Verwendung von Verfahrensweisen transformiert werden, die von Becker und Guarente, in Abelson, J. N. und Simon, M. I., Hrsg. „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, Band 194, S. 182–187, Academic Press, Inc., New York; Ito, et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; und Hinnen, et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75: 1920, beschrieben sind. Säugerzellen können durch direkte Aufnahme unter Verwendung des Kalziumphosphat-Präzipitationsverfahrens von Graham und Van der Eb (1978, Virology 52: 546) transformiert werden.
  • Rekombinante Verfahren zur Herstellung
  • Die Kohlenhydratoxidase kann durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, die das Kultivieren einer wie oben beschriebenen Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung dieser Kohlenhydratoxidase zuträglich sind, und das Gewinnen der Kohlenhydratoxidase aus den Zellen und/oder dem Kulturmedium umfasst.
  • In diesen Verfahren werden die Zellen in einem Nährstoffmedium, das zur Herstellung der Kohlenhydratoxidase geeignet ist, unter Verwendung von an sich bekannten Verfahren kultiviert. Zum Beispiel kann die Zelle durch Kultivierung in Schüttelflaschen, Fermentation in kleinem oder großen Maßstab (einschließlich kontinuierlicher, batchweiser, Fed-Batch- oder Festphasenfermentationen) im Labor oder in Industrie fermentern kultiviert werden, welche in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die erlauben, dass die Kohlenhydratoxidase exprimiert und/oder isoliert wird, durchgeführt wird. Die Kultivierung findet in einem geeigneten Nährmedium statt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahrensweisen (siehe z.B. M. V. Arbige et al., in Abraham L. Sonnenshein, James A. Hoch, und Richard Losick, Hrsg., Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1993, S. 871–895). Geeignete Medien sind von gewerblichen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Zusammensetzungen (z.B. in den Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden. Wenn die Kohlenhydratoxidase in das Nährmedium sezerniert wird, kann die Kohlenhydratoxidase direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn die Kohlenhydratoxidase nicht sekretiert wird, wird sie aus Zelllysaten gewonnen.
  • Die Kohlenhydratoxidase kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, die für das Polypeptid spezifisch sind, nachgewiesen werden. Diese Nachweisverfahren schließen die Verwendung spezifischer Antikörper, Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Substrats ein. Zum Beispiel kann ein Enzymtest verwendet werden, um die Aktivität des Polypeptids zu bestimmen.
  • Die resultierende Kohlenhydratoxidase kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Zum Beispiel kann die Kohlenhydratoxidase aus dem Nährmedium durch konventionelle Verfahrensweisen gewonnen werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Evaporation oder Präzipitation.
  • Die Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vielzahl von Verfahrensweisen, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Chromatographie (z.B. Ionenaustausch, Affinität, hydrophob, Chromatofokussierung und Größenausschluss), elektrophoretische Verfahrensweisen (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung (IEF), differenzielle Solubilisierung (z.B. Ammoniumsulfat-Präzipitation) oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, J. C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989). Verfahren zur Bestimmung der Kohlenhydratoxidase-Aktivität DMAB/MBTH-Test
    Vormischung: 7,2 mM 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB) 0,33 mM 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) 4 mg/ml rekombinante Coprinus cinereus Peroxidase (rCiP) 0,4 M/0,4 M Phosphat/Citratpuffer (pH 6)
    Inkubationsmischung: 180 μl 500 mM Glucose 25 mM Citrat 25 mM Phosphat pH 6,0 20 μl Probe
  • Die Inkubationsmischung wird für 20 Minuten bei 30°C inkubiert. Dann werden 100 ml der Inkubationsmischung und 100 ml Vormischung zusammengemischt. Nach 30 Sekunden wird die Extinktion bei 540 (oder 490) nm abgelesen. Ein Standard von 0,2 mM H2O2 ist eingeschlossen.
  • 4AA-TOPS-Test
  • Die Tests werden in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. 100 μl 0,1 M Phosphat/Citrat, pH 6 wird mit 50 μl 0,24 M Glucose und 50 μl Vormischung (3 mM 4-Aminoantipyrin (4AA), 7 mM N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin (TOPS), 40 PODU/ml rCiP) gemischt und die Reaktion durch Zugabe von 40 μl Oxidaselösung in geeigneter Verdünnung gestartet. Die Absorption wird bei 490 nm als Funktion der Zeit unter Verwendung des „Vmax Microtiter plate readers" von Molecular Devices gemessen und die Aktivität als Steigung eines linearen Anstiegs der Absorption genommen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Herstellung der Kohlenhydratoxidase aus Wildtyp M. nivale
  • Kultivierung von M. nivale
  • Ein Stamm von M. nivale, CBS 100236, wurde unter Verwendung des folgenden Komplettmediums fermentiert:
    Schüttelflaschenmedium: BA
    Rofec (Roquette) 10 Gramm
    NH4NO3 (Merck) 10 Gramm
    KH2PO4 (Merck) 10 Gramm
    Solcafloc (Dicacel) 40 Gramm
    MgSO4–7(H2O) 0,75 Gramm
    Pluronic 100% (BASF) 0,1 ml
    Leitungswasser auf ein Endvolumen von 1000 ml
  • Der pH wurde auf pH 6,5 eingestellt, dann wurde eine Tablette von 500 mg CaCO3 zugefügt. Einhundert ml des Komplettmediums wurden zu jeder 500-ml-Schüttelflasche mit 2 Prallflächen (baffle) zugefügt. Die Schüttelflaschen wurden dann für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert. Ein Inoculum wurde aus einer Sporensuspension hergestellt, die aus 5 PDA-Schrägproben hergestellt war, die für 7 Tage bei 26°C wachsen gelassen, und dann in 20 ml sterilem Wasser und Tween 80 (ICI) gewaschen worden waren. Jede Schüttelflasche wurde mit 2 ml der Sporensuspension inokuliert und dann für 10 Tage bei 26°C unter konstantem Schütteln bei 125 Upm kultiviert. Am Ende der Kultivierung wurden die Zellen pelletiert und das Enzym wurde aus dem Überstand gereinigt.
  • Reinigung
  • Aus einer 5-Liter-Fermentation wurden 4300 ml zentrifugierte Fermentationsbrühe filtriert und durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters mit einem Molekulargewichts-Rückhaltevermögen von 10 kDa (Filtron) auf 660 ml konzentriert. Das Enzym wurde mit (NH4)2SO4 zwischen 200 und 400 mg/ml präzipitiert. Nach Lösen des Präzipitats in 25 mM Tris pH 7,5 wurde die Probe durch Ultrafiltration gewaschen, bis die Leitfähigkeit mit 25 mM Tris pH 7,5 identisch war. Die Probe wurde über eine Säule von 300 ml Q-Sepharose XL (Pharmacia), welche mit dem gleichen Puffer equilibriert war, laufen gelassen und der Durchfluss gesammelt. Nach Zugabe von (NH4)2SO4 bis auf 100 mg/ml wurde die Probe über eine HIC-Säule (Toyopearl-butyl 650) (TosoHaas), welche mit 25 mM Tris pH 7,5; 100 mg (NH4)2SO4/ml equilibriert war, laufen gelassen. Der Durchfluss wurde mit 25 mM Acetatpuffer pH 5,0 gewaschen und auf eine Säule von SP-Sepharose (Pharmacia), die mit dem gleichen Puffer equilibriert war, aufgetragen. Das gebundene Enzym wurde unter Verwendung eines linearen Salzgradienten von 1 M NaCl in 25 mM Acetatpuffer pH 5,0 über 10 Säulenvolumina eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt. Die endgültige Reinigung der Präparation wurde durch HIC-Chromatographie auf einer Phenylsuperose-Säule unter Verwendung eines Puffers von 25 mM Acetatpuffer, pH 5,0 mit einem linearen Gradienten von 2 M (NH4)2SO4 bis 0 M über 20 Säulenvolumina durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen 25 mM Acetatpuffer, pH 5,0 für 24 Stunden einer Dialyse unterzogen.
  • Charakterisierung
  • Eine Analyse des gereinigten Proteins durch SDS-PAGE zeigte ein Molekulargewicht von ungefähr 52 kDa und einen pI von um die 8,9 durch isoelektrische Fokussierung an.
  • Die gereinigte M. nivale-Oxidase zeigte auch eine ausgeprägte gelbe Farbe, was das Vorhandensein von FAD als ein Cofaktor nahe legt. Ein Extinktionsscan des Enzyms ergab zwei Absorptionsmaxima, bei 385 und 440 nm, was charakteristisch für das Vorhandensein von FAD in dem Enzym ist. In Gegenwart von Glucose verschwand der Peak bei 440 nm, was auf die Reduktion von FAD hindeutet.
  • Beispiel 2: Aminosäuresequenzen aus M. nivale Kohlenhydratoxidase
  • Eine hochgereinigte Präparation von M. nivale wurde reduziert und alkyliert. Eine Probe des Enzyms wurde dann mit Lysylendopeptidase (Wako) oder TPCK-Trypsin (Promega) abgebaut. Die Peptide wurden durch RP-HPLC über eine Vydac-218TP-Säule (Vydac) in TFA (Trifluoracetat)/Isopropanol isoliert und nochmals über eine Vydac-218TP-Säule in TFA/Acetonitril gereinigt. Ausgewählte Peptide wurden durch Edman-Abbau analysiert. Die N-terminale Sequenz wurde durch Sequenzieren des gereinigten Enzyms, welches auf eine PVDF-Membran elektrogeblottet war, bestimmt.
  • Die Partialsequenzen, die erhalten wurden, waren eine N-terminale Sequenz, gezeigt bei Positionen 1–24 von SEQ ID NR. 2 und interne Sequenzen wie an Positionen 229–266, 249–271, 303–322, 336–347, 383–404, 405–414, 420–440 von SEQ ID NR. 2 gezeigt. Keine der Sequenzen aus der Kohlenhydratoxidase zeigte eine Homologie zu irgendeiner relevanten Sequenz, wenn gegen die Swissprot- und EMBL-Datenbanken gesucht wurde.
  • Beispiel 3: Extraktion von Microdochium nivale genomischer DNA
  • Agar-Schrägproben von Microdochium nivale-(NN008551, CBS 100236)-Mycelien wurden mit 10 ml sterilem 0,008% Tween 20 gespült. 2 ml der Myceliumlösung wurden in eine 250 ml Schüttelflasche inokuliert, welche 50 ml MY50 pH 6,0 Medium enthielt. MY50 pH 6,0 Medium war pro Liter zusammengesetzt aus 50 g Maltodextrin, 2 g MgSO4·7 H2O, 10 g KH2PO4, 2 g K2SO4, 2 g Zitronensäure, 10 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff und 0,5 ml AMG-Spurenelemente. Die AMG-Spurenmetalllösung war pro Liter zusammengesetzt aus 14,3 g ZnSO4·7 H2O, 2,5 g CuSO4·5 H2O, 0,5 g NiCl2·6 H2O, 13,8 g FeSO4·7 H2O, 8,5 g MnSO4·H2O und 3 g Zitronensäure. Die Schüttelflasche wurde bei 26°C, 125 Upm 6 Tage inkubiert.
  • Mycelien von 6 Tage alten Kulturen wurden durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) gesammelt, zweimal mit ungefähr 50 ml 10 mM Tris – 1 mM EDTA pH 8,0 (TE) gespült und trockengedrückt. Die Mycelien wurden dann in flüssigem Stickstoff gefroren und zu einem feinen Pulver in einer elektrischen Kaffeemühle, die mit Trockeneis vorgekühlt war, zermahlen. Eine 2 g-Probe des Pulvers wurde in ein steriles, wegwerfbares, konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 20 ml Lysepuffer (100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 500 mM Guanidin-HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) langsam, gefolgt von 20 μg DNase-freier RNase A pro ml zugefügt. Die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Proteinase K wurde dann auf 0,8 mg/ml zugefügt und die Mischung bei 50°C für zusätzliche 2 Stunden inkubiert. Die lysierte Mischung wurde bei 12–15.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert, um die unlösliche Debris zu pelletieren.
  • Der Lysatüberstand wurde in eine Qiagen-tip-500-Maxi-Säule (Qiagen, Santa Clarita, CA) überführt, welche mit 10 ml QBT-Puffer (Qiagen, Santa Clarita, CA) vorequilibriert war, und die Säule wurde mit 30 ml QC-Puffer (Qiagen, Santa Clarita, CA) gewaschen. Die DNA wurde mit 15 ml QF-Puffer (Qiagen, Santa Clarita, CA) eluiert und 7 Volumina mittels Filter sterilisiertes Isopropanol zu der eluierten DNA-Lösung zugeführt. Die Lösung wurde behutsam gemischt und dann für 20 Minuten bei 15.000 × g zentrifugiert, um die DNA zu pelletieren. Die pelletierte DNA wurde mit 5 ml eiskaltem, 70%-igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 500 μl resuspendiert.
  • Beispiel 4: PCR-Amplifikation des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Gens
  • Die Daten der primären Aminosäuresequenz aus dem N-terminalen und den internen Fragmenten der gereinigten Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase, welche in Beispiel 2 beschrieben sind, wurden verwendet, um die folgenden degenerierten PCR-Primer zu bilden, um das Kohlenhydratoxidase-Gen aus der genomischen Microdochium nivale DNA, welche in Beispiel 3 hergestellt wurde, zu amplifizieren:
    Vorwärts-Primer (N-terminale Peptidsequenz): GCIGCIGGIGTICCIATHGAYAT (SEQ ID NR. 3)
    Rückwärts Primer (interne Peptidsequenz): IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT (SEQ ID NR. 4)
  • Die Amplifikation wurde unter Verwendung eines Hot Wax-OptistartTM-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) nach den Anleitungen des Herstellers ausgeführt. Sechs Reaktionen wurden hergestellt, die sowohl im pH als auch der Mg2+-Konzentration, wie unten in der folgenden Tabelle gezeigt, variierten:
  • Figure 00330001
  • Die Amplifikationsreaktionen (50 μl) enthielten 1,62 μg Microdochium nivale genomische DNA als Template, 50 pMol eines jeden Primers, 1 × PCR-Puffer, 5 μl eines 10 mM dNTP-Gemisches und ein HotWaxTM Mg2+-Kügelchen, welches eine geeignete Menge Mg2+ enthielt. Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer-480-„Thermal Cycler", der wie folgt programmiert war, in Zyklen inkubiert: Zyklus 1 bei 94°C für 2,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten; Zyklen 2 bis 37 jeweils 94°C für 45 Sekunden, 50°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten und Zyklus 38 bei 94°C für 45 Sekunden, 50°C für 45 Sekunden und 72°C für 10 Minuten. Zyklus 39 war ein 4°C Aufweichzyklus.
  • Ein Volumen von 9 μl aus jeder Reaktion wurde auf einem 1% Agarosegel unter Verwendung von 50 mM Tris – 50 mM Borsäure – 1 mM EDTA-(TBE)-Puffer einer Elektrophorese unterzogen. Die Reaktionen 4, 5 und 6 ergaben eine Hauptbande bei 1335 bp. Die Reaktionen 4, 5 und 6 wurden gepoolt und wie zuvor auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Die 1335-bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiaex-II-Gel-Extraktionskits (Qiagen, Santa Clarita, CA) gereinigt. Das gereinigte 1335-bp-PCR-Produkt wurde dann in pCR2.1-TOPO (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert und in Escherichia-coli-TOP10-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten unter Verwendung eines „Wizard Maxi Prep"-Kits (Promega, Madison, WI) isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines „Applied Biosystems Prism 377"-DNA-Sequenzierers und der 377XL-Sammlungs- und Analyse-Software (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA) nach den Anleitungen des Herstellers sequenziert. Die Sequenzdaten bestätigen, dass das 1335-bp-Fragment einen Teil des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Gens kodierte.
  • Beispiel 5: Southern Blot von Microdochium-nivale genomischer DNA
  • Eine Probe der genomischen DNA, hergestellt in Beispiel 3, wurde durch Southern-Hybridisierung (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) analysiert. Ungefähr 3 μg der genomischen DNA wurden mit EcoRI, KpnI, NotI, SacI, SphI oder XbaI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verdaut und aufgrund ihrer Größe auf einem 0,6%-Agarosegel unter Verwendung von TBE-Puffer fraktioniert. Das Gel wurde unter kurzwelligem UV-Licht photographiert und für 30 Minuten in 0,5 M NaOH–1,5 M NaCl, gefolgt von 15 Minuten in 1 M Tris-HCl pH 8–1,5 M NaCl eingeweicht. Die DNA indem Gel wurde auf eine Hybond-N-Hybridisierungsmembran (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) durch Kapillar-Blotting in 20 × SSPE (3 M Natriumchlorid–0,2 M dibasisches Natriumphosphat–0,02 M Dinatrium-EDTA) unter Verwendung des Turbo-Blot-Verfahrens (Schleicher und Schuell, Keene, New Hampshire) überführt. Die Membran wurde mittels UV (UV Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, CA) kreuzvernetzt und dann für 2 Stunden in dem folgenden Hybridisierungspuffer bei 45°C unter leichtem Schütteln eingeweicht: 5 × SSPE, 50% Formamid (Vol/Vol), 0,3% SDS und 200 μg/ml denaturierte und gescherter Lachshoden-DNA.
  • Das 1335-bp-Fragment, beschrieben in Beispiel 4, welches einen Teil der kodierenden Sequenz der Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase enthielt, wurde durch Random-Priming (Prime it II, Stratagene, La Jolla, CA) mit α[32P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) radioaktiv markiert. Das α[32P]dCTP-markierte Fragment wurde zu dem Hybridisationspuffer auf eine Aktivität von ungefähr 1 × 106 cpm pro ml Puffer zugefügt. Die Mischung wurde dann mit der Membran über Nacht bei 45°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran 3 Mal für 15 Minuten in jeweils 2 × SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) mit 0,2% SDS bei 45°C gewaschen. Die Membran wurde auf einem Papiertuch für 15 Minuten getrocknet, dann in eine Plastikfolie eingepackt und für 3 Stunden bei –70°C mit Verstärkerfolien (Kodak, Rochester, NY) einem Röntgenfilm ausgesetzt.
  • Der Southern Blot zeigte das Vorhandensein einer 3-kb-Bande in einer Spur, die den SacI-Verdau enthielt. Da der SacI-Verdau eine Bandengröße ergab, die zum Amplifizieren klein genug war und groß genug war, um das Volllängen-Gen zu enthalten, wurde sie zur Isolierung des kompletten Gens durch inverse PCR verwendet.
  • Beispiel 6: Inverse PCR der kodierenden Sequenz des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Gens
  • Inverse PCR wurde verwendet, um die 5'- und 3'-flankierende DNA des 1335-bp-Fragments zu erhalten, um die gesamte kodierende Sequenz des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Gens zu isolieren. Eine 6-μg-Probe der Microdochium nivale genomischen DNA (Beispiel 3) wurde komplett mit SacI verdaut und dann unter Verwendung des QIAquick-Nucleotide-Removal-Kits (Qiagen, Santa Clarita, CA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Eine 1-μg-Probe der gereinigten verdauten DNA wurde über Nacht bei 14 bis 16°C mit 10 Einheiten T4-Ligase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 1 × Ligasepuffer in einem Endvolumen von 500 μl mit sich selbst ligiert. Die Ligase wurde dann durch Inkubieren der Reaktion bei 65°C für 15 Minuten Hitze inaktiviert. Die Reaktion wurde unter Verwendung eines Microcon 30 (Millipore, Bedford, MA) konzentriert. Die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung des QIAquick-Nucleotide-Removal-Kits gereinigt. Die mit sich selbst ligierten Produkte wurden dann als ein Template für die inverse PCR verwendet.
  • Die folgenden gegen das 5'- und 3'-Ende des Kohlenhydratoxidase-Gens gerichteten Primer wurden in umgekehrter Richtung zu denen in der konventionellen PCR gebildet, um aus dem bekannten Bereich des 1335-bp-PCR-Produkts hinaus zu amplifizieren:
    Oberhalb von 1199 bp: TCCAGTTCTACGACCGCTACG (SEQ ID NR. 5)
    Unterhalb von 158 bp: CAGACTTGGCAGAGACCTTGA (SEQ ID NR. 6)
  • Die Amplifikationsreaktion (100 μl) enthielt 100 pMol eines jeden Primers, 1 μg der SacI-verdauten und mit sich selbst ligierten genomischen DNA, 10 μl einer 10 mM-dNTP-Mischung, 1 × Taq-Polymerase-Puffer (Perkin Elmer, Foster City, CA) und 5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA). Steriles Mineralöl wurde auf die Reaktion geschichtet und in einen Thermozykler Model-480 von Perkin-Elmer gestellt, der wie folgt programmiert war: Zyklus 1 bei 94°C für 2,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten; Zyklus 2 bis 11 jeweils bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten; Zyklen 12 bis 28 jeweils bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten mit einer Verlängerung von 20 Sekunden pro Zyklus; und Zyklus 29 bei 72°C für 10 Minuten. Zyklus 30 war ein 4°C-Aufweichzyklus.
  • Die Reaktion wurde auf einem 1%-Agarosegel unter Verwendung von TBE-Puffer einer Elektrophorese unterzogen, was eine 3-kb-Bande ergab. Die 3-kb-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiaex-II-Gel-Extraktions-Kits gereinigt. Das gereinigte 3-kb-PCR-Produkt wurde dann in pCR2.1-TOPO kloniert und in Escherichia coli TOP-10-Zellen transformiert, um Escherichia coli pEJG40/TOP10 zu bilden. Die Transformante E. coli pEJG40/TOP10 wurde gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vom 12. Juni 1998 bei der „Agricultural Research Service Collection (NRRL)", 1815 North University Street, Peoria, IL hinterlegt und mit NRRL B-30034 bezeichnet.
  • Die Plasmid-DNA wurde aus der Transformante unter Verwendung eines „Wizard Maxi Prep Kits" isoliert. Die isolierte Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines „Applied Biosystems Prism 377"-DNA-Sequenzierers und der 377XL-Sammlungs- und Analyse-Software nach der Primer-Wanderungstechnik mit Färbeterminator-Chemie sequenziert (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47–60). Zusätzlich zu den lac-Vorwärts- und den lac-Rückwärts-Primern wurden die folgenden Oligonukleotid-Sequenzierungsprimer zum Sequenzieren verwendet:
  • Sequenzierungsprimer für das 1335-bp-Fragment:
    Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Sequenzierungsprimer für das inverse PCR-Produkt:
    Figure 00370002
  • Das Sequenzieren ergab eine Nukleinsäuresequenz mit einem offenen Leserahmen (open reading frame (ORF)) von 1448 bp (SEQ ID NR. 1), welches ein Intron von 65 bp enthielt. Der G + C-Gehalt dieses ORFs betrug 58,33%. Die -3-Position des translationalen Starts ist ein Adenin in Übereinstimmung mit den Kozak-Regeln, in welchen die -3-Position immer ein Adenin ist. Ein putatives TATA-Motiv ist bei –122, TATAAA, auch vorhanden.
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR. 2) zeigte ein Protein von 495 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 54.678 Dalton. Basierend auf den Regeln von van Heijne (van Heijne, 1984, Journal of Molecular Biology 173: 243–251) umfassen die ersten 18 Aminosäuren wahrscheinlich ein sekretorisches Signalpeptid, welches das naszierende Polypeptid in das endoplasmatische Reticulum lenkt. Ein Wert von 30.395 wurde unter Verwendung des van-Heijne-Programms zur Vorhersage von Signalpeptiden erhalten. Die Aminosäuresequenzen der Partialpeptide, die aus dem gereinigten Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Fragment (Beispiel 2) stammen, waren mit denen in der abgeleiteten Aminosäuresequenz konsistent, mit der Ausnahme, dass es ein vier Aminosäuren umfassendes Propeptid geben könnte, in dem die N-terminale Aminosäuresequenz nicht unmittelbar auf das Signalpeptid folgt.
  • Beispiel 7: Konstruktion von Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Expressionsvektoren
  • Zwei synthetische Oligonukleotid-Primer, die unten gezeigt sind, wurden synthetisiert, um das Kohlenhydratoxidase-Gen aus Microdochium nivale genomischer DNA zum Subklonieren und Exprimieren in Fusarium- und Aspergillus-Wirtszellen zu amplifizieren.
  • Um das Subklonieren des Genfragments in die Expressionsvektoren pDM181 und pBANE15 zu erleichtern, wurden SwaI- und PacI-Restriktionsenzym-Schnittstellen jeweils an dem 5'- und 3'-Ende des Carboxypeptidase-Gens eingeführt.
    Vorwärtsprimer: 5'-GATTTAAATATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3' (SEQ ID NR. 22)
    Rückwärtsprimer: 5'-GTTAATTAATTATTTGACAGGGCGGACAGC-3' (SEQ ID NR. 23)
  • Die fettgedruckten Buchstaben (jeweils an den Positionen 10 bis 30) repräsentieren die kodierende Sequenz.
  • Die PCR, die Reinigung und das Subklonieren wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Zyklusparameter wie folgt verändert wurden:
    Zyklus 1 bei 94°C für 2 Minuten, 60°C für 4 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden;
    Zyklen 2–37 jeweils bei 94°C für 45 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten; und Zyklus 38 bei 94°C für 45 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 6 Minuten. Zyklus 39 war ein 4°C-Aufweichzyklus.
  • Der Vektor pDM181 enthält den Fusarium oxysporum Trypsin-ähnlichen Protease-Promotor und -Terminator als regulatorische Sequenzen und das Streptomyces hygroscopicus bar-Gen als einen selektierbaren Marker für Pilztransformanten (WO 98/20136; de Block et al., 1987, EMBO Journal 6: 2513–2518). Der Vektor pBANE15 (1) enthält den TAKA-Promotor und AMG-Terminator und das Aspergillus nidulans amdS-Gen als selektierbaren Marker für Pilztransformantionen. Beide Vektoren enthalten auch das amp-Gen zur Selektion in E. coli.
  • Der Kohlenhydratoxidase-Klon, welcher oben erhalten wurde, wurde mit SwaI und PacI verdaut und durch eine 0,8%-Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung von TBE-Puffer und eines Qiaex-II-Gel-Extraktions-Kits gereinigt. Das verdaute Fragment wurde in pDM181 und pBANE15 kloniert, die zuvor mit SwaI und PacI verdaut wurden, was jeweils die Expressionsplasmide pEJG35 und pEJG33 ergab (2 und 3).
  • Die Expressionsplasmide wurden in E. coli-XL-10-Gold-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert. Die Transformanten, die die korrekten Plasmide enthielten, wurden isoliert und die Plasmid-DNA unter Verwendung des „Wizard Maxi Prep Kits" präpariert.
  • Beispiel 8: Expression des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase-Gens in Aspergillus oryzae
  • pEJG33 wurde in Protease-defiziente Aspergillus-oryzae-Wirtsstämme JaL142 (Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419–1422) und JaL228 (WO 98/12300) unter Verwendung von Protoplasten-Transformation (Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474) transformiert. Einhundert μl der Protoplasten (2 × 106) wurden in ein 14-ml-Falcon-Röhrchen mit ungefähr 5 μg pEJG33 gegeben und vorsichtig gemischt. Ein Volumen von 250 μl 60% PEG 4000 in 10 mM Tris-HCl pH 7,5–10 mM CaCl2 wurde zugefügt und durch vorsichtiges Rollen gemischt. Das Röhrchen wurde dann bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Drei ml STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM CaCl2) wurde zugefügt und durch Umdrehen gemischt. Die Lösung wurde dann direkt auf Cove-Platten gegeben, die pro Liter zusammengesetzt waren aus 342,3 g Saccharose, 10 ml 1,5 M CsCl, 10 ml 1 M Acetamid, 20 ml 1 × Cove-Salzlösung und 1% Agar. 50 × Cove-Salzlösung war pro Liter zusammengesetzt aus 26 g KCl, 26 g MgSO4·7 H2O, 76 g KH2PO4 und 50 ml Cove-Spurenmetalle. Die Cove-Spurenmetalllösung war pro Liter zusammengesetzt aus 0,04 g NaB4O7·10 H2O, 0,4 g CuSO4·5 H2O, 1,2 g FeSO4·7 H2O, 0,7 g MnSO4·H2O, 0,8 g Na2MoO2·2 H2O und 10 g ZnSO4·7 H2O. Die Platten wurden 5 Tage bei 37°C inkubiert. Die Transformatten wurden auf Platten desselben Mediums überführt und 5 Tage bei 37°C inkubiert. Die Transformanten wurden durch Ausstreichen der Sporen und Aufsammeln einzelner Kolonien unter Verwendung der gleichen Platten unter den gleichen Bedingungen gereinigt. Insgesamt wurden 12 Aspergillus oryzae JaL142-Transformanten und 22 Aspergillus oryzae JaL228-Transformanten gewonnen.
  • Die Transformanten wurden auf einzelnen Cove-Platten wie oben wachsen gelassen und dann auf ihre Kohlenhydratoxidase-Aktivität unter Verwendung einer Indikatorplatte, die von WiHeveen et al. (1990, Applied Microbial Biotechnology 33: 683) beschreiben wurde, getestet. Die untransformierten Wirte wurden als Kontrollen verwendet. Insgesamt wurden 11 positive Transformanten identifiziert. Sporenvorräte eines jeden positiven Transformanten wurden mit sterilem, deionisierten Wasser hergestellt. Ein Volumen von 500 μl eines jeden Sporenvorräte einschließlich des untransformierten Wirts wurde in 125-ml-Schüttelflaschen, welche 25 ml MY50-Medium enthielten, inokuliert. Die Schüttelflaschen wurden bei 37°C, 200 Upm für 7 Tage inkubiert. Da die Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase FAD als einen Cofaktor enthält, enthielt ein Satz von Flaschen auch 52 μM Riboflavin 5'-Phosphat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
  • Proben von 500 μl wurden am Tag 3, 5 und 7 aus jeder Flasche entfernt und auf ihre Kohlenhydratoxidaseaktivität getestet. Die Kohlenhydratoxidaseaktivität wurde in einer Platte mit 96 Vertiefungen gemessen, die 10 μl Überstand enthielt, gefolgt von der Zugabe von 1 μl o-Anisidin, 69 μl Britton-und-Robinson-Puffer pH 6,0, 10 μl 1 M D-Glucose und 10 μl Coprinus cinereus Peroxidase (3,76 PODU/ml), welche wie in WO 92/16634 beschrieben erhalten wurde. Die Aktivität wurde bei 405 nm für 10 Minuten in mOD/min gemessen. Die Transformanten produzierten alle eine nachweisbare Kohlenhydratoxidaseaktivität. Die Zugabe von Riboflavin-5'-Phosphat zu den Schüttelflaschen hatte eine geringe Wirkung auf steigende Aktivität. Proben von 20 μl aus den besten Kohlenhydratoxidaseproduzenten wurde auf einem 8–16% Tris-Glycin-Gel (Novex, San Diego, CA) laufen gelassen, wodurch die Produktion von Kohlenhydratoxidase bestätigt wurde.
  • Die Transformanten mit den höchsten Aktivitäten wurden sporengereinigt, indem isolierte Kolonien zweimal nacheinander auf neue COVE-Platten gesetzt und dann in Schüttelflaschen wieder wachsen gelassen wurden und die Kohlenhydratoxidaseaktivität wurde wie oben erneut getestet, um die Produktion der Kohlenhydratoxidase zu bestätigen.
  • Fermentationen von Aspergillus oryzae JaL228, welcher pEJG33 enthielt, wurden bei 34°C, pH 7, 1000–1200 Upm für 8 Tage in 2-Liter-Laborfermentern, die ein Medium enthielten, was zusammengesetzt war aus Nutriose, Hefeextrakt, (NH4)2HPO4, MgSO4·7 H2O, Zitronensäure, K2SO4, CaCl2·H2O und Spurenmetalllösung, laufen gelassen. Die Spurenmetallösung (1000 ×) war pro Liter zusammengesetzt aus 22 g ZnSO4·7 H2O, 11 g H3BO3, 5 g MnCl2·4 H2O, 5 g FeSO4·7 H2O, 1,6 g CoCl2·5 H2O, 1,6 g (NH4)6Mo7O24, und 50 g Na4EDTA. Eine Fermentation wurde mit 2 × 10–4 M FMN pro Liter (GOX003.8) supplementiert, wohingegen die andere nicht supplementiert wurde (GOX002.8).
  • Acht Tage alte Proben wurden wie oben beschrieben getestet. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Kohlenhydratoxidaseaktivität in beiden Fermentationen, aber es wurde kein Unterschied in der Kohlenhydratoxidaseaktivität zwischen beiden Fermentationsbrühen beobachtet.
  • Beispiel 9: Expression des Microdochium nivale Kohlenhydratoxidasegens in Fusarium venenatum
  • pEJG35 wurde in Fusarium venenatum Stamm CC1-3 (WO 97/26330) unter Verwendung des Verfahrens von Royer et al. (1995, Bio/Technology 13: 1479–1483) mit BASTATM (Phosphinothricinresistenzselektion) eingeführt. Der aktive Bestandteil in dem Herbizid BASTATM ist Phosphinothricin. BASTATM wurde von AgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) erhalten und zwei Mal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) vor der Verwendung extrahiert. Auf Basis des Wachstums in Gegenwart von BASTATM wurden 14 Transformanten gewonnen und dann bei Raumtemperatur auf einzelnen Agarplatten wachsen gelassen, die aus 20 ml 50 × Vogels Medium (Royer et al. 1995, supra), 25 g Saccharose, 25 g Nobel-Agar und 25 mM NaNO3, supplementiert mit 5 mg BASTATM pro ml wachsen gelassen. Die Transformanten wurden dann auf ihre Kohlenhydratoxidaseherstellung unter Verwendung einer Indikatorplatte, die von WiHeveen et al., 1990, supra beschrieben wurde, getestet. Fünf getestete Transformanten waren positiv. Ein Plaque eines jeden positiven Transformanten einschließlich untransformiertem Fusarium venenatum CC1-3 als Kontrolle wurde in einzelne 125 ml Schüttelflaschen, die 30 ml M400Da-Medium, das mit 0,5 g CaCl2 pro Liter supplementiert war, inokuliert und bei 30°C für 7 Tage unter 150 Upm Schütteln inkubiert. Das M400Da-Medium war pro Liter zusammengesetzt aus 50 g Maltodextrin, 2 g MgSO4, 2 g KH2PO4, 4 g Zitronensäure, 2 g Harnstoff, 0,5 g CaCl2 und 1 ml Cove-Spurenmetalle. Ein Satz der Flaschen enthielt auch 52 μM Riboflavin-5'-Phosphat.
  • An den Tagen 3, 5, und 7 wurden 500 μl der Kulturbrühe aus jeder Flasche entfernt und zentrifugiert. Die Überstände wurden auf Kohlenhydratoxidaseaktivität, wie in Beispiel 8 beschrieben, getestet. Die Transformanten produzierten alle nachweisbare Kohlenhydratoxidaseaktivität. Die Zugabe von Riboflavin-5'-Phosphat zu den Schüttelflaschen hatte im Wesentlichen keine Wirkung auf steigende Aktivität. Proben von 20 μl aus den besten Kohlenhydratoxidaseaktivitätproduzenten wurden auf einem 8–16% Tris-Glycin-Gel (Novex, San Diego, CA) laufen gelassen, wodurch die Produktion von Kohlenhydratoxidase bestätigt wurde. Die besten Produzenten wurden auf Vogels/BASTATM-Platten sporengereinigt.
  • Eine Fermentation des Fusarium venenatum Stamms CC1-3, welcher pEJG35 enthielt, wurde bei 30°C für 8 Tage in einem 2-Liter-Fermenter, der Medium, welches pro Liter zusammengesetzt war aus 20 g Saccharose, 2,0 g MgSO4·7 H2O, 2,0 KH2PO4, 2,0 Zitronensäure·H2O, 2,0 g CaCl2·2 H2O, 0,5 ml AMG-Spurenmetalle (pH eingestellt auf 4,5 vor der Sterilisation), und eine filtersterilisierte Mischung, welche pro Liter zusammengesetzt war aus 2,5 g Harnstoff und 30 ml einer Sojavitaminmischung, die nach der Sterilisation und Abkühlen des Mediums zugefügt wurde, laufen gelassen. Futterströme waren blockweise autoklavierte Mischungen, zusammengesetzt aus Saccharose und Harnstoff.
  • Acht Tage alte Proben wurden wie in Beispiel 8 beschrieben getestet. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Kohlenhydratoxidaseaktivität.
  • Beispiel 10: Reinigung von rekombinanter Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase
  • Die zwei Aspergillus oryzae JaL228-Fermentationsbrühen, GOX002.8 (1,2 l) und GOX003.8 (1,4 l), hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, wurden kombiniert. Die kombinierten Brühen wurden unter Verwendung eines Whatman-#2-Filterpapiers filtriert und dann gewaschen und durch Ultrafiltration auf 512 ml konzentriert, wobei ein Amicon-Spiral-Konzentrator, ausgerüstet mit einer S1Y10-Membran, verwendet wurde. Die Messung der Kohlenhydratoxidaseaktivität, wie in Beispiel 8 beschrieben, zeigte im Wesentlichen 100% Wiedergewinnung des Enzyms.
  • Das Konzentrat wurde dann auf eine Q-Sepharose-Säule (189 ml; Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, NJ) geladen, die mit 10 mM Tris-HCl pH 8 vorequilibriert war. Die Kohlenhydratoxidase wurde mit 2 M NaCl in 10 mM Tris-HCl pH 8 eluiert. Die Messung der Kohlenhydratoxidaseaktivität, wie oben beschrieben, zeigte, dass das meiste Enzym nicht an die Säule band.
  • Die Durchflussfraktion (760 ml) aus der Q-Sepharose-Säule wurde auf pH 5,5 eingestellt und auf eine SP-Sepharose-Säule (176 ml; Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) geladen, welche mit 10 mM MES pH 7,5 vorequilibriert war. Die Kohlenhydratoxidase wurde mit 1 ml NaCl in 10 mM MES pH 5,5 eluiert, was durch SDS-PAGE eine Kohlenhydratoxidasepräparation mit einer scheinbaren elektrophoretischen Reinheit ergab. Die Tabelle weiter unten fasst die Reinigung der rekombinanten Kohlenhydratoxidase zusammen. Insgesamt wurde eine 14-fache Reinigung mit einer 31%-igen Wiedergewinnung auf Basis des nachfolgenden Sauerstoffelektroden-Tests erreicht. Die Kohlenhydratoxidase wurde unter Verwendung einer Hansatech-O2-Elektrode mit einer Testlösung gemessen, die zusammengesetzt war aus 0,26 ml 10 mM MES pH 5,5, 30 μl 1 M D-Glucose und 3 μl Kohlenhydratoxidase.
  • Reinigung der rekombinanten Kohlenhydratoxidase
    Figure 00430001
  • Einheiten: Vol, ml; A × V und Wiedergewinnung (Aktivität × Vol),%; Aktivität (Peroxidase/o-Anisidintest), IU/ml.
  • Beispiel 11: Molekulare Eigenschaften der rekombinanten Kohlenhydratoxidase
  • SDS-PAGE unter Verwendung eines Novex-8–16%-Tris-Glyin-SDS-PAGE-Gels zeigte, dass die rekombinanten Kohlenhydratoxidasen, die, wie in den Beispielen 8 und 9 beschrieben, erhalten wurden, ein Molekulargewicht von ungefähr 55 kDa hatten, was ähnlich zu der Wildtyp-Kohlenhydratoxidase ist.
  • Ein N-terminales Sequenzieren der rekombinanten Kohlenhydratoxidasen wurde mittels eines „Applied-Biosystems-476A"-Protein-Sequenzierers (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) mit einer on-line HPLC und einer Flüssigphasen-Trifluoressigsäure-(TFA)-Abgabe durchgeführt. Die Präparationen der rekombinanten Kohlenhydratoxidasen wurden unter reduzierenden Bedingungen einer SDS-PAGE unter Verwendung eines Novex-10%-Bis-Tris-SDS-PAGE-Gels und von Novex Nupage MOPS-Puffer unterzogen. Die Gele wurden auf PVDF-Membranen (Novex, San Diego, CA) für 2 Stunden bei 25 Volt in 10 mM CAPS-Puffer pH 11,0 transgeblottet. Die PVDF-Membranen wurden in 0,1% Commassie Blue R250 in 40% Methanol/1% Essigsäure gefärbt und die beobachteten Banden ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Banden wurden von einer Blot-Kassette unter Verwendung Sequenzierungsagenzien (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) sequenziert. Der Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurde mittels on-line-HPLC unter Verwendung von Puffer A, der 3,5% Tetrahydrofuran in Wasser, mit 18 ml des Vormischungskonzentrats (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) enthielt, das Essigsäure, Natriumacetat und Natriumhexasulfonat enthielt, und Puffer B, der Acetonitril enthielt, durchgeführt. Die Daten wurden gesammelt und auf einem Macintosh IIsi unter Verwendung der Applied Biosystems 610 Datenanalyse-Software analysiert.
  • Das N-terminale Sequenzieren beider ausgeschnittener Banden ergab die Sequenz, welche bei Position 1–21 von SEQ ID NR. 2 gezeigt ist, wobei Position 6 nicht bestimmbar war, aber auf Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenz ein Cystein ist. Die N-terminalen Ergebnisse stimmen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz überein und zeigen ein korrektes Prozessieren durch sowohl Aspergillus oryzae als auch Fusarium venanatum Wirte an.
  • In 10 mM MES-NaCl pH 5,5 hatte die rekombinante Kohlenhydratoxidase ein für Flavoproteine typisches Spektrum von UV bis zum sichtbaren Bereich, was auf einem Shimadzu UV160U-Spektrophotometer mit einer 1-cm-Quartz-Küvette aufgezeichnet wurde. Die relative Absorption bei 280 und 450 nm betrug 19, was geringfügig höher war als der Wert 12, der für das Wildtyp-Enzym erhalten wurde. Der Extrinktionskoeffizient bei 280 nm wurde durch Aminosäureanalyse gemessen und betrug 1,9 g/(l × cm), während der vorhergesagte Wert 2,1 betrug (einschließlich des Beitrags eines FAD-Moleküls). Folglich scheint es so, dass jede rekombinante Kohlenhydratoxidase ein Flavinmolekül (wahrscheinlich FAD) enthielt.
  • Unter der Annahme, dass die Oxidation eines jeden D-Glucosemoleküls an die Reduktion von einem O2 zu H2O2 gekoppelt war, wurde die Aktivität der rekombinanten Kohlenhydratoxidase unter Verwendung einer Hansatech-O2-Elektrode, wie in Beispiel 10 beschrieben, gemessen. Die rekombinante Kohlenhydratoxidase oxidierte D-Glucose (0,1 M) mit einer spezifischen Aktivität von 4,0 IU/A280 oder 116 Durchsätze/Minute bei pH 5,5 und 20°C. Die rekombinante Kohlenhydratoxidase hatte die gleiche spezifische Aktivität wie das Wildtyp-Enzym, was durch das in Beispiel 8 beschriebene Coprinus cinereus Peroxidase/Anisidin-Verfahren getestet wurde.
  • Beispiel 12: Substratspezifität
  • Substratspezifität bei 60 mM Substratkonzentration
  • Die Substratspezifität für die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurde in einer Mikroplatte bei Raumtemperatur durch Mischen in der folgenden Reihenfolge bestimmt:
    50 μl 0,4/0,4 M Phosphat/Citrat-Puffer (pH 6)
    50 μl Substrat (360 mM)
    50 μl 21,6 mM 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB)
    50 μl 1 mM 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH)
    50 μ 75 μug/ml rek. Coprinus cinereus Peroxidase (rCiP)
    50 μl Kohlenhydratoxidase
  • Die Absorption bei 595 nm wurde für mindestens 3 Minuten verfolgt. Der Anstieg der Absorption pro Minute wurde berechnet und als ein Maß für die relative Aktivität verwendet.
  • Die Ergebnisse der oxidierenden Aktivität der Kohlenhydratoxidase der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Mono- und Disaccharidsubstrate sind in der Tabelle unten zusammengefasst und zeigen, dass die Kohlenhydratoxidase die meisten reduzierenden Zucker oxidieren kann, und höhere Aktivität auf Maltose und Cellobiose als auf entsprechende Monosaccharidglucose zeigt. Das Enzym hatte keine Wirkung auf nichtreduzierende Zucker, wie z.B. Fructose, Saccharose, Trihalose und Methyl-b-D-Glucopyranosid. Die Ergebnisse sind als Substratspezifität von M. nivale Oxidase relativ zu der optimalen Aktivität auf D-Cellobiose gezeigt.
    Substrat % Aktivität
    D-Glucose 69
    2-Desoxy-D-glucose 4,2
    D-Galactose 31,3
    D-Mannose 3,2
    D-Xylose 55,6
    D-Maltose 83,5
    D-Cellobiose „100"
    Lactose 52,5
  • Substratspezifität bei 0,83 mM
  • Weitere Analysen der Substratspezifität ergaben, dass die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale in der Lage ist, Oligosaccharide aller Polymerisationsgrade (degrees of polymerization; DP), die getestet wurden, DP2–DP5, unter Verwendung der oben beschriebenen Testbedingungen, außer, dass die Substratkonzentration auf 0,83 mM geändert wurde, zu oxidieren. Darüber hinaus kann das Enzym sowohl Maltodextrine als auch Cellodextrine hydrolysieren, wobei die Monosaccharid-Einheiten durch alpha-1,4- bzw. beta-1,4-glycosidische Bindungen verknüpft sind. Die Kohlenhydratoxidase hydrolysiert alle Cellodextrine, die getestet wurden, gleich gut und auf einem Niveau, das ungefähr 10-fach höher als das der Monosaccharide ist. Mit Maltodextrinen als dem Substrat war die Aktivität der Kohlenhydratoxidase im Bereich von 1 ½-fach höher für Maltohexaose bis fast 5-fach höher für Maltotetraose als für das Monosaccharid. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst, die den Einfluss des Polymerisationsgrades und des Typs der 1,4-Verknüpfung auf die Kohlenhydratoxidaseaktivität im Vergleich zu DP 1 (D-Glucose) zeigt.
  • Figure 00460001
  • Substratspezifität bei 1% Substratkonzentration
  • Analysen der oxidierenden Aktivität der Kohlenhydratoxidase aus M. nivale auf Polysaccharide ergab, dass das Enzym zu einer signifikanten Aktivität auf Carboxymethylcellulose (CMC) in der Lage ist, sogar nach Entfernen kleinerer Oligosaccharide und Monosaccharide durch Dialyse, wenn dies unter den oben beschriebenen Testbedingungen bei Verwendung einer Substratkonzentration von 1% getestet wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst, die die Kohlenhydratoxidaseaktivität auf Carboxymethylcellulose im Vergleich zu D-Cellobiose zeigt.
    Substrat % Aktivität
    D-Cellobiose „100"
    CMC 17,7
    CMC, dialysiert 8,8
  • Substratspezifität bei 10 mM Substratkonzentration
  • Die oxidierende Aktivität der Kohlenhydratoxidase aus M. nivale auf verschiedene Substrate wurde bei pH 7,8 (50 mM Tris-HCl Puffer), 10 mM Substrat, gemessen. Ähnliche Daten für Kohlenhydratoxidase aus Acremonium sind zum Vergleich eingeschlossen (wie beschrieben in BBA (1991) 1118, 41–47).
  • Figure 00470001
  • Beispiel 13: Oxidation von Maltose
  • Um zu zeigen, dass die reduzierende Gruppe an der 1-Position durch die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale oxidiert wird, wurde die Oxidation von Maltose chromatographisch unter den folgenden Bedingungen verfolgt: 125 μl 0,2 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH 6, wurde zu 250 μl 10 mM Maltose und 75 μl Wasser zugegeben, bevor 50 μl gereinigte M. nivale Kohlenhydratoxidase zugegeben wurde. Die Probe wurde bis zu 30 Minuten bei 40°C unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl der Probe zu 900 μl Wasser bei 95°C gestoppt. 50 μl des Reaktionsgemisches wurden dann durch Anionenaustausch-Chromatographie (CarboPac- PA1-Säule, Dionex) und anschließendem gepulsten amperometrischen Nachweis (Dionex) auf einem Dionex-DX-500-System unter den folgenden Bedingungen analysiert:
    Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
    Puffer A: 0,1 M NaOH (entgast in He)
    Puffer B: 0,1 M NaOH, 0,6 mM Natriumacetat (entgast in He)
    Gradient: 0–3 min, 5% Puffer B 3–19 min, 5–30% Puffer B 19–21 min, 30–100% Puffer B 21–23 min, 100% Puffer B 23–24 min, 100–% Puffer B
  • Standard-Maltodextrine (DP1–7) wurden von Sigma Chemical Co. bezogen. Maltobionsäure wurde gemäß Fitting & Putman (1952) J. Biol. Chem. 199: 573 hergestellt.
  • Unter Verwendung des obigen Verfahrens wird die Maltose als ein Peak mit einer Retentionszeit von ungefähr 8 Minuten nachgewiesen, wohingegen Maltobionsäure als ein Peak mit einer Retentionszeit von ungefähr 13,3 Minuten nachgewiesen wird. Bei den obigen Bedingungen wird Maltobionsäure aus Maltose in Gegenwart von M. nivale Kohlenhydratoxidase gebildet, da sich ein Peak bei ungefähr 13,3 Minuten entwickelt. Folglich oxidiert die Kohlenhydratoxidase die freie reduzierende Endgruppe in Maltose. Die Menge der produzierten Maltobionsäure ist unten als μM Maltobionsäure im Reaktionsgemisch dargestellt:
    Inkubationszeit (Minuten) Maltobionsäure (μM)
    0 0
    5 150
    10 370
    30 880
  • Beispiel 14: Bindungskonstante, Km
  • Gleichgewichtskinetiken wurden durch Variieren der Konzentration der Kohlenhydratsubstrate und Bestimmen der Kohlenhydratoxidaseaktivität mittels 4AA-TOPS-Test durchgeführt. Einfache Michaelis-Menten-Kinetiken wurden angenommen, obwohl die Reaktion kein einfacher Ein-Substrat-Ein-Produkt-Mechanismus ist (E + S ↔ ES → E + P).
  • Die Gleichgewichtskinetiken für die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurden unter Verwendung einiger bevorzugter Substrate untersucht. Die kinetischen Konstanten wurden aus einer Lineweaver-Burke-Grafik unter der Annahme einfacher Michaelis-Menten-Kinetiken (obwohl dies eine vergleichsweise schlechte Annahme ist) erhalten, um apparente Werte „Km" und „Vmax" für verschiedene Substrate zu erhalten. Die Ergebnisse für „Km" sind:
    Glucose: 42 mM
    Maltose: 11 mM
    Cellobiose: 59 mM
  • Die Kohlenhydratoxidase zeigt die höchste Aktivität auf Cellobiose; allerdings ist „Km" für Cellobiose fast 6-fach höher als für Maltose. Ähnlich ist der „Km" für Glucose signifikant höher als für Maltose, wohingegen die „Vmax" mehr oder weniger für beide Substrate gleich ist. Folglich kann die oben gezeigte Präferenz für Maltose bei niedrigen Substratkonzentrationen durch den niederen Wert für „Km" für Maltose erklärt werden.
  • Beispiel 15: pH- und Temperaturaktivitätsprofile
  • Die Aktivität der Kohlenhydratoxidase aus M. nivale über einen pH-Bereich wurde in Mikroplatten bei Raumtemperatur unter Verwendung der oben in Beispiel 12 beschriebenen Verfahren bestimmt, wobei die Puffer auf den getesteten pH-Wert eingestellt wurden; der tatsächliche pH wurde im Reaktionsgemisch gemessen. Die Ergebnisse unten (Aktivität im Vergleich zum Optimum bei pH 6,32) zeigen, dass die Kohlenhydratoxidase eine optimale Aktivität bei pH 5 bis 7 hat und sie ein relative breites pH-Aktivitätsprofil hat.
    pH % Aktivität
    3,38 5,58
    4,28 27,69
    5,31 88,97
    6,32 100,00
    7,15 96,20
    8,05 57,25
  • Das Temperaturaktivitätsprofil für die Kohlenhydratoxidase wurde durch Mischen von Puffer und Substrat in einem Glasröhrchen und Vorinkubieren bei verschiedenen Temperaturen (30–80°C) für mindestens 5 Minuten bestimmt:
    150 ml 0,4/0,4 M Phosphat/Citrat pH 6
    150 ml 180 mM Maltose
    150 ml Oxidaseverdünnung
  • Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Oxidase gestartet und die Proben bei der geeigneten Temperatur in einem eingestellten thermostatischen Bad inkubiert. Nach 5 Minuten wurden die Proben auf Eis gestellt und die Bildung von H2O2 durch Zugabe von 450 μl DMAB:MBTH:rCiP (1:1:1) bei den entsprechenden Konzentrationen wie in Beispiel 12 bestimmt und der Anstieg der Extinktion bei 590 nm wurde nach 10 Sekunden auf einem HP-8452A-Dioden-Array-Spektrophotometer (Hewlett-Packard) gemessen. Eine Blindprobe ohne Inkubation war eingeschlossen. Die unten gezeigten Ergebnisse (im Vergleich zum Optimum bei 50°C) zeigen an, dass das Enzym bis zu mindestens 60°C bei einer optimalen Aktivität bei 50°C aktiv ist.
    °C % Aktivität
    30 86,28
    40 90,98
    50 100,00
    60 79,95
    70 2,27
  • Beispiel 16: Thermostabilität durch DSC
  • Eine Probe Kohlenhydrat aus M. nivale wurde in 0,1 M MES pH 6 unter Verwendung der NAP-5-Säulen von Pharmacia entsalzt. Die Probe (enthaltend 6,5 mg/ml der Oxidase) wurde auf das VP-DSC-Gerät (MicroCal) geladen und ein linearer Scan von 20 bis 90°C mit einer Scangeschwindigkeit von 90°C/h durchgeführt.
  • Es wurde gefunden, dass die Denaturierungstemperatur 73°C beträgt.
  • Beispiel 17: Temperatur- und pH-Stabilität
  • Temperaturstabilität:
  • Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurde 10 Minuten bei pH 6 und verschiedenen Temperaturen vorinkubiert, bevor die Restaktivität durch den 4AA-TOPS-Test gemessen wurde:
    Temp.°C Restaktivität%
    40 81
    50 78
    60 100
    70 19
    80 2
  • Die Ergebnisse zeigen, dass das Enzym bis 60°C stabil, aber bei 70°C und darüber instabil ist. Dies ist in Einklang mit den Ergebnissen, die aus den DSC-Experimenten erhalten wurden.
  • pH-Stabilität:
  • Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurde 2 Stunden bei 40°C bei verschiedenen pH-Werten inkubiert, bevor die Restaktivität durch den 4AA-TOPS-Test gemessen wurde:
    pH Restakt.%
    3 2
    4 100
    5 95
    6 93
    7 99
    8 97
    9 93
  • Die Ergebnisse zeigen, dass das Enzym in dem Bereich von pH 4–9 stabil, aber bei pH 3 instabil ist. Beispiel 18: Wirkung der Kohlenhydratoxidase auf die Glutenrheologie Brotteigrezept
    Weizenmehl 100% (= 10 g)
    Wasser 58% (einschließlich Enzymlösung)
    Salz 1,5%
    Zucker 1,5%
  • Das Weizenmehl war vom Typ Meneba. Das Mehl war frei von Ascorbinsäure.
  • Der Teig wurde in einem 10-g-Mikromischer (Typ NSI-33R, von „National Manufacturing Co.") für 2:30 Minuten gemischt. Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurde vor dem Mischen zugefügt. Nach dem Mischen wurde dem Teig für 90 Minuten bei 32°C und einer relativen Feuchtigkeit von 85% erlaubt zu ruhen. Das Gluten wurde mit einer Lösung von 2% NaCl (7 Minuten in einem Glutomatic 2200, Perten Instruments) aus dem Teig gewaschen und dann in einer Gluten-Index-Zentrifuge 2015 (Perten Instruments) für 1 Minute zentrifugiert.
  • Die Glutenrheologie wurde in einem Bohlin-VOR-Rheometersystem (Bohlin Instruments), welches eine Dehnungsverformung bei einer konstanten Frequenz (1 Hz) durchführte, analysiert, um die Stärke des Teigs unter Oszillation zu beurteilen. In diesem Verfahren werden die viskoelastischen Eigenschaften des Teigs in zwei Komponenten aufgeteilt, die dynamische Scherspeicherkennzahl G' und die dynamische Scherverlustkennzahl G''. Das Verhältnis von Verlust- und Speicherkennzahl ist numerisch gleich zu der Tangente des viskoelastischen Phasenwinkels d. Ein Anstieg der Speicherkennzahl G' und ein Abfall in dem Phasenwinkel d weisen auf einen stärkeren und elastischeren Teig hin.
  • Figure 00520001
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die G'-Speicherkennzahl relativ zur Dosis der dem Teig zugefügten Kohlenhydratoxidase steigt. Im Hinblick auf den Phasenwinkel d sind alle Kohlenhydratoxidase-behandelten Teige von der Referenz unterschiedlich und der Phasenwinkel sinkt proportional mit der Menge des zugefügten Enzyms. Folglich erhöht die Kohlenhydratoxidase die elastische Kennzahl und daher die Teigelastizität in einer Dosis-abhängigen Weise. Die Zahlen stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen dar. Die mit einem Stern markierten Zahlen sind statistisch signifikant gegenüber der Referenz, ermittelt durch ANOVA-Analyse bei einem 5%-Signifikanzniveau.
  • Beispiel 19: Wirkung der Kohlenhydratoxidase auf die Teigkonsistenz Backverfahren
    Figure 00530001
  • Das Mehl war Ascorbinsäure-frei.
  • Verfahren: Der Teig wurde in einem 10-g-Mikromixer (Typ NSI-33R, von National Manufacturing Co.) für 2% Minuten gemischt. Die Kohlenhydratoxidase aus M. nivale wurde vor dem Mischen zugefügt. Die Endtemperatur des Teiges nach dem Mischen betrug ungefähr 27°C. Der Teig wurde sofort nach dem Mischen beurteilt.
  • Beurteilung des Teiges
  • Die Teigklebrigkeit und -festigkeit wurden empirisch anhand der folgenden Skala gemessen:
  • Figure 00530002
  • Die Beurteilung wurde über zwei Tage unter Verwendung von drei Wiederholungen für jede Dosis pro Tag durchgeführt. Die Daten, die in der Tabelle unten zusammengefasst sind, stellen den Mittelwert von sechs Untersuchungen dar. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Teigfestigkeit als auch -klebrigkeit die gleiche Tendenz eines Dosisabhängigen Ansteigens der Fähigkeit der Kohlenhydratoxidase zeigen, einen Teig mit einer exzellenten Teigkonsistenz zu ergeben. Bei 200 und 300 Einheiten/kg beurteilte ein ausgebildeter Bäcker den Teig als mit exzellenter Festigkeit und Weichheit und mit einer sehr luftigen Konsistenz.
  • Figure 00540001
  • Beispiel 20
  • Um die Toleranz von Microdochium nivale Kohlenhydratoxidase (MCO) gegenüber Veränderungen verschiedener Verarbeitungsparameter zu untersuchen, wurde MCO in einem „European straight dough", Backtest im Standardmaßstab (2 kg Mehl) getestet. Im Vergleich zu dem Standardbackverfahren (ABF-SP.1217.01/01) war der Teig bei Erhöhen des Wassergehalts, bei Erhöhen der Rührzeit und/oder bei Erhöhen der Fermentationszeit gespannt. Der Test hatte das Ziel zu klären, ob MCO den Teig resistenter gegen diese Veränderungen machen kann. Um ein realistisches Backverfahren zu simulieren, wurde MCO in Kombination mit Fungamyl Super MA (Xylanase und Amylase) getestet. Die Anordnung basierte auf einem nicht-vollständigen, statistischen Design. Im Vergleich zu einer Kontrolle, die kein MCO enthielt, resultierte die Zugabe von MCO in einer besseren Teig/Brotrobustheit. Zum Beispiel kann, wenn die Standfestigkeit beurteilt wird (= Fläche des „Fußes") zum Beispiel geschlossen werden, dass keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen MCO-Dosierung (0 bis 200 U) und einer Erhöhung der Wasserzugabe um 1,5% und einer Erhöhung der Rührzeit um + 2 Minuten beobachtet werden, geschlossen wurden.
  • ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (REGEL 13bis PCT))
    Figure 00550001
  • ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (REGEL 13bis PCT))
    Figure 00560001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001

Claims (11)

  1. Kohlenhydratoxidase, die in der Lage ist, reduzierende Oligosaccharide mit einem Glucoserest am reduzierenden Ende zu oxidieren, und die a) das Polypeptid ist, das von der Kohlenhydratoxidase-kodierenden DNA-Sequenz kodiert wird, die in Plasmid pCR2.1-TOPO kloniert ist, welches in Escherichia coli NRRL B-30034 vorhanden wurde, oder b) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens 80% Identität mit der in SEQ ID NR. 2 gezeigten Sequenz aufweist.
  2. Kohlenhydratoxidase von Anspruch 1, die erhältlich ist aus einem Stamm von M. nivale, vorzugsweise dem Stamm M. nivale, CBS 100236.
  3. Nukleinsäuresequenz umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die die Kohlenhydratoxidase von Anspruch 1 oder 2 kodiert.
  4. Nukleinsäuresequenz von Anspruch 3, die umfasst: a) die Kohlenhydratoxidase-kodierende DNA-Sequenz, die in Plasmid pCR2.1-TOPO kloniert wurde, welches in Escherichia coli NRRL B-30034 vorhanden ist, oder b) eine DNA-Sequenz, die mindestens 80% Identität mit der in den Positionen 67–1550 von SEQ II) NR. 1 gezeigten DNA-Sequenz aufweist.
  5. Nukleinsäurekonstrukt umfassend die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 3 oder 4, die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der Kohlenhydratoxidase in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
  6. Rekombinanter Expressionsvektor umfassend das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 5, einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale.
  7. Rekombinante Wirtszelle umfassend das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 5.
  8. Verfahren zum Herstellen einer Kohlenhydratoxidase umfassend das Kultivieren der Wirtszelle von Anspruch 7 unter Bedingungen, die für die Expression der Kohlenhydratoxidase zuträglich sind, und das Gewinnen der Kohlenhydratoxidase.
  9. Verwendung der Kohlenhydratoxidase von Anspruch 1 oder 2 zum Herstellen eines Teiges und/oder gebackenen Produkts, das aus Teig hergestellt ist.
  10. Verwendung der Kohlenhydratoxidase von Anspruch 1 oder 2, um ein Oligosaccharid mit einem Glucoserest am reduzierenden Ende zu der entsprechenden Säure zu oxidieren.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, um Lactobionsäure aus Lactose herzustellen.
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