CN104781412A - 5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化 - Google Patents

5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化 Download PDF

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Abstract

此处提供了用于氧化5-羟甲基糠醛(HMF)和HMF衍生物的酶法。

Description

5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年7月20日提交的美国临时申请序列号61/673,913的优先权。该申请的内容全部通过引用结合在此。
对序列表的引用
本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及用于通过用半乳糖氧化酶和/或环化酶进行催化氧化来氧化5-羟甲基糠醛(HMF)、2,5-二甲酰基呋喃(DFF)、5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)、以及甲酰基呋喃羧酸(FFCA)的工艺。
背景
不同工业所需的化合物多年来一直源自于石油化学工业。然而，由于原油价格的增加以及用可再生资源代替石油化学产品的总体意识的存在，对于基于可再生资源生产化合物一直存在一个希望并且仍然是一个希望。
5-羟甲基糠醛(HMF；CAS：67-47-0)是这样一种化合物的一个实例，因为它源自于糖的脱水，这使它可以从可再生资源中获得。HMF可以例如被转化为多种有用的产物，例如经铜-钌(CuRu)催化剂通过氢解C-O键被转化为液体生物燃料2,5-二甲基呋喃(罗马-莱西考伍(Roman-Leshkov)Y等人，自然(Nature)，2007,447,982)，或通过氧化被转化为2,5-呋喃二羧酸(FDCA)(博伊森(Boisen)A等人，化学工程研究和设计(Chemical Engineering Research and Design)，2009,87,1318-1327)。后面的化合物FDCA可在聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT))的生产中用作对苯二甲酸的替代。FDCA的一个缺点是，化学合成需要高压、高温、金属盐以及有机溶剂，使得该工艺昂贵并且有污染性(库普曼(Koopman)等人，生物资源技术(Bioresource Technology)2010,101,6291-6296)。
2,5-二甲酰基呋喃(DFF；CAS：823-82-5)是HMF的一种被氧化的二醛，其可在一系列不同的应用中用作结构基元和交联剂。例如，DFF可用作用于聚合物生产的一个单体，例如与脲组合，或可被进一步氧化为有用的结构基元，例如FFCA和FDCA。它还可以代替其他常用的醛，例如用于皮革交联的戊二醛或与脲、三聚氰胺和/或苯酚组合的用于木质复合材料交联的甲醛。然而，难以通过传统化学法将HMF选择性氧化为DFF，因为该反应常不加选择地氧化，产生多种氧化产物的组合。
由于升高的酶-底物特异性，通过酶催化选择性氧化HMF可对化学法提供一个替代方案。然而，HMF不是一种已知的天然酶底物，所以鉴别具有适合结构的能够选择性氧化HMF的酶将具有挑战性。
德乌尔泽恩(Deurzen)等人，碳水化合物化学杂志(J CarbohydrateChemistry)1997,16,299-309描述了使用氯过氧化物酶催化剂用过氧化氢将HMF氧化为DFF。WO 2009/023174表明使用例如芳基醇氧化酶和氯过氧化物酶将HMF氧化为DFF和其他HMF氧化产物。WO2008/119780表明了使用真菌环化酶从吡啶产生N-氧化物。
然而，由于酶特性(例如在不同条件下的稳定性和活性)上的变异性，在本领域中鉴别能够产生HMF氧化产物(例如DFF、FFCA和FDCA)的可替代酶会是有利的。本发明尤其提供了用于制备这类氧化产物的方法。
概述
此处描述了使用半乳糖氧化酶和/或环化酶来氧化5-羟甲基糠醛(HMF)和HMF衍生物的酶法。
在一个方面是一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种半乳糖氧化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶是在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。在实施例中，该反应混合物进一步包括一种环化酶，并且DFF被进一步氧化为甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。在这些实施例中的一些中，该环化酶与SEQ IDNO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在一些实施例中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
在一个方面是一种氧化HMF的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种环化酶，以提供DFF、HMFCA、FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在一些实施例中，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在一些实施例中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
在一个方面是一种氧化DFF的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使DFF接触一种环化酶，以提供FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在一些实施例中，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在一些实施例中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
在一个方面是一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种半乳糖氧化酶，以提供FFCA或其盐。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在一些实施例中，该半乳糖氧化酶是在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。在一些实施例中，该反应混合物进一步包括一种环化酶。在这些实施例中的一些中，FFCA被进一步氧化为FDCA或其盐。在这些实施例中的一些中，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在这些实施例中的一些中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
在一个方面是一种氧化HMFCA或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在一些实施例中，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在这些实施例中的一些中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
在一个方面是一种氧化FFCA或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使FFCA或其盐接触一种环化酶，以提供FDCA或其盐。在一些实施例中，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性。在这些实施例中的一些中，该环化酶是在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代的一个变体。
附图简要说明
图1显示5-羟甲基糠醛(HMF)的氧化产物。
图2A和2B显示澳美镰孢菌(天然的，SEQ ID NO:2)、澳美镰孢菌(MutA，SEQ ID NO:6)、澳美镰孢菌(MutB，SEQ ID NO:8)、以及长腿镰孢菌(F.longipes)(天然的，SEQ ID NO:4)的半乳糖氧化酶序列的比对。对于澳美镰孢菌半乳糖氧化酶公开的成熟多肽起始位点是以垂直箭头显示。这些变体澳美镰孢菌序列的取代的残基以粗体显示。
定义
半乳糖氧化酶：术语“半乳糖氧化酶”此处被定义为一种催化D-半乳糖和氧气向D-半乳糖-己二醛糖和H2O2转化的氧化还原酶(EC1.1.3.9)。出于本发明的目的，可以根据徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)2000,88,23-32描述的方法测定半乳糖氧化酶活性。
在某些方面，半乳糖氧化酶在相同条件下具有SEQ ID NO:2的成熟多肽序列的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的半乳糖氧化酶活性。
环化酶：术语“环化酶”意指根据EC 1.11.2.1的一种“非特异性环化酶”活性，其催化来自H2O2的一个氧原子***多种底物(例如硝基苯并二茂)中。出于本发明的目的，可以根据波拉杰-可比尔斯考(Poraj-Kobielska)，M.等人，分析生物化学(Analytical Biochemistry)2012,421,327–329描述的方法测定环化酶活性。
在某些方面，环化酶在相同条件下具有任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32的成熟多肽序列的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的环化酶活性。
异源多核苷酸：在此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出一种或多种(例如，两种，若干种)结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸，例如，将一种不同的(外源的)启动子连接至该多核苷酸；或通过向该宿主细胞中引入该多核苷酸的一个或多个另外的拷贝而定量改变其表达的天然多核苷酸。
编码序列：术语“编码序列”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。
cDNA序列：术语“cDNA序列”意指通过从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子反转录后的DNA序列。基因组DNA的早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。一种cDNA序列缺乏可以存在于相应基因组DNA序列中的介入内含子序列。因此，短语“SEQID NO:X的cDNA序列”意指SEQ ID NO:X介入内含子序列(如果存在)删除后产生的序列。在某些情况下—当一个参比基因组DNA序列缺乏介入内含子序列—cDNA序列可能与相应的基因组DNA序列完全相同。
基因组DNA序列：术语“基因组DNA序列”意指发现于源生物(例如，真核或原核基因组)的基因组中的一种DNA序列。在某些情况下，一种来自于真核基因组的基因组DNA序列包含一个或多个介入内含子序列，这个或这些介入内含子序列是通过初始RNA转录本经过RNA剪切去除后形成。因此，短语“SEQ ID NO:Y的基因组DNA序列”意指来自于源生物的相应的DNA序列，其包括介入内含子序列(如果有，存在于RNA拼接之前)。
成熟多肽序列：术语“成熟多肽序列”意指在任何翻译后序列修饰(例如N-末端加工和/或C-末端截短)之后的参比多肽序列部分。成熟多肽序列可能是可以预测的，例如，基于信号P(SignalP)程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)或InterProScan程序(欧洲生物信息研究所(The European BioinformaticsInstitute))。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽序列(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
在一方面，半乳糖氧化酶的成熟多肽是SEQ ID NO:2、4、6、或8的氨基酸1至639。在另一个方面，半乳糖氧化酶的成熟多肽是SEQID NO:2、4、6、或8的氨基酸3至639(例如，当由描述于徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)2000,88,23-32中的米曲霉重组表达时)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指参比多肽序列(例如，基因组或cDNA序列)编码成熟多肽序列的部分。该成熟多肽编码序列是可以预测的，例如，可以基于信号P(SignalP)程序(同上)或InterProScan(同上)程序。在某些情况下，成熟多肽编码序列可与整个参比多核苷酸序列相同。
在一个方面，半乳糖氧化酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1、5、或7的核苷酸124至2040或SEQ ID NO:3的核苷酸130至2046。在另一个方面，半乳糖氧化酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1、5、或7的氨基酸130至2040或SEQ ID NO:3的氨基酸136至2046(例如，当由描述于徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(ApplBiochem Biotechnol)2000,88,23-32中的米曲霉的重组表达时)。
片段：术语“片段”意指一种具有一个或多个(例如，两个，若干个)氨基酸从参比多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失的多肽。在一个方面中，该片段具有半乳糖氧化酶活性。在另一个方面，在该片段中的氨基酸残基的数目是描述于此的任何半乳糖氧化酶的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％，例如，是SEQ ID NO:2、4、6或8中的成熟多肽序列的氨基酸残基的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％。
子序列：术语“子序列”意指一种具有一个或多个(例如，两个，若干个)核苷酸从参比核苷酸序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸。在一个方面中，该子序列编码一种具有半乳糖氧化酶活性的片段。在另一个方面，在该子序列中的核苷酸残基的数目是编码在此描述的半乳糖氧化酶的任何序列中的核苷酸残基的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％，例如，是SEQ ID NO:1、3、5或7中的成熟多肽编码的核苷酸残基的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于此处所述的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于此处所述的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
表达：术语“表达”包括生产多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指一种包括一个或多个(例如，两个、若干个)控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单-链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰成以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可以是合成的。
控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环形的DNA分子，该分子包括编码一种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列，其中这些控制序列提供编码该多肽的多核苷酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，以及转录和翻译终止信号序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对包括在此所述的一个或多个(例如，两个、若干个)多核苷酸(例如，编码一种碳酸酐酶的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
亲本或亲本半乳糖氧化酶：术语“亲本”或“亲本半乳糖氧化酶”意指一种天然发生的半乳糖氧化酶，其在生产在此所述的变体中被用作参比物。
变体：术语“变体”意指相比于亲本在一个或多个(例如两个、若干个)位置处包括一种变化，即，一个取代、***和/或缺失的具有半乳糖氧化酶活性的一种多肽。取代意指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且***意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。此处所述的变体不一定直接来自该亲本，只要存在相对于该亲本的一个或多个所表示的变更。
这些变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的半乳糖氧化酶活性。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
变体命名惯例
出于描述于此的半乳糖氧化酶变体的目的，使用在SEQ ID NO:2中的成熟多肽来确定另一种半乳糖氧化酶中相对应的氨基酸残基。将另一种半乳糖氧化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQID NO:2的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
出于描述于此的环化酶变体的目的，使用在SEQ ID NO:10的成熟多肽来确定另一个环化酶中相对应的氨基酸残基。将另一种环化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德尔曼-翁施算法(如上所述)来确定与SEQ ID NO:10的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。
可以通过使用若干计算机程序、使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种半乳糖氧化酶中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信 息学26:1899-1900)、以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(Shindyalov和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
***。对于氨基酸***，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、***氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多重氨基酸的***被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***的氨基酸#1、***的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过将小写字母添加至在所***的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所***的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。
如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
详细说明
在此尤其描述了使用半乳糖氧化酶多肽和半乳糖氧化酶变体氧化羟甲基糠醛(HMF)的方法。
半乳糖氧化酶和编码半乳糖氧化酶的多肽
用于在此的方法中的半乳糖氧化酶可以是任何半乳糖氧化酶，其适用于氧化HMF，例如一种天然发生的半乳糖氧化酶或其一种变体。如下面更详细地描述的，该半乳糖氧化酶可由任何合适的宿主生物体，例如，米曲霉或镶片镰孢菌重组产生(参见徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)2000,88,23-32)。
在某些方面，该半乳糖氧化酶：(a)与SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)；(b)是由在至少低、中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交的一个编码序列编码；或(c)是由与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)的一个编码序列编码。在描述于此的方法的一个方面中，该半乳糖氧化酶不包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列。
在一个方面，半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在一个方面，该半乳糖氧化酶序列与SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于二个氨基酸、或相差一个氨基酸。
在一个方面，该半乳糖氧化酶包括SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列或其等位基因变体，或前述的具有半乳糖氧化酶活性的片段或由其组成。在另一个方面，该半乳糖氧化酶包括SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列或由其组成。在另一个方面，该半乳糖氧化酶包括SEQ IDNO:2或4的氨基酸1至639或由其组成。
在一个方面，半乳糖氧化酶具有SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列的一个或多个(例如，两个，若干个)氨基酸的氨基酸置换、缺失和/或***。该氨基酸改变的性质通常较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而协助纯化的小段延伸，例如多组氨酸区段、抗原表位、或结合结构域。
对于半乳糖氧化酶，技术人员可以使用来自半乳糖氧化酶晶体结构的教导(伊托(Ito)，N.等人自然(Nature)1991,350,87-90)和本领域中已知的(里珀(Lippow)等人，化学生物(Chem Biol)2010,17,1306-1315)变体库的教导以及当前披露作为鉴别氨基酸残基(其可被改变而不显著改变活性)的指导的教导。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如在H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述的。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高半乳糖氧化酶的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。下文描述了具有改进的特性的半乳糖氧化酶变体的实例。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定半乳糖氧化酶中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的半乳糖氧化酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定该半乳糖氧化酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报309:59-64。还可以从与参比半乳糖氧化酶相关的其它半乳糖氧化酶的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性半乳糖氧化酶的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一个方面中，该半乳糖氧化酶由以下编码序列编码，该编码序列在至少低严谨度条件下，例如中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交(参见，例如J.萨拉布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)，和T.麦尼艾塔斯(Maniatus)，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
在一个方面，该半乳糖氧化酶由一个编码序列编码，该编码序列与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
在一个方面，该半乳糖氧化酶由一个编码序列编码，该编码序列包括SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列或由其组成。在一个方面，该半乳糖氧化酶由一个编码序列编码，该编码序列包括SEQ ID NO:1的核苷酸124至2040，或SEQ ID NO:3的核苷酸130至2046或由其组成的。在一个方面，该半乳糖氧化酶由一个编码序列编码，该编码序列包括SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列的一个子序列或由其组成的，其中该子序列编码具有半乳糖氧化酶活性的多肽。在一个方面，在该子序列中的核苷酸残基的数目是SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列的核苷酸残基的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％。
在一个方面，该半乳糖氧化酶是SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列的片段或是在此描述的SEQ ID NO:2或4的任何方面的片段，其中该片段具有半乳糖氧化酶活性。在一个方面，在该片段中的氨基酸残基的数目是SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列的氨基酸残基的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％、或95％。
该半乳糖氧化酶可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在半乳糖氧化酶的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与编码半乳糖氧化酶多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug DiscoveryWorld)4:35-48。
用于分离或克隆多核苷酸—例如编码半乳糖氧化酶的多核苷酸—以及在此提到的任何方面使用的任何其他多肽的技术是本领域熟知的且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如英尼斯(Innis)等人，1990，PCR:方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(AcademicPress)，纽约(New York)。还可以使用其他核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可从例如镰刀菌属菌株或者另外的或相关的生物体中克隆得到多核苷酸，并且因此这些多核苷酸可以是例如该核苷酸序列的多肽编码区的等位或物种变体。
SEQ ID NO:1或3的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或其片段可以用来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株鉴定并克隆半乳糖氧化酶。具体地说，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，例如至少14个核苷酸、至少25个核苷酸、至少35个核苷酸、至少70个核苷酸长度。该探针可以更长，例如至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸长度。可以使用甚至更长的探针，例如至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有半乳糖氧化酶活性的多肽的DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:54或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中可以使用载体材料。
出于上述探针的目的，杂交是指，在非常低到非常高严谨度条件下，多核苷酸杂交到与SEQ ID NO:1或3，其全长互补链、或前述各项的子序列对应的标记核酸探针上。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片而进行检测。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列，或其子序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列的多核苷酸或其片段。
半乳糖氧化酶变体
在一些方面中，这些半乳糖氧化酶在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330以及406处的一个或多个(例如，两个、若干个)位置处包括取代。可用于在此描述的方法的另外的半乳糖氧化酶变体包括描述于里珀(Lippow)等人，化学生物(Chem Biol)2010,17,1306-1315(该内容将通过对其中变体序列引用的方式)中的那些。
该半乳糖氧化酶变体可以保持或可以不保持半乳糖活性，只要该变体依据参比方法是有氧化所指示底物(例如，HMF)能力的。
在一个实施例中，该变体与该亲本半乳糖氧化酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个方面，变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330以及406处的一个或多个(例如，两个、若干个)位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330以及406的任何两个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于SEQID NO:2的位置326、329、330以及406的任何三个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330以及406的每一个位置处包括取代。
在另一个方面，变体包括在对应于位置326的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置326相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E或由其组成。
在另一个方面，变体包括在对应于位置329的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置329相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg或Lys取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y329R/K或由其组成。
在另一个方面，变体包括在对应于位置330的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置330相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Lys取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R330K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括对应于位置406的位置或由其组成。在另一个方面，与位置406相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Thr、Arg或Lys取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326和329的位置上的改变，或由该改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326和330的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置329和330的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置329和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置330和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326、329、和330的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326、329、和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326、330、和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置329、330、和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置326、329、330、和406的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含选自以下的一个或多个(例如，两个、若干个)取代或由其组成：Q326E、Y329K、R330K、和Q406T。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+Y329R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的Q326E+R330K的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y329R/K+R330K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y329R/K+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代R330K+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+Y329R/K+R330K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+Y329R/K+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+R330K+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Y329R/K+R330K+Q406T/R/K或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代Q326E+Y329R/K+R330K+Q406T/R/K或由其组成。
这些变体在一个或多个(例如，两个、若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个额外的取代，如上所述。例如，这些变体可以包括一个或多个取代，例如，对应于SEQ ID NO:2的位置290、324、333、334、383、405、441和463处的取代，如描述于里珀(Lippow)等人，化学生物(Chem Biol)2010,17,1306-1315。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化效率。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化速率。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体在储存条件下具有改进的稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物结合。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物裂解。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物特异性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的表面特性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热稳定性。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处进行切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及***片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
可以使用任何定点诱变程序，例如许多商业上可用的试剂盒中的一个，来制备这些变体。
合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯等人，1999，自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
环化酶
用于在此的方法中的环化酶可以是任何环化酶，其适用于氧化HMF，DFF和/或FFCA，例如一种天然发生的环化酶或其一种变体。如下面更详细地描述的，该环化酶可由任何合适的宿主生物体重组产生，例如，米曲霉或镶片镰孢菌。
在某些方面，该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项或SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
在某些方面，该环化酶包括由基序：E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R代表的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。
在一个方面，该环化酶序列与任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31或32的成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于二个氨基酸、或相差一个氨基酸。
在一个方面，该环化酶包括任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的成熟多肽序列，其等位基因变体，或前述的具有环化酶活性的一个片段或由其组成。在另一个方面，该环化酶包括任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31或32或由其组成。
在一个方面，该环化酶具有SEQ ID NO:10的成熟多肽序列的一个或多个(例如，两个，若干个)氨基酸的氨基酸置换、缺失和/或***，如上所描述的。
在一个方面中，该环化酶由以下编码序列编码，该编码序列在至少低严谨度条件下，例如中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交(参见，例如，J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，见上文)。
在一个方面，该环化酶是任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31或32的成熟多肽序列的片段，或在此描述的任何相关方面的片段，其中该片段具有环化酶活性。在一个方面，该片段中的氨基酸残基的数目是任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31或32的氨基酸残基数目的至少75％，如至少80％、85％、90％或95％。
该环化酶可以是一种融合多肽或可切割的融合多肽，如上文所描述的。
用于分离或克隆编码环化酶的多核苷酸的技术描述在上文中。
任一SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32的氨基酸序列或其片段可用于设计核酸探针以从不同的属或不同的种的菌株鉴别和克隆环化酶，如上所描述的。
在此描述的可用于这些方法中的另外的环化酶包括描述于WO2008/119780中的环化酶，其内容通过引用结合在此。
环化酶变体
在一些方面中，该环化酶在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134以及201处的一个或多个(例如，两个、若干个)位置处包括取代。SEQ ID NO:9的茶树菇(Agrocybe aegeritae)环化酶和SEQ ID NO:10的灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)环化酶的环化酶变体已描述于2011年10月24日提交的USSN:61/550548中，特此将其内容通过引用结合。
该环化酶变体可以保持或可以不保持环化酶活性，只要该变体依据参比方法是有氧化所指示底物能力的。
在一个实施例中，该变体与该亲本环化酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一些方面，变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134以及201处的一个或多个(例如，两个、若干个)位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134或201的任何两个位置处包括取代。在另一个方面，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134或201的每一个位置处包括取代。
在另一个方面，变体包括在对应于位置76的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置326相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的取代M76L或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置134的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置134相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的取代M134L或由其组成。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:9的成熟多肽的取代M127L或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置201的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置201相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Phe取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的取代Y201F或由其组成。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:9的成熟多肽的取代Y194F或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置76和134的位置上的改变，或由该改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置76和201的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置134和201的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置76、134、和201的位置上的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含选自以下的一个或多个(例如，两个、若干个)取代或由其组成：M76L、M134L和Y201F。
在另一个方面，该变体包含选自M127L和Y194F的一个或两个取代或由其组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的M76L+M134L的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的M76L+Y201F的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的M134L+Y201F的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:10的成熟多肽的M76L+M134L+Y201F的取代，或由这些取代组成。
在另一个方面，该变体包含M127L+Y194F的取代或由这些取代组成。
这些变体在一个或多个(例如，两个、若干个)其他位置上可进一步包含一个或多个额外的取代，如上所述。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化效率。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化速率。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的化学稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的氧化稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的pH稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体在储存条件下具有改进的稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物结合。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物切割。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物特异性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物稳定性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的表面特性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热活性。
在另一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热稳定性。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
多肽来源
此处所述的半乳糖氧化酶和环化酶(例如亲本半乳糖氧化酶)可从任何属的微生物获得。如此处使用的，结合一种给定的来源的术语“从...中获得”应指由一种多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经***来自该来源的多核苷酸的一个细胞产生。在一些方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是由该来源产生。在一些方面，该半乳糖氧化酶或环化酶不是由该来源产生并且是由另一个物种重组地产生。如本领域技术人员可认识到的，一种半乳糖氧化酶或环化酶的活性可被宿主细胞影响，其中它是通过例如由细胞环境的差异造成的翻译后修饰产生的。在一些方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是从除了此处所述的来源中任一项之外的一种宿主表达的(例如该半乳糖氧化酶可以从除了树枝状轮枝孢霉(Dactylium dendroides)之外的一种宿主表达)。在一些方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是由一种异源多核苷酸产生的，例如该半乳糖氧化酶是从一种多核苷酸表达的，该多核苷酸对于该宿主细胞而言不是天然的。
该半乳糖氧化酶或环化酶可以是一种细菌半乳糖氧化酶或环化酶。例如，该半乳糖氧化酶或环化酶可以是一种***半乳糖氧化酶或环化酶，例如芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳酸杆菌、乳球菌、梭菌、土芽孢杆菌、或大洋芽孢杆菌半乳糖氧化酶或环化酶；或一种革兰氏阴性细菌半乳糖氧化酶或环化酶，例如一种大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、或脲原体属半乳糖氧化酶或环化酶。
在一个方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌半乳糖氧化酶或环化酶。
在另一个方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是似马链球菌、化脓链球菌、***链球菌、或马链球菌兽疫亚种半乳糖氧化酶或环化酶。在另一个方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、或变铅青链霉菌半乳糖氧化酶或环化酶。
该半乳糖氧化酶或环化酶可以是一种真菌半乳糖氧化酶或环化酶。在一个方面，该真菌半乳糖氧化酶或环化酶来自一种酵母，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)半乳糖氧化酶；或丝状真菌半乳糖氧化酶，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia菌属、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)。
在另一个方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、或卵形酵母半乳糖氧化酶或环化酶。
在另一个方面，该半乳糖氧化酶或环化酶是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、黄曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、热带金孢子菌、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、租金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、带多金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、澳美镰孢菌(Fusarium austroamericanum)、杆孢状镰孢、谷类镰抱、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳菌(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉、卵孢梭孢壳霉、秘鲁梭孢壳菌(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳菌、毛梭孢壳菌、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉半乳糖氧化酶或环化酶。
在另一个方面，该半乳糖氧化酶是一种镰孢属半乳糖氧化酶，例如SEQ ID NO:2的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种田头菇属(Agrocybe)环化酶，例如SEQ ID NO:9的茶树菇环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种鬼伞属环化酶，例如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的灰盖鬼伞环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种曲霉属环化酶，例如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15的黑曲霉环化酶；或SEQ ID NO:26的碳黑色曲霉环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种孔座壳属环化酶，例如SEQ ID NO:16的点孔座壳环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种毛壳菌属环化酶，例如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、或SEQ ID NO:28的绿毛壳环化酶；或SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24的球毛壳菌环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种腐质霉属环化酶，例如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的特异腐质霉环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种核盘菌属环化酶，例如SEQ ID NO:25的核盘菌环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种轮层菌属环化酶，例如SEQ ID NO:29的小炭球菌(Daldinia caldariorum)环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种毁丝霉属环化酶，例如SEQ ID NO:30的弗格斯毁丝霉(Myceliophthora fergusii)环化酶；或SEQ ID NO:31的黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea)环化酶。
在另一个方面，该环化酶是一种梭孢壳属环化酶，例如SEQ ID NO:32的赫卡尼亚梭孢壳霉(Thielavia hyrcaniae)环化酶。
应当理解的是，对于前述物种，包括完全和不完全状态，及其他分类学等同物，例如无性型，无论已知的它们知道的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
该半乳糖氧化酶和环化酶也可以使用以上提到的探针鉴别并且从其他来源获得，这些来源包括从自然界(例如土壤、堆肥、水、青贮等)分离的微生物或直接地从天然材料(例如土壤、堆肥、水、青贮等)获得的DNA样品。用于从自然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品衍生编码半乳糖氧化酶或环化酶的多核苷酸。一旦已经用如此处所述的一个或多个适合的探针检测到编码半乳糖氧化酶或环化酶的一种多核苷酸，则可以通过利用本领域的普通技术人员已知的多种技术来分离或克隆该序列(参见例如J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
方法
在一个方面是一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触此处所述的一种半乳糖氧化酶和/或一种环化酶，以提供一种氧化的HMF产物。
在一个实施例中是一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触此处所述的一种半乳糖氧化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)。所提供的DFF可以是最终目的产品(例如纯化的DFF)或作为另一种目的产物的原位中间体(例如作为进一步氧化的产物的中间体氧化状态，例如甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或2,5-呋喃二羧酸(FDCA))。在一些实施例中，该反应混合物进一步包括此处所述的一种环化酶，并且DFF被进一步氧化为甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
因此，在一些实施例中是氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触此处所述的一种半乳糖氧化酶以及此处所述的一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。所提供的FFCA和/或FDCA可以是一种或多种最终目的产物(例如纯化的FFCA和/或FDCA)或作为另一种目的产物的原位中间体。
在一个实施例中是一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触此处所述的一种环化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)、5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)、甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。所提供的DFF、HMFCA、FFCA和/或FDCA可以是一种或多种最终目的产物(例如纯化的)或作为另一种目的产物的原位中间体。
在另一个方面是一种氧化2,5-二甲酰基呋喃(DFF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使DFF接触此处所述的一种环化酶，以提供一种氧化的DFF产物。在一个实施例中是一种氧化2,5-二甲酰基呋喃(DFF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使DFF接触此处所述的一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。所提供的FFCA和/或FDCA可以是一种或多种最终目的产物(例如纯化的FFCA和/或FDCA)或作为另一种目的产物的原位中间体。
在另一个方面是一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触此处所述的一种半乳糖氧化酶和/或一种环化酶，以提供一种氧化的HMFCA产物或其盐。
在一个实施例中是一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触此处所述的一种半乳糖氧化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐。所提供的FFCA可以是最终目的产物(例如纯化的FFCA)或作为另一种目的产物的原位中间体。在这些实施例中的一些中，该反应混合物进一步包括此处所述的一种环化酶。在这些实施例中的一些中，该反应混合物进一步包括此处所述的一种环化酶，并且FFCA被进一步氧化为FDCA或其盐。
在另一个实施例中是一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触此处所述的一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。所提供的FFCA和/或FDCA可以是一种或多种最终目的产物(例如纯化的FFCA和/或FDCA)或作为另一种目的产物的原位中间体。
在另一个方面是一种氧化甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使FFCA或其盐接触此处所述的一种环化酶，以提供2,5-呋喃二羧酸(FDCA)或其盐。所提供的FDCA可以是一种或多种最终目的产物(例如纯化的FDCA)或作为另一种目的产物的原位中间体。
该反应混合物可以是用于氧化的任何适合的反应混合物，例如完全水性的反应混合物，或包括一种或多种有机溶剂的一种水性反应混合物(例如可与水溶混以在20℃和1atm的标准条件下形成单相***的有机溶剂；或不可与水溶混的有机溶剂)。适合的有机溶剂(例如醇类、腈类、醚类、以及酮类)可由本领域的普通技术人员确定。
在一个方面，该反应混合物主要是水，例如该水性液体的50v/v％-100v/v％是水，该水性液体的55v/v％-100v/v％是水，该水性液体的60v/v％-100v/v％是水，该水性液体的65v/v％-100v/v％是水，该水性液体的70v/v％-100v/v％是水，该水性液体的75v/v％-100v/v％是水，该水性液体的80v/v％-100v/v％是水，该水性液体的85v/v％-100v/v％是水，该水性液体的90v/v％-100v/v％是水，或该水性液体的95v/v％-100v/v％是水。因此，在一些方面，该反应混合物具有少于50v/v％的其他有机溶剂，例如在0-50v/v％、0-45v/v％、0-40v/v％、0-35v/v％、0-30v/v％、0-25v/v％、0-20v/v％、0-15v/v％、0-10v/v％、或0-5v/v％范围中的有机溶剂。
用于此处所述的氧化方法的适合的条件可以由本领域普通技术人员根据在此的教导确定。在这些方法的一些方面中，该氧化反应的持续时间是少于48小时，例如少于36小时，少于24小时，少于12小时，少于8小时，少于6小时，少于4小时，少于2小时，或少于1小时。该温度典型是约10℃至约90℃之间，例如约20℃至约60℃、约20℃至约50℃、约20℃至约40℃、或约室温，并且在约3.0至约10.0的pH下，例如约3.0至约9.0、约3.0至约7.0、约3.0至约6.0、约3.0至约5.0、约3.5至约4.5、约4.0至约8.0、约4.0至约7.0、约4.0至约6.0、约4.0至约5.0、约5.0至约8.0、约5.0至约7.0、或约5.0至约6.0、约6.0至约8.0、约6.0至约7.5、或约6.0至约7.0、或约6.5至约7.5、或约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.5。适合的缓冲剂是本领域中已知的，例如碳酸盐、1,4-哌嗪二乙磺酸(pIPES)、4-吗啉丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-I哌嗪乙磺酸(HEPES)、三乙醇胺、TRIS、磷酸盐等等。在本发明的背景下，该反应混合物的pH和温度是指该氧化工艺中的任何时间，例如t0。
使用半乳糖氧化酶的这些方法可以产生副产物，例如过氧化氢。可以消除或减少该过氧化氢副产物，例如通过使用一种过氧化氢酶和过氧化物酶以将该过氧化氢转化为水和氧，从而将该酶的不希望的氧化最小化并且允许增加产量。示例性的过氧化氢酶包括特米诺克斯(Terminox)、超级特米诺克斯(Terminox Ultra)、至尊特米诺克斯(Terminox Supreme)、以及凯特酶(Catazyme)(诺维信A/S)。
在此处所述的这些氧化方法中使用的任何所需的氧可提供为来自用于原位生产氧的大气或氧前体的氧。在许多工业应用中，来自大气的氧通常将以充足量存在。如果需要更多的O2，可添加补充的氧，例如作为加压大气或作为纯的加压O2。如前所述的过氧化氢酶可被用于从不希望的过氧化氢的降解来产生氧。
该环化酶所需的过氧化氢可被提供为过氧化氢的一种水性溶液或用于原位生产过氧化氢的一种过氧化氢前体。任何在溶解时释放环化酶可用的一种过氧化物的固体实体都可充当过氧化氢的一个来源。在水或一种合适的基于水的介质中溶解时产生过氧化氢的化合物包括但不限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯、过氧化脲、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。
过氧化氢的另一个来源是一种过氧化氢生成酶***，例如一种氧化酶(例如此处所述的一种半乳糖氧化酶)与用于该氧化酶的一种底物一起。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US 6,248,575)和一种适合的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见例如WO 95/29996)和葡萄糖、乳酸盐氧化酶和乳酸盐、半乳糖氧化酶(参见例如WO 00/50606)和半乳糖、以及醛糖氧化酶(参见例如WO99/31990)和一种适合的醛糖。
通过研究EC 1.1.3._、EC 1.2.3._、EC 1.4.3._、以及EC 1.5.3._或类似类别(在国际生物化学协会下)，本领域的普通技术人员容易识别氧化酶和底物的这类组合的其他实例。
可适用于环化酶的替代氧化剂可以是氧与一种适合的氢供体像抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、二羟延胡索酸或半胱氨酸的组合。这类氧氢供体***的实例由帕斯塔(Pasta)等人，生物技术与生物工程(Biotechnology&Bioengineering)，(1999)第62卷，第4期，第489-493页说明。
过氧化氢或一种过氧化氢源可以在本发明的方法开始时或进行中添加，例如为一次或多次分开添加过氧化氢，或连续地作为补料分批添加。过氧化氢的典型的量对应于从0.001mM到25mM的水平，优选地从0.005mM到5mM的水平，并且具体地从0.01到1mM或0.02到2mM过氧化氢的水平。还可以按对应于以下各项的一个量使用过氧化氢：从0.1mM到25mM的水平，优选地到从0.5mM到15mM的水平，更优选地到从1mM到10mM的水平，以及最优选地到从2mM到8mM过氧化氢的水平。
该反应混合物还可包含一种或多种补充的盐，例如一种无机盐，以改善产物产量和/或回收。示例性的盐包括但不限于金属卤化物、金属硫酸盐、金属硫化物、金属磷酸盐、金属硝酸盐、金属乙酸盐、金属亚硫酸盐和金属碳酸盐，例如氯化钠(NaCl)、亚硫酸钠(Na2SO3)、氯化镁(MgCl2)、氯化理(LiCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、氯化铯(CsCl)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸钾(K2SO4)、溴化锂(LiBr)、溴化钠(NaBr)、溴化钾(KBr)、硝酸锂(LiNO3)、硝酸钠(NaNO3)、硝酸钾(KNO3)以及碘化钾(KI)。
在一些方面，该反应混合物包括铜，例如硫酸铜。在这些方面的一些中，在该反应混合物中的铜在少于或等于5mM，例如少于或等于2.5mM、少于或等于1mM、少于或等于0.5mM、少于或等于0.1mM、少于或等于0.05mM、少于或等于0.01mM、少于或等于0.005mM、少于或等于0.0015mM、或少于或等于0.0005mM的浓度。
用于氧化的半乳糖氧化酶的浓度可以是任何适合的浓度，例如0.005mg/ml至50mg/ml、例如0.01mg/ml至25mg/ml、0.05mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.005mg/ml至1mg/ml、0.01mg/ml至0.5mg/ml、或0.01mg/ml至0.05mg/ml。
用于氧化的环化酶的浓度可以是任何适合的浓度，例如0.005mg/ml至50mg/ml，例如0.01mg/ml至25mg/ml、0.05mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至10mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、0.005mg/ml至1mg/ml、0.01mg/ml至0.5mg/ml、或0.01mg/ml至0.05mg/ml。
在此处所述的使用半乳糖氧化酶氧化HMF的这些方法的一些方面中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为DFF。
在此处所述的使用半乳糖氧化酶和环化酶氧化HMF的这些方法的一些方面中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在这些方面的一些中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA或其盐。在这些方面的一些中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FDCA或其盐。
在此处所述的使用半乳糖氧化酶和/或环化酶氧化HMFCA或其盐的这些方法的一些方面中，该HMFCA或其盐的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在这些方面的一些中，该HMFCA或其盐的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA或其盐。在这些方面的一些中，该HMFCA或其盐的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FDCA或其盐。
在此处所述的使用环化酶氧化HMF的这些方法的一些方面中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在这些方面的一些中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA或其盐。在这些方面的一些中，该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FDCA或其盐。
在此处所述的使用环化酶氧化DFF的这些方法的一些方面中，该DFF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA、FDCA、其盐、或前述各项的一种混合物。在这些方面的一些中，该DFF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FFCA或其盐。在这些方面的一些中，该DFF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FDCA或其盐。
在此处所述的使用环化酶氧化FFCA或其盐的这些方法的一些方面中，该FFCA或其盐的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或基本上全部被氧化为FDCA、其盐。
此处所述的这些方法的起始材料和/或产物可以处于一种非盐形式，或一种盐，例如通过将补充的盐添加到如前所述的反应混合物中。一种化合物的碱官能团的盐可以通过本领域的普通技术人员已知的方法通过将该化合物用一种酸进行处理来制备。一种化合物的酸官能团的盐可以通过本领域的普通技术人员已知的方法通过将该化合物用一种碱进行处理来制备。酸化合物的无机盐的实例包括但不限于碱金属和碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、铋盐、以及钙盐；铵盐；以及铝盐。酸化合物的有机盐的实例包括但不限于普鲁卡因、二苄胺、N-乙基哌啶、N,N'-二苄基乙二胺、三甲胺、以及三乙胺盐。碱化合物的无机盐的实例包括但不限于盐酸以及氢溴酸盐。碱化合物的有机盐的实例包括但不限于酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、以及琥珀酸盐。
可以使用本领域已知的任何程序从该反应混合物可任选地回收并纯化此处所述的这些方法中任一项的氧化产物，这些程序包括但不限于色谱法(例如，尺寸排阻色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法)、电泳程序、溶解度差异、萃取(例如，液液萃取)、渗透蒸发、萃取过滤、膜过滤、膜分离、反渗透、超滤、或结晶化。
在这些方法的一些方面中，在可任选地纯化之前和/或之后的此处所述的这些方法中任一项的氧化产物是基本上纯的。关于此处所述的这些方法，“基本上纯的”意指包含不多于15％杂质的参比产物的一种制剂(例如HMF、FFCA、或FDCA)，其中杂质意指除了参比产物盐和非盐形式以外的化合物。在一种变体中，提供了一种基本上纯的DFF制剂，其中该制剂包含至多25％杂质、或至多20％杂质、或至多10％杂质、或至多5％杂质、或至多3％杂质、或至多1％杂质、或至多0.5％杂质。
可以使用本领域已知的方法进行用来针对在此描述的氧化产物的产生的测试的适合的测定。例如，可以通过方法(例如薄层色谱法(TLC)、HPLC(高效液相色谱法)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)、NMR(核磁共振))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对该氧化产物(以及其他有机化合物)进行分析。
通过说明提供了以下实例，并且并不旨在使限制本发明。
实例
用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
培养基
DAP4C-1培养基是由0.5g酵母萃取物、10g麦芽糖、20g右旋糖、11g硫酸镁七水合物、1g磷酸氢二钾、2g一水合柠檬酸、5.2g磷酸钾三元一水化物、1ml Dowfax 63N10(消泡剂)、2.5g碳酸钙组成，补充以1ml KU6金属溶液以及去离子水至1000ml。
KU6金属溶液由6.8g ZnCl2、2.5g CuSO4.5H2O(一水合柠檬酸)、0.13g NiCl2、13.9g FeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、3g C6H8O7.H2O、以及补足至1000ml的去离子水组成。
PDA板由39g马铃薯右旋糖琼脂和补足至1000ml的去离子水组成。
LB板是由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂及补足至1000ml的去离子水组成。
LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物及10g的氯化钠，以及补足至1000ml的去离子水组成。
COVE-蔗糖-T板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1000ml的去离子水组成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、以及TritonX-100(50μl/500ml)。
COVE-N-琼脂管是由218g山梨糖醇、10g右旋糖、2.02g KNO3、25g琼脂、50ml Cove盐溶液以及补足至1000ml的去离子水组成。
COVE盐溶液由26g的MgSO4·7H2O、26g的KCl、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1000ml的去离子水组成。
COVE痕量金属溶液由0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及补足至1000ml的去离子水组成。
实例1：半乳糖氧化酶和环化酶的制备
澳美镰孢菌(树枝状轮枝孢霉、禾谷镰孢)半乳糖氧化酶
非重组体(树枝状轮枝孢霉)：产生自天然来源树枝状轮枝孢霉的半乳糖氧化酶购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。树枝状轮枝孢霉被重新归类为禾谷镰孢，并且然后被认为是禾谷镰孢复合体的谱系1，或澳美镰孢菌(参见科代罗(Cordeiro)等人，基础微生物学杂志(J Basic Microbiol)2010,50,527-537)。
重组体(米曲霉)：在米曲霉宿主中表达的重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶是通过如前所述将SEQ ID NO:1的编码序列(编码SEQID NO:2的半乳糖氧化酶)克隆并转化到米曲霉中来制备(徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(Appl Biochem Biotechnol)2000,88,23-32)。
重组体(镶片镰孢菌)：在镶片镰孢菌宿主中表达的重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶是通过如前所述将SEQ ID NO:1的编码序列(编码SEQ ID NO:2的半乳糖氧化酶)克隆并转化到镶片镰孢菌中来制备(徐(Xu)，F.等人，应用生物化学与生物技术(Appl BiochemBiotechnol)2000,88,23-32)。
澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体“MutA”
该澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体“MutA”与野生型酶的区别在于具有Q326E、Y3289、以及R330K处的取代的三个位置；并且据报道具有改变的底物特异性，对葡萄糖具有相对高的活性(里浦(Lippow)等人，化学生物学(Chem Biol)2010,17,1306-1315)。为了获得该变体以测试和表征，购买对该变体进行编码的合成基因，亚克隆到曲霉属表达载体中，并转化到米曲霉属表达菌株中。
该野生型酶的基因序列是从公共序列记录EMBL：M86819中获得，修整至包括该编码和科扎克(Kozak)序列，并且关于取代的位置的密码子被修饰为编码这些取代的残基。在5’和3’末端处添加HindIII和XhoI限制性位点以促进亚克隆，并且从(生命科技(LifeTechnologies)公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)订购和购买所得的编辑过的DNA序列(其包括SEQ ID NO:5的编码序列，该编码序列编码SEQ ID NO:6的MutA变体)。
利用该基因和载体中的HindIII和XhoI位点将对该MutA变体进行编码的合成基因亚克隆到曲霉属表达载体pMStr57(WO 2004/032648)中，生成MutA表达构建体(指定为pMStr287)。载体pMStr57包含用于在大肠杆菌中选择和繁殖、以及在曲霉属中选择和表达的序列。在曲霉属中的选择通过构巢曲霉的amdS基因促进，该amdS基因允许使用乙酰胺作为唯一氮源。在曲霉属中的表达通过来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导，该启动子与来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5’前导序列和来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶编码基因的终止子融合。将米曲霉菌株MT3568(JaL355(WO 02/40694)的amdS(乙酰胺酶)破坏的衍生物，其中pyrG营养缺陷体是通过用该pyrG基因破坏该米曲霉amdS基因修复的)用构建体pMStr287使用标准技术(例如，如在WO 2004/032648中所述的)进行转化。
为了鉴别产生该半乳糖氧化酶变体MutA的转化体，将这些转化体和MT3568在具有1ml孔容量的96孔深孔微量滴定板中于750μl的三种不同的培养基，YP+2％葡萄糖(WO 05/066338)、FG4P(WO94/26925)、以及DAP4C-1中进行培养。将这些培养物在30℃不经振动地孵化。在4天的生长之后取出样品并用SDS-PAGE分解以监测重组体蛋白产生。如通过比较在SDS-PAGE中分解的重组蛋白带的强度所判断的，从针对该半乳糖氧化酶变体的相对较高的表达所测试的那些中选择一种单一的转化体。通过在含有0.01％X-100的选择性培养基上稀释划线分生孢子来将所得的转化体分离两次以限制菌落大小。
澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体“MutB”
该澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体“MutB”包含MutA的三种取代Q326E、Y3289、以及R330K，以及在由里浦等人(同上)鉴别的位置处的一个另外的取代，Q406T，如底物特异性中涉及的。为了获得该变体酶以测试和表征，购买对该变体进行编码的合成基因，亚克隆到曲霉属表达载体中，并转化到米曲霉属表达菌株中。
将该MutB肽序列用一种优先地利用密码子的方法逆向翻译，这些密码子常用于米曲霉中，并且用设计以鉴别和去除会阻碍克隆或表达的序列特点的算法分析所得的DNA序列。从这一工艺选择一种单一的基因序列，并且通过直接添加一种促进翻译的科扎克序列至起始密码子5’上，并且在5’和3’末端添加BamHI和XhoI位点，以促进亚克隆，从而完成该基因序列盒(file)。从(生命科技(LifeTechnologies)公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)订购和购买所得的DNA序列(其包括SEQ ID NO:7的编码序列，该编码序列编码SEQ ID NO:8的MutA变体)。
利用该基因和载体中的BamHI和XhoI位点将对该MutB变体进行编码的合成基因亚克隆到曲霉属表达载体pMStr57(WO 2004/032648)中，生成MutB表达构建体(指定为pMStr288)。在曲霉属中的选择通过构巢曲霉的amdS基因促进，该amdS基因允许使用乙酰胺作为唯一氮源。在曲霉属中的表达通过来自黑曲霉的修饰的中性淀粉酶II(NA2)启动子介导，该启动子与来自构巢曲霉的丙糖磷酸异构酶(tpi)编码基因的5’前导序列和来自黑曲霉的淀粉葡糖苷酶编码基因的终止子融合。用pMStr288使用标准技术(例如如在WO 2004/032648中所述的)转化该米曲霉菌株MT3568(同上)。
为了鉴别产生该半乳糖氧化酶变体MutB的转化体，将这些转化体和MT3568在具有1ml孔容量的96孔深孔微量滴定板中于750μl的三种不同的培养基，YP+2％葡萄糖(WO 05/066338)、FG4P(WO94/26925)、以及DAP4C-1中进行培养。将这些培养物在30℃不经振动地孵化。在4天的生长之后取出样品并用SDS-PAGE分解以监测重组体蛋白产生。如通过比较在SDS-PAGE中分解的重组蛋白带的强度所判断的，从针对该半乳糖氧化酶变体的相对较高的表达所测试的那些中选择一种单一的转化体。通过在含有0.01％X-100的选择性培养基上稀释划线分生孢子来将该转化体分离两次以限制菌落大小。
长柄镰孢(Fusarium longipes)半乳糖氧化酶
长柄镰孢菌株IMI179815被用作包含SEQ ID NO:3的编码序列的半乳糖氧化酶基因的来源，其编码SEQ ID NO:4的全长长柄镰孢半乳糖氧化酶。米曲霉MT3568(同上)被用于编码该长柄镰孢半乳糖氧化酶的基因的异源表达。
克隆：下示的克隆引物组(SEQ ID NO:33和34)被设计以PCR-扩增SEQ ID NO:3的长柄镰孢半乳糖氧化酶编码序列。根据如在该InFusion HD EcoDry克隆试剂盒(科隆达实验室有限公司(ClontechLaboratories,Inc.)，山景城，加利福尼亚州，美国)中所述的方案，将针对InFusion克隆的5’标签添加到克隆引物中，以适应该表达载体pDAu109中的克隆(WO 2005/042735)。
引物1：
5’-ACACA ACTGG GGATC CACCA TGAAA CAGCT CTTGACACTT GCTCT TTGCT TCAG-3’(SEQ ID NO:33)
引物2：
5’-AGATC TCGAG AAGCT TATCG AGTAA CGCGA AGAGTCGTTG CTACA CT-3’(SEQ ID NO:34)
将该长柄镰孢半乳糖氧化酶基因编码序列通过PCR使用如上所述的正向和反向克隆引物用长柄镰孢菌株IMI179815基因组DNA进行扩增，该基因组DNA是先前使用一种土壤用FastDNA Spin试剂盒(MP生物医疗，梭伦(Solon)，OH,USA)从生长于PDA板上的菌丝体制备的。该PCR是由1μl的基因组DNA，2.5μl的引物1(10μM)，2.5μl的引物2(10μM)，10μl的5X HF缓冲液(费泽姆公司(FinnzymesOy)，埃斯波(Espoo)，芬兰(Finland))，1.6μl的50mM MgCl2，2μl的10mM dNTP，0.5μl的DNA聚合酶(费泽姆公司，埃斯波，芬兰)以及补足至50μl的PCR-级水组成的。该扩增反应是使用热循环仪(M.J.研究有限公司，南旧金山，加利福尼亚州，美国)进行的，该热循环仪程序设定为在98℃下持续2分钟，接着19个退火(touchdown)循环各自在98℃下持续15秒、70℃(-1℃/循环)下持续30秒、及72℃下持续2分钟30秒；以及25个循环各自在98℃下持续15秒、60℃下持续30秒及72℃下持续2分钟30秒；并且最终在72℃下延伸5分钟。
在1.0％琼脂糖凝胶电泳上使用TAE缓冲液来分离反应产物，其中将约2.0kb PCR带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE医疗公司(GE Healthcare)，希勒勒丹麦(Denmark))进行纯化。将对应于长柄镰孢半乳糖氧化酶基因编码序列的DNA克隆到表达载体pDAu109(WO2005/042735)中，用Bam HI和Hind III，使用IN-FUSIONTM脱水(Dry-Down)PCR克隆试剂盒(科隆达实验室有限公司，山景城，加利福尼亚州，美国)根据生产商说明线性化。
将2.5μl体积的稀释的连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)。在包含100μg氨比西林/ml的LB琼脂板中选择三个菌落并在3ml的补充有100μg的氨比西林/ml的LB培养基中培养过夜。将质粒DNA使用凯杰公司(Qiagen)旋转迷你制备型(Spin Miniprep)试剂盒(凯杰公司(QIAGEN GmbH)，希尔登，德国)根据生产商说明进行纯化。在异源表达之前通过桑格测序(Sanger sequencing)来验证长柄镰孢基因编码序列。将指定为IF395#2(包含SEQ ID NO:3的基因编码序列)的质粒针对如下所述的原生质体转化和异源表达进行选择。
转化：米曲霉MT3568的原生质体是根据WO 95/002043制备的。将一百μl的原生质体与2.5-15μg的曲霉属表达载体IF395#2(同上)和250μl的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2、以及10mM Tris-HCl pH 7.5混合并轻轻混合。将该混合物在37℃下孵化30分钟并且将这些原生质体涂布到COVE板上用于选择。在37℃下孵化4-7天之后，将八个转化体的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的DAP-4C-1培养基(如下所述补充有乳酸和磷酸氢二铵)中。在30℃培养4天之后，将培养肉汤通过SDS-PAGE使用4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)进行分析，以鉴别从长柄镰孢产生最大量的重组半乳糖氧化酶的这些转化体。
将最好的转化体的孢子涂布于包含0.01％X-100的COVE-蔗糖-T板上，以分离单个菌落。在COVE-蔗糖-T板上总共重复两次涂布，并且然后将单个菌落涂布于COVE-N-琼脂管上，直至孢子形成。
发酵：将补充有5ml的20％乳酸、3.5ml的50％磷酸氢二铵、1ml硝酸铜(II)(150mM)和来自上文的最好的米曲霉转化体的孢子的150ml的DAP4C-1培养液在30℃的温度下在100rpm搅动下在4天过程中培养于摇瓶中。通过使用0.2μm过滤装置过滤收获培养肉汤。
茶树菇环化酶
非重组体(茶树菇；AaP)：对应于SEQ ID NO:9的成熟多肽序列的环化酶产生自天然来源茶树菇并如前所述的进行分离(乌尔里克(Ullrich)等人，应用与环境微生物学(Appl Env Microbiol)2004,70,4575-4581)。
重组体(米曲霉；rAaP)：通过如在WO 2008/119780中所述的通过在米曲霉宿主中表达来制备对应于SEQ ID NO:9的成熟多肽序列的重组产生的茶树菇环化酶。
绿毛壳(Per21)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:28的成熟多肽序列的重组产生的绿毛壳环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
特异腐质霉(Per27)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:19的成熟多肽序列的重组产生的特异腐质霉环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
小炭球菌(Per106)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:29的成熟多肽序列的重组产生的小炭球菌环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
弗格斯毁丝霉(Per113)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:30的成熟多肽序列的重组产生的弗格斯毁丝霉环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
黄褐毁丝霉(Per114)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:31的成熟多肽序列的重组产生的黄褐毁丝霉环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
赫卡尼亚梭孢壳霉(Per117)环化酶
如本领域中已知的制备对应于SEQ ID NO:32的成熟多肽序列的重组产生的赫卡尼亚梭孢壳霉环化酶(例如参见WO 2013/021061，将其内容通过引用而特此结合)。
实例2：筛选用于HMF氧化的氧化酶
在35℃于打开的玻璃管中在4mL水性溶液中进行一个小时的氧化，该水性溶液包括1mM HMF和50mM磷酸盐缓冲剂(pH 7.5)中的指定量的氧化酶。在恒温器热块中用磁铁搅拌该反应混合物，并且在整个反应过程中将氧气鼓泡通过该反应混合物。将样品通过加热到75℃持续5分钟灭活并在分析之前进行离心(13,000x g，5min)。
将样品在GC/MS***上进行分析，该***由配备有5975C质量检测器和7693自动进样器的7890A GC***(安捷伦公司(Agilent)，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)组成。将样品注射到来自安捷伦J&W(圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)的DB-200柱(30m，250μm，0.25μm)上的脉冲型无分流模式中并用1.2mL/min氦使用以下温度程序进行洗脱：100℃(持续1min)，100℃-180℃以40℃/min，180℃-220℃以20℃/min，180℃-280℃以40℃/min，280℃(持续1min)。以SIM模式(监测离子95，97，124以及126m/z)操作该质量检测器。通过外部校准使用真正的标准量化HMF和DFF并计算为DFF的摩尔分数(XDFF＝[DFF]/([DFF]+[HMF])以解释由溶剂蒸发引起的任何变化。结果示于表1中。
表1.
在所提供的条件下，重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶(SEQ IDNO:2的成熟多肽)以及重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体(SEQ ID NO:4的成熟多肽)各自能够显著地将HMF氧化为DFF(分别为29％和93％)。有趣地，这种半乳糖氧化酶(条目4)的非重组体型式不能在背景水平之上显著氧化HMF。
实例3：树枝状轮枝孢霉半乳糖氧化酶对HMF氧化的活性
为了进一步探测由树枝状轮枝孢霉天然表达的半乳糖氧化酶的HMF氧化的缺乏，使用脱盐酶和补充有铜的酶进行附加反应。
将来自西格玛公司的树枝状轮枝孢霉半乳糖氧化酶溶解于10mM磷酸盐缓冲液(pH 6)中。将所溶解的酶的一部分在PD-10脱盐柱(GE医疗生物科学公司，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)进行脱盐，并且另外的样品补充有化学计算量的硫酸铜(II)。然后如在实例1中所述进行氧化，在30min和1小时进行取样。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC***(安捷伦公司，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)上进行分析并且在60℃在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加利福尼亚州，美国)的协同融合-RP(Synergi Fusion-RP)柱(4μm，250x 2mm)的上进行分离。将分析物用包含2％v/v乙腈的水性75mM磷酸的等度洗脱液进行洗脱。在210nm通过外部校准使用真正的标准量化HMF和DFF并计算为DFF的摩尔分数(XDFF＝[DFF]/([DFF]+[HMF])以解释由溶剂蒸发引起的任何变化。结果示于表2中。
表2.
在所提供的条件下，尽管在该反应混合物中酶脱盐和补充铜，由树枝状轮枝孢霉产生的非重组体半乳糖氧化酶不能在背景水平之上显著氧化HMF。
实例4：筛选用于HMF氧化的半乳糖氧化酶
对来自托姆青霉、产黄青霉、以及长柄镰孢的、重组产生的半乳糖氧化酶发酵物的上清液针对HMF底物的氧化活性进行测试。
使用1mM HMF在50mM磷酸盐pH 6.5缓冲液中的4mL水性溶液，在35℃在打开的玻璃管中进行1小时氧化。以50μL/样品给予该半乳糖氧化酶发酵的上清液。在恒温器热块中用磁铁搅拌该反应混合物，并且在整个反应过程中将氧气鼓泡通过该反应混合物。将样品通过加热到75℃持续5分钟灭活并在分析之前进行离心(13,000x g，5min)。来自托姆青霉和产黄青霉的半乳糖氧化酶与对照相比都未显示对HMF的活性，而长柄镰孢半乳糖氧化酶显示约1.1％摩尔分数的DFF。
实例5：重组体澳美镰孢菌半乳糖氧化酶在不同的pH对HMF氧化的活性
如在实例2中所述的进行氧化，在指定的pH值下使用于50mM磷酸盐缓冲液中的0.005mg ep/mL的、SEQ ID NO:8的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体(mutB)。通过HPLC进行样品分析，如实例3中所述的。结果示于表3中。
表3.
pH X DFF
5.5 10％
6.0 49％
6.5 90％
7.0 63％
7.5 17％
8.0 5％
在所提供的条件下，该重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体在约6.5的pH下显示最高的HMF氧化。
实例6：铜和过氧化氢酶对于半乳糖氧化酶对HMF氧化的活性的影响
如在实例2中所述的进行氧化，将硫酸铜和/或特米诺克斯 200L过氧化氢酶(在样品中稀释10,000倍)添加至如在表4中所指示的反应混合物中。指示为“N.D.”的结果是未确定的。
表4.
实例7：在不同的pH下通过环化酶进行DFF氧化
在指定的pH下用在50mM磷酸盐缓冲液中的1mM H2O2进行1mM DFF的氧化，使用0.01mg ep/mL的以下环化酶中的一种：非重组体茶树菇(AaP)、由米曲霉(rAaP)或特异腐质霉(Per27)重组产生的茶树菇。在室温下进行反应持续5分钟，并且然后通过在75℃加热5分钟灭活样品。如实例3中所述的，通过HPLC进行样品分析。在表5中结果显示为FFCA的摩尔分数(XFFCA＝[FFCA]/([DFF]+[FFCA])。
表5.
pH AaP rAaP Per27
5.5 26％ 11％ 3％
6.0 27％ 16％ 4％
6.5 35％ 19％ 4％
7.0 33％ 22％ 5％
7.5 25％ 16％ 4％
8.0 14％ 9％ 4％
实例8：使用半乳糖氧化酶和环化酶的组合进行HMF氧化
在35℃于打开的玻璃管中在终体积4mL的水性溶液中进行125分钟的氧化，该水性溶液包括1mM HMF和在50mM磷酸盐pH 6.5缓冲液中的0.005mg/mL的SEQ ID NO:8的重组产生的澳美镰孢菌半乳糖氧化酶变体(mutB)。来自茶树菇的环化酶(AaP)被添加为使用0.04mg ep/mL的单一的初始剂量，或为使用初始0.04mg ep/mL的多剂量，并且在25和60分钟(仅对条目4和6)之后添加另外的0.02mg ep/mL剂量或在60分钟(仅对条目8和10)之后添加另外的0.04mgep/mL剂量。在恒温器热块中用磁铁搅拌该反应混合物，并且在整个反应过程中将氧气鼓泡通过该反应混合物。在5分钟之后，使用注射泵(模型220-CE，世界精密仪器公司(World precision instruments)，阿斯顿(Aston)，斯蒂夫尼奇(Stevenage)，英国)给予水性过氧化氢(20或40mM)，直至已达到总共1、1.5、2或4mM过氧化氢。将样品通过加热到75℃持续5分钟灭活并离心(13,000x g，5min)，并且使用针对HMF、DFF、FFCA、以及FDCA的外部校准如在3中所述通过HPLC分析进行量化。在表6中结果显示为所指示的产物中每个的摩尔分数。
表6.
条目 AaP H2O2 X HMF X DFF X FFCA X FDCA
1 无 无 17％ 83％ 0％ 0％
2 单剂量 无 0％ 44％ 55％ 1％
3 单剂量 1mM 0％ 0％ 85％ 15％
4 多剂量 1mM 0％ 0％ 67％ 33％
5 单剂量 1.5mM 0％ 0％ 79％ 21％
6 多剂量 1.5mM 0％ 0％ 58％ 42％
7 单剂量 2mM 0％ 1％ 76％ 23％
8 多剂量 2mM 0％ 0％ 55％ 45％
9 单剂量 4mM 0％ 1％ 78％ 21％
10 多剂量 4mM 0％ 0％ 54％ 46％
实例9：通过环化酶进行HMF氧化
在pH 6.5下用在10mM磷酸盐缓冲液中的2mM H2O2进行1mMHMF的氧化，使用0.02mg ep/mL的以下环化酶中的一种：由米曲霉(rAaP)、绿毛壳(Per21)、特异腐质霉(Per27)、小炭球菌(Per106)、弗格斯毁丝霉(Per113)、黄褐毁丝霉(Per114)或赫卡尼亚梭孢壳霉(Per117)重组产生的茶树菇。
在室温下进行反应持续120分钟并且然后添加过氧化氢酶(超级特米诺克斯50L，诺维信，巴格斯瓦德，丹麦)，以分解残余的H2O2。将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC***(安捷伦公司，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)上进行分析并且在60℃在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加利福尼亚州，美国)的协同融合-RP(Synergi Fusion-RP)柱(4μm，250x 2mm)的上进行分离。将分析物用包含2％v/v乙腈的水性10mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)的等度洗脱液进行洗脱。在以下波长处通过外部校准使用真正的标准量化分析物：HMF(280nm)、DFF(280nm)、HMFCA(260nm)、FFCA(280nm)以及FDCA(260nm)。在表7中结果显示为所指示的产物中每个的摩尔分数。
表7.
实例10：通过环化酶进行DFF氧化
在pH 6.5下用在10mM磷酸盐缓冲液中的2mM H2O2进行1mMDFF的氧化，使用0.02mg ep/mL的以下环化酶中的一种：由米曲霉(rAaP)、特异腐质霉(Per27)、小炭球菌(Per106)、弗格斯毁丝霉(Per113)、黄褐毁丝霉(Per114)或赫卡尼亚梭孢壳霉(Per117)重组产生的茶树菇。在室温下进行反应持续120分钟并且然后添加过氧化氢酶(超级特米诺克斯50L，诺维信，巴格斯瓦德，丹麦)，以分解残余的H2O2。将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC***(安捷伦公司，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)上进行分析并且在60℃在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加利福尼亚州，美国)的协同融合-RP(Synergi Fusion-RP)柱(4μm，250x 2mm)的上进行分离。将分析物用包含2％v/v乙腈的水性10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)的等度洗脱液进行洗脱。在指定的波长处通过外部校准使用真正的标准量化以下的分析物：HMF(280nm)、DFF(280nm)、HMFCA(260nm)、FFCA(280nm)以及FDCA(260nm)。在表8中结果显示为所指示的产物中每个的摩尔分数。
表8.
实例11：另外筛选用于HMF氧化的氧化酶
如在实例2中所述进行氧化(除了使用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)之外)。将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC***(安捷伦公司，圣克拉拉市，加利福尼亚州，美国)上进行分析并且在70℃在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加利福尼亚州，美国)的Rezex ROA-有机酸H+(8μm，300x 7.8mm)柱上进行分离。将分析物用水性0.005N硫酸的等度洗脱液进行洗脱。在280nm通过外部校准使用真正的标准量化HMF和DFF并计算为DFF的摩尔分数(XDFF＝[DFF]/([DFF]+[HMF])以解释由溶剂蒸发引起的任何变化。结果示于表10中。
表10
虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细描述了上文，本领域的普通技术人员将清楚的是，可以实施任何等效方面或修饰。因此，该说明和实例不应当解释为限制本发明的范围。
可通过以下编号的段落进一步描述本发明：
[1]一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种半乳糖氧化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)。
[2]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶：(a)与SEQ IDNO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)；(b)是由在至少低、中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交的一个编码序列编码；或(c)是由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)的一个编码序列编码。
[3]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[4]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列或由其组成。
[5]如段落[1]-[4]中任一项所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:2的氨基酸1至639。
[6]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由在至少低、中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交的一个编码序列编码。
[7]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)的一个编码序列编码。
[8]如段落[1]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由包括SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或由其组成的一个编码序列编码。
[9]如段落[1]-[8]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
[10]如段落[1]-[8]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处包括取代。
[11]如段落[10]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处的取代是用Glu进行的。
[12]如段落[10]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处的取代是Q326E。
[13]如段落[1]-[12]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处包括取代。
[14]如段落[13]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处的取代是用Arg或Lys进行的。
[15]如段落[13]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处的取代是Y329R/K。
[16]如段落[1]-[15]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处包括取代。
[17]如段落[16]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处的取代是用Lys进行的。
[18]如段落[16]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处的取代是R330K。
[19]如段落[1]-[18]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处包括取代。
[20]如段落[19]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处的取代是用Thr、Arg、或Lys进行的。
[21]如段落[19]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处的取代是Q406T/R/K。
[22]如段落[1]-[21]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、或406的任两个位置处包括取代。
[23]如段落[1]-[21]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、或406的任三个位置处包括取代。
[24]如段落[1]-[21]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、以及330的每个位置处包括取代。
[25]如段落[1]-[21]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的每个位置处包括取代。
[26]如段落[9]-[25]中任一项所述的方法，其中该变体半乳糖氧化酶相对于该亲本半乳糖氧化酶具有改进的催化效率或催化速率。
[27]如段落[9]-[26]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:6的成熟多肽序列或由其组成。
[28]如段落[27]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:6的氨基酸1至639。
[29]如段落[9]-[26]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:8的成熟多肽序列或由其组成。
[30]如段落[29]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:8的氨基酸1至639。
[31]如段落[1]-[30]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从一种异源多核苷酸表达的。
[32]如段落[1]-[31]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从除澳美镰孢菌(Fusarium austroamericanum)之外的宿主表达的。
[33]如段落[32]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从米曲霉宿主表达的。
[34]如段落[32]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从镶片镰孢菌宿主表达的。
[35]如段落[1]-[34]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶不包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列。
[36]如段落[1]-[35]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种过氧化氢酶。
[37]如段落[1]-[36]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括铜。
[38]如段落[1]-[36]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括硫酸铜。
[39]如段落[37]或[38]所述的方法，其中该铜处于少于或等于1mM，例如少于或等于0.5mM，或少于或等于0.0015mM的浓度。
[40]如段落[1]-[39]中任一项所述的方法，其中该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％被转化为DFF。
[41]如段落[1]-[40]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种环化酶，并且DFF被进一步氧化为甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[42]如段落[41]所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[43]如段落[42]所述的方法，其中该成熟多肽序列包括基序：E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R(SEQ ID NO:27)。
[44]如段落[42]或[43]所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[45]如段落[44]所述的方法，其中该环化酶包括SEQ ID NO:9的成熟多肽序列或由其组成。
[46]如段落[45]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:9的氨基酸1至328。
[47]如段落[41]-[44]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
[48]如段落[41]-[44]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处包括取代。
[49]如段落[48]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[50]如段落[48]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是M76L。
[51]如段落[41]-[44]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处包括取代。
[52]如段落[51]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[53]如段落[51]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是M134L或M127L。
[54]如段落[41]-[44]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处包括取代。
[55]如段落[54]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是用Phe进行的。
[56]如段落[54]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是Y201F或Y194F。
[57]如段落[47]-[56]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的任两个位置处包括取代。
[58]如段落[47]-[56]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的每个位置处包括取代。
[59]如段落[41]-[58]中任一项所述的方法，其中该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％被转化为甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[60]如段落[41]-[59]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括补充的H2O2。
[61]一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种半乳糖氧化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐。
[62]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶：(a)与SEQ IDNO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)；(b)是由在至少低、中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交的一个编码序列编码；或(c)是由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)的一个编码序列编码。
[63]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[64]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶包括SEQ IDNO:2的成熟多肽编码序列或由其组成。
[65]如段落[61]-[64]中任一项所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:2的氨基酸1至639。
[66]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由在至少低、中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的全长互补链杂交的一个编码序列编码。
[67]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)的一个编码序列编码。
[68]如段落[61]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是由包括SEQID NO:1的成熟多肽编码序列或由其组成的一个编码序列编码。
[69]如段落[61]-[67]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
[70]如段落[61]-[67]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处包括取代。
[71]如段落[70]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处的取代是用Glu进行的。
[72]如段落[70]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置326的一个位置处的取代是Q326E。
[73]如段落[61]-[72]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处包括取代。
[74]如段落[73]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处的取代是用Arg或Lys进行的。
[75]如段落[73]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置329的一个位置处的取代是Y329R/K。
[76]如段落[61]-[75]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处包括取代。
[77]如段落[76]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处的取代是用Lys进行的。
[78]如段落[76]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置330的一个位置处的取代是R330K。
[79]如段落[61]-[78]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处包括取代。
[80]如段落[79]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处的取代是用Thr、Arg、或Lys进行的。
[81]如段落[79]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:2的位置406的一个位置处的取代是Q406T/R/K。
[82]如段落[61]-[81]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、或406的任两个位置处包括取代。
[83]如段落[61]-[82]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、或406的任三个位置处包括取代。
[84]如段落[61]-[83]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、以及330的每个位置处包括取代。
[85]如段落[61]-[84]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的位置326、329、330、以及406的每个位置处包括取代。
[86]如段落[61]-[85]中任一项所述的方法，其中该变体半乳糖氧化酶相对于该亲本半乳糖氧化酶具有改进的催化效率或催化速率。
[87]如段落[61]-[86]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:6的成熟多肽序列或由其组成。
[88]如段落[87]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:6的氨基酸1至639。
[89]如段落[61]-[86]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:8的成熟多肽序列或由其组成。
[90]如段落[89]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:8的氨基酸1至639。
[91]如段落[61]-[90]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从一种异源多核苷酸表达的。
[92]如段落[61]-[91]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从除澳美镰孢菌之外的宿主表达的。
[93]如段落[92]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从米曲霉宿主表达的。
[94]如段落[92]所述的方法，其中该半乳糖氧化酶是从镶片镰孢菌宿主表达的。
[95]如段落[61]-[94]中任一项所述的方法，其中该半乳糖氧化酶不包括SEQ ID NO:2的成熟多肽序列。
[96]如段落[61]-[95]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种过氧化氢酶。
[97]如段落[61]-[96]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括铜。
[98]如段落[61]-[96]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括硫酸铜。
[99]如段落[97]或[98]所述的方法，其中该铜处于少于或等于1mM，例如少于或等于0.5mM，或少于或等于0.0015mM的浓度。
[100]如段落[61]-[99]中任一项所述的方法，其中该HMFCA或其盐的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％被转化为FFCA或其盐。
[101]如段落[61]-[100]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种环化酶，并且其中该反应混合物提供了甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[102]如段落[101]所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[103]如段落[102]所述的方法，其中该成熟多肽序列包括基序：E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R(SEQ ID NO:27)。
[104]如段落[101]所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[105]如段落[101]所述的方法，其中该环化酶包括SEQ ID NO:9的成熟多肽序列或由其组成。
[106]如段落[105]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:9的氨基酸1至328。
[107]如段落[101]-[104]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
[108]如段落[101]-[107]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处包括取代。
[109]如段落[108]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[110]如段落[108]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是M76L。
[111]如段落[101]-[110]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处包括取代。
[112]如段落[111]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[113]如段落[111]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是M134L或M127L。
[114]如段落[101]-[113]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处包括取代。
[115]如段落[114]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是用Phe进行的。
[116]如段落[114]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是Y201F或Y194F。
[117]如段落[101]-[116]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的任两个位置处包括取代。
[118]如段落[101]-[117]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的每个位置处包括取代。
[119]如段落[101]-[118]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括补充的H2O2。
[120]一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种环化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)、5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)、甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[121]一种氧化2,5-二甲酰基呋喃(DFF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使DFF接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[122]一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
[123]一种氧化甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使FFCA或其盐接触一种环化酶，以提供2,5-呋喃二羧酸(FDCA)或其盐。
[124]如段落[120]-[123]中任一项所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[125]如段落[124]所述的方法，其中该成熟多肽序列包括基序：E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R(SEQ ID NO:27)。
[126]如段落[120]-[123]中任一项所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
[127]如段落[120]-[123]中任一项所述的方法，其中该环化酶包括SEQ ID NO:9的成熟多肽序列或由其组成。
[128]如段落[127]所述的方法，其中该成熟多肽序列是SEQ ID NO:9的氨基酸1至328。
[129]如段落[120]-[126]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
[130]如段落[120]-[126]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处包括取代。
[131]如段落[130]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[132]如段落[130]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置76的一个位置处的取代是M76L。
[133]如段落[120]-[132]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处包括取代。
[134]如段落[133]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是用Leu进行的。
[135]如段落[133]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置134的一个位置处的取代是M134L或M127L。
[136]如段落[120]-[135]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处包括取代。
[137]如段落[136]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是用Phe进行的。
[138]如段落[136]所述的方法，其中在对应于SEQ ID NO:10的位置201的一个位置处的取代是Y201F或Y194F。
[139]如段落[120]-[138]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的任两个位置处包括取代。
[140]如段落[120]-[139]中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的每个位置处包括取代。
[141]如段落[120]-[140]中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括补充的H2O2。

Claims (20)

1.一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种重组表达的半乳糖氧化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)。
2.如权利要求1所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至639或由其组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶是一种亲本半乳糖氧化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ IDNO:2的位置326、329、330、以及406的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
5.如权利要求4所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:6的氨基酸1至639或由其组成。
6.如权利要求4所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶变体包括SEQ ID NO:8的氨基酸1至639或由其组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该重组表达的半乳糖氧化酶是从一种异源多核苷酸表达的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种过氧化氢酶。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括铜。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该HMF的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％被转化为DFF。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该反应混合物进一步包括一种环化酶，并且DFF被进一步氧化为甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中该环化酶与SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、或32中任一项的成熟多肽序列具有至少60％序列一致性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性)。
13.如权利要求12所述的方法，其中该成熟多肽序列包括基序：E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R(SEQ ID NO:27)。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中该环化酶包括SEQ ID NO:9的氨基酸1至328或由其组成。
15.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中该环化酶是一种亲本环化酶的一个变体，该变体在对应于SEQ ID NO:10的位置76、134、以及201的一个或多个(若干个)位置处包括取代。
16.一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种半乳糖氧化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐。
17.一种氧化5-羟甲基糠醛(HMF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMF接触一种环化酶，以提供2,5-二甲酰基呋喃(DFF)、5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)、甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
18.一种氧化2,5-二甲酰基呋喃(DFF)的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使DFF接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
19.一种氧化5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使HMFCA或其盐接触一种环化酶，以提供甲酰基呋喃羧酸(FFCA)、2,5-呋喃二羧酸(FDCA)、其盐、或前述各项的一种混合物。
20.一种氧化甲酰基呋喃羧酸(FFCA)或其盐的方法，该方法包括在适合的条件下在反应混合物中使FFCA或其盐接触一种环化酶，以提供2,5-呋喃二羧酸(FDCA)或其盐。
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