DE69930955T2

DE69930955T2 - Polypeptide mit lysophospholipaseaktivität und nukleinesäuren die sie kodieren

Info

Publication number: DE69930955T2
Application number: DE69930955T
Authority: DE
Inventors: M. Randy Davis BERKA; W. Michael Davis REY; Tony Davis BYUN; Ryoko Sukagawa-shi ITAMI; Noriko Ichikawa-shi TSUTSUMI; Alan Dixon KLOTZ
Original assignee: Novozymes Japan Ltd; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Japan Ltd; Novozymes Inc
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: AU768657B2; CA2354182C; ATE323770T1; CA2354182A1; DE69930955D1; EP1131444B1; EP1131444A1; US20030100092A1; DK1131444T3; US6682922B2; US6489154B1; WO2000028044A1; AU2148400A; CA2848113A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität und isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäure-Konstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Beschreibung der verwandten Technik
Phospholipasen sind Enzyme, die an der Hydrolyse von Phospholipiden teilnehmen, die aus einer Glycerinhauptkette mit zwei Fettsäuren in einer äußeren (sn-1) Position und der mittleren (sn-2) Position bestehen und mit Phosphorsäure in der dritten Position verestert sind. Die Phosphorsäure kann wiederum mit einem Aminoalkohol verestert sein.
Es können mehrere Phospholipaseaktivitätstypen, die die Fettsäureacyl-Gruppierungen hydrolysieren, unterschieden werden. Die Phospholipase A1 und die Phospholipase A2 katalysieren die Deacylierung einer Fettsäureacylgruppe in der sn-1- bzw. sn-2-Position eines Diacylglycerophospholipids unter Herstellung von Lysophospholipid. Lysophospholipase (von der Nomenklatur-Komission der International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classifikation of Enzymes {Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992} auch Phospholipase B genannt) katalysiert die Hydrolyse der restlichen Fettsäureacylgruppe in einem Lysophospholipid. Eine Phospholipase B, die die Deacylierung beider Fettsäuren aus einem Diacylglycerophospholipid katalysiert und von Natur aus Lysophospholipase-Aktivität besitzt, wurde aus Penicillium notatum beschrieben (Saito et al., 1991, Methods in Enrymology 197:446–456).
Pilzenzyme mit Phospholipaseaktivität wurden aus verschiedenen Quellen beschrieben, einschließlich Cryptococcus neoformans (Chen et al., Infection and Immunity 65:405–411), Fusobacterium necrophorum (Fifis et al., 1996, Veterinary Microbiology 49:219–233), Penicillium notatum (auch bekannt als Penicillium chrysogenum; Kawasaki, 1975, Journal of Biochemistry 77:1233–1244; Masuda et al., 1991, European Journal of Biochemistry 202:783–787), Penicillium cyclopium (Mustranta et al., 1995, Process Biochemistry 30:393–401), Saccharomyces cerevisia (Ichimasa et al., 1985, Agric. Biol. Chem. 49:1083–1089; Paultauf et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:19725–19730), Torulaspora delbrueckii (alter Name: Saccharomyces rosei, Kuwabara, 1988, Agric. Biol. Chem. 52:2451–2458; Watanabe et al., 1994, FEMS Microbiological Letters 124:29–34), Schizosaccharomyces pombe (Oishi et al., 1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60:1087–1092), Neurospora crassa (Chakravarti et al., 1981, Archives of Biochemistry and Biophysics 206:393–402). Aspergillus niger (Technical Bulletin, G-zyme^TM G6999, Enzyme Bio-Systems Ltd.; Mustranta et al., 1995, supra), Corticium centrifugum (Uebara et al., 1979, Agric. Biol. Chem. 43:517–525), Fusarium oxysporum (WO 98/26057) und Fusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological Notes 58:1437–38).
Pilzphospholipase-Gene wurden aus mehreren Quellen kloniert, einschließlich Penicillium notatum (Masuda et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii (Watanabe et al.,1994, FEMS Microbiology Letters 124:29–34), Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:19725–19730), Apergillus ( JP 10155493 ), Neurospora crassa (EMBL 042791) und Schizosaccharomyces pombe (EMBL 013857).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, verbesserte Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität und Nukleinsäure, die die Polypeptide codiert, bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

(a) einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine mindestens 65%ige Identität mit den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 aufweist;
(b) einer Allel-Variante von (a); und
(c) einem Fragment von (a) oder (b), wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die die Polypeptide codieren und Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A, 1B und 1C zeigen die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusarium venenatum-Lysophospholipase (SEQ ID NOS. 1 bzw. 2).
2 zeigt eine Restriktionskarte von pDM 181.
3 zeigt eine Restriktionskarte von pSheB 1.
4 zeigt eine Restriktionskarte von pRaMB54.
5 zeigt das pH-Aktivitätsprofil einer Fusarium venenatum-Lysophospholipase.
Die 6A, 6B und 6C zeigen die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusarium verticillioides-Lysophospholipase (SEQ ID NOS. 15 bzw. 16).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität
Der Begriff "Lysophospholipaseaktivität" ist hier als eine Carboxylester-Hydrolyseaktivität definiert, die die Deacylierung von einer oder beiden der Fettsäureacylgruppen in der sn-1- und sn-2-Position eines Diacylglycerophospholipids katalysiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Phospholipaseaktivität durch Inkubation der Lysophospholipase mit Lysolecithin (oder L-α-Lysophosphatidylcholin) in Gegenwart von Calciumchlorid bei 37°C, pH 5 oder 7, für 10 min und Messen der Freisetzung der Fettsäure unter Verwendung eines beliebigen aus der Technik bekannten Verfahrens, wie der NEFA C-Testsatz (Wako Chemicals, Richmond, VA), nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Eine Lysophospholipase-Aktivitätseinheit ist definiert als 1,0 μmol freie Fettsäure, die pro Minute bei 37°C, pH 5,0 oder pH 7,0, produziert wird.
Bei einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die einen Identitätsgrad mit den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 von mindestens etwa 65%, vorzugsweise von mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt von mindestens etwa 80% und noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 90%, besonders bevorzugt von mindestens etwa 95% und am meisten bevorzugt von mindestens etwa 97% aufweist, die Lysophospholipase-Aktivität aufweisen (hier "homologe Polypeptide"). Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die homologen Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die sich um 5 Aminosäuren, vorzugsweise um 4 Aminosäuren, stärker bevorzugt um 3 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt um 2 Aminosäuren und besonders bevorzugt um 1 Aminosäure von den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 oder von den Aminosäuren 17 bis 648 der SEQ ID NO. 16 unterscheidet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zwischen zwei Aminosäuresequenzen durch das Clustal-Verfahren (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter Verwendung der LASERGENE^TM MEGALIGN^TM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden multiplen Anordnungsparametern bestimmt: Gap penalty 10 und gap length penalty 10. Die paarweisen Anordnungsparameter lauteten Ktuple=1, gap penalty=3, windows=5 und diagonals=5.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 oder eine Allel-Variante davon; oder ein Fragment davon mit Lysophospholipase-Aktivität. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2, das das reife Polypeptid der SEQ ID NO. 2 ist, oder eine Allel-Variante davon oder ein Fragment davon, wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 oder aus einer Allel-Variante davon oder einem Fragment davon, wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 oder aus einer Allel-Variante davon oder aus einem Fragment davon, wobei das Fragment Lysophospholipase-Aktivität aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2.
Ein Fragment der SEQ ID NO. 2 ist ein Polypeptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren aus dem Amino- und/oder Carboxyl-Terminus dieser Aminosäuresequenz deletiert wurden. Vorzugsweise enthält ein Fragment mindestens 500 Aminosäurereste, stärker bevorzugt mindestens 550 Aminosäurereste und besonders bevorzugt mindestens 600 Aminosäurereste.
Eine Allel-Variante bezeichnet zwei oder mehrere beliebige alternative Formen eines Gens, das den gleichen chromosomalen Lokus einnimmt. Eine Allel-Variation entsteht natürlicherweise durch Mutation und kann zu Polymorphismus innerhalb der Populationen führen. Genmutationen können still (keine Änderung in dem codierten Polypeptid) sein oder können Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen codieren. Eine Allel-Variante eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das von einer Allel-Variante eines Gens codiert wird.
Die Aminosäuresequenzen der homologen Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 oder dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäureresten und/oder der Substitution von einer oder mehreren Aminosäureresten mit unterschiedlichen Aminosäureresten unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäure-Änderungen geringfügig, d.h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die die Faltung und/oder Aktivität des Proteins nicht nennenswert beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von ein bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methionin-Rest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten; oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Änderung der Nettoladung oder einer anderen Funktion, wie ein Polyhistidintrakt, ein Antigen-Epitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtert.
Beispiele für konservative Substitutionen liegen in der Gruppe der basischen Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin), der sauren Aminosäuren (Glutaminsäure und Asparaginsäure), der polaren Aminosäuren (Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und Valin), der aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und der kurzen Aminosäuren (Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäure-Substitutionen, die die spezifische Aktivität im Allgemeinen nicht ändern, sind aus der Technik bekannt und beispielsweise von H. Neurath und R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York beschrieben. Die häufigsten auftretenden Änderungen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
Die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 15 oder eine Untersequenz davon sowie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 oder der SEQ ID NO. 16 oder ein Fragment davon können zur Konstruktion einer Nukleinsäuresonde zur Identifizierung und Klonierung einer DNA, die Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität codiert, aus Stämmen von verschiedenen Gattungen oder Spezies nach aus der Technik bekannten Verfahren verwendet werden. Insbesondere können solche Sonden zur Hybridisierung mit der genomischen oder der cDNA der Gattung oder Spezies von Interesse unter Befolgung von Standard-Southern Blot-Verfahren verwendet werden, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können beträchtlich kürzer sein als die Gesamtsequenz, sollten allerdings mindestens 15, vorzugsweise mindestens 25 und stärker bevorzugt mindestens 35 Nukleotide lang sein. Längere Sonden können ebenfalls verwendet werden. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Typischerweise werden die Sonden zum Nachweis des entsprechenden Gens markiert (beispielsweise mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin, oder Avidin).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der SEQ ID NO. 2 oder eine Untersequenz davon codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die SEQ ID NO. 1. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäuresonde die Nukleotide 214 bis 2061 der SEQ ID NO. 1, die ein reifes Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenz, die in Plasmid pFB0346 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL B-30073 enthalten ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenz, die die codierende Region des reifen Polypeptids codiert, die in dem Plasmid pFB0346 enthalten ist, welches in Escherichia coli NRRL B-30073 enthalten ist.
Für lange Sonden einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden wird das Trägermaterial schließlich jeweils dreimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC, 0,2% SDS, vorzugsweise bei mindestens 45°C (sehr niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 50°C (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt bei mindestens 55°C (mittlere Stringenz), stärker bevorzugt bei 60°C (mittel hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65°C (hohe Stringenz) und am stärksten bevorzugt bei mindestens 70°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Für kurze Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind, sind die Stringenz-Bedingungen definiert als Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen nach der Hybridisierung bei 5°C bis 10°C unterhalb der berechneten T_m unter Verwendung der Berechnung nach Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1X Denhardt-Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM einbasiges Natriumphosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml unter Befolgung der Standard-Southern Blot-Verfahren.
Für kurze Sonden, die etwa 15 Nukleotide bis etwa 70 Nukleotide lang sind, wird das Trägermaterial einmal in 6 × SCC plus 0,1% SDS 15 min gewaschen und jeweils zweimal für 15 min unter Verwendung von 6 × SSC bei 5°C bis 10°C unterhalb der berechneten T_m gewaschen.
Bei einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Varianten des Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2, umfassend eine Substitution, Deletion und/oder Insertion von einer oder mehrerer Aminosäuren.
Die Aminosäuresequenzen der Varianten-Polypeptide können sich von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 2 oder dem reifen Polypeptid davon durch eine Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) und/oder durch die Substitution von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) durch unterschiedliche Aminosäurereste unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäure-Änderungen geringfügig, d.h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die die Faltung und/oder Aktivität des Proteins nicht wesentlich beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von 1 bis etwa 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest; ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20–25 Resten; oder eine kleine Extension, die die Reinigung durch Veränderung der Nettoladung oder einer weiteren Funktion, wie ein Polyhistidintrakt, ein Antigenepitop oder eine Bindungsdomäne, erleichtert.
Beispiele für konservative Substitutionen liegen innerhalb der Gruppe von basischen Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin), sauren Aminosäuren (Glutaminsäure und Asparaginsäure), polaren Aminosäuren (Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Isoleucin und Valin), aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin), und kleinen Aminosäuren (Glycin, Alanin, Serin, Threonin und Methionin). Aminosäure-Substitutionen, die im Allgemeinen die spezifische Aktivität nicht ändern, sind aus der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben von H. Neurath und R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu und Asp/Gly sowie diese umgekehrt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, stärker bevorzugt mindestens 60%, noch stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 100% der Lysophospholipase-Aktivität des reifen Polypeptids der SEQ ID NO. 2.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann aus Mikroorganismen einer beliebigen Gattung erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten aus", wie hier im Zusammenhang mit einer gegebenen Quelle verwendet, bedeuten, dass das Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz codiert wird, von der Quelle oder von einer Zelle produziert wird, in die die Nukleinsäuresequenz aus der Quelle inseriert wurde. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid extrazellulär sekretiert.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein bakterielles Polypeptid sein. Beispielsweise kann das Polypeptid ein Gram-positives bakterielles Polypeptid sein, wie ein Bazillus-Polypeptid, z.B. ein Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus brevis-, Bacillus circulans-, Bacillus coagulans-, Bacillus laurus-, Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus megaterium-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus subtilis-, oder ein Bacillus thuringiensis-Polypeptid; oder ein Streptomyces-Polypeptid, z.B. ein Streptomyces lividans- oder ein Streptomyces murinus-Polypeptid; oder ein Gramnegatives bakterielles Polypeptid, z.B. ein E. coli- oder ein Pseudomonas sp.-Polypeptid.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein Pilz-Polypeptid sein und stärker bevorzugt ein Hefe-Polypeptid wie ein Candida-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- oder Yarrowia-Polypeptid; oder stärker bevorzugt ein Fadenpilz-Polypeptid, wie ein Acremonium-, Aspergillus-, Aureobasidium-, Cryptococcus-, Filibasidium-, Fusarium-, Humicola-, Magnaporthe-, Mucor-, Myceliophthora-, Neocallimastix-, Neurospora-, Paecilomyces-, Penicallium-, Piromyces-, Schizophyllum-, Talaromyces-, Thermoascus-, Thielavia-, Tolypocladium-, oder ein Trichoderma-Polypeptid.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-, Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis-, oder ein Saccharomyces oviformis-Polypeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Aspergillus aculeatus-, Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger-, Aspergillus oryzae-, Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-, Penicillium purpurogenum-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma longibrachiatum-, Trichoderma reesei-, oder ein Trichoderma viride-Polypeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium graminum-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-, Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichioides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium torulosum-, Fusarium trichothecioides-, Fusarium venenatum-, oder ein Fusarium verticillioides-Polypeptid.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Fusarium venenatum-Zelle Fusarium venenatum A3/5, die ursprünglich als Fusarium graminearum ATCC 20334 hinterlegt und neuerdings neu als Fusarium venenatum von Yoder und Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23:62–80 und O'Donnell et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23:57–67 klassifiziert worden ist; sowie taxonomische Äquivalente von Fusarium venenatum, ohne Rücksicht auf den Speziesnamen, unter dem sie derzeit bekannt sind. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fusarium venenatum-Zelle eine morphologische Mutante von Fusarium venenatum A3/5 oder Fusarium venenatum ATCC 20334, wie in der WO 97/26330 offenbart.
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Fusarium verticillioides-Zelle Fusarium verticillioides CBS 650.96.
Es ist selbstverständlich, dass für die zuvor genannten Spezies die Erfindung sowohl den perfekten als auch den nicht perfekten Zustand und weitere taxonomische Äquivalente, z.B. Anamorphe, einschließt, ohne Rücksicht auf den Speziesnamen, unter dem sie bekannt sind. Die Fachleute erkennen leicht die Identität von entsprechenden Äquivalenten. Beispielsweise werden taxonomische Äquivalente von Fusarium von D.L. Hawksworth, P.M. Kirk, B.C. Sutton und D.N. Pegler (Herausgeber), 1995, In Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi, Achte. Ausgabe, CAB International, University Press, Cambridge, England, Seiten 173–174 definiert.
Stämme dieser Spezies sind für die Öffentlichkeit leicht aus einer Anzahl von Kultursammlungen erhältlich, wie die American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Außerdem können solche Polypeptide aus anderen Quellen, einschließlich von Mikroorganismen, die aus der Natur isoliert wurden (z.B. aus Boden, Kompost, Wasser, etc.) unter Verwendung der oben erwähnten Sonden identifiziert und erhalten werden. Techniken zur Isolierung von Mikroorganismen aus natürlichen Lebensräumen sind aus der Technik gut bekannt. Anschließend kann die Nukleinsäuresequenz durch einfaches Screening einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek von anderen Mikroorganismen abgeleitet werden. Nachdem eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, mit der (den) Sonde(n) nachgewiesen wurde, kann die Sequenz unter Anwendung von Techniken, die den Fachleuten bekannt sind (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra), isoliert oder kloniert werden.
Wie hier definiert, ist ein "isoliertes" Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen nicht Lysophospholipase-Polypeptiden ist, z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und sogar am meisten bevorzugt etwa 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Polypeptide, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen codiert wurden, umfassen auch Fusionspolypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide, bei denen ein weiteres Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder des Fragmentes davon gebunden ist. Ein Fusionspolypeptid wird durch die Verbindung einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon), die ein anderes Polypeptid codiert, mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils davon) hergestellt. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind aus der Technik bekannt und umfassen die Ligation der codierenden Sequenzen, die die Polypeptide codieren, so dass sie im Raster sind und sich die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle desselben (derselben) Promotors (Promotoren) und derselben Terminationssequenz befindet.
Nucleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuresequenzen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz in SEQ ID NO. 1 ausgeführt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz in der SEQ ID NO. 15 ausgeführt. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die in dem Plasmid pFB0346 enthalten ist, das in Escherichia coli NRRL B-30073 enthalten ist. Bei einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die in Fusarium verticillioides CBS 650.96 enthalten ist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Sequenz, die das reife Polypeptid von SEQ ID NO. 1 codiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Region, die das reife Polypeptid von SEQ ID NO. 15 codiert. Bei einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Region, die das reife Polypeptid codiert, enthalten in Plasmid pFB0346, enthalten in Escherichia coli NRRL B-30073. Bei einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz die Region, die das reife Polypeptid codiert, enthalten in Fusarium verticillioides CBS 650.96. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 15 oder das reife Polypeptid davon codieren, welches sich von der SEQ ID NO. 1 bzw. der SEQ ID NO. 15 durch die Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Teilsequenzen von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 15, die Fragmente von SEQ ID NO. 2 bzw. SEQ ID NO. 17 codieren, die Lysophospholipase-Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch mutante Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eine Mutation in der das reife Polypeptid codierenden Sequenz der SEQ ID NO. 1 umfassen, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch mutante Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eine Mutation in der das reife Polypeptid codierenden Sequenz der SEQ ID NO. 15 umfassen, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 17 bis 648 der SEQ ID NO. 16 besteht.
Die zur Isolierung oder Klonierung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, angewandten Verfahren sind aus der Technik bekannt und umfassen die Isolierung aus genomischer DNA, die Präparation aus cDNA oder eine Kombination davon. Das Klonieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aus solcher genomischer DNA kann z.B. unter Verwendung der gut bekannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder durch Antikörperscreening von Expressionsbibliotheken durchgeführt werden, um klonierte DNA-Fragmente zu ermitteln, die sich strukturelle Merkmale teilen. Siehe z.B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, wie Ligase-Kettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und Amplifikation auf Nukleinsäuresequenz-Basis (NASBA) können verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann aus einem Stamm von Fusarium oder einem anderen oder verwandten Organismus kloniert werden und kann somit beispielsweise eine allelische Spezies oder eine Speziesvariante der Polypeptidcodierenden Region der Nukleinsäuresequenz sein.
Der Begriff "isolierte Nukleinsäuresequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuresequenzen, z.B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% rein, wie durch Agarose-Elektrophorese bestimmt. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäuresequenz durch Standard-Klonierungsverfahren erhalten werden, die in der Gentechnik zur Relokation der Nukleinsäuresequenz von ihrer natürlichen Lokation an eine unterschiedliche Stelle, wo sie reproduziert wird, angewandt werden. Die Klonierungsverfahren können Exzision und Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragmentes, das die Nukleinsäuresequenz einschließt, die das Polypeptid codiert, Insertion eines Fragmentes in ein Vektormolekül und Einschleusen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrere Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden, umfassen. Die Nukleinsäuresequenz kann genomischen Ursprungs sein, aus cDNA, RNA stammen, halbsynthetischen, synthetischen Ursprungs sein oder aus jeder Kombination davon stammen.
Zur Synthese von dem Polypeptid im Wesentlichen ähnlichen Polypeptiden können Modifikationen einer Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, notwendig sein. Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich" zu dem Polypeptid bezieht sich auf nicht natürlich vorkommende Formen des Polypeptids. Diese Polypeptide können sich gentechnisch von dem aus seiner nativen Quelle isolierten Polypeptids unterscheiden, z.B. Varianten, die sich in der spezifischen Aktivität, Wärmestabilität, dem pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden. Die Sequenzvariante kann auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz konstruiert werden, die als Polypeptid-codierender Teil der SEQ ID NO. 1 dargestellt wird, z.B. eine Teilsequenz davon, und/oder durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die keine andere Aminosäuresequenz des Polypeptids entstehen lassen, als die, die von der Nukleinsäuresequenz codiert wird, aber die der Kodon-Anwendung des Wirtsorganismus entsprechen, der zur Produktion des Enzyms beabsichtigt ist, oder durch Einbringen von Nukleotid-Substitutionen, die eine verschiedene Aminosäuresequenz entstehen lassen können. Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotid-Substitutionen siehe z.B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95–107.
Den Fachleuten wird klar, dass solche Substitutionen außerhalb der Regionen vorgenommen werden können, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind und immer noch ein aktives Polypeptid ergeben. Aminosäurereste, die für die Aktivität des Polypeptids essentiell sind, das von der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenz codiert wird, und mit denen darum vorzugsweise keine Substitution durchgeführt wird, können nach aus der Technik bekannten Verfahrensweisen identifiziert werden, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244:1081–1085). Bei letzterer Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingebracht, und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf Lysophospholipase-Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen einer Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenfalls durch Analyse der dreidimensionalen Struktur, wie durch solche Techniken, wie kernmagnetische Resonanz-Analyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de Vos et al., 1992, Science 255:306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59–64 bestimmt werden.
Nukleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, die mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen operabel verknüpft ist, die die Expression der codierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen steuern, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind. Die Expression wird so verstanden, dass jeder Schritt eingeschlossen ist, der an der Produktion des Polypeptids beteiligt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Transkription, posttranskriptionale Modifikation, Translation, posttranslationale Modifikation und Sekretion.
"Nukleinsäurekonstrukt" ist hier als Nukleinsäuremolekül definiert, entweder einzel- oder doppelsträngig, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wurde oder das modifiziert wurde, um Nukleinsäuresegmente zu enthalten, die auf eine Weise kombiniert und nebeneinander angeordnet werden, die sonst in der Natur nicht vorkommen würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist synonym mit dem Begriff Expressionskassette, wenn das Nukleinsäurekonstrukt sämtliche Kontrollsequenzen enthält, die zur Expression einer erfindungsgemäßen codierenden Sequenz erforderlich sind. Der Begriff "codierende Sequenz" ist hier als ein Teil einer Nukleinsäuresequenz definiert, die direkt die Aminosäuresequenz ihres Proteinsprodukts spezifiziert. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind im Allgemeinen durch eine Ribosomen-Bindungsstelle (Prokaryoten) oder durch das ATG-Startkodon (Eukaryoten), das unmittelbar stromaufwärts von dem offenen Leseraster am 5'-Ende der mRNA angeordnet ist, und durch eine Transkriptions-Terminations-Sequenz, die unmittelbar stromabwärts von dem offenen Leseraster am 3'-Ende der mRNA angeordnet ist, bestimmt. Eine codierende Sequenz kann DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann auf eine Vielzahl von Wegen manipuliert werden, um die Expression des Polypeptids zu liefern. Eine Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann je nach Expressionsvektor erwünscht oder notwendig sein. Die Techniken zur Modifizierung von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren sind aus der Technik gut bekannt.
Der Begriff "Kontrollsequenzen" ist hier so definiert, dass sämtliche Komponenten eingeschlossen sind, die zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids notwendig oder zweckmäßig sind. Jede Kontrollsequenz kann für die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, nativ oder fremdartig sein. Solche Kontrollsequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor, eine Signalpeptidsequenz und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz. Zumindest umfassen die Kontrollsequenzen einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale. Die Kontrollsequenzen können zum Zweck des Einbringens spezieller Restriktionsstellen, die die Ligation der Kontrollsequenzen mit der codierenden Region der Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, erleichtern, mit Linkern ausgestattet sein. Der Begriff "operabel verknüpft" ist hier als eine Konfiguration definiert, bei der eine Kontrollsequenz zweckmäßigerweise an einer Position relativ zu der codierenden Sequenz der DNA-Sequenz angeordnet ist, so dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids steuert.
Die Kontrollsequenz kann eine entsprechende Promotorsequenz, eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Wirtszelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird, sein. Die Promotorsequenz enthält transkriptionale Kontrollsequenzen, die die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann jede Nukleinsäuresequenz sein, die eine transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, einschließlich von mutierten Promotoren, verkürzten Promotoren und Hybrid-Promotoren, und kann aus Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre gegenüber der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Polypeptide codieren.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren, die erhalten werden aus dem E. coli-lac-Operon, dem Streptomyces coelicolor-Agarosegen (dagA), dem Bacillus subtilis-Levansucrasegen (sacB), dem Bacillus licheniformis-Alpha-Amylasegen (amyL), dem Bacillus stearothermophilusmaltogenen Amylasegen (amyM), dem Bacillus amyloliquefaciens-Alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis-Penicillasegen (penP), dem Bacillus subtilis xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen beta-Lactamase-Gen (Villa, Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727–3731), sowie der tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21–25). Weitere Promotoren sind beschrieben in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74–94; und in Sambrook et al., 1989, supra.
Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte in einer Fadenpilz-Wirtszelle sind Promotoren, die aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase, Aspergillus niger-neutrale alpha-Amylase, Aspergillus niger-säurestabile alpha-Amylase, Aspergillus niger- oder Aspergillus awamori-Glucoamylase (glaA), Rhizomucor miehei-Lipase, Aspergillus oryzae-alkalische Protease, Aspergillus oryzae-Triosephosphatisomerase, Aspergillus nidulans-Acetamidase und Fusarium oxysporum-trypsinartige Protease (WO 96/00787) erhalten werden, sowie der NA2-tpi-Promotor (ein Hybrid der Promotoren aus den Genen für Aspergillus nigerneutrale alpha-Amylase und Aspergillus oryzae-Triosephosphatisomerase) und mutierte Promotoren, verkürzte Promotoren und Hybridpromotoren davon.
In einer Hefezelle werden geeignete Promotoren aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae-Galactokinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) und Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase erhalten. Weitere geeignete Promotoren für Hefewirtszellen sind von Romanos et al., 1992, Yeast 8:423–488 beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz, eine Sequenz, die von einer Wirtszelle zur Terminierung der Transkription erkannt wird, sein. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Terminatorsequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann erfindungsgemäß verwendet werden.
Bevorzugte Terminationssequenzen für Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-7AKA-Amylase, Aspergillus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase, Aspergillus niger-alpha-Glucosidase und Fusarium oxysporum-trypsinartige Protease erhalten.
Bevorzugte Terminationssequenzen für Hefewirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase, Saccharomyces cerevisiae-Cytochrome C (CYC1), und Saccharomyces cerevisiae-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase erhalten. Weitere geeignete Terminationssequenzen für Hefewirtszellen sind bei Romanos et al., 1992, supra beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine geeignete Leadersequenz, eine nicht translatierte Region einer mRNA, die für die Translation durch die Wirtszelle wichtig ist, sein. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft. Jede Leadersequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann erfindungsgemäß verwendet werden.
Bevorzugte Leadersequenzen für Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase und für Aspergillus nidulans-Triosephosphatisomerase erhalten.
Geeignete Leader für Hefewirtszellen werden aus den Genen für Saccharomyces cerevisiae-Enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae-3-Phosphoglyceratkinase, Saccharomyces cerevisiae-alpha-Faktor und Saccharomyces cerevisiae-Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) erhalten.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Polyadenylierungssequenz, eine Sequenz, die mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist und die bei Transkription von der Wirtszelle als Signal zur Addition von Polyadenosinresten an transkribierte mRNA erkannt wird, sein. Jede Polyadenylierungssequenz, die in der Wirtszelle der Wahl funktionell ist, kann erfindungsgemäß verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für Fadenpilz-Wirtszellen werden aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Aspergilus niger-Glucoamylase, Aspergillus nidulans-Anthranilatsynthase, Fusarium oxysporum-trypsinartige Protease und Aspergillus niger-alpha-Glucosidase erhalten.
Geeignete Polyadenylierungssequenzen für Hefe-Wirtszellen sind von Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983–5990 beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Signalpeptid-codierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz codiert, die mit dem Aminoterminus eines Polypeptids verknüpft ist und das codierte Polypeptid in Richtung des sekretorischen Weges der Zelle lenkt. Das 5'-Ende der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz kann von Natur aus eine Signalpeptid-codierende Region enthalten, die in dem Translations-Leseraster natürlicherweise mit der Sequenz der codierenden Region verknüpft ist, die das sezernierte Polypeptid codiert. Alternativ kann das 5'-Ende der codierenden Sequenz eine Signalpeptid-codierende Region enthalten, die für die codierende Sequenz fremdartig ist. Die fremdartige Signalpeptid-codierende Region kann erforderlich sein, wo die codierende Sequenz nicht von Natur aus eine Signalpeptid-codierende Region enthält. Alternativ kann die fremdartige Signalpeptid-codierende Region einfach die natürliche Signalpeptidcodierende Region ersetzten, um die Sekretion des Polypeptids zu verstärken. Allerdings kann jede Signalpeptid-codierende Region, die das exprimierte Polypeptid in Richtung des sekretorischen Weges einer Wirtszelle der Wahl lenkt, erfindungsgemäß verwendet werden.
Wirksame Signalpeptid-codierende Regionen für bakterielle Wirtszellen sind die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Bacillus NCIB 11837 maltogene Amylase, Bacillus stearothermophilus-alpha-Amylase, Bacillus licheniformis-Subtilisin, Bacillus licheniformis-Beta-Lactamase, Bacillus stearothermophilus-neutrale Protease (nprT, nprS, nprM) und Bacillus subtilis prsA erhalten werden. Weitere Signalpeptide sind von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109–137 beschrieben.
Wirksame Signalpeptid-codierende Regionen für Fadenpilz-Wirtszellen sind die Signalpeptid-codierenden Regionen, die aus den Genen für Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase, Aspergillus niger-Neutralamylase, Aspergillus niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase, Humicola insolens-Cellulase und Humicola lanuginosa-Lipase erhalten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Signalpeptid-codierende Region die Nukleotide 100 bis 150 der SEQ ID NO. 1, die die Aminosäuren 1 bis 17 der SEQ ID NO. 2 codiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Signalpeptid-codierende Region die Nukleotide 1 bis 48 der SEQ ID NO. 15, die die Aminosäuren 1 bis 16 der SEQ ID NO. 16 codiert.
Geeignete Signalpeptide für Hefe-Wirtszellen werden aus den Genen für den Saccharomyces cerevisiae-alpha-Faktor und für Saccharomyces cerevisiae-Invertase erhalten. Weitere geeignete Signalpeptid-codierende Regionen sind von Romanos et al., 1992, supra beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann auch eine Polypeptid-codierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz codiert, die am Aminoterminus eines Polypeptids angeordnet ist. Das resultierende Polypeptid ist als Proenzym oder Propolypeptid (oder als Zymogen in einigen Fällen) bekannt. Im Allgemeinen ist ein Propolypeptid inaktiv und kann durch katalytische oder autokatalytische Abspaltung des Propeptids von dem Propolypeptid in ein reifes aktives Polypeptid umgewandelt werden. Die Propeptid-codierende Region kann aus den Genen für Bacillus subtilis-alkalische Protease (aprE), Bacillus subtilis-neutrale Protease (nprT), Saccharomyces cerevisiae-alpha-Faktor, Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase und Myceliophthora thermophila-Laccase (WO 95/33836) erhalten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Propeptid-codierende Region die Nukleotide 151 bis 213 der SEQ ID NO. 1, die die Aminosäuren 18 bis 37 der SEQ ID NO. 2 codiert.
Wo am Aminoterminus eines Polypeptids sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidregionen vorhanden sind, ist die Propeptidregion neben dem Aminoterminus eines Polypeptids angeordnet, und die Signalpeptidregion ist neben dem Aminoterminus der Propeptidregion angeordnet.
Es kann auch wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die die Regulation der Expression des Polypeptids relativ zu dem Wachstum der Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für regulatorische Systeme sind diejenigen, die dazu führen, dass die Expression des Gens als Reaktion auf ein chemisches oder physikalisches Stimulans, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung, ein- oder ausgeschaltet wird. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen umfassen die lac-, tac-, und trp-Operatorsysteme. In Hefe kann das ADH2-System oder das GAL1-System verwendet werden. In Fadenpilzen können der TAKA-alpha-Amylasepromotor, der Aspergillus niger-Glucoamylasepromotor und der Aspergillus oryzae-Glucoamylasepromotor als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Weitere Beispiele für regulatorische Sequenzen sind diejenigen, die die Genamplifikation ermöglichen. In eukaryotischen Systemen umfassen diese das Dihydrofolatreduktase-Gen, das in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert wird, und die Metallothionein-Gene, die mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen würde die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, mit der regulatorischen Sequenz operabel verknüpft sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte zur Änderung der Expression eines endogenen Gens, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert. Die Konstrukte können die minimale Anzahl von Komponenten enthalten, die zur Änderung der Expression des endogenen Gens notwendig sind. Bei einer Ausführungsform enthalten die Nukleinsäurekonstrukte vorzugsweise (a) eine Targetsequenz, (b) eine regulatorische Sequenz, (c) ein Exon und (d) eine Splice-Donor-Stelle. Beim Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Zelle, inseriert sich das Konstrukt durch homologe Rekombination in das zelluläre Genom an der endogenen Genstelle. Die Targetsequenz lenkt die Integration der Elemente (a)–(d) so in das endogene Gen, dass die Elemente (b)–(d) mit dem endogenen Gen operabel verknüpft werden. Bei einer anderen Ausführungsform enthalten die Nukleinsäurekonstrukte (a) eine Targetsequenz, (b) eine regulatorische Sequenz, (c) ein Exon, (d) eine Splice-Donorstelle, (e) ein Intron und (f) eine Splice-Akzeptorstelle, wobei die Targetsequenz die Integration der Elemente (a)–(f) so steuert, dass die Elemente (b)–(f) mit dem endogenen Gen operabel verknüpft werden. Allerdings können die Konstrukte zusätzliche Komponenten, wie selektierbare Marker, enthalten.
Bei beiden Ausführungsformen führt das Einbringen dieser Komponenten zur Produktion einer neuen Transkriptionseinheit, in der die Expression des endogenen Gens verändert ist. Zusammengefasst ist die neue Transkriptionseinheit ein Fusionsprodukt aus den Sequenzen, die durch die Targetkonstrukte und das endogene Gen eingebracht wurden. Bei einer Ausführungsform, bei der das endogene Gen verändert ist, ist das Gen aktiviert. Bei dieser Ausführungsform wird die homologe Rekombination zum Ersatz, zur Unterbrechung oder zur Behinderung der regulatorischen Region verwendet, die normalerweise mit dem endogenen Gen einer Elternzelle durch die Insertion einer regulatorischen Sequenz assoziiert ist, die das Gen offensichtlich zur Expression zu höheren Niveaus veranlasst als in der entsprechenden Elternzelle. Weiterhin kann das aktivierte Gen durch den Einschluss eines amplifizierbaren selektierbaren Markergens in dem Konstrukt unter Anwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren amplifiziert werden (siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,641,670). Bei einer weiteren Ausführungsform, bei der das endogene Gen verändert ist, ist die Expression des Gens reduziert.
Die Targetsequenz kann innerhalb des endogenen Gens, unmittelbar neben dem Gen, innerhalb eines Gens stromaufwärts oder stromabwärts von und mit Abstand von dem endogenen Gen vorhanden sein. Eine oder mehrere Targetsequenzen können verwendet werden. Beispielsweise verwendet ein zirkuläres Plasmid- oder DNA-Fragment vorzugsweise eine einzige Targetsequenz, während ein lineares Plasmid oder ein lineares DNA-Fragment vorzugsweise zwei Targetsequenzen einsetzt.
Die regulatorische Sequenz des Konstrukts kann aus einem oder mehreren Promotoren, Enhancern, Scaffold-Verknüpfungsregionen oder Matrix-Verknüpfungsstellen, negativen regulatorischen Elementen, Transkriptionsbindungsstellen oder aus Kombinationen dieser Sequenzen bestehen.
Weiterhin enthalten die Konstrukte ein oder mehrere Exons des endogenen Gens. Ein Exon ist als DNA-Sequenz definiert, die in RNA kopiert wird und in einem reifen mRNA-Molekül vorhanden ist, derart, dass sich die Exonsequenz im Raster mit der codierenden Region des endogenen Gens befindet. Gegebenenfalls kann das Exon DNA enthalten, die eine oder mehrere Aminosäuren und/oder teilweise eine Aminosäure codiert. Alternativ enthält das Exon DNA, die einer 5'-nicht codierenden Region entspricht. Wo das exogene Exon oder die exogenen Exons eine oder mehrere Aminosäuren und/oder einen Teil einer Aminosäure codieren, ist das Nukleinsäurekonstrukt so aufgebaut, dass sich das Leseraster bei Transkription und beim Splicen mit der codierenden Region des endogenen Gens im Raster befindet, so dass der entsprechende Leserahmen des Teils der mRNA, die sich von dem zweiten Exon ableitet, unverändert bleibt.
Die Splice-Donor-Stelle der Konstrukte steuert das Splicing von einem Exon zu einem anderen Exon. Typischerweise liegt das erste Exon 5' zu dem zweiten Exon, und die Splice-Donor-Stelle, die das erste Exon an seiner 3'-Seite überlappt und flankiert, erkennt eine Splice-Akzeptor-Stelle, die das zweite Exon an der 5'-Seite des zweiten Exons flankiert. Eine Splice-Akzeptor-Stelle, sowie eine Splice-Donor-Stelle ist eine Sequenz, die das Splicing von einem Exon zu einem anderen Exon steuert. Durch Wirken in Verbindung mit einer Splice-Donor-Stelle verwendet der Splicing-Apparat eine Splice-Akzeptorstelle, um die Entfernung eines Introns herbeizuführen.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, einen Promotor und transkriptionale und translationale Stoppsignale umfassen. Die verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen, die vorstehend beschrieben sind, können miteinander verknüpft werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, der eine oder mehrere zweckmäßige Restriktionsstellen einschließen kann, um die Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, an solchen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz durch Insertion der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäureskonstrukts, das die Sequenz umfasst, in einen zur Expression geeigneten Vektor exprimiert werden. Durch die Erzeugung des Expressionsvektors wird die codierende Sequenz in dem Vektor so angeordnet, dass die codierende Sequenz mit den entsprechenden Kontrollsequenzen zur Expression operabel verknüpft ist.
Der rekombinante Expressionvektor kann jeder beliebige Vektor sein (z.B. ein Plasmid oder ein Virus), mit dem DNA-Rekombinationsverfahren zweckmäßigerweise durchgeführt werden können und der die Expression der Nukleinsäuresequenz zustande bringen kann. Die Wahl des Vektors hängt typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle ab, in die der Vektor einzubringen ist. Die Vektoren können lineare oder geschlossene zirkuläre Plasmide sein.
Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Der Vektor kann ein beliebiges Mittel zur Sicherstellung der Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in die er integriert worden ist, repliziert wird. Außerdem können ein einziger Vektor oder Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die in das Genom der Wirtszelle einzubringende Gesamt-DNA enthalten, oder ein Transposon verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die die leichte Selektion von transformierten Zellen ermöglichen. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt biozide oder virale Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie gegenüber Auxotrophen und dergleichen bereitstellt. Beispiele für bakterielle selektierbare Marker sind die dal-Gene von Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, die Antibiotikum-Resistenz, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracylin-Resistenz, übertragen. Geeignete Marker für Hefe-Wirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3. Selektierbare Marker zur Verwendung in einer Fadenpilz-Wirtszelle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hph (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreductase), pyrG (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase) und trpC (Anthranilatsynthase) sowie Äquivalente davon. Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Gene von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das bar-Gen von Streptomyces hygroscopicus.
Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren ein Element (Elemente), welches die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenom oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle unabhängig von dem Genom der Zelle gestattet.
Zur Integration in das Wirtszellengenom kann der Vektor auf die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert oder jedes andere beliebige Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht homologe Rekombination zurückgreifen. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen zum Lenken der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen befähigen den Vektor, in das Wirtszellengenom an einer exakten Stelle (an exakten Stellen) in dem (den) Chromosomen) integriert zu werden. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Integration an einer bestimmten Stelle sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäuren, wie 100 bis 10000 Basenpaare, vorzugsweise 400 bis 10000 Basenpaare und besonders bevorzugt 800 bis 10000 Basenpaare enthalten, die mit der entsprechenden Targetsequenz stark homolog sind, um die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können eine beliebige Sequenz sein, die mit der Targetsequenz in dem Genom der Wirtszelle homolog ist. Außerdem können die Integrationselemente nicht codierende oder codierende Nukleinsäuresequenzen sein. Andererseits kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nichthomologe Rekombination integriert werden.
Zur autonomen Replikation kann der Vektor außerdem einen Replikationsursprung umfassen, der den Vektor zur autonomen Replikation in der in Frage kommenden Wirtszelle befähigt. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind Replikationsursprünge von Plasmiden pBR322, pUC19, pACYC177, und pACYC184, die die Replikation in E. coli gestatten und pUB110, pE194, pTA1060, und pAMß1, die die Replikation in Bacillus gestatten. Beispiele für Replikationsursprünge zur Verwendung in einer Hefewirtszelle sind die zwei Micron-Replikationsursprünge, ARS1, ARS4, die Kombination von ARS1 und CEN3 und die Kombination von ARS4 und CEN6. Der Replikationsursprung kann ein Ursprung mit einer Mutation sein, die sein Temperaturempfindliches Funktionieren in der Wirtszelle veranlasst (siehe z.B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).
In die Wirtszelle kann mehr als eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz inseriert werden, um die Produktion des Genprodukts zu erhöhen. Eine Erhöhung der Kopienzahl der Nukleinsäuresequenz kann durch Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Wirtszellengenom oder durch Einschließen eines amplifizierbaren selektierbaren Markergens mit der Nukleinsäursequenz erhalten werden, wobei Zellen, die amplifizierte Kopien des selektierbaren Markergens, und dadurch zusätzliche Kopien der Nukleinsäuresequenz, enthalten, durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart des entsprechenden selektierbaren Mittels selektiert werden können.
Die Verfahrensweisen, die zur Ligation der vorstehend beschriebenen Elemente angewandt werden, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren zu konstruieren, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, die zweckmäßigerweise bei der rekombinanten Produktion der Polypeptide verwendet werden. Ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfasst, wird in eine Wirtszelle eingebracht, so dass der Vektor als chromosomaler Integrand oder als selbst replizierender extrachromosomaler Vektor gehalten wird, wie zuvor beschrieben. Der Begriff "Wirtszelle" umfasst jeden Abkömmling einer Elternzelle, der auf Grund von während der Replikation auftretenden Mutationen nicht mit der Elternzelle identisch ist. Die Wahl einer Wirtszelle hängt zu einem großen Ausmaß von dem Gen, das das Polypeptid codiert, und von seiner Quelle ab.
Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus sein, z.B. ein Prokaryot, oder ein nicht einzelliger Mikroorganismus, z.B. ein Eukaryot, sein.
Geeignete einzellige Zellen sind Bakterienzellen, wie Gram-positive Bakterien, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf eine Bacillus-Zelle, z.B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermiphilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Streptomyces-Zelle, z.B. Streptomyces lividans und Streptomyces murinus oder Gramnegative Bakterien, wie E. coli und Pseudomonas sp. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Bacillus lentus-, Bacillus licheniformis-, Bacillus stearothermophilus-, oder eine Bacillus subtilis-Zelle. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Bacillus-Zelle ein alkalophiler Bacillus.
Das Einbringen eines Vektors in eine bakterielle Wirtszelle kann beispielsweise durch Protoplastentransformation (siehe z.B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111–115) unter Verwendung kompetenter Zellen (siehe, z.B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823–829, oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Baology 56:209–221), Elektroporation (siehe, z.B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6:742–751) oder Konjugation (siehe, z.B. Kohler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771–5278) durchgeführt werden.
Die Wirtszelle kann ein Eukaryot, wie eine Säuger-, Insekten-, Pflanzen- oder eine Pilzzelle, sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. "Pilze", wie hier verwendet, umfassen die Phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert von Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, B. Ausgabe, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) sowie die Oomycota (wie zitiert bei Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171) und sämtliche mitosporischen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra).
Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pilz-Wirtszelle eine Hefezelle. "Hefe", wie hier verwendet, umfasst ascosporogene Hefe (Endomycetales), basidiosporogene Hefe, und Hefe, die den Fungi Imperfecti (Blastomyceten) angehört. Da sich die Hefe-Klassifizierung künftig ändern kann, soll für die Zwecke dieser Erfindung Hefe definiert sein, wie beschrieben in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. und Davenport, R.R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposioum Series No. 9, 1980).
Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Candida-, Hansenula-, Kluyveromyces-, Pichia-, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- oder Yarrowia-Zelle.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Saccharomyces carlsbergensis-, Saccharomyces cerevisiae-, Saccharomyces diastaticus-, Saccharomyces douglasii-, Saccharomyces kluyveri-, Saccharomyces norbensis- oder Saccharomyces oviformis-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Kluyveromyces lactis-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Hefe-Wirtszelle eine Yarrowia lipolytica-Zelle.
Bei einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pilz-Wirtszelle eine Fadenpilzzelle. "Fadenpilze" umfassen sämtliche Fadenformen der Unterabteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., 1995, supra). Die Fadenpilze sind im Allgemeinen durch eine Myzelwand gekennzeichnet, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden besteht. Das vegetative Wachstum erfolgt durch Hyphen-Verlängerung, und der Kohlenstoff-Katabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum bei Hefen, wie Saccharomyces cerevisiaed, durch Knospung eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoff-Katabolismus kann fermentativ sein.
Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Zelle einer Spezies von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Aspergillus awamori-, Aspergillus foetidus-, Aspergillus japonicus-, Aspergillus nidulans-, Aspergillus niger- oder Aspergillus oryzae-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Fusarium bactridioides-, Fusarium cerealis-, Fusarium crookwellense-, Fusarium culmorum-, Fusarium graminearum-, Fusarium gramium-, Fusarium heterosporum-, Fusarium negundi-, Fusarium oxysporum-, Fusarium reticulatum-, Fusarium roseum-, Fusarium sambucinum-Fusarium sarcochroum-, Fusarium sporotrichoides-, Fusarium sulphureum-, Fusarium torulosum-, Fusarium trichothecioides-, Fusarium venenatum- oder eine Fusarium verticillioides-Zelle. Bei noch einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilz-Elternzelle eine Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.)-Zelle. Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fadenpilz-Wirtszelle eine Humicola insolens-, Humicola lanuginosa-, Mucor miehei-, Myceliophthora thermophila-, Neurospora crassa-, Penicillium purpurogenum-, Thielavia terrestris-, Trichoderma harzianum-, Trichoderma koningii-, Trichoderma Iongibrachiatum-, Trichoderma reesei-, oder eine Trichoderma viride-Zelle.
Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung, die Transformation der Protoplasten und die Regenerierung der Zellwand auf eine an sich bekannte Weise umfasst. Geeignete Verfahrensweisen zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen sind in EP 238 023 und bei Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470–1474 beschrieben. Geeignete Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies sind bei Malardier et al., 1989, Gene 78:147–156, und in WO 96/00787 beschrieben. Hefe kann unter Anwendung der von Becker und Guarante in Abelson, J.N. und Simon, M.I., Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Bd. 194, Seiten 182–187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920 beschriebenen Verfahrensweisen transformiert werden.
Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfassend (a) Kultivieren eines Stamms, der in seiner Wildtypform in der Lage ist, das Polypeptid zu produzieren, einen Überstand zu produzieren, der das Polypeptid umfasst; und (b) Gewinnen des Polypeptids. Vorzugsweise ist der Stamm aus der Gattung Fusarium und stärker bevorzugt Fusarium venenatum oder Fusarium verticillioides.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids förderlich sind und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfassend (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die der Produktion des Polypeptids förderlich sind, wobei die Wirtszelle eine mutierte Nukleinsäuresequenz mit mindestens einer Mutation in der das reife Polypeptid codierenden Region der SEQ ID NO. 1 oder der SEQ ID NO. 15 umfasst, wobei die mutante Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid codiert, das aus den Aminosäuren 38 bis 654 der SEQ ID NO. 2 bzw. den Aminosäuren 17 bis 648 der SEQ ID NO. 16 besteht und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids umfassend (a) Kultivieren einer homolog rekombinanten Zelle, die, darin eingebracht, eine neue Transkriptionseinheit aufweist, umfassend eine regulatorische Sequenz, ein Exon und/oder eine Splice-Donor-Stelle, die mit einem zweiten Exon einer endogenen Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, operabel verknüpft ist, unter Bedingungen, die der Produktion des Polypeptids förderlich sind, und (b) Gewinnen des Polypeptids. Die Verfahren beruhen auf der Verwendung der Gen-Aktivierungstechnik beispielsweise wie in der US-Patentschrift Nr. 5,641,670 beschrieben.
Bei den erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden die Zellen in einem Nährmedium, das zur Produktion des Polypeptids geeignet ist, unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren kultiviert. Beispielsweise kann die Zelle durch Schüttelkolbenkultivierung und durch Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche, Batch-, Fed-Batch- oder Festzustands-Fermentationen) im Labor oder in Industriefermentern, durchgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die es erlauben, dass das Polypeptid exprimiert und/oder isoliert wird, kultiviert werden. Die Kultivierung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferfirmen verfügbar oder können nach veröffentlichten Zusammensetzungen hergestellt werden (z.B. in den Katalogen der American Type Culture Collection). Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sezerniert wird, kann es aus den Zell-Lysaten gewonnen werden.
Die Polypeptide können unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren, die für die Polypeptide spezifisch sind, nachgewiesen werden. Die Nachweisverfahren können die Verwendung spezifischer Antikörper, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats umfassen. Beispielsweise kann ein Enzymtest zur Bestimmung der Aktivität des Polypeptids, wie hier beschrieben, eingesetzt werden.
Das resultierende Polypeptid kann durch aus der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch herkömmliche Verfahrensweisen, einschließlich, jedoch nicht darauf begrenzt, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknen, Eindampfen oder Präzipitation gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch eine Vielzahl von aus der Technik bekannten Verfahrensweisen gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Chromatographie (z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Chromatofokussierung und Größenausschlußchromatographie), elektrophoretische Verfahrensweisen (z.B. präparative isoelektrische Fokussierung), differentielle Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfatfällung), SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, J.-C. Janson und Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989).
Entfernung oder Reduktion von Lysophospholipase-Aktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer mutanten Zelle einer Elternzelle, welche das Unterbrechen oder Deletieren einer Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid oder eine Kontrollsequenz davon codiert, umfasst, was zu der mutanten Zelle führt, die beim Kultivieren unter denselben Bedingungen weniger Polypeptid produziert als die Elternzelle.
Zweckmäßigerweise kann die Konstruktion von Stämmen mit reduzierter Lysophospholipase-Aktivität durch Modifikation oder Aktivierung einer Nukleinsäuresequenz, die zur Expression des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität in der Zelle notwendig ist, erreicht werden. Die zu modifizierende oder zu inaktivierende Nukleinsäuresequenz kann beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert oder einen Teil davon sein, der zum Aufweisen von Phospholipaseaktivität essentiell ist, oder die Nukleinsäuresequenz kann eine regulatorische Funktion aufweisen, die zur Expression des Polypeptids aus der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz erforderlich ist. Ein Beispiel für eine solche regulatorische oder Kontrollsequenz kann eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon, d.h. ein Teil, der ausreicht, um die Expression des Polypeptids zu beeinflussen, sein. Weitere Kontrollsequenzen zur möglichen Modifikation sind vorstehend beschrieben.
Die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden, indem mit der Zelle eine Mutagenese durchgeführt wird und auf Zellen selektiert oder gescreent wird, in denen die Fähigkeit, Lysophospholipase zu produzieren, herabgesetzt wurde. Die Mutagenese, die spezifisch oder zufällig sein kann, kann beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen mutagenisierenden Mittels, durch Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder durch Durchführen einer PCR-generierten Mutagenese mit der DNA-Sequenz durchgeführt werden. Außerdem kann die Mutagenese durch Anwendung jeder Kombination dieser mutagenisierenden Mittel durchgeführt werden.
Beispiele für ein physikalisches oder chemisches mutagenisierendes Mittel, das für den vorliegenden Zweck geeignet ist, umfassen Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, Nitrosesäure, Ethylmethansulfonat (M), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotid-Analoge.
Werden solche Mittel verwendet, wird die Mutagenese typischerweise durch Inkubieren der zu mutagenisierenden Zelle in Gegenwart des mutagenisierenden Mittels der Wahl unter geeigneten Bedingungen und Selektieren auf Zellen, die herabgesetzte Phospholipaseaktivität oder -produktion aufweisen, durchgeführt.
Die Modifikation oder Inaktivierung der Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids kann durch Einführen, Substitution oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder eines regulatorischen Elementes, das zur Transkription oder Translation davon erforderlich ist, erreicht werden. Beispielsweise können Nukleotide inseriert oder entfernt werden, so dass sich der Einbau eines Stoppkodons, die Entfernung des Startkodons oder eine Änderung des offenen Leserasters ergibt. Eine solche Modifikation oder Inaktivierung kann durch ortsgerichtete Mutagenese oder PCR-generierte Mutagenese nach aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Obwohl im Prinzip die Modifikation in vivo durchgeführt werden kann, d.h. direkt in der Zelle, die die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz exprimiert, ist es bevorzugt, dass die Modifikation in vitro durchgeführt wird, wie nachstehend beispielhaft erläutert.
Ein Beispiel für einen zweckmäßigen Weg zur Eliminierung oder Herabsetzung der Produktion durch eine Wirtszelle der Wahl besteht in dem Gen-Ersatz oder der Gen-Unterbrechnung. Bei dem Gen-Unterbrechnungsverfahren wird eine Nukleinsäuresequenz, die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht, in vitro mutagenisiert, um eine fehlerhafte Nukleinsäuresequenz zu produzieren, die anschließend in die Wirtszelle transformiert wird, um ein fehlerhaftes Gen zu produzieren. Durch eine homologe Rekombination ersetzt die fehlerhafte Nukleinsäuresequenz das endogene Gen oder das endogene Genfragment. Es kann wünschenswert sein, dass das fehlerhafte Gen oder Genfragment auch einen Marker codiert, der zur Selektion von Transformanten verwendet werden kann, in denen das Gen, das das Polypeptid codiert, modifiziert oder zerstört worden ist.
Alternativ kann die Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz durch etablierte Anti-Sense-Techniken unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden, die zu der Sequenz, die das Polypeptid codiert, komplementär ist. Insbesondere kann die Produktion des Polypeptids durch eine Zelle reduziert oder ausgeschaltet werden, indem eine Nukleotidsequenz eingebracht wird, die zu der Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die das Polypeptid codiert, welches in der Zelle transkribiert werden kann und in der Lage ist, zu der in der Zelle produzierten mRNA zu hybridisieren. Somit wird unter den Bedingungen, unter denen sich die komplementäre Anti-Sense-Nukleotidsequenz zu der Polypeptid-mRNA hybridisieren lässt, die Menge an translatiertem Polypeptid reduziert oder beseitigt.
Es ist bevorzugt, dass die zu modifizierende Zelle gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren mikrobiellen Ursprungs ist, beispielsweise ein Pilzstamm, der zur Produktion von gewünschten Proteinprodukten, die für die Zelle entweder homolog oder heterolog sind, geeignet ist.
Nach diesem Aspekt der Erfindung ist die Entfernung von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 75%, stärker bevorzugt von mindestens 85%, noch stärker bevorzugt von mindestens 95% und am stärksten bevorzugt von mindestens 99% der Lysophospholipase-Aktivität möglich. Durch die Anwendung dieses Verfahrens kann eine vollständige Entfernung der Lysophospholipase-Aktivität erreicht werden.
Die kombinierte pH- und -Temperatur-Behandlung wird vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 6,5 bis 8,0 und bei einer Temperatur im Bereich von 45 bis 70°C für einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, um den gewünschten Effekt zu erzielen, wobei typischerweise 30 bis 60 min ausreichen.
Die zur Kultivierung und Reinigung des Produkts von Interesse angewandten Verfahren können durch aus der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen Lysophospholipase-freien Produkts sind von besonderem Interesse bei der Produktion von eukaryotischen Polypeptiden, insbesondere Pilzproteinen, wie Enzymen. Das Enzym kann z.B. aus einem amylolytischen Enzym, lipolytischen Enzym, proteolytischem Enzym, zellulytischen Enzym, Oxidoreduktase oder einem Pflanzenzellwand-abbauenden Enzym ausgewählt werden. Beispiele für solche Enzyme umfassen Aminopeptidase, Amylase, Amyloglucosidase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Deoxyribonuclease, Esterase, Galactosidase, beta-Galactosidase, Glucoamylase, Glucoseoxidase, Glucosidase, Haloperoxidase, Hemicellulase, Invertase, Isomerase, Laccase, Ligase, Lipase, Lyase, Mannosidase, Oxidase, pectinolytisches Enzym, Peroxidase, Phytase, Phenoloxidase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuclease, Transferase, Transglutaminase oder Xylanase. Die Lysophospholipase-Mangelzellen können auch zur Expression heterologer Proteine von pharmazeutischem Interesse, wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und dergleichen, eingesetzt werden.
Es ist selbstverständlich, dass der Begriff "eukaryotische Polypeptide" nicht nur native Polypeptide, sondern auch diejenigen Polypeptide einschließt, z.B. Enzyme, die durch Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen oder andere derartige Modifikationen zur Verstärkung der Aktivität, Wärmestabilität, pH-Toleranz und dergleichen beitragen.
Anwendungen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Polypeptide mit Lysophospholipase-Aktivität.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können bei jeder Anwendung eingesetzt werden, wobei die Hydrolyse der Fettsäure Acylgruppe(n) eines Phospholipids oder Lysophospholipids, wie Lecithin oder Lysolecithin, erwünscht ist. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polypeptide bei einem pH, der für die Aktivität optimal ist, eingesetzt.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität kann zur Degummierung einer wässrigen Kohlehydratlösung oder zur Aufschlämmung zur Verbesserung ihrer Filtrierbarkeit, insbesondere eines Stärkehydrolysats, insbesondere eines Weizenstärke-Hydrolysats, welches schwer zu filtrieren ist und trübe Filtrate ergibt, eingesetzt werden. Die Behandlung kann unter Anwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren durchgeführt werden. Siehe beispielsweise EP 219,269 und EP 808,903 .
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität kann bei einem Verfahren zur Reduzierung des Phospholipid-Gehalts in einem Speiseöl durch Behandeln der Öls mit dem Polypeptid eingesetzt werden, um einen Großteil des Phospholipids zu hydrolysieren und um eine wässrige Phase, die das hydrolysierte Phospholipid enthält, von dem Öl abzutrennen. Ein solches Verfahren ist auf die Reinigung eines Speiseöls anwendbar, welches Phospholipid enthält, z.B. Pflanzenöl, wie Sojaöl, Rapssamenöl und Sonnenblumenöl.
Vor der Lysophospholipase-Behandlung wird das Öl vorzugsweise zur Entfernung von Schleim (Mucilage) z.B. durch Nassraffinieren, vorbehandelt. Typischerweise enthält das Öl zu Beginn der Behandlung mit der Lysophospholipase 50 bis 250 ppm Phosphor als Phospholipid, und die Behandlung kann den Phosphorwert auf unter 5 bis 10 ppm reduzieren.
Die Lysophospholipase-Behandlung wird durch Dispergieren einer wässrigen Lösung der Lysophospholipase, vorzugsweise als Tröpfchen mit einem mittleren Durchmesser unter 10 μm, durchgeführt. Die Menge an Wasser beträgt in Relation zu dem Öl vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%. Ein Emulgator kann gegebenenfalls zugesetzt werden. Mechanisches Rühren kann angewandt werden, um die Emulsion zu erhalten.
Die Lysophospholipase-Behandlung kann bei einem pH im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 5,0 durchgeführt werden. Der Prozess-pH kann in dem Bereich von etwa 3,5 bis etwa 5 liegen, um die Enzym-Leistung zu maximieren, oder es kann ein pH im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 3 (z.B. 2–3) angewandt werden, um die alkalische Hydrolyse der Triglyceride zu unterdrücken (Verseifung). Der pH kann durch Zugabe von Citronensäure, eines Citratpuffers oder von Chlorwasserstoffsäure eingestellt werden.
Eine geeignete Temperatur beträgt vorzugsweise 30 bis 70°C (insbesondere 30 bis 45°C, z.B. 35–40°C). Die Reaktionsdauer beträgt typischerweise 1–12 h (z.B. 2–6 h). Eine geeignete Enzymdosis beträgt in der Regel 0,1 bis 10 mg pro Liter (z.B. 0,5 bis 5 mg pro Liter).
Die Lysophospholipase-Behandlung kann chargenweise, z.B. in einem Tank unter Rühren, oder kontinuierlich, z.B. in einer Serie von Rührtankreaktoren, durchgeführt werden.
Auf die Lysophospholipase-Behandlung folgt die Abtrennung einer wässrigen Phase und einer Ölphase. Die Abtrennung kann durch herkömmliche Mittel, z.B. Zentrifugation, durchgeführt werden. Die wässrige Phase enthält Lysophospholipase, und das Enzym kann zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wieder verwendet werden.
Die Behandlung kann unter Anwendung eines der aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,264,367, EP 654,527 , JP-A 2-153997.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität kann bei der Herstellung von Teig, Brot oder Kuchen verwendet werden. Die Lysophospholipase wird den Zutaten eines Teigs zugesetzt, welcher geknetet und gebacken wird, um das Brot unter Verwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren herzustellen. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 4,567,046, EP 426,211 , JP-A-60-78529, JP-A 62-111629 und JP-A 63-258528.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines Teigs oder eines Backprodukts, umfassend die Einarbeitung in den Teig einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welches eine oder mehrere Eigenschaften des Teigs oder des gebackenen Produkts, das aus dem Teig erhalten wird, relativ zu einem Teig oder zu einem Backprodukt, in den das Polypeptid nicht eingearbeitet ist, verbessert.
Der Begriff "Einarbeiten in den Teig" ist hier als eine Zugabe des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität zu dem Teig aus einer beliebigen Zutat, aus der der Teig hergestellt wird, und/oder aus einem Gemisch von Teigzutaten, aus denen der Teig hergestellt wird, definiert. Mit anderen Worten kann die Lysophospholipase in jedem Schritt der Teigherstellung zugesetzt werden und kann in einem, zwei oder mehreren Schritten zugesetzt werden. Die Lysophospholipase wird den Zutaten eines Teigs zugesetzt, der verknetet und gebacken wird, um das Backprodukt unter Anwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren herzustellen. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 4,567,046, EP 426,211 , JP-A 60-78529, JP-A 62-111629 und JP-A 63-258528.
Der Begriff "wirksame Menge" wird hier als eine Menge des Polypeptids mit Lysophospholipase-Aktivität definiert, die ausreicht, um eine messbare Wirkung auf mindestens eine Eigenschaft von Interesse des Teigs und/oder des Backprodukts bereitzustellen.
Der Begriff "verbesserte Eigenschaft" ist hier als jede Eigenschaft eines Teigs und/oder eines aus dem Teig erhaltenen Produkts, insbesondere eines Backprodukts definiert, welches durch die Einwirkung der Lysophospholipase-Aktivität relativ zu einem Teig oder einem Produkt, in den das Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität nicht eingearbeitet ist, verbessert ist. Die verbesserte Eigenschaft kann erhöhte Festigkeit des Teigs, erhöhte Elastizität des Teigs, erhöhte Stabilität des Teigs, verminderte Klebrigkeit des Teigs, verbesserte Dehnbarkeit des Teigs, verbesserte maschinelle Bearbeitbarkeit des Teigs, erhöhtes Volumen des gebackenen Produkts, verbesserte Krustenstruktur des Backprodukts, verbesserte Weichheit des gebackenen Produkts, verbessertes Aroma des gebackenen Produkts und/oder verbesserter Schutz gegen Austrocknen des Backprodukts einschließen, ist jedoch aber nicht darauf beschränkt.
Die verbesserte Eigenschaft kann durch Vergleich eines Teigs und/oder eines gebackenen Produkts, das mit und ohne Zugabe eines Polypeptids mit der erfindungsgemäßen Lysophospholipase-Aktivität nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist, bestimmt werden. Techniken, die zur Bestimmung der Verbesserungen, die durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden, eingesetzt werden können, sind nachstehend in den Beispielen beschrieben. Die organoleptischen Qualitäten können unter Anwendung von gut in der Backindustrie etablierten Verfahrensweisen bewertet werden und können beispielsweise die Verwendung eines Panels von geübten Geschmackstestern einschließen.
Der Begriff "erhöhte Festigkeit des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, welcher im Allgemeinen mehr elastische Eigenschaften aufweist und/oder mehr Arbeitseinsatz zum Formen in der Form und zum Formen erfordert.
Der Begriff "erhöhte Elastizität des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der eine stärkere Neigung aufweist, seine ursprüngliche Form wieder zu gewinnen, nachdem er einer bestimmten physikalischen Belastung ausgesetzt wurde.
Der Begriff "erhöhte Stabilität des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der gegenüber einem mechanischen Missbrauch weniger anfällig ist und somit besser seine Form und sein Volumen beibehält.
Der Begriff "verminderte Klebrigkeit des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der eine geringere Neigung zur Haftung an Oberflächen aufweist, z.B. in der Teigherstellungsmaschine, und entweder empirisch durch den Bäckereifachmann bewertet oder durch die Verwendung eines Konsistenzanalysators (z.B. TAXT2), wie aus der Technik bekannt, gemessen wird.
Der Begriff "verbesserte Dehnbarkeit des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der ohne zu reißen erhöhter Belastung oder einem verstärkten Strecken ausgesetzt werden kann.
Der Begriff "verbesserte maschinelle Bearbeitbarkeit des Teigs" ist hier als die Eigenschaft eines Teigs definiert, der im Allgemeinen weniger klebrig und/oder fester und/oder elastischer ist.
Der Begriff "erhöhtes Volumen des Backprodukts" wird als spezielles Volumen eines gegebenen Laib Brotes (Volumen/Gewicht), typischerweise bestimmt durch das traditionelle Rapssamen-Verdrängungsverfahren, gemessen.
Der Begriff "verbesserte Krustenstruktur des gebackenen Produkts" ist hier als die Eigenschaft eines gebackenen Produkts mit feineren und/oder dünneren Zellwänden in der Kruste und/oder mit einer gleichmäßigeren/homogeneren Verteilung der Zellen in der Kruste definiert und wird in der Regel durch den testenden Bäckereifachmann empirisch bewertet.
Der Begriff "verbesserte Weichheit des gebackenen Produkts" ist das Gegenteil von "Festigkeit" und ist hier als die Eigenschaft eines gebackenen Produkts definiert, das leichter komprimiert wird und entweder durch den testenden Bäckereifachmann empirisch bewertet oder durch die Verwendung eines Texturanalysators (z.B. TAXT2), wie aus der Technik bekannt, gemessen wird.
Der Begriff "verbessertes Aroma des gebackenen Produkts" wird durch ein geübtes Testpanel bewertet.
Der Begriff "verbesserter Schutz vor Austrocknung des gebackenen Produkts" ist hier als die Eigenschaften eines gebackenen Produkts definiert, welches eine herabgesetzte Geschwindigkeit der Verschlechterung der Qualitätsparameter, z.B. Weichheit und/oder Elastizität, während der Aufbewahrung aufweist.
Der Begriff "Teig" ist hier als ein Gemisch von Mehl und anderen Zutaten, die zum Kneten oder Ausrollen fest genug sind, definiert. Der Teig kann frisch, gefroren, vorher freigelegt oder vorgebacken sein. Die Herstellung von gefrorenem Teig ist von Kulp und Lorenz in Frozen and Refrigerated Doughs and Batters beschrieben.
Der Begriff "gebackenes Produkt" ist hier als ein beliebiges Produkt definiert, das aus einem Teig hergestellt wird, entweder mit einem weichen oder einem knusprigen Charakter. Beispiele für gebackene Produkte, gleich ob vom weißen, hellen oder dunklen Typ, die zweckmäßigerweise durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden können, sind Brot (insbesondere Weißbrot, Vollkornbrot oder Roggenbrot), typischerweise in Form von Laiben oder Rollen, Brot vom französischen Baguette-Typ, Pasta, Pitabrot, Tortillas, Tacos, Kuchen, Pfannkuchen, Biskuits, Kekse, Tortenboden, gedämpftes Brot und Knäckebrot und dergleichen.
Das Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität und/oder zusätzliche Enzyme, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden sind, können in jeder Form vorliegen, die für die in Frage kommende Verwendung geeignet ist, z.B. in Form eines trockenen Pulvers, eines agglomerierten Pulvers oder eines Granulats, insbesondere eines nicht staubenden Granulats, einer Flüssigkeit, insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms. Granulate und agglomerierte Pulver können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Sprühen der Lysophospholipase auf einen Träger in einem Flüssigbettgranulator. Der Träger kann aus teilchenförmigen Kernen mit einer geeigneten Teilchengröße bestehen. Der Träger kann löslich oder unlöslich sein, z.B. ein Salz (wie NaCl oder Natriumsulfat), Zucker (wie Saccharose oder Lactose), Zuckeralkohol (wie Sorbit), Stärke, Reis, Maisschrot oder Soja. Die Lysophospholipase und/oder zusätzliche Enzyme können in langsam freisetzenden Formulierungen enthalten sein. Verfahren zur Herstellung von langsam freisetzenden Formulierungen sind aus der Technik gut bekannt. Flüssige Enzymzubereitungen können beispielsweise durch Zugabe von nahrungsmittelverträglichen Stabilisatoren, wie Zucker, Zuckeralkohol oder einem anderen Polyol und/oder Milchsäure oder einer anderen organischen Säure nach den entwickelten Verfahren stabilisiert werden.
Zum Einschluss in Vorgemische oder Mehl ist es zweckmäßig, dass das Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivität in Form eines trockenen Produkts, z.B. eines nicht staubenden Granulats vorliegt, wohingegen es zum Einschluss zusammen mit einer Flüssigkeit zweckmäßigerweise in einer flüssigen Form vorliegt.
Auch eine oder mehrere zusätzliche Enzyme können in den Teig eingearbeitet werden. Das zusätzliche Enzym kann ein Enzym beliebigen Ursprungs sein, einschließlich von aus Säugern und Pflanzen stammend und vorzugsweise mikrobiellen (Bakterien, Hefe oder Pilze) Ursprungs, und kann durch Verfahren, die herkömmlicherweise in der Technik verwendet werden, erhalten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das zusätzliche Enzym eine Amylase (wie eine alpha-Amylase, die zur Bereitstellung von Zuckern, die durch Hefe fermentierbar sind und das Austrocknen verzögern, geeignet ist) oder beta-Amylase, Cyclodextrin, Glucotransferase, Peptidase, insbesondere eine Exopeptidase (zur Geschmacksverstärkung geeignet), Transglutaminase, Lipase (zur Modifikation der in dem Teig vorhandenen Lipide oder der Teigbestandteile, so dass der Teig weich wird), Phospholipase (geeignet zur Modifikation von Lipasen, die in dem Teig oder den Teigbestandteilen vorhanden sind, so dass der Teig weich wird und zur Verbesserung der Gasretention in dem Teig), Cellulase, Hemicellulase, insbesondere eine Pentosanase, wie Xylanase (die zur partiellen Hydrolyse von Pentosanen geeignet ist, die die Dehnbarkeit des Teigs erhöhen), Protease (die zur Gluten-Verminderung insbesondere bei Verwendung von Hartweizenmehl geeignet ist), Proteindisulfidisomerase, z.B. eine Proteindisulfidisomerase, wie offenbart in WO 95/00636, Glycosyltransferase, Peroxidase (die zur Verbesserung der Teigkonsistenz geeignet ist), Laccase oder Oxidase, z.B. eine Aldoseoxidase, Glucoseoxidase, Pyranoseoxidase, Lipoxygenase oder L-Aminosäureoxidase (die zur Verbesserung der Teigkonsistenz geeignet ist) sein.
Wenn nach den erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehrere zusätzliche Enzym-Aktivitäten zuzusetzen sind, können diese Aktivitäten getrennt oder zusammen mit dem Polypeptid mit Lysophospholipase-Aktivtät, gegebenenfalls als Zutaten) der Brotverbessernden und/oder Teig-verbessernden Zusammensetzung zugesetzt werden. Die anderen Enzym-Aktivitäten können eines der vorstehend beschriebenen Enzyme sein und können nach den etablierten Backpraktiken dosiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines gebackenen Produkts, umfassend das Backen eines Teigs, der durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten wird, um ein gebackenes Produkt herzustellen. Das Backen des Teigs zur Herstellung eines gebackenen Produkts kann unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung gedacht sein sollen.
Beispiele
Die als Puffer und als Substrate verwendeten Chemikalien waren handelsübliche Produkte von mindestens p.a. Reinheit.
Medien und Lösungen
COVE-Spurenmetalllösung, bestehend pro 1 aus 0,04 g NaB₄O₂·10H₂O, 0,4 g CuSO₄·5H₂O, 1,2 g FeSO₄·7H₂O, 0,7 g MnSO₄·H₂O, 0,8 g Na₂MoO·2H₂O und 10 g ZnSO₄·7H₂O.
50X COVE-Salzlösung, bestehend pro 1 aus 26 g KCl, 26 g MgSO₄·7H₂O, 76 g KH₂PO₄ und 50 ml COVE-Spurenrmetallen.
COVE-Medium, bestehend pro 1 aus 342,3 g Saccharose, 20 ml 50X COVE-Salzlösung, 10 ml 1 M Acetamid, 10 ml 1,5 M CsCi₂ und 25 g Noble Agar.
50X Vogels-Medium, bestehend pro 1 aus 150 g Natriumcitrat, 250 g KH₂PO₄, 10 g MgSO₄·7H₂O, 10 g CaCl₂·2H₂O, 2,5 ml Biotin-Stammlösung und 5,0 ml Spurenmetalllösung.
Spurenmetalllösung, bestehend pro 1 aus 14,3 g ZnSOa·7H₂O, 2,5 g CuSO₄·5H₂O, 0,5 g NiC1₂, 13,8 g FeSO₄, 8,5 g MnSO₄, und 3,0 g Citronensäure.
COVE-Topagarose, bestehend pro 1 aus 20 ml 50X COVE-Salzen, 0,8 M Saccharose, 1,5 M Cäsiumchlorid, 1,0 M Acetamid und 10 g niedrig schmelzende Agarose, pH eingestellt auf 6,0.
RA-Sporulationsmedium, bestehend pro 1 aus 50 g Succinsäure, 12,1 g NaNO₃, 1 g Glucose, 20 ml 50X Vogels-Medium und 0,5 ml einer 10 mg/ml NaMoO₄-Stammlösung, pH 6,0.
YEPG-Medium, bestehend pro 1 aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glucose.
STC, bestehend aus 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8,25 mM CaCl₂.
SPTC, bestehend aus 40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit, 25 mM Tris pH 8,25 mM CaCl₂.
M400Da-Medium, bestehend pro 1 aus 50 g Maltodextrin, 2 g MgSO₄·7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 4 g Citronensäure, 8 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff und 1 ml COVE-Spurenmetalllösung.
10X basale Salze Gew./Aminosäure bestehend pro 1 aus 66, 8 g Hefe-Stickstoffase Gew./der Aminosäure (Diffco), 100 g Succinsäure und 60 g NaOH.
SC Ura-glc-Medium bestehend pro 1 aus 100 ml 20% Glucose, 100 ml 10X basalen Salzen Gew./der Aminosäure, 25 ml 20% (Gew./Vol.) Casaminosäure, 4 ml 5% Treonin, 10 ml 1% Tryptophan und 20 g Agar Noble.
SC Ura-gal-Medium, bestehend pro Liter aus 100 ml 20% Galactose, 100 ml 10X basalen Salzen Gew./der Aminosäure, 25 ml 20% (Gew./Vol.) Casaminosäure, 4 ml 5% Treonin, 10 ml 1% Tryptophan und 20 g Noble Agar.
YPD-Medium, bestehend pro Liter aus 10 g Hefeextrakt, 20 g Bactopepton und 100 ml 20% Glucose.
1X Te/LiAC, bestehend pro 10 ml aus 1 ml 10X TE (100 mM Tris und 10 mM EDTA bei pH??), 1 ml 1 M Lithiumacetat und 8 ml Milli-Q-Wasser.
PEG/LiAc-Lösung, bestehend aus 50 ml 40% PEG und 1 ml 5 M Lithiumacetat.
Die Testplatten zum Nachweis der Lysophospholipase-Aktivität bestanden pro 1 aus 5 g L-alpha-Phosphatidylcholin 95%, 2,5 g Cholinsäure, 50 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0 Puffer, 100 ml 100 mM CaCl₂, 15 ml 2% Brilliant-Grün und 20 g Agar Noble. Die Lösung wurde in 50-ml-Aliquoten auf Falcon 1058-Platten gegossen.
STET-Lösung bestehend aus 8% Saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA und 5% Triton X-100.
Beispiel 1: Fermentation und Myzel-Gewebe
Fusarium venenatum CC1–3, eine morphologische Mutante des Fusarium-Stamms ATCC 20334 (bliebe et al., 1991, Mycol. Research 95:1284–1288), wurde in einem 2-1-Fermenter im Labormaßstab unter Anwendung eines diskontinuierlichen Fermentationsschemas mit NUTRIOSE^TM (Roquette Freres, S.A., Beinheim, Frankreich) als Kohlenstoffquelle und Hefeextrakt gezüchtet. In der Nährlösung wurde Ammoniumphosphat bereitgestellt. Der pH wurde bei 6 bis 6,5 gehalten, und die Temperatur wurde mit positiv gelöstem Sauerstoff bei 30°C gehalten.
Myzelproben wurden 2, 4, 6, und 8 Tage nach dem Animpfen geerntet und schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden bei -80°C gelagert, bis sie zur RNA-Extraktion aufgebrochen wurden.
Beispiel 2: Erstellung einer cDNA-Bibliothek
Die zelluläre Gesamt-RNA wurde aus den in Beispiel 1 beschriebenen Mycelproben nach dem Verfahren von Timberlake und Barnard (1981, Cell 26:29–37) extrahiert, und die RNA-Proben wurden durch Northern-Hybridisierung nach Blotten aus 1% Formaldehyd-Agarose-Gelen analysiert (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York). aus der Gesamt-RNA wurden mit einem mRNA-Separatorkit^TM (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) nach den Anweisungen des Herstellers polyadenylierte mRNA-Fraktionen isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von etwa 5 μg poly(A)+mRNA nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (1983, Gene 25:263–269), außer dass ein NotI-(dT)18-Primer (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) zum Start der ersten Strangsynthese verwendet wurde, synthetisiert. Die cDNA wurde mit Mungobohnen-Nuclease (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) behandelt, und die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase (New Englang Biolabs, Beverly, MA) abgestumpft.
Die cDNA wurde mit NotI verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese (0,7–4,5 kb) Größen-selektiert und mit pZErO-2.1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ligiert, was mit NotI plus EcoRV gespalten und mit alkalischer Kälberdarmphosphatase (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) dephosphoryliert wurde. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) verwendet. Die Transformanten wurden auf 2YT-Agarplatten selektiert (Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York), welche Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 μg/ml enthielten.
Zwei unabhängige direktionale cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des Plasmid-Klonierungsvektors pZErO-2.1 konstruiert. Bibliothek A wurde unter Verwendung von mRNA aus Myzel hergestellt, das nach vier Tagen geerntet wurde, und die Bibliothek B wurde mit mRNA genau nach sechs Tagen konstruiert. Keine der cDNA- Bibliotheken wurde amplifiziert, um einen repräsentativen "Schnappschuss" der Genexpressionsprofile in den Zellen zu überprüfen. Stattdessen wurden die Bibliotheken ausplattiert, titriert, und durch DNA-Sequenzierung wurden jeweils unabhängige Klone analysiert.
Bibliothek A (4 Tage alte Zellen) bestand aus etwa 7,5 × 10⁴ unabhängigen Klonen, und Bibliothek B (6 Tage alte Zellen) bestand aus etwa 1,2 × 10⁵ Klonen. Miniprep-DNA wurde aus 40 Kolonien in jeder Bibliothek isoliert und auf die Gegenwart und Größe von cDNA-Inserts überprüft. Bei dieser Analyse enthielten 39 von 40 Kolonien (97,5%) aus Bibliothek A Inserts mit Größen im Bereich von 600 bis 2200 bp (Mittelwert = 1050 bp). Ebenso besaßen 29 von 40 Kolonien (97,5%), die aus der Bibliothek B herausgegriffen wurden, Inserts mit Größen im Bereich von 800 bis 3600 bp (Mittelwert = 1380 bp).
Beispiel 3: Templatherstellung und Nukleotidsequenzierung
Aus jeder in Beispiel 2 beschriebenen cDNA-Bibliothek wurden 1192 tranformante Kolonien direkt aus den Transformationsplatten in 96-well-Mikrotiterplatten übergeführt, die 200 μl 2YT-Medium (Miller, 1992, supra) mit 50 μg/ml Kanamycin enthielten. Die Platten wurden bei 37°C ohne Schütteln über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden jeder Vertiefung 100 μl 50%iges steriles Glycerin zugesetzt. Die Transformanten wurden in zweiten 96-well-Mikrokulturplatten mit tiefen Vertiefungen (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD), die 1 ml Magnificent Broth^TM (MacConnell Research, San Diego, CA) enthielten, angereichert mit 50 μg Kanamycin pro ml in jeder Vertiefung, repliziert. Die ersten Mikrotiterplatten wurden bei -80°C tiefgefroren gelagert. Die zweiten Platten mit den tiefen Vertiefungen wurden bei 37°C über Nacht unter kräftigem Rühren (300 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Um Verschütten und Kreuzverunreinigung zu verhindern und um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen, wurde jede zweite Kulturplatte mit einem Polypropylenkissen (Advanced Genetic Technolgies Corporation, Gaithersburg, MD) und einem Mikrotiterplatten-Kunststoffdeckel abgedeckt.
Die DNA wurde unter Anwendung eines 96-well-Miniprepkit-Protokolls von Acvanced Genetic Technologies Corporation (Gaithersburg, MD), wie modifiziert von Utterback et al (1995,Genome Sci. Technol. 1:1–8), aus jeder Vertiefung isoliert. Die Single-Pass-DNA-Sequenzierung erfolgte mit einem Perkin-Eimer Applied Biosystems Sequenzierer XL Modell 377 (Perkin-Eimer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Anwendung der Farbstoff-Terminator-Chemie (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38:47–60) und des reversen lac-Sequenzierungsprimers.
Beispiel 4: Analyse der DNA-Sequenzdaten
Die Nukleotidsequenzdaten wurden sorgfältig auf Qualität geprüft und Proben mit unpassenden Zwischenräumen oder unklaren Niveaus über 2% wurden verworfen oder wiederholt.
Die Vektorsequenzen wurden manuell unter Zuhilfenahme der FACTURA^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zugeschnitten. Zusätzlich wurden die Sequenzen am Ende einer jeden Probe abgeschnitten, wenn sich die Anzahl an zweideutigen Basenabfolgen erhöhte. Sämtliche Sequenzen wurden miteinander verglichen, um die Multiplizität unter Verwendung der AutoAssembler^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) zu bestimmen. Schließlich wurden alle Sequenzen in drei Rastern translatiert und gegen eine nicht redundante Datenbasis (NRDB) unter Verwendung der GeneAssist^TM-Software (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) mit einem modifizierten Smith-Waterman-Algorithmus unter Verwendung der BLOSUM 62-Matrix mit einer Schwellenwertbewertung von 70 abgesucht. Das NRDB wurde von Genpept, Swiss-Prot und PIR-Datenbasen zusammengebaut.
Beispiel 5: Identifizierung des Lysophospholipase-cDNA-Klons
Die putativen Lysophospholipase-Klone wurden durch Teil-Sequenzierung von zufälligen cDNA-Klonen unter Verwendung eines Applied Biosystems automatischen DNA-Sequenzierers Modell 377 XL nach den Anweisungen des Herstellers und durch den Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz von Penicillium notatum-Lysphospholipase (Swissprot Zugangsnummer P39457), wie in Beispiel 4 beschrieben, identifiziert. Unter mehreren auf diese Weise gefundenen Klonen wurde von einem auf der Grundlage seiner Anordnung mit der Penicillium notatum-Lysophospholipase-Aminosäuresequenz und der Gegenwart eines möglichen Signalpeptids, das unter Verwendung des Signal-P-Computerprogramms (Nielsen, et al., 1997, Protein Engineering 10:1–6) entdeckt wurde, angenommen, dass er die volle Länge besitzt. Dieser als E. coli FB0346 bezeichnete Klon, der pFB0346 enthielt, wurde für die Nukleotidsequenzanalyse und für Expressionsstudien ausgewählt.
Beispiel 6: Nukleotidsequenzierung und Charakterisierung der Fusarium venenatum-Lysophospholipase-cDNA
Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem automatischen Applied Biosystems DNA-Sequenzierer, Modell 377 XL, unter Verwendung der Farbstoff-Terminationssequenzchemie durchgeführt. Zusammenhängende Sequenzen wurden unter Verwendung einer Transposon-Insertionsstrategie (Primer Island Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) generiert. Der Lysophospholipase-Klon aus E. coli FB0346 wurde mit einer durchschnittlichen Redundanz von 6, 9 sequenziert.
Der Lysophospholipase-Klon codierte ein offenes Leseraster von 1962 bp, welches ein Polypeptid von 654 Aminosäuren codiert. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) sind in den 1A, 1B, und 1C gezeigt. Unter Verwendung des SignalP-Programms (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1–6) wurde ein Signalpeptid von 17 Resten vorhergesagt, und die N-terminale Analyse des sekretierten Proteins zeigte die Gegenwart einer Pro-Region von 20 Aminosäuren an (siehe Beispiel 11), was daher ein vorhergesagtes Molekulargewicht von ungefähr 67 kDa für die sekretierte Lysophospholipase anzeigt. Somit besteht die reife Lysophospholipase aus 617 Aminosäuren.
Eine Vergleichsanordnung der Lysophospholipase-Sequenzen wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter Verwendung der LASERGENE^TM MEGALIGN^TM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden multiplen Anordnungsparametern durchgeführt: Gap-Penalty 10 und Gap-Längen-Penalty 10. Die paarweise angeordneten Parameter waren Ktuple=1, Gap-Penalty=3, Windows=5 und Diagonals=5.
Die Vergleichsanordnung zeigte, dass sich die Fusarium venenatum-Lysophospholipase Identitätsregionen mit Lysophospholipase-Proteinen von Neurospora crassa zu 59% (TREMBL O42791), Penicillium notatum zu 52% (Swissprot P39457), Saccharomyces cerevisiae zu 44% (Swissprot P39105) und Schizosaccharomyces pombe zu 39% (TREMBL O13857) teilte. Die Identitäten sind zwischen den Regionen am größten, die wahrscheinlich für katalytische und/oder strukturelle Rollen des Enzyms wichtig sind. Es existieren 19 potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) innerhalb der Fusarium venenatum-Lysophospholipase, und 11 von diesen sind in Neurospora crassa-Lysophospholipase konserviert, wohingegen 10 in Penicillium notatum-Lysophospholipase konserviert sind. Die Anordnung zeigt auch die Gegenwart von 8 Cys-Resten, deren Positionen unter Fusarium venenatum-, Neurospora crassa-, Penicillium notatum-, Saccharomyces pombe- und Saccharomyces cerevisiae-Lysophospholipasen strikt konserviert sind.
Beispiel 7: Konstruktion von pDM181
Das Plasmid pDM 181 wurde unter Anwendung der Splice-overlap-Extensionstechnik unter Fusion des 1,2 kb Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors (SP387) mit dem 1,1 kb Fusarium oxysporum-Trypsin-Terminator (SP387) hergestellt. Ein Polylinker, der Swal-, KpnI- und Pacl-Restriktionsstellen enthielt, wurde zwischen Promotor und Terminator als Teil der PCR-Überlappungsstrategie inseriert. Am 5'-Ende des Promotors wurde eine XhoI-Stelle zugefügt, und die native EcoRI-Stelle wurde erhalten. Am 3'-Ende des Terminators wurden durch die PCR-Reaktion EcoRI-, HindIII- und NsiI-Stellen eingebracht.
Ein PCR-Fragment, das -1208 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors plus einen 25-Basenpaar-Polylinker enthält, wurde aus dem Plasmid pJRoy20 generiert (Royer et al., 1995, Biotechnology 13:1479–1483), wobei die folgenden Primer verwendet wurden: Primer 1 (sense):
Primer 2 (antisense):
Die 100-μl-PCR-Reaktion enthielt 1X Pwo-Puffer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), jeweils 200 μM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 ng pJRoy20 und 5 Einheiten von Pwo-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Die angewandten PCR-Bedingungen waren 3 min bei 95°C und anschließend 25 Zyklen für jeweils 30 s bei 95°C, 1 min bei 50°C und 1 min bei 72°C. Der letzte Extensionszyklus war bei 72°C für 5 min.
Unter Anwendung der gleichen PCR-Bedingungen wurde ein zweites PCR-Fragment, enthaltend die Basenpaare -5 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors, einen 25-Basenpaar-Polylinker und 1060 Basenpaare der 3'-untranslatierten Region des Fusarium oxysporum-Trypsin-Gens (Terminatorregion), aus dem Plasmid pJRoy20 generiert, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: Primer 3 (sense):
Primer 4 (antisense):
Das letzte 2,3 kb PCR-Überlapp-Fragment, das -1208 bis -1 des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors, den 25 Basenpaar-Polylinker und 1060 Basenpaare des Fusarium oxysporum-Trypsin-Terminators enthielt, wurde unter Verwendung von 0,2 μl der ersten PCR (Promotor)-Reaktion und 3 μl der zweiten (Terminator)-Reaktion als Templat und von Primer 1 und 4 erhalten. Die angewandten PCR-Bedingungen waren 3 min bei 95°C und anschließend 3 Zyklen jeweils 30 s bei 95°C, 1 min bei 62°C und 3 min bei 72°C. Der letzte Extensionszyklus war 5 min bei 72°C. Pwo-DNA-Polymerase wurde ebenfalls für diese Reaktion verwendet.
Das resultierende 2,3 kb Fragment, das den Trypsin-Promotor, den Polylinker und den Trypsin-Terminator enthielt, wurde mit EcoRI verdaut und in den EcoRI-verdauten Vektor pMT1612 ligiert, der das bar-Gen (WO 97/26330) enthielt, um pDM181 zu erzeugen (2).
Beispiel 8: Konstruktion des Plasmids pSheB1
Der Fusarium venenatum-Expressionsvektor pSheB1 (3) wurde durch Modifikation von pDM181 generiert. Die Modifikationen umfassten (a) die Entfernung von zwei NcoI-Stellen innerhalb der pDM181-Sequenz und (b) Restauration des natürlichen Translationsstartes des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors (Rekonstruktion einer NcoI-Stelle am ATG-Startkodon).
Die Entfernung von zwei NcoI-Stellen innerhalb der pDM181-Sequenz wurde unter Verwendung des QuikChange^TM ortsgerichteten Mutagenese-Testsatzes (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) nach der Anweisung des Herstellers mit den folgenden Paaren von Mutagenese-Primern durchgeführt:
5'-dCAGTGAATTGGCCTCGATGGCCGCGGCCGCGAATT-3' plus (SEQ ID NO. 7
5'-dAATTCGCGGCCGCGGCCATCGAGGCCAATTCACTG-3' (SEQ ID NO. 8)
5'-dCACGAAGGAAAGACGATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' plus (SEQ ID NO. 9)
5'-dCAGACACCGTGAAAGCCATCGTCTTTCCTTCGTG-3' (SEQ ID NO. 10)
Die Restauration des natürlichen Translationsstartes des Fusarium oxysporum-Trypsin-Promotors wurde auch unter Verwendung des Stratagene QuikChange^TM ortsgerichteten Mutagenese-Testsatzes in Verbindung mit den folgenden Paaren von Mutagenese-Primern erreicht:
5'-dCTATCTCTTCACCATGGTACCTTAATTAAATACCTTGTTGGAAGCG-3' plus (SEQ ID NO. 11)
5'-dCGCTTCCAACAAGGTATTTAATTAAGGTACCATGGTGAAGAGATAG-3' (SEQ ID NO. 12)
Alle ortsgerichteten Änderungen wurden durch DNA-Sequenzanalyse der entsprechenden Vektorregionen bestätigt.
Beispiel 9: Konstruktion des Expressionsvektors pRaMB54
Der Lysophospholipase-Expressionsvektor pRaMB54 wurde, wie in 4 gezeigt, konstruiert. Die Lysophospholipase-codierende Region wurde aus dem Klon FB0346 unter Verwendung des folgenden Paars von Primern:
5'-dGGCACATGTTGGGCCCTCTCGTCTTTACT-3' (vorwärts) (SEQ ID NO. 13) und
5'-dGACTTAATTAATTTACGAAATAGCCAAGAATAAAGC-3' (rückwärts) (SEQ ID NO. 14)
amplifiziert. Der Vorwärtsprimer führt eine BspLU11I-Restriktionsstelle am Startkodon ein und der Rückwärtsprimer führt eine PacI-Stelle nach dem Stopkodon ein.
Die Amplifikationsreaktion (100 μl) enthielt die folgenden Komponenten: 0,8 μg von Klon-FB0346-cDNA, 40 pmol des Vorwärtsprimers, 40 pmol des Rückwärtsprimers, jeweils 200 μM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1X Pwo-DNA-Polymerasepuffer und 2,5 Einheiten von Pwo-DNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Eimer Thermal Cycler Modell 480, programmiert auf 30 Zyklen, jeweils 3 min bei 95°C, 2 min bei 58°C und 2 min bei 72°C, inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel (Eastman Kodak, Rochester, NY) isoliert, wobei eine 2 kb Produktbande aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von Qiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA) nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt wurde.
Das amplifizierte Lysophospholipase-Segment wurde mit BspLU11I und PacI verdaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese unter Anwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, supra) gereinigt und mit dem Vektor pSheB1 ligiert, der zuvor mit NcoI und PacI gespalten wurde (Anmerkung: BspLU11I und NcoI generieren kompatible kohäsive Enden). Das resultierende Expressionsplasmid wurde als pRaMB54 bezeichnet.
Beispiel 10: Expression von Lysophospholipase-cDNA in Fusarium venenatum
Sporen von Fusarium venenatum CC1–3 (MLY-3) wurden durch Animpfen eines Kolbens, der 500 ml RA-Sporulationsmedium mit 10 Pfropfen aus einer 1X Vogel-Medium-Platte (2,5% Noble Agar), angereichert mit 2,5% Glucose und 2,5 mM Natriumnitrat, enthielt, und Inkubieren bei 28°C, 150 U/min 2–3 Tage lang, erzeugt. Die Sporen wurden über Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) geerntet und 20 min bei 7000 U/min in einer Sorvall RC-5B-Zentrifuge (E.I. DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die pelletierten Sporen wurden zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, in einem kleinen Volumen von Wasser resuspendiert und sodann unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt.
Protoplasten wurden durch Animpfen von 100 ml YEPG-Medium mit 4X 10⁷ Sporen von Fusarium venenatum CC1–3 und 16 h Inkubieren bei 24°C und 150 U/min hergestellt. Die Kultur wurde 7 min bei 3500 U/min in einer Sorvall RT 6000D-Zentrifuge (E.I. DuPont De Nemours and Co., Wilmington, DE) zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal mit 30 ml 1 M MgSO₄ gewaschen und in 15 ml 5 mg/ml NOVOZYME 234^TM (Charge PPM 4356, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) in 1 M MgSO₄ resuspendiert. Die Kulturen wurden bei 24°C und 150 U/min inkubiert, bis sich Protoplasten bildeten. Dem Protoplastenverdau wurde ein Volumen von 35 ml 2 M Sorbit zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 2500 U/min 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert, zweimal mit STC gewaschen und bei 2000 U/min 10 min zentrifugiert, um die Protoplasten zu pelletieren. Die Protoplasten wurden mit einem Hämocytometer gezählt und in einer 8:2:0,1-Lösung von STC:SPTC:DMSO bis auf eine Endkonzentration von 1,25 × 10⁷ Protoplasten/ml resuspendiert. Die Protoplasten wurden nach Einfrieren mit kontrollierter Geschwindigkeit in einem Nalgene-Cryo-1°C-Gefrierbehälter (VWR Scientific, Inc., San Francisco, CA) bei -80°C aufbewahrt.
Die eingefrorenen Protoplasten von Fusarium venenatum CC1–3 wurden auf Eis aufgetaut. 5 μg von pRaMB54, beschrieben in Beispiel 9, und 5 μl Heparin (5 mg pro ml STC) wurden in einem sterilen 50-ml-Polypropylenröhrchen vorgelegt. 100 μl Protoplasten wurden zugesetzt, vorsichtig gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. 1 ml SPTC wurde zugesetzt und bei Raumtemperatur 20 min inkubiert. Nach Zugabe von 25 ml 40°C COVE-Top-Agarose wurde das Gemisch auf eine leere 150-mm-Durchmesser-Platte gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden zusätzliche 25 ml der 40°C-COVE-Top-Agarose, enthaltend 10 mg BASTA^TM pro ml, auf die Platte gegossen und bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage inkubiert. Der Wirkstoff in dem Herbizid BASTA^TM ist Phosphinotricin. BASTA^TM wurde von AgrEvo (Hoechst Schering, Rodovre, Dänemark) erhalten und wurde vor der Verwendung zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.
15 Transformanten wurden direkt von den Selektionsplatten (COVE underlay mit COVE-BASTA^TM overlay) in 125 ml Schüttelkolben, die 25 ml M400Da-Medium, angereichert mit 1 mM CaCl₂ und 100 μg/ml Ampicillin (zur Verhinderung von bakterieller Verunreinigung) enthielten, übergeführt und 7 Tage bei 28°C, 200 U/min auf einem Plattformschüttler inkubiert. Der nicht transformierte Empfängerstamm wurde ebenfalls als negative Kontrolle eingeschlossen.
Von den Kolben wurden nach 5 Tagen Proben genommen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, und 10 μl einer jeden Überstandsprobe wurde mit einem gleichen Volumen SDS-PAGE-Probepuffer (Novex Experimental Technology, San Diego, CA) 5 min auf 95°C erhitzt. Die denaturierten Proteine im Überstand wurden auf einem 10–20% Gradienten-Gel (Novex Experimental Technology, San Diego, CA) aufgetrennt und mit Coomassieblau angefärbt.
Die Lysophospholipase-Aktivität in den Kulturüberständen wurde ebenfalls unter Verwendung von Eigelb-Lysolecithin als Substrat mit einem NEFA C-Testsatz (Wako Chemicals, Richmond, VA) gemessen. Speziell wurde eine 10-μl-Probe des Überstandes zu 160 μl von 20 mM MOPS pH 7,0 Puffer und 30 μl Stammlösung von 5 mg Lysolecithin pro ml 100 mM NaCl gegeben und 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 μl der Reaktion zu 200 μl Reagens A (Wako Chemicals, Richmond, VA) zugesetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Schließlich wurden 400 μl Reagens B (Wako Chemicals, Richmond, VA) zugesetzt, und die Lösung wurde weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Die Extinktion bei 550 nm wurde durch Überführen von 200 μl der Endlösung in eine 96-well-Platte und Messen der Extinktion mit einem SpectraMax Modell 340 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) relativ zu einer Standardkurve, die mit Oleinsäure als Standard erstellt wurde, gemessen.
Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse beweisen eindeutig die Gegenwart einer erhöhten Lysophospholipase-Aktivität in diesen Proben. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass die Lysophospholipase-produzierenden Transformanten ein prominentes Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 116 kDa sekretieren. Die Diskrepanz zwischen dem vorhergesagten Molekulargewicht von reifer Lysophospholipase (etwa 69 kDa) gegenüber demjenigen, welches durch SDS-PAGE festgestellt wurde, legt nahe, dass das Protein schwer glycosyliert ist. Wie zuvor angemerkt, existieren 19 potentielle Stellen für die N-verknüpfte Glycosylierung innerhalb der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Fusarium venenatum-Lysophospholipase. Tabelle 1. Lysophospholipase-Aktivität, die in den Kulturüberständen aus Fusarium venenatum/pRaMB54-Transformanten vorhanden ist

^✝ Die Aktivität gibt die Hydrolysegeschwindigkeit von Eigelb-Lysolecithin bei pH 7 und 37°C wieder, gemessen in Mikromol Produkt pro min pro ml relativ zu der Aktivität des höchsten Produzenten, RamB54.01, die auf 1,00 normiert ist. N.D., nicht nachgewiesen.

Beispiel 11: Reinigung von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
Fusarium venenatum/pRaMB54 wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, 4 Tage in zwei 500-ml-Schüttelkolben, die 100 ml M400Da-Medium enthielten, kultiviert. Die 4 Tage alten Vollkulturnährmedien wurden über Miracloth und anschließend über ein 0,45-μm-Spritzenfilter (Whatman, Inc., Fairfield, NJ) filtriert, um ein Probenvolumen von etwa 150 ml zu ergeben. Anschließend wurden dem filtrierten Nährmedium 25 mM PMSF in 75% Ethanol/25% Methanol bis auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Anschließend wurde die Probe mit Wasser und 20 mM Natriumphosphat pH 7 verdünnt, um einen pH von 7,45 und eine Leitfähigkeit von 2,3 mS zu erreichen.
Q-Sepharose Big Beads (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) wurde in einer XK-26-Säule mit einem Volumen von ungefähr 80 ml Harz präpariert. Die Säule wurde mit 500 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 voräquilibriert. Anschließend wurde die Probe geladen und sodann mit 20 mM Natriumphosphat pH 7,0 gewaschen, bis eine Grundlinie erreicht war. Ein 600-ml-Gradient wurde von 0 bis 0,35 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min 120 min laufen gelassen. Fraktionen von 12,5 ml wurden gesammelt und unter Verwendung von Lauroyllysophosphatidylcholin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) als Substrat bei einer Konzentration von 1,2 mg/ml unter Anwendung des gleichen Verfahrens, das in Beispiel 10 beschrieben ist, getestet. Die Freisetzung von Laurinsäure wurde unter Verwendung eines NEFA C-Testsatzes gemessen. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, den vereinigten Fraktionen wurde (NH₄)₂SO₄ zugesetzt, um eine Konzentration von 2,2 M zu erreichen, und der pH wurde unter Verwendung von 1 M NaOH aus 7,0 eingestellt.
Anschließend wurden die vereinigten Fraktionen auf eine Phenylsuperose-16/10-Säule (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), gewaschen mit 100 ml 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, und voräquilibriert mit 200 ml 2,2 M (NH₄)₂SO₄ in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, geladen. Anschließend wurde die Säule mit 2,2 M (NH₄)₂SO₄ in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen, bis eine Grundlinie erreicht war. Sodann wurde ein 200-ml-Gradient von 2,2 M (NH₄)₂SO₄ in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 bis 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, der kein (NH₄)₂SO₄ enthielt, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min 100 min laufen gelassen. Fraktionen von 4 ml wurden gesammelt und unter Anwendung des gleichen Verfahrens, das oben beschrieben ist, getestet. Die aktiven Fraktionen wurden auch durch SDS-PAGE analysiert, was zeigte, dass die Lysophospholipase 90–95% rein war.
Beispiel 12: Proteinsequenzierung und Aminosäureanalyse von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
Die N-terminale Sequenzierung einer halb aufgereinigten Lysophospholipase, die wie in Beispiel 11 beschrieben erhalten wurde, und einer ungereinigten Lysophospholipase, die aus einem Nährmedium (5 Tage), hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben, isoliert wurde, wurde auf einem Applied Biosystems 476A Proteinsequenzierer (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) mit angeschlossener HPLC und Flüssigphasen-Trifluoressigsäure (TFA)-Abgabe durchgeführt. Mit den Lysophospholipase-Präparationen wurde eine SDS-PAGE unter Verwendung von 8- bis 16%igen Novex-Trisglycin-SDS-PAGE-Gelen unter reduzierenden Bedingungen in Gegenwart von 1 mM PMSF durchgeführt. Die Gele wurden 2 h auf PVDG-Membranen (Novex, San Diego, CA) bei 25 Volt in 10 mM CAPS pH 11,0 Puffer umgeblottet. Die PVDF-Membranen wurden in 0,1% Coomassie-Blau R 250 in 40% Methanol/1% Essigsäure angefärbt und die festgestellten Banden ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Banden wurden aus einer Blotpatrone unter Anwendung von Sequenzierungsreagentien (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) sequenziert. Der Nachweis von Phenylthiohydantoinaminosäuren wurde durch online-HPLC unter Verwendung von Puffer A, enthaltend 3,5% Tetrahydrofuran in Wasser mit 18 ml des Premix-Konzentrats (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA), enthaltend Essigsäure, Natriumacetat und Natriumhexasulfonat, und Puffer B, enthaltend Acetonitril, durchgeführt. Die Daten wurden gesammelt und auf einem Macintosh IIsi unter Einsatz der Applied Biosystems 610 Data Analysis-Software ausgewertet.
Die SDS-PAGE der gereinigten Lysophospholipase ergab Hauptbanden bei ungefähr 130 kDa und 90 kDa und Nebenbanden bei ungefähr 45, 40 und 35 kDa. Die Molekulargewichte wurden auf zuvor gefärbte Multi-Mark SDS-Page-Marker bezogen, die nicht die exakten MW-Bestimmungen wiedergeben. Die N-terminale Sequenzierung der ausgeschnittenen Banden erzeugte die folgenden Sequenzen.

Lauf Nr. AB0909 – 130-kDa-Bandensequenz: ALPDSPSGGY (SEQ ID NO. 2)
Lauf Nr. AB0910 – 90-kDa-Bandensequenz: NTAKYWDDIKDTVDEKADGW (SEQ ID NO. 2) (internes Peptid, auf Leucin folgend)
Lauf Nr. AB0912 – 45-kDa-Bandensequenz: ALPDSPSGGYA (SEQ ID NO. 2)
Lauf Nr. AB0913 – 40-kDa-Bandensequenz: ALPDSPSGGYAPKV(SEQ ID NO. 2)
Lauf Nr. AB0915 – 35-kDa-Bandensequenz: ALPD(S)P?GGYAP (SEQ ID NO. 2).

Die SDS-PAGE der ungereinigten Lysophospholipase ergab, bezogen auf Novex Mark 12-SDS-Page-Marker, eine Hauptbande bei 116 kDa. Die N-terminale Sequenzierung der ausgeschnittenen 116 kDa-Bande erzeugte die folgende Sequenz:

Lauf Nr. AB0917 – 116-kDa-Bandensequenz: ALPDSPSGGYAPKVVD?P (SEQ ID NO. 2)(?=Cys, welches ohne Modifizierung im Edman-Abbau nicht nachgewiesen wird). Der N-Terminus schien offenbar mit einem 20 Aminosäure-Propeptid verarbeitet zu werden. Die Spaltung erfolgte nach einem Arginin.

Die gesamten Ergebnisse sind wie folgt zusammengefasst:
Signalsequenz: MLGPLVFTLWLTSSAIA (SEQ ID NO. 2)
Propeptid: APDDAGLVAAPAIGKSLSIR (SEQ ID NO. 2)
N-Terminus: ALPDSPSGGYAPKVVDCP (SEQ ID NO. 2)
Beispiel 13: Charakterisierung von rekombinanter Fusarium venenatum-Lysophospholipase
Die, wie in Beispiel 11 beschrieben, gereinigte Lysophospholipase wurde unter Verwendung von Lysolecithin, Dilauroyl-L-phosphatodylcholin und Lecithin als Substrate getestet. Der Test wurde wie folgt durchgeführt: Die Lysophospholipase-Aktivität in den Kulturüberständen wurde auch unter Verwendung von Eigelb-Lysolecithin als Substrat mit einem NEFA C-Testkit (Wako Chemicals, Richmond, VA) gemessen. Insbesondere wurde eine 10-μl-Probe des Überstands zu 160 μl 20 mM MOPS pH 7,0 Puffer und 30 μl einer Stammlösung von 4 mg Lysolecithin, 5 mg Dilauroyl-L-phosphotidylcholin (dispergiert durch Ultraschall) oder 5 mg Lecithin (dispergiert durch Ultraschall) pro ml 100 mM NaCl zugesetzt und 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 μl der Reaktion zu 200 μl Wako Chemicals Reagens A zugesetzt und 10 min bei 37°C inkubiert. Schließlich wurden 400 μl Wako Chemicals Reagens B zugesetzt und die Lösung für weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Die Extinktion bei 550 mM wurde durch Überführen von 200 μl der Endlösung in eine 96-well-Platte und Messen der Extinktion mit einem SpectraMax Modell 340 relativ zu einer mit Oleinsäure als Standard erstellten Standardkurve gemessen. Mit L-Phosphatidylcholin und Lecithin als Substrat wurde keine signifikante Aktivität festgestellt.
Das pH-Optimum der Lysophospholipase wurde wie folgt bestimmt: Lösungen von 0,125 M Glycinacetat-MES-Phosphat wurden bei pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 hergestellt. Ein 50-μl-Volumen einer 16 mg/ml-Lösung von Lysophosphatidylcholin, Lauroyl in 100 mM NaCl wurde bei den verschiedenen pH-Werten zu 445 μl der Pufferlösung zugesetzt, worauf 5 μl der Enzymlösung folgten. Nach 5 min Inkubation wurden zum Stoppen der Reaktion 1 ml 5% TCA und anschließend 1,5 ml Hexan und 0,5 ml Ethanol zugesetzt. Die Lösung wurde verwirbelt, und 500 μl der Hexanschicht wurden entnommen und in ein konisches Röhrchen gegeben. Das Hexan wurde unter Stickstoff verdampft, und die Fettsäuren wurden unter Verwendung von Methyl 8 Reagens (Pierce, Rockville, IL) verestert. Die resultierenden Proben wurden durch Gaschromatographie unter Verwendung einer DB WAX-Säule (Länge 30 m, LD. 0,32 mm, Film 0,5 μm) (J&W Scientific, Folsom, CA) und eines Temperaturgradienten von 100 bis 200°C bei 4°C pro min, gefolgt von 200 bis 270°C bei 35°C pro min analysiert. Der Nachweis erfolgte durch Flammenionisation.
Ein körniges Fettsäuremethylestergemisch (Supelco, Inc., Bellefonte, PA) wurde zum Bestimmen der Retentionszeit für Lauroylfettsäuremethylester und auch zur Quantifizierung der Fettsäurepeaks verwendet.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Bei pH 2 und 8 wurde keine Hydrolyse des Substrats nachgewiesen. Das pH-Optimum wurde als ca. 4–6 bestimmt.
Beispiel 14: Konstruktion der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA-Bibliothek
Myzelien von Fusarium verticillioides wurden ebenso hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Poly A⁺-mRNA wurde aus den Myzelien von Fusarium verticillioides isoliert, und die cDNA wurde aus der Poly A⁺-mRNA mit BstXI- und NotI-Linkern entsprechend synthetisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die cDNA wurde nach den Anweisungen des Herstellers in den Hefeexpressionsvektor pYES 2,0 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) kloniert.
Beispiel 15: Tranformation von Saccharomyces cerevisiae mit der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA-Bibliothek
Kompetente Zellen von Saccharomyces cerevisiae YNG318 wurden unter Anwendung des folgenden Verfahrens hergestellt. Saccharomyces cerevisiae YNG318 wurde in 20 ml YPD-Medium über Nacht bei 30°C wachsen gelassen. Eine ausreichende Impfkultur wurde in 300 ml YPD-Medium übergeführt und 3 h bei 30°C bei 230–250 U/min kultiviert, bis die OD₆₀₀ = 0,2–0,3 betrug. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 U/min für 5 min bei 20°C geerntet. Das Pellet wurde in 50 ml sterilem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde wiederum zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 1,5 ml 1X TE/LiAc suspendiert, und Glycerin wurde bis auf eine Endkonzentration von 15% zugesetzt. Die kompetenten Zellen wurden bei -80°C bis zur Verwendung gelagert.
Die Transformation von Saccharomyces cerevisiae YNG318 wurde mit der in Beispiel 14 beschriebenen Fusarium verticillioides-cDNA-Bibliothek unter Anwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Ein 100-μl-Volumen kompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut und in ein steriles Röhrchen übergeführt, das 10 μl Carrier-DNA (Hefemarker Carrier-DNA; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) enthielt. 1 μg Plasmid-DNA aus Beispiel 14 wurde dem Röhrchen zugesetzt, und das Röhrchen wurde vorsichtig gemischt.
Anschließend wurden dem Röhrchen 0,6 ml sterile PEG/LiAc-Lösung zugesetzt. Das Röhrchen wurde unter Schütteln bei 200 U/min 30 min bei 30°C inkubiert und sodann 15 min bei 42°C Wärmeschock-behandelt. Nach dem Wärmeschock wurde das Röhrchen auf Eis gebracht und sodann 5 s zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 1,5 ml YPD gelöst. Die Zellen wurden bei 30°C unter Schütteln bei 200 U/min 45 min inkubiert. Die Transformanten wurden auf sterilisierte Cellulose-Acetat-Filter ausgestrichen, auf SC Ura-glc-Platten übergeführt und 1 Tag bei 30°C inkubiert. Die Celluloseacetatfilter wurden auf sterilisiertes Hybond-N+-Filter übergeführt, auf SC Uragal-Platten angeordnet und 3 Tage bei 30°C inkubiert.
Insgesamt wurden 89000 Hefe-Transformanten erhalten und unter Anwendung des folgenden Verfahrens auf die Expression der Lysophospholipase-Aktivität gescreent. Hybond-N+-Filter wurden auf Testplatten angeordnet und über Nacht bei 30°C inkubiert. Eine Transformante, die p87YES enthielt, zeigte auf der Testplatte eine Lysophospholipase-Aktivität als einen grünen Halo.
p87YES wurde aus der Hefe-Transformante unter Anwendung des folgenden Verfahrens gewonnen. Die Hefe-Transformante wurde bei 30°C in 1,5 ml YPD-Medium über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und das Pellet wurde in 100 μl STET resuspendiert. Eine Menge von 0,2 g 0,45-mn-Glasperlen wurde zugesetzt, und sie wurden 5 min mit einem Vortex-Verwirbler vermischt. Weitere 100 μl STET wurden zugesetzt, und das Röhrchen wurde 3 min gekocht. Ein 100-μl-Volumen des Überstands wurde in ein frisches Röhrchen übergeführt, und die Plasmid-DNA wurde mit Ethanol ausgefällt. E. coli HB101 wurde unter Anwendung von Standardverfahren mit der ausgefällten Plasmid-DNA transformiert. p87YES wurde aus einer der E. coli-Transformanten isoliert und seguenziert, um die Nukleotidsequenz des Fusarium verticilloides-Lysophospholipase-Gens zu bestimmen.
Beispiel 16: Nukleotid-Sequenzierung und Charakterisierung der Fusarium verticillioides-Lysophospholipase-cDNA
Die DNA-Sequenzierung von p87YES wurde mit einem automatisierten ABI PRISM 320 Genetic Analyzer DNA Sequencer unter Verwendung des Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der Lysophospholipase-Klon codierte ein offenes Leseraster von 1944 bp, der ein Polypeptid von 648 Aminosäuren codierte. Die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO. 15) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 16) sind in den 6A, 6B und 6C gezeigt. Unter Verwendung des SignalP-Programms (Nielsen et al., 1997, supra) wurde ein Signalpeptid von 16 Resten vorhergesagt. Somit besteht die reife Lysophospholipase aus 632 Aminosäuren.
Ein Vergleichsanordnung von Lysophospholipase-Sequenzen wurde unter Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins, 1989, CABIOS 5:151–153) unter Einsatz der LASERGENE^TM MEGALIGN^TM-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden multiplen Anordnungsparametern vorgenommen: Gap penalty 10 und Gap Längen-penalty 10. Die paarweisen Anordnungsparameter waren Ktuple=1, gap penalty=3, windows=5 und diagonals=5.
Die Vergleichsanordnung zeigte, dass sich Fusarium verticillioides-Lysophospholipase die Identitätsregionen mit den Phospholipase-Proteinen Neurospora crassa zu 55,4% (042791), Penicillium notatum zu 49,3% (Swissprot P39457), Saccharomyces cerevisiae zu 37,0% (EMBL L23089) und Torulaspora delbrueckii zu 38,3% (EMBL D32134) teilt. Die Identitäten sind zwischen den Regionen am größten, die wahrscheinlich für die katalytischen und/oder strukturellen Rollen des Enzyms von Bedeutung sind.
Hinterlegung der biologischen Materialien
Die folgenden biologischen Materialien wurden im Sinne des Budapester Vertrags mit der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604 und dem Centaalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Bos 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, hinterlegt, und ihnen wurden die folgenden Zugangsnummern gegeben:
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung soll im Umfang nicht durch die hier offenbarten speziellen Ausführungsformen eingeschränkt sein, da diese Ausführungsformen als Erläuterungen der verschiedenen Aspekte der Erfindung beabsichtigt sind. Alle entsprechenden Ausführungsformen sollen im Umfang dieser Erfindung liegen. In der Tat werden den Fachleuten aus der vorhergehenden Beschreibung, zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen, verschiedene Modifikationen der Erfindung klar. Solche Modifikationen sollen ebenfalls in den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen. Im Konfliktfall kontrolliert die vorliegende Offenbarung einschließlich der Definitionen.
Es sind hier verschiedene Druckschriften zitiert, deren Offenbarungen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind. SEQUENZLISTUNG

Claims

Polypeptid, das Lysophospholipase-Aktivität besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 65% Identität mit den Aminosäuren 38 bis 654 von SEQ ID Nr:2 besitzt; b) einer allelischen Variante von a); und c) einem Fragment von a) oder b), wobei das Fragment Lysophospholipaseaktivität besitzt.
Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Nukleinsäurekonstrukt, umfassend die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, funktionell verbunden mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen, die die Herstellung des Polypeptids in einem geeigneten Expressionswirt steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend a) Kultivieren der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die zur Herstellung des Polypeptids geeignet sind; und b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung einer Mutante einer Elternzelle, das das Unterbrechen oder Entfernen einer Nukleinsäuresequenz umfasst, die für das Polypeptid nach Anspruch 1 oder eine Kontrollsequenz davon kodiert, was zum Ergebnis hat, dass die mutierte Zelle weniger Polypeptid herstellt als die Elternzelle.
Nukleinsäurekonstrukt, umfassend ein Gen, das für ein Protein kodiert, das funktionell mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für ein Propeptid bestehend aus den Nukleotiden 151 bis 213 von SEQ ID Nr:1 kodiert, wobei das Gen zu den ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen fremdartig ist.
Verfahren, um den Phospholipidgehalt in einem Speiseöl zu reduzieren, umfassend ein Behandeln des Öls mit dem Polypeptid nach Anspruch 1, um das Phospholipid zu hydrolysieren, und das Abtrennen des hydrolysierten Phospholipids vom Öl.
Verfahren, um den Phospholipidgehalt einer wässrigen Kohlehydratlösung oder eines Schlamms zu reduzieren, umfassend ein Behandeln der wässrigen Kohlehydratlösung oder des Schlamms mit dem Polypeptid nach Anspruch 1, um das Phospholipid zu hydrolysieren, und das Abtrennen des hydrolysierten Phospholipids von der wässrigen Kohlehydratlösung oder dem Schlamm.
Verfahren zur Herstellung eines Teiges oder gebackenen Produkts, das aus Teig hergestellt wird, umfassend ein Aufnehmen des Polypeptids nach Anspruch 1 in den Teig.