DE69930293T2

DE69930293T2 - Verwendung einer xylanase zur herstellung eines lebensmittels

Info

Publication number: DE69930293T2
Application number: DE69930293T
Authority: DE
Inventors: Ole Sibbesen; Frisbaek Jens SÖRENSEN
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: GB0116552D0; DE69930293D1; AU1676600A; GB2362386B; FR2788781A1; ATE319816T1; NZ512127A; PT1141254E; ES2258345T3; JP2011092199A; GB2362386A; WO2000039289A3; FR2902974B1; EP1141254A1; AU769871B2; EP1141254B1; FR2788781B1; CN1342197A; FR2902974A1; KR20010081094A

Description

HINTERGRUND DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung und Charakterisierung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors, der in Weizenmehl vorliegt, sowie dessen Wirkung auf verschiedene Xylanasen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Xylanasen, die unter Verwendung des Inhibitors anhand einer Durchmusterung identifiziert werden, und so identifizierte neue Xylanasen.
STAND DER TECHNIK
Xylanasen werden seit mehreren Jahren im Bäckereihandwerk verwendet.
In dieser Hinsicht ist bekannt, daß Weizenmehl Arabinoxylan enthält, welches aus den Endosperm-Zellwänden stammt. Die Menge an Arabinoxylan in dem Mehl variiert in Abhängigkeit vom Ursprung des Mehls – siehe beispielsweise Rouau et al., Journal of Cereal Science (1994), 19, 259–272 Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-Making Quality of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties; Fincher and Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Band VIII (Why Pomeranz, Hrsg.) AACC, St. Paul Minnesota, 207–295, und Meuser und Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P.J. Frasier und T. Gillard, Hrsg.) Royal Society of Chemistry, London, 42–61. Typischerweise kann die Menge an Arabinoxylan von 2–5% ((w/w) auf Basis des Trockengewichts des Mehls) variieren.
Fincher und Stone (1986) berichten, daß 70% der Polysaccharide in den Endosperm-Zellwänden Arabinoxylan sind. Ein charakteristisches Merkmal von Arabinoxylan ist seine Fähigkeit, an Wasser zu binden. Ein Teil des Arabinoxylans ist wasserunlösliches Pentosan (WIP) und ein Teil ist wasserlösliches Pentosan (WSP). Die Ergebnisse von Experimenten haben einen Zusammenhang zwischen dem Abbau von WIP zu wasserlöslichen Polymeren mit hohem Molekulargewicht (HMW) und dem Brotvolumen gezeigt.
Es ist bekannt, daß bei der Herstellung eines Bäckereiprodukts die Verwendung einer Xylanase in einer geeigneten Menge zu einem stabileren Teigsystem (welches typischerweise Salz, Mehl, Hefe und Wasser umfaßt) und einem besseren Volumen von z.B. aufgegangenem Brot führen kann.
In dieser Hinsicht sollte, um das Brotvolumen zu steigern, eine gute Xylanase WIP solubilisieren unter Erhalt einer gesteigerten Viskosität in der Teigflüssigkeit ohne weiteren Abbau von WSP zu Xyloseoligomeren. Es wird angenommen, daß dieser Abbau von WIP zu WSP mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) für die Teigeigenschaften nachteilig ist und zu Klebrigkeit führen kann (Rouau et al. und McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349–354).
Die US-A-5,306,633 offenbart eine Xylanase, die von einem Bacillus subtilis-Stamm erhalten wurde. Offenbar kann diese Xylanase die Konsistenz verbessern und das Volumen von Brot und Backwaren, die diese enthalten, erhöhen.
Eine weitere Xylanase von Bacillus subtilis wurde isoliert und sequenziert (siehe Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. und Yaguchi, M. A xylanase gene from Bacillus subtilis. nucleotide sequence and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201–206 (1986)).
Es wird nun seit einiger Zeit in Erwägung gezogen, daß bakterielle Xylanasen sehr klebrigen Teig produzieren. Somit würde man normalerweise erwarten, daß auch die Xylanasen von Bacillus subtilis – wie z.B. diejenigen aus der US-A-5,306,633 – einen sehr klebrigen Teig liefern.
Klebrigkeit verursachende Enzyme aus dem Stand der Technik mußten in sorgfältig kontrollierten Mengen verwendet werden, damit Klebrigkeit die Bearbeitung nicht in einem solchen Ausmaß negativ beeinflussen konnte, daß eine effektive kommerzielle Verarbeitung beeinträchtigt wurde. Die Notwendigkeit einer sorgfältigen Kontrolle der Dosierung verhinderte jedoch die direkte Zugabe von Xylanase zu Mehl vor der Herstellung des Teiges. Es war daher bei Systemen des Standes der Technik notwendig, die Xylanase während der Herstellung des Teiges in streng kontrollierter Weise zuzugeben.
Bis heute werden beim Backen typischerweise Pilzxylanasen verwendet. Beispielsweise lehren J. Maat et al. (Xylans and Xylanases, hrsg. von J. Visser et al., 349–360, Xylanases and their application in bakery) eine β-1,4-Xylanase, die mittels eines Aspergillus niger var. awarmori-Stamms erzeugt wurde. Laut Aussage dieser Autoren ist die Pilzxylanase wirksam beim Erhöhen des spezifischen Volumens von Broten, ohne eine negative Auswirkung auf die Verarbeitbarkeit des Teiges (Klebrigkeit des Teiges) zu verursachen, wie sie bei Xylanasen zu beobachten sind, die von anderen Pilz- oder Bakterienquellen abgeleitet sind.
Von W. Debyser et al. (J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153–156, 1997 Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat) wurde vorgeschlagen, daß Xylanaseinhibitoren in Weizen vorliegen können. Der von W. Debyser et al. diskutierte Inhibitor war nicht isoliert. Des weiteren beschrieben W. Debyser et al. nicht, ob der Inhibitor endogen oder mikrobiologisch ist. Außerdem wurden für diesen Inhibitor keine chemischen Daten angegeben.
Das Vorliegen von Xylanaseinhibitor in Weizenmehl wurde kürzlich auch von X. Rouau und A. Surget (Journal of Cereal Science, 28, (1998) 63–70, Evidence for the Presence of a Penfosanase Inhibitor in Wheat Flours) diskutiert. Ähnlich wie Debyser et al. glaubten Rouau und Surget, die Existenz einer thermolabilen Verbindung in der löslichen Fraktion von Weizenmehlen entdeckt zu haben, die die Wirkung einer zugegebenen Pentosanase beschränkte. Ähnlich wie Debyser et al. isolierten diese Autoren ebenfalls keinen Inhibitor und waren nicht in der Lage zu bestimmen, ob der Inhibitor endogen oder mikrobiellen Ursprungs ist. Gleichermaßen wurden auch für diesen Inhibitor keine chemischen Daten vorgelegt.
Ein bekanntes Problem im Stand der Technik besteht daher darin, wie Backwaren aus einem Teig hergestellt werden können, der keine negativen Verarbeitungseigenschaften aufweist. Ein spezielleres Problem besteht darin, einen Teig bereitzustellen, der nicht klebrig ist, d.h. einen Teig, der nicht so klebrig ist, daß er zu Problemen bei der Bearbeitung und Verarbeitung führt.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, eine Lösung für diese Probleme zu liefern.
ZUSAMMENFASSENDE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen und den folgenden Erläuterungen ausgeführt.
Kurz gefaßt beziehen sich einige Aspekte der vorliegenden Erfindung auf:

1. neue Verwendungsformen von Xylanasen.
2. Nahrungsmittel, die mit Xylanasen hergestellt wurden.

Andere Aspekte, die die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung und/oder die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung betreffen, umfassen folgende: ein Konstrukt, welches die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, einen Vektor, welcher die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, ein Plasmid, welches die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, ein Gewebe, welches die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, ein Organ, welches die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, einen transformierten Wirt, welcher die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann, einen transformierten Organismus, welcher die Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfaßt oder diese exprimieren kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zum Exprimieren derselben, wie z.B. die Expression in einem Mikroorganismus, einschließlich Verfahren zum Übertragen derselben.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von den Lehren der WO-A-98/49278 unter anderem dadurch, daß diese PCT-Patentanmeldung im Hinblick auf den dort offenbarten proteinischen Inhibitor minimale Sequenzinformationen enthält.
Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Der Einfachheit halber sind für die Aspekte der vorliegenden Erfindung allgemein anwendbare Lehren in den Abschnitten mit den Titeln "Allgemeine Definitionen" und "Allgemeine Lehren" zu finden. Die Lehren unter jedem Abschnitt sind jedoch nicht notwendigerweise auf den jeweiligen Abschnitt beschränkt.
ALLGEMEINE DEFINITIONEN
Der Begriff "Weizenmehl", wie er hierin verwendet wird, ist ein Synonym für das fein gemahlene Mehl von Weizen. Vorzugsweise bedeutet der Begriff jedoch Mehl, welches aus Weizen per se und nicht aus einem anderen Getreide erhalten wurde. Somit bedeuten, wenn es nicht anders angegeben ist, Bezugnahmen auf "Weizenmehl", wie es hierin verwendet wird, vorzugsweise Bezugnahmen auf Weizenmehl per se sowie auf Weizenmehl, das in einem Medium, wie z.B. einem Teig, vorliegt.
Der Begriff "Xylanase" wird in seinem üblichen Sinn verwendet – wie z.B. als ein Enzym, das unter anderem in der Lage ist, die Depolymerisation von Arabinoxylan, welches in Weizen vorliegen kann, zu katalysieren (z.B. ein Enzym, welches unter anderem in der Lage ist, die Solubilisierung von WIP und die Depolymerisation von WSP, die in Weizen vorliegen können, zu katalysieren).
Ein Test zur Bestimmung der Endo-β-1,4-xylanase-Aktivität wird später beschrieben. Aus Gründen der Einfachheit wird dieser Test als "Xylanasetest" bezeichnet.
Begriff "Nukleotidsequenz" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfaßt genomische DNA, cDNA, rekombinante DNA (d.h. DNA, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde), synthetische DNA und RNA sowie Kombinationen davon.
Vorzugsweise bedeutet der Begriff "Nukleotidsequenz" DNA.
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können einzel- oder doppelstrangig sein.
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können synthetische oder modifizierte Nukleotide beinhalten. Eine Anzahl verschiedener Arten der Modifikation von Oligonukleotiden ist im Stand der Technik bekannt. Diese beinhalten Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Gerüste und die Hinzufügung von Acridin- oder Polylysinketten am 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Es versteht sich, daß für Zwecke der vorliegenden Erfindung die hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen mittels irgendeines im Stand der Technik verfügbaren Verfahrens modifiziert werden können. Solche Modifikationen können vorgenommen werden, um die Aktivität oder die Lebensdauer von Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in vivo zu verbessern.
Die Begriffe "Variante" oder "Homologes" in Bezug auf die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung sind synonym zu Allelenvariationen der Sequenzen.
Insbesondere kann der Begriff "Homologie", wie er hierin verwendet wird, mit dem Begriff "Identität" gleichgesetzt werden. Hier kann die Sequenzhomologie in Bezug auf die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung durch einen einfachen "Augen"-Vergleich (d.h. einen strengen Vergleich) irgendeiner oder mehrerer der Sequenzen mit einer anderen Sequenz bestimmt werden, um zu sehen, ob diese andere Sequenz wenigstens 75% Identität zu der Sequenz (den Sequenzen) besitzt. Die relative Sequenzhomologie (d.h. Sequenzidentität) kann ebenfalls mittels kommerziell erhältlicher Computerprogramme, die den Prozentsatz an Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen können, bestimmt werden. Ein typisches Beispiel für ein solches Computerprogramm ist CLUSTAL.
Somit können Homologievergleiche mit dem Auge vorgenommen werden. Es ist jedoch üblicher, sie mit Hilfe leicht erhältlicher Sequenzvergleichsprogramme durchzuführen. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können den Prozentsatz an Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen.
Der Prozentsatz an Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird an der anderen Sequenz ausgerichtet, und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondierenden Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, und zwar ein Rest nach dem anderen. Dies wird als "lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kleine Zahl an Resten durchgeführt (beispielsweise weniger als 50 zusammenhängende Aminosäuren).
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, wird dabei nicht berücksichtigt, daß beispielsweise eine Insertion oder Deletion in einem ansonsten identischen Paar von Sequenzen dazu führt, daß die nachfolgenden Aminosäurereste außer Ausrichtung gebracht werden, was potentiell zu einer starken Reduzierung des Prozentsatzes an Homologie führt, wenn ein globales Alignment vorgenommen wird. Folglich sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren dafür ausgestaltet, optimale Alignments zu erzeugen, die mögliche Insertionen und Deletionen in Betracht ziehen, ohne den Gesamtbetrag an Homologie übermäßig zu beeinträchtigen. Dies wird erzielt, indem "Lücken" in das Sequenzalignment eingefügt werden, um zu versuchen, die lokale Homologie zu maximieren.
Diese komplexeren Verfahren weisen jedoch jeder Lücke in dem Alignment "Lücken-Strafpunkte" zu, so daß bei derselben Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenzalignment mit so wenig Lücken wie möglich – was eine größere Verwandtschaft zwischen den beiden verglichenen Sequenzen widerspiegelt – ein besseres Ergebnis erzielt als eines mit vielen Lücken. Typischerweise werden "affine Lücken-Kosten" verwendet, die für das Vorliegen einer Lücke relativ hohe Kosten und eine kleinere Anzahl an Strafpunkten für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke verursachen. Dies ist das am häufigsten eingesetzte Lücken-Bewertungssystem. Eine große Anzahl an Lücken-Strafpunkten wird natürlich zu optimierten Alignments mit weniger Lücken führen. Die meisten Alignment-Programme lassen eine Modifizierung der Lücken-Strafpunkte zu. Es ist jedoch bevorzugt, die Standardwerte zu verwenden, wenn eine solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Beispielsweise beträgt bei Verwendung des GCG Wisconsin Bestfit-Pakets (siehe unten) die standardmäßige Anzahl an Lücken-Strafpunkten bei Aminosäuresequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Erweiterung.
Die Berechnung des maximalen Prozentsatzes an Homologie erfordert daher zunächst die Erzeugung eines optimalen Alignments unter Berücksichtigung von Lücken-Strafpunkten. Ein für ein solches Alignment geeignetes Computerprogramm ist das GCG Wisconsin Bestfit-Paket (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele anderer Software, die Sequenzvergleiche durchführen können, umfassen das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibid – Kapitel 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403–410) und die GENE-WORKS-Suite von Vergleichswerkzeugen, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für Offline- und Online-Recherchen verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibid, Seiten 7–58 bis 7–60). Es ist jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
Obwohl der endgültige Prozentsatz an Homologie im Hinblick auf die Identität gemessen werden kann, basiert der Ausrichtungsprozeß an sich nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine abgestufte Ähnlichkeits-Bewertungsmatrix verwendet, die auf Basis der chemischen Ähnlichkeit oder des evolutionären Abstands jedem Paarvergleich eine Bewertung zuordnet. Ein Beispiel einer solchen üblicherweise verwendeten Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Standardmatrix für das BLAST-Programmpaket. GCG Wisconsin-Programme verwenden im allgemeinen entweder die allgemein bekannten Standardwerte oder eine übliche Symbolvergleichstabelle, falls eine solche geliefert wird (für weitere Einzelheiten siehe Benutzerhandbuch). Es ist bevorzugt, die allgemein bekannten Standardwerte für das GCG-Paket oder im Falle einer anderen Software, wie z.B. BLOSUM62, die Standardmatrix zu verwenden.
Sobald die Software ein optimales Alignment erzeugt hat, ist es möglich, den Prozentsatz an Homologie, vorzugsweise den Prozentsatz an Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs aus und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Vorzugsweise werden Sequenzvergleiche unter Verwendung des BLAST-Suchalgorithmus durchgeführt, der unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST bereitgestellt wird und die Standardparameter verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die zu den hierin angegebenen Sequenzen oder irgendeinem Derivat, Fragment oder Derivat davon komplementär sind. Wenn die Sequenz zu einem Fragment davon komplementär ist, kann diese Sequenz als Sonde verwendet werden, um ähnliche codierende Sequenzen in anderen Organismen zu identifizieren usw.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, an die hierin angegebenen Sequenzen oder irgendein Derivat, Fragment oder Derivat davon zu hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, an die Sequenzen, die zu den hierin angegebenen Sequenzen komplementär sind, oder irgendein Derivat, Fragment oder Derivat davon zu hybridisieren.
Der Begriff "komplementär" umfaßt auch Nukleotidsequenzen, die an die Nukleotidsequenzen der codierenden Sequenz hybridisieren können.
Der Begriff "Variante" umfaßt auch Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die in der Lage sind, an die hierin angegebenen Nukleotidsequenzen zu hybridisieren.
Vorzugsweise umfaßt der Begriff "Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 Na₃-Citrat, pH 7,0}) an die hierin angegebenen Nukleotidsequenzen zu hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, die an die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung (einschließlich Sequenzen, die zu den hierin angegebenen komplementär sind) hybridisieren können.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, die zu Sequenzen, die an die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung hybridisieren können (einschließlich Sequenzen, die zu den hierin angegebenen komplementär sind), komplementär sind.
Der Begriff "Hybridisierung", wie er hierin verwendet wird, soll "den Vorgang, durch den ein Strang von Nukleinsäuren sich mittels Basenpaarung mit einem komplementären Strang verbindet", beinhalten (Coombs J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) sowie den Vorgang der Vervielfältigung, wie er in Polymerase-Kettenreaktionstechnologien stattfindet, wie es in Dieffenbach CW und GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) beschrieben ist.
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfaßt auch Polynukleotidsequenzen, die in der Lage sind, unter Bedingungen mit mittlerer bis maximaler Stringenz an die hierin angegebenen Nukleotidsequenzen zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes, wie es in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA) gelehrt wird, und verleihen eine definierte "Stringenz", wie es unten ausgeführt wird.
Eine maximale Stringenz tritt typischerweise bei etwa Tm-5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) auf, eine hohe Stringenz bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb der Tm, eine mittlere Stringenz bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb der Tm und eine niedrige Stringenz bei etwa 20°C bis 25°C unterhalb des Tm. Für Fachleute auf dem Gebiet versteht es sich, daß eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz verwendet werden kann, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung bei mittlerer (oder niedriger) Stringenz verwendet werden kann, um ähnliche oder verwandte Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,2×SSC) an die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung hybridisieren können.
ENDOGENER ENDO-β-1,4-XYLANASE-INHIBITOR
Endogene Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitoren, die aus Weizenmehl erhältlich sind, werden hierin als Referenz angegeben.
In unseren Studien haben wir herausgefunden, daß der Inhibitor ein Dipeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kDa (gemessen durch SDS oder MS) und einem pl von etwa 8 bis etwa 9,5 ist.
Der hierin beschriebene Inhibitor kann in isolierter Form und/oder in im wesentlichen reiner Form vorliegen. Hier bedeutet der Begriff "isoliert", daß der Inhibitor nicht in seiner natürlichen Umgebung vorliegt.
Bislang hat die Sequenzanalyse ergeben, daß der Inhibitor wenigstens eine oder mehrere der Sequenzen hat, die als SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 und/oder SEQ ID NO:19 angegeben sind.
Somit wird hierin ein Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitor beschrieben, der wenigstens eine oder mehrere der Sequenzen, die als SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 und/oder SEQ ID NO:19 angegeben sind, oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon umfaßt.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf den Inhibitor der vorliegenden Erfindung umfassen jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer (oder mehrerer) Aminosäure(n) in oder zu der Sequenz, was dazu führt, daß die resultierende Aminosäure eine Xytanase hemmende Wirkung hat und vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität besitzt wie ein Inhibitor, der wenigstens eine oder mehrere der Sequenzen umfaßt, die als SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 und/oder SEQ ID NO:19 angegeben sind. Insbesondere umfaßt der Begriff "Homologes" Homologie im Hinblick auf die Struktur und/oder die Funktion, was dazu führt, daß der resultierende Inhibitor eine Xylanase hemmende Aktivität hat und vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität besitzt wie ein Inhibitor, der wenigstens eine oder mehrere der Sequenzen umfaßt, die als SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 und/oder SEQ ID NO:19 angegeben sind. In Bezug auf die Sequenzhomologie (d.h. Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 80%, noch bevorzugter wenigstens 85% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll angegebenen Sequenz. Ganz besonders bevorzugt besteht wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll gezeigten Sequenz.
Ein mutmaßliches Beispiel einer Variante des Inhibitors der vorliegenden Erfindung weist wenigstens eine oder mehrere der Sequenzen auf, die als SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 angegeben sind.
Die hierin beschriebenen Inhibitoren sind aus einer Reihe von Gründen vorteilhaft.
Beispielsweise ist es nun, nachdem die chemische Identität eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors bekannt ist, möglich, die Menge an Inhibitor in beispielsweise einem Weizenmehl zu bestimmen. Der Einfachheit halber nennen wir dieses Verfahren das "Verfahren zur Bestimmung der Inhibitormenge".
Das Verfahren zur Bestimmung der Inhibitormenge erlaubt es, eine oder mehrere geeignete Xylanasen für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl auszuwählen und/oder geeignete Mengen einer oder mehrerer Xylanasen für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl auszuwählen.
Somit wird hierin auch ein Verfahren beschrieben, welches folgendes umfaßt: (a) Bestimmen der Menge oder des Typs des Inhibitors in einem Weizenmehl, (b) Auswählen einer geeigneten Xylanase für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und/oder Auswählen einer geeigneten Menge einer Xylanase für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und (c) Hinzufügen der geeigneten Xylanase und/oder der geeigneten Menge der Xylanase zu dem Weizenmehl.
Hierin wird auch ein Verfahren beschrieben, welches folgendes umfaßt: (a) Bestimmen der Menge oder des Typs des Inhibitors in einem Weizenmehl, (b) Auswählen eines geeigneten Xylanaseinhibitors für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und/oder Auswählen einer geeigneten Menge eines Xylanaseinhibitors für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und (c) Hinzufügen des geeigneten Xylanaseinhibitors und/oder der geeigneten Menge des Xylanaseinhibitors zu dem Weizenmehl.
Des weiteren wird hierin ein Verfahren beschrieben, welches folgendes umfaßt: (a) Bestimmen der Menge oder des Typs des Inhibitors in einem Weizenmehl, (b) Auswählen einer geeigneten Xylanase und eines geeigneten Xylanaseinhibitors für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und/oder Auswählen einer geeigneten Menge eines Xylanaseinhibitors für die Hinzufügung zu dem Weizenmehl und (c) Hinzufügen der geeigneten Xylanase und des geeigneten Xylanaseinhibitors und/oder der geeigneten Menge des Xylanaseinhibitors zu dem Weizenmehl.
Die Bestimmung der Menge an Inhibitor kann mittels chemischer Standardtechniken vorgenommen werden, wie z.B. durch Analyse von Festkörper-NMR-Spektren. Die Menge an Inhibitor kann sogar unter Verwendung von Xylanaseenzymen bestimmt werden, von denen bekannt ist, daß sie durch den Inhibitor in nachteiliger Weise beeinflußt werden. Bei diesem letzten Aspekt wäre es möglich, eine Probe des Weizenmehls zu entnehmen und es zu einer bekannten Menge einer solchen Xylanase hinzuzugeben. Zu einem bestimmten Zeitpunkt kann die Aktivität der Xylanase bestimmt werden, wobei die resultierende Aktivität dann mit einer Menge an Inhibitor in dem Weizenmehl in Beziehung gesetzt werden kann.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der Kombination aus einer Xylanase und dem Inhibitor als ein Mittel zum Messen und/oder Bestimmen der Menge an Inhibitor in einer Weizenmehlprobe.
Antikörper gegen den Inhibitor können verwendet werden, um Weizenmehlproben auf das Vorliegen des Inhibitors der vorliegenden Erfindung zu untersuchen. Die Antikörper können sogar verwendet werden, um Mengen des Inhibitors aus einer Weizenmehlprobe zu isolieren.
TESTVERFAHREN ZUM BESTIMMEN DER WIRKUNG DES β-1,4-XYLANASEINHIBITORS AUF VERSCHIEDENE XYLANASEN
Es gibt eine zusätzliche wichtige Verwendungsmöglichkeit für den Inhibitor der vorliegenden Erfindung.
In dieser Hinsicht könnte der Inhibitor in einem Test/einer Untersuchung verwendet werden, um Xylanasen zu identifizieren, die durch den Inhibitor beeinflußt werden.
Beispielsweise kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, nach einer Xylanase zu screenen, die eine geringe Resistenz gegen den Inhibitor aufweist, d.h. die kaum resistent ist.
Bei einem Aspekt kann der Inhibitor in einem Test/einer Untersuchung verwendet werden, um Xylanasen zu identifizieren, die eine mäßige (mittlere) Resistenz gegen den Inhibitor aufweisen, d.h. die halbwegs resistent sind.
Bei einem Aspekt kann der Inhibitor in einem Test/einer Untersuchung verwendet werden, um Xylanasen zu identifizieren, die eine hohe Resistenz gegenüber dem Inhibitor aufweisen.
Ein geeignetes Protokoll zur Bestimmung des Ausmaßes der Hemmung durch den Inhibitor wird später beschrieben. Der Einfachheit halber nennen wir dieses Protokoll "Inhibitortestprotokoll".
Ein Verfahren zur Bestimmung des Ausmaßes der Resistenz einer Xylanase gegen einen Xylanaseinhibitor wird hierin ebenfalls beschrieben, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Inkontaktbringen einer interessierenden Xylanase mit dem Inhibitor und (b) Bestimmen, ob der Inhibitor die Aktivität der interessierenden Xylanase hemmt. Der Einfachheit halber nennen wir dieses Verfahren das "Inhibitortestverfahren".
Hier bedeutet der Begriff "resistent", daß die Aktivität der Xylanase durch den Inhibitor nicht vollständig gehemmt wird. Mit anderen Worten, der Inhibitor kann in einem Test/einer Untersuchung verwendet werden, um Xylanasen zu identifizieren, die durch den Inhibitor nicht nachteilig beeinflußt werden.
Somit ist der Begriff "Ausmaß der Resistenz" in Bezug auf die Xylanase gegenüber dem Xylanaseinhibitor synonym zu dem Ausmaß der Nicht-Hemmung der Aktivität einer Xylanase durch den Xylanaseinhibitor. Daher entspricht eine Xylanase mit einem hohen Ausmaß an Resistenz gegenüber dem Xylanaseinhibitor einem hohen Ausmaß an Nicht-Hemmung einer Xylanase durch den Xylanaseinhibitor.
Darüber hinaus wird hierin auch ein Verfahren gelehrt, welches die Stufen umfaßt, bei denen man (a) das Inhibitortestverfahren durchführt, (b) eine oder mehrere Xylanasen mit einem hohen (oder mittleren oder niedrigen) Grad an Resistenz gegenüber dem Inhibitor identifiziert und (c) eine Menge dieser einen oder dieser mehreren identifizierten Xylanasen herstellt.
Geeignete identifizierte Xylanasen können dann verwendet werden, um ein Nahrungsmittel, insbesondere einen Teig für die Herstellung eines Bäckereiprodukts, herzustellen.
Darüber hinaus ist es durch Identifizieren einer Xylanase, die in einem gewissen Maße gegenüber dem Inhibitor resistent ist (d.h. einer Xylanase, die nicht so stark gehemmt wird wie andere Xylanasen), möglich, eine geringere Menge dieser identifizierten Xylanase zu einem Medium für dessen anschließende Verwendung zuzugeben. Der Endgebrauch der Xylanasen kann eines oder mehrere von der Herstellung von Nahrungsmitteln, der Herstellung von Proteinen und Stärke, der Papierherstellung und der Zellstoffverarbeitung usw. umfassen.
Des weiteren wird hierin auch ein Verfahren gelehrt, welches die Stufen umfaßt, bei denen man (a) das Inhibitortestverfahren durchführt, (b) eine oder mehrere Xylanasen mit einem hohen (oder mittleren oder niedrigen) Grad an Resistenz gegenüber dem Inhibitor identifiziert und (c) einen Teig herstellt, der die eine oder die mehreren identifizierten Xylanasen enthält.
Im Verlauf der mit der vorliegenden Erfindung in Beziehung stehenden Experimente fanden wir überraschenderweise heraus, daß bakterielle Xylanasen dem Inhibitor gegenüber resistent sein konnten, und zwar in dem Sinne, daß ihre Aktivität nicht vollständig aufgehoben wurde. In einigen Fällen zeigten die Xylanasen gegenüber dem Inhibitor eine sehr vorteilhafte Resistenz.
TESTVERFAHREN ZUM BESTIMMEN DER WIRKUNG VERSCHIEDENER XYLANASEN IN TEIGEN
Wir haben überraschend herausgefunden, daß, wenn einige Bakterienxylanasen, die als für das Inhibitortestverfahren geeignet identifiziert worden waren, in einem Teiggemisch vorlagen, das Teiggemisch nicht so klebrig war wie ein Teiggemisch, welches eine Pilzxylanase enthielt. Diese Ergebnisse waren im Hinblick auf die Lehren des Standes der Technik völlig unerwartet.
Ein weiteres Testverfahren zum Identifizieren einer Bakterien-Xylanase oder einer Mutante davon ist für die Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet. Das Verfahren umfaßt (a) das Einbringen einer interessierenden Bakterien-Xylanase in ein Teiggemisch und (b) das Bestimmen der Klebrigkeit des resultierenden Teiggemischs, so daß die Bakterien-Xylanase oder die Mutante davon für die Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet ist, wenn die resultierende Teigmischung eine Klebrigkeit aufweist, die geringer ist als die einer ähnlichen Teigmischung, die eine Pilzxylanase enthält, wie es hierin ebenfalls gelehrt wird. Der Einfachheit halber bezeichnen wir dieses Verfahren als das "Klebrigkeitstestverfahren".
Des weiteren wird hierin ein Verfahren gelehrt, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Durchführen des Klebrigkeitstestverfahrens, (b) Identifizieren einer oder mehrerer Xylanasen, die für die Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet sind, und (c) Herstellen einer Menge dieser einen oder dieser mehreren identifizieren Xylanasen.
Ein geeignetes Protokoll zur Bestimmung der Klebrigkeit eines Teiges wird später beschrieben. Der Einfachheit halber bezeichnen wir dieses Protokoll als das "Klebrigkeitsprotokoll". Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Teig, der eine Xylanase gemäß der vorliegenden Erfindung enthält und der weniger klebrig ist als ein Teig, der eine Pilzxylanase enthält, gegebenenfalls als "nicht-klebriger Teig" bezeichnet werden.
Wenn eine Bakterien-Xylanase vorteilhafte Eigenschaften besitzt – indem sie einen Teig erzeugt, der nicht so klebrig ist wie ein Teig, der eine Pilzxylanase enthält –, kann diese Xylanase für die Herstellung eines Nahrungsmittels, wie z.B. eines Teigs zur Herstellung eines Bäckereiprodukts, verwendet werden.
Des weiteren wird hierin ein Verfahren gelehrt, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Durchführen des Klebrigkeitstestverfahrens, (b) Identifizieren einer oder mehrerer Xylanasen, die für die Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet sind, und (c) Herstellen eines Teiges, der die eine oder die mehreren identifizierten Xylanasen enthält.
TESTVERFAHREN ZUM BESTIMMEN DER WIRKUNG VON GLUCANASE(N) AUF TEIGEIGENSCHAFTEN VON TEIGEN, DIE XYLANASEN ENTHALTEN KÖNNEN
Im Verlauf der mit der vorliegenden Erfindung in Beziehung stehenden Experimente haben wir auch herausgefunden, daß das Vorliegen von Glucanaseenzymen in bestimmten Mengen eine nachteilige Wirkung auf die Xylanasen haben könnte.
Somit ist es bei einem Aspekt vorteilhaft, wenn bei der Xylanaseherstellung keine nachteiligen Mengen an Glucanaseenzymen vorhanden sind – wie z.B. in dem Medium, das verwendet wird, um die Xylanaseenzyme herzustellen oder zu extrahieren. Weiterhin ist es für einige Aspekte vorteilhaft, wenn keine nachteiligen Mengen an Glucanaseenzymen in einem Medium vorliegen, welches zur Herstellung eines Nahrungsmittels verwendet werden soll und welches die Xylanase enthält. Hier bedeutet der Begriff "nachteilige Menge", daß eine solche Menge an Glucanase vorhanden ist, daß die Vorteile der Xylanase von der nachteiligen Wirkung der Glucanaseenzyme überdeckt werden.
Daher wird hierin ein weiteres Testverfahren zum Identifizieren einer Xylanasezusammensetzung (z.B. einer Xylanasepräparation) oder eines Mediums, in dem eine Xylanase hergestellt werden soll, oder eines Mediums, zu dem eine für die Verwendung zur Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignete Xylanase zugegeben werden soll, gelehrt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, die die interessierende Xylanase enthält, oder eines Mediums, in dem die Xylanase hergestellt werden soll, oder eines Mediums, zu dem die Xylanase zugegeben werden soll, und (b) Bestimmen des Vorliegens eines aktiven Glucanaseenzyms (aktiver Glucanaseenzyme) in der Zusammensetzung oder dem Medium, so daß, wenn höchstens eine geringe Menge an aktivem (aktiven) Glucanaseenzym(en) in der Zusammensetzung oder dem Medium vorliegt, diese Zusammensetzung oder dieses Medium für die Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet ist. Der Einfachheit halber bezeichnen wir dieses Verfahren als das "Glucanasetestverfahren".
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Durchführen des Glucanasetestverfahrens, (b) Identifizieren einer oder mehrerer Zusammensetzungen oder eines Mediums oder mehrerer Medien, das bzw. die für eine Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet ist bzw. sind, (c) Herstellen einer Menge dieser einen oder dieser mehreren identifizierten Zusammensetzungen oder dieses einen identifizierten Mediums oder dieser mehreren identifizierten Medien.
Ein geeignetes Protokoll zur Bestimmung der Aktivität von Glucanasen wird später beschrieben. Der Einfachheit halber bezeichnen wir dieses Protokoll als das "Glucanaseprotokoll".
Wenn die Zusammensetzung oder das Medium vorteilhafte Eigenschaften aufweist – in dem Sinne, daß die mit der Xylanase assoziierten vorteilhaften Wirkungen durch das Vorliegen nachteiliger Mengen an Glucanaseenzymen nicht vollständig überdeckt werden –, so kann diese Zusammensetzung oder dieses Medium für die Herstellung eines Nahrungsmittels, vorzugsweise eines Teiges für die Herstellung eines Bäckereiprodukts, verwendet werden.
Somit wird hierin auch ein Verfahren gelehrt, welches die folgenden Stufen umfaßt: (a) Durchführen des Glucanasetestverfahrens, (b) Identifizieren einer oder mehrerer identifizierter Zusammensetzungen oder eines oder mehrerer identifizierter Medien, die für eine Verwendung bei der Herstellung eines gebackenen Nahrungsmittels geeignet sind, und (c) Herstellen eines Teiges, der die eine oder die mehreren identifizierten Zusammensetzungen oder das eine oder die mehreren identifizierten Medien enthält.
Somit wird hierin auch eine Xylanasepräparation beschrieben, wobei die Xylanasepräparation im wesentlichen frei von Glucanaseenzym(en) ist.
In dieser Hinsicht kann die Xylanasepräparation aus einer anfänglichen Präparation hergestellt werden, aus der im wesentlichen das (die) gesamte(n) Glucanaseenzym(e), das (die) vorhanden sein kann (können), entfernt wurde(n) oder in der sogar die Aktivität des Glucanaseenzyms (der Glucanaseenzyme) unterdrückt wird oder eliminiert wurde. Techniken, um dies zu erzielen, könnten die Verwendung von Antikörpern umfassen, die das Glucanaseenzym (die Glucanaseenzyme) erkennen und daran binden und dadurch die Aktivität des Glucanaseenzyms (der Glucanaseenzyme) inaktivieren. Alternativ können Glucanaseenzym-spezifische Antikörper an einen Träger gebunden sein, so daß ein Passieren der gebundenen Antikörper durch die anfängliche Präparation dazu führen würde, daß das Glucanaseenzym (die Glucanaseenzyme) daraus entfernt würde(n), wodurch eine Xylanasepräparation entstehen würde, die im wesentlichen frei von Glucanaseenzym(en) ist. In einer alternativen Ausführungsform oder sogar in einer zusätzlichen Ausführungsform kann die Xylanasepräparation aus einem Wirtsorganismus hergestellt werden, der eine minimale oder gar keine Glucanaseenzymaktivität aufweist. In diesem Aspekt kann die Aktivität der in dem Wirtsorganismus vorliegenden Glucanaseenzyme inaktiviert werden. In einem alternativen Aspekt kann die Expression der Glucanasegene abgeschwächt und/oder ausgeschaltet werden. Techniken, um dies zu erzielen, könnten die Anwendung von Antisense-Sequenzen auf Sequenzen, die die Glucanase codieren, beinhalten. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Wirtsorganismus verwendet, der keine oder höchstens minimale Expression von Glucanaseenzymen aufweist.
K_i-TEST
In einigen Fällen kann die Messung des K_i-Werts einer Xylanase (was wir hier als einen "K_i-Test" bezeichnen) nützlich sein. In dieser Hinsicht haben wir herausgefunden, daß der K_i-Wert in einigen Fällen die Eignung der Xylanase für (eine) bestimmte Anwendungsform(en) anzeigt. Die Kenntnis des K_i-Werts an sich könnte nützlich sein.
KOMBINATIONSTESTS
Geeignete Kombinationen der Tests der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Betracht gezogen werden.
In dieser Hinsicht kann ein Kombinationsverfahren in Betracht gezogen werden, welches zwei oder mehrere der folgenden Stufen umfaßt: eine Stufe, die das Verfahren zur Bestimmung der Menge an Inhibitor umfaßt, eine Stufe, die das Inhibitortestverfahren umfaßt, eine Stufe, die das Klebrigkeitstestverfahren umfaßt, eine Stufe, die das Glucanasetestverfahren umfaßt, und eine Stufe, die den K_i-Test umfaßt. Bei dem Kombinationsverfahren können die Stufen in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden und müssen nicht notwendigerweise gleichzeitig oder aufeinanderfolgend ausgeführt werden.
NEUE XYLANASEN
Wie oben angegeben, liefert die vorliegende Erfindung einen geeigneten Test zum Identifizieren von Xylanasen, die bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, insbesondere von Teigen zur Verwendung bei der Herstellung von Bäckereiprodukten, verwendet werden können.
In dieser Hinsicht haben wir drei neue Xylanasen identifiziert, die für die Herstellung von Nahrungsmitteln, insbesondere von Teigen für die Verwendung bei der Herstellung von Bäckereiprodukten, geeignet sind.
So wird hierin auch eine Aminosäuresequenz gelehrt, die irgendeine der Aminosäuresequenzen, die als SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 angegeben sind, oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon umfaßt.
Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf die Xylanase der vorliegenden Erfindung umfassen jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer (oder mehrerer) Aminosäure(n) in oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Aminosäuresequenz Xylanaseaktivität aufweist und vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität wie eine der als SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 angegebenen Aminosäuresequenzen hat. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" Homologie im Hinblick auf die Struktur und/oder die Funktion ab, mit der Maßgabe, daß das resultierende Protein Xylanaseaktivität aufweist, und zwar vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität wie irgendeine der Aminosäuren, die als SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 angegeben sind. Im Hinblick auf die Sequenzhomologie (d.h. Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll gezeigten Sequenz. Noch bevorzugter besteht wenigstens 95%, besonders bevorzugt wenigstens 98% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll gezeigten Sequenz.
Vorzugsweise umfaßt die Xylanase die als SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:11 angegebene Sequenz oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon.
Eine die Aminosäuresequenzen codierende Nukleotidsequenz wird hierin ebenfalls gelehrt.
Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz unter folgenden ausgewählt:

(a) einer Nukleotidsequenz, die irgendeine der als SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:12 angegebenen Sequenzen oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon umfaßt,
(b) irgendeiner der als SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenzen oder dem Komplement davon,
(c) einer Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an irgendeine der als SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenzen oder ein Fragment davon zu hybridisieren,
(d) einer Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an das Komplement irgendeiner der als SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenzen oder eines Fragments davon zu hybridisieren, und
(e) einer Nukleotidsequenz, die aufgrund des genetischen Codes zu den in (a), (b), (c) oder (d) definierten Nukleotiden degeneriert ist.

Die Begriffe "Variante", "Homologes" oder "Fragment" in Bezug auf die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Hinzufügung einer (oder mehrerer) Nukleinsäuren in oder zu der Sequenz, mit der Maßgabe, daß die resultierende Nukleotidsequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die Xylanaseaktivität besitzt und vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität wie eine der als SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" Homologie im Hinblick auf die Struktur und/oder die Funktion ab, mit der Maßgabe, daß das resultierende exprimierte Protein Xylanaseaktivität besitzt, und zwar vorzugsweise wenigstens dieselbe Aktivität wie irgendeine der als SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:11 angegebenen Aminosäuresequenzen. Im Hinblick auf die Sequenzhomologie (d.h. Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität) besteht vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:12 gezeigten Sequenz. Besonders bevorzugt besteht wenigstens 95%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 98% Homologie zu der im anhängenden Sequenzprotokoll gezeigten Sequenz.
Vorzugsweise umfaßt die Nukleotidsequenz die als SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:12 angegebene Sequenz oder eine Variante, ein Homologes oder ein Fragment davon.
NEUE VERWENDUNGEN VON XYLANASEN
Wie oben angegeben, liefert die vorliegende Erfindung auch einen geeigneten Test zum Identifizieren von Xylanasen, die bei der Herstellung nicht-klebriger Teige (wie hierin definiert) zur Verwendung bei der Herstellung von Bäckereiprodukten verwendet werden können.
In dieser Hinsicht haben wir bestimmte Xylanasen, sowohl bekannte als auch neue Bakterienxylanasen, identifiziert, die für die Herstellung von Nahrungsmitteln, insbesondere von Teigen für die Verwendung bei der Herstellung von Bäckereiprodukten, geeignet sind.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung einen nicht-klebrigen Teig (wie hierin definiert), der eine Xylanase enthält, die durch den Test der vorliegenden Erfindung identifiziert werden kann. Vorzugsweise hat die Xylanase die als SEQ ID NO:5 angegebene Aminosäuresequenz.
Im Gegensatz zu den Systemen aus dem Stand der Technik bietet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, eine Xylanase vor der Herstellung des Teiges direkt zu Mehl zuzugeben. Somit kann eine einzige Charge eines Mehl/Xylanase-Gemischs an den Teighersteller geliefert werden. Darüber hinaus benötigt der Teighersteller keinerlei Dosierungsausrüstung, um einen leicht zu verarbeitenden Teig zu erhalten.
MIT XYLANASEN HERGESTELLTE NAHRUNGSMITTEL
Hierin wird ebenfalls ein Mittel zum Identifizieren geeigneter Xylanasen für die Verwendung bei der Herstellung eines Nahrungsmittels gelehrt. Typische Nahrungsmittel, die auch Tierfutter beinhalten, umfassen Molkereiprodukte, Fleischprodukte, Geflügelprodukte, Fischprodukte und Bäckereiprodukte.
Vorzugsweise ist das Nahrungsmittel ein Bäckereiprodukt. Typische Bäckerei- (gebackene) Produkte, die innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen, umfassen Brot – wie Laibe, Brötchen, Semmeln, Pizzaböden usw. -, Brezeln, Tortillas, Kuchen, Kekse, Plätzchen, Kräcker usw.
ALLGEMEINE LEHREN
In der folgenden Erklärung beziehen sich Verweise auf "Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" bzw. "Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" auf irgendeine oder mehrere der hierin angegebenen Nukleotidsequenzen und auf irgendeine oder mehrere der hierin angegebenen Aminosäuresequenzen.
Aminosäuresequenz/Polypeptidsequenz
Der Begriff "Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" ist synonym zu dem Ausdruck "Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung". Hier kann die Aminosäuresequenz die der Xylanase oder des Xylanaseinhibitors sein.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten auch Fragmente der angegebenen Aminosäuresequenz und Varianten davon. Geeignete Fragmente haben eine Größe von wenigstens 5, z.B. wenigstens 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch modifiziert sein, so daß sie eine oder mehrere (z.B. wenigstens 2, 3, 5 oder 10) Substitutionen, Deletionen oder Insertionen, einschließlich konservierter Substitutionen enthalten.
Konservierte Substitutionen können gemäß der folgenden Tabelle, die konservierte Substitutionen angibt, hergestellt werden, wobei Aminosäuren in demselben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile in der dritten Spalte gegeneinander substituiert werden können.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer im wesentlichen isolierten Form vorliegen. Es versteht sich, daß das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, die den beabsichtigten Verwendungszweck des Polypeptids nicht stören, gemischt sein und dennoch als im wesentlichen isoliert angesehen werden kann. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch in einer im wesentlichen gereinigten Form vorliegen, wobei es in diesem Fall das Polypeptid im allgemeinen in einer Präparation umfaßt, in der mehr als 90%, z.B. 95%, 98% oder 99% des Polypeptids in der Präparation ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können beispielsweise durch Hinzufügen von Histidinresten modifiziert werden, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder durch Hinzufügen einer Signalsequenz, um ihre Absonderung aus einer Zelle, wie unten diskutiert, zu fördern.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können synthetisch (z.B. wie von Geysen et al., 1996 beschrieben) oder rekombinant, wie unten beschrieben, hergestellt werden.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen – wie Hefe-, Pilz- und Pflanzenwirtszellen – kann solche posttranslationalen Modifikationen (z.B. Myristolierung, Glycosylierung, Verkürzung, Lapidierung und Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) bereitstellen, die notwendig sein können, um den Produkten der rekombinanten Expression der vorliegenden Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen.
Nukleotidsequenz/Polynukleotidsequenz
Der Begriff "Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" ist synonym zu dem Ausdruck "Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung".
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen Nukleotidsäuresequenzen, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren. Es versteht sich, daß infolge der Degeneration des genetischen Codes eine Reihe verschiedener Polynukleotide eine bestimmte Aminosäuresequenz codiert.
In Kenntnis der hierin angegebenen Aminosäuresequenzen ist es möglich, Nukleinsäuresequenzen mit teilweiser und voller Länge, wie cDNA- und/oder genomische Klone, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, zu entwickeln. Beispielsweise können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung erhalten werden unter Anwendung degenerierter PCR, die Primer einsetzt, die dafür ausgestaltet sind, auf Sequenzen zu zielen, die die hierin angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer enthalten typischerweise mehrere degenerierte Stellen. Um die Degeneration zu verringern, werden jedoch Sequenzen ausgewählt, die Bereiche der hierin angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, die Aminosäuren, wie Methionin, die nur durch ein Triplett codiert werden, enthalten. Darüber hinaus werden Sequenzen ausgewählt, die die Codonverwendung in dem Organismus, dessen Nukleinsäure als Matrix-DNA für das PCR-Verfahren verwendet wird, berücksichtigen. PCR wird unter Bedingungen eingesetzt, deren Stringenz niedriger ist als bei denjenigen, die zum Klonieren von Sequenzen mit Einzelsequenz- (nicht degenerierten) Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Mittels PCR erhaltene Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung codieren, können dann eingesetzt werden, um unter Verwendung von Hybridisierungstechniken zur Durchmusterung von Bibliotheken größere Sequenzen zu erhalten. Beispielsweise kann ein PCR-Klon mit radioaktiven Atomen markiert werden und dazu verwendet werden, eine cDNA- oder eine genomische Bibliothek anderer Spezies, vorzugsweise anderer Pflanzenspezies oder Pilzspezies, zu durchmustern. Die Hybridisierungsbedingungen sind typischerweise Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz (beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C).
Degenerierte Nukleinsäuresonden, die die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz codieren, können auch verwendet werden, um cDNA- und/oder genomische Bibliotheken anderer Spezies, vorzugsweise anderer Pflanzenspezies oder Pilzspezies, zu untersuchen. Es ist jedoch bevorzugt, zunächst PCR-Techniken anzuwenden, um für die Verwendung in weiteren Durchmusterungsverfahren eine einzelne Sequenz zu erhalten.
Die Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten wurden, können verwendet werden, um unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken weitere homologe Sequenzen und Varianten zu erhalten. Sie können für die Verwendung beim Exprimieren der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Wirtszellsystemen auch modifiziert werden, beispielsweise um die Codonpräferenzen für eine bestimmte Wirtszelle, in der die Polynukleotidsequenzen exprimiert werden, zu optimieren. Andere Sequenzveränderungen können wünschenswert sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzubringen oder um die Eigenschaften oder die Funktion der durch die Polynukleotide codierten Polypeptide zu verändern.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um einen Primer herzustellen, wie z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Vervielfältigungsreaktion, eine Sonde, die z.B. unter Verwendung herkömmlicher Mittel mit radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen mit einer Erkennungsmarkierung versehen wurde, oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente haben eine Länge von wenigstens 15, vorzugsweise wenigstens 20, beispielsweise wenigstens 25, 30 oder 40 Nukleotiden, und sie sind durch den Begriff Polynukleotide der vorliegenden Erfindung, wie er hierin verwendet wird, ebenfalls umfaßt.
Die Polynukleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung können eine Erkennungsmarkierung tragen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie Biotin. Solche Markierungen können zu den Polynukleotiden oder Primern der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden und können unter Verwendung an sich bekannter Techniken detektiert werden.
Polynukleotide, wie ein DNA-Polynukleotid, und Primer gemäß der vorliegenden Erfindung können rekombinant, synthetisch oder auf irgendeine für einen Fachmann verfügbare Weise hergestellt werden. Sie können auch unter Verwendung von Standardtechniken kloniert werden.
Im allgemeinen werden Primer auf synthetischem Weg hergestellt, was eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz, d.h. die Herstellung eines Nukleotids nach dem anderen, umfaßt. Techniken, um dies zu erreichen, die automatisierte Techniken einsetzen, sind aus dem Stand der Technik zu entnehmen.
Längere Polynukleotide werden im allgemeinen unter Verwendung rekombinanter Mittel, beispielsweise unter Verwendung von PCR- (Polymerasekettenreaktions-) Klonierungstechniken, hergestellt. Dies umfaßt die Herstellung eines Paares von Primern (z.B. mit etwa 15–30 Nukleotiden) in einem Bereich des Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitorgens, dessen Klonierung gewünscht ist, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer Pilz-, einer Pflanzen- oder einer prokaryontischen Zelle erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die eine Vervielfältigung des gewünschten Bereichs bewirken, das Isolieren des vervielfältigten Fragments (z.B. durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf Agarosegel) und das Gewinnen der vervielfältigten DNA. Die Primer können so ausgestaltet sein, daß sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so daß die vervielfältigte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
Regulatorische Sequenzen
Vorzugsweise ist das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung funktionsfähig mit einer regulatorischen Sequenz verbunden, die in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz, wie z.B. durch die ausgewählte Wirtszelle, zu bewirken. Beispielsweise umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfaßt und funktionsfähig mit einer solchen regulatorischen Sequenz verbunden ist, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff "funktionsfähigverbunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei der die beschriebenen Komponenten zueinander in einer Beziehung stehen, die es ihnen gestattet, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die mit einer codierenden Sequenz "funktionsfähig verbunden" ist, ist so ligiert, daß eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Der Begriff "regulatorische Sequenzen" umfaßt Promotoren und Enhancer und andere Expressionsregulationssignale.
Der Begriff "Promotor" wird im herkömmlichen Sinne des Standes der Technik verwendet, wie z.B. als eine RNA-Polymerasebindungsstelle.
Eine verstärkte Expression des Polynukleotids, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann auch durch die Auswahl heterologer regulatorischer Bereiche erzielt werden, z.B. Promo tor-, Sekretionssteuer- und Terminationsregionen, die dazu dienen, die Expression zu steigern und, falls gewünscht, die Menge der Sekretion des interessierenden Proteins aus dem gewählten Expressionswirt zu steigern und/oder die induzierbare Steuerung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Vorzugsweise kann die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung funktionsfähig mit wenigstens einem Promotor verbunden sein.
Neben dem Promotor, der in dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierenden Gen natürlich vorkommt, können auch andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Der Promotor kann anhand seiner Wirksamkeit bei der Steuerung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression des gewünschten Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Ein solches Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile bereitstellen, da es die Notwendigkeit umgeht, die Expressionswirte auf einem Medium zu kultivieren, welches ein induzierendes Substrat enthält.
Beispiele stark konstitutiver und/oder induzierbarer Promotoren, die für die Verwendung bei Pilz-Expressionswirten bevorzugt werden, sind diejenigen, die aus den Pilzgenen für Xylanase- (xlnA-), Phytase-ATP-Synthetase-Untereinheit 9- (oliC-), Triosephosphatisomerase- (tpi-), Alkoholdehydrogenase- (AdhA-), α-Amylase- (amy-), Amyloglucosidase- (AG- – aus dem glaA-Gen), Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3-phosphatasedehydrogenase- (gpd-) Promotoren erhältlich sind.
Beispiele starker Hefepromotoren sind diejenigen, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
Beispiele starker Bakterienpromotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren sowie Promotoren aus extrazellulären Proteasegenen.
Hybridpromotoren können ebenfalls verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Der Promotor kann zusätzlich Merkmale aufweisen, die die Expression in einem geeigneten Wirt sicherstellen oder steigern. Beispielsweise können die Merkmale konservierte Bereiche, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box, sein. Der Promotor kann sogar andere Sequenzen enthalten, um das Niveau der Expression der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen (z.B. aufrechtzuerhalten, zu verstärken oder zu verringern). Beispielsweise beinhalten geeignete andere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen beinhalten induzierbare Elemente – wie durch Temperatur, chemisch, durch Licht oder durch Streß induzierbare Elemente. Auch können geeignete Elemente vorhanden sein, um die Transkription oder Translation zu verstärken. Ein Beispiel für das letztgenannte Element ist die TMV 5'-Signalsequenz (siehe Sleat Gene 217 [1987] 217–225, und Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
Sekretion
Oft ist es wünschenswert, daß das Polypeptid der vorliegenden Erfindung aus dem Expressionswirt in das Kulturmedium abgesondert wird, aus dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung leichter gewonnen werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sekretionssteuersequenz auf Basis des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Hybridsignalsequenzen können im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Typische Beispiele heterologer Sekretionssetuersequenzen sind diejenigen, die aus dem Pilz-Amyloglucosidase- (AG-) Gen (glaA – Versionen mit sowohl 18 als auch 24 Aminosäuren z.B. von Aspergillus), dem α-Faktor-Gen (Hefen, z.B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylasegen (Bacillus) stammen.
Konstrukte
Der Begriff "Konstrukt" – der synonym zu Begriffen wie "Konjugat", "Kassette" und "Hybrid" ist – beinhaltet die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, die direkt oder indirekt an einen Promotor angehängt ist. Ein Beispiel einer solchen indirekten Anhängung ist das Vorsehen einer geeigneten Spacer-Gruppe, wie z.B. einer Intronsequenz, wie das Sh1-Intron oder das ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung. Gleiches gilt für den Begriff fusioniert in Bezug auf die vorliegende Erfindung, welcher die direkte oder indirekte Anhängung umfaßt. In jedem Fall umfassen die Begriffe nicht die natürliche Kombination der Nukleotidsequenz, die das Protein codiert, welches für gewöhnlich mit dem Wildtyp-Genpromotor assoziiert ist, sowie den Fall, daß beide in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen.
Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, der eine Auswahl des genetischen Konstrukts, beispielsweise in einem Bakterium, vorzugsweise der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis, oder Pflanzen, wie Kartoffeln, Zuckerrüben usw., in die es überführt wurde, erlaubt. Es gibt verschiedene Marker, die verwendet werden können, wie beispielsweise diejenigen, die Mannose-6-phosphatisomerase (insbesondere für Pflanzen) codieren, oder diejenigen Marker, die eine Antibiotikaresistenz bewirken – z.B. Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
Vorzugsweise umfaßt das Konstrukt der vorliegenden Erfindung wenigstens die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, die wirksam mit einem Promotor verbunden ist.
Vektoren
Der Begriff "Vektor" beinhaltet Expressionsvektoren und Transformationsvektoren und Shuttle-Vektoren.
Der Begriff "Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das zur Expression in vivo oder in vitro in der Lage ist.
Der Begriff "Transformationsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das in der Lage ist, von einer Einheit zu einer anderen Einheit überführt zu werden – die derselben Spezies oder einer anderen Spezies angehören kann. Wenn das Konstrukt von einer Spezies zu einer anderen überführt werden kann – wie z.B. von einem E. coli-Plasmid zu einem Bakterium, vorzugsweise einem Bakterium der Gattung Bacillus –, wird der Transformationsvektor manchmal als "Shuttle-Vektor" bezeichnet. Er kann sogar ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid zu einem Agrobacterium zu einer Pflanze überführt werden kann.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, wie es unten beschrieben wird, um eine Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu bewirken. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie er oben beschrieben wurde, unter Bedingungen transformiert oder transfiziert wurde, die eine Expression durch den Vektor einer codierenden Sequenz, die die Polypeptide codiert, bewirken, und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide umfaßt.
Die Vektoren können beispielsweise Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, optional mit einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und optional mit einem Regulator für den Promotor versehen sind.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten. Die am besten geeigneten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind diejenigen, die von der Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation im Wirtsorganismus erfordern. Beispiele von Selektionsmarkern aus Pilzen sind die Gene für Acetamidase- (amdS), ATP-Synthetase-Untereinheit 9- (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase- (pvrA), Phleomycin- und Benomylresistenz (benA). Beispiele von Selektionsmarkern, die nicht aus Pilzen stammen, sind das bakterielle G418-Resistenzgen (dieses kann auch in Hefe, nicht jedoch in Pilzen verwendet werden), das Ampicillinresistenzgen (E. coli), das Neomycinresistenzgen (Bacillus) und das E. coli uidA-Gen, das β-Glucuronidase (GUS) codiert.
Vektoren können in vitro verwendet werden, wie beispielsweise zur Herstellung von RNA, oder sie können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Somit können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung in einen rekombinanten Vektor (typischerweise einen replizierbaren Vektor), beispielsweise einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, eingebracht werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung durch Einbringen eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Replikation des Vektors bewirken. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden unten im Zusammenhang mit Expressionsvektoren beschrieben.
Gewebe
Der Begriff "Gewebe", wie er hierin verwendet wird, umfaßt Gewebe per se und Organe.
Wirtszellen
Der Begriff "Wirtszelle" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfaßt jede Zelle, die die Nukleotidsequenz, die das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder daraus erhaltene Produkte codiert, enthalten könnte, wobei ein Promotor die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben kann, wenn er in der Wirtszelle vorliegt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert somit Wirtszellen, die mit einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert wurden. Vorzugsweise wird das Polynukleotid in einem Vektor für die Replikation und Expression des Polynukleotids getragen. Die Zellen werden so ausgewählt, daß sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können beispielsweise prokaryontische (beispielsweise Bakterien-), Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
Das Gram-negative Bakterium E. coli findet als Wirt für die heterologe Genexpression weitverbreitet Anwendung. Große Mengen an heterologem Protein neigen jedoch dazu, sich im Inneren der Zelle anzusammeln. Die anschließende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Masse an E. coli-Proteinen innerhalb der Zelle kann manchmal schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli sind Bakterien der Gattung Bacillus als heterologe Wirte sehr gut geeignet, da sie in der Lage sind, Proteine in das Kulturmedium abzusondern. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen der Gattungen Streptomyces und Pseudomonas.
In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Polynukleotids, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder dem Wunsch, das exprimierte Protein weiter zu verarbeiten, können eukaryontische Wirte, wie Hefen oder Pilze, bevorzugt sein. Im allgemeinen werden Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch von der Hefezelle entweder schlecht abgesondert, oder sie werden in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein Pilz als Wirtsorganismus ausgewählt werden.
Beispiele bevorzugter Expressionswirte innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies (wie diejenigen, die in der EP-A-0 184 438 und der EP-A-0 284 603 beschrieben sind) und Trichoderma-Spezies, Bakterien, wie Bacillus-Spezies (wie diejenigen, die in der EP-A-0 134 048 und der EP-A-0 253 455 beschrieben sind), Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies und Hefen wie Kluyveromyces-Spezies (wie diejenigen, die in der EP-A-0 096 430 und der EP-A-0 301 670 beschrieben sind) und Saccharomyces-Spezies.
Typische Expressionswirte können unter Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae ausgewählt sein.
Organismus
Der Begriff "Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfaßt jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz, die das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder daraus erhaltene Produkte enthalten könnte, wobei ein Promotor die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben kann, wenn er in dem Organismus vorhanden ist. Für den Xylanaseinhibitoraspekt der vorliegenden Erfindung können bevorzugte Organismen einen Pilz, eine Hefe oder eine Pflanze beinhalten. Für den Xylanaseaspekt der vorliegenden Erfindung kann ein bevorzugter Organismus ein Bakterium, vorzugsweise der Gattung Bacillus, noch bevorzugter Bacillus subtilis, sein.
Der Begriff "transgener Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfaßt jeden Organismus, der die Nukleotidsequenz, die das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder daraus erhaltene Produkte enthält, wobei der Promotor die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in dem Organismus erlauben kann. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz in das Genom des Organismus aufgenommen.
Der Begriff "transgener Organismus" deckt nicht die natürliche codierende Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer natürlichen Umgebung ab, wenn sie unter der Kontrolle ihres natürlichen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Darüber hinaus deckt die vorliegende Erfindung nicht das natürliche Protein gemäß der vorliegenden Erfindung ab, wenn es in seiner natürlichen Umgebung vorliegt und wenn es durch seine natürlich vorkommende codierende Nukleotidsequenz, die ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, exprimiert wurde und wenn diese Nukleotidsequenz unter der Kontrolle ihres natürlichen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt.
Daher umfaßt der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus, der irgendeines oder Kombinationen der Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, der Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung (einschließlich Kombinationen davon), der Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung, der Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung, der Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung oder der Produkte davon umfaßt. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus könnte akzeptable Mengen der gewünschten Verbindung erzeugen, die leicht aus der Zelle oder dem Organismus gewonnen werden könnten.
Transformation von Wirtszellen/Wirtsorganismen
Wie es zuvor angegeben wurde, kann der Wirtsorganismus ein prokaryontischer oder ein eukaryontischer Organismus sein. Beispiele geeigneter prokaryontischer Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation von prokaryontischen Wirten sind im Stand der Technik gut dokumentiert, siehe beispielsweise Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in the Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Wenn ein prokaryontischer Wirt verwendet wird, kann es notwendig sein, die Nukleotidsequenz vor der Transformation in geeigneter Weise zu modifizieren – wie beispielsweise durch das Entfernen von Introns.
Wie oben erwähnt, ist ein bevorzugter Wirtsorganismus ein Organismus der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis.
In einer weiteren Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In dieser Hinsicht fanden Hefen auch als Vehikel für die heterologe Genexpression weitverbreitet Anwendung.
Die Spezies Saccharomyces cerevisiae wird seit langer Zeit industriell verwendet, einschließlich ihrer Verwendung für die heterologe Genexpression. Die Expression heterologer Gene in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., Hrsg., S. 401–429, Allen und Unwin, London) und von King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Hrsg., S. 107–133, Blackie, Glasgow) beschrieben.
Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen für die heterologe Genexpression gut geeignet. Erstens ist sie für Menschen nicht pathogen, und sie ist auch nicht in der Lage, bestimmte Endotoxine zu bilden. Zweitens hat sie nach jahrhundertelanger kommerzieller Nutzung für verschiedene Zwecke eine lange Geschichte der sicheren Verwendung. Dies hat zu einer großen Akzeptanz in der Öffentlichkeit geführt. Drittens haben die extensive kommerzielle Verwendung und die dem Organismus gewidmete Forschung zu einer Fülle an Wissen über die Genetik und die Physiologie sowie zu umfangreichen Fermentationscharakteristika von Saccharomyces cerevisiae geführt.
Eine Übersicht über die Grundlagen der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und der Absonderung von Genprodukten wird von E. Hinchcliffe E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony N. Rose und J. Stuart Harrison, Hrsg., 2. Aufl., Academic Press Ltd.) gegeben.
Es sind verschiedene Arten von Hefevektoren, einschließlich integrativer Vektoren, die für ihre Erhaltung eine Rekombination mit dem Wirtsgenom erfordern, und autonom replizierender Plasmidvektoren, verfügbar.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden durch Einfügen der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in ein für die Expression in Hefe ausgestaltetes Konstrukt Expressionskonstrukte hergestellt. Es wurden mehrere Arten von Konstrukten entwickelt, die für die heterologe Expression verwendet werden. Die Konstrukte enthalten einen Promotor, der in Hefe aktiv und mit der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung fusioniert ist; für gewöhnlich wird ein Promotor mit Hefeursprung, wie z.B. der GAL1-Promotor, verwendet. Üblicherweise wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, wie z.B. die das SUC2-Signalpeptid codierende Sequenz, verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
Für die Transformation von Hefe wurden verschiedene Transformationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise kann unter Befolgung der Lehren von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929), Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104) und Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163–168), eine transgene Saccharomyces hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener Selektionsmarker selektiert. Unter den für die Transformation verwendeten Markern befinden sich eine Reihe auxotropher Marker, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominanter Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosid-Antibiotikamarker, z.B. G418.
Ein weiterer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das Grundprinzip bei der Herstellung genetisch modifizierter Pflanzen besteht darin, genetische Informationen so in das Pflanzengenom einzufügen, daß eine stabile Erhaltung des eingefügten genetischen Materials erreicht wird.
Es existieren verschiedene Techniken zum Einfügen der genetischen Information; die beiden Hauptprinzipien sind dabei die direkte Einbringung der genetischen Information und die indirekte Einbringung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems. Eine Übersicht über die allgemeinen Techniken ist in Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27) zu finden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Vektorsystem, welches eine Nukleotidsequenz oder ein Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung trägt und in der Lage ist, die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt in das Genom eines Organismus, wie einer Pflanze, einzubringen.
Das Vektorsystem kann einen Vektor umfassen, doch es kann auch zwei Vektoren umfassen. Im Falle zweier Vektoren wird das Vektorsystem normalerweise als ein binäres Vektorsystem bezeichnet. Binäre Vektorsysteme sind in Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1–19, ausführlicher beschrieben.
Ein extensiv angewandtes System für die Transformation von Pflanzenzellen mit einer bestimmten Nukleotidsequenz basiert auf der Verwendung eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium rhizogenes; An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301–305, und Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.: D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203–208.
Es wurden mehrere verschiedene Ti- und Ri-Plasmide hergestellt, die für die Herstellung der Pflanze oder der Pflanzenzellkonstrukte, wie oben beschrieben, geeignet sind. Ein nicht beschränkendes Beispiel eines solchen Ti-Plasmids ist pGV3850.
Die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung sollte vorzugsweise zwischen den terminalen Sequenzen der T-DNA oder benachbart zu einer T-DNA-Sequenz in das Ti-Plasmid eingefügt werden, um so eine Unterbrechung der die T-DNA-Grenzen unmittelbar umgebenden Sequenzen zu vermeiden, da zumindest einer dieser Bereiche für die Einbringung modifizierter T-DNA in das Pflanzengenom wesentlich zu sein scheint.
Wie es sich aus der obigen Erklärung ergibt, ist, wenn der Organismus eine Pflanze ist, das Vektorsystem vorzugsweise eines, das die Sequenzen enthält, die notwendig sind, um die Pflanze (z.B. die vir-Region) und wenigstens einen Grenzbereich einer T-DNA-Sequenz zu infizieren, wobei der Grenzbereich auf demselben Vektor liegt wie das genetische Konstrukt. Vorzugsweise ist das Vektorsystem ein Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens oder ein Ri-Plasmid aus Agrobacterium rhizogenes oder ein Derivat davon; da diese Plasmide gut bekannt sind und bei der Herstellung transgener Pflanzen weitverbreitet eingesetzt werden, existieren viele Vektorsysteme, die auf diesen Plasmiden oder Derivaten davon basieren.
Bei der Herstellung einer transgenen Pflanze kann die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung zuerst in einem Mikroorganismus, in dem sich der Vektor replizieren kann und der vor der Einfügung in die Pflanze leicht zu manipulieren ist, hergestellt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Mikroorganismus ist E. coli, aber es können auch andere Mikroorganismen, die die obigen Eigenschaften besitzen, verwendet werden. Wenn ein Vektor eines Vektorsystems, wie es oben definiert wurde, in E. coli hergestellt wurde, wird er, falls notwendig, in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z.B. Agrobacterium tumefaciens, überführt. Das die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung beherbergende Ti-Plasmid wird somit vorzugsweise in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm, z.B. A. tumefaciens, überführt, um so eine Agrobacterium-Zelle zu erhalten, die die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung beherbergt, deren DNA anschließend in die zu modifizierende Pflanzenzelle überführt wird.
Auf diese Weise kann die Nukleotidsequenz oder das Konstrukt der vorliegenden Erfindung an eine geeignete Restriktionsstelle in dem Vektor eingebracht werden. Das enthaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert und dann geerntet und lysiert. Dann wird das Plasmid wiedergewonnen. Als Analyseverfahren werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektroforese und weitere biochemische/molekularbiologische Verfahren eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz geschnitten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Sequenz kann in demselben oder einem anderen Plasmid kloniert werden.
Nach jedem Verfahren zum Einbringen der gewünschten Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in die Pflanzen kann das Vorliegen und/oder die Einfügung weiterer DNA-Sequenzen notwendig sein. Wenn beispielsweise für die Transformation das Ti- oder Ri-Plasmid der Pflanzenzellen verwendet wird, können wenigstens die rechte Grenze, oft jedoch auch die rechte und die linke Grenze der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Bereiche der eingebrachten Gene verbunden werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ist in der EP-A-120 516, Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. B., Alblasserdam, 1985, Kapitel V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46, und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–284, beschrieben.
Die direkte Infizierung von Pflanzengeweben mit Agrobacterium ist eine einfache Technik, die weitverbreitet angewendet wird und die in Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, Hrsg.: D.S. Ingrams und J.P. Helgeson, 203–208, beschrieben ist. Für weitere Lehren zu diesem Thema siehe Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech März/April 1994 17–27). Mit dieser Technik kann die Infizierung einer Pflanze an einem bestimmten Teil oder Gewebe der Pflanze, d.h. an einem Teil eines Blattes, einer Wurzel, eines Stengels oder eines anderen Teils der Pflanze, vorgenommen werden.
Bei der direkten Infizierung von Pflanzengeweben mit Agrobacterium, welches die Nukleotidsequenz trägt, wird typischerweise eine zu infizierende Pflanze verletzt, z.B. durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge oder durch Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder durch Reiben der Pflanze mit einem Schleifmittel. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium geimpft. Die geimpfte Pflanze oder der geimpfte Pflanzenteil wird dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, und man läßt sie sich zu ausgewachsenen Pflanzen entwickeln.
Wenn Pflanzenzellen hergestellt werden, können diese Zellen gemäß gut bekannter Gewebekultivierungsverfahren gezüchtet und erhalten werden, wie z.B. durch Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, das mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Aminosäuren, Pflanzenhormonen, Vitaminen usw., versehen ist. Die Regeneration der transformierten Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen kann unter Verwendung bekannter Verfahren für die Regeneration von Pflanzen aus Zell- oder Gewebekulturen, beispielsweise durch Auswählen transformierter Triebe unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivieren der Triebe auf einem Medium, welches die geeigneten Nährstoffe, Pflanzenhormone usw. enthält, enthält werden.
Weitere Lehren über die Transformation von Pflanzen sind in der EP-A-0 449 375 zu finden.
Herstellung des Polypeptids
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren beispielsweise von mikrobiellen Expressionswirten, die mit einem oder mehreren Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, in einem herkömmlichen Fermentationsnährmedium bewirkt werden. Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirts basieren und/oder sie kann auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts basieren. Solche Medien sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Das Medium kann, falls dies gewünscht ist, zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen potentiell kontaminierenden Mikroorganismen begünstigen.
Antikörper
Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um – z.B. unter Verwendung von Standardtechniken – Antikörper gegen die Aminosäuresequenz herzustellen. Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse usw. durch Injektion des Inhibitors oder irgendeines Anteils, einer Variante, eines Homologen, eines Fragments oder eines Derivats davon oder eines Oligopeptids, das immunogene Eigenschaften besitzt, immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtsspezies können verschiedene Hilfsstoffe verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken. Solche Hilfsstoffe umfassen Freund'sches Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-limpet-Hämocyanin und Dinitrophenol, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potentiell geeignete humane Hilfsstoffe, die eingesetzt werden können.
Monoklonale Antikörper gegen die Aminosäuresequenz können sogar unter Verwendung irgendeiner Technik, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur bereitstellt, hergestellt werden. Diese Techniken umfassen die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Koehler und Milstein (1975 Nature 256: 495–497) beschrieben wurde, die humane B-Zell-Hybridomtechnik (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc. S. 77–96), sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Darüber hinaus können Techniken verwendet werden, die für die Herstellung "chimärer Antikörper", das Spleißen von Maus-Antikörpergenen an menschliche Antikörpergene, um ein Molekül mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, entwickelt wurden (Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6851–6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604–608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452–454). Alternativ können Techniken, die für die Herstellung von Einzelkettenantikörpern beschrieben wurden (US-A-4,946,779), so angepaßt werden, daß sie inhibitorspezifische Einzelkettenantikörper bilden.
Antikörper können auch durch Induzieren der Produktion in der Lymphozytenpopulation in vivo oder durch Durchmustern rekombinanter Immunglobulinbibliotheken oder einer Auswahl hochspezifischer Bindungsreagenzien, wie sie in Orlandi et al. (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833–3837) und Winter G. und Milstein C. (1991; Nature 349: 293–299) beschrieben sind, erzeugt werden.
PROTOKOLLE
PROTOKOLL 1
XYLANASETEST
(Endo-β-1,4-xylanase-Aktivität)
Xylanaseproben werden in Zitronensäure (0,1 M) – Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (0,2 M), pH 5,0, unter Erhalt von etwa OD = 0,7 in dem abschließenden Test verdünnt. Drei Verdünnungen der Probe und ein innerer Standard mit definierter Aktivität werden für 5 Minuten bei 40°C thermostatiert. Zum Zeitpunkt = 5 Minuten wird 1 Xylazyme-Tablette (vernetztes, gefärbtes Xylansubstrat) zu der Enzymlösung zugegeben. Zum Zeitpunkt = 15 Minuten wird die Reaktion beendet, indem 10 ml 2% TRIS zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, und die OD des Überstands wird bei 590 nm gemessen. Unter Berücksichtigung der Verdünnungen und der Menge an Xylanase kann die Aktivität (TXU, Gesamt-Xylanaseeinheiten) der Probe relativ zum Standard berechnet werden.
PROTOKOLL 2
KLEBRIGKEITSPROTOKOLL
(Klebrigkeitsbestimmung)
Die Klebrigkeit von Teig wird in einem TA-XT2-System (Stable Micro Systems) unter Verwendung einer SMS-Teigklebrigkeitszelle gemessen. Das Protokoll ist eine modifizierte Version des von Chen und Hoseney (1995) beschriebenen Verfahrens. Ein Teig wird unter Verwendung eines Farinographs (AACC-Verfahren 54–21) aus Mehl, 2% NaCl und Wasser zu 400 Brabender-Einheiten (BU) hergestellt. Das Mehl und das NaCl werden für 1 Minute trocken gemischt. Wasser wird zugegeben, und der Teig wird für weitere 5 Minuten gemischt. Man könnte den erhaltenen Teig in vorteilhafter Weise in dicht verschlossenen Behältern bei 30°C für 10, 30 oder 45 Minuten ruhen lassen.
Etwa 4 Gramm Teig werden in die Teigklebrigkeitszelle gegeben. 4 mm Teig werden unter Erhalt einer einheitlichen Extrusion extrudiert. Danach werden gemäß dem Stable Micro Systems-Protokoll (TA-XT2-Anwendungsstudie für die Messung der Klebrigkeit von Teig) 5 Messungen durchgeführt. Kurz gesagt wird 1 mm Teig extrudiert. Die Sonde (25 mm Perspex-Zylindersonde), die mit dem TA-XT2-System verbunden ist, wird mit einer festgelegten Kraft in den extrudierten Teig hineingedrückt. Die Sonde wird angehoben, und die Anhaftung zwischen dem Teig und der Sonde wird aufgezeichnet. Es werden die folgenden TA-XT2-Einstellungen verwendet:

Option: Anhaftungstest

Geschwindigkeit vor Test: 2,0 mm/s

Testgeschwindigkeit: 2,0 mm/s

Geschwindigkeit nach Test: 10,0 mm/s

Abstand: 15 mm

Kraft: 40 g

Zeit: 0,1 s

Auslösertyp: Auto – 5 g

Datenerfassungsrate: 400 pps
Die aufgezeichneten Ergebnisse aus dem Test sind die Spitzenkraft, d.h. die Kraft, die notwendig ist, um die Sonde aus dem extrudierten Teig anzuheben, der Abstand, d.h. die Strecke, auf der der Teig an der Sonde klebt, und die Fläche, d.h. die Fläche unter der erhaltenen Kurve.
Die Klebrigkeit von Teig ist abhängig von der Qualität des verwendeten Mehls und von dem Rezept. Daher ist ein nicht-klebriger Teig ein Teig, der sich im Hinblick auf die Klebrigkeit im Vergleich zu einem Referenzteig ohne die Xylanase um 100% bis 200% (relativ) unterscheidet, oder der vorzugsweise weniger als 70% (relativ) der Klebrigkeit aufweist, die mit einer kommerziell erhältlichen Pilzxylanase (d.h. Pentopan mono BG, Novo Nordisk) bei einer Dosierung in einer Menge, die in einem Backversuch zu derselben Volumensteigerung führte, erzielt wird.
PROTOKOLL 3
INHIBITORTESTPROTOKOLL
(Inhibitortest)
Um den Inhibitor während der Isolierung und Charakterisierung zu detektieren, wird der folgende Test verwendet. 100 μl Inhibitorfraktion, 250 μl Xylanaselösung (enthaltend 12 TXU/ml) und 650 μl Puffer (0,1 M Zitronensäure – 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer, pH 5,0) werden gemischt. Das Gemisch wird für 5 Minuten bei 40°C thermostatiert. Zum Zeitpunkt = 5 Minuten wird eine Xylazyme-Tablette zugegeben. Zum Zeitpunkt = 15 Minuten wird die Reaktion durch die Zugabe von 10 ml 2% TRIS beendet. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert (3500 g, 10 Minuten, Raumtemperatur), und der Überstand wird bei 590 nm gemessen. Die Inhibition wird als Restaktivität im Vergleich zur Kontrolle berechnet. Die Kontrolle wird auf dieselbe Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 100 μl Inhibitor durch 100 μl Puffer (0,1 M Zitronensäure – 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer, pH 5,0) ersetzt werden. Beispielsweise kann angenommen werden, daß XM-1 einen hohen Grad an Resistenz gegenüber dem Inhibitor aufweist (siehe 20). XM-2 und XM-3 können so angesehen werden, daß sie einen mittleren Grad an Resistenz gegenüber dem Inhibitor aufweisen (siehe 20).
PROTOKOLL 4
GLUCANASEPROTOKOLL I
(Endo-β-1,4-glucanaseaktivität)
Glucanaseproben werden in 0,1 M Natriumacetat-Zitronensäurepuffer, pH = 5,0 unter Erhalt von etwa OD = 0,7 in dem abschließenden Test verdünnt. Drei Verdünnungen der Probe und ein innerer Standard mit definierter Aktivität werden für 5 Minuten bei 40°C thermostatiert. Zum Zeitpunkt = 5 Minuten wird 1 Glucazyme-Tablette (vernetztes, gefärbtes Glucansubstrat) zu der Enzymlösung zugegeben. Zum Zeitpunkt = 15 Minuten wird die Reaktion durch die Zugabe von 10 ml 2% TRIS beendet. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, und die OD des Überstands wird bei 590 nm gemessen. Unter Berücksichtigung der Verdünnungen und der Menge an Glucanase kann die Aktivität (BGU, Betaglucanaseeinheiten) der Probe relativ zum Standard berechnet werden.
PROTOKOLL 5
INHIBITORTESTPROTOKOLL II
(Inhibitorkinetiktest)
Um die Kinetik des Inhibitors zu untersuchen, wurde ein lösliches Substrat verwendet (Azo-Xylan, Megazyme). Eine 2%-ige (w/v) Lösung des Substrats wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers in 20 mM NaPi, pH 6,0, hergestellt. Der Test wurde durch Vorwärmen des Substrats, der Xylanase und des Inhibitors für 5 Minuten bei 40°C durchgeführt.
Für eine Vorabcharakterisierung des Inhibitors wird die verwendete Xylanase auf 40 TXU/ml verdünnt. Für die K_I-Bestimmungen werden die Xylanasen auf etwa 40 TXU/ml verdünnt.
0,5 ml Substrat, 0,1 ml Xylanase und 0,1 ml Inhibitor wurden zum Zeitpunkt = 0 Minuten bei 40°C gemischt. Zum Zeitpunkt = 125 Minuten wurde die Reaktion durch die Zugabe von 2 ml Ethanol (95%), gefolgt von Vortexen für 10 Sekunden beendet. Präzipitiertes, nicht-hydrolysiertes Substrat wurde mittels Zentrifugation (3500 × g, 10 Minuten, Raumtemperatur) entfernt. Die OD im Überstand wurde bei 590 nm gegen Wasser gemessen.
Eine Kontrolle wurde auf die gleiche Weise hergestellt. Die einzige Modifikation bestand darin, daß der Inhibitor durch 20 mM NaPi, pH 6,0, ersetzt wurde.
Für kinetische Experimente mit verringerter Substratkonzentration wurden durch Verdünnen in 20 mM NaPi, pH 6,0, die folgenden Substratkonzentrationen hergestellt: 2%, 1%, 0,5% und 0,25% lösliches Azo-Xylan (w/v).
Für die K_I-Bestimmungen wurden die oben genannten Xylanase- und Substratkonzentrationen verwendet. Diese wurden im Test mit den folgenden Konzentrationen an Inhibitorextrakt vereinigt: 0, 2, 5, 10, 25, 50 und 100 μl im Test. Aufgrund der Verwendung von μl Inhibitor und keiner molaren Konzentration des Inhibitors wird K_I als μl Inhibitor ausgedrückt.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammengefaßt stellt die vorliegende Erfindung unter anderem folgendes bereit:

a. Die Isolierung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors aus Weizenmehl.
b. Die Charakterisierung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors, der aus Weizenmehl isoliert wurde.
c. Die Charakterisierung der Wirkung von endogenem Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitor auf verschiedene Xylanasen.
d. Ein Mittel zum Auswählen von Xylanasen, die durch den endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitor nicht nachteilig beeinflußt werden.
e. Ein Mittel zum Auswählen von Xylanasen, die durch Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitoren nicht nachteilig beeinflußt werden.
f. Xylanasen, die einen Teig liefern, der im Vergleich zu Teigen, die Pilzxylanasen enthalten, ein vorteilhaftes Volumen und eine akzeptable Klebrigkeit aufweist.
g. Ein Verfahren zum Durchmustern von Xylanasen und/oder Mutieren derselben unter Verwendung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors und die Verwendung dieser Xylanasen oder Mutanten davon bei der Herstellung von Teigen.
h. Ein Nahrungsmittel, das mit den Xylanasen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.

HINTERLEGUNGEN
Die folgenden Proben wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, Vereinigtes Königreich, AB2 1RY, am 22. Dezember 1998 hinterlegt:

DH5α::pCR2.1_BS Xylanase NCIMB-Nummer NCIMB 40999

BL21(DE3)::pET24A_XM1 NCIMB-Nummer NCIMB 41000

BL21(DE3)::pET24A_XM3 NCIMB-Nummer NCIMB 41001

DH5α::pCR2.1_BS-Xylanase umfaßt Wildtyp-Xylanase.
BL21(DE3)::pET24A_XM1 umfaßt XM1-Xylanase.
BL21(DE3)::pET24A_XM3 umfaßt XM3-Xylanase.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Sequenzen, die von diesen Hinterlegungen ableitbar und/oder exprimierbar sind, und diese umfassende Ausführungsformen.
EINFÜHRUNG ZUM ABSCHNITT DER BEISPIELE UND ZU DEN ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 ein Diagramm zeigt;
2 ein Diagramm zeigt;
3 ein Diagramm zeigt;
4 ein Diagramm zeigt;
5 ein Diagramm zeigt;
6 ein Diagramm zeigt;
7 ein Diagramm zeigt;
8 ein Diagramm zeigt;
9 ein Diagramm zeigt;
10 ein Diagramm zeigt;
11 ein Bildergebnis eines SDS-PAGE-Experiments zeigt;
12 ein Diagramm zeigt;
13 ein Diagramm zeigt;
14 ein Diagramm zeigt;
15 ein Diagramm zeigt;
16 ein Diagramm zeigt;
17 ein Bildergebnis eines IEF-Experiments ist;
18 ein Diagramm zeigt;
19 ein Diagramm zeigt;
20 ein Diagramm zeigt;
21 ein Diagramm zeigt;
22 ein Diagramm zeigt;
23 ein Diagramm zeigt;
24 ein Diagramm zeigt;
25 ein Diagramm zeigt;
26 ein Diagramm zeigt;
27 ein Diagramm zeigt;
28 ein Diagramm zeigt;
29 ein Diagramm zeigt;
30 ein Diagramm zeigt; und
31 ein Diagramm zeigt.
Etwas ausführlicher:
1 – Klebrigkeit als eine Funktion der Xylanasen, der Dosis und der Ruhezeit.
2 – Klebrigkeit als eine Funktion der Xylanasen, der Dosis und der Ruhezeit.
3 – Gelfiltrationschromatographie einer 75 ml Probe von Inhibitorextrakt. Säule: 500 ml Superdex G-25 F, Flußrate: 10 ml/min, Fraktionsgröße: 30 ml.
4 – Kationenaustauschchromatographie einer 240 ml mit Gelfiltration behandelten Inhibitorextraktprobe. Säule: 50 ml Sepharose SP, Flußrate: 5,0 ml/min, Fraktionsgröße: 10 ml.
5 – HIC-Chromatographie einer mit Ionenaustauscher behandelten 147 ml Inhibitorextraktprobe; (NH₄)₂SO₄ zugegeben in einer Menge von 1,0 M Säule: 10 ml Phenyl HIC, Flußrate: 2,0 ml/min, Fraktionsgröße: 2,5 ml.
6 – Präparative Gelfiltrationschromatographie von 2 ml konzentrierter Inhibitorprobe. Der Inhibitor eluierte bei 176 ml. Säule: 330 ml Superdex 75 PG (Pharmacia). Elutionsmittel: 50 mM NaOAc, 200 mM NaCl, pH 5,0. Flußrate: 1 ml/Minute. Fraktionsgröße: 5,5 ml.
7 – Kationenaustauschchromatogramm von reiner Xylanase + gekochtem Inhibitorextrakt. Probe: 1 ml entsalzter 980601 + gekochter Inhibitorextrakt. Säule: 1 ml Quelle S 15. Puffersystem: A: 50 mM NaOAc, pH 4,5, B: A + 1 M NaCl. Flußrate: 2 ml/Minute.
8 – Kationenaustauschchromatogramm von reiner Xylanase nach drei Stunden Inkubation mit Inhibitorextrakt. Probe: 1 ml entsalzter 980601 + Inhibitor. Säule: 1 ml Quelle S 15. Puffersystem: A: 50 mM NaOAc, pH 4,5, B: A + 1 M NaCl. Flußrate: 2 ml/Minute.
9 – Analytische Gelfiltrationschromatographie von 100 μl konzentrierter Inhibitorprobe. Der Inhibitor eluierte bei 10,81 ml. Säule: 24 ml Superdex 75 10/30 (Pharmacia, Schweden). Elutionsmittel: 50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, pH 5,0, Flußrate: 0,5 ml/Minute. Fraktionsgröße: 2,0 ml.
10 – Log(MW) als Funktion von Kav für Standardproteine, durchgeführt auf einer Superdex 75 10/30.
11 – SDS-PAGE von Fraktion 31, 32 und Fraktion 33 aus präparativer Gelfiltration. Die Spuren 1 und 3 sind Molekulargewichtsmarker (Pharmacia LMW-Marker, Schweden). Die Spuren 2 und 4 sind Fraktion 32, beladen mit 10 bzw. 25 μl. Die Spuren 6 und 8 sind Fraktion 31, beladen mit 10 und 25 μl. Die Spuren 7 und 9 sind Fraktion 33, beladen mit 10 und 25 μl.
12 – Umkehrphasenchromatogramm von Fraktion 33 aus der Gelfiltrationschromatographie. Das Chromatogramm zeigt vier verschiedene Peaks. Peak 3 ist der Xylanaseinhibitor. Die Peaks 4, 5 und 6 sind sequenziert und zeigen eine sehr große Homologie zu dem Weizenprotein Serpin.
13 – MS von Fraktion 3 aus RP-Chromatographie. Die Spektren zeigen ein Molekül mit einem Molekulargewicht von 39503 Da.
14 – Umkehrphasenchromatographie der carboxymethylierten Fraktion 3 aus dem Umkehrphasenchromatogramm von Fraktion 33 (siehe 12). Das Chromatogramm zeigt zwei verschiedene Peaks (Fraktion 2 und 3), was auf ein Dipeptid hindeutet.
15 – MS von Fraktion 2 aus carboxymethylierter Umkehrphasenchromatographie (siehe 14). Die Spektren zeigen ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 12104 Da.
16 – MS von Fraktion 3 aus carboxymethylierter Umkehrphasenchromatographie (siehe 14). Die Spektren zeigen ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 28222 Da.
17 – IEF von Fraktion 33 und 34 aus präparativer Gelfiltrationschromatographie. Spur 2 ist pl 3–10 Standards, Spur 3 ist pl 2,5–6,5 Standards, Spuren 4 und 5 sind Fraktion 33 bzw. 34, Spur 6 ist Trysininhibitor (pl 4,55), Spur 7 ist β-Lactoglobulin (pl 5,20) und Spuren 8 und 9 sind Fraktionen 33 bzw. 34. Die Pfeile zeigen verschiedene Banden in Fraktion 33 an.
18 – pH-Wert und relative OD (aus Inhibitortest) als Funktion der Fraktionen aus Chromatofokussierungschromatographie von Xylanaseinhibitor. Wie aus der Figur zu sehen ist, nimmt die relative OD in Fraktion 7 ab, was auf Inhibitoraktivität hindeutet. Dies entspricht einem pH-Wert von 9,4.
19 – Restaktivität von vier Xylanasen als eine Funktion der Inhibitorkonzentration in %. Die vier verwendeten Xylanasen sind – -♦-X1, -∎-X3, -x-BX, -
-Novo.
20 – Restaktivität von 980601 (coli-1), 980603 (Belase) und drei Mutanten von 980601 (XM1, XM2 und XM3) nach Inkubation mit einem Mehlextrakt.
21 – Lineweaver – Burk-Diagramm von Xylanase (980601) +/– Inhibitor. Die Substratkonzentration beträgt % Azo-Xylan. V ist die relative OD 590 aus dem Test (wobei 100 S = 2% ist).
22 – K_I für verschiedene Xylanasen, ausgedrückt in Mikroliter Inhibitor.
23 – Inhibition dreier Xylanasen (980601 = Bac. sub., Gew., 980601 = X1 und 980901 = Thermomyces) als Funktion des pH-Werts. Die Daten werden durch Subtrahieren relevanter Kontrollen erhalten.
24 – pH-Optimum für drei Xylanasen (980601 = BX, 980801 = X1 und 980901 = Novo).
25 – Spez. Vol. = f (Xylanase × Dosis)
26 – Steigerung spez. Vol. = f (Xylanase × Dosis)
27 – Klebrigkeit = f (Xylanase × Dosis)
28 – Klebrigkeit als Funktion verschiedener Xylanasepräparationen und der Kontrolle, gemessen nach 10 (_10) und 45 (_45) Minuten Ruhen. 980603 ist gereinigte Xylanase von Röhm, XM1 ist Xylanasemutante 1 und #2199 ist das Produkt Veron Spezial von Röhm.
29 – Zunahme der Klebrigkeit als Funktion dreier Xylanasepräparationen nach 10 (_10) und 45 (_45) Minuten Ruhen. 980603 ist gereinigte Xylanase von Röhm, XM1 ist Xylanasemutante 1 und #2199 ist das Produkt Veron Spezial von Röhm.
30 – Zunahme der Klebrigkeit als Funktion zweier Xylanasepräparationen nach 10 (_10) und 45 (_45) Minuten Ruhen. XM1 ist Xylanasemutante 1 und #2199 ist das Produkt Veron Spezial von Röhm.
31 – Zunahme der Klebrigkeit als Funktion der zugegebenen Endo-β-1,4-glucanase. 1: Kontrollteig ohne Xylanase, 2: 7500 TXU reine Röhm-Xylanase/kg Mehl, 3: 7500 TXU reine Röhm-Xylanase/kg Mehl + 158 BGU/kg Mehl, 4: 15000 TXU reine Röhm-Xylanase/kg Mehl, 5: 15000 TXU reine Röhm-Xylanase/kg Mehl + 316 BGU/kg Mehl. Der Teig wurde nach 10 (Stik_10) und 45 (Stik_45) Minuten gemessen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Klebrigkeit des Teiges als eine Funktion verschiedener Xylanasen, der Dosierung und der Ruhezeit
Die Fähigkeit der folgenden Xylanasen, Teig klebrig zu machen, wurde getestet.
(Siehe auch Chen, W.Z. und Hoseney, R.C. (1995). Development of an objective method for dough stickiness. Lebensmittel Wiss. u. Technol., 28, 467–473)
Enzyme

"X1" entspricht einer gereinigten Probe von Endo-β-1,4-xylanase aus Aspergillus niger. Diese Xylanase hat eine Aktivität von 8400 TXU (15000 TXU/mg).
"Novo" entspricht Pentopan Mono BG von Novo Nordisk aus Thermomyces. Diese Xylanase hat eine Aktivität von 350.000 TXU (56000 TXU/mg).
"BX" entspricht einer gereinigten Probe der neuen Bakterien-Xylanase. Diese Probe hat eine Aktivität von 2000 TXU (25000 TXU/mg).
"Röhm" entspricht der Bakterien-Xylanase Veron Spezial der Röhm GmbH. Diese Probe hat eine Aktivität von 10500 TXU (25000 TXU/mg).

Xylanasetest
Xylanasetests wurden gemäß Protokoll 1 durchgeführt.
Mehl
Bei diesem Versuch wurden zwei Arten von Mehl verwendet: dänisches Mehl, Charge Nr. 98022, und deutsches Mehl, Charge Nr. 98048. Die Wasserabsorption der beiden Mehlsorten betrug 58 bzw. 60% bei 400 BU.
Teigherstellung
Teig wurde wie in Protokoll 2 beschrieben hergestellt. Nach dem Mischen ruhte der Teig für 10 bzw. 45 Minuten bei 30°C in dicht verschlossenen Behältern.
Klebrigkeitsmessung
Klebrigkeitsmessungen wurden gemäß Protokoll 2 durchgeführt.
Ergebnisse und Diskussion
Pilzxylanasen im Vergleich zur neuen Bakterien-Xylanase
Die folgenden Teige wurden aus Mehl 98048 hergestellt und nach 10 und 45 Minuten auf Teigklebrigkeit getestet.
Tabelle 1 Mit verschiedenen Dosen zweier Pilzxylanasen und einer Bakterien-Xylanase hergestellter Teig (Dosis berechnet pro kg Mehl)
Der Teig in Tabelle 1 ergab die Teigklebrigkeitsergebnisse, die in Tabelle 2 und in 1 angegeben sind.
Tabelle 2 Mit verschiedenen Dosen verschiedener Xylanasen hergestellter Teig im Vergleich zur Kontrolle Der Teig wurde für 10 bzw. 45 Minuten ruhen gelassen. Die Klebrigkeit ist als g × s angegeben, der Klebrigkeitswert ist ein Mittelwert aus 5 Bestimmungen.
Die Daten aus Tabelle 2 sind in 1 veranschaulicht.
Wie aus Tabelle 2 und aus 1 zu erkennen ist, verursachen die Pilzxylanase X1 und die Xylanase in dem Novo-Produkt Teigklebrigkeit. Die neue Bakterien-Xylanase verursacht nicht dieselbe Klebrigkeit. Darüber hinaus scheint die Klebrigkeit im Vergleich zur Kontrolle abzunehmen.
Neue Bakterien-Xylanase im Vergleich zur Bakterien-Xylanase von Röhm
Um die Funktionalität der neuen Bakterien-Xylanase im Vergleich zu der Bakterien-Xylanase in dem Produkt Veron Spezial von Röhm zu testen, wurde unter Verwendung von Mehl 98022 der folgende Teig hergestellt (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3 Mit verschiedenen Dosen zweier Bakterien-Xylanasen hergestellter Teig. (Dosis berechnet pro kg Mehl)
Der Teig aus Tabelle 3 lieferte für die Teigklebrigkeit die in Tabelle 4 und 2 angegebenen Ergebnisse.
Tabelle 4 Mit verschiedenen Dosen verschiedener Xylanasen hergestellter Teig im Vergleich zur Kontrolle Die Klebrigkeit ist als g × s angegeben, der Klebrigkeitswert ist ein Mittelwert aus 5 Bestimmungen.
Die Daten aus Tabelle 4 sind in 2 veranschaulicht.
Die Ergebnisse zeigen, daß BX (die neue Bakterien-Xylanase) zu einer viel geringeren Klebrigkeit führt als die getestete Pilzxylanase. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß die neue Xylanase zu einer viel geringeren Teigklebrigkeit führt als die Bakterien-Xylanase von Röhm.
Beispiel 2
Inhibitorreinigung, -charakterisierung und Auswirkungen auf Xylanasen
Mehl
Bei diesen Experimenten wurden drei verschiedene Mehlsorten verwendet (Charge 98002, 98026 und 98058). Bei den Mehlchargen 98002 und 98058 handelt es sich um dänisches Mehl. Die Mehlcharge 98026 ist deutsches Mehl.
Inhibitorextraktion
Der Inhibitor wurde unter Verwendung von eiskaltem destilliertem Wasser und unter Rühren aus dem Mehl extrahiert. Ein Äquivalent Mehl wurde zu zwei Äquivalenten eiskaltem destilliertem Wasser zugegeben. Ein Magnetrührer wurde in das Gemisch eingesetzt, es wurde in ein Eisbad gestellt und für 20 Minuten gerührt. Nach dem Rühren wurde die Mehlaufschlämmung in Zentrifugenröhr chen gegeben und zentrifugiert (10000 g, 4°C und 10 Minuten). Der Überstand enthielt den Xylanaseinhibitor.
Inhibitortest
Inhibitortests wurden gemäß Protokoll 3 durchgeführt.
Inhibitorisolierung
Nach Extraktion von 100 g Mehlprobe (98026) wurde der Xylanaseinhibitor unter Verwendung der folgenden chromatographischen Techniken gereinigt:
Gelfiltrationschromatographie (dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt)
75 ml Extrakt wurden mit 10 ml/Minute auf eine 500 ml Superdex G-25 F-Säule (Pharmacia, Schweden), eingestellt mit 20 mM NaOAc, pH 4,25, aufgebracht. Das Elutionsmittel wurde in Fraktionen von 30 ml bei derselben Flußrate gesammelt. Alle Fraktionen wurden auf Inhibitor untersucht.
Kationenaustauschchromatographie (dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt)
Der aus dem Gelfiltrationsdurchlauf (240 ml) gesammelte Inhibitorpeak wurde mit 5 ml/Minute auf eine 50 ml SP Sepharose-Säule (Pharmacia, Schweden) aufgebracht. Nach dem Beladen wurde die Säule mit Puffer A (20 mM NaOAc, pH 4,25) bis zur Grundlinie gewaschen. Der Inhibitor wurde mit einem linearen Gradienten über 10 Säulenvolumen bei derselben Flußrate von Puffer A zu Puffer B (B: A + 350 mM NaCl) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 10 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde auf Xylanaseinhibitor untersucht.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt)
Der Inhibitorpeak aus der Kationenaustauschchromatographie (110 ml) wurde mit 1,0 M (NH₄)₂SO₄ versetzt und mit 2 ml/Minute auf eine 10 ml Phenyl Sepharose HIC- (Pharmacia, Schweden) Säule aufgebracht. Der Inhibitor wurde mit einem linearen Gradienten über 12 Säulenvolumen von A (20 mM NaPi, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH 6,0) zu B (20 mM NaPi, pH 6,0) aus der Säule eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 2,5 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde auf Xylanaseinhibitor untersucht.
Präparative Gelfiltrationschromatographie
5 ml Inhibitorpeak aus dem HIC-Durchlauf wurden unter Verwendung eines Rotationsverdampfers auf 2 ml aufkonzentriert. Diese Probe wurde mit 1 ml/Minute auf eine 330 ml Superdex 75 PG-(Pharmacia, Schweden) Säule aufgebracht. Das verwendete Puffersystem war 50 mM NaOAc, 0,2 M NaCl, pH 5,0. Das Eluat wurde in Fraktionen von 5,5 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde auf Xylanaseinhibitor untersucht.
Analyse der Proteaseaktivität
Um bestimmen zu können, ob die gefundene Inhibitorwirkung auf einen Inhibitor oder auf eine die Xylanase hydrolysierende Protease zurückzuführen war, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
Inkubationsversuche
2 ml reine Xylanase 980601 (siehe Endo-β-1,4-xylanasen) wurden mit 0,25 ml Inhibitorextrakt für drei Stunden bei 40°C inkubiert. Als Kontrolle wurde dieselbe Inkubation mit gekochtem (5 Minuten) Inhibitorextrakt hergestellt. Nach der Inkubation wurden zu den Proben 50 mM NaOAc, pH 4,5, in einer Menge von 2,5 ml zugegeben und mittels Gelfiltration auf einer PD-10-Säule (Pharmacia, Schweden) entsalzt, was 3,5 ml Probe in 50 mM NaOAc, pH 4,5 ergab.
Hydrolyseanalyse
Die beiden Proben reiner Xylanase aus den Inkubationsversuchen wurden auf einer SOURCE 15 S-Säule analysiert. 1 ml der gelfiltrierten Probe wurde mit 2 ml/Minute auf die Säule (eingestellt mit Puffer A: 50 mM NaOAc, pH 4,5) aufgebracht. Die Probe wurde mit einem linearen Gradienten über 20 Säulenvolumen von A nach B (B: A + 1 mM NaCl) eluiert und in Fraktionen von 2 ml gesammelt. Die Xylanase wurde unter Verwendung der OD 280 nm bestimmt und auf Xylanaseaktivität in den Fraktionen untersucht (100 μl Fraktion + 900 μl Puffer (0,1 M Zitronensäure – 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer, pH 5,0) + 1 Xylazyme-Tablette, 10 Minuten, 40°C. Reaktion abgeschlossen durch 10 ml 2% TRIS, blaue Farbe = Xylanaseaktivität).
Inhibitorcharakterisierung
Analytische Gelfiltrationschromatographie
100 μl (auf Rotationsverdampfer zweimal konzentriert) des Inhibitorpeaks aus dem HIC-Durchlauf wurden mit 0,5 ml/Minute auf eine 24 ml Superdex 75 10/30- (Pharmacia, Schweden) Säule aufge bracht. Der verwendete Laufpuffer war 50 mM NaOAc, 0,1 M NaCl, pH 5,0. Das Eluat wurde in Fraktionen von 2 ml gesammelt. Alle Fraktionen wurden auf Inhibitor untersucht.
Um die Größe des Inhibitors bestimmen zu können, wurde eine Reihe bekannter Proteine auf die 24 ml Superdex 75 10/30-Säule aufgebracht. Die Bedingungen für diesen Durchlauf waren wie oben beschrieben. Die verwendeten Standardproteine waren:

Protein Größe, kDa

BSA 67

Ovalbumin 43

Chymotrypsin 25

Ribonuklease A 13,7
Die Proteine wurden bei 280 nm detektiert.
SDS-PAGE
Zu Fraktionen der präparativen Gelfiltrationschromatographie wurden mit SDS-Probenpuffer (hergestellt gemäß NOVEX-Protokoll) versetzt, für drei Minuten gekocht und auf ein 8–16%-iges PAGE-Gel aufgebracht. Das Gel wurde gemäß NOVEX-Protokoll für Silberfärbung angefärbt. Als Molekulargewichtsmarker wurden die LMW-Marker von Pharmacia verwendet.
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Um den pl des nativen Inhibitors zu bestimmen, wurde eine Probe von gereinigtem Inhibitor (Fraktion 33 von 330 ml Superdex 75 PG) auf ein IEF-GEL (NOVEX), pH-Wert 3–10, aufgebracht. Das Gel wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers laufen gelassen. Der Broad pl Kit 3,5–9,3 von Pharmacia (Schweden) wurde als Standard verwendet. Das Gel wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Coomassie-Brilliantblau eingefärbt.
Chromatofokussierungschromatographie
Eine Probe von Fraktion 33 der präparativen Gelfiltrationschromatographie wurde zu Wasser gelfiltriert. 100 μl entsalzte Probe wurden auf eine Mono P HR 5/5-Säule (Pharmacia, Schweden) aufgebracht. Die Ausgangsbedingungen wurden mit 25 mM Ethanolamin-HCI, pH 9,4 erhalten. Die Säule wurde mit Poly-Puffer 96 : Wasser in einem Verhältnis von 1 : 10 eluiert. Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt (Flußrate: 0,5 ml/Min., Fraktionsgröße: 0,5 ml). Nach der Elution mit Poly-Puffer 96 wurde die Säule mit Poly-Puffer 74 : Wasser in einem Verhältnis von 1 : 10 weiter eluiert. Der pH-Wert wurde auf 3,80 eingestellt (Flußrate: 0,5 ml/Min, Fraktionsgröße: 0,5 ml).
Bei allen Fraktionen wurde der pH-Wert gemessen und sie wurden unter Verwendung von Protokoll 3 auf Xylanaseinhibitor untersucht.
Aminosäuresequenz
Es wurde eine Probe (erhalten aus Fraktion 33 von 330 ml Superdex 75 PG) von reinem Inhibitor aus präparativer Reinigung verwendet. 200 μl wurden auf eine C4-Umkehrphasensäule (Applied Biosystems) aufgebracht. Das verwendete Puffersystem war A: 0,1 % TFA in Wasser und B: 0,1 % TFA in 100% Acetonitril. Der Inhibitorpeak aus diesem Durchlauf wurde carboxymethyliert und erneut auf einer C4-Säule laufen gelassen. Auf diese Weise wurden zwei interessierende Inhibitorpeptide erhalten. Diese wurden N-terminal sequenziert. Darüber hinaus wurden die Peptide mit Lys-C verdaut. Die erhaltenen Peptide wurden unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie gewonnen und aminosäuresequenziert.
Um durch Aminosäuresequenzierung erhaltene Sequenzen zu verifizieren, wurde eine kleine Fraktion der interessierenden Probe unter Verwendung von MS (Voyager) analysiert.
Inhibitorkinetik
Inhibitortests wurden gemäß Protokoll 5 durchgeführt. In dieser Hinsicht wurde die für die vorausgehenden Inhibitorcharakterisierungsstudien verwendete Xylanase 980601 auf 40 TXU/ml verdünnt, und der Inhibitor wurde aus dem Mehl 98002 extrahiert. Für K_I-Bestimmungen wurden die folgenden Xylanasen verwendet: 980601, 980603, 980801, 980901, 980903, 980906 und 980907, verdünnt auf etwa 40 TXU/ml. Der für K_I-Bestimmungen verwendete Inhibitor wurde aus dem Mehl 98058 extrahiert.
Bestimmung der Inhibition als eine Funktion des pH-Wertes
Diese Experimente wurden durchgeführt, wie es in Protokoll 3 beschrieben ist, mit den folgenden Modifikationen. Neben der Verwendung von 650 μl Puffer (0,1 M Zitronensäure – 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat), pH 5,0, in dem Test wurde der Test auch unter Verwendung desselben Puffersystems bei pH 4, 6 und 7 durchgeführt.
Endo-β-1,4-xylanasen
Es wurden die folgenden Xylanasepräparationen verwendet:

980601 (BX): Gereinigte Präparation der neuen Bakterien-Xylanase von Danisco, exprimiert in E. coli. (1225 TXU/ml)
980603 (Röhm): Gereinigte Präparation von Belase-Xylanase von Frimond (identisch zu der von Röhm). (1050 TXU/ml)
980801 (X1): Gereinigte X1 aus Aspergillus niger (8400 TXU/g).
980802 (Röhm): Gereinigte Präparation von Belase-Xylanase von Frimond (identisch zu der von Röhm). (265 TXU/ml)
980901 (Novo): Gereinigte Präparation von Thermomyces-Xylanase aus Pentopan mono BG von Novo (2900 TXU/ml).
980903 (XM1): Gereinigte Mutante von Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (1375 TXU/ml).
980906 (XM3): Gereinigte Mutante von Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (1775 TXU/ml).
980907 (XM2): Gereinigte Mutante von Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (100 TXU/ml).
9535 (X3): Gereinigte Xylanase X3 aus Aspergillus niger (6490 TXU/ml).

Ergebnisse und Diskussion
Inhibitorextraktion zur Isolierung und Charakterisierung
100 g Mehl (98026) wurden extrahiert. Nach Zentrifugation wurde ein Überstand von 150 ml erhalten. Das Vorliegen von Inhibitor in diesem Extrakt wurde untersucht (Tabelle 5) und für positiv befunden.
Tabelle 5 Restaktivität als eine Funktion der +/– -Zugabe von Inhibitorextrakt aus Weizenmehl (98026) Die verwendete Xylanase ist 980601.
Inhibitorisolierung
75 ml des Inhibitorextrakts wurden auf eine 500 ml Gelfiltrationssäule aufgebracht (3). Nach der Untersuchung auf Inhibitor konnte dieser in den Fraktionen [4–11] lokalisiert werden (Tabelle 6).
Tabelle 6 Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie von 75 ml Inhibitorextrakt wurden auf Xylanaseinhibitor untersucht. OD-Durchlauf 1 bzw. 2 entsprechen den beiden Durchläufen, die auf der Säule durchgeführt wurden. Es wurde herausgefunden, daß in den Fraktionen [4–11 ] Inhibitor vorhanden war. Diese Fraktionen wurden für jeden Durchlauf vereinigt, was zweimal 240 ml ergab.
Die vereinigte Menge des Inhibitorpeaks in beiden Durchläufen auf der Gelfiltrationssäule betrug etwa 240 ml.
Zweimal wurde eine vereinigte Menge von 240 ml aus der Gelfiltration auf den Kationenaustauscher aufgebracht. Der Durchfluß wurde bezüglich Inhibitor als negativ befunden. Wie aus 4 und Tabelle 7 zu sehen ist, band der Inhibitor an die Säule und eluierte bei etwa 750 mM NaCl.
Tabelle 7 Fraktionen aus der Kationenaustauschchromatographie von 240 ml gelfiltriertem Inhibitorextrakt wurden auf das Vorhandensein von Xylanaseinhibitor getestet. OD-Durchlauf 1 bzw. 2 entsprechen den beiden Durchläufen, die auf der Säule durchgeführt wurden. Inhibitor wurde in den Fraktionen [44–54] gefunden.
Der vereinigte Inhibitor aus den Ionenaustausch-Durchläufen betrug 110 ml aus jedem Durchlauf. Zu diesen beiden vereinigten Fraktionen wurde (NH₄)₂SO₄ in einer Menge von 1,0 M zugegeben und in zwei Durchläufen auf die HIC-Säule aufgebracht. Der Durchfluß wurde auf Inhibitor untersucht und für negativ befunden. Wie aus 5 und Tabelle 8 zu sehen ist, band der gesamte Inhibitor an die Säule, und es wurde eine gute Abtrennung erzielt.
Die Analyse der Fraktionen aus der HIC-Chromatographie ist in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8 Fraktionen von 147 ml Inhibitorextrakt aus der HIC-Chromatographie wurden auf Xylanaseinhibitor untersucht. OD-Durchlauf 1 bzw. 2 entsprechen den beiden Durchläufen, die auf der Säule durchgeführt wurden. Inhibitor wurde in den Fraktionen [15–23] gefunden.
Die Fraktionen 17 und 18 aus der NIC-Chromatographie wurden etwa zweimal konzentriert und auf eine präparative Gelfiltrationssäule aufgebracht (6).
Die Analyse der Fraktionen aus der präparativen Gelfiltration ist in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9 Fraktionen aus der präparativen Gelfiltrationschromatographie von 2 ml konzentrierter Inhibitorprobe wurden auf das Vorhandensein von Xylanaseinhibitor untersucht. Inhibitor wurde in den Fraktionen [31–33] gefunden.
Analyse der Proteaseaktivität
Auf Basis des obigen Xylanaseinhibitortests kann nicht ausgeschlossen werden, daß die Abnahme der Aktivität der Xylanase, wenn sie mit dem Mehlextrakt gemischt ist, nicht auf eine proteolytische Hydrolyse der Xylanase zurückzuführen ist. Daher wurde eine gereinigte Xylanase mit einem "Inhibitor"-Extrakt inkubiert. Wie aus den 7 und 8 zu erkennen ist, scheint keine Hydrolyse stattzufinden. In dem Chromatogramm mit aktivem Inhibitor (8) ist etwas mehr Hintergrund zu sehen. Dieser Hintergrund entspricht jedoch dem Chromatogramm von Inhibitor alleine (Chromatogramm von Inhibitor nicht gezeigt). Der Unterschied im Hintergrund muß auf Präzipitation in der gekochten Inhibitorprobe zurückzu führen sein.
Inhibitorcharakterisierung
Analytische Gelfiltrationschromatographie
100 μl zweimal konzentrierte Inhibitorprobe aus Fraktion 18 des zweiten HIC-Durchlaufs wurden auf eine analytische 24 ml Superdex 75 10/30-Säule (Pharmacia, Schweden) aufgebracht (9). Das Eluat wurde in Fraktionen von 2 ml gesammelt. Diese Fraktionen wurden auf Xylanaseinhibitor untersucht (Tabelle 10).
Tabelle 10 Fraktionen aus der analytischen Gelfiltrationschromatographie von 100 μl konzentrierter Inhibitorprobe wurden auf das Vorliegen von Xylanaseinhibitor untersucht. Inhibitor wurde in den Fraktionen [6–7] gefunden.
Nach der Gelfiltration der aufkonzentrierten Inhibitorprobe wurde ein Gemisch aus vier Proteinen mit Standard-Molekulargewicht unter Verwendung exakt desselben Verfahrens auf die Säule aufgebracht (Chromatogramm nicht gezeigt). In Tabelle 11 sind die Molekulargewichte und die Elutionszeiten der Proteine zusammengefaßt. Tabelle 11 Für die Bestimmung des Molekulargewichts des Inhibitors verwendete Standardproteine. Abkürzungen und Gleichungen sind unterhalb der Tabelle erklärt.

*) Kav = (Ve – Vo)/Vt – Vo)

log (Molekulargew.) ist als eine Funktion von Kav aufgetragen. Es ist möglich, eine Gleichung zu erhalten und die molekulare Größe eines unbekannten Moleküls abzuschätzen (10).
Unter Verwendung der in 10 erhaltenen Gleichung und der Retentionszeit für den Inhibitor ist es möglich, die molekulare Größe des Inhibitors zu berechnen:
Das für den Inhibitor gefundene Molekulargewicht war höher, als wir es nach Rouau und Surget (1998, Evidence for the presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flour. Journal of Cereal Science. 28: 63–70) erwartet hatten; das Molekulargewicht des Moleküls beträgt etwa 8 kDa. Das durch Gelfiltration erhaltene MW könnte durch die Aggregation verschiedener Inhibitormoleküle erklärt werden. Um dies weiter zu untersuchen, wurde eine SDS-PAGE mit den Fraktionen 31, 32 und 33 aus der präparativen Gelfiltrationschromatographie durchgeführt (11). Wie aus diesem Gel zu sehen ist, erscheinen drei Banden in den mit gereinigter Inhibitorprobe beladenen Spuren. Diese Banden entsprechen Proteinen mit Molekulargewichten von etwa 40, 30 und 10 kDa.
Molekulargewichtsbestimmung mittels MS
Eine Probe von Fraktion 33 aus der präparativen Gelfiltration des Inhibitors wurde unter Verwendung des Presorb-Systems und 5 Volumen von 20 mM Essigsäure entsalzt. 200 μl wurden auf eine C4-Umkehrphasensäule (Applied Biosystems) aufgebracht. Bei diesem Durchlauf wurden drei Peaks erhalten. Einer dieser Peaks (Peak 3) dominierte eindeutig, und es wurde angenommen, daß es sich um den Inhibitor handelte (12). Die anderen Peaks aus dem Durchlauf wurden ebenfalls sequenziert. Aus der erhaltenen Sequenz kann geschlossen werden, daß sie alle aus demselben Weizenprotein, Serpin, stammen und nicht mit dem Inhibitor (Peak 3) identisch sind. Daraus wird gefolgert, daß Peak 3 der interessierende Xylanaseinhibitor ist. Dieser Peak wurde mittels MS (Voyager) weiter charakterisiert.
MS-Spektrenanylase zeigte ein Signal, das einem Protein von 39503 Da entspricht, wobei Sinapinsäure als Matrix verwendet wurde (13).
Wie oben erwähnt, zeigte das SDS-PAGE-Gel drei Banden: eine Bande bei etwa 10 kDa, eine bei etwa 30 kDa und eine Bande bei etwa 40 kDa. Um die aus der SDS-PAGE erhaltenen Ergebnisse zu erklären, wurde eine reine dominante Fraktion gesammelt, lyophilisiert und carboxymethyliert und anschließend unter Verwendung derselben Bedingungen, wie sie oben erwähnt wurden, erneut auf der C4-Säule laufen gelassen.
Die bei diesem erneuten Durchlauf erhaltene Fraktion (14) wurde mittels MS analysiert. Wie aus den 15 und 16 zu sehen ist, beträgt das Molekulargewicht dieser Polypeptide 12104 und 28222 Da.
Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, nehmen wir an, daß der Xylanaseinhibitor entweder ein natives Dipeptid (Molekulargewicht 39503 Da) ist oder während des Analysevorgangs denaturiert und reduziert wird (zwei Peptide mit einem Molekulargewicht von 12104 bzw. 28222).
Bestimmung des pl für den Xylanaseinhibitor unter Verwendung von IEF und Chromatofokussierungschromatoqraphie
Das IEF-Gel zeigte drei Banden im alkalischen Bereich (etwa 9,3, 8,6 bzw. 8,2) und drei Banden im sauren Bereich (etwa 5,1, 5,3 bzw. 5,5) (17). Auf Basis dieser Ergebnisse alleine könnte es unmöglich sein, den pl des nativen Xylanaseinhibitors zu bestimmen. In dieser Hinsicht wußten wir aus den Sequenzierungsergebnissen, daß die Probe nur den Xylanaseinhibitor und drei Fragmente von Serpin von etwa 4500 Da enthielt. Eine theoretische Berechnung des pl für Serpin ergibt 5,58, und der pl, der für das durch Sequenzierung erhaltene Fragment berechnet wird, ergibt pl 5,46 (unter Verwendung von Swiss Prot-Programmen). Dies könnte darauf hindeuten, daß die drei sauren Banden, die auf dem Gel zu sehen sind, die drei Peaks von Serpin sind, die bei Umkehrphasenchromatographie zu sehen sind (12), und daß die drei alkalischen Banden die drei verschiedenen Formen des Xylanaseinhibitors sind, d.h. die Form des nativen Dipeptids und die der zwei Peptide (wie durch Sequenzierung angezeigt).
Wie aus den in 18 gezeigten Ergebnissen der Chromatofokussierungschromatographie zu sehen ist, bindet der Xylanaseinhibitor unter den gegebenen Bedingungen nicht an die Säule. Dies könnte bedeuten, daß der native Xylanaseinhibitor einen pl von 8,5 oder sogar noch höher hat. Somit könnte es scheinen, daß die obigen Annahmen, nämlich daß es auf dem IEF-Gel drei alkalische Banden gibt und es daher drei mögliche Formen des Xylanaseinhibitors geben könnte, richtig sein könnten.
Zusammenfassend nehmen wir an, daß der native Xylanaseinhibitor einen pl im Bereich von 8,0–9,5 hat. Innerhalb dieses Bereichs gibt es drei Banden. Diese drei Banden entsprechen wahrscheinlich dem Xylanaseinhibitor, der möglicherweise in drei Formen existiert (siehe die Ergebnisse, die unter Verwendung von IEF bestimmt wurden). In dieser Hinsicht läuft das Protein bei Verwendung von IEF als natives Protein, doch können durch diese Technik einige Dipeptide teilweise beschädigt werden, was zu mehr als einer Bande führt.
Sequenzdaten
Die beiden den Inhibitor bildenden Peptide wurden sequenziert, was N-terminale und innere Sequenzen lieferte. Die Ergebnisse sind in dem angefügten Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:13–19 wiedergegeben.
Die die erste Kette (Kette A) bildenden Sequenzen sind als SEQ ID NO:13 und 14 gezeigt. Die die zweite Kette (Kette B) bildenden Sequenzen sind als SEQ ID NO:15 bis 19 gezeigt.
Eine Datenbanksuche auf Homologie zu den sequenzierten Polypeptiden verlief negativ. Keines der Polypeptide wurde zuvor sequenziert oder beschrieben.
Wirkung des Inhibitors auf verschiedene Xylanasen
Es wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um die Inhibition verschiedener Xylanasen zu untersuchen. Zuerst nahmen wir an, daß die Abnahme der Xylanaseaktivität auf eine proteolytische Aktivität in dem Extrakt zurückzuführen ist. Daher wurden verschiedene Xylanasen mit verschiedenen Mengen an "Inhibitor"-Extrakt (19) inkubiert. Es wurde herausgefunden, daß die Xylanasen in unterschiedlichem Ausmaß gehemmt wurden. Wir fanden ebenfalls heraus, daß es eine Zunahme der Inhibition als Funktion der "Inhibitor"-Konzentration zu geben schien.
Die in 19 veranschaulichten Ergebnisse könnten anzeigen, daß die Abnahme auf Proteolyse oder Inhibitor zurückzuführen ist. Zeitverlaufsexperimente mit konstanten Xylanase- und Inhibitorkonzentrationen sowie die oben genannten Ergebnisse unter "Analyse der Proteaseaktivität" zeigten keine verminderte Aktivität als eine Funktion der Zeit. Um in der Lage zu sein, zwischen Protease und Inhibitor zu unterscheiden, muß eine echte Kinetik durchgeführt werden (siehe "Inhibitorkinetiken").
Zwei Bacillus subtilis-Xylanasen wurden im Hinblick auf ihre Backleistung sehr genau untersucht. Diese Xylanasen waren im Hinblick auf ihre Funktionalität leicht verschieden, was bedeutet, daß eine ein etwas größeres spezifisches Volumen ergab, wenn beide in identischen Mengen gebacken wurden. Eine Erklärung könnte die unterschiedliche Inhibition ihrer Aktivität in dem Mehl sein. Es wurde daher ein Experiment durchgeführt, um dies zu untersuchen. Das Experiment wurde unter Verwendung zweier verschiedener Mehlarten als Quelle für den Inhibitor zweimal wiederholt (Tabelle 14).
Tabelle 14 Inhibition zweier Xylanasen (980601 und 980603) durch Inhibitor, der aus zwei Arten von Mehl (98002 und 98026) gewonnen wurde. Die Inhibition ist als % Inhibition und als % Restaktivität im Vergleich zur Kontrolle berechnet.
Der Versuch zeigt, daß die beiden Xylanasen in unterschiedlichem Ausmaß durch den Inhibitor gehemmt werden. Die Xylanasen unterscheiden sich nur durch sechs Aminosäuren.
Auf Basis von 980601 wurden drei Xylanasemutanten hergestellt (XM1, XM2 und XM3). Diese Mutanten wurden auf Inhibition analysiert (20).
Wie in 20 zu erkennen ist, unterscheiden sich die drei Mutanten hinsichtlich ihrer Restaktivität, was bedeutet, daß sie in unterschiedlichem Ausmaß durch den Xylanaseinhibitor gehemmt werden. Vier (BX, Röhm, XM1 und XM3) der fünf Xylanasen haben dieselbe spezifische Aktivität (etwa 25000 TXU/mg Protein). Es wird erwartet, daß XM2 dieselbe spezifische Aktivität besitzt.
Der Unterschied in der Inhibition zwischen XM1 und XM2 beträgt etwa 250% (die Restaktivität von XM1 ist 2,5-mal höher als die Restaktivität von XM2). Dieser Unterschied ist auf eine Aminosäure zurückzuführen. Die Aminosäure 122 in XM2 ändert sich von Arginin zu Asparagin, was weniger positive Ladung in die Nähe der aktiven Stelle bringt.
Inhibitorkinetik
Es wurden einfache vorläufige Kinetiken durchgeführt, um bestimmen zu können, ob der Inhibitor kompetitiv oder nicht-kompetitiv ist.
Verschiedene Mengen von Substrat wurden mit einer konstanten Xylanase- und Inhibitorkonzentration inkubiert (21).
Wie aus 21 zu erkennen ist, beträgt V_max für Xylanase sowohl mit Inhibitor als auch ohne Inhibitor etwa 1,19. Dies bedeutet, daß die Inhibition kompetitiv ist.
Aufgrund der oben genannten vorläufigen Inhibitorexperimente, welche auf einen Unterschied im K_i zwischen den untersuchten Xylanasen hinwiesen, wurde der tatsächliche K_I für verschiedene Xylanasen bestimmt. Wie aus den Daten in 22 zu erkennen ist, unterscheiden sich die K_I-Werte der Xylanasen nicht signifikant. Dies bestätigt die Ergebnisse, die durch die einfache vorläufige Inhibitorcharakterisierung erhalten wurden.
Inhibition als eine Funktion des pH-Werts
Eine einfache Untersuchung auf einen Xylanaseinhibitor bei einem anderen pH-Wert ergab, daß der pH-Wert eine Auswirkung auf die Inhibition der Xylanasen zu haben schien. Daher wurde ein Experiment durchgeführt, um diese Wirkung zu untersuchen. Wie aus 23 zu sehen ist, wird die Inhibition der Xylanasen durch den pH-Wert beeinflußt. 24 veranschaulicht die pH-Optima für die Xylanasen. Vergleicht man diese zwei Kurven, so sieht man die stärkste Inhibition beim pH-Optimum der Xylanase, mit Ausnahme der Messung bei pH 4 für die Novo-Xylanase (980901).
Um zu bestimmen, ob die Inhibitionsverhältnisse, die in den hier erläuterten Tests gemessen wurden, im Teig relevant sind, können einige Berechnungen vorgenommen werden: Inhibitorextraktion

Gramm Mehl 6

ml Wasser: 12

g Mehl/ml: 0,5

g Mehl im Test: 0,05

Xylanaselösung

TXU/ml: 12

TXU/ml im Test: 3

Inhibitor: Xylanase Verhältnisse

TXU/kg Mehl: 60000 in Inhibitortest

TXU/kg Mehl: 3000 in Bäckereianwendungen
Aus den obigen Berechnungen kann das Inhibitor: Xylanase-Verhältnis in dem Test so berechnet werden, daß es im Test etwa 20-mal kleiner ist als in Teig. Dies kann nur bedeuten, daß die Xylanase in Teig viel stärker gehemmt sein muß. Die Mobilität und die Wasseraktivität ist in Teig weitaus geringer, und dies könnte die Inhibition beeinflussen.
Zusammenfassende Diskussion
Weizenmehl enthält endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitor. Der Inhibitor kann unter Verwendung einer einfachen Extraktion unter Verwendung von Wasser aus Weizenmehl extrahiert werden, was bedeutet, daß der Inhibitor wasserlöslich ist. Der Inhibitor wurde unter Verwendung von chromatographischen Techniken der Gelfiltration, des Ionenaustauschs und der hydrophoben Interaktion gereinigt.
Die Charakterisierung des gereinigten Inhibitors unter Verwendung von analytischer Gelfiltrationschromatographie, SDS-PAGE, Umkehrphasenchromatographie und MS ergab ein Polypeptid von etwa 40 kDa. Dieses Polypeptid stellte sich als Dipeptid heraus, welches zwei Peptide mit einem Molekulargewicht von 12104 bzw. 28222 Da enthielt. Der gereinigte Inhibitor (genauer gesagt die beiden Peptide) wurden N-terminal sequenziert, gefolgt von Verdau und Sequenzierung der erhaltenen Peptide.
Das vorläufige Experiment mit dem Inhibitor zeigte, daß die gefundene Abnahme der Xylanaseaktivität auf Proteolyse zurückzuführen sein könnte. Die Analyse von Inkubationstests (Xylanase + Inhibitor) und der Kinetik des Inhibitors ergab jedoch, daß die beobachtete Abnahme der Xylanaseaktivität auf einen kompetitiven Inhibitor zurückzuführen war.
Inhibitorexperimente unter Verwendung mehrerer Xylanasen zeigen Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor. Einige Xylanasen werden durch den Inhibitor zu fast 100% gehemmt (bei einem kleineren Inhibitor: Xylanase-Verhältnis als in dem Mehl). Durch Variieren des pH-Werts in dem Inhibitortest ergibt sich, daß die Inhibition in hohem Maße vom ph-Wert im Test abhängig ist. Eine Untersuchung der Xylanasemutanten ergab, daß die Veränderung einer Aminosäure zu einer 250%-igen Verringerung der Inhibition führen kann.
Um die oben beschriebenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden K_I-Werte für mehrere Xylanasen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten in Abhängigkeit von der verwendeten Xylanase verschiedene K_I-Werte, was die Unterschiede in der Resistenz gegen den Inhibitor als eine Funktion der Xylanase, wie sie in früheren Ergebnissen gefunden wurde, bestätigte.
Beispiel 3
Backversuche
Die unten stehenden Daten stammen aus einem Backversuch mit der Mutante XM1. Die Daten zeigen, daß diese neue Xylanasemutante BX (Bacillus subtilis-Wildtyp) auf Basis des Volumens eindeutig überlegen ist. Auf Basis der Klebrigkeitsmessung besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Xylanasen.
Enzyme

980902 (BX): Gereinigte Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (2000 TXU/ml).
980903 (XM1): Gereinigte Mutante von Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (1375 TXU/ml).

Mehl

Dänisches Mehl, Charge 98022.

Backtest (Brötchen mit harter Kruste)
2000 g Mehl, 40 g Trockenhefe, 32 g Zucker, 32 g Salz, 4 g GRINDSTED^TM Panodan A2020, Wasser, 400 Brabender-Einheiten + 4%, wurden in einem Hobart-Mischer mit Haken für 2 Minuten bei geringer Geschwindigkeit und für 9 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Die Teigtemperatur betrug 26°C. Das Wiegen des Teigs ergab 1350 g. Ruhezeit 10 Minuten bei 30°C, gefolgt von Formen in einem Fortuna-Automat. Gehenlassen für 45 Minuten bei 34°C, 85% RH. Gebacken in einem Bago-Ofen für 18 Minuten bei 220°C und Bedampfen für 12 Sekunden.
Nach dem Abkühlen wurden die Brötchen gewogen, und ihr Volumen wurde mit dem Rapssamen-Verschiebungsverfahren bestimmt.
Klebrigkeitsmessung
Die Klebrigkeitsmessung wurde gemäß Protokoll 2 durchgeführt.
Wie aus Tabelle 15 zu sehen ist, liefert die neue Xylanasemutante (XM1) bedeutend größere Zunahmen des Brotvolumens als BX.
Tabelle 15 Zunahme des Brotvolumens (ml/Gramm) und der Klebrigkeit (g × s) als Funktion zweier Xylanasen (BX und XM1), die in verschiedenen Mengen verwendet wurden
Die Daten sind in den 25, 26 und 27 gezeigt.
Beispiel 4
Teigklebrigkeit als eine Funktion von XM1, der Xylanase Veron Spezial von Röhm und einer gereinigten Version der Xylanase Veron Spezial von Röhm
Um zu bestimmen, ob die neue Xylanase XM1 einen klebrigeren oder einen weniger klebrigen Teig ergibt als die Xylanase Veron Spezial von Röhm (und eine gereinigte Version davon), wurde Teig hergestellt und die Klebrigkeit als eine Funktion der Xylanase bestimmt.
Mehl
Es wurde dänisches Mehl, Charge 98022, verwendet.
Teigherstellung
Teig wurde wie in Protokoll 2 beschrieben hergestellt. Nach dem Mischen ruhte der Teig für 10 bzw. 45 Minuten in dicht verschlossenen Behältern, ehe die Klebrigkeit gemessen wurde.
Messung der Klebrigkeit
Klebrigkeitsmessungen wurden gemäß Protokoll 2 durchgeführt.
Enzyme

980903 (XM1): Gereinigte Mutante von Bacillus sub.-Wildtyp-Xylanase, exprimiert in E. coli (1375 TXU/ml).
#2199: Die Xylanase Veron Spezial von Röhm (10500 TXU/g)
980603 (Röhm): Gereinigte Präparation von Frimonds Belase-Xylanase (identisch zu der von Röhm) (1050 TXU/ml).

Es wurden die folgenden Teige hergestellt (Tabelle 16):
Tabelle 16 Teig, der für die Bestimmung der Klebrigkeit hergestellt wurde
Der Teig in Tabelle 16 lieferte die Klebrigkeitsergebnisse in Tabelle 17.
Tabelle 17 Ergebnisse der Klebrigkeitsmessung von Teig, hergestellt mit gereinigter Röhm-Xylanase, Kontrolle und Xylanase Veron Spezial von Röhm
Die Daten sind in den 28, 29 und 30 gezeigt.
Die Zunahme der Klebrigkeit bei Verwendung von XM1 ist geringer als die Zunahme der Klebrigkeit bei Verwendung der gereinigten Xylanase von Röhm. Die Zunahme der Klebrigkeit, die unter Verwendung der ungereinigten Xylanase von Röhm erhalten wurde, ist viel größer.
Beispiel 5
Teigklebrigkeit als eine Funktion von bakterieller Endo-β-1,4-glucanase
Die nachfolgenden Ergebnisse stammen aus einem Experiment, das zur Untersuchung der Fähigkeit von bakterieller Endo-β-1,4-glucanase, Klebrigkeit hervorzurufen, diente.
Enzyme

981102–1 (Xyl): Entspricht einer gereinigten Präparation von Bakterien-Xylanase des Produkts Veron Spezial von Röhm. Die Präparation ist reine Xylanase und enthält keine Endo-β-1,4-glucanase (350 TXU/ml).
981102–2 (Xyl + Gluc): Entspricht einer gereinigten Präparation von Bakterien-Xylanase des Produkts Veron Spezial von Röhm, die Endo-β-1,4-glucanase (900 TXU/ml + 19 BGU/ml) enthält.

Xylanasetest
Xylanasetests wurden gemäß Protokoll 1 durchgeführt.
Glucanasetest
Glucanasetests wurden gemäß Protokoll 4 durchgeführt.
Mehl
Es wurde dänisches Mehl, Charge Nr. 98058 verwendet. Die Absorption von Wasser bei 400 BU beträgt 60%.
Teigherstellung
Teig wurde wie in Protokoll 2 beschrieben hergestellt. Nach dem Mischen ruhte der Teig für 10 bzw. 45 Minuten bei 30°C in dicht verschlossenen Behältern.
Klebrigkeitsmessung
Klebrigkeitsmessungen wurden gemäß Protokoll 2 durchgeführt.
Der in Tabelle 18 aufgeführte Teig wurde hergestellt und auf Klebrigkeit untersucht.
Tabelle 18 Teig, der für die Untersuchung der Klebrigkeit hergestellt wurde
Der in Tabelle 18 aufgelistete Teig lieferte die Klebrigkeitswerte in Tabelle 19.
Tabelle 19 Klebrigkeitswerte aus Teig mit Xylanase und Xylanase + Glucanase Teig Nr. bezieht sich auf die Teig-Nr. in Tabelle 18 Stik_10 bedeutet Ergebnisse von Klebrigkeitsmessungen nach 10 Minuten Stik_45 bedeutet Messungen nach 45 Minuten Ruhezeit
Wie aus Tabelle 19 zu sehen ist, erhöht die Zugabe von Endo-β-1,4-glucanase die Klebrigkeit des Teigs. Die Ergebnisse aus Tabelle 19 sind in 31 gezeigt.
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit, und die Beispiele zeigen unter anderem folgendes:

a. Die Isolierung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors aus Weizenmehl.
b. Die Charakterisierung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors, der aus Weizenmehl isoliert wurde.
c. Die Charakterisierung der Wirkung des endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors auf verschiedene Xylanasen.
d. Ein Mittel zum Auswählen von Xylanasen, die durch den endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitor nicht nachteilig beeinflußt werden.
e. Ein Mittel zum Auswählen von Xylanasen, die durch Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitoren nicht nachteilig beeinflußt werden.
f. Xylanasen, die Teig liefern, welcher im Vergleich zu Teigen, die Pilzxylanasen enthalten, ein gutes Volumen und eine akzeptable Klebrigkeit besitzt.
g. Verfahren zum Screenen von Xylanasen und/oder Mutieren derselben unter Verwendung eines endogenen Endo-β-1,4-xylanase-Inhibitors, und die Verwendung dieser Xylanasen oder Mutanten davon bei der Herstellung von Teigen.
h. Ein Lebensmittel, das mit den Xylanasen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.

Alle in der obigen Beschreibung genannten Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen Verfahren und Syste me der vorliegenden Erfindung liegen für Fachleute auf dem Gebiet auf der Hand, ohne vom Gedanken und Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Obwohl die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, daß die beanspruchte Erfindung nicht in ungebührlicher Weise auf solche spezifischen Ausführungsformen beschränkt sein soll. Tatsächlich sollen verschiedene Modifikationen der beschriebenen Arten der Ausführung der Erfindung, die für Fachleute auf dem Gebiet der Biochemie und der Biotechnologie oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, innerhalb des Schutzumfangs der nachfolgenden Ansprüche liegen.
SEQUENZPROTOKOLL
Die folgenden Seiten geben eine Reihe von Sequenzprotokollen wieder, die die folgenden Sequenzen umfassen:
SEQ ID NO:1 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:2 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:3 – Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Xylanase (R)
SEQ ID NO:4 – Nukleotidsequenz einer Wildtyp-Xylanase (R)
SEQ ID NO:5 – Aminosäuresequenz einer Wildtyp-Xylanase (D)
SEQ ID NO:6 – Nukleotidsequenz einer Wildtyp-Xylanase (D)
SEQ ID NO:7 -Aminosäuresequenz einer Xylanasemutante (XM1)
SEQ ID NO:8 – Nukleotidsequenz einer Xylanasemutante (XM1)
SEQ ID NO:9 – Aminosäuresequenz einer Xylanasemutante (XM2)
SEQ ID NO:10 – Nukleotidsequenz einer Xylanasemutante (XM2)
SEQ ID NO:11 – Aminosäuresequenz einer Xylanasemutante (XM3)
SEQ ID NO:12 – Nukleotidsequenz einer Xylanasemutante (XM3)
SEQ ID NO:13 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:14 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:15 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:16 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:17 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:18 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
SEQ ID NO:19 – Aminosäuresequenz von dem Inhibitor
Anmerkungen:
Für XM1, XM2 und XM3 führten wir durch ortsspezifische Mutation des Gens Veränderungen (wie gezeigt) in die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz ein. Das mutierte Gen kann in E. coli, in Bacillus oder in irgendeinem Organismus nach Wahl exprimiert werden.
SEQ ID NO. 1
SEQ ID NO. 2
Inhibitor KETTE A

Sequenzquelle: Weizenmehl-Xylanaseinhibitor
N-terminal:
GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEQ ID NO.13
C-terminal:
KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEQ ID NO. 14

Inhibitor KETTE B

Sequenzquelle: Weizenmehl-Xylanaseinhibitor
N-terminal:
LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21aa) SEQ ID NO. 15
Lys-C verdaute Kette B:
LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEQ ID NO. 16
GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE (24aa) SEQ ID NO. 17
VNVGVLAACAPSK (13aa) SEQ ID NO. 18
VANRFLLCLPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLVVVK SEQ ID NO. 19

Claims

Verwendung einer als SEQ ID NO:5 dargestellten Aminosäuresequenz zur Herstellung eines Nahrungsmittels oder einer Substanz (z.B. eines Teiges) für die Herstellung desselben.
Bäckereiprodukt, welches eine als SEQ ID NO:5 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt oder aus dieser hergestellt ist.
Verwendung einer Aminosäuresequenz, die die als SEQ ID NO:5 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt, zur Herstellung eines Teiges, der weniger klebrig ist als ein Teig, der eine Pilzxylanase umfaßt, wobei die Klebrigkeit durch das Klebrigkeitsbestimmungsverfahren, welches hierin als Protokoll 2 wiedergegeben ist, bestimmt werden kann.