ES2270467T3 - Metodos para detectar y amplificar secuencias de acido nucleico utilizando oligonucleotidos modificados que tienen una tm especifica de la diana mas elevada. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS QUE CONTIENEN UNO O MAS NUCLEOTIDOS MODIFICADOS LO QUE AUMENTA LA AFINIDAD AL ENLACE DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS A ACIDOS NUCLEICOS OBJETIVO QUE TIENEN UNA SECUENCIA BASE DE NUCLEOTIDOS COMPLEMENTARIA. ESTOS OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS SE HIBRIDAN A LA SECUENCIA OBJETIVO A UNA VELOCIDAD MAYOR A LA QUE LO HACEN LOS OLIGONUCLEOTIDOS NO MODIFICADOS CON UNA SECUENCIA BASE DE NUCLEOTIDOS IDENTICA. TALES OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS INCLUYEN OLIGONUCLEOTIDOS QUE CONTIENE AL MENOS UNA FRACCION DE 2'' - O METILRIBOFURANOSILO UNIDA A UNA BASE DE NITROGENO. LOS OLIGONUCLEOTIDOS SE PUEDEN MODIFICAR SEGUN LA PRESENTE INVENCION PARA QUE SE UNAN PREFERENTEMENTE A OBJETIVOS DE ARN. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA LA UTILIZACION DE ESTOS OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS Y A KITS QUE LOS CONTIENEN.
Description
Métodos para detectar y amplificar secuencias de
ácido nucleico utilizando oligonucleótidos modificados que tienen
una T_{m} específica de la diana más elevada.
Esta invención se refiere a métodos y
composiciones para la detección y amplificación de secuencias de
ácidos nucleicos utilizando oligonucleótidos que contienen uno o más
nucleátidos que presentan una o más modificaciones, lo que se
traduce en una mayor afinidad por la diana. Como consecuencia, los
métodos y composiciones de la presente invención ofrecen ventajas
para las aplicaciones en las que se utiliza la hibridación de ácidos
nucleicos, por ejemplo, en la realización de diagnósticos médicos y
veterinarios, en la realización de pruebas de alimentos, y en
medicina forense.
En los años recientes, la hibridación de ácidos
nucleicos se ha convertido en una forma cada vez más importante de
identificar, medir y detectar la presencia de ácidos nucleicos
concretos en una muestra determinada. Así, por ejemplo, los campos
de los diagnósticos médicos, de la realización de pruebas de
alimentos y medioambientales, y de la medicina forense, se han
beneficiado del uso de la hibridación de ácidos nucleicos como
forma rápida, sencilla y extraordinariamente exacta de probar la
presencia o ausencia de contaminantes biológicos o microorganismos
determinados en una muestra dada.
La mayoría de los esquemas de hibridación de
ácidos nucleicos tienen características comunes. Una de estas
características comunes es el uso de sondas de ácidos nucleicos de
una sola cadena (o de sondas de doble cadena desnaturalizadas) que
tienen una secuencia de nucleótidos conocida o claramente definida.
Las moléculas sonda pueden obtenerse de fuentes biológicas, por
ejemplo, ADN o ARN genómico, o pueden sintetizarse por medios
enzimáticos (en una célula huésped procariótica o eucariótica, o
bien, in vitro). Actualmente, la mayoría de las sondas de
ácidos nucleicos que se usan comúnmente son sondas de
oligonucleótidos que se crean mediante métodos de síntesis química
("oligonucleótidos sintéticos"). Uno de tales métodos de
síntesis es la adición secuencial automatizada de nucleótidos
protegidos, activados en su extremo 3', al extremo 5' de una cadena
creciente de oligonucleótidos unidos a fase sólida; tras esta
adición secuencial, se separa el oligonucleótido completado del
soporte, y se lo desprotege. Véase, por ejemplo, Eckstein,
Oligonucleotides & Analogues: A Practical Approach
(1991).
Los oligonucleótidos sintéticos que se utilizan
como sondas de hibridación suelen ser desoxirribonucleótidos que
tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la
secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que se desea detectar.
Normalmente se prefieren los oligonucleótidos de ADN, por una serie
de razones. Entre estas razones está la Imayor estabilidad que
tiene el ADN frente a la hidrólisis enzimática cuando es expuesto a
muestras comunes, ya que en las muestras se da una presencia casi
ubicua de diversas ARNasas. Además, se sabe que el ARN es menos
estable químicamente que el ADN; por ejemplo, la degradación
del ARN se ve facilitada por la presencia de metales pesados y
bases. En comparación con el ARN, en las condiciones habituales de
los ensayos (en el contexto del presente documento, por
"ensayos" y "pruebas" se entiende los procedimientos que
se llevan a cabo para la detección, el análisis, la determinación,
etc., de o con materiales biológicos o sintéticos), el ADN es menos
proclive a adoptar estructuras secundarias estables. La formación
de dichas estructuras secundarias puede hacer que los
oligonucleótidos dejen de estar disponibles para la hibridación
intermolecular. Sin embargo, es posible utilizar oligonucleótidos
de ARN, aunque se consideren menos preferibles.
La hibridación de ácidos nucleicos aprovecha la
capacidad que los ácidos nucleicos monocatenarios (de una sola
cadena) tienen para formar híbridos estables con las
correspondientes regiones de cadenas de ácidos nucleicos que tienen
secuencias de nucleótidos complementarias. Habitualmente, dichos
híbridos constan de dúplex de doble cadena, aunque también se ha
observado la formación de estructuras de triple cadena. En general,
las cadenas simples de ADN o de ARN se forman a partir de
nucleótidos que contienen las bases adenina (A), citosina (C),
timidina (T), guanina (G), uracilo (U), o inosina (I). Las cadenas
de una sola hélice pueden hibridarse, formando una estructura de
doble cadena que queda unida por puentes de hidrógeno entre los
pares de bases complementarias. Generalmente, A se une mediante
puentes de hidrógeno a T o U, mientras que G o I se unen mediante
puentes de hidrógeno a C. En las cadenas de doble hélice están
presentes los clásicos pares de bases AT o AU, TA o UA, GC, o CG.
También pueden estar presentes algunos pares de bases mal
emparejadas, (por ejemplo, AG, GU). En las condiciones de
hibridación apropiadas, pueden formarse híbridos ADN/ADN, ARN/ADN,
o ARN/ARN.
"Complementarias" significa que las
secuencias de nucleótidos de las regiones correspondientes de dos
ácidos nucleicos monocatenarios, o dos regiones diferentes del
mismo ácido nucleico monocatenario, tienen una composición de bases
nucleotídicas que permite que las cadenas únicas se hibriden entre
sí, formando una región de doble cadena estable, unida por puentes
de hidrógeno, en condiciones de hibridación astringentes. Cuando
una secuencia contigua de nucleótidos de una región monocatenaria
es capaz de formar una serie de pares de bases unidas por puentes de
hidrógeno "canónicos" con una secuencia de nucleótidos análoga
a la otra región monocatenaria, de manera que A se empareje con U o
T, y C se empareje con G, se considera que las secuencias de
nucleótidos son "perfectamente" complementarias.
La enorme especificidad de la hibridación de
ácidos nucleicos, que en algunas circunstancias puede permitir
discriminar ácidos nucleicos que difieren entre sí en tan solo una
base, ha posibilitado el desarrollo de ensayos, basados en la
hibridación, para muestras que contengan microorganismos concretos,
ácidos nucleicos que presenten determinados marcadores genéticos,
tejidos, líquidos biológicos, y muestras similares. A menudo este
tipo de ensayos son capaces de identificar ácidos nucleicos que
pertenecen a especies concretas de microorganismos, en muestras que
contienen también otras especies, estrechamente relacionadas con
las que se desea identificar. Además, los ensayos de hibridación de
ácidos nucleicos son capaces de detectar o identificar,
específicamente, a ciertos individuos, o grupos de individuos,
dentro de una misma especie, como ocurre con el uso en medicina
forense de las técnicas RLFP (siglas en inglés de "polimorfismo
de la longitud de los fragmentos de restricción") y PCR (siglas
en inglés de "reacción en cadena de la polimerasa") para las
pruebas con muestras de origen humano.
A menudo, el uso de los oligonucleótidos como
herramienta de diagnóstico en los ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos implica el uso, aunque no es estrictamente necesario
usarlo, de un grupo "informador" o "marcador", que se une
a la molécula sonda, o tanto a la sonda como a la diana. La
fracción de tal grupo informador puede incluir, por ejemplo, un
radioisótopo (isótopo radiactivo), un agente quimioluminiscente o
fluorescente, o una enzima unida al oligonucleótido. El marcador se
emplea para conseguir que la sonda sea capaz de detectar,
especialmente cuando la sonda se híbrida con el ácido nucleico
diana.
En la mayoría de los métodos de ensayo en los
que se utilizan ácidos nucleicos, se hace uso de un paso de
separación física con el fin de separar el híbrido sonda:analito de
la porción no unida de la sonda. Estos métodos de ensayo se
denominan ensayos "heterogéneos". En los ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos, una molécula de analito es la
especie de ácido nucleico diana que se desea detectar, cuantificar
o identificar. Un "híbrido" es ácido nucleico que presenta,
parcialmente o en su totalidad, una doble hélice que consta de dos
ácidos nucleicos monocatenarios, por ejemplo, una sonda y un ácido
nucleico diana, que presentan una región de complementariedad que
provoca la unión intermolecular mediante puentes de hidrógeno bajo
las condiciones del ensayo o de amplificación.
Entre los métodos de ensayo en los que se
utiliza un paso de separación física se incluyen métodos en los que
en el proceso de separación se hace uso de una matriz de fase
sólida, por ejemplo, vidrio, minerales o materiales poliméricos. La
separación puede consistir en unir preferencialmente el complejo
sonda:analito a la matriz de fase sólida, y a la vez, permitir que
las moléculas sonda que no hayan quedado asociadas permanezcan en
una fase líquida. Esta unión entre el complejo sonda:analito y la
matriz de fase sólida puede ser no específica, como es, por ejemplo,
el caso de la hidroxiapatita, o específica, por ejemplo, mediante
la interacción, específica de secuencia, del ácido nucleico diana
con una sonda "de captura" que es inmovilizada directa o
indirectamente en el soporte sólido. En cualquiera de estos casos,
la cantidad de sonda que permanece unida al soporte de fase sólida
después de un paso de lavado es proporcional a la cantidad de
analito que hay en la muestra.
Como alternativa, el ensayo puede consistir en
unir preferencialmente la sonda no hibridada, dejando que el
híbrido permanezca en la fase líquida. En tal caso, la cantidad de
sonda que hay en la fase líquida después de un paso de lavado es
proporcional a la cantidad de analito que había en la muestra
original. Cuando la sonda es un ácido nucleico o un oligonucleótido,
el soporte sólido puede incluir, entre otros componentes, un
adsorbente tal como la hidroxiapatita, una fracción policatiónica,
un material hidrófobo o de "fase inversa", una matriz de
intercambio fónico (por ejemplo, DEAE (dietilaminoetanol)), una
matriz de filtración en gel, o una combinación de uno o más de
estos materiales de fase sólida. El soporte sólido puede contener
uno o más oligonucleótidos, u otra fracción que se una de manera
específica, para capturar, directa o indirectamente, a la sonda, la
diana, o ambas. En el caso de medios, tales como la filtración en
gel, el gel de poliacrilamida o el gel de agarosa, la separación no
se debe a la unión con el oligonucleótido, sino a la tamizado
molecular de moléculas de diferente tamaño o forma geométrica. En
estos últimos dos casos mencionados, la separación puede impulsarse
electroforéticamente aplicando una corriente eléctrica a través
del gel, lo que ocasiona una migración diferencial, a través de
éste, de ácidos nucleicos de diferente tamaño o forma geométrica,
por ejemplo, ácidos nucleicos de doble cadena y de una sola
cadena.
Un método de ensayo heterogéneo podría consistir
también en unir la sonda a una matriz de fase sólida antes de
añadir la muestra que se sospecha contiene el analito de interés.
Se podría hacer entrar en contacto la muestra con el marcador en
condiciones tales que harían que el ácido nucleico deseado quedase
marcado, si es que está presente en la mezcla de la muestra. Se
pueden añadir derivados a la matriz de fase sólida, o se puede
activar dicha matriz, de manera tal que se forme una unión
covalente entre la sonda y la matriz. Como alternativa, puede unirse
la sonda a la matriz mediante fuertes interacciones no covalentes,
incluidas, entre otras, las siguientes interacciones: iónicas,
hidrófobas, de fase inversa, inmunofijación, quelación, y
enzima-sustrato. Una vez que la sonda unida a la
matriz es expuesta, en condiciones que permiten la formación de un
híbrido, al ácido nucleico marcado, se lleva a cabo el paso de
separación lavando la matriz de fase sólida para que quede libre de
analito marcado no unido. Y al revés: se puede unir el analito a
la matriz de fase sólida y hacer que entre en contacto con la sonda
marcada, lavando la matriz para eliminar el exceso de sonda libre
antes de pasar a detectar el marcador.
Hay otro tipo de sistema de ensayo denominado
"ensayo homogéneo". Por lo general, se pueden realizar ensayos
homogéneos en una solución, sin llevar a cabo un paso de separación
en fase sólida; en los ensayos homogéneos así realizados se suelen
aprovechar las diferencias químicas existentes entre la sonda libre
y el complejo analito:sonda. Un ejemplo de sistema de ensayo que
puede utilizarse en formato homogéneo o heterogéneo es el ensayo de
protección de la hibridación (HPA, por sus siglas en inglés)
revelado en Arnold, et al, patente estadounidense número
5,238,174, en la que se une una sonda a una fracción
quimioluminiscente, se la hace entrar en contacto con un analito, y
luego se la somete a degradación química selectiva o a un cambio
detectable de la estabilidad, en condiciones que alteran el
reactivo quimioluminiscente unido o fijado a una sonda no
hibridada, sin alterar el reactivo quimioluminiscente unido o
fijado a un conjugado analito:sonda. El subsiguiente inicio de una
reacción quimioluminiscente hace que el marcador asociado al
híbrido emita luz.
Los ensayos competitivos, en los que un analito
o una sonda marcados compiten, con sus análogos no marcados, por
unirse, se usan también comúnmente en el formato heterogéneo. En
función de cómo esté diseñado el sistema, se puede correlacionar la
cantidad de sonda marcada unida, o de sonda marcada no unida, con
la cantidad de analito que hay en la muestra. No obstante, también
es posible usar este tipo de ensayo en formato homogéneo, sin
realizar paso de separación física, o en un formato que incorpore
elementos tanto de un ensayo heterogéneo como de un ensayo
homogéneo.
Los métodos de ensayo aquí descritos son
meramente ilustrativos, y no debe pensarse que representan la
totalidad de los formatos de ensayo en los que se utilizan ácidos
nucleicos y que son conocidos para aquellos cualificados en la
materia.
Se ha utilizado la hibridación de ácidos
nucleicos en métodos cuyo fin era usar oligonucleótidos como
agentes terapéuticos para modificar o inhibir la expresión de genes
dentro de organismos vivos. En un ejemplo de tal utilización,
pueden dirigirse agentes "antisense", compuestos de
oligonucleótidos, contra una especie de ARNm que codifica un
producto genético deletéreo, por ejemplo, una proteína vírica o un
oncogén. Véase, por ejemplo, Zamecnik and Stephenson, 75
Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 280-284 (1978);
Stephenson and Zamecnik, 75 Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA),
285-288 (1978); y Tullis, Patente estadounidense
número 5,023,243. Aunque el Solicitante no desea limitarse a la
teoría, se cree que el dúplex ARN:ADN que es originado por la unión
del oligonucleótido antisense a las dianas de ARN puede actuar como
sustrato de la ARNasa H, que es una enzima que degrada el ARN y que
está presente en la mayoría de las células, y que es específica del
ARN contenido en el dúplex ARN:ADN. Con arreglo a este modelo, la
molécula de ARN diana es destruida por la hibridación con el
oligonucleótido antisense. Existen variaciones de esta estrategia
general, en las que, por ejemplo, el oligonucleótido tiene una
estructura que confiere actividad enzimática sobre el
oligonucleótido, como la actividad ARNasa de las llamadas ribozimas.
Véase, por ejemplo, Goodchild, Número de publicación PCT
WO93/15194.
Dado que los oligonucleótidos antisense
terapéuticos están diseñados para funcionar sobre todo in
vivo, las formulaciones para la administración de tales agentes
no deben inhibir significativamente la función celular normal. Así,
los inhibidores de la nucleasa, que a veces pueden ser incluidos en
pruebas diagnósticas in vitro con el fin de evitar la
degradación de los oligonucleótidos, no resultan adecuados para su
uso in vivo. Este hecho ha fomentado el desarrollo de
diversos oligonucleótidos modificados a nivel de los enlaces entre
nucleótidos, a nivel de la fracción de base o de azúcar, o en forma
de combinaciones de estos lugares, con el fin de obtener una mayor
resistencia a la nucleasa que la que tiene el ADN no
modificado.
Así, se ha creado una serie de derivados de los
oligonucleótidos, en los que se han realizado modificaciones en la
base nitrogenada, incluida la sustitución, por hidrógeno, del grupo
amino presente en la posición 6 de adenosina, con lo que se obtiene
una purina; o la sustitución, por hidrógeno, del oxígeno
6-ceto de la guanosina, con lo que se obtiene una
2-amino purina; o la sustitución de este oxígeno
6-ceto de la guanosina por azufre, con lo que se
obtiene 6-tioguanosina; así como la sustitución del
oxígeno 4-ceto de la timidina por azufre o por
hidrógeno, con lo que se obtiene, respectivamente,
4-tiotimidina o 4-hidrotimidina.
Todos estos análogos de los nucleótidos pueden ser utilizados como
reactantes para la síntesis de oligonucleótidos. Véase, por
ejemplo, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach,
mencionado anteriormente. En la disciplina se conocen otras
bases sustituidas. Véase, por ejemplo, Cook et al.,
Número de publicación PCT WO92/02258, titulada Nuclease
Resistant, Pyrimidine Modified Oligonucleotides that Detect and
Modulate Gene Expression. En el mercado pueden obtenerse
derivados de nucleótidos, modificados en cuanto a sus bases
nitrogenadas, que pueden utilizarse para la síntesis de
oligonucleótidos.
Igualmente, se ha informado de una serie de
derivados de nucleótidos con modificaciones en la fracción
ribofuranosilo o desoxirribofuranosilo. Véase, por ejemplo,
Cook et al., Número de publicación PCT WO94/19023, titulada
Cyclobutyl Antisense Oligonucleotides, Methods of Making and Use
Thereof; McGee et al., Número de publicación PCT
WO94/02051, titulada Novel
2'-O-Alkyl Nucleosides and
Phosphoramidites Processes for the Preparation and Use Thereof;
y Cook, Número de publicación PCT W093/13121, titulada Gapped,
2'-modified Oligonucleotides.
La mayoría de los oligonucleótidos compuestos de
tales bases modificadas han sido formuladas con el objetivo de
obtener mayor recaptación celular, mayor resistencia a la nucleasa,
o mayor unión al sustrato. En otras palabras, tales
oligonucleótidos se describen como agentes terapéuticos moduladores
de los genes.
En la naturaleza existen ácidos nucleicos que
presentan residuos nucleotídicos modificados. Así, en función de su
tipo o de su origen, las bases modificadas del ARN pueden ser,
entre otras, bases metiladas o dimetiladas, bases desaminadas,
bases carboxiladas, bases azufradas, o bases que presentan varias
combinaciones de estas modificaciones. Además, se sabe que en la
naturaleza existen ácidos nucleicos que presentan bases
2'-O-alquiladas. Véase Adams,
The Biochemistry of the Nucleic Acids, 7, 8 (onceava
edición, 1993).
\newpage
En la patente europea EP0742287A2 (McGall et
al) se describe un abanico de posibles modificaciones a las
sondas de oligonucleótidos unidas a sustratos sólidos. Se eligen
modificaciones diferentes para crear estructuras secundarias en las
sondas o para variar la afinidad de las sondas por sus dianas.
La presente invención permite usar un
oligonucleótido con una modificación
2'-O-metilo, y con una secuencia de
nucleótidos conocida, como sonda para una secuencia diana plegada
de ARNr, de ARNt, de o ARN vírico, presentes en una muestra que
contiene ácido nucleico no diana. Se modifican más de 4 nucleótidos
contiguos del oligonucleótido modificado, para incluir una
sustitución 2'-O-metilo, y la
velocidad de hibridación entre el oligonucleótido modificado y la
diana es superior que la velocidad de hibridación que se da entre
el oligonucleótido no modificado y la diana.
Básicamente, es posible modificar todos los
nucleótidos del oligonucleótido.
Junto con el oligonucleótido modificado, puede
usarse una sonda "helper" no marcada.
Se modifica preferiblemente una fracción
ribofuranosilo del oligonucleótido.
Se puede unir el oligonucleótido a una molécula
de conjugado, que funciona aumentando la afinidad de dicho
oligonucleótido por la diana, así como la velocidad de hibridación
de dicho oligonucleótido con la diana; la molécula de conjugado se
selecciona de un grupo que consta de aminas catiónicas, tintes de
intercalación, antibióticos, proteínas, fragmentos peptídicos y
complejos metal ión.
El oligonucleótido tiene una longitud,
preferiblemente, de entre 10 y 100 bases; idóneamente, de entre 10
y 15 bases. Además, puede incluir un marcador; dicho marcador es,
preferiblemente, un agente quimioluminiscente o un agente
fluorescente.
Puede haberse sometido la muestra a un
procedimiento de amplificación.
El oligonucleótido puede ser inmovilizado
uniéndolo directa o indirectamente a un soporte sólido.
La muestra puede obtenerse de una muestra
clínica, de un alimento, o de una muestra medioambiental.
La sonda y el complejo sonda:diana pueden estar
libres dentro de una solución.
Pueden modificarse por completo los
oligonucleótidos usados en la presente invención.
Aunque el término T_{m} se refiere a la
temperatura a la que el 50% de una población de cantidades iguales
de cadenas de ácidos nucleicos complementarias están en la forma de
doble cadena, en el ámbito de la presente invención, la "T_{m}
de un oligonucleótido o de un ácido nucleico (monocatenario)"
significa la T_{m} de un oligonucleótido o de un ácido nucleico
integrado en un dúplex de ácidos nucleicos con una diana, donde el
ácido nucleico contiene una región de secuencia de bases que es
exactamente complementaria de una región de secuencia de bases del
oligonucleótido, a menos que se indique otra cosa.
Como la T_{m} de los oligonucleótidos
modificados es mayor que la de los oligonucleótidos
correspondientes, no modificados, que tienen la misma secuencia de
bases, el uso de la presente invención significa que en las
composiciones y en los métodos de diagnóstico aquí descritos se
pueden emplear oligonucleótidos y sondas de oligonucleótidos de
longitud inferior a la que de otro modo resulta práctica para la
hibridación y detección específicas de las dianas de la invención.
El uso de oligonucleótidos más cortos para unirlos de manera
específica a ácidos nucleicos diana a una temperatura determinada
proporciona ventajas adicionales. Por ejemplo, los oligonucleótidos
más cortos tienen, por lo general, una capacidad mayor para
discriminar entre dianas perfectamente complementarias y regiones
con secuencias de bases "mal emparejadas". Además, es menos
probable que estos oligonucleótidos, más cortos, se solapen con
secuencias de bases no deseadas. Asimismo, debido a su mayor
T_{m}, los oligonucleótidos modificados pueden hibridarse a
temperaturas más altas que los oligonucleótidos no modificados.
El uso de temperaturas de hibridación más altas
impulsa cinéticamente la reacción de hibridación, lo que genera
velocidades de hibridación superiores a las que se dan a
temperaturas más bajas. Además, los oligonucleótidos modificados que
se usan en los métodos descritos en la presente invención generan
velocidades de hibridación mayores que las de sus análogos no
modificados, incluso si no se aumenta la temperatura.
Una velocidad de hibridación más alta
proporciona varias otras ventajas en los ensayos diagnósticos. Por
ejemplo, los ensayos diagnósticos que se lleven a cabo conforme al
uso de la presente invención se puede realizar más rápidamente que
los ensayos de hibridación que existían hasta ahora. En los casos
en los que los resultados de un ensayo puedan dictaminar cómo se
tiene que llevar a cabo un tratamiento médico u otras acciones, el
hecho de obtener el resultado del ensayo con mayor rapidez ofrece
claras ventajas en cuanto al pronóstico de una enfermedad dada, y
puede conducir a un tratamiento más eficaz. Además, gracias a las
mayores velocidades de hibridación y a la mayor afinidad que los
oligonucleótidos modificados tienen por las dianas, se pueden usar
concentraciones inferiores de la sonda de la presente invención
para lograr la misma cantidad de señal. De esta manera, puede
reducirse la interferencia de fondo ("background" o
"ruido") del ensayo, y la menor concentración de sonda puede
contribuir a eliminar reacciones cruzadas no deseadas con ácidos
nucleicos no diana. Asimismo, se pueden llevar a cabo estos ensayos
con mayores volúmenes de muestra, lo que incrementa la sensibilidad
del ensayo.
Y así, con arreglo al uso de la presente
invención, pueden diseñarse sondas, para ensayos de hibridación,
que aprovechen la mayor velocidad de hibridación específica con las
dianas.
La Figura 1 proporciona la nomenclatura de la
IUPAC para un muestrario de ésteres de acridinio que se pueden usar
como marcadores quimioluminiscentes detectables en la presente
invención.
La Figura 2 muestra una disposición en la que,
para la detección de un analito, antes es necesario que el analito
se hibride con un ácido nucleico que no sea la sonda. Conforme a
esta disposición, la sonda no es capaz de unirse al analito ni al
ácido nucleico que no forma parte de la sonda hasta que el analito
se ha hibridado con el ácido nucleico que no forma parte de la
sonda. (Las regiones que se han representado con trazos más gruesos
representan las regiones de complementariedad entre el analito y el
ácido nucleico que no forma parte de la sonda.) Sin embargo, la
hibridación del analito con el ácido nucleico que no forma parte de
la sonda altera la configuración de este último, en un grado que es
suficiente para posibilitar la hibridación de la sonda con el
ácido nucleico que no forma parte de la sonda, lo que permite
detectar el analito.
La Figura 3 muestra la curva de fusión de una
sonda de
2'-O-metil-oligonucleótidos
con una diana de ARN o con una diana de ADN (dos experimentos
diferentes), donde la fusión se representa como un aumento de la
absorbancia lumínica a 260 nm (desplazamiento hipercromático).
La Figura 4 muestra la hibridación de una
concentración única de desoxi- o
2'-O-metil-oligonucleótidos,
de secuencias de bases idénticas, marcados con éster de acridinio,
con cantidades variables de una diana de ARN plenamente
complementaria, durante un período de hibridación fijo.
La Figura 5 muestra la hibridación de cantidades
variables de desoxi- o
2'-O-metil-oligonucleótidos,
de secuencias de bases idénticas, marcados con éster de acridinio,
con cantidades fijas de una diana de ARN plenamente complementaria,
durante un período de hibridación fijo.
La Figura 6 muestra la hibridación de una
cantidad fija de desoxi- y
2'-O-metil-oligonucleótidos,
de secuencias de bases idénticas, marcados con éster de acridinio,
con una cantidad fija de una diana de ARN plenamente
complementaria, durante períodos de hibridación diversos.
La Figura 7 muestra la hibridación de una sonda
de ADN o de una sonda de
2'-O-metil-oligonucleótidos,
con una diana de ARN plenamente complementaria. Los datos se han
representado con arreglo a la ecuación:
ln(1-H) = (k) (C_{o}t), en la que H es el
porcentaje de hibridación, k es la constante de la velocidad de
hibridación, C_{o} es la concentración de la sonda, y t es el
tiempo.
A menos que se indique claramente de otro modo,
en el ámbito de esta invención, los términos siguientes tienen los
significados indicados.
Por "analito de ácido nucleico" o por
"analito" se entiende un ácido nucleico que se desea detectar
en una muestra o un ácido nucleico sintetizado gracias a una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos, y que contiene al
menos unos 20 nucleótidos de la secuencia de bases nucleotídicas de
un ácido nucleico que se quiere detectar en una muestra, o del
complemento de aquélla.
Por "sintetizar" un ácido nucleico o un
oligonucleótido se entiende crear el ácido nucleico mediante
síntesis química o por medios enzimáticos. Se sabe que ciertas
polimerasas con actividad enzimática sobre los ácidos nucleicos son
capaces de incorporar, durante la síntesis enzimática, nucleótidos
modificados.
Por "modificado", "nucleótido
modificado" o "modificación" se entiende una variante
intencionada de los clásicos ribonucleótidos y
desoxirribonucleótidos A, T, G, C y U. En esta invención, el
término "modificado" se refiere a una variante de los
nucleótidos clásicos, y dichas variantes proporcionan una mayor
eficiencia de unión cuando un oligonucleótido que contiene dichos
nucleótidos modificados se hibrida con un ácido nucleico diana, que
cuando ese mismo oligonucleótido contiene los nucleótidos clásicos.
En algunos casos se hace mención de un oligonucleótido que tiene un
extremo 3' modificado. Eso significa que el extremo 3' del
oligonucleótido presenta una sustitución que inhibe o impide la
extensión (el alargamiento) del extremo 3' por parte de una
polimerasa de ácidos nucleicos.
Por "molécula de conjugado" se entiende una
molécula que puede unirse con un oligonucleótido de una manera tal
que, en el producto combinado resultante, se retienen por lo menos
algunas de las características tanto de la molécula como del
oligonucleótido. La mayoría de las veces, la molécula de conjugado
aporta una propiedad física o química nueva al oligonucleótido,
mientras que el oligonucleótido mantiene su capacidad para
emparejarse por pares de bases.
Por "afinidad de unión" se entiende una
medida de la intensidad de la unión, mediante puentes de hidrógeno,
entre ácidos nucleicos que son al menos parcialmente
complementarios, en condiciones de hibridación de ácidos nucleicos
bien definidas. Una manera práctica de medir la eficiencia de unión
es la T_{m}, que es la temperatura a la que el 50% de las
anteriormente mencionadas dos hélices están en la forma de doble
cadena o hibridada.
Por "marcador" se entiende una fracción
"informadora" que es capaz de ser detectada como indicación de
la presencia del oligonucleótido al que se une. Cuando el
oligonucleótido marcado se hibrida con uno o más oligonucleótidos,
la presencia del marcador puede ser una indicación de la presencia
de otro oligonucleótido u oligonucleótidos. En la disciplina se
conocen fracciones informadoras adecuadas, que pueden ser, entre
otras, radioisótopos, tintes, compuestos quimioluminiscentes,
compuestos fluorescentes, compuestos que son a la vez
quimioluminiscentes y electroluminiscentes, secuencias de ácidos
nucleicos, enzimas, sustratos de enzimas, cromóforos y
haptenos.
Por "condiciones del ensayo con ácidos
nucleicos" se entiende las condiciones ambientales, incluidas la
temperatura y la concentración de sales, que favorecen la formación
de híbridos estables entre regiones con secuencias de bases
complementarias, en vez de favorecer la formación de híbridos
estables entre regiones con secuencias de bases no
complementarias.
Por "derivado de éster de acridinio" o
"EA" se entiende cualquiera de una familia de compuestos
derivados del anillo del acridinio que tienen un éster marcado o una
unión de tipo éster marcada en la posición C9, que conecta el
anillo del acridinio a un grupo saliente. El grupo saliente es,
preferiblemente, un grupo arilo o arilo sustituido. Se pueden
realizar sustituciones, tales como un grupo alquilo (por
ejemplo, metilo), un grupo alcoxi (por ejemplo, metoxi),
un grupo arilo y haluro (por ejemplo, Br y F), en el anillo
del acridinio, en el grupo saliente, o en ambos. En la Figura 1 se
muestran ejemplos de estos ésteres de acridinio.
En la presente invención se describe el
descubrimiento inesperado, por parte del inventor, de que los
oligonucleótidos que contienen uno o más nucleótidos modificados de
tal manera que dichos oligonucleótidos tienen una mayor T_{m} en
relación con una diana dada (en comparación con los mismos
oligonucleótidos, pero no modificados), se hibridan con una diana
dada a una velocidad mayor que la de los oligonucleótidos no
modificados. Se produce un aumento máximo de la velocidad de
hibridación de un oligonucleótido modificado cuando se modifica un
"racimo" ("clúster") de nucleótidos. Por "racimo" se
entiende que se modifica, de la manera expuesta anteriormente, un
mínimo de unos 4 de 5 nucleótidos consecutivos. De este modo, los
oligonucleótidos que contienen una mezcla de nucleótidos
modificados y no modificados pueden ser igual de eficaces, para
aumentar la velocidad de hibridación con la diana, que los
oligonucleótidos que contienen un 100% de nucleótidos modificados.
Algunos aspectos de la presente invención se refieren la creación
de oligonucleótidos "quiméricos" que contienen
oligonucleótidos tanto modificados como no modificados.
Cuando se usa en este contexto, un ácido
nucleico "diana" es un ácido nucleico que se desea hibridar
con un oligonucleótido. Dicho ácido nucleico puede ser un ácido
nucleico que se dé en la naturaleza (por ejemplo, ARN
ribosómico), puede ser el producto (por ejemplo, un
"amplicón") del uso de métodos de amplificación de los ácidos
nucleicos, tales como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
o de un método de amplificación basado en la transcripción, como se
describe más detalladamente más adelante, o puede ser otro
oligonucleótido sintético.
En la presente invención se describen métodos de
diagnóstico y composiciones en los que se hace uso de
oligonucleótidos modificados que producen un aumento de la
velocidad de hibridación oligonucleótido:diana, en comparación con
la velocidad de hibridación entre la diana y un oligonucleótido no
modificado que tenga la misma secuencia de bases.
Las modificaciones a la posición 2' del anillo
del desoxirribofuranosilo (o ribofuranosilo) consisten en colocar
un grupo que no sea ni hidrógeno ni hidroxilo en la posición 2' del
anillo del ribofuranosilo. Sea cual sea la naturaleza de la
sustitución, no debe dificultar estéricamente la capacidad, de un
oligonucleótido que contenga una o más de tales modificaciones en
sus nucleótidos, para hibridarse con un oligonucleótido
monocatenario que presente una secuencia de bases nucleotidicas
complementaria. La hibridación de ácidos nucleicos de doble cadena
complementarios en los que una cadena contenga tales modificaciones
es sensiblemente mayor que en las situaciones en las que ninguna de
ambas cadenas está modificada de la manera expuesta.
Cuando se dice que un oligonucleótido modificado
tiene una afinidad o velocidad "aumentada" o "mayor",
significa que la velocidad de hibridación o la afinidad de ese
oligonucleótido modificado es mayor que la velocidad de hibridación
con la misma diana o la afinidad por la misma diana de un
oligonucleótido no modificado que tenga la misma longitud y la
misma secuencia de bases.
Los oligonucleótidos sustituidos con un grupo
metoxi en la posición 2' del azúcar muestran mayor preferencia por
dianas de ARN que por dianas de ADN que tengan la misma secuencia
que la diana de ARN (salvo que, en el ARN, el U ocupa las
posiciones que la T tiene en el ADN), tanto en términos de T_{m}
como en términos de la velocidad de hibridación. En la disciplina se
conocen otros oligonucleótidos de estas características.
Las moléculas de conjugado unidas a los
oligonucleótidos modificados que aquí se describen pueden funcionar
de manera tal que aumentan aún más la afinidad de unión y la
velocidad de hibridación de estos oligonucleótidos con una diana.
Ejemplos de estas moléculas de conjugado pueden ser, entre otros:
aminas catiónicas, tintes de intercalación, antibióticos,
proteínas, fragmentos peptídicos, y complejos metal ión. Entre las
aminas catiónicas están, por ejemplo, la espermina y la
espermidina, es decir, poliaminas. Entre los tintes de
intercalación conocidos en la disciplina están, por ejemplo, el
bromuro de etidio, las acridinas y la proflavina. Entre los
antibióticos que se pueden unir a los ácidos nucleicos están, por
ejemplo, la actinomicina y la netropsina. Entre las proteínas
capaces de unirse a los ácidos nucleicos están, por ejemplo, las
enzimas de restricción, los factores de transcripción, y las
enzimas modificadoras del ADN y del ARN. Los fragmentos peptídicos
capaces de unirse a los ácidos nucleicos pueden contener, por
ejemplo, un motivo SPKK
(serina-prolina-lisina
(arginina)-lisina (arginina)), un motivo KH o un
motivo de caja RGG
(arginina-glicina-glicina).
Véase, por ejemplo, Suzuki, EMBOJ,
8:797-804 (1989); y Bund et al,
Science, 265:615-621 (1994). Entre
los complejos metal ión que se pueden unir a los ácidos nucleicos
están, por ejemplo, el complejo hexamina-cobalto y
el complejo
1,10-fenantrolina-cobre. Los
oligonucleótidos representan otro tipo más de moléculas de
conjugado cuando, por ejemplo, el híbrido resultante incluye tres o
más ácidos nucleicos. Un ejemplo de un híbrido de esas
características podría ser un triplex compuesto de un ácido
nucleico diana, una sonda de oligonucleótidos hibridada con la
diana, y una molécula de conjugado de oligonucleótidos hibridada
con la diana. Las moléculas de conjugado pueden unirse a los
oligonucleótidos de diversas maneras, entre otras: mediante
intercalación, interacción con el surco, unión electrostática, y
puentes de hidrógeno. Aquellos cualificados en la materia estarán
complacidos por el hecho de que se pueden fijar otras moléculas de
conjugado a los oligonucleótidos modificados que son objeto de la
presente invención. Véase, por ejemplo, Goodchild,
Bioconjugate Chemistry, 1 (3):165-187
(1990). Además, se puede fijar o unir una molécula de conjugado a
un nucleótido o a nucleótidos antes o después de la síntesis del
oligonucleótido que contiene el nucleótido o los nucleótidos.
El Solicitante ha descubierto también, de forma
inesperada, que el aumento que se observa en la velocidad de
hibridación de los oligonucleótidos modificados con sus dianas no
siempre continúa de manera indefinida a medida que va aumentando el
número de oligonucleótidos modificados contiguos, especialmente
cuando la diana tiene una estructura abierta o no plegada, o cuando
hay sondas "helper" presentes. En tales circunstancias, la
colocación de los oligonucleótidos modificados en una disposición
esencialmente contigua, es decir, unos 4 ó 5 nucleótidos contiguos
en el oligonucleótido, seguida por la hibridación con una diana
complementaria, generará un aumento en la velocidad de hibridación,
pero sólo hasta alcanzado un número determinado de modificaciones.
Por lo general, la adición de nucleótidos modificados al racimo,
más allá de este número determinado, no generará un aumento
sustancial de la velocidad de hibridación.
En los oligonucleótidos modificados en los que
se emplean sustituciones
2'-O-metilo, se obtienen velocidades
de hibridación óptimas en los oligonucleótidos que presentan un
racimo de unos 8 residuos modificados contiguos. Dado el
descubrimiento de que los oligonucleótidos modificados pueden
aumentar la velocidad de hibridación, no se esperaba que este efecto
no acompañe siempre al aumento de la T_{m} causado por la adición
de oligonucleótidos modificados. Es decir, la adición de
oligonucleótidos modificados más allá del tamaño óptimo del racimo
para la velocidad de hibridación sigue incrementando la T_{m}.
Aunque el Solicitante no desea verse limitado
por la teoría, se cree que tales racimos actúan como "centros de
nucleación", que son las primeras regiones del oligonucleótido o
del ácido nucleico que se unen mediante puentes de hidrógeno, en un
paso que limita la velocidad, seguido por la rápida unión, mediante
puentes de hidrógeno, del resto de las bases. Aunque es posible
modificar, de la manera expuesta, la totalidad del oligonucleótido
o del ácido nucleico, parece que se obtiene un escaso aumento de la
velocidad de hibridación una vez que se supera sustancialmente el
tamaño óptimo del racimo.
Sin embargo, cuando la estructura de la diana es
de tipo cerrado o plegado y no se incluyen sondas "helper", en
general es posible aumentar la velocidad de hibridación entre el
oligonucleótido y la diana añadiendo nucleótidos modificados al
oligonucleótido en un número superior a unos 4 nucleótidos
modificados contiguos. En una forma de realización preferida, se
modifican virtualmente todos los nucleótidos de un oligonucleótido
complementario a la estructura de la diana que presenta una
estructura de tipo cerrado.
La velocidad de hibridación, en una solución, de
dos ácidos nucleicos monocatenarios complementarios, depende de
diversos factores, tales como la concentración de los ácidos
nucleicos, la temperatura de hibridación, y las propiedades de la
solución de solvente, por ejemplo, la concentración de sales. Se
han empleado diversas metodologías para aumentar las velocidades de
hibridación. La mayoría de dichas metodologías implican cambiar el
sistema de solvente, por ejemplo: formar emulsiones de solventes
inmiscibles; emplear agentes que precipitan los ácidos nucleicos
(por ejemplo, Kohne et al, patente estadounidense
número 5,132,207), o agentes incrementadores del volumen, por
ejemplo, polietilenglicol; o aumentar la concentración de la cadena
de un ácido nucleico.
Un problema asociado al uso de este último
enfoque en un ensayo diagnóstico es que habitualmente el ácido
nucleico diana está presente en cantidades bastante pequeñas. Por
eso, para aumentar la concentración de un ácido nucleico es
necesario usar un exceso de oligonucleótido, lo que genera un
aumento del coste y de los residuos de reactivos, y además, si se
marca el oligonucleótido, existe el riesgo de obtener "ruidos"
inaceptablemente altos. Los demás métodos, como los que hacen
necesario el uso de varios solventes y reactivos, por ejemplo,
polietilenglicol, pueden conllevar dificultades de orden práctico,
como una manipulación de muestras y un tiempo excesivos.
En la presente invención se describen maneras de
aumentar las velocidades de hibridación de los oligonucleótidos con
las dianas de ARN, así como para aumentar la afinidad de unión de
los oligonucleótidos por las dianas de ARN, usando oligonucleótidos
que contienen nucleótidos con una sustitución en la posición 2' del
anillo del ribofuranosilo ("oligonucleótido modificado en
2-"), incluida una sustitución alcoxi y una sustitución metoxi.
Estas propiedades proporcionan métodos útiles para el uso de tales
oligonucleótidos en un formato de ensayo de hibridación diagnóstico
mediante el aumento de la velocidad y la extensión de la
hibridación de un oligonucleótido de las mencionadas
características, sin que se necesite un aumento concomitante de las
concentraciones de los ácidos nucleicos que se hibridan, un cambio
en las propiedades o en la composición de la solución de
hibridación, la adición de "oligonucleótidos helper" (descrita
en Hogan & Milliman, patente estadounidense número 5,030,557),
ni un aumento de la temperatura de hibridación. No obstante, el uso
de la presente invención puede complementar el uso de una o más de
las técnicas citadas en cualquier procedimiento en el que un
aumento de la velocidad de hibridación de los ácidos nucleicos
resulte ventajosa.
Como se ha mencionado anteriormente, una de las
ventajas descritas en la presente invención se refiere a la
capacidad de los oligonucleótidos con modificaciones
2'-O-metilo para hibridarse
preferencialmente con el ARN, más que con el ADN. Esta propiedad
permite diseñar sondas de oligonucleótidos dirigidas contra el ARN.
Pueden crearse sondas que no tienden a unirse al ADN en condiciones
de hibridación astringentes, incluso si la secuencia del ADN es
idéntica a la secuencia del ARN diana (idéntica salvo por el hecho
de que, en el ARN, el U ocupa las posiciones que la T tiene en el
ADN). Tales propiedades pueden utilizarse en una serie de formatos
diferentes en los que la detección específica del ARN sea una
ventaja. Por ejemplo, para indicar y medir cambios en la velocidad
de transcripción de especies de ARN concretas, tales como, por
ejemplo, especies de ARNm concretas; para realizar un seguimiento
de la eficacia de una terapia determinada; para sondear, de manera
específica, ARNt o ARNr, con preferencia por los genes que
codifican estas especies de ARN; y para detectar, de manera
específica, virus ARN en preparaciones de ácidos nucleicos que
contengan grandes cantidades de ADN cromosómico, incluso en
preparaciones de ADN que contengan "versiones ADN" de las
secuencias virales.
Una ventaja adicional de este y de otros
aspectos es una T_{m} diana:oligonucleótido aumentada cuando se
usan oligonucleótidos modificados, por ejemplo oligonucleótidos con
modificaciones 2', en comparación con la T_{m} de los híbridos
diana:oligonucleótido cuando el oligonucleótido es un
desoxioligonucleótido. Por "diana:oligonucleótido" se entiende
un complejo de ácidos nucleicos de doble cadena, unidos por puentes
de hidrógeno, que contiene un oligonucleótido monocatenario. La
estabilidad del complejo diana:sonda aumenta cuando aumenta el
número de residuos de nucleótidos con modificaciones 2' que
contiene la sonda. En cambio, el aumento de la velocidad de
hibridación parece ser óptimo en los ácidos nucleicos que tienen un
racimo de unos 8 residuos nucleotídicos con modificaciones 2' y no
aumenta significativamente cuando se añaden residuos nucleotídicos
modificados consecutivos por encima de esa cifra. Asimismo, se
podrían diseñar oligonucleótidos "quiméricos" que tengan por
lo menos un racimo de nucleótidos modificados, para obtener
velocidades de hibridación mayores sin que necesariamente se
incremente significativamente la T_{m} del oligonucleótido entero
en relación con su diana.
Una T_{m} más alta puede ser aprovechada en
cualquier procedimiento de diagnóstico en el que sea deseable
contar con la estabilidad añadida de un dúplex de ácidos nucleicos.
Por ejemplo, se pueden usar temperaturas de hibridación más altas
para acelerar la velocidad de hibridación. Además, una T_{m} más
alta permite usar oligonucleótidos sustancialmente más cortos que
los que resultaba práctico usar hasta ahora; de esta manera, se
obtiene un ahorro en los costes asociados con la producción de
oligonucleótidos para la hibridación, así como otras ventajas, como
se ha expuesto anteriormente.
Los oligonucleótidos quiméricos pueden contener
una porción modificada diseñada para unirse al ácido nucleico diana,
y pueden contener también una porción desoxinucleotídica que sea
capaz de unirse, directa o indirectamente, a un oligonucleótido
fijado a una fase sólida. Como ejemplo, entre otros muchos, tal
oligonucleótido puede ser un oligonucleótido de captura de diana
diseñado para unirse a un ácido nucleico diana (por ejemplo, en una
solución) y enlazar el ácido nucleico diana "capturado" a una
matriz en fase sólida, que tenga derivados unidos; tal matriz puede
ser, por ejemplo, una perla, una microesfera, una sustancia
polimérica (tal como la agarosa o el dextrano), o una partícula
magnetizada. Los derivados unidos a la matriz puede ser, entre
otros, antibióticos, ligandos, u oligonucleótidos total o
parcialmente monocatenarios que presenten una secuencia de
nucleótidos específica, como por ejemplo, un tracto homopolimérico,
diseñada para fijar el oligonucleótido que se desea capturar o un
oligonucleótido intermediario. Después, la diana fijada se puede
hibridar aún más con una sonda (de ARN, de ADN, o modificada), y se
pasaría a lavar la sonda no unida para que quede libre del complejo
sonda:diana inmovilizado, antes de realizar la detección de la
presencia del ácido nucleico diana.
En determinadas circunstancias puede ser
beneficioso aumentar la temperatura con la que hibridar un
oligonucleótido modificado con su diana. Como se ha descrito
anteriormente, aumentar la temperatura de hibridación incrementa
también la velocidad de hibridación, siempre que la temperatura de
hibridación esté suficientemente por debajo de la T_{m} del
híbrido deseado. Los métodos de hibridación reivindicados en la
presente invención, en los que se emplean oligonucleótidos
modificados que tienen una T_{m} más alta que la de sus análogos
no modificados, pueden llevarse a cabo a temperaturas superiores a
las que de otro modo se podrían usar. En tal caso, el aumento de la
velocidad de hibridación que se debe exclusivamente a la
modificación, es aumentado aún más por la temperatura superior que
se utiliza.
\newpage
A continuación se presentan ejemplos que
incluyen formas de realización de la invención; no debe pensarse
que tales ejemplos constituyen el único ámbito de dicha invención.
Aquellos cualificados en la materia concebirán fácilmente formas de
realización adicionales basándose en la información contenida en
este documento.
Los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos
hacen uso de una o más sondas de ácidos nucleicos dirigidas contra
un ácido nucleico que se desea detectar; "dirigidas contra"
significa que tienen una secuencia de bases nucleotídicas que es
esencialmente complementaria de la del ácido nucleico que se desea
detectar. A menudo la sonda consta de un oligonucleótido (un ácido
nucleico monocatenario que tiene de unos 10 a unos 100 nucleótidos
de longitud) que se crea sintéticamente para que tenga una secuencia
de nucleótidos determinada. Por "esencialmente complementaria"
se entiende que el oligonucleótido se une con su diana en las
condiciones selectivas adecuadas, formando un dúplex unido por
puentes de hidrógeno.
Aunque, por lo general, una sonda de un ensayo
de hibridación se fija a un marcador detectable, puede no marcarse
la sonda y, en vez de eso, detectar el híbrido sonda:diana
mediante, por ejemplo, absorbancia de luz ultravioleta,
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), electroforesis
en gel y posterior tinción del híbrido de ácidos nucleicos, o
mediante otros métodos bien conocidos en la disciplina. En los
ensayos de hibridación, se hace entrar en contacto la sonda y la
diana en condiciones que permiten una hibridación estable y
específica. Después, el híbrido resultante se separa del híbrido no
marcado y se detecta el marcador, o bien puede detectarse el
marcador en condiciones que permiten detectar preferentemente el
híbrido, en vez de detectar el híbrido no marcado.
En la disciplina se conocen métodos para separar
ácidos nucleicos; por ejemplo: cromatografía de exclusión
(filtración en gel), cromatografía en fase inversa, y adsorción con
hidroxiapatita. El Solicitante prefiere usar un formato de ensayo
en el que el híbrido marcado y la sonda no marcada sin hibridar
puedan diferenciarse químicamente mediante la formación de una
doble hélice. Un formato de ensayo particularmente preferido es el
ensayo de protección de la hibridación, véase la patente
estadounidense número 5,283,174 de Arnold et al, en el que
es posible hacer, de forma selectiva, que la sonda no marcada sin
hibridar sea indetectable, mientras que la sonda hibridada queda
relativamente no afectada. De este modo, la detección del marcador,
en este formato de ensayo, es una indicación del híbrido
marcado.
En la presente invención se describe el uso,
como sondas, de oligonucleótidos modificados en un ensayo de
hibridación. Los oligonucleótidos modificados que tienen una
T_{m} específica de diana más alta que los oligonucleótidos no
modificados de idéntica secuencia de bases pueden emplearse para
aumentar la velocidad de hibridación del ensayo, en comparación con
los ensayos en los que se usen oligonucleótidos no modificados con
la misma secuencia de bases. En el tipo de métodos de ensayo objeto
de la presente invención es posible utilizar temperaturas de
hibridación más altas que las que es posible emplear usando
oligonucleótidos no modificados. Esta temperatura de hibridación
más alta aumenta aún más la velocidad de hibridación, y asimismo,
puede reducir la cantidad de hibridación cruzada (hibridación de la
sonda con secuencias no diana), lo que incrementa la especificidad
del ensayo.
Las sondas descritas en la presente invención
pueden constar de un racimo de unos 4 o más residuos nucleotídicos
modificados esencialmente contiguos, mezclados con residuos no
modificados.
Como alternativa, la sonda puede constar de un
100% de residuos modificados.
La modificación de una sonda de oligonucleótidos
de tal manera que incluya sustituciones
2'-O-metilo hace que dicha sonda de
oligonucleótidos presente una mayor afinidad por las dianas de ARN,
así como una mayor velocidad de hibridación con dichas dianas de
ARN, sin que se produzca apenas efecto sobre su afinidad por el ADN
ni sobre la velocidad de formación de híbridos sonda:ADN. De nuevo,
se ha hallado que esta preferencia por el ARN se optimiza cuando el
oligonucleótido tiene al menos un racimo de unas 4 a unas 8 bases
modificadas.
Puesto que los oligonucleótidos modificados de
la manera aquí expuesta presentan una velocidad de hibridación
muchísimo más alta, en muchos casos es posible usar tales sondas de
oligonucleótidos modificados sin necesidad de añadir "sondas
helper" no marcadas, que se describen en Hogan (citado
anteriormente), como forma de aumentar las velocidades de
hibridación de la sonda con la diana. No obstante, el Solicitante ha
descubierto que en algunos casos el uso combinado de tales
oligonucleótidos modificados y sondas "helper" puede generar un
funcionamiento combinado que aumenta aún más la velocidad de
hibridación. En cualquier caso, el uso de dichos oligonucleótidos
modificados en los métodos de diagnóstico permite identificar más
rápidamente los analitos de origen biológico, lo que a su vez
conduce, por ejemplo, a tratamientos más eficaces para las
enfermedades provocadas o indicadas por dichos analitos.
Como se describe más detalladamente más
adelante, el Solicitante ha descubierto que es posible usar las
sondas que muestran una afinidad preferencial por las dianas de ARN
para detectar de manera específica el ARN, frente a ADN de idéntica
secuencia (idéntica salvo por el hecho de que, en el ARN, el U
ocupa las posiciones que la T tiene en el ADN). Tales métodos
tienen aplicación, por ejemplo, en la detección específica de los
virus ARN en las células que contienen "versiones ADN" del
genoma vírico, o en la detección específica de los niveles de
transcripción del ARN en las células.
\newpage
También pueden diseñarse sondas que contienen
tanto secuencias complementarias de la secuencia de la diana como
secuencias adicionales, no complementarias de la secuencia de la
diana. Estas secuencias no complementarias de la secuencia de la
diana pueden desempeñar otras funciones. Por ejemplo, pueden ser
complementarias de la secuencia de otro oligonucleótido o de la de
un ácido nucleico diana, o pueden presentar propiedades
funcionales, por ejemplo, como secuencias promotoras o como sitios
de restricción. Así, una sonda puede tener más de una función, y
puede que sólo una de sus funciones sea la que se deba detectar
como indicación de la presencia de una diana.
Además, pueden diseñarse sondas de modo tal que
tengan al menos dos secuencias complementarias de la secuencia de la
diana, que puedan hibridarse con un ácido nucleico diana. En Hogan
et al, patentes estadounidenses números 5,424,413 y
5,451,503, se describe un ejemplo de estas sondas. Las sondas
descritas por Hogan et al incluyen además un mínimo de dos
brazos que no se hibridan con la diana, sino que poseen regiones
complementarias que son capaces de hibridarse entre sí. Es posible
diseñar estos brazos para que precisen de la presencia de la diana
para que sus secuencias complementarias puedan hibridarse en las
condiciones de hibridación adecuadas. En tal caso, para que los
brazos puedan hibridarse entre si, antes es necesario que las
secuencias complementarias de la secuencia de la diana se hibriden
con la diana. La estructura resultante se denomina ácido nucleico
ramificado.
Pueden diseñarse otras sondas que no sean
capaces de unirse de manera específica a la diana. Para que
resulten útiles para detectar la diana, este tipo de sondas deben
ser capaces de hibridarse con otro ácido nucleico que sea capaz de
unirse a la diana, ya sea directa o indirectamente. Un ejemplo de
tal disposición puede consistir en un ácido nucleico que puede ser
estructurado para que contenga al menos una primera y una segunda
región con una secuencia de bases nucleotídicas que no se
superpongan; la primera de tales regiones sería complementaria de
una secuencia de bases nucleotídicas de la diana, y la segunda de
tales regiones sería complementaria de una secuencia de bases
nucleotídicas de la sonda. En esa disposición, la segunda región de
nucleótidos del ácido nucleico no estaría disponible para su unión a
la sonda hasta que la diana se haya hibridado con la primera región
de nucleótidos del ácido nucleico. La unión del ácido nucleico con
la diana alteraría la configuración del ácido nucleico, lo que
permitiría que la segunda región de nucleótidos del ácido nucleico
se uniese con la sonda. Véase la Figura 2. Por supuesto,
sería posible modificar esta disposición de manera tal que la unión
indirecta entre el ácido nucleico y la diana, lograda gracias a uno
o más ácidos nucleicos participantes o "de acoplamiento",
hiciese que la segunda región de nucleótidos del ácido nucleico
estuviese disponible para unirse a la sonda.
En la presente invención se describen métodos
para emplear cebadores ("primers"), cebadores promotores o
plantillas de ayuste ("splicing"), basados en oligonucleótidos
modificados, para la amplificación de ácidos nucleicos. También se
describen composiciones que incluyen tales oligonucleótidos
modificados, en las que los oligonucleótidos modificados contienen
al menos un racimo de bases modificadas que origina un aumento de
la velocidad de hibridación.
Entre los métodos de amplificación en los que se
emplean cebadores está el método de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y sus variaciones, como se describe en Mullis et
al, (véanse las patentes estadounidenses números
4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159, así como las solicitudes de
patentes europeas números 86302298.4, 86302299.2 y 87300203.4, y el
volumen 155 de la revista Methods in Enzymology,
335-350 (1987)). Hoy en día, la metodología PCR es
ya una materia bien conocida para aquellos cualificados en la
materia.
Se ha acoplado el método PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) a la transcripción de ARN, incorporando una
secuencia promotora a uno de los cebadores empleados en la reacción
PCR y, después, tras la amplificación obtenida mediante PCR, usando
el ADN de doble cadena como una plantilla para la transcripción del
ARN monocatenario. (Véase, por ejemplo, Murakawa et
al, DNA, 7:287-295 (1988)).
Otros métodos de amplificación hacen uso de
varios ciclos de síntesis y transcripción del ADN, dirigidos por el
ARN, para amplificar dianas de ADN o de ARN. Véase, por
ejemplo, Burg et al, patente estadounidense número
5,437,990; 89/1050; Gingeras et al, WO 88/10315; Davey and
Malek, Número de publicación EPO 329 8223; Malek et al,
WO91/02818, Kacian and Fultz, patente estadounidense número
5,480,783; McDonough et al, WO94/03472; y Kacian et
al, WO93/22461. En Urdea et al, WO91/10746, se describe
un método en el que se logra la amplificación de la señal usando
una secuencia promotora T7.
Cada uno de estos métodos hace uso de uno o más
cebadores o plantillas de ayuste, a base de oligonucleótidos, que
son capaces de hibridarse con una determinada secuencia de
nucleótidos deseada, o de hibridarse cerca de ésta. Tras la
hibridación del cebador, la cadena de ácido nucleico complementaria
de la diana es sintetizada enzimáticamente, ya sea mediante
extensión del extremo 3' del cebador o mediante transcripción,
usando un cebador promotor o una plantilla de ayuste. En algunos
métodos de amplificación, por ejemplo, en el método PCR, se
alternan rondas de extensión del cebador (mediante una enzima que
polimeriza el ácido nucleico) con la desnaturalización térmica de
las cadenas de ácido nucleico complementarias. Otros métodos, tales
como los de Kacian & Fultz, citado anteriormente,
McDonough et al, citado anteriormente, y Kacian et
al, citado anteriormente, son métodos de amplificación
isotérmica basada en la transcripción.
Sin embargo, en cada método de amplificación,
las reacciones secundarias causadas por la hibridación del cebador
con las secuencias no diana pueden reducir la sensibilidad de la
reacción específica de diana. Es posible reducir la incidencia de
estos "emparejamientos incorrectos" competitivos aumentando la
temperatura de reacción. No obstante, aumentar la temperatura puede
también reducir la cantidad de unión específica del cebador con la
diana.
En relación con esto, en la presente invención
se describen cebadores que tienen una alta afinidad por la diana y
que constan de nucleótidos modificados en la región de unión a la
diana. Dichos cebadores pueden usarse en los métodos de
amplificación de ácidos nucleicos para amplificar y detectar con
mayor sensibilidad cantidades pequeñas de una secuencia de ácido
nucleico diana, gracias a la mayor temperatura (y con ésta, gracias
a la mayor velocidad de hibridación con las moléculas diana), a la
vez que se reduce la incidencia de reacciones secundarias
competitivas (reactividad cruzada) debidas a la unión no específica
con la diana. Algunos oligonucleótidos pueden contener al menos un
racimo de bases modificadas, pero, en los oligonucleótidos
preferidos, no todos los nucleótidos son nucleótidos
modificados.
En la presente invención se describen asimismo
cebadores con oligonucleótidos modificados que se usan en una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que el ácido
nucleico diana es ARN. Véase, por ejemplo, Kacian and Fultz,
citado anteriormente. La diana puede ser el ácido nucleico
presente inicialmente en la muestra, o puede ser un intermediario
de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos. El uso de
cebadores modificados en 2', por ejemplo, de oligonucleótidos que
contengan nucleótidos con sustituciones
2'-O-metilo, permite trabajar a una
mayor temperatura de hibridación, gracias a la T_{m}
relativamente más alta que estos oligonucleótidos modificados le
confieren al híbrido, en comparación con la T_{m} de los
desoxioligonucleótidos de idéntica secuencia. Además, gracias a la
preferencia de los oligonucleótidos modificados con
2'-O-metilo por el ARN (y no por el
ADN), también es posible reducir la competición por las moléculas de
cebador por parte de las secuencias de ADN no diana contenidas en
una muestra de ensayo. Asimismo, en aplicaciones en las que se
desee detectar secuencias específicas de ARN de entre una población
de moléculas de ADN que tengan la misma secuencia de ácidos
nucleicos (salvo por el hecho de que, en el ARN, el uracilo (U)
ocupa las posiciones que la timidina (T) tiene en el ADN), el uso
de cebadores con oligonucleótidos modificados que tengan
preferencia cinética y de equilibrio por el ARN permite la
amplificación específica del ARN (y no del ADN) contenido en una
muestra.
Como se ha descrito anteriormente en este
documento, los oligonucleótidos modificados que presentan, de
manera específica, una mayor velocidad de hibridación con la diana,
así como una mayor afinidad de unión con ésta, en comparación con
sus análogos no modificados, se pueden usar en una amplia variedad
de metodologías de procesado de muestras en ensayos de
hibridación.
Por procesado de muestras se entiende los
métodos que permiten o mejoran la discriminación entre ácidos
nucleicos analito y no analito. En tales métodos se puede realizar,
por ejemplo, una inmovilización directa o indirecta de los ácidos
nucleicos u oligonucleótidos de la fase líquida en un ensayo
heterogéneo. En algunos de tales métodos pueden tener lugar dos o
más eventos de hibridación con los que se logra tal
inmovilización.
Por ejemplo, en Ranki et al, patentes
estadounidenses números 4,486,539 y 4,563,419, se describe un
método de hibridación de ácidos nucleicos en "sándwich", que
tiene un único paso, en el que se usa un ácido nucleico, unido a
una fase sólida, que tiene una secuencia complementaria de la
secuencia de la diana, así como una sonda de ácidos nucleicos
marcada que es complementaria de otra porción del ácido nucleico
diana. En Stabinsky, patente estadounidense número 4,751,177, se
describen métodos en los que se usa un polinucleótido
"mediador" que, según se informa, resuelve los problemas de
sensibilidad, asociados a la fuga del oligonucleótido inmovilizado
del soporte sólido, que se dan en el método de Ranki.
Otros métodos pueden hacer uso de un
oligonucleótido inmovilizado, por ejemplo, un oligonucleótido que
contenga un tracto homopolimérico, tal como poli-T,
o que contenga una secuencia simple corta repetida, así como de dos
o más oligonucleótidos de acoplamiento, uno de los cuales es capaz
de hibridarse con el oligonucleótido inmovilizado, y otro de los
cuales es capaz de hibridarse, de manera específica, con la diana.
Cada uno de estos oligonucleótidos de acoplamiento es capaz de
unirse al menos con otro oligonucleótido de acoplamiento. Si un
oligonucleótido de acoplamiento no contiene una secuencia que sea
complementaria de la secuencia de la diana o de la secuencia del
oligonucleótido inmovilizado, será capaz de hibridarse al menos con
dos otros oligonucleótidos de acoplamiento simultáneamente. El
soporte sólido puede estar compuesto de materiales tales como
nitrocelulosa, una sustancia polimérica tal como poliacrilamida o
dextrano, sustancias metálicas, o un cristal de poro controlado. El
soporte puede tener forma de lámina, membrana o partícula.
Además, el soporte sólido puede tener carga
magnética, para facilitar la recuperación de muestra, o para
facilitar la eliminación, mediante lavado, de los ácidos nucleicos
que no queden unidos, o de otros componentes de la muestra.
La unión del oligonucleótido inmovilizado con el
soporte sólido puede lograrse mediante cualquier método que sea
capaz de seguir fijando, a lo largo de todos los pasos del ensayo,
el oligonucleótido inmovilizado. Además, es importante que, cuando
se use un soporte sólido en un ensayo, sea esencialmente incapaz, en
las condiciones del ensayo, de unirse de manera no específica con
los oligonucleótidos o ácidos nucleicos no diana, así como que sea
incapaz de adsorberlos.
\newpage
En los métodos de inmovilización más habituales,
se fija el ácido nucleico u oligonucleótido a nitrocelulosa, a un
derivado de la celulosa o del nylon, o a otros materiales
similares. Estos dos últimos materiales mencionados forman
interacciones covalentes con el oligonucleótido inmovilizado,
mientras que la nitrocelulosa se une al oligonucleótido
inmovilizado mediante interacciones hidrófobas. Cuando se usan
estos materiales, es importante emplear una solución
"bloqueadora", como las que contienen una proteína, por
ejemplo, seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés), o
bien, emplear un ácido nucleico "portador", por ejemplo, ADN de
esperma de salmón, para que ocupen los restantes sitios
disponibles en el soporte sólido antes de utilizar éste en el
ensayo.
En otros métodos de inmovilización, para fijar
el oligonucleótido al soporte sólido se puede usar un brazo de
enlace, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS) y
sus derivados. En los métodos de inmovilización, se usan
habitualmente como soportes sólidos, entre otros, los siguientes:
sílice, derivados de la poliacrilamida, y sustancias metálicas. En
dichos métodos, un extremo del brazo de enlace puede contener un
grupo reactivo (por ejemplo, un grupo amida) que forma un enlace
covalente con el soporte sólido, mientras que el otro extremo del
brazo de enlace contiene otro grupo reactivo que puede unirse al
oligonucleótido que se desea inmovilizar. En una forma de
realización especialmente preferida, el oligonucleótido formará un
enlace con brazo de enlace en su extremo 3'. El brazo de enlace es,
preferible y básicamente, un hidrato de carbono de cadena recta que
fija el oligonucleótido inmovilizado en una posición que está a una
cierta distancia de la superficie del soporte sólido. No obstante,
es posible usar enlaces no covalentes, por ejemplo, quelación o
complejos antígeno-anticuerpo, para fijar el
oligonucleótido al soporte sólido.
Una a forma de realización deseable de este
último sistema de ensayo contiene dos oligonucleótidos de
acoplamiento: (i) un primer oligonucleótido de acoplamiento que
contiene una secuencia de nucleótidos que es esencialmente
complementaria de la secuencia del oligonucleótido inmovilizado, por
ejemplo, un primer oligonucleótido de acoplamiento con una secuencia
de nucleótidos poli-A complementaria de una
secuencia de nucleótidos poli-T del oligonucleótido
inmovilizado, y (ii) un segundo oligonucleótido de acoplamiento que
contiene una secuencia de nucleótidos que es esencialmente
complementaria de la secuencia del ácido nucleico diana o de la
secuencia de una sonda detectable, o de ambas secuencias. El segundo
oligonucleótido de acoplamiento puede contener una secuencia de
nucleótidos que es esencialmente complementaria de la secuencia del
ácido nucleico diana. Además, en la forma de realización preferida,
cada oligonucleótido de acoplamiento contiene otra secuencia de
nucleótidos que permite que el primer y el segundo oligonucleótido
de acoplamiento se hibriden entre sí en las condiciones del ensayo.
No obstante, es posible introducir uno o más oligonucleótidos de
acoplamiento adicionales, de manera tal que el primer y el segundo
oligonucleótido de acoplamiento se unan indirectamente entre sí
mediante estos oligonucleótidos de acoplamiento participantes
adicionales. Los oligonucleótidos de acoplamiento adicionales
serían esencialmente incapaces de hibridarse con el ácido nucleico
diana, con la sonda de oligonucleótidos marcada detectable, o con
el oligonucleótido inmovilizado, en las condiciones del ensayo.
Pero, otro sistema de ensayo que ofrece ventajas
prácticas de facilidad de uso y de rapidez podría constar de un
oligonucleótido inmovilizado que presente una porción
complementaria a la secuencia de un oligonucleótido "de
captura". El oligonucleótido "de captura" (sonda de captura)
contendrá una secuencia de bases que le permite hibridarse con la
diana. Además, el oligonucleótido de captura tendrá un marcador
fijado dentro de la región de la secuencia de nucleótidos que se
une a la diana, o cerca de dicha región, y dicho marcador puede ser,
por ejemplo, un éster de acridinio, sustituido o no sustituido, que
se puede utilizar en un sistema de ensayo homogéneo o semihomogéneo
con el que se pueden detectar ácidos nucleicos híbridos, de manera
específica, sin detección de ácidos nucleicos monocatenarios, como
lo es la propia sonda de captura. Un sistema de estas
características preferido por el Solicitante es el HPA, que se ha
indicado anteriormente en el presente documento. En el formato HPA,
el marcador contenido en toda sonda de captura que no se haya
hibridado con su correspondiente diana será hidrolizado mediante la
adición de base, mientras que el híbrido diana:sonda de captura
protegerá de la hidrólisis al marcador asociado a la sonda del
híbrido.
Una ventaja de este último sistema de ensayo es
que sólo es necesario que se produzca un evento de hibridación
específico de diana (a saber, marcado del híbrido sonda de
captura:diana) para que se pueda detectar la diana, en vez de los
dos eventos de hibridación específicos de diana (formación del
híbrido sonda de captura:diana y marcado del híbrido sonda:diana)
que son necesarios en los demás procedimientos de procesado de
muestras descritos en el presente documento. El uso de una menor
cantidad de oligonucleótidos en el ensayo tenderá a hacer que éste
sea más rápido y fácil de optimizar, ya que la velocidad global a
la que se captura la diana marcada está limitada por la sonda que se
hibrida más despacio. Además, aunque en estos ensayos no es
necesario que la porción de la diana que es complementaria del
oligonucleótido de captura sea tan específica como la región de
unión de la diana con la sonda, la secuencia de bases de dicha
porción debe ser lo suficientemente "rara" para evitar una
saturación importante, con ácidos nucleicos no diana, de la sonda
de captura. Por eso, la preferencia por el uso de dos secuencias
diana específicas e independientes puede dificultar el hallazgo de
una diana adecuada con la que dirigir tales ensayos. En cambio, en
el ensayo preferido por el Solicitante, sólo es necesario hallar
una secuencia diana adecuada, ya que la misma secuencia de
nucleótidos actúa simultáneamente inmovilizando y detectando el
ácido nucleico diana.
En cualquier caso, independientemente de qué
abordaje se utilice, un elemento necesario en todo ensayo es un
método de detección de la diana. Aquellos cualificados en la
materia tienen a su disposición una serie de opciones. Una de tales
opciones es el uso directo de una sonda de ácido nucleico marcada.
Dicha sonda tendría una región dotada de una secuencia de
nucleótidos esencialmente complementaria de la del ácido nucleico
diana de interés, con el cual se puede hibridar de manera
específica. Tras la hibridación con la diana y la inmovilización
del híbrido diana:sonda, es posible eliminar, mediante lavado, la
sonda no unida, o inactivarla, y luego se puede detectar o medir el
marcador restante asociado al híbrido.
Otra opción que se puede utilizar combina los
elementos de detección y de amplificación de ácidos nucleicos. En
este sistema, se inmoviliza ácido nucleico diana de la manera en
que se ha descrito, por ejemplo, y entre otras, de la manera
empleada en los procedimientos de ensayo descritos anteriormente.
Se puede hacer que, en condiciones de amplificación de los ácidos
nucleicos (por ejemplo, en presencia de una o más polimerasas
de ácidos nucleicos y de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos
trifosfato), uno o más oligonucleótidos de amplificación (véase,
por ejemplo, Kacian et al, WO93/22461), por ejemplo, un
cebador, un cebador promotor, o una plantilla e ayuste, capaz de
hibridarse con una región concreta del ácido nucleico diana, entre
en contacto con el ácido nucleico diana inmovilizado.
Hibridando la cadena de polinucleótidos
resultante (amplicón) con uno o más oligonucleótidos de
amplificación en condiciones de amplificación de los ácidos
nucleicos, puede hacerse que dicha cadena de polinucleótidos esté
disponible para su hibridación específica con una sonda de ensayo
de hibridación marcada, así como para la detección específica de
dicha sonda marcada, o bien, para proseguir con la amplificación.
Si se elige esto último, puede proseguirse con la reacción de
amplificación hasta conseguir el grado de amplificación deseado, y
luego pueden detectarse los amplicones resultantes (que pueden
contener copias de al menos una porción del ácido nucleico diana
inmovilizado, o polinucleótidos complementarios de al menos una
porción del ácido nucleico diana inmovilizado, o ambas cosas) usando
una o más sondas de oligonucleótidos marcadas. Si la reacción de
amplificación debe tener lugar mientras la diana está inmovilizada,
es importante que la porción de la molécula diana que se utilice
como plantilla para los amplicones no contenga la región que
presenta la secuencia de nucleótidos necesaria para la
inmovilización del ácido nucleico diana. Aunque con las sondas
marcadas se pueden detectar amplicones de cualquiera de los dos
sentidos ("senses"), o amplicones de ambos sentidos, en una
forma de realización preferida sólo se detectarán amplicones del
sentido opuesto al de la diana inmovilizada, es decir, amplicones
complementarios de ésta.
Un método heterogéneo de captura de la diana tal
como el que se acaba de describir es especialmente ventajoso, ya
que las muestras clínicas frescas pueden contener sustancias que
inhiban la reacción de amplificación o que interfieran con ésta.
Por ello, la capacidad para separar el ácido nucleico diana de
tales sustancias interferentes puede permitir o aumentar la
sensibilidad de la amplificación de los ácidos nucleicos.
Este esquema de amplificación asociada a fase
sólida puede usarse en multitud de sistemas de ensayo, incluidos
los descritos anteriormente en este documento. El Solicitante
prefiere usar un sistema de ensayo en el que se empleen uno o más
oligonucleótidos de acoplamiento, como los que se han descrito
anteriormente, que sean capaces de fijar indirectamente el ácido
nucleico diana al soporte sólido. También es preferible que las
regiones con secuencia de nucleótidos complementaria del
oligonucleótido acoplado al soporte, así como el oligonucleótido de
captura diseñado para hibridarse con aquél, sean al menos
parcialmente homopoliméricos o contengan secuencias de nucleótidos
sencillas repetidas, para promover una hibridación rápida. Además,
o como alternativa, estas regiones del oligonucleótido
inmovilizado, del oligonucleótido de captura, o de ambos, pueden
ser modificadas de manera acorde a lo expuesto en la presente
invención, con el fin de incrementar la velocidad de hibridación
entre ambos oligonucleótidos. En un sistema de ensayo de estas
características, se deja que el oligonucleótido de captura de la
diana y los ácidos nucleicos diana se hibriden preferiblemente en
una solución, antes de realizar la hibridación con el
oligonucleótido inmovilizado. En la forma de realización preferida
actualmente, se lava el oligonucleótido inmovilizado, se hace que
el oligonucleótido (u oligonucleótidos) de amplificación entre en
contacto con la diana inmovilizada en condiciones de amplificación
de los ácidos nucleicos, y tras la amplificación, se añade y se
detecta la sonda marcada dirigida por los
amplicones.
amplicones.
El Solicitante prefiere usar el método de
amplificación basado en transcripción descrito en Kacian &
Fultz, citado anteriormente. Con arreglo a dicho método, se
hace que un cebador promotor que tiene una región 3' complementaria
de una porción de la diana, y una región 5' y un cebador que tienen
la misma secuencia de nucleótidos que una porción de la diana,
entren en contacto con una molécula de ARN diana. El cebador y el
cebador promotor definen los límites de la región de la diana que
se desea amplificar, incluidos el sentido presente en la molécula
diana y su complemento, y con ello, la longitud y la secuencia del
amplicón. Puede hacerse que los oligonucleótidos de amplificación y
el ARN diana inmovilizado entren en contacto en presencia de
cantidades eficaces de transcriptasa inversa derivada del virus de
la leucemia murina de Moloney y de ARN polimerasa T7,
ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos trifosfato, y las sales y
cofactores necesarios a 42ºC. En estas condiciones se produce la
amplificación de los ácidos nucleicos, que genera predominantemente
amplicones de ARN de un sentido opuesto al del ácido nucleico
diana. Después, estos amplicones se detectan usando, por ejemplo,
una sonda de ensayo de hibridación, marcada con éster de acridinio,
que tenga el mismo sentido que el del ácido nucleico diana, en el
ensayo de protección de la hibridación descrito en Arnold,
citado anteriormente.
Se puede "taponar" o bloquear el extremo 3'
del oligonucleótido inmovilizado, del oligonucleótido de captura y
del oligonucleótido (u oligonucleótidos) de acoplamiento, con el
fin de evitar o inhibir su uso como plantillas para la actividad de
las polimerasas de ácidos nucleicos. Para realizar el taponamiento,
se pueden añadir, en el extremo 3',
3'-desoxirribonucleótidos (por ejemplo,
cordicepina), residuos 3',2'-didesoxinucleótidos,
enlazadores no nucleotídicos como los descritos en Arnold et
al, citado anteriormente, modificaciones alcanodiol, o
residuos nucleotídicos no complementarios.
Aunque es posible hacer que los cebadores entren
en contacto con la diana después de la inmovilización de la diana,
pueden obtenerse ventajas en cuanto a la cinética de hibridación
combinando el ácido nucleico diana y al menos un cebador
complementario con éste al mismo tiempo que se añade el
oligonucleótido de captura de la diana. El Solicitante cree que
resulta ventajoso realizar la hibridación de la diana en una
solución, antes de llevar a cabo la inmovilización de la diana, ya
que la hibridación puede producirse a una mayor velocidad en una
solución que cuando un ácido nucleico está inmovilizado.
Igualmente, aunque el Solicitante prefiere
formar y detectar amplicones de un sentido opuesto al de la diana,
no hay motivos para no formar y detectar amplicones del otro
sentido o de ambos sentidos. Además, cuando se amplifican ácidos
nucleicos diana contenidos en muestras clínicas frescas, parece que
es importante llevar a cabo un paso de lavado antes de llevar a
cabo el paso de amplificación, con el fin de evitar la inhibición
de las enzimas o la degradación de los ácidos nucleicos a causa de
las sustancias presentes en la muestra.
Será evidente, para aquellos cualificados en la
materia, que esta metodología es aplicable, de la forma descrita o
incorporando modificaciones obvias, a otros diversos esquemas de
amplificación, incluida la reacción en cadena de la polimerasa.
En los métodos de procesado de muestras en los
que se emplea la hibridación de ácidos nucleicos, incluidos los
métodos de captura de diana descritos anteriormente, se pueden
utilizar oligonucleótidos modificados capaces de hibridarse a una
mayor velocidad con las dianas complementarias correspondientes. A
la luz de la presente invención, se hará evidente que tales
oligonucleótidos parcial o totalmente modificados pueden emplearse
como sondas de ensayo de hibridación o como oligonucleótidos de
amplificación en estos sistemas. Además, los oligonucleótidos
parcial o totalmente modificados que presentan mayores velocidades
de hibridación con la correspondiente diana pueden emplearse como
oligonucleótidos inmovilizados, como oligonucleótidos de captura de
la diana, o como uno o más oligonucleótidos de acoplamiento en
ensayos heterogéneos en los que se haga uso de la hibridación de
ácidos nucleicos. Por ejemplo, tales modificaciones pueden
emplearse para reducir la duración total del ensayo o para
posibilitar que los pasos de hibridación del ensayo discurran a una
sola temperatura. Las ventajas que así se obtienen, en un entorno
clínico, en cuanto a reducción de la duración y a facilidad del
funcionamiento del ensayo serán evidentes para aquellos
cualificados en la materia.
Asimismo, es posible modificar los
oligonucleótidos de manera tal que presenten una cinética de
hibridación o preferencias de equilibrio por un tipo concreto de
ácido nucleico, como el ARN o el ADN. Por ejemplo, y tal como se ha
descrito anteriormente en este documento, los
2'-O-metil-oligonucleótidos
muestran preferencia por hibridarse con el ARN, en vez de con el
ADN. De este modo, los oligonucleótidos de captura de la diana que
contienen
2'-O-metil-nucleótidos
pueden emplearse para capturar, de manera específica, ácidos
nucleicos diana compuestos de ARN, por ejemplo, ARNm o ARNr, en
condiciones de hibridación que no promueven la hibridación del
oligonucleótido con la versión genómica de éste. Igualmente, pueden
diseñarse oligonucleótidos de amplificación modificados en forma de
2'-O-metil-oligonucleótidos,
o sondas marcadas compuestas por
2'-O-metil-oligonucleótidos,
que tendrán como diana el ARN en vez del ADN, para la amplificación
o detección, tal y como se ha descrito anteriormente.
Los oligonucleótidos "helper" se describen
en Hogan, citado anteriormente. Por lo general, los
oligonucleótidos "helper" no van marcados, y se usan junto con
sondas de ensayo de hibridación marcadas para aumentar la T_{m} y
la velocidad de hibridación de la sonda marcada "abriendo" las
regiones de la diana que presentan secuencias de nucleótidos que
pueden participar en la estructura secundaria; de este modo, dichas
regiones se tornan disponibles para su hibridación con la sonda
marcada.
A la luz de la presente invención, aquellos
cualificados en la materia se darán cuenta fácilmente de que el uso
de oligonucleótidos "helper" modificados, que se hibridan a
mayor velocidad con el ácido nucleico diana, frente al uso de sus
análogos no modificados, puede llevar a velocidades de hibridación
aún mayores de la sonda marcada con su diana. Por ello, en el
ámbito de la presente invención se desean englobar métodos y
composiciones para la detección de oligonucleótidos empleando tales
oligonucleótidos "helper" modificados. Los oligonucleótidos
"helper" preferidos presentan modificaciones que les dotan de
una mayor avidez por el ARN que por el ADN. En una forma de
realización preferida, tales modificaciones incluyen un racimo de
al menos unos 4
2'-O-metil-nucleótidos.
En una forma de realización particularmente preferida, tales
modificaciones incluyen un racimo de unos 8
2'-O-metil- nucleótidos.
Los métodos descritos en la presente invención
favorecen claramente el diseño y uso de kits de diagnóstico
especialmente formulados para su uso en tales métodos. Dichos kits
contendrán uno o más oligonucleótidos que se usarán en un ensayo
diagnóstico de hibridación de ácidos nucleicos. Al menos uno de
dichos oligonucleótidos contendrá un racimo de al menos unos 4
nucleótidos modificados, diseñados para hibridarse con una región
del ácido nucleico diana a una velocidad más alta que la velocidad
a la que se hibridaría el mismo oligonucleótido no modificado.
Tales kits de diagnóstico pueden contener, entre
otras, una o más combinaciones de los oligonucleótidos de la sonda,
oligonucleótidos de amplificación, oligonucleótidos "helper", y
oligonucleótidos para el procesado de muestras descritos en la
presente invención.
El kit puede contener al menos una sonda de
oligonucleótidos marcada que presente una región que contenga uno o
más racimos de al menos unos 4 residuos nucleotídicos, modificados
en 2', contiguos. La región puede contener uno o más racimos de
unos 8 residuos nucleotídicos modificados en 2'.
Se puede usar un derivado del éster de acridinio
como marcador no radiactivo, y añadirse un grupo metoxi como
modificación. Al menos uno de los oligonucleótidos modificados
puede contener uno o más racimos de unos 8
2'-O-metil-nucleótidos.
Los kits que contengan uno o más de los
oligonucleótidos modificados descritos en la presente invención se
podrían vender para su uso en cualquier tipo de método de ensayo de
hibridación diagnóstico, o método de amplificación relacionado. En
un ensayo de tales características, al menos uno de los
oligonucleótidos modificados contenidos en el kit funcionaría como
sonda capaz de hibridarse con un ácido nucleico diana. Si se hace
entrar en contacto la sonda modificada con una muestra que contenga
el ácido nucleico diana, la sonda tendrá mejores propiedades de
hibridación que una sonda no modificada que presente una secuencia
de bases idéntica. Por ejemplo, la afinidad de unión de la
hibridación entre la diana y la sonda modificada será mayor que la
afinidad de unión de la hibridación entre la diana y una forma no
modificada de la sonda, en las mismas condiciones del ensayo de
hibridación. Además, la velocidad de hibridación entre la diana y
la sonda modificada será más alta que la velocidad de hibridación
entre la diana y una forma no modificada de la sonda, en las mismas
condiciones del ensayo de hibridación.
Con el fin de mejorar aún más las propiedades de
hibridación de la sonda, se puede unir una o más moléculas de
conjugado a aquélla, preferiblemente en una región que contenga un
racimo de al menos unos 4 nucleótidos modificados. También es de
esperar que en el envase del kit se incluyan instrucciones para el
uso de uno o más oligonucleótidos modificados en un ensayo de
hibridación diagnóstico.
En la presente invención se describen métodos
con los que aumentar tanto la avidez de unión como la velocidad de
hibridación entre una sonda de ácidos nucleicos diagnóstica y el
ácido nucleico diana correspondiente, mediante el uso de moléculas
de sonda que contengan uno o más nucleótidos modificados,
preferiblemente, un racimo de unos 4 o más nucleótidos modificados,
y aún mejor, de unos 8 nucleótidos modificados. Las modificaciones
pueden consistir en modificaciones en la posición 2' del anillo del
ribofuranosilo. Pueden consistir, además, en una sustitución
2'-O-metilo.
También se describe, en la presente invención,
cómo proporcionar métodos para aumentar la velocidad de hibridación
de un oligonucleótido monocatenario con ácido nucleico diana
mediante la incorporación de una pluralidad de nucleótidos
modificados a dicho oligonucleótido. Una mayor velocidad de
hibridación lograda de esta manera será más alta que la conseguida
aumentando la temperatura, la concentración de sales o la
concentración de los reactantes con el ácido nucleico.
Se describen asimismo métodos de diagnóstico
dirigidos selectivamente contra el ARN en vez de contra el ADN,
mediante el uso de oligonucleótidos modificados de manera tal que
presentan una mayor eficiencia de unión con la diana y que se
hibridan con el ARN, en vez de con el ADN, a una velocidad más
alta. Dichos oligonucleótidos pueden contener una modificación
2-O-metilo en el anillo del
ribofuranosilo.
Se describen también métodos de procesado de
muestras en los que se emplea un oligonucleótido inmovilizado que
captura, directa o indirectamente, los ácidos nucleicos diana. En
tales métodos pueden emplearse uno o más oligonucleótidos que se
pueden hibridar de manera específica con el ácido nucleico diana,
posibilitando así su detección e inmovilización. Un único
oligonucleótido marcado puede ser el responsable tanto de la
captura como de la detección de la diana. Se puede fijar un ácido
nucleico de acoplamiento o puente tanto al oligonucleótido
inmovilizado como al oligonucleótido responsable de la captura y
detección de la diana. Es posible añadir ácidos nucleicos de
acoplamiento adicionales. Algunos de los oligonucleótidos empleados
en los métodos de procesado de muestras, o todos los
oligonucleótidos empleados en dichos métodos, pueden contener
modificaciones que aumenten la velocidad de la hibridación
específica con la diana.
Asimismo, en la presente invención se describen
oligonucleótidos específicos de diana que contienen de unas 10 a
unas 100 bases (preferiblemente, de unas 10 a unas 15 bases, y aún
mejor, de unas 12 a unas 15 bases), que contienen, preferiblemente,
al menos un racimo de al menos unos 4 nucleótidos o, aún mejor, de
unos 8 nucleótidos, modificados de tal modo que aumenta su
eficiencia de unión específica con la diana, a la vez que aumenta
su grado de discriminación entre las secuencias de nucleótidos
diana y las secuencias de nucleótidos no diana, en comparación con
oligonucleótidos más largos, no modificados, diseñados para
hibridarse con el mismo sitio.
En la presente invención se describen, además,
kits que presentan uno o más oligonucleótidos que contienen
nucleótidos modificados que actúan aumentando la velocidad de
hibridación entre el oligonucleótido y un ácido nucleico diana.
Dichos kits podrían incluir una combinación cualquiera de
oligonucleótidos de la sonda, oligonucleótidos de amplificación,
oligonucleótidos "helper", y oligonucleótidos para el procesado
de muestras. Los oligonucleótidos modificados de estos kits
podrían contener al menos un racimo de unas 4 modificaciones
2'-O-metilo al anillo del
ribofuranosilo. Los kits que contengan este tipo de
oligonucleótidos modificados se podrían comercializar para su uso
en ensayos de hibridación diagnósticos y en ensayos de
amplificación diagnósticos. Junto con tales kits pueden incluirse
instrucciones por escrito en las que se indique a los profesionales
cómo emplear los oligonucleótidos modificados en los ensayos de
hibridación diagnósticos o ensayos de amplificación
diagnósticos.
Es posible adaptar los métodos diagnósticos de
manera que aprovechen las propiedades de hibridación de los
oligonucleótidos modificados, que tienen una mayor afinidad de
unión. Dichos métodos pueden emplearse para la detección o la
cuantificación de cualquier ácido nucleico dado. En una forma de
realización preferida, el ácido nucleico diana es ARN. En los
métodos pueden emplearse oligonucleótidos "quiméricos",
compuestos de regiones de oligodesoxirribonucleótidos u
oligorribonucleótidos, combinadas con regiones de oligonucleótidos
modificados, o bien, pueden emplearse oligonucleótidos totalmente
modificados. Es preferible que los oligonucleótidos no estén
totalmente modificados. Se puede diseñar estas regiones para que
simplemente promuevan una hibridación rápida de la sonda con la
diana, o bien, para que, además, desempeñen otras funciones. Por
ejemplo, se puede diseñar un oligonucleótido quimérico que se una
tanto al ARN como al ADN. En tal caso, la región del
oligonucleótido fijadora del ARN puede contener una pluralidad de
nucleótidos modificados que se unen de manera preferente con la
diana de ARN. Como alternativa, se puede diseñar la región de
residuos nucleotídicos modificados de modo tal que esté dirigida
contra una diana que esté presente en una cantidad escasa, con el
fin de aumentar la velocidad de hibridación.
A la luz de la presente invención, se
comprenderá que ciertos métodos y composiciones, incluidos los
kits, harán uso de oligonucleótidos que presentan más de un tipo de
modificación que afecta a las propiedades de hibridación del
oligonucleótido resultante, es decir, a su T_{m} y su velocidad de
hibridación. Tales modificaciones múltiples pueden actuar de forma
cooperativa para aumentar aún más la velocidad de hibridación o
para aumentar la especificidad del oligonucleótido resultante por
un tipo de ácido nucleico diana dado, por ejemplo, ARN. Además, los
oligonucleótidos quiméricos pueden presentar o constar de regiones
de oligonucleótidos modificados de maneras diferentes, a saber,
nucleótidos modificados en 2' o nucleótidos que presenten otras
modificaciones, o ambos tipos de nucleótidos modificados.
A menos que se indique de otro modo, en todos
los siguientes ejemplos, los oligodesoxirribonucleótidos,
oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados se sintetizaron
usando las técnicas estándar de la fosforamidita, de las que los
diversos métodos son bien conocidos en la disciplina. Véase, por
ejemplo, Carruthers et al, volumen 154 de la revista
Methods in Enzymology, 287 (1987). Asimismo, a menos que en
el presente documento se indique de otro modo, los nucleótidos
modificados eran
2'-O-metil-nucleótidos,
que se usaron en la síntesis como sus análogos a base de
fosforamidita. El Solicitante preparó los oligonucleótidos usando
un Sintetizador de ADN Expedite 8909 (fabricante: PerSpetive
Biosystems, Framingham, MA, Estados Unidos).
Además, a menos que se indique de otro modo, los
oligonucleótidos indicados como marcador contenían un éster de
fenilo y acridinio. Los compuestos ésteres de fenilo y acridinio
son derivados del acridinio que presentan un centro de nitrógeno
cuaternario, así como derivados en la posición 9, que generan una
fracción fenil éster. No obstante, en la disciplina son bien
conocidos los grupos salientes que no son fracciones fenilo. Los
ésteres de acridinio tienen la propiedad de reaccionar con el
peróxido de hidrógeno, formando un anillo transitorio de dioxetano,
en el que participa el carbono C-9 del anillo del
acridinio, tras lo que se forma una acridona excitada. La
relajación irradiativa de la acridona excitada produce luz. La
síntesis de ésteres de acridinio, así como una descripción general
de su uso como agentes marcadores quimioluminiscentes, se describe
en Weeks et al, Acridinium Esters as High Specific
Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem.,
29:1474-1478 (1984).
En estos Ejemplos, se fijaron los ésteres de
acridinio, usando técnicas químicas estándar, a una unidad
monomérica no formada por nucleótidos que tenía un "brazo de
enlace", compuesto de una amina primaria, que estaba unido a la
fracción del éster de acridinio y que se inserta entre secuencias
contiguas de nucleótidos durante la síntesis química de los
oligonucleótidos, o que se coloca en una posición terminal del
oligonucleótido. Véase Arnold et al,
Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes, Número de publicación EPO 313219. No obstante, se
comprenderá que la preferencia que los oligonucleótidos modificados
en 2' presentan por las dianas de ARN, así como el efecto que los
oligonucleótidos modificados tienen sobre la velocidad de
hibridación con las dianas de ADN, no vienen determinadas por la
presencia de un marcador ni por la naturaleza concreta de éste. Así,
aquellos cualificados en la materia se darán cuenta de que los
oligonucleótidos que se emplean en el uso de la presente invención
pueden marcarse con varios marcadores diferentes, o no marcarse en
absoluto.
Los derivados del éster de acridinio pueden
fijarse al conjugado brazo de enlace:sonda de hibridación empleando
técnicas bien conocidas en la disciplina. A este respecto, el
Solicitante prefiere emplear los métodos que se describen en.
Nelson et al, Detection of Acridinium Esters by
Chemiluminiscence in Non-Isotopic Probe
Techniques (Academic Press 1992) y en Arnold et al,
Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes, Número de publicación EPO 313219.
Además, a menos que se indique de otro modo,
todos los ácidos nucleicos diana eran ARN.
Se hibridaron individualmente sondas de
oligonucleótidos de secuencias idénticas que contenían cantidades
variables de
2'-O-metil-nucleótidos,
de manera que fuesen perfectamente complementarias de dianas
sintéticas de ARN de la misma longitud. A la secuencia de la sonda
se le asignó el número identificador de secuencia SEQ ID NO: 1 y a
la secuencia de la diana se le asignó el número identificador de
secuencia SEQ ID NO: 2. Las secuencias de bases nucleotídicas de
estos oligonucleótidos eran las siguientes:
SEQ ID NO: 1 | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
SEQ ID NO: 2 | 5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC-3' |
Las sondas, como se ilustra a continuación, se
sintetizaron de modo que: no contuviesen ningún
2'-O-metil-nucleótido
(Sonda A); todos sus nucleótidos fuesen
2'-O-metil-nucleótidos
(Sonda B); contuviesen una combinación de desoxinucleótidos y
2'-O-metil-nucleótidos
(Sondas C, D y E). La Sonda C contenía cuatro
desoxirribonucleótidos contiguos colocados directamente adyacentes
a cada lado del sitio de acoplamiento del brazo de enlace; además,
contenía
2'-O-metil-ribonucleótidos
en todas las demás bases. La Sonda D contenía cuatro
2'-O-metil-nucleótidos
contiguos colocados directamente adyacentes a cada lado del sitio
de acoplamiento del brazo de enlace; además, contenía
desoxirribonucleótidos en todas las demás bases. La Sonda E
contenía ocho
2'-O-metil-nucleótidos
contiguos colocados directamente adyacentes a cada lado del sitio
de acoplamiento del brazo de enlace; además, contenía
desoxirribonucleótidos en todas las demás bases. Se determinó la
T_{m} de cada híbrido mediante un método quimioluminiscente y
mediante un método óptico.
Usando el método quimioluminiscente, se dejó que
aproximadamente 1 pmol de la diana de ARN y 0,1 pmol de cada sonda
de oligonucleótidos, marcados, como se ha descrito anteriormente,
con éster de acridinio estándar
(4-(2-succinimidiloxicarbonil
etil)fenil-10-metilacridinio
9-carboxilato fluorosulfonato), se hibridasen a 60ºC
durante 60 minutos en 30 \mul de tampón succinato de litio (EDTA
(ácido etilendiamino-tetracético) 1,5 mM, EGTA
(ácido etilenglicol-bis
(\beta-aminoetil éter)
N,N,N',N'-tetracético) 1,5 mM, lauril sulfato de
litio 310 mM, succinato de litio 0,1 M (a pH = 5,2)). Después, la
solución resultante se diluyó hasta 500 \mul con tampón succinato
de litio, y se incubaron alícuotas de 50 \mul a diversas
temperaturas durante 7 minutos. El éster de acridinio unido a las
moléculas de sonda no hibridadas se hidrolizó añadiendo 150 \mul
de una solución que contenía Na_{2}B_{4}O_{7} 190 mM (a pH =
7,6), TRITON® X-100 (polioxietilen
p-t-octil fenol) al 7% (v/v), y
gelatina al 0,02% (p/v), y se calentaron las muestras a 60ºC
durante 10 minutos. La quimioluminiscencia restante (asociada a los
híbridos) de cada muestra se determinó en un luminómetro LEADER® 50
(fabricante: MGM Instruments, Hamden, Ct, Estados Unidos) mediante
la inyección automática de una solución que contenía H_{2}O_{2}
al 0,1% (v/v) en HNO_{3} 0,001 M, seguida, de 0,5 a 2 segundos
más tarde, de una inyección de 200 \mul de NaOH 1N. La emisión de
luz resultante se integró a lo largo un intervalo de 2
segundos.
Usando el método óptico, se sintetizó un
conjunto idéntico de sondas de oligonucleótidos que presentaban un
brazo de enlace, pero que no fueron marcadas con éster de
acridinio. Se dejó que cuatro microgramos de cada sonda de
oligonucleótidos se hibridasen con 4 \mug de la diana de ARN
complementaria durante 60 minutos a 60ºC en 30 \mul de un tampón
de hibridación que contenía hidróxido de litio 200 mM, EDTA 3 mM,
EGTA 3 mM, lauril sulfato de litio al 17% (p/v), y ácido succínico
190 mM (a pH = 5,2). Después de la hibridación, se añadieron 600
\mul del tampón de hibridación, se dividió la muestra en dos, y
se examinó el comportamiento de fusión de cada porción de la
muestra usando un espectrofotómetro Beckman DU® 640 dotado de un
accesorio con microceldas para el análisis de la T_{m}. Se varió
la temperatura en 1ºC por minuto en el caso de las temperaturas que
eran 10ºC superiores o inferiores a la T_{m}, y en 0,5ºC por
minuto, a intervalos de 0,2ºC, en el caso de todas las demás
temperaturas. Se realizó un seguimiento de los cambios en la
hipocromaticidad y se registraron dichos cambios como función de la
temperatura. Los resultados se presentan en la Tabla 1, a
continuación.
\hskip1cm nh = no hecho
Como se aprecia en la Tabla 1, los datos de
T_{m} generados usando los métodos quimioluminiscente y óptico
fueron bastante similares. Los valores de T_{m} ligeramente
menores observados con el método quimioluminiscente se pueden
atribuir a las menores concentraciones de ácidos nucleicos
empleadas en el método quimioluminiscente (en comparación con las
empleadas en el método óptico). Los datos revelan que la
sustitución de todos los residuos desoxirribonucleotídicos de la
Sonda A con
2'-O-metil-nucleótidos
(Sonda B) generó híbridos sonda:diana de ARN que presentaron un
aumento de la T_{m} de unos 20,4ºC. Las Sondas C, D y E
presentaron aumentos de la T_{m} de 15ºC, 4ºC y 11,6ºC,
respectivamente. Calculando el efecto sobre la T_{m} de cada
sustitución por un
2'-O-metil-nucleótido,
los datos revelan que la T_{m} del híbrido
2'-O-metil-oligonucleótido:diana
de ARN aumenta unos 0,8ºC con cada sustitución. Este efecto es
aproximadamente lineal a lo largo de la serie de sustituciones
probadas.
Se sintetizaron tres conjuntos de sondas de
oligonucleótidos, de diferente longitud y secuencia, y cada
conjunto contenía dos oligonucleótidos de idéntica secuencia de
bases. La Sonda F tenía 17 bases de longitud e incluía un marcador
a base de éster de acridinio, fijado en un sitio ubicado entre una
base timina y una base adenina. La Sonda G tenía 18 bases de
longitud e igualmente incluía un marcador a base de éster de
acridinio, fijado en un sitio ubicado entre una base timina y una
base adenina. La Sonda H tenía 20 bases de longitud e incluía un
marcador a base de éster de acridinio, fijado en un sitio ubicado
entre una base timina y una base guanina.
Cada conjunto de sondas contenía un
oligonucleótido compuesto enteramente de desoxirribonucleótidos y
otro oligonucleótido que sólo contenía
2'-O-metil-nucleótidos.
Se hibridó cada sonda con el ARN ribosómico correspondiente, y se
determinó la T_{m} de los híbridos resultantes usando el método
quimioluminiscente que se ha descrito anteriormente. Los resultados
se presentan en la Tabla 2, a continuación.
Los datos confirman los resultados del Ejemplo
1, y muestran que sustituir un desoxirribonucleótido con un
2'-O-metil-nucleótido
aumenta la T_{m} del híbrido sonda:diana de ARN resultante.
Además, cuando se calcula en forma de promedio del aumento de
T_{m} de las tres sondas por nucleótido modificado, la
contribución de cada nucleótido modificado fue de un aumento de
0,8ºC por nucleótido modificado.
En este Ejemplo se evaluó el efecto de la
modificación en 2' sobre los híbridos sonda:ADN. La Sonda I, que
contenía cantidades variables de
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridó con una diana de ADN exactamente complementaria que
presentaba la misma longitud, y se examinó, mediante el método
quimioluminiscente que se ha descrito anteriormente, el
comportamiento de fusión de los híbridos resultantes. La Sonda I
tenía 29 bases de longitud e incluía un marcador a base de éster de
acridinio, fijado en un sitio ubicado entre una base timina y una
base guanina.
Se diseñó la Sonda I de manera que contuviese:
(i) sólo desoxirribonucleótidos; (ii) sólo
2'-O-metil-nucleótidos;
(iii) sólo
2'-O-metil-nucleótidos,
excepto cuatro desoxirribonucleótidos, que se colocaron
inmediatamente adyacentes a cada lado del sitio de fijación del
marcador. Los resultados de la determinación de la T_{m} se
presentan en la Tabla 3, a continuación.
Como muestran los datos, la sustitución de los
desoxirribonucleótidos por
2'-O-metil-nucleótidos
en las dos últimas variaciones de la Sonda I hizo que la T_{m}
del híbrido sonda marcada:diana de ADN aumentase aproximadamente
0,3ºC por cada
2'-O-metil-nucleótido.
Se llevó a cabo una prueba similar empleando
tres conjuntos de oligonucleótidos diferentes. Cada conjunto
incluía dos oligonucleótidos; uno de dichos oligonucleótidos
contenía desoxirribonucleótidos y el otro contenía un 100% de
2'-O-metil-nucleótidos;
las secuencias de bases eran idénticas. La Sonda J tenía 16 bases
de longitud e incluía un marcador a base de éster de acridinio,
fijado en un sitio ubicado entre una base timina y una base adenina.
La Sonda K tenía 18 bases de longitud e igualmente incluía un
marcador a base de éster de acridinio, fijado en un sitio ubicado
entre una base timina y una base adenina. La Sonda L tenía 29 bases
de longitud e incluía un marcador a base de éster de acridinio,
fijado en un sitio ubicado entre una base timina y una base
guanina.
En cada uno de estos casos, las dianas de ADN
sintético eran completamente complementarias de las sondas. Los
resultados se presentan en la Tabla 4, a continuación.
Los datos expuestos en las Tablas 3 y 4
demuestran que, cuando se introducen sustituciones
2'-O-metilo en las sondas, la
T_{m} de las dianas de ADN aumenta mucho menos que la T_{m} de
las dianas de ARN.
Con el fin de comparar las estabilidades
relativas de híbridos que contenían diversas combinaciones de
cadenas de ADN, ARN y
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridaron sondas de oligonucleótidos, marcadas con éster de
acridinio, que presentaban la secuencia SEQ ID NO: 1 (véase el
Ejemplo 1 anterior), con dianas sintéticas que presentaban una
secuencia de bases perfectamente complementaria. Las secuencias de
las sondas y de las dianas contenían un 100% de ribonucleótidos
(ARN), o un 100% de desoxirribonucleótidos (ADN), o un 100% de
2'-O-metil-nucleótidos,
formando las combinaciones que se indican en la Tabla 5. En dicha
Tabla 5 (a continuación) se muestran las características de fusión
de cada híbrido probado, determinadas usando el método
quimioluminiscente o el método óptico. En la Tabla, cuando aparece
más de un punto de datos, significa que se realizó un experimento
independiente, duplicado.
\hskip1cm nd = sin datos
De esta manera, este experimento indica que la
estabilidad de los híbridos sonda marcada:diana sigue el orden:
2'-O-metil/2'-O-metil
\geq 2'-O-metil/ARN > ARN/ARN
> ADN/ADN > 2'-O-metil/ADN
> ADN/ARN.
Como se ha indicado en el Ejemplo 4, los
híbridos 2'-O-metil/ARN son
considerablemente más estables que los híbridos
2'-O-metil/ADN. Para demostrar que
esta diferencia en la estabilidad se puede aprovechar en un ensayo
diagnóstico con el fin de detectar de manera específica moléculas de
ARN, en vez de moléculas de ADN que tengan una secuencia idéntica
(idéntica salvo por el hecho de que, en el ARN, el uracilo (U)
ocupa las posiciones que la timidina (T) tiene en el ADN), se llevó
a cabo el siguiente experimento.
Se dejó que una sonda de oligonucleótidos
marcada con éster de acridinio, que presentaba una secuencia SEQ ID
NO: 1 (véase el Ejemplo 1, anteriormente en este documento) y que
estaba compuesta de un 100% de
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridase con una diana de ARN o ADN sintético completamente
complementaria. Dejando a un lado el hecho de que el oligonucleótido
estaba marcado, la hibridación y la medición de la T_{m} fueron,
por lo demás, iguales a lo descrito en el Ejemplo 1, Método Óptico.
Los resultados se presentan en la Tabla 5 anterior, y se ilustran
más detalladamente en la Figura 3.
Como se indica en la Figura 3, a 81,6ºC el
2'-O-metil-oligonucleótido
forma un híbrido, detectable, con la diana de ARN, y no con la diana
de ADN. En cambio, como revela la Tabla 5, cuando se híbrida un
oligonucleótido de ADN marcado de la misma secuencia con las dianas
de ARN o ARN idénticas, los híbridos resultantes tienen
características de fusión esencialmente similares.
Así, y conforme al aspecto de la presente
invención demostrado aquí, es posible detectar de manera específica
dianas de ARN, de manera preferente respecto de dianas de ADN, en
condiciones de hibridación que se determinan con facilidad. Tales
métodos se pueden usar, entre otras cosas, para detectar de manera
específica diversas especies de ARN, tales como ARNm, ARNt o ARNr,
sin que se produzca interferencia por parte de la secuencia
idéntica que existe en el ADN genómico del organismo que se está
sometiendo a ensayo. Dichos métodos pueden ser útiles para diversas
aplicaciones, por ejemplo, para realizar un seguimiento de la tasa
de expresión de un producto génico concreto. Aquellos cualificados
en la materia se darán cuenta fácilmente de otras aplicaciones en
las que se puede aprovechar esta capacidad que tienen los
oligonucleótidos modificados en 2'.
El efecto de los nucleótidos modificados en 2'
sobre la velocidad de hibridación se ilustró empleando cuatro
métodos diferentes. Las moléculas de sonda utilizadas en este
ejemplo se marcaron con éster de acridinio estándar, de la manera
descrita anteriormente en este documento.
a) En el primer método, se hibridaron, durante
un período de tiempo constante, 2 fmol de una sonda, marcada con
éster de acridinio y que presentaba una secuencia SEQ ID NO: 1
(véase el Ejemplo 1 anterior), con cantidades variables de una
diana de ARN completamente complementaria; después, se realizó una
hidrólisis diferencial y detección de la diana. La hibridación se
llevó a cabo esencialmente de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Método quimioluminiscente, aunque con las diferencias que se
indican a continuación. Se dejó que cantidades variables de diana
de ARN se hibridasen con la sonda marcada, a 60ºC durante 45
minutos. En la Figura 4 se muestran los resultados de este
experimento; la sonda fue un oligonucleótido de ADN (sonda
representada por cuadrados huecos), o bien, constó enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
(sonda representada por diamantes oscuros); estos resultados se
presentan también en la Tabla 6, a continuación. El grado de
hibridación se expresa en forma de unidades relativas de luz (rlu),
que es una medición del número de fotones emitidos por el marcador
éster de acridinio.
Los resultados indican que la velocidad de
hibridación, como función de la concentración de diana, aumenta
notablemente cuando la sonda contiene
2'-O-metil-nucleótidos
en vez de nucleótidos no modificados. Esto es así en todo el
intervalo de concentraciones de diana estudiado. Con fines
comparativos, las pendientes iniciales de estos datos se emplean
para calcular las velocidades de hibridación relativas de las
sondas de desoxioligonucleótidos (pendiente = 1,0) y de
2'-O-metil- oligonucleótidos.
b) En un segundo método, se hibridó una cantidad
constante (2 fmol) de la misma diana que la empleada en a) con
cantidades variables de la sonda perfectamente complementaria,
durante una cantidad fija de tiempo. En la Figura 5 se ilustran los
resultados de este experimento; la sonda fue un oligonucleótido de
ADN (sonda representada por cuadrados huecos), o bien, constó
enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
(sonda representada por cuadrados oscuros). Los pasos de
hibridación y de detección fueron los mismos que los descritos en
a), salvo por el hecho de que la reacción de hibridación se llevó a
cabo durante 30 minutos, en vez de durante 45 minutos. Los datos se
presentan en la Tabla 7, a continuación.
De nuevo, los resultados de este ejemplo indican
que la velocidad de hibridación, que es una función de la
concentración de diana, aumenta notablemente cuando la sonda
contiene
2'-O-metil-nucleótidos
en vez de nucleótidos no modificados. Las pendientes de estos
trazados son similares a las de la Figura 4, lo que indica que,
independientemente de si se varía la concentración de sonda o la
concentración de diana, la diferencia en la velocidad de
hibridación entre las interacciones
2'-O-metil-nucleótidos/ADN
y ADN/ADN sigue siendo la misma. En este experimento, la pendiente
inicial de la reacción que contenía la sonda de ADN fue de 1,0, y
la pendiente inicial de la reacción que contenía la sonda de
2'-O-metil-oligonucleótidos
fue de 3,1.
c) Como tercera demostración de la capacidad de
los oligonucleótidos modificados en 2' para aumentar la velocidad
de hibridación, se dejó que cantidades fijas de sonda modificada o
no modificada (1 fmol) y de diana (100 amol) se hibridasen durante
cantidades de tiempo variables. Los protocolos de hibridación y de
detección fueron, por lo demás, los mismos que en b). En la Figura
6 se ilustran los resultados; la sonda fue un oligonucleótido de ADN
(sonda representada por cuadrados huecos), o bien, constó
enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
(sonda representada por diamantes oscuros). Los datos se presentan
en la Tabla 8, a continuación.
De nuevo, las velocidades de hibridación
relativas pueden determinarse a partir de las pendientes iniciales
de las curvas (desoxioligonucleótidos = 1,0;
2'-O-metil-oligonucleótidos
= 2,2). En este experimento, la pendiente inicial de la reacción
que contenía el oligonucleótido de ADN fue de 1,0, y la pendiente
inicial de la reacción que contenía la sonda de
2'-O-metil-oligonucleótidos
fue de 2,2.
d) El cuarto método empleado para mostrar las
diferencias existentes entre las velocidades de hibridación de las
sondas modificada en 2' y no modificada fue un análisis de la
C_{o}t. Se utilizaron sondas, marcadas con éster de acridinio,
que presentaban una secuencia SEQ ID NO: 1 (véase el Ejemplo 1
anterior). Se dejó que una cantidad fija de sonda y cantidades
diversas de diana ("exceso de sonda"), o una cantidad fija de
diana y cantidades diversas de sonda ("exceso de diana"), se
hibridasen a 60ºC durante cantidades de tiempo diversas. La
cantidad fija de sonda o de diana fue de 0,25 fmol, y las
cantidades diversas de sonda o de diana fueron cantidades
comprendidas en el intervalo de 0,25 a 50 fmol. Por lo demás, la
hibridación se llevó a cabo como en el Ejemplo 1, Método
Quimioluminiscente.
Se llevó a cabo una hidrólisis diferencial del
éster de acridinio no hibridado, y una detección de la sonda
hibridada, añadiendo a la muestra 150 \mul de
Na_{2}B_{4}O_{7} 190 mM (a pH = 7,6), TRITON®
X-100 al 7% (v/v) y gelatina al 0,02% (p/v), y
calentando la mezcla a 60ºC durante 10 minutos. Se leyó la
quimioluminiscencia en un luminómetro, tal y como se ha descrito
anteriormente. El porcentaje máximo de hibridación se definió como
la proporción formada por el valor observado de rlu dividido entre
el valor máximo de rlu observado cuando se utilizaron cantidades
saturantes de sonda o de diana en la reacción de hibridación.
En la representación de la C_{o}t que aparece
en la Figura 7, se representa el logaritmo neperiano (1n) de la
cantidad frente a la concentración de diana multiplicada por el
tiempo de hibridación. El valor H se define como el porcentaje de
hibridación de la sonda a una concentración de diana dada, tras un
tiempo dado.
En esta representación, las velocidades de
hibridación relativas de las sondas de ADN y de
2'-O-metil-oligonucleótidos
vienen dadas por la inversa de las proporciones relativas de la
C_{o}t en el momento en el que se ha alcanzado el 50% de la
hibridación (ln(1-0,5);
desoxioligonucleótidos = 1,0, y
2'-O-metil-oligonucleótidos
= 2,2).
En la Tabla 9 se presenta un resumen de las
velocidades de hibridación relativas de una sonda marcada con éster
de acridinio y que constaba enteramente de desoxirribonucleótidos
o de
2'-O-metil-ribonucleótidos;
se presentan los valores dichas velocidades de hibridación
relativas, determinados empleando los cuatro métodos que se acaban
de exponer. Los datos resultantes de estos experimentos indican
que, a 60ºC, un oligonucleótido compuesto enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
se híbrida 2,3 veces más deprisa que la sonda de
desoxirribonucleótidos correspondiente.
Con el fin de ampliar estas comparaciones de las
velocidades de hibridación a las secuencias de otras sondas y
dianas, se sintetizó la Sonda H descrita en el Ejemplo 2 anterior,
de manera tal que constaba enteramente de desoxinucleótidos o de
2'-O-metil-nucleótidos,
y se hibridó con ARNr en presencia de sondas "helper". Como en
el Ejemplo 6(d), se llevó a cabo un análisis de la C_{o}t.
Los resultados se presentan en la Tabla 10, a continuación.
En este Ejemplo, la sonda que constaba
enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
se hibridó 3,75 veces más deprisa que la sonda de
desoxirribonucleótidos de idéntica secuencia. Por lo tanto, el
aumento de la hibridación por parte de las sondas marcadas con éster
de acridinio que contienen
2'-O-metil-nucleótidos
no parece estar limitada a ninguna secuencia de sonda o de diana
concreta.
Como se ha mencionado anteriormente, cuando la
temperatura aumenta, aumenta la velocidad de hibridación de los
ácidos nucleicos. No obstante, las ventajas que ofrece este aumento
de la velocidad de hibridación podrían verse contrarrestadas por
los efectos desestabilizadores del aumento de la temperatura sobre
la formación de dúplex, especialmente en ensayos diagnósticos y en
procedimientos de amplificación de los ácidos nucleicos en los que
se utilicen oligonucleótidos relativamente cortos (de entre unos 10
y unos 50 bases de longitud). Pero, como se expone a continuación,
la mayor estabilidad que los oligonucleótidos modificados descritos
en la presente invención proporcionan a los dúplex puede minimizar
el efecto desestabilizador y posibilitar que la velocidad de
hibridación sea aún mayor al llevar a cabo la hibridación a una
temperatura mayor a la que de otro modo sería posible. De este
modo, los oligonucleótidos modificados y la mayor temperatura de
hibridación actúan conjuntamente para aumentar la velocidad de
hibridación.
Se dejó que una sonda de oligonucleótidos,
marcada con éster de acridinio, de secuencia SEQ ID NO: 1 (véase el
Ejemplo anterior), compuesta enteramente por
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridase con una diana de ARN perfectamente complementaria, de
longitud idéntica a la descrita anteriormente. La hibridación y el
protocolo de análisis de la C_{o}t fueron los mismos que los
descritos en el Ejemplo 6(d), salvo por el hecho de que las
temperaturas de hibridación fueron de 60ºC o de 70ºC. Como indican
los datos que se presentan en la Tabla 11 (a continuación), cuando
se aumentó la temperatura de hibridación del
2'-O-metil-oligonucleótido
con su diana de 60ºC a 70ºC, la velocidad de hibridación aumentó
1,5 veces.
La velocidad de hibridación también se ve
incrementada cuando aumenta la concentración de sales. El siguiente
ejemplo ilustra el efecto de diversas concentraciones de sales,
por ejemplo, LiCl, sobre la velocidad de hibridación de los
2'-O-metil-nucleótidos.
Se dejó que una sonda, marcada con éster de acridinio, que
presentaba una secuencia SEQ ID NO: 1 (véase el Ejemplo 1 anterior)
compuesta enteramente por
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridase a 80ºC con una diana de ARN exactamente
complementaria, de la misma longitud, de la manera descrita
anteriormente en el Ejemplo 6(d); asimismo, se llevó a cabo
un análisis de la C_{o}t (de la manera descrita anteriormente). La
hibridación se llevó a cabo empleando dos concentraciones de LiCl
diferentes. Como se presenta en la Tabla 12 (a continuación),
cuando se aumentó la concentración de LiCl de 0,5 M a 1,0 M, la
velocidad de hibridación aumentó 2,9 veces.
Estos resultados demuestran que, cuando se dobla
la concentración de sales en una reacción de hibridación, la
velocidad de hibridación de los oligonucleótidos modificados
aumenta en un factor de 2,9.
Con el fin de demostrar el efecto que aumentar
tanto la temperatura de hibridación como la concentración de sales
tiene sobre la velocidad de hibridación de los oligonucleótidos
modificados en 2', se llevaron a cabo las siguientes reacciones. Se
dejó que, en un análisis de la C_{o}t, un oligonucleótido de ADN
y un oligonucleótido marcado con éster de acridinio que constaba
enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos,
ambos de una secuencia SEQ ID NO: 1 (véase el Ejemplo 1 anterior),
se hibridasen, por separado, con una molécula diana de ARN
exactamente complementaria. Las condiciones de hibridación fueron
las mismas que las descritas en el Ejemplo 6(d). Las
temperaturas de hibridación y las concentraciones de sales fueron
las que se indican en la Tabla 13 (a continuación). Los resultados
fueron los siguientes:
Como indican los datos, a una temperatura de
hibridación de 80ºC y en presencia de LiCl 1,0 M, el
2'-O-metil-oligonucleótido
se hibridó con su diana a una velocidad 8,6 veces mayor que la
velocidad a la que se hibridó el oligonucleótido de ADN
correspondiente a una temperatura de 60ºC en presencia de LiCl a
una concentración de 0,5 M.
Se determinaron por separado las velocidades de
hibridación relativas, con dianas de ADN y de ARN completamente
complementarias, de ARN, ADN y oligonucleótidos modificados con
2'-O-metilo, marcados. La
determinación de la velocidad se llevó a cabo de la manera descrita
en el Ejemplo 6(c) o en el Ejemplo 6(d). Los
oligonucleótidos marcados presentaban secuencias de bases idénticas
(SEQ ID NO: 1 (véase el Ejemplo 1 anterior)). Los resultados se
presentan en la Tabla 14 (a continuación).
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Los experimentos representados por las filas 1 a
4 se llevaron a cabo de la manera descrita en el Ejemplo
6(c), empleando 3 fmol de sonda marcada y 0,3 fmol de diana.
Los experimentos representados por las filas 5 y 6 se llevaron a
cabo de la manera descrita en el Ejemplo 6(d). En los casos
en los que en la tabla aparece más de un resultado, cada valor se
corresponde con un experimento individual diferente.
Los resultados expuestos en la Tabla 14 muestran
que la sustitución de los residuos desoxirribonucleotídicos por
residuos 2'-OH (ARN) o
2'-O-metilo aumenta la afinidad de
la sonda por la diana de ARN, así como la velocidad de hibridación
de la sonda con la diana de ARN. En cambio, la sustitución de los
residuos desoxirribonucleotídicos por residuos
2'-O-metilo no aumenta la afinidad
de la sonda por la diana de ADN, ni la velocidad de hibridación de
la sonda con la diana de ADN.
Los resultados presentados en la Tabla 14
revelan que la sustitución de los residuos desoxirribonucleotídicos
por residuos 2'-O-metilo aumenta la
afinidad de la sonda por la diana de ARN, así como la velocidad de
hibridación de la sonda con la diana de ARN, pero no la afinidad de
la sonda por la diana de ADN, ni la velocidad de hibridación de la
sonda con la diana de ADN. No obstante, estos experimentos no
eliminan la posibilidad de que el marcador éster de acridinio o el
brazo de enlace por el que se fija a la sonda puedan ser los
responsables de estas características de la velocidad de
hibridación.
Con el fin de demostrar que ni el éster de
acridinio ni el brazo de enlace afectan de manera apreciable a las
velocidades de hibridación, se llevó a cabo el siguiente
experimento.
Se dejó que una sonda de ARN de secuencia SEQ ID
NO: 1, marcada con éster de acridinio (véase el Ejemplo 1 anterior)
y que contenía un brazo de enlace no nucleotídico que fijaba el
marcador a la sonda, se hibridase con una diana exactamente
complementaria compuesta enteramente por
2'-O-metil-nucleótidos
o por desoxirribonucleótidos. La hibridación y el análisis de la
C_{o}t se llevaron a cabo de la manera descrita en el Ejemplo
6(d). Los resultados se presentan en la Tabla 15 (a
continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Estos datos revelan que la sustitución de
desoxirribonucleótidos por residuos
2'-O-metilo aumenta la velocidad de
hibridación de un oligonucleótido que no contenga éster de
acridinio o brazo de enlace. Por lo tanto, el aumento de la
velocidad de hibridación que se observa en las sondas modificadas
con 2'-O-metilo no se debe a la
presencia de un marcador o de un brazo de enlace, sino que se trata
de una propiedad intrínseca de los oligonucleótidos modificados con
2'-O-metilo.
Como se describe en Hogan, citado
anteriormente, la hibridación de algunas sondas con los ácidos
nucleicos, especialmente con los que tienen una cantidad
significativa de estructura secundaria, se ve facilitada por el uso
de sondas adicionales, denominadas sondas "helper". Un
ejemplo, entre otros, de una especie de ácido nucleico que presenta
un alto grado de estructura secundaria, es el ARN ribosómico
(ARNr). Las sondas "helper" pueden facilitar la alteración de
la estructura secundaria que puede estar enmascarando la región
diana. Habitualmente, la sonda "helper" está dirigida contra
una región cercana a la secuencia que es la diana de la sonda;
preferiblemente, no está solapada a dicha secuencia. En la práctica,
por lo general no se marcan las sondas "helper", y se suelen
usar en una concentración molar muy en exceso. El efecto que el uso
de las sondas "helper" tiene sobre la hibridación de una sonda
marcada se suele expresar como un aumento de la T_{m} y de la
velocidad de hibridación en relación con el híbrido sonda
marcada:diana.
Los siguientes experimentos se llevaron a cabo
para determinar si las sondas de oligonucleótidos modificados en
2' tienen los mismos requisitos, en cuanto a sondas "helper",
que las sondas de ADN, cuando están dirigidas contra regiones diana
dadas que presentan una gran cantidad de estructura secundaria. Se
prepararon dos mezclas de sondas. Cada mezcla de sondas contenía
las Sondas F, G y H del Ejemplo 2 descrito anteriormente. Los
oligonucleótidos de una de las mezclas de sondas estaban compuestos
de un 100% de
2'-O-metil-nucleótidos,
y los oligonucleótidos de la otra mezcla de sondas estaban
compuestos enteramente de desoxirribonucleótidos. Donde así se
indica, las mezclas de sondas incluían las sondas "helper" de
ADN no marcadas a, b, c, d, e y f, que tenían longitudes de 33, 36,
41, 31, 29 y 40 bases, respectivamente.
Cada sonda "helper" estaba dirigida contra
secuencias de bases del ARNr cercanas al sitio diana de una de las
sondas marcadas. El grado de hibridación se midió usando el ensayo
de protección de la hibridación (HPA), tal y como se ha descrito
anteriormente. Los resultados se expresan en unidades relativas de
luz (rlu).
Como se indica en la Tabla 16 (a continuación),
en ausencia de sondas "helper" las mezclas de sondas de ADN se
hibridaron escasamente con el ARNr. En cambio, cuando se
hibridaron con el ARNr, en ausencia de sondas "helper", mezclas
de sondas que contenían sondas de
2'-O-metil-oligonucleótidos
que presentaban una secuencia idéntica a la de las mezclas de
sondas de ADN, se observaron niveles de hibridación mucho mayores.
Además, cuando se emplearon sondas "helper" junto con ambos
tipos de mezclas de sondas, se produjo una hibridación mucho mayor
de las sondas con sus dianas respectivas en el caso de las mezclas
de sondas de oligonucleótidos modificados en 2'. Dado que la
hibridación de una sonda de ADN con un ARNr depende en gran medida
de la presencia de sondas "helper", mientras que la hibridación
de una sonda idéntica, pero compuesta de
2'-O-metil-oligonucleótidos,
no depende de dicha presencia de sondas "helper", las sondas
de
2'-O-metil-oligonucleótidos
pueden hibridarse eficazmente con moléculas de ARN altamente
estructuradas, tales como el ARN ribosómico, en condiciones en las
que las sondas de ADN no son capaces de hibridarse eficazmente con
dichas moléculas de ARN altamente estructuradas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los datos expuestos en la Tabla 16 constituyen
una demostración adicional de que, cuando se emplean
oligonucleótidos modificados en 2', no es necesario utilizar sondas
"helper" para facilitar la unión de la sonda. No obstante,
utilizando sondas "helper" junto con las sondas de
oligonucleótidos modificados en 2' se puede conseguir una
sensibilidad incluso más alta que la descrita en los ensayos
anteriores.
Los resultados de los experimentos descritos en
el Ejemplo 12 se generaron empleando tres sondas marcadas
diferentes, en presencia o en ausencia de los seis oligonucleótidos
"helper" indicados en el Ejemplo 12. En este Ejemplo 13, se
dejó que las Sondas F y H del Ejemplo 2, que constaban enteramente
de desoxirribonucleótidos o de
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridasen con un ARNr diana, en presencia o en ausencia de las
sondas "helper" indicadas. Se utilizaron las sondas
"helper" a, b, c y d del Ejemplo 12. En la Tabla 17 se
muestran las características de hibridación del ADN y de los
2'-O-metil-oligonucleótidos
de la Sonda F. En la Tabla 18 se muestran las características de
hibridación del ADN y de los
2'-O-metil-oligonucleótidos
de la Sonda H. Se evaluó cada sonda marcada en presencia o en
ausencia de las diversas sondas "helper" y combinaciones de
sondas "helper" indicadas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las Tablas 17 y 18 muestran que las sondas de
ADN marcadas precisaron de oligonucleótidos "helper" para
poder hibridarse eficazmente con sus dianas en las condiciones del
ensayo. Además, la Tabla 18 muestra que los oligonucleótidos
modificados en 2' se hibridaron con sus dianas, en ausencia de
sondas "helper", en mayor medida que los oligonucleótidos de
ADN con la misma diana y en presencia de los oligonucleótidos
"helper" añadidos. Por último, los
2'-O-metil-oligonucleótidos
se caracterizaron por propiedades de hibridación aún mayores en
presencia de los oligonucleótidos "helper".
Los datos presentados en el Ejemplo 13 indican
que los
2'-O-metil-oligonucleótidos
se hibridan en un grado detectable con las dianas de ARN, incluso
con estructuras muy plegadas como el ARNr, en ausencia de sondas
"helper". No obstante, las sondas "helper" pueden
acelerar la hibridación de los
2'-O-metil-oligonucleótidos
con el ARN altamente estructurado. Con el fin de evaluar más de
cerca el efecto de las sondas "helper", se hibridaron sondas
de desoxioligonucleótidos y de
2'-O-metil-oligonucleótidos
con ARNr, a diferentes temperaturas y en presencia o en ausencia de
sondas "helper". La Tabla 19 representa estudios llevados a
cabo empleando sondas marcadas con éster de acridinio que
presentaban la secuencia de nucleótidos de la Sonda F del Ejemplo 2
anterior, y empleando asimismo las sondas "helper" c y d del
Ejemplo 12 anterior. La Tabla 20 representa estudios llevados a
cabo empleando sondas marcadas con éster de acridinio que
presentaban una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 (véase el
Ejemplo 1 anterior), y empleando asimismo sondas "helper" g y
h, de 41 y 32 bases respectivamente.
Estos experimentos demuestran que, a 60ºC y a
75ºC, las sondas "helper" aumentaron las velocidades de
hibridación de las sondas de
2'-O-metil-oligonucleótidos
con sus dianas, en un factor de 3,1 a 4,3.
Como demostración adicional del efecto de los
oligonucleótidos modificados sobre las características de eficacia
de las moléculas sonda diagnósticas, se llevó a cabo una serie de
otros experimentos. Dichos experimentos se basaron en el método de
detección preferido del Solicitante, en el que se emplea el ensayo
de detección HPA. Conforme al formato HPA, se fija un éster de
acridinio quimioluminiscente a una sonda, y se hibrida la sonda con
un analito. Después de la hibridación, la quimioluminiscencia
asociada a la sonda que no ha quedado hibridada es destruida
selectivamente mediante una breve hidrólisis en tampón borato.
Puesto que en este proceso no se destruyen las moléculas
sonda:analito, la quimioluminiscencia restante de la sonda
hibridada es una medición directa del analito que está presente en
la muestra. En esta aplicación, son preferibles las sondas marcadas
con éster de acridinio que se hidrolizan más deprisa cuando no están
hibridadas que cuando están formando un complejo de híbrido
sonda:analito. La hidrólisis de la sonda y del híbrido es de
"pseudo primer orden" y se puede caracterizar con el valor
t_{1/2}, que es el tiempo, medido en minutos, que se requiere para
hidrolizar el 50% del éster de acridinio fijado a la sonda o al
híbrido. Así, son altamente deseables las sondas que muestran una
proporción de hidrólisis diferencial (DH, por sus siglas en inglés)
grande (t_{1/2} (híbrido) / t_{1/2} (sonda)).
Con el fin de evaluar el efecto de los
oligonucleótidos modificados sobre las propiedades de hidrólisis de
las sondas marcadas con éster de acridinio, se construyeron cuatro
conjuntos de sondas; cada conjunto de sondas presentaba una
secuencia de bases nucleotídicas bien diferenciada, y las sondas
miembro de cada conjunto presentaban secuencias de bases
nucleotídicas idénticas entre sí. Cada conjunto de sondas contenía
una sonda compuesta enteramente de nucleótidos no modificados y
otra sonda compuesta enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos.
Las sondas que se emplearon fueron las Sondas A y B del Ejemplo 1
(véase anteriormente en este documento) y las Sondas F, G y H del
Ejemplo 2. Las proporciones de DH de cada sonda respecto de una
diana de ARN exactamente complementaria se determinaron de la
manera descrita anteriormente, por ejemplo, en el Ejemplo 1. Como
se presenta en la Tabla 21 (a continuación), las sondas no
hibridadas que contenían desoxinucleótidos o
2'-O-metil-nucleótidos
se hidrolizaron a velocidades muy similares.
En cambio, en tres de las secuencias, el
marcador asociado al híbrido sonda modificada:diana fue
aproximadamente dos veces más resistente a la hidrólisis que el
asociado al híbrido sonda no modificada:diana (idéntico salvo por
el hecho de que la sonda no estaba modificada). En uno de los
casos, en el que la sonda contenía una secuencia ATAT en torno al
brazo de enlace del éster de acridinio, la proporción de DH del
marcador asociado al híbrido sonda modificada:diana disminuyó en un
factor de 1,4.
Con el fin de determinar si los nucleótidos
modificados deben estar cerca del sitio de fijación del marcador
para poder mejorar el comportamiento de DH del éster de acridinio,
se hibridaron con una diana de ARN complementaria sondas marcadas
con éster de acridinio, de secuencia SEQ ID NO: 1 y que contenían
racimos de
2'-O-metil-nucleótidos
en diferentes posiciones en relación con el sitio de de enlace del
éster de acridinio. Los nucleótidos que contenían sustituciones
2'-O-metilo se indican a
continuación mediante un subrayado:
Sonda M: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda N: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda O: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda P: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' |
Como se ilustra en la Tabla 22 (a continuación),
las mediciones revelan que cuatro
2'-O-metil-nucleótidos
a un lado o al otro del sitio de enlace del éster de acridinio son
suficientes para mejorar el comportamiento de DH de una sonda
marcada con éster de acridinio tanto como una sonda compuesta
enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos.
En la Tabla, cuando aparece más de un punto de datos, significa que
se realizaron experimentos independientes, duplicados.
Como se ha mencionado anteriormente, gracias a
su mayor estabilidad térmica, los oligonucleótidos modificados
objeto de la presente invención son capaces de hibridarse a una
temperatura más alta que los oligonucleótidos no modificados.
Cabría esperar que, a esas temperaturas más altas, la velocidad de
hibridación, así como la velocidad de otras reacciones, aumentase.
Entre tales otras reacciones tenemos la velocidad de la hidrólisis
de los marcadores a base de éster de acridinio. Puesto que en el
método de detección preferido por el Solicitante se emplea el
ensayo de protección de la hibridación (HPA), descrito
anteriormente en este documento, se llevó a cabo el siguiente
experimento con el fin de determinar si, a tales temperaturas más
altas, las ventajas del ensayo diagnóstico, conferidas por un
aumento de la velocidad de hibridación, se verían contrarrestadas
por una disminución de las proporciones de DH de los marcadores a
base de éster de acridinio asociados y no asociados a los
híbridos.
Se dejó que una sonda marcada con éster de
acridinio, compuesta enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos,
se hibridase, a 60ºC, 70ºC y 80ºC, con una diana de ARN
complementaria. Las condiciones de hibridación fueron, por lo
demás, las mismas que las que se han descrito anteriormente.
Como se presenta de forma resumida en la Tabla
23 (a continuación), a 70ºC y a 80ºC las sondas marcadas con éster
de acridinio compuestas de
2'-O-metil-nucleótidos,
mostraron proporciones de DH comparables a las que mostraron, a
60ºC, las sondas marcadas con éster de acridinio compuestas de
desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, en ensayos diagnósticos en
los que se empleen los métodos y las composiciones objeto de la
presente invención, se puede utilizar la temperatura más alta (el
aumento de temperatura) resultante sin que se produzca una
disminución detectable en la sensibilidad del ensayo a causa de la
degradación del marcador.
Los experimentos que se han expuesto se llevaron
a cabo empleando éster de acridinio estándar como el marcador
quimioluminiscente detectable. Con el fin de evaluar si el
comportamiento de hidrólisis diferencial de marcadores que no sean
el éster de acridinio estándar se ve mejorado por nucleótidos
modificados que aumentan la T_{m}, se marcaron exactamente de la
misma manera y en la misma posición (véase el Ejemplo 1 anterior)
sondas de secuencia SEQ ID NO: 1, que contenían desoxinucleótidos o
2'-O-metil-nucleótidos,
y se evaluó su comportamiento de DH. Los marcadores que se
emplearon fueron: éster de acridinio estándar,
o-diBr-éster de acridinio,
2-Me-éster de acridinio, naftil-éster de acridinio,
o-F-éster de acridinio,
2,7-diisopropil-éster de acridinio, o una mezcla de
1- y 3-Me-éster de acridinio.
(Nota: Me = Metil)
Véanse, en la Figura 1, ejemplos de
ésteres de acridinio. Como se presenta de forma resumida en la
Tabla 24 (a continuación), el uso de sondas de nucleótidos
modificados produjo un aumento de la proporción de DH en todos los
derivados del éster de acridinio que se sometieron a prueba, en un
factor de 1,1 a 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estudiar relación existente entre
la velocidad de hibridación y el número de
2'-O-metil-nucleótidos
contenidos en la secuencia de una sonda, se sintetizaron sondas
marcadas con éster de acridinio que presentaban la secuencia SEQ ID
NO: 1 (véase el Ejemplo 1 anterior). Estas sondas sintetizadas
contenían cantidades crecientes de residuos modificados con
2'-O-metilo (las bases que aparecen
subrayadas a continuación indican la presencia de residuos
modificados con 2'-O-metilo), a
ambos lados del sitio de enlace del éster de acridinio (EA):
Sonda Q: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda R: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda S: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda T: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' |
Sonda U: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' | |
Sonda V: | 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(EA)AACC CAACAT-3' |
Los resultados se presentan de forma resumida en
la Tabla 25 (a continuación).
De los resultados presentados en la Tabla 25, se
desprende que fueron suficientes tan solo ocho
2'-O-metil-nucleótidos
(Sonda T) - cuatro a cada lado del sitio de enlace del éster de
acridinio - para aumentar la velocidad de hibridación de una sonda
marcada con éster de acridinio hasta el mismo nivel (la misma
velocidad) que una sonda compuesta casi enteramente de
2'-O-metil-nucleótidos
(Sonda V). En cambio, la T_{m} de una sonda que contenía cuatro
2'-O-metil-nucleótidos
a cada lado del sitio de enlace del éster de acridinio es inferior
a la T_{m} de un híbrido sonda:diana que contenga
2'-O-metil-nucleótidos
adicionales. Por lo tanto, conforme a la presente invención es
posible optimizar, o "ajustar", la eficacia de una sonda
marcada con éster de acridinio, en cuanto a su velocidad de
hibridación, hidrólisis diferencial y propiedades de fusión. Por
ejemplo, una sonda marcada con éster de acridinio que contenga
cuatro
2'-O-metil-nucleótidos
a cada lado del sitio de enlace del éster de acridinio tendrá su
velocidad de hibridación y sus propiedades de hidrólisis diferencial
maximizadas de forma óptima, mientras que un híbrido que contenga
esta sonda mostrará un sólo aumento pequeño de su temperatura de
fusión.
A medida que se añadan
2'-O-metil-nucleótidos
esencialmente contiguos que reemplacen a los desoxirribonucleótidos
en la sonda marcada, la velocidad de hibridación y las propiedades
de hidrólisis diferencial del híbrido sonda:diana se mantendrán
esencialmente constantes, mientras que su T_{m} seguirá
aumentando. La capacidad para ir aumentando, incrementalmente, la
influencia de una sonda sobre la T_{m} del híbrido sonda:diana,
permite ajustar la especificidad de una sonda, de manera tal que no
se produzcan reacciones cruzadas entre dicha sonda y secuencias
estrechamente relacionadas, como se ha expuesto en la Tabla 25.
Con el fin de ilustrar la utilidad general de
las composiciones y métodos objeto de la presente invención en la
aplicación diagnóstica de la tecnología de hibridación de ácidos
nucleicos, se construyeron oligonucleótidos que presentaban una
modificación que no consistía en una modificación en 2' de la
fracción ribofuranosilo, pero que también generaban un aumento de
la afinidad de unión de una sonda con su diana. En este ejemplo, se
sintetizaron oligonucleótidos que contenían dos nucleótidos
modificados a nivel de la base nitrogenada. Concretamente,
N-diisobutilaminometilideno-5-(l-propinil)-2'-desoxicitidina
(un análogo de la citidina); y
5-(1-propinil)-2'-desoxiuridina
(un análogo de la timidina). Estos análogos de nucleótidos están
disponibles en el mercado y se pueden adquirir, por ejemplo, de
Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos).
Como primera consideración, se hibridaron con
ARNr, en presencia de sondas "helper", sondas que presentaban
22 bases y un éster de acridinio fijado en un sitio ubicado entre
una base timina y una base guanina en las sondas W e Y, y entre dos
bases timina en la sonda X, pero que contenían números variables
de nucleótidos modificados con propino (metilacetileno). Esta
hibridación se llevó a cabo con el fin de evaluar el efecto de la
modificación que se acaba de describir sobre la T_{m} de los
híbridos marcados con éster de acridinio. La Sonda W no contenía
modificaciones propino. La Sonda X contenía dos modificaciones
propino, cada una de ellas directamente adyacente a cada lado del
sitio de unión del marcador. La Sonda Y contenía once
modificaciones propino, incluidas cuatro modificaciones contiguas
directamente adyacentes en el lado 5' respecto del sitio de unión
del marcador y siete modificaciones ubicadas en bases que distaban
3, 4, 6, 9-11 y 14 bases del sitio de unión del
marcador (en el lado 3' respecto de éste).
Se realizaron determinaciones de la hibridación
y de la T_{m}, de la manera descrita anteriormente en este
documento haciendo uso de la detección de los híbridos marcados con
éster de acridinio. Como se presenta de forma resumida en la Tabla
26 (a continuación), los datos indican que la T_{m} del
oligonucleótido, cuando se hibridó con una diana de ARN, aumentó
1ºC (como promedio) por cada reemplazo de una pirimidina con una
pirimidina sustituida con propino.
Con el fin de estudiar el efecto de los grupos
propino (metilacetileno) sobre la velocidad de hibridación de los
oligonucleótidos, se determinó, mediante análisis de la C_{o}t (de
la manera descrita en el Ejemplo 6), la velocidad de hibridación
de las sondas marcadas con propino (descritas en el Ejemplo 20
anterior) con el ARN. Como se presenta de forma resumida en la
Tabla 27 (a continuación), la sonda que contenía dos grupos propino
(Sonda W) se hibridó a la misma velocidad que la sonda que no
contenía ningún grupo propino (Sonda X), mientras que la sonda que
contenía once grupos propino (Sonda Y) se hibridó 1,9 veces más
deprisa.
Estos datos refrendan la generalidad de la
presente invención, ya que demuestran que, cuando se modifican los
oligonucleótidos de modo tal que la T_{m} aumenta, también aumenta
la velocidad a la que el oligonucleótido modificado se híbrida con
su diana, en comparación con un oligonucleótido no modificado de
idéntica secuencia de bases. Además, este ejemplo demuestra que
tales modificaciones pueden realizarse en la fracción de bases
nitrogenadas, además de en la fracción de azúcar. Aquellos
cualificados en la materia se darán cuenta de que dichas
modificaciones pueden realizarse asimismo en las uniones entre
nucleótidos.
Aunque en la discusión anterior se han descrito
las formas de realización preferidas de la presente invención, el
Solicitante no se limita a éstas. Aquellos cualificados en la
materia a quienes resulta aplicable esta invención concebirán
formas de realización adicionales a la luz de este descubrimiento.
Además, en las reivindicaciones que conforman la conclusión de esta
invención y sus equivalentes se incluyen formas de realización
adicionales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Becker, Michael M.
\vskip0.800000\baselineskip
- Majlessi, Mehrdad
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para la detección y la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos empleando oligonucleótidos modificados que presentan una mayor T_{m} específica de diana
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Gen-Probe Incorporated
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9800 Campus Point Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92121
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE EN UN ORDENADOR/COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete de 3,5 pulgadas de 1,44 Megabytes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Tipo IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS, Versión 6.22
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ, Versión 1.5
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fisher, Carlos A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36510
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: GP95013
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (+1) 619-535-2807
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (+1) 619-546-7929
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCGTTGCG GGACTTAACC CAACAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC
\hfill
Claims (13)
1. El uso de un oligonucleótido modificado con
2'-O-metilo, con una secuencia de
nucleótidos conocida, como sonda para una secuencia diana plegada
que consta de ARNr, ARNt o ARN vírico, presente en una muestra que
contiene ácido nucleico no diana; dicho oligonucleótido modificado
tiene más de 4 nucleótidos contiguos modificados de manera tal que
incluyen una sustitución
2'-O-metilo, y la velocidad de
hibridación entre el oligonucleótido modificado y la diana es mayor
que la velocidad de hibridación que se da entre el oligonucleótido
no modificado y la diana.
2. El uso conforme a lo expuesto en la
reivindicación 1, en el que esencialmente todos los nucleótidos del
oligonucleótido son nucleótidos modificados.
3. El uso conforme a lo expuesto en las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que se usa una sonda "helper",
no marcada, junto con el oligonucleótido modificado.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3, en el que se modifica una fracción ribofuranosilo del
oligonucleótido.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en el que se fija el oligonucleótido a una molécula de
conjugado, y dicha molécula de conjugado actúa incrementando la
afinidad de unión de dicho oligonucleótido por la diana y la
velocidad de hibridación de dicho oligonucleótido con la diana, y
dicha molécula de conjugado se selecciona de un grupo que consta de
aminas catiónicas, tintes de intercalación, antibióticos,
proteínas, fragmentos peptídicos y complejos metal ión.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en el que el oligonucleótido tiene de 10 a 100 bases de
longitud.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en el que el oligonucleótido tiene de 10 a 15 bases de
longitud.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, en el que el oligonucleótido incluye, además, un
marcador.
9. El uso conforme de la reivindicación 8, en el
que el marcador es un agente quimioluminiscente o un agente
fluorescente.
10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 9, en el que se ha sometido la muestra a un procedimiento de
amplificación.
11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10, en el que se inmoviliza directa o indirectamente el
oligonucleótido fijándolo a un soporte sólido.
12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, en el que la muestra se obtiene de una fuente clínica, de
una fuente alimenticia, o de una fuente medioambiental.
13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12, en el que la sonda y todo complejo sonda:diana están libres
en una solución.
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