DE60115811T2

DE60115811T2 - Amplifizierung unter Verwendung von modifizierten Primern

Info

Publication number: DE60115811T2
Application number: DE60115811T
Authority: DE
Inventors: Walter J. Pinole Laird; John T. San Leandro Niemiec
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-10-25
Filing date: 2001-10-20
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-10-21
Also published as: CA2359838A1; ES2254306T3; EP1201768A3; JP3737734B2; US20030044817A1; ATE312942T1; EP1201768B1; JP2002291490A; EP1201768A2; CA2359838C; DE60115811D1; US6794142B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und Nukleinsäurechemie. Im Besonderen betrifft sie Verfahren und Reagenzien zur Verbesserung von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen. Die Erfindung hat daher Anwendungen in jeglichen Gebieten in denen Nukleinsäureamplifikation verwendet wird.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Erfindung der Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglichte die in vitro Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen. PCR wird in den U.S. Patenten Nr. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188; Saiki et al., 1985, Science 230: 1350–1354; Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 und Mullis und Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335–350 beschrieben. Die Entwicklung und Anwendung der PCR wurde in der Literatur umfangreich beschrieben. Ein Bereich von PCR-bezogenen Themen wird zum Beispiel in PCR Technology – principles and applications for DNA amplification, 1989, (Ed. H. A. Erlich) Stockton Press, New York, PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (Ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego und PCR Strategies, 1995, (Ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego diskutiert. Kommerzielle Anbieter, wie Applied Biosystems (Foster City, CA), vermarkten PCR Reagenzien und veröffentlichen PCR Protokolle.
Seit der Originalveröffentlichung der Nukleinsäureamplifikation wurden verschiedene Primer-basierten Nukleinsäureamplifikationsverfahren beschrieben, beinhaltend, aber nicht beschränkt auf das Strangersetzungsassay (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392–396; Walker et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691–1696 und U.S. Patent Nr. 5,455,166) und die Transkriptions-basierten Amplifikationssysteme, beinhaltend die in den U.S. Patenten Nr. 5,437,990; 5,409,818 und 5,399,491 beschriebenen Verfahren; das Transkriptionsamplifikationssystem (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177) und die selbsterhaltende Selbstreplikation (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878 und WO 92/08800). Eine Übersicht über Amplifikationssysteme wird in Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 bereitgestellt.
Die Spezifität von Primer-basierten Amplifikationsreaktionen hängt weitgehend von der Spezifität der Primerhybridisierung und -verlängerung ab. Unter den erhöhten Temperaturen, wie sie in einer typischen Amplifikation verwendet werden, hybridisieren die Primer nur mit der beabsichtigten Zielsequenz. Amplifikationsreaktionsmischungen werden jedoch typischerweise bei Raumtemperatur zusammengefügt, weit unterhalb der Temperatur, die zur Sicherstellung der Spezifität der Primerhybridisierung notwendig ist. Unter solch weniger stringenten Bedingungen können sich die Primer unspezifisch an andere, nur teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenzen oder an andere Primer binden und die Synthese von unerwünschten Verlängerungsprodukten initiieren, die neben der Zielsequenz amplifiziert werden können. Die Amplifikation von unspezifischen Primerverlängerungsprodukten kann mit der Amplifikation der gewünschten Zielsequenz konkurrieren und die Effizienz der Amplifikation der gewünschten Sequenz signifikant verringern.
Ein häufig beobachteter Typ eines unspezifischen Amplifikationsproduktes ist ein templatunabhängiges Artefakt von Amplifikationsreaktionen, das „Primerdimer" genannt wird. Das Primerdimer ist ein doppelsträngiges Fragment, dessen Länge typischerweise nahe der Summe der beiden Primerlängen ist und aufzutreten scheint, wenn ein Primer über dem anderen Primer verlängert wird. Das resultierende Verlängerungsprodukt bildet ein unerwünschtes Templat, das aufgrund seiner geringen Länge effizient amplifiziert wird.
Unspezifische Amplifikation kann durch Verringerung von Primerverlängerungsprodukten vor dem Start der Reaktion verringert werden. Bei einem Verfahren, das „Heißstart"-Protokoll genannt wird, werden ein oder mehrere kritische Reagenz(ein) von der Reaktionsmischung zurückbehalten bis die Temperatur ausreichend angehoben wurde, um die notwendige Hybridisierungsspezifität zu liefern. Manuelle Heißstart-Verfahren, bei denen die Reaktionsröhrchen nach dem anfänglichen Hochtemperaturinkubationsschritt geöffnet und die fehlenden Reagenzien zugegeben werden, sind arbeitsintensiv und erhöhen das Risiko einer Kontamination der Reaktionsmischung. Alternativ kann ein wärmeempfindliches Material, wie Wachs, dazu verwendet werden, Reaktionskomponenten zu trennen oder abzusondern, wie in U.S. Patent Nr. 5,411,876 und Chou et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20(7): 1717–1723 beschrieben. Bei diesen Verfahren wird das wärmeempfindliche Material durch eine Hochtemperaturpräreaktionsinkubation geschmolzen, was den Reagenzien dadurch erlaubt sich zu mischen.
Ein anderes Verfahren der Verringerung der Bildung von Primerverlängerungsprodukten vor dem Beginn der Reaktion verläßt sich auf die wärmereversible Deaktivierung der DNA-Polymerase. U.S. Patente Nr. 5,773,258 und 5,677,152 beschreiben DNA-Polymerasen, die durch die kovalente Anlagerung einer Modifikationsgruppe reversibel modifiziert sind. Inkubation der deaktivierten DNA-Polymerase bei hohen Temperaturen führt zur Spaltung der Modifizierer-Enzym-Bindung, wodurch das Enzym reaktiviert wird.
Nicht-kovalente reversible Hemmung einer DNA-Polymerase durch DNA-Polymerase-spezifische Antikörper ist im U.S. Patent Nr. 5,338,671 beschrieben.
Unspezifische Amplifikation kann auch durch enzymatischen Abbau von Verlängerungsprodukten, die vor dem Start der Reaktion gebildet werden, durch Verwendung der im U.S. Patent Nr. 5,418,149 beschriebenen Verfahren verringert werden. Der Abbau frisch hergestellter Verlängerungsprodukte wird durch Einführen von dUTP und UNG in die Reaktionsmischung und Inkubieren der Reaktionsmischung bei 45–60°C, bevor die Amplifikationsreaktion ausgeführt wird, erreicht. Primerverlängerung resultiert in der Bildung von Uracil-haltiger DNA, die durch UNG unter den Vor-Amplifikationsbedingungen abgebaut wird. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass der Abbau der Verlängerungprodukte mit der Bildung von Verlängerungsprodukt konkurriert und die Beseitigung des unspezifischen Primerverlängerungsprodukts weniger vollständig sein kann. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass Uracil-haltige DNA, die als Kontamination einer vorausgegangenen Reaktion in die Reaktionsmischung eingebracht wurde, ebenfalls abgebaut wird und somit dieses Verfahren auch das Problem der Kontamination einer PCR mit der amplifizierten Nukleinsäure aus vorangegangenen Reaktionen verringert.
Ein weiteres Verfahren die Bildung von Primerverlängerungsprodukten vor dem Start der Reaktion zu verringern, verläßt sich auf die Verwendung von Primern, die am oder nahe des 3'-Endes durch die Addition eines Restes an ein exozyklisches Amin modifiziert sind, wie im U.S. Patent Nr. 6,001,611 beschrieben.
Konventionelle Techniken der Molekularbiologie und Nukleinsäurechemie, die innerhalb des Standes der Technik sind, sind vollständig in der Literatur erläutert. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins. Eds., 1984); PCR Technology – principles and applications for DNA amplification, 1989, (Ed. H. A. Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (Ed. M. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego und PCR Strategies, 1995, (Ed. A. Innis et al.) Academic Press, San Diego.
Oligonukleotide, die 2'-O-Methylnukleotide, 2'-Fluornukleotide, 2'-Aminonukleotide und Arabinosenukleotide enthalten, sind im Stand der Technik bekannt. In der WO 98/02582 ist die Verwendung von 2'-O-Methylnukleotiden in Oligonukleotiden zur Erhöhung der Bindungsstabilität dieser Oligonukleotide bei der Hybridisierung an die Zielsequenz beschrieben. Cummins et al. (Nucleic Acids Research 23: 2019–2024), Aurup et al. (Nucleic Acids Research 22: 20–24) und Wilds et al. (Nucleic Acids Research 28: 3625–3635) beschreiben Oligonukleotide, die 2'-Fluornukleotide, 2'-Aminonukleotide und Arabinosenukleotide enthalten, um die Hybridisierungsstabilität und Nukleasenstabilität von Antisensehybridsierungssonden zu erhöhen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien für die in vitro Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, die eine Primer-basierte Amplifikationsreaktion verwendet, die eine einfache und wirtschaftliche Lösung des Problems der unspezifischen Amplifikation liefert, bereit. Die Verfahren umfassen die Verwendung von Oligonukleotidprimern, die bestimmte Modifikationen des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der oder nahe der 3'-Endstellung enthalten.
In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren die Verwendung eines modifizierten Primers, der im wesentlichen aus einem Oligonukleotid besteht, in dem wenigstens eine der drei 3'-endständigen Nukleotiden ein modifiziertes Nukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und 2'-Fluornukleotiden besteht, ist.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Verfahren die Verwendung eines modifizierten Primers, der im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid besteht, in dem wenigstens eine der drei 3'-endständigen Nukleotiden ein modifiziertes Nukleotid ist, das Arabinose enthält.
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Kits zur in vitro Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, die eine Primer-basierte Amplifikationsreaktion verwenden, wobei die Kits wenigstens einen modifizierten Primer, bevorzugt zwei, für jedes vorgesehene Ziel beinhaltet. Ein Kit beinhaltet ein oder mehrere Amplifikationsreagenzien, z.B. eine Nukleinsäurepolymerase, Nukleosidtriphosphate oder geeignete Puffer. Optional kann ein Kit Additionskomponenten beinhalten, wie ein Mittel zur Detektion des amplifizierten Produkts.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure, die die Ausführung einer primerbasierten Nukleinsäureamplifikationsreaktion beinhalten, wobei wenigstens ein modifizierter Primer verwendet wird. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereit, beinhaltend:

(a) Bereitstellung einer Amplifikationsreaktionsmischung, beinhaltend die Zielnukleinsäure und ein Primerpaar, worin ein oder beide Teile des Primerpaars modifizierte Primer sind; und
(b) Behandlung der Reaktionsmischung aus Schritt (a) unter Bedingungen, die für die Amplifikation der Nukleinsäure geeignet sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion (PCR), bei der wenigstens ein und bevorzugt alle Primer modifiziert sind.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Amplifikationsreaktionsmischungen, die wenigstens einen modifizierten Primer enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Amplifikationsreaktionsmischung ein Paar modifizierter Oligonukleotidprimer zur Durchführung einer PCR.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im Folgenden einige Begriffe definiert.
Die Begriffe „Nukleinsäure" und „Oligonukleotid" beziehen sich auf Polydesoxyribonukleotide (beinhaltend 2'-Desoxy-D-ribose), auf Polyribonukleotide (beinhaltend D-Ribose) und jeden anderen Typ eines Polynukleotids, das ein N-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist. Es gibt keine beabsichtigte umfängliche Unterscheidung zwischen den Begriffen „Nukleinsäure" und „Oligonukleotid" und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe beziehen sich lediglich auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher schließen diese Begriffe sowohl doppel- und einzelsträngige DNA, als auch doppel- und einzelsträngige RNA ein. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein Oligonukleotid auch Nicht-Purin- oder Nicht-Pyrimidinnukleotidanaloge beinhalten.
Oligonukleotide können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, beinhaltend direkte chemische Synthese durch ein Verfahren wie dem Phosphortriesterverfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99, dem Phosphordiestervenfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151, dem Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862 und des Festträgerverfahrens des U.S. Patents Nr. 4,458,066. Eine Übersicht über Syntheseverfahren von Konjugaten von Oligonukleotiden und modifizierten Nukleotiden ist in Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3): 165–187 bereitgestellt.
Der Begriff „Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, als Initiierungspunkt einer DNA-Synthese unter Bedingungen unter denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primerverlängerungproduktes induziert wird, zu wirken, d.h. jederzeit in der Gegenwart von vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten und einem Mittel zur Verlängerung (z.B. eine DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem passenden Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Ein Primer ist bevorzugt eine einzelsträngige DNA. Die passende Länge eines Primers hängt von der beabsichtigten Verwendung des Primers ab, ist jedoch typischerweise im Bereich 10 bis 50 Nukleotide, bevorzugt 15–35 Nukleotide. Kurze Primermoleküle benötigen gewöhnlich niedrigere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridisierungskomplexe mit dem Templat zu bilden. Ein Primer muß nicht die exakte Sequenz des Nukleinsäuretemplats wiedergeben, muß aber ausreichend komplementär sein, um mit dem Templat zu hybridisieren. Der Aufbau geeigneter Primer für die Amplifikation einer gegebenen Zielsequenz ist im Stand der Technik wohlbekannt und zum Beispiel in der hier zitierten Literatur beschrieben.
Primer können zusätzliche Eigenschaften einbringen die die Detektion oder Immobilisierung des Primers erlauben, aber nicht die grundlegende Eigenschaft des Primers, als Initiierungspunkt für DNA-Synthesen zu wirken, ändern. Primer können zum Beispiel eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz am 5'-Ende enthalten, die nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisiert, die jedoch die Klonierung des amplifizierten Produktes ermöglicht. Die Region des Primers, die ausreichend komplementär zum Templat ist, um zu hybridisieren, wird hier als die Hybridisierungsregion bezeichnet.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein „modifizierter Primer" auf einen Primer, der wenigstens ein Nukleotid beinhaltet, das einen anderen Zucker als die gewöhnliche 2'-Desoxy-D-ribose oder D-Ribose, die in natürlich vorkommender DNA und RNA gefunden wird, enthält. Wie hier ebenso verwendet, bezieht sich ein „modifiziertes Nukleotid" auf ein Nukleotid, das einen anderen Zucker als die gewöhnliche 2'-Desoxy-D-ribose oder D-Ribose, die in natürlich vorkommender DNA und RNA gefunden wird, beinhaltet und Nukleotide umfaßt, in denen der Zucker durch die Addition oder Substitution einer Seitenkette verändert ist oder in denen der Zucker ein Stereoisomer der gewöhnlichen 2'-Desoxy-D-ribose oder D-Ribose ist, die in natürlich vorkommender DNA und RNA gefunden wird, oder beides. Die Begriffe werden nicht verwendet, um anzuzeigen, dass ein modifizierter Primer oder ein modifiziertes Nukleotid ein Produkt eines Modifikationsprozesses ist, sondern eher um die Gegenwart von Änderungen im Oligonukleotidrückgrat gegenüber natürlich vorkommender DNA oder RNA anzuzeigen. Im Besonderen werden die Primer der vorliegenden Erfindung bevorzugt hergestellt, um ein modifiziertes Nukleotid zu beinhalten, obwohl die chemische Modifikation eines Primers, der zuerst nur gewöhnliche Nukleotide enthält, eine alternative Synthese sein kann.
Die Begriffe „Ziel", „Zielsequenz", „Zielregion" und „Zielnukleinsäure" beziehen sich auf eine Region oder Teilsequenz einer Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll.
Der Begriff „Hybridisierung" bezieht sich auf die Bildung einer Duplexstruktur aus zwei einsträngigen Nukleinsäuren aufgrund der Paarung der komplementären Basen. Die Hybridisierung kann zwischen vollständig komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen „im wesentlichen komplementären" Nukleinsäuresträngen auftreten, die kleinere Regionen von Fehlpaarung enthalten. Bedingungen unter denen nur vollständig komplementäre Nukleinsäurestränge hybridisieren, werden als „stringente Hybridisierungsbedingungen" oder als „sequenzspezifische Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Stabile Duplexe von im Wesentlichen komplementären Sequenzen können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erhalten werden; der Grad an tolerierter Fehlpaarung kann durch geeignete Anpassung der Hybridisierungsbedingungen beeinflußt werden. Fachleute der Nukleinsäuretechnologie können die Duplexstabilität empirisch bestimmen, in dem eine Anzahl von Variablen bedacht werden, einschließlich, zum Beispiel, die Länge und Basenpaarkonzentration der Oligonukleotide, ionische Stärke, Metallkation und Auftreten von fehlgepaarten Basenpaaren, wenn sie den Anleitungen folgen, die durch die Technik bereitgestellt werden (siehe, z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York und Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4): 227–259).
Wie hier verwendet, ist ein Primer für eine Zielsequenz „spezifisch", wenn er in einer Amplifikationsreaktion unter ausreichend stringenten Bedingungen verwendet wird. Der Primer kann nur verlängert werden, wenn er mit der Zielnukleinsäure hybridisiert ist. Typischerweise ist ein Primer für eine Zielsequenz spezifisch, wenn die Primer-Zielduplex-Stabilität, besonders in der Region der 3'-Endstellung des Primers, größer ist als die Stabilität eines Duplexes ist, der aus dem Primer und jeder beliebigen in der Probe gefundenen Sequenz gebildet wurde. Der Fachmann berücksichtigt, dass verschiedene Faktoren, wie Basenzusammensetzung des Primers und die Stellung der Fehlpaarung, die Spezifität des Primers beeinflussen und dass routinemäßige, experimentelle Bestätigung der Primerspezifität in den meisten Fällen notwendig ist. Hybridisierungsbedingungen unter denen ein zielspezifischer Primer nur verlängerbar ist, wenn er mit einer Zielsequenz hybridisiert, können routinemäßig empirisch bestimmt werden. Daher ermöglicht die Verwendung von Ziel-spezifischen Primern unter angemessen stringenten Amplifikationsbedingungen die spezifische Amplifikation dieser Zielsequenzen, die die Ziel-Primer-Bindungsstellen enthalten. Die Verwendung von sequenzspezifischen Amplifikationsbedingungen ermöglicht die spezifische Amplifikation jener Zielsequenzen, die die exakt komplementären Primer-Bindungsstellen enthalten.
Der Begriff „unspezifische Amplifikation" bezieht sich auf die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, die anders sind als die Zielsequenz, was daraus resultiert, dass Primer mit anderen Sequenzen als den Zielsequenzen hybridisieren und dann als Substrat für die Primerverlängerung dienen. Die Hybridisierung eines Primers zu einer Nicht-Zielsequenz wird als „unspezifische Hybridisierung" bezeichnet und kann bei den niedrigeren Temperaturen, der weniger strengen Präamplifikationsbedingungen auftreten. Der Fachmann versteht, dass selbst höchst instabile Duplexe, obwohl diese im Zustand des Gleichgewichts höchst benachteiligt sind, vorübergehend gebildet werden können.
Der Begriff „Primerdimer" wird hier allgemein verwendet, um templatunabhängige unspezifische Amplifikationsprodukte zu umfassen. Es wird angenommen, dass ein Primerdimer aus Primerverlängerungen resultiert, bei denen ein anderer Primer als Templat dient, obwohl die Entstehung von Primerdimer nicht gut verstanden ist. Das resultierende Amplifikationsprodukt scheint üblicherweise ungefähr einem Konkatamer zweier Primeren zu entsprechen, d.h. einem Dimeren, obwohl Konkatamere von mehr als zwei Primern auch auftreten.
Der Begriff „Reaktionsmischung" bezieht sich auf eine Lösung, die Reagenzien enthält, die zur Durchführung einer gegebenen Reaktion notwendig sind. Eine „Amplifikationsreaktionsmischung" bezieht sich auf eine Lösung, die Reagenzien enthält, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion notwendig sind und typischerweise Oligonukleotidprimer und eine Nukleinsäurepolymerase in einem geeigneten Puffer enthält. Eine „PCR-Reaktionsmischung" enthält typischerweise eine DNA-Polymerase (besonders typisch eine thermostabile DNA-Polymerase), dNTP's und ein zweiwertiges Metallkation in einem geeigneten Puffer. Eine Reaktionsmischung wird als vollständig bezeichnet, wenn sie alle notwendigen Reagenzien enthält, um die Reaktion zu ermöglichen, und unvollständig, wenn sie nur eine Teilmenge der notwendigen Reagenzien enthält. Vom Fachmann wird es verstanden, dass Reaktionskomponenten routinemäßig als separate Lösungen gelagert werden, die jede eine Teilmenge der gesamten Komponenten aus Gründen der Einfachheit, Lagerstabilität oder um eine anwendungsabhängige Anpassung der Komponentenkonzentration zu erlauben, enthalten, und dass die Komponenten vor der Reaktion zusammengeführt werden, um eine vollständige Reaktionsmischung zu erzeugen. Weiterhin wird es vom Fachmann verstanden, dass Reaktionskomponenten zur Vermarktung separat verpackt sind und dass nützliche kommerzielle Kits der Erfindung jede Teilmenge der Reaktionskomponenten enthalten können, was die modifizierten Primer der Erfindung einschließt.
Modifizierte Primer
Die modifizierten Amplifikationsprimer der vorliegenden Erfindung enthalten besondere Modifikationen am Zucker-Phosphatrückgrat an der oder nahe der 3'-Endstellung. In einer Ausführungsform bestehen die modifizierten Primer im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid, bei dem wenigstens eines der drei 3'-endständigen Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist, ausgewählt aus der aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und 2'-Fluornukleotiden bestehenden Gruppe. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die modifizierten Primer im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid in dem wenigstens eines drei 3'-endständigen Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist, ausgewählt aus der aus 2'-O-Methylribonukleotiden, 2'-Desoxy-2'-aminonukleotiden und 2'-Desoxy-2'-fluornukleotiden bestehenden Gruppe. Diese Modifikationen stellen die Addition eines Restes an das 2'-OH oder die Substitution des 2'-OH durch einen alternativen Rest dar.
In einer anderen Ausführungsform besteht der modifizierte Primer im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid, in dem wenigstens eines der drei 3'-endständigen Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist, das Arabinose enthält. Arabinose ist ein Stereoisomer der Ribose, das nur in der Konfiguration am C-2 abweicht. Es wird erwartet, dass Ausführungsformen in denen die 2'-Position der Arabinose durch die Addition eines Restes an das 2'-OH oder die Substitution des 2'-OH durch einen alternativen Rest modifiziert ist, für die Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der modifizierte Primer im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid, in dem wenigstens eines der drei 3'-endständigen Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist, das unmodifizierte Arabinose enthält.
Der Aufbau und die Verwendung der Amplifikationsprimer sind im Allgemeinen im Stand der Technik wohlbekannt. Die Primer der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch den Einschluß von festgelegten, modifizierten Nukleotiden in die Primersequenz aus. Andere Aspekte des Primers, wie die Gesamtlänge und Sequenz, werden gemäß den Standardpraktiken des Primerdesigns ausgewählt.
Typischerweise bestehen Primer aus einem einzelnen Strang Desoxyribonukleotiden (DNA) und enthalten die konventionellen Basen: Die beiden Purinbasen Adenin und Guanin und die beiden Pyrimidinbasen Cytosin und Thymin. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Primer, die ausschließlich aus den konventionellen Basen bestehen, beschränkt. Basenanaloga können verwendet werden, um zum Beispiel die Hybridisierungsstabilität des Primer-Ziel-Duplexes zu verändern. Jedes Basenanaloge, das in einem unmodifizierten Amplifikationsprimer verwendet werden kann, kann in den Primern der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele für Basenanaloga, auch als unkonventionelle Basen bezeichnet, beinhalten 3-Methyladenin, 7-Methylguanin, 3-Methylguanin, 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin.
Theorie der Wirkungsweise
Eine primerbasierte Amplifikation umfaßt wiederholte Primerverlängerungen bei denen die Primer zunächst mit der Zielnukleinsäure hybridisieren und dann enzymatisch verlängert werden. Die Spezifität der Amplifikation hängt von der Spezifität der Primerhybridisierung ab. Eine Hypothese ist, dass unspezifische Amplifikation auftritt, wenn ein instabiler, kurzlebiger Hybridisierungsduplex zwischen einem Primer und einem Nicht-Zielmolekül, möglicherweise einem anderen Primer, gebildet wird, in dem das 3'-Ende des Primers vorübergehend mit einer komplementären Base in einem anderen Molekül gepaart ist. Die anfängliche Primerverlängerung führt zur Bildung einer komplementären Sequenz, die den Duplex stabilisiert und weitere Verlängerung erlaubt.
Obwohl nicht zwingend durch die Theorie erforderlich, wird angenommen, dass die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung unspezifische Amplifikationen durch Erhöhung der, für die anfängliche Primerverlängerung benötigten, Zeit reduzieren. Die Rückgratmodifikationen verzögern wahrscheinlich die anfängliche Verlängerung indem es den Primer-Ziel-Duplex zu einem weniger bevorzugten Templat zur Verlängerung macht. Die Verzögerung der anfänglichen Verlängerung reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass ein instabiler, kurzlebiger Hybridisierungsduplex, wie zwischen Primern unter Präreaktionsbedingungen, eine ausreichend lange Zeit besteht, um Primerverlängerung zu erlauben.
Im Gegensatz dazu sind Primer-Ziel-Duplexe unter den bei einer Amplifikation verwendeten Primerhybridisierungsbedingunen ausreichend stabil, so dass die zusätzlich benötigte Zeit die Verlängerung nicht behindert. Somit hemmt die Modifikation, unter diesem Modell, die Primerverlängerung unter den Amplifikationsbedingungen nicht signifikant, verringert jedoch die Wahrscheinlichkeit von Verlängerungen von Primern, die an instabilen, kurzlebigen Duplexe, beteiligt sind, die mit Nicht-Zielsequenzen unter den Präamplifikationsbedingungen gebildet wurden.
Die 2'-O-Methylribonukleotide, 2'-Desoxy-2'-aminonukleotide und 2'-Desoxy-2'-fluornukleotide beinhalten im Vergleich zu einem typischen Oligodesoxynukleotidprimer raumfüllendere, am C-2 des Zuckers gebundene, Seitengruppen. Es ist wahrscheinlich, dass die Seitengruppe sterisch die Bindung des Enzyms an den Primer-Ziel-Duplex behindert, jedoch nicht genug, um eine Verlängerung auszuschließen. Dies weist darauf hin, dass zusätzliche Seitengruppen ähnlicher Raumerfüllung einen ähnlichen Effekt haben würden und ebenso in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können.
Durch Änderung der Orientierung der, am C-2 des Zuckers gebundenen, H- und OH-Seitengruppen verändern die arabinosehaltigen Nukleotide die Wechselwirkung mit dem Enzym. Es ist wahrscheinlich, dass andere Stereoisomere die Verlängerung hemmen, jedoch nicht unterdrücken können und es wird erwartet, dass diese Verbindungen in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Herstellung von modifizierten Primern
Die Herstellung der modifizierten Primer wird unter Verwendung von chemischen Standardmitteln, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, zum Beispiel dem Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862 und des Festträgerverfahrens des U.S. Patents Nr. 4,458,066, durchgeführt.
Bevorzugt wird die Synthesereaktion in einem kommerziell erhältlichen automatischen DNA Synthesizer (z.B. ABI 374 DNA Synthesizer von Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Nukleotidphosphoramiditen (z.B. von Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Nukleotidphosphoramidite und zur Herstellung von Oligonukleotiden, die modifizierte Nukleotide, wie die hier verwendeten, enthalten, geeignete Träger, sind kommerziell zum Beispiel von Glen Research (Sterling, VA) erhältlich.
Die Standardoligonukleotidherstellung wird durch die schrittweise Zugabe von Nukleosidmonomeren zu einer wachsenden Kette durchgeführt. Jede Addition umfaßt die Kupplung einer reaktiven 3'-Phosphorgruppe eines Nukleosidmonomers an das 5'-Hydroxyl eines anderen Nukleosids, das an einen festen Träger gebunden ist. Nach der Zugabe des letzten Nukleosids wird das Oligonukleotid vom Träger abgespalten, Schutzgruppen werden von den Basen entfernt und das Oligonukleotid wird zur Verwendung gereinigt.
Bei der Verwendung von Standardherstellungsverfahren wird das 3'-endständige Nukleotid im fertigen Oligonukleotid aus dem ursprünglich an den festen Träger gebundenen Nukleosid erhalten. Daher wird die Herstellung eines an der 3'-Endstellung modifizierten Nukleotids mit einem festen Träger, der das modifizierte Nukleotid enthält, begonnen. Die Herstellung von Oligonukleotiden, die interne modifizierte Nukleotide enthalten, wird unter Verwendung der entsprechenden Nukleosidphosphoramiditmonomeren durchgeführt.
Die 2'-O-Methylribonukleoside sind als Phosphoramidite und an einen Reaktionsträger gebunden kommerziell erhältlich. Andere modifizierte Nukleotide sind möglicherweise nur als Phosphoramidite leicht verfügbar. Alternative Reaktionsträger, die die Herstellung von Oligonukleotiden mit einem an der 3'-Endstellung modifizierten Nukleotid unter Verwendung der Phosphoramidite der modifizierten Nukleosidmonomeren ermöglichen, sind verfügbar. Zum Beispiel erlauben Universalträger, wie sie von Glen Research (Sterling, VA) unter der Lizenz von Avecia Ltd. vermarktet werden, die Abspaltung des hergestellten Oligonukleotids vom festen Träger zwischen den ersten und den zweiten 3'-Monomeren. Ein modifiziertes Nukleosid, das dazu bestimmt ist, das 3'-endständige Nukleosid zu werden, wird bei der ersten Monomerzugabe zugegeben und wird dann zum zweiten Monomer in der wachsenden Kette. Nach der letzten Zugabe wird das 3'-endständige Nukleosid, das ursprünglich am Träger angebracht war, im abschließenden Spaltungsschritt eliminiert und läßt das gewünschte endständig modifizierte Nukleotid zurück.
Amplifikationen unter Verwendung von modifizierten Primern
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die Durchführung einer primerbasierten Amplifikation, wobei wenigstens einer der Primer ein modifizierter Primer der vorliegenden Erfindung ist. Im Allgemeinen können die modifizierten Primer anstelle von unmodifizierten Primern, die die gleichen Nukleotidsequenz beinhalten, allein durch normale Veränderungen der Bedingungen der Amplifikationsreaktion gemäß der hier gegebenen Anleitung, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, was in den U.S. Patenten Nr. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188; Saiki et al., 1985, Science 230: 1350–1354; Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 und Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335–350 beschrieben ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf ein bestimmtes Amplifikationssystem beschränkt. Es wird erwartet, dass die Verwendung der modifizierten Primer in anderen primerbasierten Amplifikationsverfahren, in denen Primerdimer oder unspezifische Amplifikationsprodukte gebildet werden können, nützlich ist. Beispiele von primerbasierten Amplifikationsverfahren beinhalten das Strangersetzungsassay (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392–396; Walker et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691–1696 und U.S. Patent Nr. 5,455,166) und die Transkriptions-basierten Amplifikationsverfahren, einschließlich der Verfahren, die in den in U.S. Patenten Nr. 5,437,990; 5,409,818 und 5,399,491 beschrieben sind, dem Transkriptionsamplifikationssystem (TAS) (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177) und der selbsterhaltenden Selbstreplikation (3SR) (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878 und WO 92/08800). Eine Übersicht über Amplifikationssysteme wird in Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 zur Verfügung gestellt.
Enzyme zur Verwendung in den oben beschriebenen Nukleinsäureamplifikationsverfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Zum Beispiel, DNA-Polymerasen und deren Mutanten, die für verschiedenartige Anwendungen der PCR verwendbar sind, werden beschrieben in: U.S. Patent Nr. 4,889,818; U.S. Patent Nr. 5,079,352; U.S. Patent Nr. 5,352,600; U.S. Patent Nr. 5,374, 553; U.S. Patent Nr. 5,405, 774; U.S. Patent Nr. 5,420,029; U.S. Patent Nr. 5,455,170; U.S. Patent Nr. 5,466,591; U.S. Patent Nr. 5,491,086; U.S. Patent Nr. 5,618,711; U.S. Patent Nr. 5,624,833; U.S. Patent Nr. 5,674,738; U.S. Patent Nr. 5,677,152; U.S. Patent Nr. 5,773,258; U.S. Patent Nr. 5,789,224; U.S. Patent Nr. 5,795,762; U.S. Patent Nr. 5,939,292; U.S. Patent Nr. 5,968,799; Europäische Patentveröffentlichung Nr. 892058; Europäische Patentveröffentlichung Nr. 823479; Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0902035 und parallel anhängige U.S.-Anmeldung Nr. 09/146,631. Weitere Enzyme zur Verwendung in anderen Nukleinsäureamplifikationsverfahren sind im Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt und zum Beispiel in den oben zitierten Literaturstellen, die die Amplifikationsverfahren beschreiben, beschrieben.
Der Fachmann wird verstehen, dass das Ausmaß des Effekts des modifizierten Primers von der jeweiligen Amplifikationsreaktion und den ausgewählten Reaktionsbedingungen abhängen wird. Das Ausmaß des Effekts kann empirisch bestimmt werden, folgt man der Lehre in den Beispielen.
DNA-Polymerasen benötigen zur katalytischen Aktivität ein zweiwertiges Kation. Bei Verlängerungsreaktionen, die eine thermoaktive oder thermostabile DNA-Polymerase und ein DNA-Templat verwenden, ist das bevorzugte zweiwertige Kation Mg²⁺, obwohl andere Kationen wie Mn²⁺ oder Co²⁺ DNA-Polymerasen aktivieren können. Die Verwendung von Mn²⁺ zur Steigerung der Effizienz von Verlängerungsreaktionen unter Verwendung eines RNA-Templats, z.B. reverse Transkription, ist beschrieben im U.S. Patent Nr. 5,310,652; U.S. Patent Nr. 5,322,770; U.S. Patent Nr. 5,407,800; U.S. Patent Nr. 5,561,058; U.S. Patent Nr. 5,641,864 und U.S. Patent Nr. 5,693,517. Die Verwendung von Mn²⁺ verringert auch die Fidelität von Amplifikationen, sowohl bei der Verwendung eines RNA- als auch eines DNA-Templats. Im Allgemeinen verringert die Verwendung von Mn²⁺ die Verzögerung der Templatamplifikation, die sich aus der Verwendung von modifizierten Primern ergibt, verglichen mit einer unter Verwendung von Mg²⁺ ausgeführten Amplifikation.
Besondere mutante DNA-Polymerasen können in der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Die parallel anhängige U.S.-Anmeldung Nr. 60/198,336 beschreibt die Verwendung von besonderen mutanten DNA-Polymerasen, die in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 902,035 und der parallel anhängigen U.S.-Anmeldung Nr. 09/146,631 beschrieben sind, um effizientere reverse Transkriptionen bei hohen Temperaturen und RNA-Amplifikationsreaktionen, besonders in Mg²⁺-aktivierten Reaktionen, zu erhalten. Wie in den Beispielen beschrieben, neigt diese besondere Mutation dazu, den verzögernden Effekt der modifizierten Primer auf die Zielamplifikation zu erniedrigen, wenn sie im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Von Thermatoga maritima abgeleitete DNA-Polymerasen, in den oben zitierten Patenten beschrieben, können ähnliche Vorteile bieten, wenn sie in den vorliegenden Verfahren verwendet werden.
Die Auswahl geeigneter Primermodifikationen, Enzymen, Kation und anderen Reaktionsreagenzien und -bedingungen wird von der Anwendung abhängen. In manchen Anwendungen ist die Minimierung des Primerdimers wichtiger als die Effizienz der Zielamplifikation. In anderen Anwendungen kann es wünschenswert sein, die Effizienz der Zielamplifikation soweit wie möglich aufrecht zu erhalten während Primerdimer reduziert werden soll. Der Fachmann wird verstehen, dass geeignete Reaktionsbedingungen im Allgemeinen, und für das Enzym und das Kation im Besonderen, für jede besondere Anwendung unter Verwendung von experimentellen Standardverfahren empirisch ausgewählt werden können, folgt man der hier und in den Beispielen gegebenen Anleitung.
Die vorliegende Erfindung ist mit anderen Verfahren zur Reduktion von unspezifischer Amplifikation kompatibel, wie jene, die in der oben zitierten Literatur beschrieben wurden. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung in einer Amplifikation unter Verwendung eines reversibel deaktivierten Enzyms, wie in den U.S. Patenten Nr. 5,677,152 und 5,773,258 beschrieben, verwendet werden. Die Verwendung eines reversibel deaktivierten Enzyms, das unter Hochtemperaturbedingungen reaktiviert wird, reduziert die unspezifische Amplifikation weiter, indem die Primerverlängerung eines jeden modifizierten Primers vor dem Start der Reaktion gehemmt wird. Eine reversibel deaktivierte thermostabile DNA-Polymerase, entwickelt und hergestellt von Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) und von Applied Biosystems (Foster City, CA) vermarktet, ist in Birch et al., 1996, Nature 381(6581): 445–446 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung kann auch in Verbindung mit den modifizierten Primern, die in U.S. Patent Nr. 6,001,611 beschrieben sind, verwendet werden. Wie dort beschrieben, können die Primer durch kovalente Bindung einer Modifikationsgruppe an das exozyklische Amin eines Nukleotids an der oder nahe der 3'-Endstellung modifiziert werden. Die Anlagerung einer Gruppe an das exozyklische Amin behindert nicht die Verwendung von, an der oder nahe der 3'-Endstellung modifizierten, Nukleotiden, wie hier näher beschrieben. Geeignete Kombinationen von Reaktionsbedingungen und Primermodifikationen für die Verwendung mit einem bestimmten Ziel können durch normales Experimentieren, wie unten in den Beispielen beschrieben, ausgewählt werden.
Für Amplifikationsreaktionen geeignete Probenvorbereitungsverfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt und vollständig in der hier zitierten Literatur beschrieben. Das jeweilig verwendete Verfahren ist kein kritischer Teil der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann kann die Reaktionsbedingungen zur Verwendung mit den bekannten Probenvorbereitungsverfahren optimieren.
Verfahren zur Analyse von amplifizierten Nukleinsäuren sind im Stand der Technik wohlbekannt und vollständig in der hier zitierten Literatur beschrieben. Das jeweilig verwendete Verfahren ist kein kritischer Teil der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann kann ein geeignetes Analysenverfahren abhängig von der Anwendung auswählen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Analyse einer Amplifikationsreaktion ist, die Zunahme der Gesamtmenge von doppelsträngiger DNA in der Reaktionsmischung zu beobachten, wie in Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026–1030; Higuchi and Watson, 1999, in PCR Applications (Ed. Innis et al.) Chapter 16, Academic Press, San Diego; U.S. Patent Nr. 5,994,056 und Europäische Patentveröffentlichungen Nr. 487218 und 512334 beschrieben. Bei diesem Verfahren, hier als „kinetische PCR" bezeichnet, basiert auf der Detektion von doppelsträngiger DNA auf die erhöhte Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA-bindende Marker aufweisen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Die Amplifikation wird in der Gegenwart des Markers ausgeführt. Die Zunahme der doppelsträngigen DNA, die aus der Herstellung von Zielsequenzen stammt, führt zu einer Zunahme der Menge des, an doppelsträngige DNA gebundenen, Markers und einer damit einhergehenden Erhöhung der Fluoreszenz, die während der Amplifikation beobachtet wird. Somit erlauben diese Verfahren den Fortschritt einer Amplifikationsreaktion zu beobachten.
In einer kinetischen PCR hängt die gemessene Fluoreszenz von der Gesamtmenge vorhandener doppelsträngiger DNA ab, egal ob diese aus unspezifischer Amplifikation oder aus Amplifikation der Zielsequenz resultiert. Die Beobachtung der Fluoreszenz erlaubt die Messung der Zunahme der Gesamtmenge doppelsträngiger DNA, jedoch wird die aus der Amplifikation der Zielsequenz stammende Zunahme nicht unabhängig von der Zunahme, die von unspezifischem Amplifikationsprodukt verursacht wird, gemessen. Die modifizierten Primer der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bei der kinetischen PCR nützlich, da sie nicht nur die Menge an gebildetem Primerdimer reduzieren, sondern auch die Bildung von nachweisbaren Mengen an Primerdimer verzögern. Ein verzögerung der Primerdimerbildung bis nach dem Auftreten einer signifikanten Zunahme an Zielsequenz erlaubt die unabhängige Beobachtung der Amplifikation von Zielsequenzen und minimiert die Störung durch Primerdimer.
Kits
Die vorliegende Erfindung betrifft Kits, typischerweise Mehrfachbehältereinheiten einschließlich nützlicher Komponenten zur Ausübung des jeweiligen Verfahrens. Ein nützliches Kit enthält Primer, von denen wenigstens einer, wie hier beschrieben wurde, zur Nukleinsäureamplifikation modifiziert ist. Andere optionale Komponenten des Kits beinhalten zum Beispiel ein Mittel zur Katalyse der Synthese der Primerverlängerungsprodukte, die Substratnukleosidtriphosphate, geeignete Reaktionspuffer und Anweisungen zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens.
Die unten dargelegten Beispiele der vorliegenden Erfindung werden ausschließlich zu veranschaulichenden Zwecken bereitgestellt und nicht, um den Umfang der Erfindung einzuschränken. Zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung innerhalb des Umfang der Ansprüche, die den Beispielen folgen, werden dem gewöhnlichen Fachmann durch Lesen des vorangegangenen Textes und der folgende Beispiele offensichtlich sein.
Beispiel 1
Zum Testen der modifizierten Primer verwendete Protokolle
Die Effekte der verschiedenen modifizierten Primer auf die Bildung von Primerdimer wurden durch vergleichende Amplifikation unter Verwendung von modifizierten oder unmodifizierten Primern überprüft. Die Vergleiche wurden unter Verwendung eines Protokolls durchgeführt, das im Wesentlichen unten beschrieben ist. Wenn das Protokoll abgewandelt wurde, sind die Veränderungen in der Beschreibung des Experiments dargelegt.
Zielnukleinsäure
Plasmide, die ein Segment von HIV-1 Subtyp O DNA aus dem Gag-Gen enthalten, wurden als Ziel verwendet.
Primer
Die Amplifikationen wurden unter Verwendung sowohl modifizierter, als auch unmodifizierter Primer durchgeführt. Die Nukleotidsequenz der Primer ist unten in der Orientierung von der 5'- zur 3'-Richtung, dargestellt. Diese Primer amplifizieren einen Teil des Gag-Gens aus einer HIV-1-Sequenz.
Die drei Vorwärtsprimer sind Varianten des gleichen Primers, jeder vollständig komplementär zur Zielsequenz, unterscheiden sich jedoch im endständigen Nukleotid (A, T oder G). Dies erlaubt Vergleiche der Effekte der Modifikation des endständigen Nukleotids bei gleichzeitiger Minimierung der Effekte von Unterschieden der Primersequenz.
Amplifikationsprimersequenzen
Vorwärts

SK145 – T (SEQ ID NO: 1) AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA
SK145 (SEQ ID NO: 2) AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
SK145 + G (SEQ ID NO: 3) AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATG

Rückwärts

GAG152 (SEQ ID NO: 4) GGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC

Die modifizierten Primer bestehen aus den gleichen Nukleotidsequenzen, jedoch ist eines der mehreren 3'-endständigen Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid. Die folgenden Abkürzungen werden zur Identifizierung der Nukleotide verwendet.
Da jeder der obigen Primer im 3'-endständigen Nukleotid unterschiedlich ist, werden die Primer durch die endständigen Nukleotide in den unten stehenden Beispielen identifiziert. Bei Primern, die zusätzliche vorwärts modifizierte Nukleotide enthalten, werden bei Bedarf die endständigen zwei oder drei Nukleotide angegeben. Daher bezieht sich zum Beispiel ein als 2'omeG identifizierter Vorwärtsprimer auf einen Primer, der die Sequenz SK145 + G (SEQ ID NO: 3) besitzt, wobei das 3'-endständige Nukleotid ein 2'-O-Methylguanosin ist. Analog bezieht sich ein als 2'omeA-dA identifizierter Vorwärtsprimer auf einen Primer, der die Sequenz SK145 – T (SEQ ID NO: 1) besitzt, wobei das 3'-vorletzte Nukleotid ein 2'-O-Methyladenosin und das 3'-endständige Nukleotid ein unmodifiziertes Adenosin ist.
Die Primer wurden auf einem ABI 394 DNA-Synthesizer (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) hergestellt. Die modifizierten Nukleosidphosphoramidite wurden zum Beispiel von Glen Research (Sterling, VA) bezogen. Es wurden im Wesentlichen konventionelle Synthesebedingungen verwendet, wie von den Herstellern empfohlen.
Die rohen Primer wurden durch Standard-DMT-On/Off-HPLC unter der Verwendung einer Rainin Pure-DNA-Kolonne auf einem Rainin HPLC-System (Rainin Instrument Co, Woburn, MA) gereinigt. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines ABI Kapillarelektrophorese-Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA) oder durch denaturierende Anionenaustausch-HPLC-Chromatographie auf einer Dionex Nucleopak-Kolonne (Dionex Corp, Sunnyvale, CA) analysiert.
DNA-Polymerasen
Amplifikationen wurden unter Verwendung der thermostabilen DNA-Polymerase aus Thermus Spezies ZO5, beschrieben im U.S. Patent Nr. 5,455,170 und U.S. Patent Nr. 5,674,738, durchgeführt.
Amplifikationen wurden ebenso unter Verwendung zweier mutanter Formen einer DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (Tth) durchgeführt. Tth ist im U.S. Patent Nr. 5,618,711 beschrieben.
Eine der mutanten Tth DNA-Polymerasen, hier als CE31 bezeichnet, enthält die Punktmutationen Q682K und E683K, wobei die Zahl die Aminosäureposition der Mutation angibt, der vorgestellte Buchstabe ist der Standard-Einbuchstaben-Code der Aminosäure im natürlichen Enzym und der nachgestellte Buchstabe ist der Standard-Einbuchstaben-Code der Aminosäure im mutierten Enzym. Die E683K-Mutation erhöht die Fähigkeit der DNA-Polymerase Nukleotide zu einzubringen, beinhaltend Desoxynukleotide (dNTP's) und Nukleotidanaloge wie Didesoxynukleotide (ddNTP's), die mit Fluorescein und Farbstoffe der Cyaninfamilie markiert sind, wie in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 902,035 und der parallel anhängigen U.S.-Anmeldung Nr. 09/146,631 beschrieben. Die parallel anhängige U.S.-Anmeldung Nr. 60/198,336 beschreibt die Verwendung dieser mutanten DNA-Polymerasen, um effizientere Hochtemperatur-reverse-Transkriptions- und RNA-Amplifikationsreaktionen, besonders in Mg²⁺-aktivierten Reaktionen, bereit zu stellen.
Die andere mutante Tth DNA-Polymerase, hier als CE18 bezeichnet, enthält die Punktmutationen Q682K, E683K und G46E. Die G46E-Mutation eliminiert im wesentlichen die 5'- zu 3'-Exonukleaseaktivität, wie im U.S. Patent Nr. 5,466,591 beschrieben. CE18 unterscheidet sich von CE31 nur durch die Gegenwart der G46E-Mutation. Es wird erwartet, dass die Gegenwart oder Abwesenheit dieser Punktmutation in der 5'- zu 3'-Exonukleasedomäne des Enzyms keinen Einfluß auf die Fähigkeit des Enzyms hat, einen modifizierten Primer zu verlängern.
Amplifikationsbedingungen
Die Amplifikationen wurden in 100 μl Reaktionsvolumen durchgeführt, die die folgenden Reagenzien, soweit nicht anders vermerkt, enthielten:
Entweder kein Ziel (negative Kontrolle) oder 10⁴–10⁶ Kopien der HIV
Templat DNA
0,5 μM von jedem Primer (50 pmol)
5–50 Einheiten der DNA-Polymerase
50 mM Tricin (pH 8,3)
120 mM KOAc
300 μM jeweils von dATP, dCTP und dGTP
600 μM dUTP
3 mM MnOAc
8,5% Glyzerin
10 Einheiten von UNG
1,0 μg/ml Ethidiumbromid.

Die thermische Zyklisierung jeder Reaktion wurden in einem GeneAmp^® PCR System 9600 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA) ausgeführt, das zur Erleichterung der Beobachtung der Fluoreszenz des Ethidiumbromids während der Reaktion, wie beschrieben in Higuchi and Watson, 1999, in PCR Applications (Ed. Innis et al.) Chapter 16, Academic Press, San Diego, aufgenommen durch Bezugnahme, verändert war. Alternativ können die Reaktionen in einem ABI PRISM^® 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt werden, das die Auswahl der Wellenlängen zur Detektion zur Verwendung mit verschiedenen Farbstoffen erlaubt, oder in einem GeneAmp^® 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), das mit einer festgelegten Wellenlänge konstruiert ist oder mit SYBR^® Green I (Molecular Probes, Eugene, OR) verwendet wird. Die thermische Zyklisierung wurde unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils, soweit nicht anders vermerkt, durchgeführt:

Prä-Reaktionsinkubation	48°C für 12 Minuten
Hochtemperaturinkubation	96°C für 10 Sekunden
bis zu 60 Zyklen:	Denaturierung bei 91°C für 10 Sekunden, Assoziieren/Verlängern bei 65°C für 40 Sekunden.

Die Prä-Reaktionsinkubation erfolgt, um dem UNG die Erleichterung des Abbaus eines jeden dU-haltigen, während des Niedrigtemperatur-Reaktionsaufbaus gebildeten, Primerverlängerungsprodukts zu ermöglichen, wie in U.S. Patent Nr. 5,418,149 beschrieben. Die Zyklisierung der Temperatur wurde bei den meisten Reaktionen über 60 Zyklen durchgeführt, obwohl manche Reaktionen bei einem früheren Zyklus beendet wurden.
Detektion des amplifizierten Produkts
Die Anreicherung von Amplifikationsprodukt wurde bei jedem Zyklus während der Reaktion unter Verwendung von kinetischen PCR-Verfahren, die oben beschrieben wurden, gemessen. Die Fluoreszenz des Ethidiumbromids in der Reaktionsmischung, das stärker fluoresziert wenn es in doppelsträngige DNA eingelagert wird, wurde beobachtet, um die Zunahme der doppelsträngigen DNA während der Amplifikation zu messen. Die Reaktionen wurden durch Messung der Fluoreszenz der Reaktionsmischung in jedem Zyklus beobachtet.
Fluoreszenzmessungen wurden durch Division mit einer anfänglichen Fluoreszenzmessung, die während eines frühen Zyklusses in der Reaktion erhalten wurde, wenn die Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen relativ konstant, d.h. vor einer meßbaren Zunahme des Reaktionsproduktes, sind, normalisiert. Die Nummer des Zyklusses, die für die anfängliche Fluoreszenzmessung ausgewählt wurde, war für alle verglichenen Reaktionen die selbe, so dass alle Messungen die Zunahme relativ zum gleichen Reaktionszyklus repräsentieren.
Die Zunahme des Reaktionsprodukts während der Reaktion wurde als die Anzahl der durchgeführten Amplifikationszyklen gemessen, bis die normalisierte Fluoreszenz einen willkürlichen Fluoreszenzlevel („arbitary fluorescenc level", AFL) überschritt. Der AFL wurde nahe des Basisfluoreszenzlevels gewählt, jedoch oberhalb des Bereichs von zufälligen Schwankungen der gemessenen Fluoreszenz, so dass die Reaktionskinetiken während der geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation gemessen wurden. In späteren Zyklen hemmt die Anreicherung von amplifiziertem Produkt die Reaktion und führt letztlich zu einem Reaktionsplateau.
Für alle Reaktionen wurde ein AFL von 1,2 gewählt. Da eine PCR-Amplifikation aus diskreten Zyklen besteht und die Fluoreszenzmessungen einmal pro Zyklus durchgeführt wurden, erhöht sich die gemessene Fluoreszenz typischerweise von unterhalb des AFL nach oberhalb des AFL in einem einzigen Zyklus. Um die Genauigkeit der Messungen zu erhöhen, wurde eine "exakte" Anzahl der Zyklen, um den AFL-Grenzwert, hier als der C_T-Wert bezeichnet, zu erreichen, durch Interpolieren der Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen errechnet.
Da die kinetischen PCR-Verfahren lediglich eine Zunahme der Gesamtmenge an doppelsträngiger DNA messen, wird unspezifisches Amplifikationsprodukt nicht unabhängig vom beabsichtigten Amplifikationsprodukt gemessen. Um die Herstellung von templatunabhängigen, unspezifischen Amplifikationsprodukten (Primerdimer) zu messen, wurden separate Reaktionen ohne Templatnukleinsäure in der Reaktionsmischung durchgeführt. In solchen templatfreien Reaktionen kann jede Zunahme doppelsträngiger DNA der Bildung von templatunabhängigen, unspezifischen Amplifikationsprodukten, d.h. "Primerdimer", zugeordnet werden.
In den meisten Reaktionen, wenn genügend Amplifikationszyklen durchgeführt werden, wird letzten Endes Primerdimer gebildet und, sobald es einmal gebildet ist, wird das Primerdimer aufgrund seiner geringen Größe effizient amplifiziert. Die Bildung von Primerdimer beeinflußt jedoch nicht den beobachteten C_T der Zielamplifikation, so lange das Primerdimer bis deutlich nach dem C_T der Zielamplifikation nicht nachweisbar ist. Bevorzugt wird die Bildung von Primerdimer verzögert, so dass es nicht innerhalb der Anzahl der, für die Reaktion verwendeten, Zyklen gebildet wird.
Selbst eine geringfügige Verzögerung der Bildung von Primerdimer im Verhältnis zur Zielamplifikation kann signifikante Vorteile in einer Reaktion liefern. Aufgrund der schnellen Anreicherung von amplifiziertem Produkt während der geometrischen Wachstumsphase einer PCR – jeder Zyklus resultiert fast in einer Verdopplung der Menge an amplifiziertem Produkt – halbiert jeder Zyklus an Verzögerung der Bildung von Primerdimer im Verhältnis zur Zielamplifikation die vorhandene Menge an Primerdimer im Verhältnis zur Menge an Zielprodukt. Diese Verringerung der relativen Menge von Primerdimer hilft Effekte der Bildung von Primerdimer auf den C_T des Ziels zu verringern.
Die modifizierten Primer haben typischerweise einen Effekt, üblicherweise eine Verzögerung, auf die Bildung des gewünschten Amplifikationsprodukts. Bevorzugt wird diese Verzögerung minimiert, während die Verzögerung der Bildung von Primerdimer maximiert wird. Da der, in einer Amplifikation des Ziels erhaltene, absolute C_T von der anfänglichen Konzentration des Ziels abhängt, wurden die Ergebnisse der Reaktionen, die das Zieltemplat enthielten, durch Vergleich der Differenzen der erhaltenen C_T-Werte, als ΔC_T bezeichnet, zwischen Reaktionen, die modifizierte Primer verwenden und vergleichbaren Reaktionen, die unmodifizierte Primer verwenden, ausgewertet. Somit sind bevorzugte modifizierte Primer jene, die eine minimale Änderung von C_T der Zielamplifikation liefern und eine maximale Zunahme von C_T der Nicht-Zielamplifikation liefern.
Beispiel 2
Ergebnisse der Verwendung von unmodifizierten Primern
Um ein Maß der Bildung von Primerdimer zu liefern, das zur Beurteilung der Verbesserungen, die durch die Verwendung von modifizierten Primern erhalten werden, verwendet werden kann, wurden Amplifikationen ohne Zieltemplat unter der Verwendung von unmodifizierten Versionen der Primer SK145 (SEQ ID NO: 2) und GAG152 (SEQ ID NO: 4) durchgeführt. Die Reaktionen wurden über einen Bereich von DNA-Polymerasekonzentrationen durchgeführt. Repräsentative C_T-Werte, die bei den templatfreien Reaktionen beobachtet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.
templatfreie Reaktionen
Bei beiden DNA-Polymerasen neigt das Primerdimer dazu, bei höheren Enzymkonzentrationen früher gebildet zu werden. Im Allgemeinen führten Reaktionen unter Verwendung von CE31 DNA-Polymerase früher zu Primerdimer (niedrigerer C_T-Wert), als jene unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase.
Es wurden Amplifikationen durchgeführt (Daten nicht gezeigt), die die Primerdimerbildung in Reaktionen unter Verwendung von unmodifizierten Formen der drei Vorwärtsprimer vergleichen. Unter Verwendung der drei Vorwärtsprimer wurden annähernd identische Ergebnisse erhalten. Aus diesem Grund wurden die drei möglichen unmodifizierten Primerpaare in den Vergleichen von modifizierten Primern mit unmodifizierten Primern, die unten beschrieben sind, austauschbar verwendet.
Es sollte erwähnt werden, dass C_T-Werte aus templatfreien Reaktionen dazu neigen stärker variabel zu sein, als C_T-Werte aus Amplifikationen von Templat. Das spiegelt wahrscheinlich die Zufälligkeit der Zeit zur Bildung des anfänglichen Primerdimertemplats wieder, die in manchen Reaktionen möglicherweise nicht auftritt. Sobald einmal gebildet, wird Primerdimer aufgrund seiner geringen Größe effizient amplifiziert. Obwohl Primerdimer üblicherweise in wiederholten Reaktionen nach ungefähr der gleichen Zyklenzahl nachweisbar wurde, wurde in manchen Reaktionen Primerdimer signifikant verzögert oder bildete sich in einer der Wiederholungen überhaupt nicht, wie unten gezeigt wird.
Beispiel 3
Ergebnisse der Verwendung von 2'-O-methylmodifizierten Primern
Die Ergebnisse der Amplifikationen unter Verwendung einer Vielzahl an modifizierten Primerkombinationen werden in den unten stehenden Tabellen berichtet. Die Primermodifikationen, das Enzym und die Enzymkonzentration, die in jeder Reaktion verwendet wurde, sind in der Tabelle angegeben.
Die Ergebnisse der Amplifikationen von Zieltemplat, die das vorgesehene Amplifikationsprodukt ("Amplikon") ergaben, werden als die Differenz in C_T (ΔC_T) zwischen Reaktionen, die mit den angegebenen modifizierten Primern, und Reaktionen, die mit unmodifizierten Primern ausgeführt wurden, berichtet. Amplifikationen wurden typischerweise doppelt ausgeführt und die gemittelten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Die Ergebnisse der Amplifikationen unter Verwendung von templatfreien Reaktionen, die, wenn überhaupt etwas, nur Primerdimer ergeben, werden als die C_T berichtet. In den meisten Fällen sind die berichteten Ergebnisse der Durchschnitt von doppelt ausgeführten Reaktionen. Bei doppelt ausgeführten Reaktionen in denen Primerdimer bei signifikant verschiedenen Zyklenzahlen nachweisbar wurde, d.h. bei denen die C_T-Werte recht unterschiedlich sind (zum Beispiel, wenn Primerdimer in einer Wiederholung nicht gebildet wurde), werden beide Werte separat berichtet. Bei Reaktionen, in denen kein Primerdimer im letzten Zyklus, in dem Fluoreszenzmessungen gemacht wurden, nachgewiesen wurde, ist die Nummer des letzten Reaktionszyklus angegeben und das Ergebnis ist mit einem Stern markiert.
I. 3'-endständig 2'-O-Me modifizierte Primer
Die Ergebnisse von Amplifikationen unter Verwendung von Primern, die ein modifiziertes Nukleotid an der 3'-Endstellung enthalten, sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
Amplifikationen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase
Die erhaltenen Primerdimer C_T-Werte können mit denen, die aus Reaktionen unter Verwendung von unmodifizierten Primern erhalten wurden, bei denen C_T-Werte von 37–38 beobachtet wurden, verglichen werden. Die Daten zeigen, dass im Allgemeinen die Verwendung von wenigstens einem Primer, der ein 3'-endständiges 2'-O'-Me-Nukleotid einbringt, die Bildung von Primerdimer in templatfreien Reaktionen verzögert. Insbesondere wurde in fast allen Reaktionen ein C_T-Wert von mehr als 40, üblicherweise signifikant höher, erhalten.
Der beobachtete Effekt eines 3'-endständigen 2'-O'-Me-Ribonukleotids auf die Amplifikation eines Zieles hing von der jeweiligen Base des modifizierten Nukleotids ab. Die Verwendung eines 3'-endständigen 2'-O'-Me-C oder -U oder -G resultierte in einer minimalen Verzögerung der Zielamplifikation, im Bereich von 0,5 Zyklen Verzögerung bei der Verwendung eines einzigen modifizierten Primers bis zu 1,8 Zyklen Verzögerung bei der Verwendung zweier modifizierter Primer. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung eines 3'-endständigen 2'-O'-Me-A in Reaktionen, die ZO5 DNA-Polymerase verwendeten, zu einer Verzögerung von 4–5 Zyklen.
Amplifikationen unter Verwendung von CE31 DNA-Polymerase
Wie oben angegeben, neigen Reaktionen, die unmodifizierte Primer mit CE31 verwenden, dazu, Primerdimer bei einem früheren Zyklus zu bilden, als Reaktionen, die ZO5 DNA-Polymerase verwenden. Die erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung von 3'-endständig modifizierten Primern zeigen ähnliche Verbesserungen, wie jene, die bei Reaktionen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase beobachtet wurden. Im Allgemeinen neigten Amplifikationen von Templaten unter Verwendung von CE31 dazu, durch die Verwendung von 3'-modifizierten Primern weniger beeinflußt zu werden. Im Besonderen minimiert die Verwendung von CE31 die Verzögerung in Zielamplifikationen, die unter Verwendung eines Primers mit einem 3'-endständigen 2'-O-Me-A durchgeführt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Primer, die ein modifiziertes Nukleotid am 3'-endständigen Nukleotid enthalten, in den vorliegenden Verfahren nützlich sind.
II. 3'-vorletzte Nukleotidmodifikationen
Die Ergebnisse von Amplifikationen, die unter Verwendung von Primern, die ein modifiziertes Nukleotid an der 3'-vorletzten Position enthalten, sind in den folgenden Tabellen gezeigt.
Amplifikationen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase
Amplifikationen unter Verwendung von CE31 DNA-Polymerase
Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Primer, die ein modifiziertes Nukleotid am 3'-vorletzen Nukleotid enthalten, in den vorliegenden Verfahren nützlich sind.
III. Zwei 3'-endständige Nukleotidmodifikationen
Die Ergebnisse von Amplifikationen die unter Verwendung von Primern, die zwei modifizierte Nukleotide, eines an der 3'-endständigen und eines an der 3'-vorletzten Position enthalten, sind in den folgenden Tabellen gezeigt.
Amplifikationen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase
Amplifikationen unter Verwendung von CE31 DNA-Polymerase
Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Primer, die modifizierte Nukleotide an den beiden 3'-endständigen Positionen enthalten, in den vorliegenden Verfahren nützlich sind.
Zusätzliche Amplifikationen (Daten nicht gezeigt) zeigten, dass beide Primer an den letzten zwei 3'-Endstellungen modifiziert werden können. Diese Kombination ist weniger bevorzugt, obwohl Primerdimer effektiv verzögert wurde, da die Verzögerung der Amplifikation des Ziels auch vergrößert war (ungefähr 3 Zyklen). Unter gewissen Reaktionsbedingungen jedoch, besonders wenn die maximale Verzögerung der Bildung von Primerdimer überragend ist, würde die Verwendung eines Primerpaars, wobei jeder modifizierte Nukleotide an den beiden 3'-Endstellungen enthält, nützlich sein.
Beispiel 4
Fluor-, Amino- und Arabinose-modifizierte Primer

Die Ergebnisse von Amplifikationen, die unter Verwendung von Primern, die mit einer 2'-Fluor- oder 2'-Aminogruppe modifiziert sind, oder ein Arabinosenukleotid enthalten, sind in den folgenden Tabellen gezeigt. Die Amplifikationen wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung des im folgenden dargestellten Temperaturprofils:

Prä-Reaktionsinkubation	48°C für 12 Minuten
Hochtemperaturinkubation	93°C für 2 Minuten
bis zu 60 Zyklen:	Denaturierung bei 93°C für 10 Sekunden, Assoziieren/Verlängern bei 60°C für 40 Sekunden.

In templatfreien Amplifikationen unter Verwendung unmodifizierter Primer und 40 U ZO5 DNA-Polymerase wurde ein C_T der Primerdimerbildung von 34,1 beobachtet. Im Allgemeinen neigt die Verwendung einer niedrigeren Assoziierungs-/Verlängerungs-Temperatur (60°C) im Temperaturzyklenprofil, die Bildung von Primerdimer zu erhöhen. Aus diesem Grund sind die unten gezeigten C_T-Werte nicht direkt mit denen vergleichbar, die im vorangegangenen Beispiel vorgestellt wurden.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Amplifikationen unter Verwendung anderer Primermodifikationen
Die Ergebnisse zeigen, dass 2'-Fluor-, 2'-Amino- und Arabinosenukleotide ebenfalls verbesserte Ergebnisse liefern, wenn sie in modifizierten Primern in den vorliegenden Verfahren verwendet werden.
Die unter Verwendung eines 2'-Fluornukleotid enthaltenden Primers, wenn dieser mit einem anderen modifizierten Primer gepaart wurde, erhaltenen Ergebnisse zeigten signifikante Verbesserungen, selbst gegenüber denen, die dem zweiten modifizierten Primer zu zuordnen waren. Die unter Verwendung eines 2'-Fluornukleotid enthaltenden Primers, der mit einem unmodifizierten Primer gepaart war, erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch, falls überhaupt etwas, einen geringfügig nachteiligen Effekt. Die Ursache für dieses ungewöhnliche Ergebnis ist nicht offensichtlich.
Beispiel 5
Primervergleiche: Mg²⁺-aktivierte Reaktionen

Zusätzliche Reaktionen wurden im Wesentlichen, wie im oben beschriebenen Beispiel 1, durchgeführt, jedoch unter Verwendung von 3,0 mM Mg²⁺ in der Reaktionsmischung anstelle von Mn²⁺ und 40 Einheiten ZO5 oder CE18 DNA-Polymerase und dem folgenden Temperaturprofil:

Prä-Reaktionsinkubation	48°C für 12 Minuten
Hochtemperaturinkubation	94°C für 10 Sekunden
bis zu 60 Zyklen:	Denaturierung bei 91°C für 10 Sekunden, Assoziieren/Verlängern bei 60°C für 40 Sekunden.

In templatfreien Amplifikationen unter Verwendung von unmodifizierten Primern und 40 U ZO5 DNA-Polymerase wurde ein C_T der Primerdimerbildung von 35,1 beobachtet. Wie oben erwähnt, neigt die Verwendung einer niedrigeren Assoziierungs-/Verlängerungstemperatur (60°C) im Temperaturzyklenprofil dazu, die Bildung von Primerdimer zu erhöhen. Aus diesem Grund sind die unten gezeigten C_T-Werte nicht direkt mit denen vergleichbar, die im vorangegangenen Beispiel vorgestellt wurden.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt. Ein „neg" in den Ergebnisspalten weist darauf hin, dass kein Amplifikationsprodukt beobachtet wurde.
Amplifikationen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase
Amplifikationen unter Verwendung von CE18 DNA-Polymerase
Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Primer, die modifizierte Nukleotide an der 3'-Endstellung enthalten, in den vorliegenden Verfahren, selbst bei Mg²⁺-aktivierten Amplifikationen, nützlich sein können, obwohl das modifizierte Nukleotid in einem Mg²⁺-Puffer einen größeren Einfluß auf die Zielamplifikation hat, als in einem Mn²⁺-Puffer. Im Besonderen verzögert ein 2'-O-Methyl-A an der 3'-Endstellung des Primers die Amplifikation des Ziels unter diesen Reaktionsbedingungen.
Beispiel 6
Mehrfach modifizierte Primer
Die Amplifikationen wurden unter Verwendung des, durch Einbau eines 2'-O-Me-Ribonukleotids an jeder fünften Position, beginnend mit dem 3'-endständigen Nukleotid, modifizierten Vorwärtsprimers SK145 (SEQ ID NO: 2) durchgeführt. Diese Primer werden in den folgenden Tabellen als „1/5ome" bezeichnet. Die Amplifikationen wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
Amplifikationen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase
Amplifikationen unter Verwendung von CE18 DNA-Polymerase
Die Ergebnisse zeigen, dass Primer, die ein modifiziertes Nukleotid an jeden fünften Nukleotid, beginnend mit dem 3'-endständigen Nukleotid, enthalten, in den vorliegenden Verfahren nützlich sind. Es wird erwartet, dass das hier verwendete jeweilige Muster der Modifikation nicht kritisch ist und dass zusätzliche, mehrfach modifizierte Primer in den vorliegenden Verfahren nützlich sein werden. Zweifellos werden Primer, die ein modifiziertes Nukleotid an jeden fünften Nukleotid, beginnend mit dem 3'-vorletzten Nukleotid, enthalten, ebenso in den vorliegenden Verfahren nützlich sein.
Beispiel 7
Primer, die an den drei 3'-endständigen Nukleotiden modifiziert sind
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines Primers, der 2'-O-Me-Ribonukleotide an den drei 3'-Endstellungen enthält. Diese bestimmten Reaktionen wurden unter Verwendung von Primern durchgeführt, die eine Sequenz des menschlichen Parvovirusgenoms (B19) amplifizieren.

Die Reaktionen wurden entweder unter Verwendung eines Paares unmodifizierter Primer oder eines Primerpaars, in dem der Vorwärtsprimer, der in seiner unmodifizierten Form mit A-G-T am 3'-Ende endet, mit 2'omeA-2'omeG-2'omeU endet. Der Rückwärtsprimer war unmodifiziert. Die Reaktionsbedingungen (Mn²⁺-aktivierte Reaktionen unter Verwendung von ZO5 DNA-Polymerase) waren den oben beschriebenen zur Amplifikation einer HIV-1-Sequenz ähnlich, verwendeten jedoch 20 pmol eines jeden Parvovirusprimers und ein Zieltemplat bestehend aus gereinigter Parvovirusnukleinsäure. Die thermische Zyklisierung wurde unter Verwendung des folgenden Temperaturprofils durchgeführt.

Prä-Reaktionsinkubation	48°C für 12 Minuten
Hochtemperaturinkubation	94°C für 10 Sekunden
bis zu 60 Zyklen:	Denaturierung bei 92°C für 10 Sekunden, Tempern/Verlängern bei 60°C für 60 Sekunden.

Die Ergebnisse der Amplifikationen sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Da es bekannt ist, dass die Neigung Primerdimer zu bilden systemabhängig ist, sind die vorliegenden Ergebnisse nicht direkt mit denen vergleichbar, die in den vorangegangenen Beispielen vorgestellt wurden. Trotz der Unterschiede in den Reaktionen sind jedoch die beobachteten C_T der templatfreien Amplifikationen unter Verwendung unmodifizierter Parvovirusprimer (37,0) zu denen vergleichbar, die unter Verwendung des unmodifizierten HIV-Primers in den in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionen, beobachtet wurden.
Amplifikationen unter Verwendung eines dreifachmodifizierten Primers
Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Primer, die modifizierte Nukleotide an den drei 3'-enständigen Nukleotiden enthalten, in den vorliegenden Verfahren nützlich sind.
SEQUENZ-LISTING

Claims

Kit zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion, worin das genannte Kit ein Primerpaar umfasst, worin mindestens ein Primer des Primerpaars ein modifiziertes Nukleotid in den drei 3'-Nukleotidendstellungen enthält; worin das genannte modifizierte Nukleotid aus der Gruppe, bestehend aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Fluornukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und Arabinosenukleotiden, ausgewählt ist.
Kit gemäß Anspruch 1, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-O-Methylnukleotid ist.
Kit gemäß Anspruch 1, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-Fluornukleotid ist.
Kit gemäß Anspruch 1, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-Aminonukleotid ist.
Kit gemäß Anspruch 1, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein Arabinosenukleotid ist.
Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das modifizierte Nukleotid an der 3'-Endstellung ist.
Kit gemäß Anspruch 1, worin jeder Primer des genannten Primerpaars unabhängig ein modifiziertes Nukleotid in den drei 3'-Nukleotidendstellungen enthält; worin das genannte modifizierte Nukleotid aus der Gruppe, bestehend aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Fluornukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und Arabinosenukleotiden, ausgewählt ist.
Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäurezielsequenz, worin das genannte Verfahren die Durchführung einer auf Primer beruhenden Amplifikationsreaktion in einer Reaktionsmischung aufweist, welche ein Primerpaar umfasst, wobei mindestens ein Primer des genannten Primerpaars ein modifiziertes Nukleotid in den drei 3'-Nukleotidendstellungen enthält; worin das genannte modifizierte Nukleotid aus der Gruppe, bestehend aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Fluornukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und Arabinosenukleotiden, ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-O-Methylnukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-Fluornukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein 2'-Aminonukleotid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte modifizierte Nukleotid ein Arabinosenukleotid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, worin das genannte modifizierte Nukleotid an der 3'-Endstellung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin jeder Primer des genannten Primerpaars unabhängig ein modifiziertes Nukleotid in den drei 3'-Nukleotidendstellungen enthält; worin das genannte modifizierte Nukleotid aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Methylnukleotiden, 2'-Fluornukleotiden, 2'-Aminonukleotiden und Arabinosenukleotiden ausgewählt ist.