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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Einfangen eines Polynukleotids,
das in einer Probe auf einem festen Träger vorhanden sein kann. Die
Erfindung ist besonders zum Abtrennen eines Ziel-Polynukleotids
vom anderen Material in einer Probe geeignet und wird bevorzugt
als Teil eines diagnostischen Verfahrens zum Detektieren der Anwesenheit
eines Ziel-Polynukleotids in einer Probe verwendet.
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Hintergrund der Erfindung
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Ein
Ziel-Polynukleotid ist ein in einer Probe vorhandenes Polynukleotid,
das aus einer oder mehreren Probenbestandteilen aufgereinigt werden
kann und/oder dessen Anwesenheit mittels verschiedener Techniken
detektiert werden kann. Solche Techniken werden üblicherweise als Teil eines
diagnostischen Verfahrens zum Detektieren der Anwesenheit eines
Ziel-Polynukleotids,
das einen Hinweis auf die Anwesenheit eines infektiösen Agens
oder eines pathogenen Zustandes gibt, durchgeführt.
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Die
Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotid-Basensequenzbereichs, der in einem Ziel-Polynukleotid vorhanden
ist, kann mittels verschiedener Verfahren, wie z.B. solchen, die
Nukleinsäuresonden
verwenden, die mit einer Ziel-Sequenz
hybridisieren, detektiert werden. Sonden können entworfen werden, um verschiedene
Ziel-Sequenzen, wie z.B. solche, die für Mikroorganismen, Viren, menschliche
Gene, Pflanzen oder tierische Gene und/oder pathogene Zustände charakteristisch
sind, zu detektieren.
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Eine
Technik zum Auf reinigen eines Ziel-Polynukleotids, die häufig in
diagnostischen Verfahren verwendet wird, schließt das Einfangen eines Ziel-Polynukleotids
auf einem Trägermaterial
ein. Das Trägermaterial
hält das
Ziel-Polynukleotid
während
eines oder mehrerer Waschschritte im Reinigungsverfahren für das Ziel-Polynukleotid
fest.
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Ranki
et al., U.S. Pat. Nr. 4,486,539 beschreiben eine Hybridisierungs-Sandwichtechnik
zum Einfangen und zum Detektieren der Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids.
Die Technik schließt
das Einfangen eines Ziel-Polynukleotids durch eine Sonde, die an
ein Trägermaterial
gebunden ist, und das Hybridisieren einer Detektionssonde mit dem
eingefangenen Ziel-Polynukleotid ein. Die Detektionssonden, die
nicht mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert sind, werden einfach
vom Trägermaterial
abgewaschen. Daher ist der verbleibende Marker mit dem Ziel-Polynukleotid,
das von Anfang an in der Probe vorhanden ist, verbunden.
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Stabinsky,
U.S. Pat. Nr. 4,751,177 beschreibt ein Verfahren, das ein Vermittler-Polynukleotid
verwendet, das sowohl mit einem Ziel-Polynukleotid als auch mit
einem Polynukleotid, das an einem Trägermaterial fixiert ist, hybridisiert.
Das Vermittler-Polynukleotid bindet das Ziel-Polynukleotid an das Trägermaterial,
um ein gebundenes Ziel zu erzeugen. Eine markierte Sonde kann mit
dem gebundenen Ziel hybridisiert werden, und die ungebundene markierte
Sonde kann vom Trägermaterial
weggewaschen werden.
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Collins
et al., EP Pat. Veröffentlichungsnr.
0328829 offenbaren ein Verfahren zum Detektieren einer Ziel-Nukleinsäure, in
dem diese mit einer ersten Sonde bei einer ersten Temperatur inkubiert
wird, eine immobilisierte zweite Sonde, die zur ersten komplementär ist, bei
einer zweiten Temperatur zugegeben wird, das eingefangene Ziel gereinigt,
amplifiziert und mit einer markierten Sonde detektiert wird.
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Englehardt
et al., U.S. Pat. Nr. 4,894,324 und 5,288,609 beschreiben ein Verfahren
zum Detektieren eines Ziel-Polynukleotids.
Im Verfahren werden zwei einzelsträngige Polynukleotidsegmente
verwendet, die mit dem gleichen oder gegenüberliegenden Strängen des
Ziels komplementär
sind, und die Bildung eines Doppelhybrids mit dem Ziel-Polynukleotid
ergibt. In einer Ausführungsform
kann das Doppelhybrid auf einem Trägermaterial eingefangen werden.
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Cape
et al., EP Pat. Veröffentlichungsnr.
0 370 694 beschreiben Verfahren und Kits zum Detektieren von Nukleinsäuren unter
Verwendung eines Festphaseneinfangmittels. Die Verfahren verwenden
Oligonukleotidprimer, die mit spezifischen Bindungspartnern markiert
sind, um Primer und Primer-Verlängerungsprodukte zu
immobilisieren. Der Marker komplexiert spezifisch mit seinem Rezeptor,
der an einem Trägermaterial
gebunden ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß eines
Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Einfangen eines in
einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotids offenbart, das die Schritte
einschließt:
Inkubieren einer Mischung, die ein Ziel-Polynukleotid, eine Fänger-Sonde
und eine immobilisierte Sonde enthält, bei einer ersten Hybridisierungsbedingung,
die die Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes,
der aus der Fänger-Sonde
und dem Ziel-Polynukleotid gebildet wird, begünstigt und die Bildung eines
immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes,
der aus der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde gebildet wird, weniger
begünstigt;
und dann Inkubieren der Mischung bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung,
die die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes
begünstigt,
wodurch das Ziel-Polynukleotid in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex,
der aus der immobilisierten Sonde, der Fänger-Sonde und dem Ziel-Polynukleotid gebildet
wird, einfängt.
Im ersten Inkubationsschritt wird eine Temperatur unterhalb einer
Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes
und oberhalb einer Tm des immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes verwendet,
und im zweiten Inkubationsschritt wird eine Temperatur unterhalb
einer Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes verwendet.
Zum zweiten Inkubationsschritt gelangt man bevorzugt durch Verringern
der Temperatur bei der ersten Hybridisierungsbedingung um wenigstens
etwa 10°C,
oder um wenigstens etwa 20°C.
In einer Ausführungsform
wird im ersten Inkubationsschritt eine Temperatur von etwa 60°C verwendet,
und im zweiten Inkubationsschritt wird eine Temperatur von etwa
40°C oder
niedriger verwendet. Das Verfahren schließt auch den Schritt des Aufreinigens
des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes
ein. In anderen Ausführungsformen
des Verfahrens wird der Schritt des Detektierens des Ziel-Polynukleotids
im immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex
durch Hybridisieren einer markierten Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid und
Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen. Das Verfahren kann
ebenfalls den Schritt des Amplifizierens des Ziel-Polynukleotids
einschließen,
um eine amplifizierte Nukleinsäure,
bevorzugt durch ein transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren,
herzustellen. Wenn der Amplifikationsschritt eingeschlossen ist,
kann das Verfahren ebenfalls den Schritt des Detektierens der amplifizierten
Nukleinsäure einschließen, bei
dem bevorzugt die Schritte des Hybridisierens einer markierten Sonde
mit der amplifizierten Nukleinsäure,
die zum Ziel-Polynukleotid
komplementär
ist, und das Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen sind.
Das Verfahren kann im Detektionsschritt auch einen Schritt zum Entfernen
der unhybridisierten markierten Sonde einschließen. In bevorzugten Ausführungsformen
ist bei beiden Inkubationsschritten die Verwendung der immobilisierten
Sonde, die einen Fänger-Sonde-Bindungsbereich von
wenigstens fünf
Nukleotidbasen- Erkennungsgruppen
in der Länge
einschließt,
und die Fänger-Sonde, die einen
immobilisierte Sonde-Bindungsbereich von wenigstens fünf Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen
in der Länge
einschließt, vorausgesetzt
dass der Fänger-Sonde-Bindungsbereich zum
immobilisierte Sonde-Bindungsbereich komplementär ist, eingeschlossen. Bevorzugt
umfasst der Fänger-Sonde-Bindungsbereich:
(a) ein erstes Rückgrat, das
wenigstens eine Zucker-Phosphordiester-Verknüpfung oder wenigstens eine
Peptid-Nukleinsäuregruppe, wenigstens
eine Phosphorthioat-Verknüpfung
oder eine Kombination davon und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen,
die mit dem ersten Rückgrat
verbunden sind, enthält,
wobei jede Nukleotid-Erkennungsgruppe
mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder Inosin eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden
kann; und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich umfasst: (a)
ein zweites Rückgrat,
das wenigstens eine Zucker-Phosphordiester-Verknüpfung oder wenigstens eine
Peptid-Nukleinsäuregruppe,
wenigstens eine Phosphorthioat-Verknüpfung oder eine Kombination
davon, und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten
Rückgrat
verbunden sind, die mit den Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die
mit dem ersten Rückgrat
verbunden sind, Wasserstoffbrückenbindungen
ausbilden können,
enthält. In
einer Ausführungsform
des Verfahrens besteht der Fänger-Sonde-Bindungsbereich
aus einem Homopolymer, das wenigstens 10 Nukleotide umfasst, und
der immobilisierten Sonde-Bindungsbereich besteht aus einem Homopolymer,
das wenigstens 25 Nukleotide, von denen wenigstens 10 Nukleotide
komplementär
zu den 10 Nukleotiden des Fänger-Sonde-Bindungsbereiches
sind, umfasst. Bevorzugt schließt
der Fänger-Sonde-Bindungsbereich
etwa vierzehn nebeneinander liegende A- oder T-Basen ein, und der
immobilisierte Sonde-Bindungsbereich schließt eine Sequenz von etwa 30 dazu
komplementären
Basen ein. In bevorzugten Ausführungsformen
werden in den Inkubationsschritten eine Mischung aus der immobilisierten
Sonde und der Fänger-Sonde
verwendet, in der jede Sonde Desoxynukleotide, Ribonukleotide, 2'-Methoxy substituierte
Nukleotide, 2'-Halo
substituierte Nukleotid-Komponenten oder Kombinationen davon einschließt.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen der
Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids in einer Probe. Dieses Verfahren
schließt
die Schritte ein:
Bereitstellen einer Fänger-Sonde, die mit einem in
einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotid hybridisieren kann; Mischen
der Fänger-Sonde
mit einer Probe, die vermutlich das Ziel-Polynukleotid enthält, bei einer ersten Inkubationstemperatur,
die die Hybridisierung der Fänger-Sonde
und des Ziel-Polynukleotids
begünstigt, wodurch
ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
erzeugt wird; Bereitstellen einer immobilisierten Sonde, die mit
der Fänger-Sonde
hybridisieren kann; Inkubieren des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes und
der Immobilisierungssonde bei einer zweiten Inkubationstemperatur,
die die Hybridisierung der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde
begünstigt,
wodurch ein eingefangenes Ziel-Polynukleotid, das einen immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
umfasst, erzeugt wird; Aufreinigen des eingefangenen Ziel-Polynukleotids,
wodurch ein gereinigtes Ziel-Polynukleotid erzeugt wird; Amplifizieren
des gereinigten Ziel-Polynukleotids, wodurch eine amplifizierte
Nukleinsäure
erzeugt wird und Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, um
die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids
in der Probe zu bestimmen. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens
sind beim Detektionsschritt das Hybridisieren einer markierten Sonde
mit der amplifizierten Nukleinsäure,
die mit dem Ziel-Polynukleotid oder einem Abschnitt davon komplementär ist, und das
Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1A und
B illustrieren schematisch die Verwendung zwei verschiedener Hybridisierungsbedingungen,
um ein Ziel-Polynukleotid,
das mit einem "(c)" gekennzeichnet ist,
mittels einer immobilisierten Sonde, die mit einem "(a)" gekennzeichnet ist,
die an einem Trägermaterial
gebunden ist, und einer Fänger-Sonde,
die durch ein "(b)" gekennzeichnet ist,
einzufangen. In 1A wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung
die Hybridisierung einer Fänger-Sonde
(b) und eines Ziel-Polynukleotids (c) ermöglicht, um einen Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 15 zu
bilden, wobei jedoch die Hybridisierung der Fänger-Sonde (b) und der immobilisierten
Sonde (a) nicht ermöglicht
wird. In 1B wird bei der zweiten Hybridisierungsbedingung
die Hybridisierung der Fänger-Sonde
(b) und der immobilisierten Sonde (a) ermöglicht, um einen immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 20 zu
bilden.
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2 illustriert die Schritte A bis F eines
Verfahrens, das die Amplifikation einer eingefangenen Ziel-Polynukleotidsequenz
(Schritt (A)) mittels einer transkriptionsgebundenen Amplifikation
(Schritte (B) bis (F)) einschließt. In 2,
Schritt (A), sind eine immobilisierte Sonde (a), die an ein Trägermaterial 10 gebunden ist,
eine Fänger-Sonde
(b) und eine Ziel-Polynukleotidsequenz (c) wie in 1 gekennzeichnet.
Eine Promotorsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird,
ist mit "P" gekennzeichnet; "(-)" gibt das 5'-Ende einer Nukleinsäure an und "(+)" gibt das 3'-Ende einer komplementären Nukleinsäure an;
und eine gestrichelte Linie "(---)" gibt eine Nukleinsäurepolymerisation
an.
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3A, 3B und 3C illustrieren
die Verwendung zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen,
um die Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids (c) mittels einer immobilisierten
Sonde (a), die an ein Trägermaterial 10 gebunden
ist, einer Fänger-Sonde
(b), die wie in 1 gekennzeichnet ist,
und markierter Sonden, die als "(d)" dargestellt werden,
zu detektieren. In 3A wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung
die Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Komplexes 30 ermöglicht.
In 3B wird bei der zweiten Hybridisierungsbedingung
die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Komplexes 40 ermöglicht,
wobei ungebundene markierte Sonden 50 zurückbleiben.
In 3C sind die ungebundenen markierten Sonden weggewaschen
worden, wobei der gereinigte immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Komplex 40 zurückbleibt.
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4 illustriert
das Beispiel eines Trägermaterials 10 mit
angebundenen immobilisierten Sonden, die aus einer T14-Sequenzen bestehen;
die obere Sonde (neben "(a)" auf der rechten
Seite liegend) ist ein immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex, in dem die T19 immobilisierte
Sonde (dargestellt als ":" zwischen den Basen)
mit einer Fänger-Sonde
(3' A14 TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG
5'(SEQ ID NO:1)),
die eine komplementäre
A14 Sequenz enthält, hybridisiert ist; die mittlere
Sonde (neben "(b)" auf der rechten
Seite liegend) liegt in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
vor, der die immobilisierte Sonde enthält, die mit der Fänger-Sonde,
die mit einer Ziel-Sequenz (5' CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC 3'(SEQ ID NO: 2)) innerhalb
einer größeren Sequenz
(gekennzeichnet durch terminale "NNNNNN"-Sequenzen) hybridisiert ist, hybridisiert;
und die untere Sonde (neben "(b)" auf der rechten
Seite liegend) ist eine unhybridisierte immobilisierte T14-Sonde.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zum Einfangen eines Ziel-Polynukleotids
auf einem Trägermaterial
unter Verwendung einer Fänger-Sonde
und zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen. Es werden verschiedene
Hybridisierungsbedingungen verwendet, um die Reihenfolge der Hybridisierung in
einer Probe, die ein Ziel-Polynukleotid enthält, das mit einer Fänger-Sonde
und einer immobilisierten Sonde gemischt ist, zu kontrollieren.
Unter einer "Hybridisierungsbedingung" ist die für eine Reaktion
verwendete kumulative Umgebung gemeint, in der eine einzelsträngige Nukleinsäure Wasserstoffbrückenbindungen
mit einer zweiten einzelsträngigen
Nukleinsäure
ausbildet, um einen Hybridisationskomplex (der hier manchmal als
ein "Komplex" bezeichnet wird)
zu erzeugen. Die kumulative Umgebung schließt z.B. die Konzentrationen
und Komponenten (z.B. Salze, chelatierende Agenzien und nicht-kompetitive
inhibierende Nukleinsäuren)
einer wässrigen
oder organischen Lösung,
die die einzelsträngigen
Nukleinsäuren
enthält,
und die Temperatur der Reaktionsmischung ein. Andere Faktoren, die
einen Beitrag zur kumulativen Umgebung leisten, schließen zum Beispiel
den Zeitraum in dem die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen
möglich
ist, die physikalische Geometrie der die Reaktanten enthaltenden
Kammer und den Einsatz des Mischens oder Rührens während der Hybridisierung ein.
Alle diese Umgebungsbedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt
(z.B., siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989)). In der vorliegenden Erfindung erleichtert die erste
Hybridisierungsbedingung die Hybridisierung der Fänger-Sonde
mit dem Ziel-Polynukleotid während
die Hybridisierung der Fänger-Sonde
und der immobilisierten Sonde im Wesentlichen ausgeschlossen ist,
und bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung wird die Hybridisierung
der Fänger-Sonde
und der immobilisierten Sonde erleichtert.
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Eine
immobilisierte Sonde stellt Mittel zum Anbinden einer Fänger-Sonde
an einen immobilisierten Träger
bereit. Die immobilisierte Sonde ist ein Basensequenz-Erkennungsmolekül, das an
ein Trägermaterial gebunden
ist, das das Abtrennen des gebundenen Ziel-Polynukleotids vom ungebundenen
Material erleichtert. Jedes bekannte Trägermaterial kann verwendet
werden, wie z.B. Matrizen und frei in Lösung vorliegende Partikel.
Zum Beispiel können
Trägermaterialien
Nitrozellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, gemischte Polymere, Polystyren,
Silanpolypropylen und bevorzugt magnetisierbare Partikel sein. Besonders
bevorzugte Träger
sind magnetische Kügelchen,
die monodispers sind (d.h., einheitlich in der Größe ± etwa
5%), wodurch gleich bleibende Ergebnisse erzeugt werden, was besonders
für die
Verwendung in automatisierten Assays von Vorteil ist.
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Die
immobilisierte Sonde ist direkt oder indirekt über eine Verknüpfung oder
Wechselwirkung, die bei der ersten und zweiten Hybridisierungsbedingung,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, stabil ist, mit
einem Trägermaterial
verbunden. Es gibt eine direkte Verbindung, wenn das immobilisierte
Sondenmolekül in
Abwesenheit einer intermediären
Gruppe mit dem Trägermaterial
verbunden ist. Zum Beispiel kann die direkte Verbindung eine kovalente
Verknüpfung,
Chelatierung oder ionische Interaktion sein. Es gibt eine indirekte
Verbindung, wenn die immobilisierte Sonde über einen oder mehrere Linker
mit dem Trägermaterial
verbunden ist. Ein "Linker" ist ein Mittel,
um mindestens zwei unterschiedliche Moleküle in einem stabilen Komplex zu
binden und enthält
eine oder mehrere Komponenten einer Bindungspartnerreihe.
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Mitglieder
einer Bindungspartnerreihe sind in der Lage einander zu erkennen
und zu binden. Bindungspartnerreihen können zum Beispiel Rezeptor
und Ligand, Enzym und Substrat, Enzym und Kofaktor, Enzym und Koenzym,
Antikörper
und Antigen, Zucker und Lectin, Biotin und Streptavidin, Ligand
und chelatierendes Agens, Nickel und Histidin, im Wesentlichen komplementäre Nukleotidbasen-Erkennungsmoleküle, und
komplementäre,
homopolymere Nukleinsäuren
oder homopolymere Abschnitte von polymeren Nukleinsäuren sein.
Komponenten einer Bindungspartnerreihe sind die Bereiche der Mitglieder,
die an der Bindung teilnehmen.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung weisen viele verschiedene Ausführungsformen
auf. In einer ist der Linker direkt mit dem Trägermaterial verbunden und ist
durch Komponenten einer Bindungspartnerreihe an die immobilisierte
Sonde gebunden. In einer anderen Ausführungsform gibt es mehr als
ein Linker, wobei ein erster Linker direkt mit dem Trägermaterial
verbunden ist, und wenigstens ein zweiter Linker durch Komponenten
einer Bindungspartnerreihe mit der immobilisierten Sonde verbunden
ist. Zusätzliche
Linker können verwendet
werden, um an den ersten und zweiten Linker zu binden.
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Ein "Basensequenz-Erkennungsmolekül" ist ein Polymer,
das Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen enthält, die über ein Rückgrat miteinander verknüpft sind.
Die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen
stellen Sequenzinformationen zum Hybridisieren mit einem komplementären Molekül bereit.
Eine individuelle Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann mit Adenin
(A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) oder Derivaten davon
Wasserstoffbrückenbindungen
ausbilden. Das Rückgrat
eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls stellt die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen
mit der geeigneten Orientierung und Beabstandung für die Wasserstoffbrückenbindung
während
der Hybridisierung, insbesondere zu Basen einer Nukleinsäure, bereit.
Basensequenz-Erkennungsmoleküle
können,
z.B. RNA, DNA, eine Peptidnukleinsäure oder Derivate davon sein.
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Eine
Fänger-Sonde
stellt Mittel zum stabilen Verbinden eines Ziel-Polynukleotids und
einer immobilisierten Sonde bereit. Die Fänger-Sonde schließt einen
oder mehrere Basensequenz-Erkennungsabschnitte ein: einen Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich
und einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich.
Diese zwei Bindungsbereiche können
in einem oder mehreren Basensequenz-Erkennungsmolekülen vorhanden
sein, sind jedoch bevorzugt in einem einzelnen Basensequenz-Erkennungsmolekül, das die
zwei Bindungsbereiche enthält,
eingeschlossen. In einer anderen Ausführungsform enthält die Fänger-Sonde
einen Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich und einen immobilisierte
Sonde-Bindungsbereich, die auf zwei verschiedenen Basensequenz-Erkennungsmolekülen, die
durch einen oder mehrere Linker verbunden sind, vorhanden sind.
Zum Beispiel kann ein immobilisierte Sonde-Bindungsbereich in einem
ersten Basensequenz-Erkennungsmolekül vorhanden sein, der Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich
kann in einem zweiten Basensequenz-Erkennungsmolekül vorhanden
sein und die zwei verschiedenen Moleküle sind über einen Linker miteinander
verbunden, der ein Basensequenz-Erkennungsmolekül ist, das mit den ersten und
zweiten Basensequenz-Erkennungsmolekülen hybridisiert.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ein Verfahren zum Fangen eines in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotids
ein. Als erstes wird eine Mischung, die die Probe, eine Fänger-Sonde
und eine immobilisierte Sonde einschließt, hergestellt und bei einer
ersten Hybridisierungsbedingung inkubiert, um einen Fänger-Sonde:Ziel-Komplex
zu bilden, der aus der mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisierten
Fänger-Sonde
zusammengesetzt ist. Die erste Hybridisierungsbedingung verwendet
eine Temperatur unterhalb der Tm eines Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes
und oberhalb der Tm eines immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde-Hybrids.
Bevorzugt liegt bei der ersten Hybridisierungsbedingung weniger
als wenigstens 50% der Fänger-Sonde
in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex vor. Bevorzugter
liegen bei der ersten Hybridisierungsbedingung weniger als 25%,
noch bevorzugter weniger als 10% und am meisten bevorzugt weniger
als 1% der Fänger-Sonde
in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex vor.
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Dann
wird eine zweite Hybridisierungsbedingung verwendet, um einen immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex zu bilden,
der aus der immobilisierten Sonde, die mit der Fänger-Sonde hybridisiert ist,
die mit dem Ziel-Polynukleotid
hybridisiert ist, zusammengesetzt ist. Die Temperatur der zweiten
Hybridisierungsbedingung liegt unterhalb der Tm des
immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes
und ist daher kompatibel mit der Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes.
Bevorzugt liegt die immobilisierte Sonde relativ zur Fänger-Sonde im Überschuss
vor.
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"Tm" bezieht sich auf
die Schmelztemperatur bei der 50% der Hybridisationskomplexe, die
zwischen den Basensequenz-Erkennungsmolekülen gebildet
werden, denaturiert sind. Bei einer Temperatur unterhalb der Tm wird die Bildung des Hybridisations-Komplexes
begünstigt,
während
bei einer Temperatur oberhalb der Tm die
Komplexbildung nicht begünstigt
wird.
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Die
Bezugnahme auf die Tm eines Hybridisations-Komplexes,
der eine Fänger-Sonde
oder immobilisierte Sonde enthält,
schließt
Komplexe eine, die durch Hybridisierung mit einem oder mehreren
Linkern, die vorhanden sein können,
gebildet werden. Wenn Linker vorhanden sind, dann spiegelt die Tm eines Hybridisations-Komplexes die allgemeine
Stabilität
des Komplexes wieder, so wie es auch vom Fachmann berechnet werden
kann. Zum Beispiel gibt es bei einer Fänger-Sonde, die aus drei Oligonukleotiden
zusammengesetzt ist, eine erste Tm des ersten
Oligonukleotids, das mit dem zweiten Oligonukleotid hybridisiert
ist, und eine zweite Tm des zweiten Oligonukleotids,
das mit einem dritten Oligonukleotid hybridisiert ist. Der Niedrigere
dieser ersten und zweiten Tm bestimmt die
Stabilität
der Fänger-Sonde
und ob die drei Oligonukleotide aus denen die Fänger-Sonde zusammengesetzt
ist, bei einer bestimmten Hybridisierungsbedingung hybridisiert
bleiben.
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Der
Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Hybridisations-Komplex
kann, so wie andere hierin beschriebene Komplexe, neben den angegebenen
Komponenten weitere Gruppen enthalten. Solche zusätzlichen
Gruppen schließen
zum Beispiel eine markierte Sonde, die mit dem Ziel-Polynukleotid
hybridisiert ist, oder ein Oligonukleotid, das mit dem Ziel hybridisiert
ist, das für
die Amplifikation des Ziel-Polynukleotids hilfreich ist, ein. Zusätzliche
Gruppen, die das Funktionieren der vorliegenden Erfindung nicht
beeinflussen, können
ebenfalls vorhanden sein.
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Eine
markierte Sonde ist ein Basensequenz-Erkennungsmolekül, das eine detektierbare Gruppe
enthält.
Detektierbare Gruppen können
zum Beispiel ein fluoreszierender Rest, ein chemilumineszierender
Rest, ein Radioisotop, Biotin, Avidin, ein Enzym oder Enzymsubstrat
oder eine reaktive Gruppe sein.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können außerdem einen Reinigungsschritt
einschließen.
Mit "Reinigen" ist gemeint, dass
eine oder mehrere Komponenten, die Bestandteil der Probe vor der
Reinigung sind, von einer oder mehreren anderen Komponenten der
Probe entfernt werden. Probenkomponenten schließen Nukleinsäuren ein
und können
auch Materialien, wie zum Beispiel Proteine, Kohlenhydrate, Lipide
und markierte Sonden einschließen.
Bevorzugt entfernt der Reinigungsschritt wenigstens etwa 70%, noch
bevorzugter wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt wenigstens
etwa 95% der Nicht-Ziel-Nukleinsäure,
die in der Probe vorhanden ist.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch das Amplifizieren
eines gereinigten Ziel-Polynukleotids nach dem Fangen (hierin als "Gefangenes Ziel" bezeichnet) einschließen, um
eine amplifizierte Nukleinsäure
herzustellen. Das Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäure verwendet
eine Nukleinsäurepolymerase, um
mehrere Kopien des gesamten Ziel-Polynukleotids,
oder Fragmenten davon oder einer Nukleinsäure, die zum gesamten Ziel-Polynukleotid
oder Fragmenten davon komplementär
ist, herzustellen. Geeignete Amplifikationstechniken, die im Stand
der Technik gut bekannt sind, schließen zum Beispiel eine transkriptionsgebundene
Amplifikation, Polymerasekettenreaktion (PCR), eine durch eine Replikase
vermittelte Amplifikation und Ligase-Kettenreaktion (LCR) ein.
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Die
Amplifikation von "Fragmenten
davon" betrifft
das Herstellen einer amplifizierten Nukleinsäure, die weniger als das vollständige Ziel-Polynukleotid
oder das Komplement davon enthält.
Solche Fragmente können
durch das Amplifizieren eines Abschnitts des Ziel-Polynukleotids,
zum Beispiel durch Verwenden eines Amplifikationsoligonukleotides,
das die Polymerisation einer internen Position des Ziel-Polynukleotids
hybridisiert, und die Polymerisation davon initiiert, hergestellt
werden. Bevorzugt enthält
das amplifizierte Fragment eine detektierbare Ziel-Sequenz. Die
Anwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäure kann mittels verschiedener
gut bekannter Techniken, wie zum Beispiel das Hybridisieren einer
markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, detektiert werden. Andere
im Stand der Technik gut gekannte Techniken zum Detektieren von Nukleinsäure schließen zum
Beispiel die Gelfiltration, die Gelelektrophorese und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) ein.
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Eine
markierte Sonde kann verwendet werden, um die Anwesenheit eines
gereinigten Gefangenen Ziels zu detektieren. Bevorzugt wird ein
Reinigungsschritt verwendet, um ungebundene markierte Sonden von gebundenen
markierten Sonden, die mit gefangenen Ziel-Polynukleotiden hybridisiert
sind, zu entfernen. Der Reinigungsschritt kann simultan zum Reinigen des
gefangenen Ziel-Polynukleotids verwendet werden. Alternativ dazu
können
markierte Sonden zu einem gereinigten, eingefangenen Ziel-Polynukleotid
zugegeben werden und ungebundene, markierte Sonden können in
einem darauf folgenden Reinigungsschritt entfernt werden.
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Mit "Entfernen" in Bezug auf eine
Probenkomponente oder einer Hybridisierungsreaktionskomponente (z.B.
ungebundene, markierte Sonde) ist gemeint, dass wenigstens 70% der
unerwünschten
Komponente von einer festgehaltenen Komponente abgetrennt werden.
Noch bevorzugter werden wenigstens 90% und am meisten bevorzugt
wenigstens 95% der unerwünschten
Komponente entfernt. Komponenten können unter Verwendung von Standardverfahren,
wie zum Beispiel durch Verwendung eines Waschverfahrens, entfernt werden.
-
Die
Anwesenheit eines eingefangenen Ziel-Polynukleotids kann mittels
eines homogenen detektierbaren Markers, der an der Fänger-Sonde
oder an einer separaten Detektionssonde angeordnet ist, detektiert werden.
Ein "homogener detektierbarer
Marker" betrifft
einen Marker, dessen Anwesenheit auf homogene Art und Weise, basierend
darauf, ob der Marker an einem Molekül vorliegt, das mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert
ist, detektiert werden kann. Demnach kann der homogene detektierbare
Marker ohne physikalisches Entfernen der hybridisierten von den
unhybridisierten Formen des Markers detektiert werden. Homogene
detektierbare Marker sind zuvor bereits beschrieben worden, einschließlich Beispielen
in Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174; Woodhead et al., U.S.
Pat. Nr. 5,656,207 und Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737.
-
Die
immobilisierte Sonde kann eine oder mehrere repetitive Basensequenzen,
die komplementär
zu einer oder mehreren repetitiven Basensequenzen der Fänger-Sonde
sind, enthalten. Diese komplementären repetitiven Sequenzen sind
bevorzugte Sequenzen von wenigsten fünf Basen in der Länge und
dienen als Bindungsbereiche (d.h. ein Fänger-Sonde-Bindungsbereich
der immobilisierten Sonde und ein immobilisierte Sonde-Bindungsbereich der
Fänger-Sonde).
Die komplementären
repetitiven Sequenzen der immobilisierten und der Fänger-Sonden erleichtern
das Hybridisieren zwischen den zwei Sonden.
-
Eine "repetitive" Sequenz bezieht
sich auf sich regelmäßig wiederholende
Basensequenzen, wie zum Beispiel jene, die zum Beispiel durch Nukleinsäurehomopolymere
von Poly-Adenin (An), Poly-Thymin (Tn), Poly-Cytosin (Cn)
und Poly-Guanin (Gn) gebildet werden. Repetitive
Sequenzen schließen
auch aus Nukleinsäure gemischte
Polymere, wie zum Beispiel AT Wiederholungen ([AT]n),
ein.
-
Die
repetitive Basensequenz der Fänger-Sonde
ist bevorzugt länger
als eine komplementäre
repetitive Basensequenz der immobilisierten Sonde. Die Längen der
komplementären
repetitiven Sequenzen der zwei Sonden bestimmen den Tm des
immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes.
Die längere
repetitive Basensequenz der Fänger-Sonde
erleichtert das Binden an die repetitive Basensequenz der immobilisierten
Sonde, da die zusätzliche
Länge einen
Abstand zwischen der Sekundärstruktur
eines Ziel-Polynukleotids bereitstellt, die ansonsten mit der Hybridisierung
der immobilisierten Sonde interferieren würde. Die repetitive Basensequenz
der immobilisierten Sonde ist bevorzugt wenigstens etwa 10 Basen,
noch bevorzugter etwa 14 Basen in der Länge; und die repetitive Basensequenz
der komplementären
Fänger-Sonde
ist wenigstens etwa 10 Basen, bevorzugt wenigstens etwa 14 Basen,
noch bevorzugter wenigstens etwa 25 Basen in der Länge und
am meisten bevorzugt etwa 30 Basen in der Länge.
-
Ein
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um zu bestimmen,
ob ein Ziel-Polynukleotid in einer Probe vorhanden ist. Das Verfahren
schließt
einen Schritt zum Einfangen des Ziels ein, der zwei Hybridisierungen,
einen Reinigungsschritt, gegebenenfalls einen Amplifizierungsschritt und
einen Detektionsschritt einschließt. In Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids
wird bei der ersten Hybridisierung ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
erzeugt und bei der zweiten Hybridisierung hybridisiert eine immobilisierte
Sonde mit der Fänger-Sonde.
Demnach führt
in Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids
der Schritt des Einfangens des Ziels zur Bildung eines immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes, der eine
immobilisierte Sonde, eine Fänger-Sonde
und ein Ziel-Polynukleotid umfasst. Wenn kein Ziel-Polynukleotid vorhanden
ist, dann wird dieser immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Komplex nicht
gebildet und nur der immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex der zweiten
Hybridisierung wird gebildet. Der Komplex, der während des Schritts zum Einfangen
des Ziels gebildet wird, wird gereinigt, um ein gereinigtes Ziel-Polynukleotid
für Proben,
die ein Ziel-Polynukleotid enthalten, zu erzeugen.
-
Das
gereinigte Ziel-Polynukleotid kann amplifiziert und dann detektiert
werden oder das gereinigte Ziel-Polynukleotid kann ohne einen Amplifikationsschritt
detektiert werden. Die Anwesenheit des gereinigten, eingefangenen
Ziel-Polynukleotids oder der amplifizierten Nukleinsäure wird
bevorzugt mittels einer markierten Sonde detektiert. Noch bevorzugter
hybridisiert die markierte Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid, um
einen markierte Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex mit einer Tm über
der Temperatur der ersten Hybridisierungsbedingung zu bilden. Die
Detektion der markierten Sonde im Komplex zeigt die Anwesenheit
des Ziel-Polynukleotids in der Probe an.
-
Wenn
ein optionaler Amplifizierungsschritt im Verfahren eingeschlossen
ist, wird das gereinigte Ziel-Polynukleotid amplifiziert, um eine
amplifizierte Nukleinsäure
zu erzeugen, die dann mittels einer markierten Sonde, wie weiter
oben beschrieben, oder durch irgendeine Variante bekannter Techniken
zum Detektieren von Nukleinsäure
(z.B. Visualisierung mit einem fluoreszenzinterkalierenden Agens) detektiert
wird. Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäure zeigt an, dass das Ziel-Polynukleotid
anfänglich
in der Probe vorhanden war.
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Während der
Hybridisierung einer Fänger-Sonde
mit einem Ziel-Polynukleotid ist es hilfreich die Fänger-Sonde
in Lösung
zu haben anstatt an einen festen Träger gebunden, um die Konzentration
der freien Fänger-Sonde
zu maximieren, und um die günstigen
Hybridisierungskinetiken in der flüssigen Phase, die dem Fachmann
bekannt sind, auszunutzen. Das heißt, dass die Hybridisierung
in der gelösten
Phase im Allgemeinen 100-fach schneller erfolgt als eine Hybridisierung
in der festen Phase, bei der die gleichen komplementären Bindungssequenzen
verwendet werden. Es ist auch wünschenswert,
die immobilisierte Sonde vor der Hybridisierung der Fänger-Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid
zuzugeben, um die Anzahl von Reagenzzugaben und Abtrennungen und
die Komplexität
der Chemie zu minimieren. Diese Aspekte der Erfindung sind besonders
wichtig für
ein automatisiertes Assay.
-
In
den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Fangen eines Ziel-Polynukleotids
auf einem festen Träger
mittels einer Fänger-Sonde
und zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen, kann der feste
Träger
bei beiden Hybridisierungsbedingungen mit einer immobilisierten
Sonde, Fänger-Sonde
und Ziel-Nukleinsäure
vorhanden sein. Die gefangene Ziel-Nukleinsäure kann von anderem Material,
das vorhanden ist, durch wegwaschen des anderen Materials unter
Bedingungen bei denen das eingefangene Ziel beibehalten wird, gereinigt
werden. Dann kann das gereinigte Ziel-Polynukleotid mittels geeigneter
Bedingungen vom festen Träger,
wie zum Beispiel durch Inkubieren bei einer Temperatur über der
Tm des Fänger-Sonde:immobilisierte Sonde-Komplexes,
eluiert werden.
-
Diese
Verfahren sind besonders nützlich
als Teil eines diagnostischen Assays, in dem das Ziel-Polynukleotid
amplifiziert wird, um große
Mengen von amplifizierten Nukleinsäuren zu erzeugen, die frei
in Lösung vorliegen.
Die amplifizierten Nukleinsäuren
in Lösung
können
mittels gut bekannter Techniken, wie zum Beispiel Nukleinsäurehybridisierung,
detektiert werden.
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Ein
automatisiertes diagnostisches Assay unter Verwendung der Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden zum Beispiel durch:
(1) Hinzufügen
einer Probe, die vermutlich ein Ziel-Polynukleotid aufweist, zu
einem Behälter,
der eine Fänger-Sonde,
die für
das Ziel spezifisch ist, und eine immobilisierte Sonde, die mit
einem festen Träger
verbunden ist, enthält;
(2) Durchführen
einer Zwei-Schritt-Hybridisierung,
um das Ziel-Polynukleotid durch Inkubieren bei einer ersten Hybridisierungsbedingung
und dann Erniedrigen der Temperatur bis auf die der zweiten Hybridisierungsbedingung
auf dem festen Träger
zu Fangen; (3) Entfernen von Probenkomponenten, die nicht an dem
festen Träger
gebunden sind, zum Beispiel durch Verwenden eines Waschschrittes;
(4) Zugeben einer Lösung,
die Oligonukleotide enthält,
die bei der Nukleinsäureamplifikation
aller oder eines Teils des Ziels verwendet wird, die geeigneten
Lösungskomponenten
zum Durchführen
der Amplifikation, und eine Sonde, die mit der amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert
und einen homogenen detektierbaren Marker enthält, zum festen Träger; (5)
Herstellen amplifizierter Nukleinsäure; und (6) Detektieren der
amplifizierten Nukleinsäure,
wie zum Beispiel durch Behandeln der Probe, um ein Signal vom Marker,
der mit der amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert ist, zu erhalten.
Das Detektieren des Signals zeigt die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in
der Probe an. Verschiedene Abwandlungen des obigen Schemas können auf
Grundlage der hierin bereitgestellten Offenbarung durchgeführt werden.
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1 bis 3 stellen
schematische Illustrationen der Verwendung der vorliegenden Erfindung
zum Fangen eines Ziel-Polynukleotids,
um ein Polynukleotidziel optimal zu detektieren und die Anwesenheit
des Polynukleotidziels zu detektieren, dar. Obwohl 1 bis 3 bevorzugte Ausführungsformen darstellen, wird
der Fachmann erkennen, dass andere Abwandlungen und Äquivalente
verwendet werden können,
um die beschriebene Erfindung basierend auf der hierin bereitgestellten
Beschreibung durchzuführen. 4 zeigt
ein Beispiel der Arten von Komplexen, die über eine immobilisierte Sonde,
die ein Homopolymer ist, an einen festen Träger angebunden werden können.
-
1A und 1B illustrieren
das Fangen eines Ziel-Polynukleotids.
Am Anfang des Assays ist die immobilisierte Sonde (a) an ein festes
Trägerpartikel 10 gebunden
und die Fänger-Sonde
(b) und das Ziel-Polynukleotid (c) liegen frei in Lösung vor.
Bezug nehmend auf 1A, wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung
ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 15 in
Lösung
gebildet, wobei jedoch die Fänger-Sonde
(b) im Wesentlichen nicht an die immobilisierte Sonde (a) gebunden
ist. Dann wird die Reaktion bei der zweiten Hybridisierungsbedingung,
wie in 1B dargestellt, inkubiert. Bei
der zweiten Hybridisierungsbedingung hybridisiert die Fänger-Sonde
(b) mit der immobilisierten Sonde (a), wodurch das Ziel-Polynukleotid
(c) in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Nukleinsäure-Komplex 20 gefangen
wird. Bevorzugt tritt die zweite Hybridisierungsbedingung in der
gleichen Lösung
durch Erniedrigen der Temperatur gegenüber der ersten Hybridisierungsbedingung
auf. Ein spezifisches Beispiel der Komplexe, die an einen festen
Träger über eine
immobilisierte Sonde gebunden werden können, wird in 4 dargestellt.
-
2 illustriert eine Ausführungsform,
die weiter die Amplifikation einer Ziel-Polynukleotidsequenz (c) mittels
einer transkriptionsgebundenen Amplifikation einschließt. Das
5' und 3' Ende der Nukleinsäuren wird durch
(-) bzw. (+) auf der rechten Seite der Figur neben der Linie, die
die Nukleinsäuren
darstellt, angegeben; mittels dieser Bezeichnung geben Stränge, die
mit "(-)" markiert sind Antisense-Stränge an,
und Stränge,
die mit einem "(+)" markiert sind, geben
Sinn-Stränge
an. Die gestrichelte Linie (---), die in einem Pfeil endet (→ oder ←), gibt
eine Nukleinsäurepolymerisation
eines komplementären
Strangs einer Nukleinsäure
an.
-
In 2 illustriert Schritt (A) ein gefangenes
Ziel-Polynukleotid
(c), wie für 1B beschrieben,
das mit einem Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz "P" enthält, hybridisiert worden ist,
um einen Nukleinsäure-Hybridisations-Komplex 22 auszubilden.
Mittels einer Polymerase, wie zum Beispiel einer reversen Transkriptase,
wird eine komplementäre
DNA synthetisiert (dargestellt durch ---). In Schritt (B) wird der
(-)-Strang mit einem Primer 24 hybridisiert und die reverse
Transkriptase wird verwendet, um eine DNA-Duplex 23, die
einen doppelsträngigen
Promotor P enthält,
durch Polymerisation (dargestellt durch ---) zu bilden. In Schritt
(B) wird der Komplex 23 frei in Lösung vorliegend dargestellt,
obwohl er nicht vom festen Träger 10 freigesetzt
werden muss. Das Verfügbarmachen
des (-)-Stranges für
die Hybridisierung mit einem Primer 24 kann mittels verschiedener
Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel
durch Verwenden eines Denaturierungsschritts oder einer RNase H-Aktivität, erzielt
werden. Bevorzugt wird die RNase H-Aktivität verwendet, wenn das Ziel
ein RNA-Polynukleotid ist.
-
2 Schritte (C) bis (E) stellen die Herstellung
der amplifizierten Nukleinsäure
ausgehend vom Produkt aus Schritt (B) dar. Eine RNA-Polymerase,
wie zum Beispiel die T7-RNA-Polymerase
wird verwendet, um mehrere Sinn-RNA-Transkripte (Schritt (C)) herzustellen,
an die der Primer 24 für
die Primerverlängerung
binden kann (Schritt (D)). Die gestrichelte Linie in Schritt (D)
illustriert die Primerverlängerung.
Der Primer 24, der manchmal als Promotor-Primer beschrieben
wird, kann vor dem Beginn der Amplifikation zugegeben werden.
-
Zwischen
den Schritten (C) bis (F) werden die (-)-Stränge für das Hybridisieren mit einem
Promotor-Primer 24 zugänglich
gemacht. 2, Schritte (D) bis (F) illustrieren
die Verwendung eines Promotor-Primers, um einen doppelsträngigen Promotor
zu bilden, der durch eine RNA-Polymerase erkannt wird und zum Erzeugen
zusätzlicher
RNA-Transkripte verwendet wird.
-
Die
erzeugten Transkripte können
in einem anderen Amplifizierungszyklus verwendet werden (dargestellt
durch den Pfeil auf der linken Seite von 2,
der die Schritte (F) und (C) verbindet). Die Amplifizierungsschritte
werden im detaillierter weiter unten unter "Transkriptionsgebundene Amplifikation" beschrieben.
-
3A bis 3C illustrieren
das Fangen und Detektieren eines Ziel-Polynukleotids (c) mit einer
markierten Sonde (d). Am Anfang des Assays schließt die Reagenzmischung
die immobilisierte Sonde (a), die an ein festes Partikel 10 gebunden
ist, die Fänger-Sonde
(b), das Ziel-Polynukleotid (c) und die markierte Sonde (d) frei
in Lösung
ein. Wie in 3A dargestellt, wird bei der
ersten Hybridisierungsbedingung ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Hybridisations-Komplex 30 in
der Lösung
gebildet. Die Fänger-Sonde (b), die in 3A dargestellt
wird, besteht aus einem Linker 31, der mit einem ersten
Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 33 und
einem zweiten Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 35 verbunden
ist. Das erste Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 33 schließt einen
Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich 32 ein und
das zweite Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 35 schließt einen
immobilisierte Sonde-Bindungsbereich 34 ein.
-
Wie
in 3B dargestellt, hybridisiert bei der zweiten Hybridisierungsbedingung
der Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Hybridisations-Komplex 30 mit der immobilisierten
Sonde (a), wodurch ein immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte
Sonde-Komplex 40 (d.h. eine gebundene markierte Sonde)
erzeugt wird. Dieser Komplex 40 wird gebildet, wenn die
immobilisierte Sonde (a) mit dem immobilisierte Sonde-Bindungsbereich 34 hybridisiert.
Die zweite Hybridisierungsbedingung kann durch Erniedrigen der Temperatur
der ersten Hybridisierungsbedingung erreicht werden.
-
Es
kann in Bezugnahme auf 3C ein Waschschritt verwendet
werden, um eine ungebundene markierte Sonde (nicht dargestellt)
von der gebundenen markierten Sonde (d), die im Komplex 40,
der am festen Träger 10 gebunden
ist, vorhanden ist, zu entfernen. Das Detektieren der gebundenen
markierten Sonde (d) ist ein Hinweis für die anfängliche Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids
in der Probe.
-
4 illustriert
ein Beispiel eines festen Trägers 10,
an den immobilisierte Sonden, die als T14-Seguenzen
dargestellt werden, angebunden sind. Die obere immobilisierte Sonde
(markiert als (a) auf der rechten Seite) ist in einem immobilisierte
Sonde:Fänger-Sonde-Komplex
dargestellt, in dem die T14-Sonde mit einer komplementären A14-Sequenz einer Fänger-Sonde, dargestellt als 3' A14TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG
5'(SEQ ID NO: 1),
hybridisiert ist (dargestellt als ":" zwischen
den Basen). Die mittlere immobilisierte Sonde (markiert als (b)
auf der rechten Seite) wird in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
dargestellt, der die Komponenten des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes mit dem
5'-Bereich der Fänger-Sonde,
die mit einer komplementären
Ziel-Sequenz, dargestellt als 5' CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC
3'(SEQ ID NO: 2),
hybridisiert ist, enthält.
Die dargestellte Zielsequenz ist eine interne Sequenz, die durch
die terminalen "NNNNNN"-Sequenzen dargestellt wird.
Die niedrigste immobilisierte Sonde (auf der rechten Seite mit (c)
markiert) ist unhybridisiert.
-
Basensequenz-Erkennungsmoleküle
-
Basensequenz-Erkennungsmoleküle enthalten
Sequenzinformationen, die die Hybridisierung mit im Wesentlichen
komplementären
Nukleinsäuren
bei geeigneten Reaktionsbedingungen ermöglichen. Mit "ausreichend komplementär" ist eine zusammenhängende Nukleinsäurebasensequenz
gemeint, die mit einem Basensequenzerkennungsmolekül (z.B.
einer anderen zusammenhängenden
Nukleinsäurebasensequenz) durch
das Ausbilden von Wasserbrückenbindungen
zwischen komplementären
Basen hybridisieren kann. Die komplementäre Basensequenz kann in jeder
Position im Basensequenz-Erkennungsmolekül bei Standardbasenpaarung
(z.B. G:C, A:T oder A:U-Paarung) komplementär sein. Alternativ dazu kann
die komplementäre Basensequenz
einen oder mehrere Reste enthalten, die bei Verwendung der Standardwasserstoffbrückenbindung
(einschließlich
abasische "Nukleotide") nicht komplementär sind,
die gesamte komplementäre
Basensequenz jedoch in der Lage sein mit dem Basensequenzerkennungsmolekül bei geeigneter
Hybridisierungsbedingung spezifisch zu hybridisieren. Für den Fachmann
sind geeignete Hybridisierungsbedingungen gut bekannt, können einfach
aufgrund der Sequenzzusammensetzung vorhergesagt werden oder können empirisch durch
Verwendung von Routinetests bestimmt werden (z.B. siehe Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91,
7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57 teilweise in §§ 9.50-9.51,
11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57). Diese Basensequenz-Erkennungsmoleküle können zusätzliche
Gruppen enthalten, die keine Sequenzinformationen bereitstellen.
Diese zusätzlichen
Gruppen, wenn vorhanden, verhindern nicht die Hybridisierung eines
Basensequenz-Erkennungsmoleküls mit einer
ausreichend komplementären
Nukleinsäure bei
den Reaktionsbedingungen.
-
Ein
Basensequenz-Erkennungsmolekül
umfasst Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen,
die über
ein Rückgrat
miteinander verbunden sind. Die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen
können
mit stickstoffhaltigen Nukleotidbasen, die in einer Nukleinsäure vorhanden
sind, Wasserstoffbrückenbindungen
ausbilden. Das Rückgrat
stellt eine geeignete Konformation und Beabstandung bereit, um es
den Gruppen zu ermöglichen, eine
Wasserstoffbrückenbindung
mit Nukleotiden einer Nukleinsäure
auszubilden.
-
Eine
gegebene Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann mit einem bestimmten
Nukleotid (z.B. A, G, C, T und U) komplementär sein und daher in der Lage
sein mit einem Nukleotid, das in einer Nukleinsäure vorhanden ist, Wasserstoffbrückenbindungen
auszubilden. Eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe
kann auch Wasserstoffbrückenbindungen
mit unterschiedlichen Nukleotiden ausbilden. Wenn zum Beispiel Inosin
eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe ist, kann es eine Wasserstoffbrückenbindung
mit U, A oder C ausbilden.
-
Bevorzugte
Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen sind stickstoffhaltige Purin- oder
Pyrimidinbasen oder Derivate davon, die Wasserstoffbrückenbindungen
entweder mit A, G, C, T, U oder Inosin (I) ausbilden können. Beispiele
von Basensequenz-Erkennungsgruppen schließen A, G, C, T, U oder I und
Derivate davon ein. Beispiele von Derivaten schließen modifizierte
Purin- oder Pyrimidinbasen, wie zum Beispiel N4-Methyldesoxyguanosin,
Deaza- oder Azapurine und Deaza- oder Azapyrimidine, die anstelle
von natürlichen
Purin- und Pyrimidinbasen verwendet werden, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen
in der 5- oder 6-Position und Purinbasen mit einem veränderten
oder Ersatzsubstituenten in den 2, 6 oder 8-Positionen ein. Solche
Derivate und ihre Synthese sind im Stand der Technik gut bekannt
(siehe Cook, PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 93/13121). Zusätzliche
Beispiele sind 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin,
4-Thio-pyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimindine,
O4-Alkylpyrimidine,
und andere im Stand der Technik bekannte.
-
Das
Rückgrat
eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls kann aus verschiedenen Gruppen
oder Verknüpfungen,
die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Bevorzugt
enthält
das Rückgrat
ein oder mehrere Zucker-Phosphordiester-Verknüpfungen, eine oder mehrere
Peptidnukleinsäurerückgratgruppen,
eine oder mehrere Phosphorthioat-Verknüpfungen oder Kombinationen
davon.
-
Struktur
I illustriert eine Zucker-Phosphordiestertyp-Rückgratgruppe,
in der die Zucker-Gruppe eine Pentofuranosyl-Gruppe ist. Die Zuckergruppen werden
durch eine Phosphordiester-Verknüpfung
oder andere geeignete Verknüpfungen
miteinander verbunden.
-
-
Bezug
nehmend auf Struktur I, repräsentiert
X die Gruppe, die zwei Zucker miteinander verbindet. Beispiele für X schließen -P(O)3-, -NHP(O)3-, -OCOO-,
-OCH2CONH-,-OCH2COO-
und -OCONH- ein.
-
In
Bezug auf die anderen hierin bereitgestellten Beispiele und basierend
auf der bereitgestellten Offenbarung, können andere im Stand der Technik
gut bekannte Äquivalente
ebenfalls verwendet werden. Y1 und Y2 sind unabhängig voneinander ausgewählte Gruppen.
Beispiele für
Y1 und Y2 schließen H, OH,
ein Alkoxy, das bis zu 4 Kohlenstoffatome enthält, Halogen und C1-C4 Alkyl ein. Y1 und
Y2 sind bevorzugt unabhängig voneinander H, OH, F oder
OCH3. Base1 und
Base2 sind unabhängig ausgewählte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen.
Bevorzugt sind Base1 und Base2 unabhängig entweder
A, G, C, T, U oder Inosin (I). R1 und R2 repräsentieren
unabhängig
ausgewählte
Gruppen, die zusätzliche
Zucker-Phosphordiestertypgruppen, eine Peptidnukleinsäure und
Reste, die keine Sequenzinformationen enthalten, wie zum Beispiel
abasische "Nukleotide" (die ein Phosphordiesterrückgrat enthalten,
jedoch keine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe), Polymere, wie zum
Beispiel Polyethylenglykol, Polysacharide, Polypeptide, Peptide
und andere Nicht-Nukleotid-Verknüpfungen,
einschließen.
Andere Typen von Nicht-Nukleotid-Verknüpfungen sind gut bekannt (siehe
Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,585,481).
-
Derivate
der Struktur I, die eine Komponente eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls sein
können, sind
im Stand der Technik gut bekannt, wie zum Beispiel Moleküle mit einem
unterschiedlichen Zuckertyp im Rückgrat.
Zum Beispiel kann ein Basensequenz-Erkennungsmolekül Cyclobutyl-Reste
aufweisen, die durch Verknüpfungsreste
verbunden sind, wobei die Cyclobutyl-Reste heterozyklische Basen aufweisen,
die daran gebunden sind (z.B. siehe Cook et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 94/19023).
-
Ein
anderer Rückgrattyp
eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls ist eine
peptidartige Bindung, wie zum Beispiel die, die in Peptidnukleinsäuren vorhanden
ist. Die "Peptidnukleinsäure" betrifft ein DNA-Analog, in
dem das Desoxyribosephosphatrückgrat
durch ein Pseudopeptidrückgrat
ersetzt worden ist, wie bereits zuvor beschrieben von (Hyrup & Nielsen, 1996,
Bioorg. & Med.
Chem. 4:5-23; Hydig-Hielsen et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 95/32305).
Bevorzugt ist die Peptidnukleinsäure
aus N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten zusammengesetzt, wie in Struktur
II dargestellt, in der R1, R2 und
Base1 die gleichen sind, wie sie für Struktur I
artige Verbindungen beschrieben worden sind.
-
-
Basensequenz-Erkennungsmoleküle können mittels
bekannter Verfahren, wie zum Beispiel Organische Standardsyntheseverfahren
zum Erzeugen von Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden
erzeugt werden (zum Beispiel, siehe Eckstein, F., Oligonukleotides
and Analogues, a Practical Approach, Kapitel 1-5, 1991; Caruthers
et al., Meth. In Enzymol., Vol. 154, S. 287, 1987; Bhatt, U.S. Pat.
Nr. 5,252,723; Klem et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 92/07864;
Cook, PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 93/13121; Miller et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/15619;
McGee et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 94/02051; Cook et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/19023;
Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23, 1996 und Hydig-Hielsen
et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 95/32305; Ordoukhanian et al., Nuc. Acids Res. 25(19):3783-3786,
1997; Myer et al., Bioconjug. Chem. 7(4):401-412, 1996; Schultz
et al. Nuc. Acids Res. 24(15):2966-2973, 1996; Woo et al., Nuc.
Acids Res. 24(13):2470-2475, 1996; Agris et al. Biochemie 77:125-134,
1995; Berressem et al., Nuc. Acids Res. 23(17):3465-3472, 1995;
Seela et al., Nuc. Acids Res. 23(13):2499-2505, 1995; Vinayak et
al., Nuc. Acids Symp. Ser. 33:123-125, 1995; Limbach et al., Nuc.
Acids Res. 22(12):2183-2196, 1994; Gryaznov et al., Nuc. Acids Res.
20(8):1879-1882, 1992; Kawana et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 25:93-94,
1991; Pfleiderer et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 24:29-32, 1991; Wagner
et al., Nuc. Acids Res. 19(21):5965-5971, 1991; Marquez et al.,
Nuc. Acids Symp. Ser. 22:35-36, 1990; Lin et al., Nuc. Acids Res.
17(24):10373-10383, 1989; Farrance et al., Anal. Biochem. 179(1):60-65,
1989; Gildea et al., Nuc. Acids Res. 17(6):2261-2281, 1989; Yeung et al., Nuc. Acids
Res. 16(10):4539-4554, 1988; Pon et al., Nuc. Acids Res. 13(18):6447-6465,
1985; Millican et al., Nuc. Acids Res. 12(19):7435-7453, 1984; Schinazi
et al., J. Med. Chem. 21(11):1141-1146, 1978).
-
Bevorzugte
Basensequenz-Erkennungsmoleküle
schließen
unabhängig
ein: (i) ein Rückgrat,
das wenigstens eine Zucker-Phosphordiesterartige
Gruppe, wenigstens eine Peptidnukleinsäure-Gruppe, wenigstens eine
Phosphorthioat-Gruppe
oder eine Kombination davon, und (ii) unabhängig ausgewählte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen,
die mit A, G, C, T, U oder I, die mit dem Rückgrat verbunden sind, Wasserstoffbrückenbindungen
ausbilden können.
Basensequenz-Erkennungsmoleküle können Komponenten
einschließen, die
aus Desoxynukleotiden, Ribonukleotiden, 2'-Methoxy-substituierten Ribonukleotiden
oder 2'-Halo-substituierten
Ribonukleotiden ausgewählt
werden. Bevorzugt machen eine oder mehrere der in Bezug genommenen Komponenten
wenigstens etwa 70%, bevorzugt wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter
wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt etwa 100% des Basensequenz-Erkennungsmoleküls aus.
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Immobilisierung an einem
festen Träger
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Ein
Basensequenz-Erkennungsmolekül
kann durch verschiedene bekannte Mittel an verschiedene Trägertypen
angebunden werden, um eine immobilisierte Sonde zu bilden. Kovalentes
Anhängen
von Oligonukleotiden, die unter Verwendung von chemischen Standardtechniken
an einen festen Träger
synthetisiert worden sind, sind zuvor bereits beschrieben worden
(Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988; Europäische Pat.
Anm. Veröffentlichungsnr.
0444120). Besonders bevorzugte feste Träger sind magnetisch anziehbare
Partikel, die in einem Abtrennungsschritt nützlich sind, da die Partikel
zum Standort eines Reaktionsbehälters
gezogen und in Position gehalten werden können, während ungebundene Lösungskomponenten weggewaschen
werden. Magnetisch anziehbare Partikel können mittels Standardtechniken
erzeugt werden oder aus kommerziell zugänglichen Quellen bezogen werden.
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Tm und
Hybridisierungsbedingungen
-
Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung verändern die Hybridisierungsbedingungen,
um den Zeitablauf der Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes und
eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes
zu kontrollieren. Die Fähigkeit
von zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen zu hybridisieren, hängt von den
Strukturen und den umgebenden Reaktionsumfeld ab. Das Reaktionsumfeld
schließt
die Zusammensetzung der Lösung,
die zwei oder mehr Erkennungsmoleküle enthält, und die Lösungstemperatur
ein.
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Bei
einer bestimmten Assay-Zusammensetzung ist ein Hybridisationskomplex
nicht stabil, wenn die Assay-Temperatur über dem Tm des
Komplexes liegt. Lösungsfaktoren,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel die
Salzkonzentration und die Anwesenheit von denaturierenden Agenzien,
können
die Tm eines gegebenen Komplexes beeinflussen.
Zwei Basensequenz-Erkennungsmoleküle, die einen Hybridisationskomplex
ausmachen, können
konstruiert werden, damit sie Tm-Charakteristika
aufweisen, die für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung basierend auf den hierin
bereitgestellten Beschreibungen und im Stand der Technik gut bekannter
Techniken geeignet sind (z.B., siehe Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Gold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51
und 11.47-11.57, besonders in §§ 9.50-9.51,
11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57).
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Die
Hybridisationskomplexstabilität
wird durch die Länge
und den Grad der Komplementarität
zwischen den zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen, den Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen
und dem Rückgrat
des Basensequenz-Erkennungsmoleküls beeinflusst.
Zum Beispiel kann die Tm eines Komplexes, der
zwischen zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen gebildet wird, durch ein
Konstruieren der Moleküle, die
dann interne Bereiche von weniger als 100 Komplementarität zueinander
aufweisen, erniedrigt werden. Dies kann durch das Einbeziehen von
Fehlpaarungen oder Linker-Komponenten, wie zum Beispiel Nicht-Nukleotid-Linkern
und abasischen "Nukleotiden" erreicht werden.
Linker-Komponenten können
auf der gegenüberliegenden
Seite einer Base in einem gegenüberliegenden
Strang positioniert sein oder können
aus einem Strang "ausbuchten", wodurch die Komplexstabilität verringert
wird. Der Typ der Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, der auf gegenüberliegenden
Strängen
vorhanden ist, wird auch die Stabilität eines Sonden-Hybridisationskomplexes
beeinflussen. Zum Beispiel ist die G:C-Paarung stärker als
die A:T-Paarung, da die Wasserstoffbrückenbindung in G:C-Paaren im
Vergleich zu A:T-Paaren erhöht
ist.
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Die
Rückgratzusammensetzung
eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls kann
auf verschiedenen Wegen angepasst werden, um die Stabilität des Hybridisationskomplexes
zu beeinflussen. Bevorzugte Rückgrate
sind Peptidverknüpfungen,
wie zum Beispiel jene, die in einer Peptidnukleinsäure vorhanden
sind, und Zucker-Phosphordiestertyp-Verknüpfungen, wie zum Beispiel jene,
die in Ribonukleinsäuren
und Desoxyribonukleinsäuren
oder Derivaten davon vorhanden sind. Peptidnukleinsäuren bilden
im Allgemeinen einen stabileren Komplex mit RNA als mit der korrespondieren
DNA-Sequenz. Noch bevorzugter wird das Rückgrat aus Verknüpfungen
des Zucker-Phosphordiestertyps
hergestellt, in der sowohl die Zuckergruppe als auch die Verknüpfung in
Verbindung mit der Gruppe die Stabilität des Komplexes beeinflussen
können.
Zum Beispiel kann der Zuckereffekt mit 2'-Methoxy-substituierten RNA-Gruppen,
in denen ein Hybridisationskomplex, der zwischen der 2'-Methoxy-substituierten
RNA und der komplementären
2'OH-RNA gebildet wird,
im Allgemeinen stabiler ist als ein entsprechender DNA:RNA-Komplex,
verdeutlicht werden. Eine 2'-Fluor-substituierte
RNA hat im Wesentlichen den gleichen Wirkungstyp wie 2'-Methoxy-substituierte
RNA auf die Komplexstabilität.
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Eine
Verknüpfung,
die zwei Zuckergruppen verbindet, kann die Stabilität des Hybridisationskomplexes durch
Beeinflussen der allgemeinen Ladung, oder der Ladungsdichte oder
durch Beeinflussen der sterischen Assoziierung zwischen zwei Molekülkomponenten
beeinflussen. Sterische Interaktionen von großen Verknüpfungen erzeugen "Ausbuchtungen", die die Stabilität des Komplexes
verringern. Verknüpfungen
mit geladenen (z.B. Phosphorthioaten) oder neutralen (z.B. Methylphosphonaten)
Gruppen können
die Stabilität
des Komplexes beeinflussen.
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Die
Tm kann mittels Standardberechnungen vorhergesagt
werden und mittels Routinetesttechniken, die im Stand der Technik
gut bekannt sind, gemessen werden. Solche Verfahren werden zum Beispiel
beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57,
9.47-9.51 und 11.47-11.57, besonders in §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47
und 11.55-11.57), und Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842.
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Bei
der ersten Hybridisierungslösung
von bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist die Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes
um wenigstens etwa 5°C,
bevorzugt um etwa wenigstens 10°C,
noch bevorzugter um etwa wenigstens 20°C und am meisten bevorzugt um
etwa wenigstens 25°C
größer als
die Tm des immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes.
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Ändern der Hybridisierungsbedingungen
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Das
bevorzugte Verfahren zum Ändern
der Hybridisierungsbedingungen erfolgt durch Ändern der Temperatur der Hybridisierungslösung, die
Assay-Komponenten enthält.
Veränderungen
in der Temperatur können
ohne die Zugabe von Reagenzien zur Lösung einfach erzielt werden
und sind daher kompatibler bei einer Automation. Ein automatisiertes
Assay ist eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird die zweite Hybridisierungsbedingung
durch Verringern der Temperatur der ersten Hybridisierungsbedingung
um wenigstens etwa 10°C,
bevorzugt um wenigstens etwa 15°C,
noch bevorzugter um wenigstens etwa 20°C und am meisten bevorzugt um
wenigstens etwa 25°C
erzielt. Jedoch kann jedes bekannte Verfahren zum Verringern der
Stringenz einer Hybridisierungsbedingung, wie zum Beispiel durch
Erhöhen
der Ionenstärke
der Lösung
oder Verdünnen
der Lösung
mit Denaturierungsreagenzien, verwendet werden, um die zweite Hybridisierungsbedingung
zu erreichen.
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Amplifikation
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Die
Amplifikation erhöht
die Kopienanzahl des Ziel-Polynukleotids.
Die Amplifikationsbedingungen sind kompatibel mit der Nukleinsäurepolymerisation
zum Erzeugen eines Nukleinsäurestranges,
der komplementär
zu einer Nukleinsäurematrize
ist, durch Verwenden wenigstens einer Nukleinsäurepolymerase. Die Amplifikationsbedingungen
schließen
ein oder mehrere Enzyme, Amplifikationsoligonukleotide, Nukleotidtriphosphatsubstrate,
Puffer und die Inkubation bei einer geeigneten Temperatur ein. Die
spezifischen Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt und
hängen
vom Typ der verwendeten Nukleinsäureamplifikation ab.
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Enzyme
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Geeignete
Nukleinsäurepolymerasen
zum Durchführen
der Nukleinsäureamplifikationsverfahren
sind kommerziell einfach zugänglich
oder können
isoliert und gereinigt werden. Solche Polymerasen schließen zum Beispiel
die DNA-abhängigen
DNA-Polymerasen,
wie zum Beispiel Escherichia coli DNA-Polymerase I, Bazillus stearothermophilus
DNA-Polymerase I, B. caldotenex DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase
und die Taq Polymerase ein. Andere geeignete Enzyme sind DNA-abhängige RNA-Polymerasen, wie
zum Beispiel die T7 RNA-Polymerase, die T3 RNA-Polymerase und die
SP6 RNA-Polymerase. Geeignete Enzyme schließen auch RNA-abhängige DNA-Polymerasen,
wie zum Beispiel die Avian Myeloblastosis Virus (AMV) reverse Transkriptase
und die Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse Transkriptase
ein. Die Amplifikation kann auch durch Verwendung von Replikasen
(z.B. Qβ-Replikase),
Ligasen (z.B., E. coli DNA-Ligase
und T4 DNA-Ligase) oder Kombinationen von Enzymen durchgeführt werden.
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Amplifikationsoligonukleotide
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"Amplifikationsoligonukleotide" sind Oligonukleotide,
die mit einer Ziel-Nukleinsäure,
oder seinem Komplement hybridisieren und an einer Amplifikationsreaktion
teilnehmen. Beispiele für
Amplifikationsoligonukleotide schließen Primer und Promotor-Primer
ein.
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Die
Auswahl von Amplifikationsoligonukleotiden hängt vom verwendeten Amplifikationsverfahren
und der zu amplifizierenden Nukleinsäure ab. Ein bestimmtes Amplifikationsoligonukleotid
kann abhängig
von der Sequenz der gewünschten
Ziel-Nukleinsäure
und dem vom Praktiker der vorliegenden Erfindung gewählten Amplifikationsverfahren
durch einen Fachmann einfach entworfen und synthetisiert werden.
Beispiele für
allgemein verwendete Amplifikationsoligonukleotide schließen solche
ein, die analog oder komplementär
zu einer Nukleotidbasensequenz sind und die optional Nukleinsäuresequenzbereiche
enthalten, die zur Ziel-Nukleinsäure nicht
komplementär
sind. Zum Beispiel kann ein Amplifikationsoligonukleotid eine Promotorsequenz enthalten,
die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder eine Basensequenz,
die durch eine Replikase erkannt wird.
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Ein
analoges Amplifikationsoligonukleotid schließt einen Bereich ein, der mit
einer Nukleinsäure
hybridisieren kann, die völlig
komplementär
zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäure ist (z.B. eine cDNA, wenn
die Ziel-Nukleinsäure
eine RNA ist). Das analoge Oligonukleotid kann mit der komplementären Nukleinsäure in einer
Position hybridisieren, die nahe dem 3' Ende der komplementären Ziel-Sequenz lokalisiert
ist. Das analoge Oligonukleotid kann auch einen nicht-komplementären Bereich,
wie z.B. einen Promotorsequenzbereich, und/oder eine oder mehrere
Modifikationen, wie z.B. eine Modifikation, die die Aktivität der Nukleinsäurepolymerase
inhibiert, enthalten. Bevorzugt enthält das analoge Oligonukleotid
wenigstens etwa 10 nebeneinander liegende Basen und noch bevorzugter
wenigstens etwa 12 nebeneinander liegende Basen, die komplementär zur Nukleinsäure sind,
die völlig
komplementär
zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäure ist. Die nebeneinander liegenden
Basen sind bevorzugt zu wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter zu
wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt zu etwa 100% komplementär zu einem
Bereich der Ziel-Nukleinsäuresequenz.
Das analoge Oligonukleotid ist bevorzugt etwa 12 bis 60 Nukleotidbasen
lang und kann gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbasen einschließen.
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Ein
zur Matrize komplementäres
Amplifikationsoligonukleotid weist einen Bereich auf, der mit der Ziel-Nukleinsäure in einer
Position, die am 3' der
Ziel-Sequenz lokalisiert ist, hybridisieren kann. Das zur Matrize
komplementäre
Oligonukleotid kann einen nicht-komplementären Bereich, wie zum Beispiel
einen 5' Promotorbereich,
enthalten. Bevorzugt enthält
das zum Ziel komplementäre
Oligonukleotid wenigstens etwa 10 nebeneinander liegende Basen und
noch bevorzugter wenigstens etwa 12 nebeneinander liegende Basen,
die komplementär
zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäuresequenz sind. Die nebeneinander
liegenden Basen sind bevorzugt zu wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter
zu wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt zu etwa 100 komplementär mit einem
Bereich der Ziel-Sequenz. Das zur Matrize komplementäre Oligonukleotid ist
bevorzugt 12 bis 60 Basen lang und kann gegebenenfalls modifizierte
Nukleotide einschließen.
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Ein "Primer" betrifft ein optional
modifiziertes Oligonukleotid, das mit einer Matrize hybridisieren
kann und das ein 3' Ende
aufweist, das in einer bekannten Polymerisationsreaktion wirksam
verlängert
werden kann. Der 5' Bereich
des Primers kann nicht-komplementär zur Ziel-Nukleinsäure sein. Wenn der 5' nicht-komplementäre Bereich
eine Promotorsequenz einschließt,
wird er als "Promotor-Primer" bezeichnet. Ein
Primer oder Promotor-Primer kann analog oder komplementär zu einer
Ziel-Nukleinsäure
sein.
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Transkriptionsgebundene
Amplifikation
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Die
transkriptionsgebundene Amplifikation verwendet eine RNA-Polymerase,
um mehrere RNA-Transkripte ausgehend von einer Nukleinsäurematrize
zu erzeugen. Die transkriptionsgebundene Amplifikation verwendet
im Allgemeinen eine RNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate
und ein zur Promotor-Matrize komplementäres Oligonukleotid. Häufig wird
auch ein analoges Oligonukleotid verwendet.
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Unterschiedliche
Variationen transkriptionsgebundener Amplifikationen sind im Stand
der Technik gut bekannt. Beispiele für unterschiedliche Variationen,
die unterschiedliche Reaktionsbedingungen und unterschiedliche Anzahlen
und Typen von Amplifikationsoligonukleotiden verwenden, werden im
Detail beschrieben von Burg et al., U.S. Pat. Nr. 5,437,990; Kacian
et al., U.S. Pat. Nr. 5,399,491 und 5,554,516; Kacian et al., PCT
Int. Veröffentlichungsnr.
93/22461; Gingeras et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 88/01302;
Gingeras et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 88/10315; Malek et al., U.S. Pat. Nr. 5,130,238; Urdea et al.,
U.S. Pat. Nr. 4,868,105 und 5,124,246; McDonough et al., PCT Int.
Veröffentlichungsnr.
WO 94/03472 und Ryder et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 95/03430.
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Kurz
dargestellt, im Allgemeinen verwendet eine transkriptionsgebundene
Amplifikation ein zur Promotor-Matrize komplementäres Oligonukleotid,
das einen 5' Basensequenzbereich
enthält,
der, wenn er doppelsträngig
erzeugt wird, durch eine RNA-Polymerase (in 2 mit "P" markiert) erkannt wird, und einen 3' Sequenzbereich,
der mit einer Nukleinsäurematrize
in einem Punkt 3' von
einer Ziel-Sequenz
(wie in 2 dargestellt) hybridisieren
kann. Nach der Hybridisation des zur Promotor-Matrize komplementären Oligonukleotids
und der Matrize, wird ein doppelsträngiger Promotor stromaufwärts der
Matrize gebildet. Der doppelsträngige
Promotor kann durch eine Polymerasevermittelte Primerverlängerung
des zur Promotor-Matrize komplementären Oligonukleotids gebildet
werden, um einen Zielkomplementären
Strang (2) zu erzeugen, gefolgt von
einer Hybridisierung eines analogen Oligonukleotids (z.B. Primer
24 in 2) und einer Primerverlängerung
des analogen Oligonukleotids (siehe 2).
Andere bekannte Techniken sind für
das Bilden eines doppelsträngigen
Promotors geeignet, wie zum Beispiel solche, die eine Primerverlängerung
der Ziel-Nukleinsäure einschließen.
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Die
transkriptionsgebundene Amplifikation schreitet mit der Bindung
eines Enzyms mit RNA-Polymeraseaktivität in einem Promotorbereich
und der Synthese von einzelsträngigen
RNA-Transkripten
in einer 5' bis
3' Richtung (siehe 2) voran. Multiple RNA-Transkripte (z.B.,
etwa 100 bis 3000) können
durch transkriptionsgebundene Amplifikation mittels einer einzelnen
Matrize (z.B., durch Wiederholen von 2,
C bis F) erzeugt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren,
das eine RNase H Aktivität
verwendet, für
die Ziel-Amplifikation verwendet. Dies erzeugt große Mengen
einzelsträngiger
amplifizierter Nukleinsäure
bei einer im Wesentlichen konstanten Reaktionsbedingung. Noch bevorzugter
wird die RNase H Aktivität
durch eine reverse Transkriptase bereitgestellt.
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Andere Amplifikationsverfahren
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Andere
gut bekannte Amplifikationsverfahren können im Amplifikationsschritt
der Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich der
Replikase-vermittelten Amplifikation, der Polymerasekettenreaktion (PCR)
und der Ligase-Kettenreaktion (LCR) verwendet werden. Die Replikasevermittelte
Amplifikation verwendet selbst replizierende RNA-Moleküle und eine Replikase, wie
zum Beispiel die Qβ-Replikase
(z.B., siehe Kramer et al., U.S. Pat. Nr. 4,786,600; PCT Int. Veröffentlichungsnr.
WO 90/14439). Die PCR Amplifikation ist gut bekannt und verwendet
die DNA-Polymerase, Primer und den Wärmewechsel, um mehrere Kopien
der zwei komplementären
Stränge
der DNA oder cDNA zu synthetisieren (z.B., siehe Mullis et al.,
U.S. Pat. Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159; Methods in Enzymology,
1987, Vol.155:335-350). Die LCR verwendet wenigstens vier separate
Oligonukleotide, um ein Ziel und seinen komplementären Strang
zu amplifizieren, indem mehrere Zyklen der Hybridisierung, Ligation
und Denaturierung verwendet werden (siehe Europäische Pat. Anm. Veröffentlichungsnr.
0 320 308).
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Detektion des Ziel-Polynukleotids
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Die
Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids kann mittels verschiedener Techniken,
die eine Detektionssonde verwenden und/oder eine amplifizierte Nukleinsäure detektieren,
detektiert werden. Das Ziel-Polynukleotid wird bevorzugt mittels
einer markierten Sonde detektiert, die mit dem Ziel-Polynukleotid oder
mit einem Amplifikationsprodukt des Ziel-Polynukleotids, besonders eine amplifizierte
Nukleinsäure,
die zum Ziel-Polynukleotid komplementär ist, hybridisiert.
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Markierte
Sonden können
verschiedene Markertypen enthalten und verschiedene Techniken können verwendet
werden, um den Marker zu detektieren. Zum Beispiel enthalten gut
bekannte Sonden Radioisotope, Fluoreszenzreste, chemilumineszierende
Reste und katalytische Gruppen (z.B. ein Enzym, das an einer Reaktion
teilnimmt, die zu einer Farbveränderung
führt).
Beispiele für
das Erzeugen und/oder Verwenden von solchen markierten Sonden werden
im Detail beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; Nelson et al., U.S. Pat.
Nr. 5,658,737; Woodhead et al., U.S. Pat. Nr. 5,656,207; Hogan et
al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842; Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174;
Kourilsky et al., U.S. Pat. Nr. 4,581,333 und Becker et al., Europäische Pat.
Anm. Veröffentlichungsnr.
0 747 706.
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Markierte
Sonden können
mit einem Ziel-Polynukleotid, einer amplifizierten Nukleinsäure oder
einem intermediären
Molekül,
das direkt oder indirekt mit dem Ziel-Polynukleotid oder der amplifizierten
Nukleinsäure hybridisiert
ist, hybridisiert sein. Die indirekte Hybridisierung kann durch
Verwenden mehrerer intermediärer Moleküle, die
miteinander hybridisiert sind, erreicht werden.
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Die
amplifizierte Nukleinsäure
kann mittels einer markierten Sonde oder mittels anderer gut bekannter Verfahren
zum Detektieren von Nukleinsäure
detektiert werden. Zum Beispiel kann die amplifizierte Nukleinsäure während der
Amplifizierung durch Verwenden markierter Vorstufen oder nach der
Amplifikation mittels fluoreszierender interkalierender Agenzien
(z.B. Ethidiumbromid) markiert werden. Die markierte amplifizierte Nukleinsäure kann
mittels gut bekannter Verfahren, wie zum Beispiel der Gelfiltration,
der Gelelektrophorese und der HPLC detektiert werden.
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Die
folgenden Beispiele illustrieren einige bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, obwohl der Fachmann erkennen wird, dass
andere Reagenzien und Reaktionsbedingungen verwendet werden können, um
die Verfahren der vorliegenden Erfindung vergleichbar zu praktizieren.
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Beispiel 1: Anpassen der
Tm durch Variieren der Komplementaritätslänge
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Ein
Verfahren zum Anpassen der Tm eines Hybridisationskomplexes
ist es, die Länge
der Komplementarität
zwischen zwei Nukleinsäuren,
aus denen der Komplex zusammengesetzt ist, zu variieren. Dieses
Beispiel illustriert die Veränderung
der Tm infolge von Unterschieden in der
Länge der
Komplementarität
in einem Komplex.
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Hybride
wurden zwischen einem ersten und zweiten Oligonukleotidstrang gebildet.
Der erste Strang war ein Homopolymer von 40 Desoxythymidinen (dT40) und der zweite Strang war ein Homopolymer
von Desoxyadenosinen variierender Größer (dAn).
Diese Oligonukleotide wurden mittels Standardnukleinsäuresyntheseverfahren
synthetisiert.
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Beide
Stränge
(von jedem 350 pmol) wurden in einem 40 μl Volumen, das 20 μl eines 2X
Hybridisierungspuffers (200 mM Lithium Succinat (pH 5,1-5,2), 17%
Lithiumlaurylsulfat (LLS) 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
und 3 mM Ehtylenglykol-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA))
enthält,
gemischt und bei 55°C für 30 Minuten
erhitzt. Dann wurde jeder Komplex mit 1 × Hybridisierungspuffer (d.h.
die Hälfte
der Konzentration des 2X Hybridisierungspuffers) auf 300 μl verdünnt.
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In
dieser Lösung
wurde die Tm durch Detektieren einer hyperchromatischen
Verschiebung detektiert. Kurz dargestellt, wurde das Absorptionsvermögen bei
260 nm während
der inkrementellen Veränderungen
der Temperatur der Reaktionsmischung gemessen und eine Verschiebung
des Absorptionsvermögens
der Lösung wurde über den
Temperaturbereich hin detektiert. Die Tm ist
die Temperatur am Mittelpunkt der Verschiebung des Absorptionsvermögens. Tabelle
1 zeigt die Ergebnisse der Hybridisationskomplexe, in denen die
dAn-Länge über einem
Bereich von dA10 bis dA40 variierte.
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Wie
man anhand dieser Ergebnisse sehen kann, erhöht sich auch die Tm des
Komplexes, wenn die Länge
der Komplementarität
erhöht
wird. Die längeren
Hybridisationskomplexe (z.B. dA30:dT40) tendierten dazu, relativ breite Verschiebungen
des Absorptionsvermögens
aufzuweisen, da es aufgrund der Staffelung der Paarung (z.B. 30-mer,
29-mer, 28-mer Paarung usw.) viele mögliche Typen von Hybridisationskomplexen
in der Mischung gibt. Die Kombinationen von Homopolymeren, die zu
kürzeren
Hybridisationskomplexen führten (z.B.
dA15:dT40, das einen
Komplex bis zu 15-mer bilden kann) hatte eine Tm von
unter etwa 60°C.
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Diese
Eigenschaft wurde durch Inkubieren von 100 μg einer immobilisierten Poly-dT14 oder dT30-Sonde,
die an magnetische Kügelchen
gebunden war, mit 2,5 pmol einer 32P-markierten
dT30-Fänger-Sonde
in Lösung
weiter untersucht. Die Reaktanten wurden in einem Hybridisierungspuffer
(3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 17% LLS, 190 mM Bernsteinsäure, 250
mM Lithiumhydroxid, pH 5,1 ± 0,1)
für 30
min bei entweder 60°C
oder Raumtemperatur (etwa 25°C)
in fünf
Wiederholungen für
jede Hybridisierungsbedingung inkubiert. Bei Raumtemperatur lagen
die durchschnittlichen Prozentzahlen der markierten dA30-Sonden, die mit den
dT14 und dT30-Sonden
hybridisierten bei 90% bzw. 88%, wohingegen bei 60°C der durchschnittliche
Prozentsatz der markierten dA30-Sonden,
die mit den dT14 und dT30-Sonden
hybridisiert waren bei 61% bzw. 1% lagen.
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Diese
Hybridisierungscharakteristika nutzte man in einem Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay,
in dem die immobilisierte Sonde bei den Hybridisierungsbedingungen
bei zwei unterschiedlichen Temperaturen, wie es im nachfolgenden
Beispiel verdeutlicht wird, vorhanden war.
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Beispiel 2: Zwei-Schritt-Hybridisierung
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Dieses
Beispiel illustriert das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren mittels Zwei-Schritt-Hybridisierungstemperaturen,
um das Fangen des Ziel-Polynukleotids
zu erreichen. Bei einer Assaybedingung lagen die Fänger-Sonde,
das Ziel-Polynukleotid und die immobilisierte Sonde gleichzeitig
in der Beimischung während beider
Hybridisierungsbedingungen vor. In einem anderen Assay wurde die
immbolisierte Sonde nach der Hybridisierung der Fänger-Sonde
mit dem Ziel-Polynukleotid bei der ersten Hybridisierungsbedingung
beigegeben. Das gleichzeitige Beimengen des ersten Assays ist vorteilhaft,
da es weniger Reagenzzugabeschritte erfordert, jedoch führte die
separate Zugabe der immobilisierten Sonde im Allgemeinen zu einem
zweifach höheren
Signal als das, was bei der Zwei-Schritt-Hybridisierung, die bei gleichzeitiger
Beimengung durchgeführt wurde,
beobachtet werden konnte.
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Das
Fänger-Sonde
Oligonukleotid und das Acridiniumester (AE)-markierte Ziel-Polynukleotid
wurden mittels Standardtechniken synthetisiert und detektiert. Solche
Techniken sind im Stand der Technik bekannt, wie es von Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel
10; Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737; Woodhead et al., U.S.
Pat. Nr. 5,656,207; Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842; und Arnold
et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174 beschrieben wird.
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Die
Fänger-Sonde
(1,25 pmol) und das AE-markierte Ziel-Polynukleotid wurden anfänglich mit
oder ohne 100 μg
einer Poly-T immobilisierten Sonde, die an Seradyn magnetische Kügelchen
gebunden war, für 30
min bei 60°C
in 1 × Hybridisierungspuffer
(siehe Beispiel 1) inkubiert, und dann wechselte man für 30 min auf
Raumtemperatur. Für
Proben, die bei 60°C
ohne die an die Kügelchen
gebundene immobilisierte Sonde inkubiert wurden, wurde dieser Bestandteil
(in 50 μl
1 × Hybridisierungspuffer)
zu Beginn der zweiten Inkubation zugegeben. Die Volumina beider
Proben wurden durch Zugabe von 50 μl 1 × Hybridisierungspuffer zum Assay,
das bereits die immobilisierte Sonde enthielt, gleichgehalten. Die
immobilisierte Sonde war ein Homopolymer aus dT14 oder
dT30, die an den festen Träger, der
aus Magnetkügelchen
bestand, gebunden war. Die Fänger-Sonde
war ein Polynukleotid, das eine Basensequenz-Komplementarität mit einer
Sequenz im Ziel-Polynukleotid
(eine Neisseria gonorrhoeae 16S rRNA-Sequenz) und einen Poly-A-Schwanz
aus dA15 oder dA30 aufwies.
Die Ziel-Sequenz
war AE-markierte N. gonorrhoeae 16S rRNA. Bei Verwendung dieser
Kombination wurde ein immobilisierter Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
durch Hybridisierung der Ziel-Sequenz mit der komplementären Ziel-Sequenz der Fänger-Sonde
während
der ersten Hybridisierung bei 60°C und
der Hybridisierung des dA-Bereiches der Fänger-Sonde mit dem dT-Bereich
der immobilisierten Sonde während
der zweiten Hybridisierung bei Raumtemperatur gebildet.
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Das
eingefangene AE-markierte Ziel-Polynukleotid wurde durch Einwirken
eines magnetischen Feldes, das die Kügelchen mit der immobilisierten
Sonde an einen Ort im Reaktionsbehälter zieht und anschließendem zweimaligem
Waschen mit dem Bindungspuffer (50 mM Lithiumsuccinat, 100 mM LiCl,
1,5% LLS, 1,5 mM EDTA, 1,5 mM EGTA, pH 5,2) gereinigt. Die Kügelchen
wurden resuspendiert und das gefangene Ziel-Polynukleotid wurde durch Messen der
Chemilumineszenz, die von dem AE-Marker erzeugt wurde, detektiert. Die
Chemilumineszenz wurde in relativen Lichteinheiten (RLU) mittels
Techniken, die im Wesentlichen dem bereits zuvor beschriebenen entsprachen
(Arnold et al., Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989); Nelson et
al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737) detektiert. Die RLU Ergebnisse werden
in Tabelle 2 dargestellt und stellen Mittelwerte in dreifach getesteten
Proben dar. Tabelle
2
- 1repräsentiert
das Fangen von 62% des markierten Ziels
- 2repräsentiert das Fangen von 67%
des markierten Ziels
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Die
Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen, dass eine Zwei-Schritt-Hybridisierung verwendet werden
kann, um das Ziel-Polynukleotid
mittels einer Fänger-Sonde
und einer immobilisierten Sonde, die beide während beider Hybridisierungen
in der Reaktionsmischung vorhanden sind oder vor der zweiten Hybridisierung
zugegeben werden, effektiv zu fangen. Daher kann dieses Verfahren
zum Fangen des Ziels führen,
wenn alle Reagenzien während
beider Hybridisierungen gleichzeitig vorhanden sind, wodurch weniger
Reagenzzugabeschritte erforderlich sind. Die Ergebnisse der Tabelle
2 zeigen auch, dass relativ kurze komplementäre Sequenzen (dT14 und
dA15) für
das Fangen des Ziels im immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
effektiv waren. Die Verwendung der 14-mer immobilisierten Sonde
ergab im Wesentlichen das gleiche Signal, egal ob die immobilisierte
Sonde bei der zweiten Hybridisierung zugegeben wurde oder während beider Hybridisierungen
vorhanden war. Ein kürzeres
immobilisiertes Sonden-Homopolymer erschien vorteilhafter als ein
kürzeres
Fänger-Sonde-Homopolymer,
wie anhand des höheren
Signals deutlich wird, das mit der dT14:dA30-Kombination
im Vergleich zur dT30:dA15-Kombination
erhalten wurde.
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Beispiel 3: Zwei-Schritt-Hybridisierung
mit amplifizierter Ziel-Sequenz
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Dieses
Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, um ein Mycobacterium tuberculosis
Ziel-Polynukleotid,
das in einer klinischen Probe vorhanden ist, zu detektieren. Das
Assay ist auch in der Lage, andere Mycobacterium Spezies (d.h.,
M. bovis, M. simiae und M. africanum, die häufig kollektiv als M. tuberculosis-Komplex
bezeichnet werden) zu detektieren, wird jedoch, aufgrund der Einfachheit,
hierin in Bezug auf M. tuberculosis beschrieben.
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Das
Basisprotokoll enthielt die folgenden Schritte. Ein Lysat der Probe
wurde durch Zugabe einer klinischen Probe (z.B. 500 μl des Sediments
vom Sputum, der bronchoalveolaren Spülung oder von Bronchialwaschungen)
zum gleichen Volumen eines Lysepuffers (2,2 M LiCl, 250 mM HEPES-Puffer,
pH 7,5, der 4% (w/v) LLS enthält)
vorbereitet und die Organismen im Lysat wurden durch Hitze abgetötet (95°C für 15 min). Wenn
M. tuberculosis in der klinischen Probe vorhanden ist, wird ein
Ziel-Polynukleotid (z.B. rRNA-Sequenz), die von M. tuberculosis
stammt, im Lysat vorhanden sein. Ein Aliquot (250 μl) des Lysats
wurde mit dem gleichen Volumen einer Lösung vermischt, die die für die M.
tuberculosis Ziel-Sequenz spezifische Fänger-Sonde und eine immobilisierte
Sonde, die an einem festen Träger
gebunden ist, enthält.
Die Fänger-Sonde
war ein 58-Basen Oligonukleotid, das eine 5' 15-Basensequenz, die zu einer M. tuberculosis
rRNA-Sequenz komplementär
ist, eine interne T3 und einen 3' dA40-Schwanz
enthält.
Die immobilisierte Sonde war eine Poly-dT14-Sequenz,
die mittels Carbodiimidchemie (im Wesentlichen wie bereits zuvor
von Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988 beschrieben)
an einen festen Träger
aus magnetischen Partikeln (0,7-1,05 μ Partikel, Seradyn, Indianapolis,
IN) gebunden worden ist. In diesem Assay wurden 5 pmol der Fänger-Sonde
und 50 μg
der immobilisierten Sondenpartikel pro Reaktion verwendet. Die Mischung
wurde sukzessive bei zwei verschiedenen Temperaturen (60°C für 20 min
und 25°C
für 15
min) inkubiert. Bei der ersten Temperatur hybridisierte die M. tuberculosiskomplementäre Sequenz
der Fänger-Sonde
mit der Ziel-Sequenz, da die Tm dieses Hybridisationskomplexes
größer ist
als 60°C,
und bei der zweiten Temperatur hybridisierte die homopolymere immobilisierte
Sonde mit dem komplementären
homopolymeren Bereich der Fänger-Sonde,
da die Tm des dA:dT-Komplexes bei weniger
als etwa 50°C
liegt. Beiden Inkubationen nachfolgend wurden die Magnetkügelchen
mittels eines magnetischen Feldes, so wie es im Wesentlichen in
Beispiel 2 beschrieben wurde, aus den Lösungen abgetrennt. Wenn M.
tuberculosis in der Probe vorhanden war, befanden sich an diesen
magnetischen Kügelchen
ein Hybridisationskomplex, der aus dem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid
besteht. Wenn M. tuberculosis in der Probe nicht vorhanden war,
befand sich an den Kügelchen
ein Hybridisationskomplex, der aus der immobilisierten Sonde und
der Fänger-Sonde
besteht. Die Kügelchen
wurden zweimal durch Resuspendieren der Kügelchen im Puffer mit 1 ml
des Waschpuffers pro Waschung und anschließendem Wiederholen des magnetischen
Abtrennungsschrittes gewaschen. Gewaschene Kügelchen wurden dann in 75 μl einer Nukleinsäure-Amplifikations-Reagenzlösung zur
transkriptionsgebundenen Amplifikation mittels Verfahren, die im
Wesentlichen wie bei Kacian et al., U.S. Pat. Nr. 5,399,491 und
5,554,516 beschrieben wurden, resuspendiert. Die Kügelchen
und 15 pmol jedes einzelnen Primers, der für das M. tuberculosis Ziel-Polynukleotid
spezifisch ist, wurden in einer Reaktionsmischung (40 mM Trizma-Base
pH 7,5, 17,5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5% Polyvinylpyrrolidon
(PVP), 1 mM jedes dNTPs, 4 mM jedes rNTPs), die mit einer Schicht
(200 μl)
aus einem inerten Öl
bedeckt wurde, um die Verdampfung zu verhindern, bei 60°C für 10-15
min und dann bei 41,5-42°C
für 5 min
inkubiert. Die reverse Transkriptase (etwa 750 Einheiten und etwa 2000
Einheiten der T7 RNA-Polymerase in 25 μl) wurde pro Reaktion zugegeben,
vermischt, und die Amplifikation des Ziel-Polynukleotids bei 41,5-42°C für 2 h fortgesetzt.
Amplifizierte M. tuberculosis Ziel-Sequenzen wurden mittels einer
AE-markierten Sonde detektiert, die durch Chemilumineszenz detektiert
wurde, und in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt, wie
es im Wesentlichen bereits vorher beschrieben wurde (U.S. Pat. Nr.
5,658,737 in Spalte 25, Zeilen 27-46; Nelson et al., 1996, Biochem.
35:8429-8438 bei 8432). Für
jedes Assay wurde eine negative Kontrolle, die aus allen gleichen
Reagenzien, jedoch durch gleiche Volumen negativen Sputums als Probe
ersetzt, bestand, und eine positive Kontrolle, die aus allen gleichen
Reagenzien, jedoch 50 μl
extrahierter gesamtzellulärer
M. tuberculosis RNA (enthielt etwa 2000 Kopien rRNA) anstelle der Probe,
bestand, erstellt. Die Proben wurden für jedes Assay zweifach getestet
(RLU Nr. 1 und RLU Nr. 2 in Tabelle 3).
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Die
Ergebnisse dieses Assays, die bei 15 klinischen Proben, die unabhängig positiv
auf die Anwesenheit von M. tuberculosis bestimmt worden sind (basierend
auf den standardklinischen Abstrichanalysen und/oder BACTEC Kulturlösungsergebnissen),
werden in Tabelle 3 dargestellt.
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Wie
anhand der Ergebnisse in Tabelle 3 deutlich wird, wurden alle Proben,
die für
M. tuberculosis basierend auf wenigstens einem klinischen Assayergebnis
positiv waren, im Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay relativ zur
Negativkontrolle positiv getestet. Positiv-Ergebnisse basierten
auf Proben mit einer RLU Auslesung, die um wenigstens etwa 10-fach
größer ist
als die einer Negativkontrolle. Für die meisten Proben basierte
das Positiv-Ergebnis auf einer RLU Auslesung, die wenigstens etwa
100-fach größer war
als die einer Negativkontrolle. Im Allgemeinen war die Chemilumineszenz
die auf das M. tuberculosis Ziel-Polynukleotid in der Probe hinwies
um etwa 1000-fach größer als
die, die in der Negativ-Kontrolle
detektiert wurde und im Wesentlichen gleich oder größer als
die der Positiv-Kontrolle.
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Beispiel 4: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
zum Detektieren variierender Niveaus eines Neisseria gonorrhoeae-Ziels
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Dieses
Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, um weniger als 5 fg eines Ziel-Polynukleotids,
das auf eine bakterielle Infektion hinweist, zu detektieren. Das
Ziel-Polynukleotid war eine rRNA-Sequenz, die für N. gonorrhoeae spezifisch
war (Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,541,308; Nelson et al., 1996,
Biochem. 35:8429-8438). Darüber
hinaus waren die Ergebnisse mit kleineren Variationen reproduzierbar,
wenn die Proben über
eine dreitägige
Periode bei 0-4°C
gelagert wurden und am 1., 2. und 3. Tag untersucht wurden. Die
5 fg und 50 fg Mengen des untersuchten N, gonorrhoeae-Ziel-Polynukleotids
entsprachen der rRNA, die in 1 Zelle bzw. 10 Zellen vorhanden war.
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Das
verwendete Basisprotokoll schließt die folgenden Schritte ein.
Für jede
untersuchte Probe wurden 20 μl
einer wässrigen
Lösung
von entweder 0 fg (Negativkontrolle), 5 fg oder 50 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids
in 400 μl
Wasser mit 400 μl
einer synthetischen Urinkontrolle (KOVATROLTM;
Hycor Biomedical, Inc.) und 200 μl
eines Ziel-Fänger-Puffers
(TCB; bestehend aus 2,2 M LiCl, 250 mM HEPES-Puffer, pH 7,5), der ein Fänger-Oligonukleotid
(6,25 nM) mit einer Sequenzkomplementarität zum N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid, und
eine dT3dA30-Sequenz
enthält,
vermischt. Eine immobilisierte dT14-Sonde,
die an magnetische Partikel als feste Träger gebunden ist, wurde zu
100 μg/ml
gegeben und die Mischung wurde sukzessive bei zwei verschiedenen
Temperaturen (60°C
für 20
min und 25°C
für 15
min) inkubiert. Bei der ersten Temperatur hybridisierten die Fänger-Sonde
und das Ziel-Polynukleotid, da die Tm des
Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes
größer ist
als 60°C,
und bei der zweiten Temperatur hybridisierten die immobilisierte
Sonde und der Poly-dA-Abschnitt der Fänger-Sonde, da die Tm des dA:dT-Komplexes geringer ist als etwa 52°C. Nach der
Inkubation sind die magnetischen Kügelchen mittels eines magnetischen
Feldes, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben, abgetrennt
worden. Für
Proben, die das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid enthielten, haben
die magnetischen Kügelchen
den immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex
angebunden, wohingegen für
die Negativ-Kontrollproben die Kügelchen
die immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde
gebunden haben. Dann wurden die Kügelchen, im Wesentlichen wie
in Beispiel 3 beschrieben, zweimal gewaschen und die gewaschenen
Kügelchen
wurden in 75 μl
eines Nukleinsäureamplifkationsreagenzes
resuspendiert und im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben
mittels eines Primers, der für
das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, amplifiziert.
Nach der Amplifikation wurden die amplifizierten Ziel-Sequenzen
mittels einer AE-markierten Sonde, die mittels eines Chemilumineszenzassays,
wie in Beispiel 3 beschrieben, detektiert wurde, detektiert, und
das Signal wurde in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt. Für die Assays
der einzelnen Tage wurden die Hintergrund RLU der Negativ-Kontrollen und der
Positiv-Kontrollen auf die gleiche Weise mittels der gleichen Reagenzien
bestimmt. Die Ergebnisse der Assays sind in Tabelle 4 dargestellt,
einschließlich
der RLU-Ergebnisse
für jede
experimentelle Probe und die Mittelwerte von zwei Positiv-Kontrollen
und zehn Negativ-Kontrollen, die für jeden Tag erhalten wurden.
Die Hintergrund (Durchschnitt für
zwei Proben)-Werte lagen bei 6,81 × 102,
1,18 × 103 und 6,61 × 102 RLU
für die
Tage 1, 2 bzw. 3.
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Die
in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
weniger als 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids reproduzierbar
detektieren kann, wobei die erzeugte Chemilumineszenz signifikant über der
von Proben liegt, die kein Ziel-Polynukleotid enthalten, die unter
den gleichen Bedingungen getestet wurden. Darüber hinaus, wenn die Proben
gelagert wurden und wiederholt mittels des Verfahrens über einen
Zeitraum von 3 Tagen getestet wurden, ergab sich eine gute Reproduzierbarkeit
der Ergebnisse über
den gesamten Zeitraum. Die Ergebnisse zeigen auch eine gute von
Probe-zu-Probe-Reproduzierbarkeit über den drei Tageszeitraum.
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Beispiel 5: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
zum Detektieren von Bakterien in klinischen Urinproben
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Dieses
Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, um ein Ziel zu detektieren, das
für eine
bakterielle Infektion bei Verwendung von klinischen Urinproben Indikativ
ist. Das Ziel-Polynukleotid war eine Sequenz, die für Chlamydia
trachomatis spezifisch ist. Die Proben sind unabhängig voneinander
mittels eines PCR-basierten Assays auf C. trachomatis getestet worden,
und die Ergebnisse, die mit dem Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren
erhalten wurden, sind mit denen verglichen worden, die mit dem PCR-basierten
Assay erhalten wurden. Die Urinproben wurden bei Verwendung des
Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahrens doppelt getestet, wobei die
Proben in zufälliger
Reihenfolge relativ zu ihrer Klassifizierung (positiv oder negativ)
bezogen auf den PCR-basierenden
Assayergebnissen angeordnet wurden.
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Kurz
gesagt, sah das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassayprotokoll
wie folgt aus. Jedes Reaktionsröhrchen
enthielt 200 μl
TCB (wie in Beispiel 4 definiert), der 6,25 pmol eines Fänger-Oligonukleotids
mit einer Sequenzkomplementarität
zum C. trachomatis Ziel-Polynukleotid
und einer dT3dA30-Sequenz
aufwies, zu dem 800 μl der
vorbereiteten Urinprobe (400 μl
Urin plus 400 μl
TM-Puffer (100 mM (NH4)2SO4, 50 mM Hepes, pH 7,5, 8% LLS)) oder 800 μl an Kontrollen
(als Negativ-Kontrollen wurden benutzt 400 μl KOVATROLTM plus
400 μl TM-Puffer;
als Positiv-Kontrollen wurden benutzt 400 μl KOVATROLTM plus
400 μl TM-Puffer,
der 5 fg von C. trachomatis gesamtzellulärer RNA (d.h. rRNA-Ziel-Polynukleotid enthält) zugegeben
wurden. Die Röhrchen wurden
versiegelt, vermischt und bei 60°C
für 30
min inkubiert und dann bei 40°C
für 30
min. Die Röhrchen wurden
dann einem Magnetfeld ausgesetzt, und die magnetischen Kügelchen
mit der immobilisierten Sonde wurden von der Lösung abgetrennt und die immobilisierten
Komponenten wurden zweimal gewaschen, im Wesentlichen wie in Beispiel
2 beschrieben. Bei 60°C
hybridisierte die Fänger-Sonde
und das C. trachomatis Ziel-Polynukleotid,
weil die Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes größer ist
als 60°C,
und bei der zweiten Temperatur hybridisierte die Poly-dT-Sonde und
der Poly-A-Abschnitt der Fänger-Sonde,
da die Tm des dA:dT-Komplexes geringer ist
als etwa 52°C.
Das Ziel-Polynukleotid wurde mittels eines Primers, der für die C.
trachomatis Ziel-Sequenz spezifisch ist, und Reagenzien für die transkriptionsgebundene
Amplifikation, die in einem Volumen von 75 μl, im Wesentlichen wie in Beispiel
3 beschrieben, amplifiziert, mit der Ausnahme, dass die Amplifikation
für 1 h
stattfand. Die AE-markierte Sonde, die für die C. trachomatis Ziel-Sequenz
spezifisch ist, wurde zugegeben (in 100 μl), vermischt und die Mischung
bei 60°C
für 20
min inkubiert, wonach 300 μl
des Selektionsreagenzes zugegeben wurden, vermischt, inkubiert und
als RLU (siehe Beispiel 3) detektiert wurden.
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Tabelle
5 zeigt die Ergebnisse des Zwei-Schritt-Hybridisierungsassays ("RLU" ist der Mittelwert
der doppelten Tests für
30 Urinproben und die Mittelwerte der fünf positiven und fünf negativen
Kontrollen) und der PCR-basierten Tests (positiv oder negativ für die Detektion
von C. trachomatis Nukleinsäure).
-
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Wie
man anhand der Ergebnisse in Tabelle 5 sehen kann, ergibt in allen
untersuchten Proben das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren positive Ergebnisse
für solche
Proben, die mit dem unabhängigen PCR-basierten
Assay positiv getestet wurden, und in allen Fällen, in denen mit dem PCR-basierten Assay negativ
getestet worden ist, waren die Proben ebenfalls negativ, wenn sie
mit dem Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren
getestet wurden. Für
solche negativen Proben, die relativ hohe (103)
negative Signale (Proben 2, 8 und 22) aufwiesen, schlossen die doppelten
Assays immer ein "0" RLU-Signal ein und
ein relativ hohes Hintergrundsignal. Daher kann das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
verwendet werden, um Bakterien zu detektieren, die in klinischen
Urinproben vorhanden sind, und man erhält positive oder negative Ergebnisse
die mit denen im PCR-Assay erhaltenen vergleichbar sind.
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Beispiel 6: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
zum Detektieren mehrerer bakterieller Ziele in einer Probe
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Dieses
Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, um mehrere Ziele zu detektieren,
die auf bakterielle Infektionen durch verschiedene Spezies in einer
einzelnen Probe hinweisen. Die Ziel-Polynukleotide waren Sequenzen,
die für
Neisseria gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis spezifisch sind,
und die Assays wurden im Wesentlichen wie in den Beispielen 3-6
beschrieben durchgeführt.
Diese Proben wurden auch mit Kontaminanten (1% bis 10% v/v Blut) versetzt.
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Die
Assays wurden im Wesentlichen wie in den Beispielen 3-6 beschrieben durchgeführt, in
denen die Proben aus normalen Urin (keine bakterielle Kontamination)
bestanden, die entweder enthielten: kein Ziel-Polynukleotid (Negativ-Kontrollen);
5 fg eines C. trachomatis Ziel-Polynukleotids; 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids;
oder eine Mischung aus 5 fg eines C. trachomatis Ziel-Polynukleotids
und 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids. In jedem Probensatz
enthielten die Assayröhrchen
weiter entweder 0%, 1%, 5 oder 10% v/v Blut. Das gleichzeitige Detektieren
der zwei Ziel-Sequenzen mittels Chemilumineszenzsonden wurde im
Wesentlichen nach der Beschreibung von Nelson et al. (1996, Biochem.
35:8429-8438 bei 8432) mittels einer ortho-F-AE-markierten Sonde, die für das C.
trachomatis Ziel-Polynukleotid
spezifisch ist, und einer 2-Me-AE-markierten Sonde, die für das N.
gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, durchgeführt. Die Urinproben
wurden vorbereitet und bei 60°C
für 30
min und dann bei 40°C
für 30
min für
die sukzessiven Hybridisierungsschritte, im Wesentlichen wie hierin
in Beispiel 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Blutkontaminante
in einigen der Proben, wie weiter oben beschrieben, enthalten war,
inkubiert. Die immobilisierten Sonden in den Hybridisationskomplexen
wurden mittels des Magnetfeldes und der Waschschritte gereinigt
und die gereinigten Ziel-Sequenzen wurden mittels transkriptionsgebundener
Amplifikationsverfahren, die Primer enthielten, die für das C.
trachomatis Ziel-Polynukleotid und das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid
spezifisch sind, wie in Beispielen 4 und 5 weiter oben beschrieben,
amplifiziert. Das Detektionsreagenz wurde zugegeben und gleichzeitig
wurde die Chemilumineszenz von der C. trachomatis spezifischen markierten
Sonde und der N. gonorrhoeae spezifischen markierten Sonde detektiert.
Für jeden
untersuchten Probentyp wurden vier Wiederholungsversuche angesetzt
und untersucht und die RLU-Ergebnisse (Mittelwerte für jeden
Probentyp) in Tabelle 6 dargestellt. In Tabelle 6 wird das für die C.
trachomatis-spezifische markierte Sonde detektierte Signal (RLU)
durch "CT" dargestellt und
das Signal, das für
die N. gonorrhoeae-spezifische markierte Sonde detektiert wurde,
wird durch "NG" dargestellt.
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Die
in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay
verwendet werden kann, um zwei Ziele in einer einzelnen Probe gleichzeitig
zu detektieren. Die Negativkontrollen geben im Wesentlichen vernachlässigbare
Signale verglichen zu denen der Proben, die das C. trachomatis-Ziel alleine
enthielten, das N. gonorrhoeae-Ziel alleine oder beide Ziele. Die
Detektion beider Ziele wurde von einer bis zu 10% v/v Blutkontamination
nicht gestört
und beide Ziele wurden gleichzeitig in einer einzelnen Probe detektiert,
sogar mit einer Blutkontamination bis zu 10% v/v.
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Obwohl
mehrere Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung hierin beschrieben worden sind, können verschiedene
Modifikationen der einzelnen Sonde vorgenommen werden ohne vom Geist
und vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, der durch die folgenden
Ansprüche
beschrieben wird, abzuweichen.
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