DE69721473T2

DE69721473T2 - Injektion durch elektromigration von einer mikroreservoir elektrode in ein kapillares separationssystem

Info

Publication number: DE69721473T2
Application number: DE69721473T
Authority: DE
Inventors: K. Purnendu DASGUPTA; Kazimierz Surowiec
Original assignee: Dionex Corp
Current assignee: Dionex Corp
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: CA2233711C; DE69721473D1; AU709730B2; JP3065358B2; ATE239225T1; EP0858598A4; US6086736A; AU3906297A; CA2233711A1; EP0858598B1; JPH10512681A; WO1998005950A1; EP0858598A1

Description

Beziehung zu anderen Patentanmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Fortsetzung der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/023 074 der Anmelderin, eingereicht am 2. August 1996 mit der Bezeichnung "Elektromigrationsinjektion aus einer kleinen Schlinge in der kapillaren Elektrophorese".
Hintergrund der Erfindung
Die kapillare Elektrophorese ("KE") und die zugehörigen kapillaren Skaliertechnologien sind sehr wichtige analytische Techniken zur Trennung und Mengenbestimmung großer Biomoleküle. Zwar sind diese Techniken brauchbar bei der Trennung und Erfassung kleiner Ionen, die Ionenchromatographie ist jedoch eine beherrschendere Technik. Die erfolgreicheren Ionenchromatographie-Erfassungstechniken haben sich auch als anwendbar auf die kapillare Elektrophorese erwiesen. Ein Ergebnis waren die sogenannten unterdrücktkonduktometrischen Kapillar-Elektrophorese-Trennsysteme ("SuCCESS"). Die SuCCESS-Technologie kann in robuster Weise niedrige μg/l-Grenzen der Erfassung für eine Vielfalt kleiner Ionen erzeugen, ohne dass spezielle Maßnahmen hinsichtlich einer Vorkonzentration ergriffen werden müssten. (Siehe US-Patente 5 358 612 und 5 433 838, Dasgupta und Bao.)
Die kapillare Elektrophorese wird jedoch am häufigsten unter Anwendung der UV-visuellen absorptiometrischen Erfassung ausgeführt, wie in 1 gezeigt (siehe z. B. "Capillary Electrophoresis" von S.F.Y. Li, Elsevier, NY, 1992.) Wie in 1 gezeigt, enthält ein KE-Analysesystem 10 eine Trennkapillare 20, deren distale Spitze 30 anfangs in Fluidverbindung mit einer Analytproben A und typischerweise auch andere Substanzen X enthaltenden Lösung 40 steht. Die Lösung 40 befindet sich in einem Quellbehälter 50 und ist über einen Draht 57 und eine Elektrode 55 mit einer Hochspannungsquelle mit dem Potenzial V 1 verbunden, die typischerweise viele Kilovolt führt. Eine zweite oder Masseelektrode 155 ist oft in einem Endbestimmungsbehälter 160 untergebracht. Wie 1 zeigt, verläuft die Kapillare 20 durch einen UV-Vis-Absorptionsdetektor 90, bevor sie den Endbestimmungsbehälter 160 erreicht.
Verbindet man, wie in 1 gezeigt, die HV-Spannungsquelle 60 mit der Kapillare 20, so wandert der Analyt A, wie durch die nach rechts gerichteten Pfeile gezeigt, innerhalb der Kapillare von links nach rechts. Diese Wanderung kann innerhalb von Sekunden nach Einschalten der Spannungsquelle 60 beginnen. Die Spannungsquelle 60 kann dann ausgeschaltet werden, worauf die Spitze 30 der Kapillare 20 in einen zweiten Behälter 70 gebracht werden kann, der den laufenden Elektrolyten 80 enthält. Die Spannungsquelle 60 wird mit der Lösung 80 über eine Elektrode 55 verbunden, die identisch mit der Elektrode 55 sein oder bei der es sich um die gleiche Elektrode 55 handeln kann, die im Zusammenhang mit dem Behälter 50 beschrieben wurde. Die Spannungsquelle 60 kann dann wieder eingeschaltet werden, worauf sich die stromab gerichtete Wanderung des Probeanalyten fortsetzt. Diese Art der durch ein elektrisches Feld induzierten Injektion wird als elektromigrative oder elektrokinetische Injektion ("EI") bezeichnet.
Das distale Ende der Kapillare 140 ist in Fluidverbindung mit dem im Endbestimmungsbehälter 160 befindlichen Elektrolyten 150. Der Elektrolyt 150 ist vorzugsweise der gleiche wie der laufende Elektrolyt 80; er liegt in der hier gezeigten Ausführungsform auf Massepotenzial.
Wie erwähnt, wird während der EI Hochspannung angelegt, wobei die mit dem Hintergrundelektrolyten gefüllte Kapillare in ein Probenfläschchen getaucht ist. In einer typischen Situation wirken elektroosmotische und elektrophoretische Bewegungen zusammen, die gewünschte Klasse von Analytionen in die Kapillare einzuführen. Allgemein gilt, wenn die elektroosmotische Beweglichkeit (μ_eo) klein ist gegenüber der elektrophoretischen Beweglichkeit (μ_eo), sind die Bedingungen für eine elektromigrative Vorkonzentration am günstigsten. Unter diesen Bedingungen kann eine beachtliche Analytmenge eingeleitet werden, ohne dass gleichzeitig ein beachtliches Flüssigkeitsvolumen eingeführt wird. Die EI wird in weitem Maße für die Spurenanalyse angewendet. Dies gilt besonders für die UV-Vis-Erfassung, weil Kolonnen-UV-Vis-Absorptionsdetektoren, z. B. der Detektor 90, wie sie typischerweise bei der KE verwendet werden, relativ schlechte Konzentrationserfassungsgrenzen haben. Bei der Bestimmung kleiner Ionen, bei der typischerweise die indirekte Erfassung angewandt wird, ist die Situation noch weniger günstig als bei der direkten Erfassung.
Bei der EI werden, wenn die Probeionenstärke sehr niedrig ist, beste Ergebnisse erzielt, wenn der Probe bewusst ein Ion geringer Beweglichkeit mit einer Konzentration zuge geben wird, die hoch ist gegenüber der Gesamtkonzentration des Analyten. Mit "geringer Beweglichkeit" ist ein Ion gemeint, dessen Beweglichkeit kleiner ist als jedes der interessierenden Analytionen. Dabei verhält sich das zugefügte Ion wie ein Endanalyt, und die elektromigrative Vorkonzentration ähnelt stark der Isotachophorese. In manchen Fällen ist ein Ion hoher Beweglichkeit der interessierende Analyt und sind bereits Ionen niedriger Beweglichkeit im Überfluss vorhanden, wie bei der Bestimmung des Restsulfats in Sulfonatfarbstoffen. In diesen Fällen brauchen keine Endelektrolyten zugeführt zu werden. Ist der interessierende Analyt in einer Probe mit beachtlicher Ionenstärke in niedriger Konzentration vorhanden, ist es unpraktisch, ausreichend Endelektrolyten zuzufügen, um diesen im laufenden Träges dominant zu machen.
Leider ist auch bei identischen Probeanalytkonzentrationen und Instrumenteneinstellungen die Menge des in ein EI-System eingeleiteten Analyten stark abhängig von der Konduktanz der Probe. Diese Beziehung tritt auf, weil die Konduktanz die Rate der elektroosmotischen Einleitung beeinträchtigt. Weniger direkt beeinträchtigt die Konduktanz auch die Rate der elektrophoretischen Bewegung durch eine Änderung der Feldstärke, der die Probe ausgesetzt ist. Ferner ist die EI abhängig von der Beweglichkeit des Analyten selbst, wodurch sich ein Vorzug oder Vorteil (im folgenden „Biss") zugunsten der hochbeweglichen Ionen ergibt. Mit "Bias" ist gemeint, dass sich die injizierte Probe von der ursprünglichen Probe unterscheidet. Der Unterschied tritt auf, weil ein relatives Defizit der geringer beweglichen Ionen besteht und im Gegensatz zu dem, was ursprünglich in der Probe vorhanden war, ein relativer Überschuss schneller beweglicher Ionen in dem injizierten Probenteil vorhanden ist. Zwar haben Wissenschaftler, wie Lee und Yeung, Anal. Chem. 1992, 64, 1226–1231, versucht, die Genauigkeit bei der EI durch Überwachen des Systemstroms zu verbessern; die Technik von Lee-Yeung löst jedoch kaum das durch die bevorzugte Injektion bewirkte Problem.
Andere bekannte Versuche haben die oben erwähnte Vorzugsabhängigkeit der Probenleitfähigkeit ins Auge gefasst. Z. B. wurde die Verwendung zweier getrennter interner Standards vorgeschlagen, die den gesamten interessierenden Bereich der Beweglichkeiten des Analyten umfassen, wie auch die standardgemäße Hinzufügung jedes interessierenden Analyten. Diese Versuche sind nicht zufrieden stellend und können in der Tat mühsam sein.
Schließlich neigt der Stand der Technik dazu, die grundlegende Tatsache zu übersehen, dass die EI von Probenionen in eine Kapillare schließlich abhängig ist vom lokalen elekt rischen Feld. Jegliche Änderungen der Geometrie oder des physikalischen Abstands zwischen der HV-Elektrode und der Kapillarenspitze kann die EI zutiefst beeinflussen. Leider war es bisher schwierig, ein wirklich symmetrisches elektrisches Feld zu erzeugen.
Nach dem Stand der Technik ist die gesamte Analytenmenge im Probenvolumen, von dem Analytionen durch elektrokinetische Injektion in die Kapillare eingeführt werden, im Vergleich zur tatsächlich eingeführten Analytenmenge sehr groß. Könnte man die EI von einem wirklich kleinen Probenvolumen für eine ausreichend lange Zeitperiode durchführen, wäre es im Prinzip möglich, in vollständiger Weise virtuell alle interessierenden Analytionen in die Kapillare einzuführen. Das Probevolumen würde während des Prozesses nicht deionisiert oder nicht leitend werden. Es würde keine Deionisation oder kein Leitfähigkeitsverlust eintreten, weil elektrisch erzeugtes H⁺ oder OH^– und die geeigneten, bereits in der Probe vorhandenen Gegenionen und die aus der Kapillare gegen das EOF wandernden Ionen die Probe leitfähig hielten. Tatsächlich würden, wenn die EI lange genug ausgeführt werden könnte, beachtliche Mengen von H⁺ oder OH^– eingeführt werden. Leider kann nach dem Stand der Technik eine vollständige Elektromigration nicht wirksam praktiziert werden.
Es besteht daher ein Bedarf an einem leicht erzeugten Mikroreservoir, vorzugsweise mit einem Sub-μl-Flüssigkeitsfassungsvermögen, das bei einer vollständigen Elektromigration und Elektrophorese verwendet werden kann. Vorzugsweise sollte ein solches Mikroreservoir es gestatten, die gesamte enthaltene Probe leicht einem symmetrischen elektrischen Feld auszusetzen. Ferner sollte es das Mikroreservoir gestatten, die Spitze einer Trennkapillare am symmetrischen Zentrum der Probe anzuordnen. Ein diese Merkmale und diese Methodologie umfassendes System würde in vorteilhafter Weise die Einwirkungen der Leitfähigkeit bei der Elektromigrations-Injektions-Kapillarelektrophorese vermindern.
Dasgupta und Kar, Anal. Chem. 1995, 67, 3853–3860, bezieht sich auf die Messung von Gasen durch ein unterdrückt-konduktometrisches Kapillarelektrophorese-Trennsystem.,
Yin et al., HRC Journal of High Resolution Chromatography, 14 (1991), April, Nr. 4, Heidelberg, Deutschland, bezieht sich auf ein Miniaturgerät zur elektrokinetischen oder hydrodynamischen Probeneinleitung aus kleinen Volumina beider Kapillarelektrophorese.
Dasgupta und Surowiec, Anal. Chem. 1996, 68, 1164-1168, bezieht sich auf die quantitative Injektion aus einer Mikroschlinge und die reproduzierbare volumetrische Probeneinleitung bei der Kapillarzonen-Elektrophorese.
Demgemäß wird durch die Erfindung bereitgestellt ein Verfahren zum vollständigen Injizieren von Analytionen durch Elektromigration in eine Trenn-Kapillarleitung, bei dem die Analytionen einer gewählten Polarität in einer Probe durch Anlegen einer Hochspannung zum Wandern gebracht werden, so dass die Injektion im Wesentlichen unabhängig ist von der Ionenbeweglichkeit einzelner Analytionen und im Wesentlichen unabhängig ist von der Leitfähigkeit der Probe, mit folgenden Schritten:

(a) Bereitstellen eines elektrisch leitfähigen Mikroreservoirs, das einem Wesentlichen konstantes endliches und symmetrisch geformtes Haltevolumen begrenzt, in dem ein reproduzierbares Volumen der Probe gehalten wird,
(b) Anordnen der Eingangsspitze der Trennkapillare in Kontakt mit einem Teil der Probe am Symmetriezentrum des Mikroreservoirs, und
(c) Aussetzen der gesamten, in dem elektrisch leitfähigen Mikroreservoir gehaltenen Probe einem symmetrischen elektrischen Feld durch Verbinden eines Leiters der Hochspannung mit dem Mikroreservoir, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannung für eine Zeitperiode eingeschaltet wird, die ausreicht, die Analytionen in der Probe der gewählten Polarität im Wesentlichen vollständig in die Spitze der Trennkapillare einzuleiten, ohne gleichzeitig ein beachtliches Flüssigkeitsvolumen einzuleiten.

Die Merkmale der Schritte (a) bis (c) sind aus den oben genannten Druckschriften 1 und 2 bekannt.
Unerwünschte Biaseffekte werden in einem Elektromigrations-Injektion ("EI") verwendenden Trennsystem durch vollständige Einleitung von Analytionen einer gewünschten Polarität in der Probe in die Trennkapillare eingeleitet, indem eine ein Mikroreservoir darstellende Elektrode verwendet wird. (Das Trennsystem kann ein elektrophoretisches oder elektrochromatographisches System sein.) Eine in einer metallisierten Basis gebildete Drahtschlinge oder Hemisphäre bildet ein Mikroreservoir endlichen Volumens, das symmetrisch ist, um die Zeit zu verringern, die erforderlich ist, um Entleerung zu erreichen. Die Eingangsspitze der Trennkapillare ist am Zentrum des Mikroreservoirs angeordnet, wodurch die zur Entleerung erforderliche Zeit in vorteilhafter Weise vermindert wird.
Weil das Mikroreservoir ein elektrischer Leiter ist, ist er an eine Klemme einer Hochspannungsquelle angeschlossen und bildet eine der Hochspannungselektroden im Trennsystem. Bei angelegter hoher Spannung wird die zu analysierende Probe innerhalb des Mikroreservoirs einem elektrischen Feld ausgesetzt und das Trennsystem wird zur Ausführung einer vollständigen Injektion des Analyten benutzt. Die Ausführung der vollständigen Elektroinjektion im Trennsystem vermindert in vorteilhafter Weise die Vorzugseffekte wesentlich, wodurch sich schneller bewegende Ionen in der Probe früher in die Kapillare eintreten als sich langsamer bewegende Ionen der gleichen Polarität. Die vollständige Injektion unter Verwendung der Elektromigration resultiert in einer Probeninjektion in wesentlicher Quantität. Diese Injektion erfolgt im Wesentlichen unabhängig von der Leitfähigkeit der Probe und im Wesentlichen unabhängig von der Ionenbeweglichkeit der verschiedenen Analytionen gleicher Polarität.
Die vollständige Elektroinjektion wird vorzugsweise wie folgt ausgeführt. Unter Verwendung einer symmetrischen Mikroreservoir-Elektrode, deren Volumen reproduzierbar und klein ist, z. B. <2 μl, wird eine kleine Menge oder ein kleiner Teil entnommen. Der Teil kann ein Film sein, der gebildet wurde durch Eintauchen und Herausziehen einer schlingenförmigen Mikroreservoir-Elektrode in und aus einem Behälter, der die Probe enthält. An die Mikroreservoir-Elektrode als eine Elektrode wird EI-Potenzial für eine gewünschte Zeitdauer angelegt, z. B. 30 bis 60 Sekunden; während dieser Zeit werden sämtliche in der Probe enthaltenen Ionen der gewünschten Polarität im Wesentlichen quantitativ in die Spitze der Trennkapillare injiziert. Zunächst werden die sich schneller bewegenden Ionen und, wenn diese abgereichert sind, die sich langsamer bewegenden Ionen in die Kapillare injiziert. Dieses Ergebnis wird erzielt, weil das Volumen des Reservoirs verhältnismäßig klein ist. Im Ergebnis werden Bisseffekte reduziert, indem die injizierte Probe ein genaueres Bild der sich langsamer bewegenden Ionen, zusätzlich zu den sich schneller bewegenden Ionen, enthält.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen, in der die bevorzugten Ausführungsformen im Einzelnen dargestellt sind.
Kurzbeschreibung der Erfindung
1 zeigt ein herkömmliches Trennsystem nach dem Stand der Technik;
2 zeigt ein EI-Trennsystem zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren;
3A zeigt eine erste Ausführungsform einer Mikroreservoir-Elektrode mit einer geneigten Schlingengeometrie und einem zugehörigen Trägerdraht zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren;
3B zeigt eine zweite Ausführungsform einer Mikroreservoir-Elektrode mit einer planaren Schlingengeometrie, bei der die Längsachse der Kapillare und der Schlingenradius auf einer gemeinsamen Ebene liegen, zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren;
3C zeigt eine dritte Ausführungsform einer Mikroreservoir-Elektrode mit einer in einem leitfähigen Basismaterial ausgebildeten Hemisphäre zur Verwendung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren;
4 zeigt numerische EI-Simulationsdaten aus einem gut gemischten Film nach der vorliegenden Erfindung;
5 zeigt eine numerische Simulation der EI von einem Film, in dem keine Mischung vorhanden ist, während andere Bedingungen die gleichen sind wie für die Ausführungsform der 4, nach der vorliegenden Erfindung;
6 zeigt die räumliche Verteilung von Chlorid, Acetat und Hydroxid in einem Film in Abhängigkeit von der EI-Periode, wobei die anderen Bedingungen die gleichen sind wie bei 5, nach der vorliegenden Erfindung;
7 zeigt eine numerische Simulation der EI aus einem Film, wobei das Modell eine Diffusionsmischung enthält, wobei die übrigen Bedingungen die gleichen sind wie für 5, nach der vorliegenden Erfindung;
8 zeigt die räumliche Verteilung von Chlorid, Acetat und Hydroxid in einem Film in Abhängigkeit von der EI-Periode, wobei das Modell eine Diffusionsmischung enthält, nach der vorliegenden Erfindung;
9 zeigt eine Fraktion von injiziertem Chlorid und Acetat in Abhängigkeit vom Schlingenradius und der EI-Periode, nach der vorliegenden Erfindung;
10A und 10B zeigen die herkömmliche EI bzw. die EI von einer Schlinge, gemäß der vorliegenden Erfindung;
11A zeigt die EI aus einer kleinen Schlinge mit einem extrem großen Dynamikbereich mit einer Acetatänderung über drei Größenordnungen bei konstanter Nitratkonzentration, gemäß der vorliegenden Erfindung;
11B zeigt die Änderung von Nitrat über 3 Größenordnungen bei konstanter Acetatkonzentration, gemäß der vorliegenden Erfindung;
12 zeigt normalisierte Daten der Schlingen-EI für Chlorid zum Acetat-Spitzenflächenverhältnis in Abhängigkeit von der HV- und der EI-Periode, gemäß der vorliegenden Erfindung;
13A zeigt das injizierte äquivalente Schlingen-EI-Volumen in Abhängigkeit der EI, gemäß der vorliegenden Erfindung;
13B zeigt den Schlingen-EI-Bias gegenüber Chlorid als Funktion der EI, gemäß der vorliegenden Erfindung; und
14 zeigt die Hydroxideinleitung bei verlängerter EI aus einer Schlinge, gemäß der vorliegenden Erfindung.
Eingehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
2 zeigt ein etwas modifiziertes KE-System 10', bei dem eine Mikroreservoir-Elektrode 59 vorgesehen ist. Wie im Folgenden beschrieben, begrenzt eine Mikroreservoir- Elektrode vorzugsweise ein Volumenfassungsvermögen von etwa 1 μl oder weniger und dient vorteilhafterweise als Elektrode statt der Elektrode 55 nach dem Stand der Technik gemäß 1. Die Geometrie der Mikroreservoir-Elektrode ist symmetrisch, vorzugsweise eine aus leitfähigem Draht gebildete Schlinge (3A, 3B) oder eine in einer Metallbasis oder leitfähigen Basis gebildete, Hemisphäre (siehe 3C).
Das System 10' wurde von den Anmeldern als voll automatisiertes, speziell angefertigtes KE-System mit Kapillaren 20 aus geschmolzenem Siliziumdioxid mit einem Innendurchmesser von 74 μm, einem Außendurchmesser von 360 μm und einer Länge von 60 cm verwendet. Solche Kapillaren sind erhältlich bei Polymicro Technologies, Phoenix, AZ. Die Hochspannungs-("HV"-)Quelle 60 war eine programmierbare HV-Spannungsquelle, Modell CZE2000 der – Spellman High Voltage, Plainview, NY. Ein UV-Vis-Kolonnen-Absorbansdetektor 120 oder 130 mit variabler Wellenlänge (ein LINEAR-Modell 206 PHD der Thermo Separation Systems) wurde in Kombination mit UV-206-Datengewinnungssoftware (LINEAR) verwendet, die auf einem (nicht gezeigten) 80386-Personalcomputer (PC) betrieben wurde. Natürlich können andere Geräte und anders bemessene Kapillaren verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass das System 10' ein kapillares Elektrochromatographiesystem enthalten kann. In diesem Fall wäre die Kapillare 20 eine Füllkörperkolonne statt ein hohles Rohr.
Bei der Ausführung der Erfindung ist ein automatisiertes System besonders wichtig, das die Rückziehbewegung des kapillaren Probenentnahmekopfes aus der Probe genau steuert. Es wird gewünscht, eine reproduzierbare Flüssigkeitsmenge aus dem Behälter SO als Film auf einer Drahtschlinge zu entnehmen, z. B. der Mikroreservoir-Elektrodenschlinge 59 der 3A und 3B. Es ist eine langsame Rückzugsbewegung notwendig, um sicherzustellen, dass eine reproduzierbare Flüssigkeitsmenge in dem Film enthalten bleibt. Bei den Versuchen der Anmelder wurde das System automatisiert durch Verwendung eines modifizierten Fraktionskollektors (Modell 2110, BIO-RAD, Richmond, CA) als automatisches Entnahmegerät. Eine Anzahl pneumatischer Linear-Stellmotoren, die durch elektrisch betätigte Luft-Magnetventile gesteuert wurden, dienten zur Horizontal- und Vertikalbewegung des Kapillarkopfes. Der Betrieb des Systems wurde gesteuert durch einen programmierbaren Mikrocontroller (eine Micro Master LS-Einheit der Minarik Electric, Los Angeles, CA). Es sei darauf hingewiesen, dass stattdessen auch andere Steuersysteme verwendet werden können. Die se Bauteile und Subsysteme sind in 2 insgesamt mit 200 bezeichnet. Die physikalische Bewegung der Mikroreservoir-Elektrode 59 ist nicht gezeigt, um 2 nicht zu überfrachten.
Die Veröffentlichung der Anmelder in Anal. Chem. 1996, 68, 1164–1168, beschreibt allgemein Techniken zur Bildung von Drahtschlingen an der Spitze einer Kapillare. Die bei den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendeten Schlingen, wie sie in 3A und 3B gezeigt sind, sind dagegen wesentlich größer und daher ziemlich einfach herzustellen. Es wurden, kurz, Schlingen mit einem Durchmesser von 0,2 cm (5/64 Zoll) bis 0,3 cm (1/8 Zoll) hergestellt, indem rostfreier Stahldraht mit einem Durchmesser von 135 μm um Bohrerspitzen geeigneter Drehung gewickelt und mit einer oder zwei Windungen gehalten wurden.
Die Mikroreservoir-Elektroden in Form von Drahtschlingen (abgekürzt "Schlinge") wurden in zwei unterschiedlichen Geometrien verwendet, wie sie in den 3A und 3B gezeigt sind. In 3A ist die Ebene der Schlinge 59 um einen Winkel φ von 45° bis 90° gegenüber der Längsachse der Trennkapillare 20 geneigt. Ein vertikaler Trägerdraht 64, der pa- rallel zur Kapillare 20 verläuft, hält die Schlinge 59 in ihrer Stellung. Es sei darauf hingewiesen, dass die Schlinge symmetrisch und die Mitte der Spitze 30 symmetrisch im Zentrum der Schlinge liegt. Der Trägerdraht und die Kapillare wurden durch eine kleine Spannvorrichtung 66 aus Plexiglas wenige Zentimeter oberhalb der unteren Kapillarenspitze 30 gehalten. Ein leitfähiger Draht 57 verbindet die Drahtschlinge mit der Hochspannungsquelle 50 (richtig: 60), so dass die Schlinge 59 im Trennsystem 10' eine Elektrode bildet. Ein Vorteil der Mikroreservoir-Elektrode in Form einer Schlinge besteht darin, dass über die Elektrode ein sehr symmetrisches elektrisches Feld erzeugt wird. Bei der Ausführungsform der 3A nimmt die in der Schlinge gehaltene Flüssigkeitsmenge beim Herausziehen aus einer Flüssigkeit ab, je weiter sich der Winkel der Schlingenebene der Vertikalen nähert.
Bei der Ausführungsform der 3B ist die Schlinge 59 rings um die Kapillarenspitze 30 gebildet, wobei die Kapillarenachse nun parallel zur Ebene der Schlinge liegt. Der Anschlussdraht 68 ist um die Spitze der Kapillare gewickelt und daran mittels Epoxykleber befestigt.
Bei den Ausführungsformen der 3A und 3B wurden der vorstehende Draht (oder Trägerdraht) 64 oder ein mit der Schlinge verbundener Draht 57 mit Hochspannung verbun den. Das Ergebnis ist, wie erwähnt, dass anstelle der Elektrode 55 in Fig: 1 die Schlinge 59 als HV-Elektrode dient. Da die vorliegenden Versuche auf umgekehrte Polarität (–HV) begrenzt waren, war nicht rostendes Stahlmaterial zur Herstellung der Schlingenelektroden 59 geeignet.
Wie erwähnt, soll die Mikroreservoir-Elektrode 59 eine endliche Flüssigkeitsmenge halten, z. B. <l μl, und im System 10' ein gleichmäßiges elektrisches Feld über das Mikroreservoir erzeugen. Eine symmetrische Schlinge, wie die in den 3A und 3B gezeigte, erfüllt diesen Zweck. Bei der Ausführungsform der 3C weist die Mikroreservoir-Elektrode 59 eine Basis aus elektrisch leitfähigem Material, z. B. Metall, mit einer Oberfläche auf, in der eine halbkugelförmige Vertiefung 68 ausgebildet ist. Die Basis ist zwar zur Erleichterung der Darstellung quadratisch gezeigt, stattdessen könnte aber auch eine kreisförmige Basis verwendet werden, die weiter zur Symmetrie beitragen würde. Die halbkugelförmige Vertiefung ist so bemessen, dass sie eine gewünschte Flüssigkeitsmenge aufnehmen kann, z. B. <1 μl; so dass sie als Mikroreservoir mit einem endlichen Fassungsvermögen dient. Zur Aufnahme, eines festen Volumens kann solch ein Reservoir auch selbstfüllend sein. Weil das Mikroreservoir aus einem elektrisch leitfähigen Material hergestellt ist, kann der Draht 57 mit der Basis der Mikroreservoir-Elektrode 59 verbunden werden, so dass sie auch als Elektrode wirkt. Nochmals, die Spitze 30 der Kapillare 20 liegt symmetrisch am Zentrum der Mikroreservoir-Hemisphäre 68. Das Ergebnis ist, dass die in der Hemisphäre 68 befindliche Probe einem symmetrischen elektrischen Feld ausgesetzt wird.
Hinsichtlich der im System 10' verwendeten Reagenzien sei erwähnt, dass sämtliche Lösungen in destilliertem deionisiertem Wasser (z. B. Barnstead Nanopure) mit einem spezifischen Widerstand, größer als 16 MΩ·cm hergestellt wurden. Natriumchromat (5 mM) wurde täglich frisch aus einem Vorrat von 50 mM bereitet, der hergestellt war aus Na₂CrO₄·4H₂O, A. R. Grade; Mallinckrodt; eingestellt auf einen pH-Wert von 8,0 mit 0,1 M H₂SO₄. Es wurde Cetyltrimethylammoniumhydroxid (CTAOH) hergestellt, indem eine Cetyltrimethylammoniumchloridlösung einem Ionenaustausch unterzogen wurde, und zwar durch eine OH-Form Dowex 1 × 8 Anionen-Austauschkolonne mit 200 bis 400 Mesh aus einem Vorrat von 20 mM. CTAOH wurde als elektroosmotischer Strömungs-("EOF")-Modifizierer verwendet (um eine Strömung zur Masseelektrode mit angelegter –HV zu erreichen) und dem Chromatelektrolyten zugefügt, so dass sich schließlich eine Konzentration von 0,5 mM ergab.
Im Betrieb des Systems 10' wurde die Kapillare 20 zunächst mit dem BGE gefüllt, worauf die Spitze 30 zum Waschen der Schlinge 59 in ein Probenfläschchen abgesenkt und daraus herausgezogen wurde. Die Kapillare wurde dann in ein zweites identisches Probenfläschchen eingeführt und zur Bildung eines Probenfilms auf der Schlinge langsam daraus herausgezogen. Die Kapillare wurde dann horizontal bewegt und in eine Stellung in einer Höhe abgesenkt, die gleich war dem Flüssigkeitspegel auf der Bestimmungsseite, z. B. dem Behälter 160 in 2. In dieser Stellung ist der Bereich rings um die Schlinge zylindrisch umschlossen, und ein kleiner Strom von N₂ (≈20 bis 25 cm³/min) dient dazu, eine übermäßige Einleitung von CO₂ zu verhindern. Darauf wurde von der Hochspannungsquelle 60 die Blektromigrationsspannung (–3 kV, wenn nicht anders erwähnt) angelegt. Wie, erwähnt, diente das Mikroreservoir 59 als eine Elektrode im System 10', während die andere Elektrode mit der Elektrode 155 (oder mit einer anderen Stelle im System 10') verbunden war.
Nach Ablauf einer gewünschten EI-Zeitperiode wird die Kapillare zum Waschen in ein erstes BGE-Fläschchen gelegt und dann für den Betrieb in ein zweites, frisches BGE-Fläschchen abgesenkt. Für die Elektrophorese wurde eine Arbeitsspannung von –18 kV verwendet. Im Wesentlichen die gleiche Prozedur wurde in analoger Weise ausgeführt, wenn die EI von einem herkömmlichen Probenfläschchen ausgeführt wurde. Die Bestimmung der Anionen wurde studiert und, wenn nicht anders beschrieben, bildete die Probe ein Gemisch aus Chlorid (200 μg/l), Nitrat (400 μg/l), Format (400 μg/l) und Acetat (400 μg/l), sämtlich als Natriumsalze.
Es seien nun die zugrunde liegenden Arbeitsprinzipien bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung betrachtet. Bei der EI ist die Menge Q_i der Spezies i, die während der Zeit t in eine Kapillare der Länge L mit dem Innenradius r_c, an die eine Spannung V angelegt ist, durch folgende Gleichung gegeben:
Qi = (μi + μeo)πrc 2VCit/L (1)
worin μ_i und μ_eo die elektrophoretische bzw. elektroosmotische Beweglichkeit und C_i die Konzentration der Spezies i sind. Diese Analyse geht davon aus, dass das Feld E an der Spitze der Kapillare das gleiche ist wie das Feld innerhalb der Kapillare und daher gegeben ist durch V/L. Der Fluss entsteht durch den Querschnitt des Einlasses der Kapillare. Das Massenreservoir des Analyten i ist so groß, dass C' während der Dauer der EI im Wesentlichen unverän dert bleibt. Solange daher die Migrationsrate des Analytenions innerhalb der Kapillare die Einleitungsrate des Analyten an der Kapillarenspitze nicht beeinflusst, gilt eine allgemeinere Formulierung der Gleichung (1):
Mi = dQi/dt = (μi + μeo)EaCi (2)
worin M_i die Massentransportrate (eq/s) des Ions i durch eine Fläche a rings um die Kapillarenspitze zur Kapillare ist, wobei C_i die Konzentration der Spezies i ist.
In der Praxis ist unwahrscheinlich, dass das Feld innerhalb und außerhalb der Kapillare das gleiche ist. Gleichwohl ist die elektroosmotisch eingeleitete Komponente der elektrokinetischen Injektion beherrscht vom in der Kapillare erzeugten EOF. Daher wird die vom EOF beeinflusste Komponente der EI besser direkt spezifiziert, und zwar als in der Kapillare erzeugte Massenstromgeschwindigkeit μ_eo. Ist μ_eo sehr klein gegenüber E_μi, so vereinfacht sich Gleichung (2) zu:
Mi = Eμ iaCi (3)
Es sei nun die Feldgeometrie an der Kapillarenspitze und die Widerstandsfähigkeit des Films betrachtet. Es sei vereinfachend angenommen, dass die Probe eine dünne kreisförmige Scheibe bildet mit dem Radius r_out und der Dicke h, und dass sich die Kapillarenspitze an der Mitte der Scheibe befindet. Solange h klein ist gegenüber r_out, kann man annehmen, dass der Diffusionstransport in vertikaler Richtung kein begrenzender Vorgang ist.
Die Umfangsfläche der Scheibe, 2πr_outh, bildet eine Elektrode. Es sei erwähnt, dass selbst dann, wenn der Film/die Scheibe dicker als der Durchmesser des die Schlinge bildenden Drahtes wäre, die Elektrodenfläche immer noch richtig durch die gesamte Umfangsfläche für eine dünne Scheibe angenähert würde. Der Querschnitt der Kapillare, πr_c ² , stellt die zweite, virtuelle Elektrode dar. In den meisten Fällen ist r_c sehr klein gegenüber r_out. Anstelle einer planaren Geometrie lässt sich die zentrale Elektrode als zylindrisch mit dem Radius re mit einer Fläche gleich dem Querschnitt der Kapillare annähern. Daher ist:
re = rc 2/2h (4)
Das Ergebnis ist somit ein ringförmiges Elektrodensystem, anfänglich mit einem den Ring füllenden Medium mit homogenem spezifischem Widerstand p, worin:
ρ = 1/(ΣλjCj) (5)
worin λ_j die äquivalente spezifische Leitfähigkeit (in S cm² eq^–1) des Ions j und C_j seine Konzentration in Äquivalenten/cm³ ist. Dies ergibt einen spezifischen Widerstand p in Ω·cm. Die Ionen j umfassen nicht nur die interessierenden Analyt-Anionen (Ionen i, z. B. Chlorid), sondern auch eine gleiche Konzentration von Gegenionen (z. B. Natrium), das zur Aufrechterhaltung einer elektrischen Neutralität im Medium vorhanden ist.
Bei dieser Analyse nahmen die Anmelder an, dass der interessierende, den Durchsatz begrenzende Vorgang die Wanderung der Ionen i in die Kapillare ist. Als solche ist die rückläufige Migration des Gegenions aus der Kapillare (wo es verglichen mit der Konzentration der Analytionen im Film in sehr großer Konzentration vorhanden ist) nicht der begrenzende Schritt. Es sei auch erwähnt, dass die EI begleitet ist von der elektrolytischen Entstehung von OH" an der Schlingenelektrode, die auf negativem Potenzial gehalten wird. Nicht nur der spezifische Widerstand p im Schlingenfilm wird beeinflusst durch einen ansteigenden NaOH-Gehalt, sondern es wird auch OH- zusammen mit den Probenionen eingeführt, wobei die relative Menge mit steigender EI-Periode ansteigt.
Es seien die Auswirkungen des elektrischen Widerstandes der Schlinge betrachtet. Hat die innere Elektrode einen Radius r und eine Dicke h und befindet sich die zweite Elektrode in einem unendlich kleinen Abstand dr hiervon, so ergibt sich der Widerstand dR zwischen den Elektroden aus der Gleichung:
dR = ρdr/2πrh (6)
Daher ist
R = (ρ/2πh)logr (7)
Damit ergibt sich unter Anwendung der obigen Ausführungen auf die interessierenden Ausführungsformen für eine Schlinge mit dem Außenradius r_out und dem Innenradius r_c der Schlingenwiderstand R_loop zu:
Rloop = (ρ/2πh)log(rout/re) (8)
Es wird nun der Massentransfer in die Kapillare beschrieben. In Gleichung (3) kann die Feldstärke E beschrieben werden als:
E = dV/dr (9)
Der durch das System fließende Strom ist abhängig von der angelegten Gesamtspannung V und der Summe des elektrischen Widerstandes der Kapillare (R_cap) und dem Widerstand der Schlinge (R_loop). Für den Strom ergibt sich folgende Beziehung:
I = V/(Rloop+Rcap) (10)
Während der EI bleibt die angelegte Gesamtspannung konstant, und der elektrische Widerstand der Kapillare (R_cap) ist im Wesentlichen unveränderlich und wesentlich größer als R_loop. Der. Strom I bleibt im Wesentlichen konstant. Daher wird Gleichung (9) zu:
E = IdR/dr (11)
An der Spitze der Kapillare ist die Fläche a von Gleichung (3), durch die der Massentransfer erfolgt, die Oberfläche der inneren zylindrischen Elektrode und ebenfalls gleich dem Querschnitt der Kapillare. Die Fläche a lässt sich ausdrücken als:
A = 2πreh (12)
Setzt man r = r_c an der Kapillarenspitze, so ergibt Gleichung (6):
dR/dr = ρ/2πreh (13)
Kombiniert man die Gleichungen 3, 11, 12 und 13, so kommt man zu folgendem einfachen Ergebnis:
Mi = IρμiCi (14)
Der Probenfilm ist nach der vorliegenden Erfindung räumlich gut gemischt und homogen. Es sei angenommen, dass der ganze Film stets gut gemischt ist. Für alle Anionen außer Hydroxid gilt:
–dCi/dt = Mi/Vf = IρμiCi/Vf (15)
worin V_f das Volumen des Schlingenfilms πr² _out·h ist.
OH^– wird auch im Film mit einer Rate von I/F eq/s erzeugt, worin F die Faradaysche Konstante ist. Es folgt dann:
–dCOH/dt = I(ρμOHCOH – 1/F)/Vf (16)
Durch Erweiterung von Gleichung (5) erhält man:
ρ = 1/ΣCiλi + COHλOH + λNa(COH + ΣCi) (17)
Gleichungen 15, 16 und 17 bilden eine Gruppe gekoppelter Differentialgleichungen zweiter Ordnung, für die keine allgemeine Lösung existiert. Das Gleichungssystem kann jedoch leicht numerisch gelöst werden.
Wenn nicht anders erwähnt, bestanden und werden vorausgesetzt die folgenden Systemkennwerte: Schlingenradius 1 mm, Probenvolumen 1 μl, Probenzusammensetzung Cl (200 μg/l)_; NO₃ ^– (400 μg/l), HCOO^– (400 μg/l), CH₃OOO^– (400 μg/l), EI-Spannung –3 kV, Innendurchmesser der Kapillare 75 μm, BGE 5 mM Na₂CrO₄. Für eine Kapillarenlänge von 60 cm ist der berechnete Widerstand R_cap gleich 1,008 GΩ; dies stimmt sehr genau mit einem beobachteten Strom von –3 μA überein.
Auf einem Pentium-Rechner mit einer Arbeitsfrequenz von 133 MHz wurden Berechnungen mit einem Code in TURBO BASIC (der Borland International) ausgeführt. Die Konvergenz der Lösungen wurde geprüft durch Verminderung des Zeitintervalls der Iterationsschritte. Typischerweise wurden keine beachtlichen Änderungen unterhalb eines Iterationsschrittes von 100 μs beobachtet. Alle hier beschriebenen Daten basieren auf einem solchen zeitlichen Iterationsschritt.
Die Rechenzeit für den obigen Fall' des gut gemischten Films war nicht besonders groß. Wenn sich aber in einem realistischeren Umfeld die Filmzusammensetzung während der (hier beschriebenen) EI radial ändert, erfordert die Simulation von 30 s der EI mit einem Iterationsschritt von 50 μs eine Rechenzeit von über 14 Stunden.
Verständlicherweise dürfte eine Rechenzeit von 14 Stunden die akzeptable obere Zeitgrenze für PC-Berechnungen darstellen.
Die Analyse der Anmelder erfolgte nach den folgenden Algorithmusschritten:

1. Berechne aus der anfänglichen Probenzusammensetzung den Anfangswert von ρ (Gleichung 17), R_loop (Gleichung 8) und I (Gleichung 10);
2. berechne die Masse (kumulative Masse) der Analytionen und OH-, die während des gewählten Iterationsintervalls injiziert wurden (Gleichung 14);
3. berechne die Zusammensetzungsveränderung des Probenfilms sowohl hinsichtlich der Analytionen als auch NaOH (Gleichungen 15 und 16) und damit für die neue Zusammensetzung;
4. Ausführen der gleichen Berechnungen wie im obigen Schritt 1 unter Verwendung der neuen Zusammensetzung;
5. Wiederholen der Schritte 2, 3 und 4, bis die gewünschte Gesamt-EI-Periode simuliert wurde.

4 zeigt die Ergebnisse dieser numerischen Simulation einer EI für einen gut gemischten Film. Mit steigender EI-Zeit erreicht die Gesamtmenge jedes injizierten Analyten angenähert exponentiell die jeweiligen begrenzenden Plateauwerte. Mit steigender EI-Zeit steigt aber die Menge des injizierten OH^– (mit Sternchen gezeigt) linear. Obwohl keiner der Analyten unter dieser Bedingung quantitativ injiziert wurde, wurden am Ende der EI-Periode das schnell bewegliche Chlorid und Nitrat angenähert vollständig, mit 96% bzw. 95%, inji ziert. Acetat, der langsamste der vier Analyten, wird in einem Ausmaß von 81% injiziert. Der relative Bias von Chlorid gegenüber Acetat beträgt 1,183, d. h. das Ausmaß, in dem das Verhältnis der injizierten Chlorid- und Acetatmengen größer ist als das Verhältnis der jeweils ursprünglich in der Probe vorhandenen Ionen.
Wenn man dagegen den gleichen relativen Bias für die herkömmliche EI aus einem Probenfläschchen aus Gleichung (1) berechnet, ist der erhaltene Wert das Verhältnis der zwei Beweglichkeiten, 1,866. Die Daten sind zwar nicht gezeigt, die Anmelder haben dies aber ebenfalls experimentell beobachtet. Es kann daher eine sehr beachtliche Verminderung des Vorteils erwartet werden, wenn EI erfindungsgemäß aus einem endlichen, begrenzten Volumen ausgeführt wird.
Während der EI treten räumliche Konzentrationsgradienten auf. Die oben beschriebene Methodologie ist zwar aufschlussreich, jedoch etwas zu stark vereinfachend. In Wirklichkeit ist die Schlingengröße endlich. Ferner führt die relativ schnelle Bewegung der Ionen mit unterschiedlichen Raten zum Eingang der Kapillare dazu, dass während des EI-Vorganges nicht nur die zeitliche, sondern auch die räumliche Zusammensetzung des Films nicht konstant ist.
Während der EI werden die Ionen in der Nähe des Kapillareneingangs abgereichert und müssen ersetzt werden. Andererseits wird bei dem einfachen Modell, während OH- in der Nähe des äußeren Umfangs des Films tatsächlich in beträchtlicher Menge erzeugt wird, angenommen; dass es sich augenblicklich über den Film vermischt, so dass der berechnete spezifische Widerstand des Films verringert wird. Entsprechend werden auch das Feld über die Schlinge und die Rate der EI gegenüber dem, was sonst zu erwarten wäre, verringer. Während in einem Modell verschiedene Komplexitätsstufen erfasst werden können, um diese Erscheinungen zu berücksichtigen, wird auf numerische Lösungen rückgegriffen, wenn sich auf das Basismodell beziehende Gleichungen analytisch nicht gelöst werden können.
Der von den Anmeldern angewandte Basis-Ansatz nimmt an, dass der Film radial in eine Anzahl dünner Segmente individuell von gleichförmiger Zusammensetzung unterteilt ist. Die innerste Zone hat einen Radius RINZONE. Der Rest der Schlinge ist nach außen in Segmente der Dicke Δr unterteilt, bis r_out erreicht ist. Wenn nicht anders erwähnt, wird bei den hier beschriebenen Simulationen angenommen, dass die RINZONE 50 μm ist; dies ist etwas größer als der innere Radius der Kapillare von 37,5 μm. Hier wird durchwegs ein Wert ΔR = 10 μm verwendet. Für r_out = 0,1 cm ergeben sich n = 96 separate Zonen. Diese n Zonen können in ihren Radien in cm bezeichnet werden mit r₁, r₂,... r₉₅, r₉₆, worin r₁ = RINZONE, r₂ = r₁+0,001, r_k = r₁+(k-1)·0,001, r₉₆ = r_out, mit r₀ gleich 0 ist. Übernimmt man diese Nomenklatur, so ergibt sich das Volumen V_k jeder Zone oder Schale zu:
Vk = π(r2 k – r2 k–1)h (18)
Der elektrische Widerstand Rk jeder Schale ergibt sich analog zu Gleichung (7) zu:
Rk = (ρ/2πh)log(rk/rk–1) (19)
unter der Bedingung, dass in diesem Fall r₀ nicht gleich null, sondern der Radius der hypothetischen zylindrischen Zentralelektrode r_c ist. R_loop ergibt sich dann wie folgt:
Rloop = ΣRk(mit k = 1 bis n) (20)
Gleichung (10) kann nun zur Berechnung des Stroms verwendet werden. Während der anfänglichen Schritte lässt sich die Menge jedes Analyten und von OH^– in jeder der 'Zonen A_i,k und A_OH,k wie folgt berechnen:
pi,k = Ci,kVk (21a)
AOH,k = COH,kVk (21b)
Die Gleichung für OH^– und für die Analyten ist im Allgemeinen die gleiche und braucht nicht wiederholt zu werden, es sei denn, dass eine Differenz vorhanden ist. Daher werden alle Gleichungen für Analyen, für die eine entsprechende Gleichung für OH^– existiert, mit "a" nach dem numerischen Bezug bezeichnet, was eine identische entsprechende Gleichung "b", hier nicht angeführt, bezeichnet, die sich auf Hydroxid bezieht. Dann werden die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt:
6. Die von Zone k nach Zone k–1, ΔiA_i _,k über eine Iterationsperiode Δt übertragene Analytmenge i wird im Wesentlichen nach Gleichung (14) berechnet:
ΔAi,k = IρkμiCi,kΔt (22a)
7. Die neuen Mengen in jeder Zone werden dann wie folgt berechnet:
Ai,k(neu) = Ai,k(alt)–ΔAi,k+ΔAi,k+1 (23a)
Für alle Analyten wird die äußerste Zone n, ΔA_i,k+1 gleich null gesetzt. Es wird aber in dieser Zone Hydroxid erzeugt und somit:
ΔAokOH,n+1 = IΔt/F (24)
8. Für die Menge ΔA_i,1, die in die Kapillare eingeführte Analytmenge, wird ein kumulatives Ergebnis gehalten.
9. Für jede Zone k wird der Wert von pk nach Gleichung 17 und der Strom I unter Verwendung der Gleichungen 19, 20 und 10 berechnet.
10. Die Schritte 6, 7; 8 und 9 werden wiederholt, bis die gewünschte EI-Periode erreicht ist.
5 zeigt eine EI-Simulation unter Verwendung der obigen Annäherung, wobei eine am Modell vorhergesagte quantitative Injektion von Chlorid in 5s und eine vorhergesagte quantitative Injektion von Acetat in 10 s erreicht wird. 6 zeigt die radiale Analytverteilung in Abhängigkeit von den EI-Zeiten. Man beachte in 6 die radiale Verteilung der Analyten mit fortschreitender EI-Zeit. Sowohl Chlorid als auch Acetat werden zuerst in den äußeren Zonen abgereichert und erreichen dann virtuelle Plateaus mit Annäherung an die Mitte der Schlinge (oder einer anderen endlichen Mikroreservoir-Elektrode). Das Chlorid verschwindet viel schneller als das sich langsamer bewegende Acetat. OH^– wird an der äußeren Elektrode erzeugt und hat eine Verteilung, die zu jeder Zeit eine Konzentration hat, die mit Annäherung an die äußere Zone fast exponentiell steigt. Dieser Anstieg steigt mit steigender EI-Periode und zeigt im Wesentlichen das entgegengesetzte Verhalten der Analytionen. Die restliche Konzentration der Analyten in der äußersten Zone ist, wie beschrieben, künstlich hoch.
Das Modell der Anmelder versucht, die Diffusion zu berücksichtigen. Oberflächlich gesehen kann es scheinen, dass die Diffusion der flüssigen Phase langsam ist und im Vergleich mit dem durch das elektrische Feld bestimmten Transport der Ionen vernachlässigbar ist. Dies mag während der anfänglichen EI-Stufen richtig sein, der Diffusionstransport hat aber zwei wichtige Effekte bei annähernd vollständiger Analyteinleittung. Erstens kann die diffusive Mischung dem von der in einer Richtung erfolgenden Elektromigration bestimmten Transport entgegenwirken und dadurch die Zeit verlängern, die notwendig ist, jeglichen Analyten, in nahezu quantitativer Weise einzuleiten. Zweitens wird während des letzteren Teils einer EI-Periode in der äußersten Zone die NaOH-Konzentration ausreichend hoch, so dass die Zone sehr leitfähig wird und das lokale elektrische Feld schwach ist. In diesem Fall unterstützt die Diffusion den Transport in starkem Maße, insbesondere für OH^–, von der äußersten Zone nach innen. Man kann Fickschen diffusiven Transport zwischen zwei benachbarten Segmenten annehmen, so dass die durch Diffusion vom Segment k zum Segment k-1, ΔA_Di,k transportierte Menge der Spezies i sich ergibt aus:
ΔADi,k = Di(Ci,k – Ci,k–1)a/Δr (25a)
Mit dem Diffusionskoeffizienten D; (auch gleich μ_iRT/F), der Transport-Zwischenfläche a aus 2π_k–1h und dem Diffusionsabstand Δr ergibt sich der mittlere radiale Abstand zwischen zwei aneinander angrenzenden Segmenten aus (r_k-r_k_₂)/2. R ist die universale Gaskonstante, T die absolute Temperatur. Die modifizierte Form von Gleichung (22), die den Diffusionstransport berücksichtigt, ergibt sich somit aus:
ΔAi,k = μΔt(IρkiCi,k + 4πRTrk–1h(Ci,k – Ci,k–1)/(F(rk – rk–2))) (26A)
In der gleichen Weise, wie beschrieben, wird eine iterative Berechnung ausgeführt. 7 und 8 zeigen die den 5 und 6 entsprechenden Ergebnisse, mit der Ausnahme, dass nun die Diffusion berücksichtigt ist. Es sei darauf hingewiesen, dass die Berücksichtigung der Diffusionsmischung eine beachtliche Auswirkung hat auf die Verzögerung der Rate der Analyteinleitung durch die EI. Die größere Vermischung von Hydroxid von der äußersten Zone ist ebenfalls merklich. Aus dem gleichen Grund sind die künstlichen restlichen Analytkonzentrationen in der äußersten Zone nicht mehr sichtbar.
Die Differenzen zwischen den 7 und 8 und den entsprechenden 4 und 5 scheinen allein wegen der Auswirkungen der Diffusion aufzutreten. Die elektrische Beweglichkeit eines Analyten steht in linearer Beziehung zu seinem Diffusionskoeffizienten. Während aber die Elektromigration ein vom elektrischen Feld abhängiger Prozess ist, gilt dies nicht für die Diffusion. Entsprechend nimmt die relative Wichtigkeit der Diffusion bei niedrigeren angelegten EI-Spannungen zu. Die Differenz zwischen den zwei Ergebnisgruppen kann so auf der Grundlage dessen interpretiert werden, wie Änderungen der angelegten EI-Spannung den Prozess beeinflussen können. Man betrachte den Effekt von Änderungen der angelegten Spannung in einem numerischen Modell. Im Gegensatz zu Gleichung (1) ist bei konstantem Produkt aus Spannung und Zeit die EI bei höheren angelegten Spannungen wirksamer. Z. B. wird für Acetat 94,59% gegenüber 91,33% mit 5 s bei –6 kV eingeleitet, gegenüber 10 s bei –3 kV, und 99,87% gegenüber 99,62% mit 5 s bei 18 kV gegenüber 10 s bei 9 kV.
Die Anmelder haben auch versucht, die Auswirkungen der nicht diffusionsbedingten Mischung und der elektroosmotischen Strömung zu berücksichtigen. Gewiss, die Annahme; dass der Gesamtfilm eine gut gemischte Masse ist, ist eine zu starke Vereinfachung. Gleichwohl, auch die Annahme, dass der einzige Mischvorgang Diffusion ist, kann ebenfalls ungenau sein.
Die iterative Rechenprozedur der Anmelder setzt voraus, dass der Inhalt jedes 10 μm dicken Segments alle 100 μs homogenisiert wird. Diese Annahme stellt einen wesentlich effizienteren Prozess als die Diffusionsmischung allein dar. Weil aber die Berechnungen an Iterationsschritten kleiner 100 μs konvergieren, scheint so kein Fehler aufzutreten. In einem realen System besteht Grund für die Annahme, dass effizientere Mittel der Vermischung existieren, insbesondere in der innersten und der äußersten Zone. In ersten Fall kann die Gegenwart der Kapillarspitzen eine nicht diffusionsbedingte Vermischung bewirken, während im zweiten Fall die elektrolytische Gasentwicklung zu einer beachtlichen Vermischung führen kann.
Diese Erscheinungen lassen sich berücksichtigen durch eine Wahl der radialen Abstände, die die innerste und äußerste Zone definieren, weil eine solche Wahleffektiv das Volumen ändert, das bei jedem Iterationsschritt homogenisiert wird. Im Modell der Anmelder hatte eine Veränderung der RINZONE zwischen 50 μm und 150 μm (während die Breite der äußersten Zone und der Schlingenradius bei 10 μm bzw. 1000 μm konstant gehalten wurden) eine sehr geringe Auswirkung auf die Ergebnisse. Die in 10 s injizierte Chloridfraktion nimmt mit der genannten Erhöhung in der RINZONE von 99,4790% auf 99,4786% ab; auch die Änderung für Acetat ist sehr gering, nämlich von 91,1068% auf 91,1009%.
Die Auswirkung der Änderung der Breite der äußersten Zone ist deutlicher. In diesem Fall nimmt mit steigender Zonenbreite die injizierte Fraktion aller Ionen ab. Die RINZONE und der Schlingenradius wurden bei 50 μm bzw. 1000 μm konstant gehalten für die äußerste Zonenbreite von 10, 50, 100, 200 und 350 μm. Die in 10 s injizierten Chloridfraktionen betrugen 99,48%, 99,40%, 99,04%, 97,56% bzw. 94,40%, und die Acetatfraktionen betrugen 91,11%, 90,82%, 89,72%, 86,01% bzw. 79,52%. Der größere Effekt der Änderung der Breite der äußersten Zone ist verständlich. In diesem Bereich wird NaOH produziert, und es können starke Änderungen des effektiven elektrischen Feldes auftreten, wodurch ein größeres Volumen beeinflusst werden kann, wenn die Änderungen über ein größeres Volumen auftreten.
Der elektroosmotische Strom Q_eo ist während der EI im vorliegenden System ziemlich klein, nämlich 0,500 nl/s. Zur Berücksichtigung des elektroosmotischen Stroms wird angenommen, dass die durch EOF eingeleitete Menge innerhalb einer gegebenen Iterationsperiode der gleichen Zusammensetzung wie in der innersten Zone entspricht. Die modifizierte Form des Schritts 8 (unmittelbar nach Gleichung (24)) wird so formuliert zu:
mi,inj(neu) = mi,inj(alt)+ΔAi,k+QeoΔtCt,1 (27)
worin m_in,inj die in die Kapillare injizierte Menge des Analyten i ist und sich ΔA_i,k aus Gleichung (26) ergibt. Die Volumenänderung im Film infolge des EOF lässt sich durch eine entsprechende Änderung in der Filmdicke h berücksichtigen. Dies ist jedoch ein etwas kosmetischer Schritt, weil der vertikale Transport nicht als begrenzender Faktor berücksichtigt wird.
Wichtiger: Es ist notwendig, Änderungen der Analytmenge im Film und Konzentrationsänderungen zu berücksichtigen. Mit dem Ziel einer genaueren Alternative bei der Darstellung des realen Systems wird angenommen, dass der in die Kapillare injizierte Analyt wiedergegeben wird durch eine Änderung der Analytkonzentration über den Film hinweg, und zwar proportional zur Analytkonzentration in jeder Zone:
Ci,k(neu) = Ci,k(alt)·(mi,rem – QcoΔtCi,1/mi,rem·(h/(h–Δh)) (28)
worin m_i,rem die Restmenge des Analyten i im Film und Δh sich ergibt aus:
Δh = QeoΔt/(πr2 out) (30)
worin h die gegenwärtige Dicke des Films ist. Es sei erwähnt, dass auf der rechten Seite der Gleichung (28) der erste Term die Mengenänderung und der zweite Term die Volumenänderung infolge der Änderung der Dicke des Films berücksichtigt.
Im experimentellen System der Anmelder war EOF sehr langsam, und Q_eo berücksichtigt nur 1,5% des Filmvolumens über eine EI-Periode von 30 s bei 3 kV. Diese Verfeinerung des Modells der Anmelder führt als solche kaum zu einer merklichen Änderung, z. B. steigt bei einer 10 s dauernden EI-Periode mit Acetat die eingeleitete Fraktion von 91,11% auf 91,33%. Eine stärkere Änderung wird aber bei höherer EOF beobachtet. Bei dem obigen Beispiel betrug die eingeleitete Fraktion 93,42% bei um das Zehnfache größerer EOF.
Wie erwähnt, soll ein endliches, kleines Mikroreservoir aufrechterhalten werden, dessen Volumen vorzugsweise kleiner als etwa 1 μl ist. Die Drahtschlinge der 3A, 3B bildet ein solches Mikroreservoir in vorteilhafter Weise. Ferner bietet ein solches Mikroreservoir die Fähigkeit, die gesamte darin enthaltene Probe einem gleichförmigen elektrischen Feld auszusetzen, indem die das Mikroreservoir bildende Metallschlinge als Hochspannungselektrode verwendet wird. Die Anmelder haben andere Konfigurationen des Mikroreservoirs geprüft, d. h. eine leitfähige Hemisphäre, wie sie anhand von 3C beschrieben wurde.
Es werden nun die Auswirkungen der Radiusdimension einer Drahtschlinge oder eines hemisphärischen Mikroreservoirs betrachtet. Verständlicherweise ändert sich effektiv das Probenvolumen, wenn der Radius geändert wird. Für eine bestimmte angelegte Spannung ist für eine "vollständige" EI eine beträchtlich längere Zeitperiode erforderlich. 9 zeigt die Ergebnisse einer numerischen Simulation für injizierte Fraktionen von Chlorid und Acetat in Abhängigkeit vom Schlingenradius des Mikroreservoirs und der EI-Periode.
Für Vergleichszwecke haben die Anmelder unter Anwendung des hier beschriebenen Systems und der hier beschriebenen Schlingenelektrode die herkömmliche hydrodynamische und die herkömmliche EI-Injektion aus einem Fläschchen geprüft. Die hydrodynamische In jektion war über die Zeit linear, z. B. von 10 s bis 90 s war die Höhendifferenz 4,7 cm bei Verwendung von N,N-Dimethylformamid als Probe.
Die Spitzenfläche in willkürlichen Einheiten (wE) ist durch Gleichung (27) wie folgt gegeben:
Spitzenfläche (wE) = 12,39±0,37t(sec)–
(19,66±3,78);
r2 = 0,9867 (27)
[0082] Aus einem Fläschchen wurde die herkömmliche EI ausgeführt mit einem Spuren-Standardgemisch aus Cl^–, NO₃ ^–, HCOO^–, CH₃COO^–. Für eine EI-Periode von 1 s bis 30s mit einer Hochspannung von -3 kV wurden sämtliche individuellen Ionen mit einer Rate eingeleitet, die linear proportional zur EI-Periode war. Einzelne Werte von r² waren 0,9976 (Cl^–), 0,9980 (NO₃ ^–), 0,9968 (HCOO^–) und 0,9904 (CH₃COO^–). Weder die Konzentration der einzelnen Analyten in der Probe noch ihre Antwortfaktoren waren die gleichen. Es ist daher zweckmäßig, die Ergebnisse als äquivalente volumetrische Proben-Einleitungsrate zu bezeichnen. Die Rate ändert sich mit der Beweglichkeit des Probenions; sie beträgt 0,489±0,008 μl/s (Cl^–), 0,443±0,007 μl/s (NO₃ ^–), 0,338±0,007 μl/s (HCOO^–) und 0,2373±0,008 μl/s (CH₃COO^–).
Die Beziehung zwischen der Injektionsrate dV_inj/dt und der ionischen Beweglichkeit μ_i ist gegeben durch die Gleichung (28) als:
(dVinj/di) = (6,69±0,24)·102 μi-(4,51±1,54)·10–2 ,
r2 = 0,9975 (28)
Das obige Ergebnis steht in enger Übereinstimmung mit dem aus Gleichung (1) zu erwartenden. Diese Ergebnisse können aber die besten von solchen Systemen zu erwartenden sein; merkliche Abweichungen von dem aus Gleichung (1) erwarteten Verhalten sind bei höheren angelegten Spannungen zu beobachten.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Messungen bei –3 kV haben die Anmelder Versuche durchgeführt, bei angelegten EI-Spannungen von –6 kV und bis zu 15 s und –9 kV und bis zu 10 s. Bei jeder angelegten Spannung war die Beziehung zwischen der eingeleiteten Probenmenge und der EI-Periode für Cl– und NO3 (r² > 0,9970) linear. Für HCOO- war der r²-Wert gleich 0,9829 bei –9 kV, und für CH₃COO verschlechterte sich der lineare Wert r² auf 0,96 bei –6 kV und auf 0,25 bei –9 kV.
Bedeutsamer ist, dass aufgrund Gleichung (1) zu erwarten wäre, dass die Probeneinleitungsraten linear proportional zur angelegten Spannung sind. Für Cl- und NO₃- lag das Verhältnis der Einleitungsraten bei –3 kV, –6 kV und –9 kV bei 1 : 1,59 : 1,72 bzw. 1 : 1,45 : 1,50 statt der erwarteten Ergebnisse 1 : 2 : 3. Tatsächlich änderte sich die Einleitungsrate von Nitrat zwischen –6 kV und –9 kV kaum. Für Format war das beobachtete Verhältnis in Abhängigkeit von der angelegten Spannung 1 : 1,25 : 0,98 und die Einleitungsrate verminderte sich tatsächlich bei –9 kV. Dieser Effekt war bei Acetat deutlicher mit einem beobachteten Verhältnis von 1 : 0,83 : 0,05. Bei der höchsten angelegten Spannung wurde insgesamt sehr wenig Acetat eingeleitet, und die Menge war kaum abhängig von der EI-Periode (nämlich mit dem oben erwähnten r²).
Es ist unwahrscheinlich, dass für dieses Verhalten die elektrochemische Reduktion von Acetat ein plausibler Mechanismus ist. Vielmehr nehmen die Anmelder an, dass diese Verminderung auf die Abreicherung der sich langsam bewegenden Ionen in der Nähe der Kapillarenspitze ist. Wenn dies zutrifft, würde eine Verminderung der Konzentration der Analyten die Situation verschlechtern, besonders für die empfindlicheren Ionen.
10A und 10B zeigen übereinander gelegte Elektro-Pherogramme für das Spurentest-Standardgemisch der Anmelder (10A-(a)) und die Lösung von 10A-(a) , jedoch vierfach verdünnt (10A-(b)), wobei beide Lösungen für 30 s bei –3 kV der EI unterzogen wurden. Es sei darauf hingewiesen, dass Format und Acetat im Pherogramm der 10A-(b) nicht unterscheidbar sind.
Allgemein ist dieses Verhalten zumindest qualitativ verständlich. Wenn eine Kapillare und eine HV-Elektrode in ein Probenfläschchen eingetaucht und eine EI versucht wird, ist ein elektrisches Feld primär zwischen Kapillarenspitze und Elektrode vorhanden. Somit wird nur ein kleiner Teil des Probenvolumens dem elektrischen Feld ausgesetzt. Mit fortschreitender EI konzentriert die Elektrolytproduktion von Säure und Base das elektrische Feld auf den gleichen Bereich.
In einer Schlinge liegen die hypothetischen, aufeinander folgenden radialen Zonen elektrisch miteinander in Reihe. Bei der herkömmlichen EI liegen aber die verschiedenen Wege zwischen der Kapillarenspitze und der Elektrode effektivparallel zueinander und nicht in Reihe. Der Hauptmechanismus der Ergänzung der Analytionen, in diesem primären Feldbereich ist die Diffusion. Für ein Ion mit kleinem Diffusionskoeffizienten tritt nur ein geringer Transfer ein. Im Ergebnis entsteht in der Lösungsmasse kein Konzentrationsgradient, wo- durch der diffusive Transport weiter verhindert wird, ein sich selbst verewigender Effekt. Offensichtlich steigt der Bias, wenn die Analytkonzentration, um damit zu beginnen, gering ist, oder wenn das angelegte elektrische Feld hoch ist.
Es sei nun die Elektromigrationsinjektion (EI) aus einer symmetrischen Mikroreservoir-Elektrode, wie der Schlinge der Anmelder, und die Rolle des auf die Beweglichkeif zurückzuführenden Bias betrachtet. Ein besonders wichtiger Aspekt der EI aus einer Schlinge ist, dass die Art des Vorzugs, wie in 10A-(a) und 10A(b) gezeigt, weder theoretisch zu erwarten noch experimentell zu beobachten ist. 10B(c) zeigt die gleichen Bedingungen wie 10A-(b), mit der Ausnahme, dass nun EI ausgeführt wird (bei gleicher Spannung und gleicher Periode) aus einer Schlinge mit einem Volumen von 1 μl. Nicht nur werden alle vier erwarteten Spitzen beobachtet, sondern es wird auch eine Spitze infolge Carbonat beobachtet.
Ein endender Elektrolyt wie Natriumpentansulfonat wird bei der herkömmlichen EI oft zugefügt, um die Spurenanalyse zu verbessern; dies geschah für die Daten der 10B(d). 10B zeigt, dass bei der EI aus einer Schlinge von der Zugabe eines solchen Elektrolyten nichts gewonnen wird. Theoretisch ist zu erwarten, dass dieser bei der herkömmlichen EI angetroffene Bias mit der Geometrie des Feldes in Verbindung steht. Dementsprechend wurde ein Versuch unternommen, beidem die Probe in einer hemisphärischen Vertiefung mit einem Volumen von etwa 10 μl in einem Metallblock enthalten war, der als HV-Elektrode (3C) diente. Die Kapillarenspitze befand sich in der Mitte dieser Vertiefung. Die Ergebnisse sind sehr ähnlich zu den mit der Schlinge erzielten, was die Wichtigkeit der Geometrie des Feldes unterstreicht, dem die Probe ausgesetzt ist.
11A und 11B zeigen ein noch auffälligeres Beispiel des dynamischen Bereichs der EI aus einer Schlinge. Beim Versuch der 11A wurde Acetat zwischen 30 Teile pro Billion (ppb) bis 30 Teile pro Million (ppm) verändert, während Nitrat bei 300 ppb konstant gehalten wurde. Für die Daten in 11B wurde Acetat bei 200 ppb konstant gehalten und Nitrat ebenso verändert. Die um die Migrationszeitverschiebung korrigierten Spitzenflächen zeigen, dass die hier beschriebene Technik in vorteilhafter Weise einen wesentlich größeren dynamischen Bereich ermöglicht als dies bei der herkömmlichen EI möglich ist.
Die Ergebnisse der Probeneinleitung durch die EI von einer Schlinge wurden bei angelegten Spannungen im Bereich von 3 kV bis 18 kV, variiert in Schritten von 3 kV, für Produkte V·t zwischen 9 kV·s bis 108 kV·s untersucht. Die Ergebnisse der EI von der Schlinge sind, wie oben beschrieben, von der EI aus der Probenflasche sehr unterschiedlich. Für ein bestimmtes Produkt V·t ist die Einleitung, wie theoretisch zu erwarten, bei höheren angelegten Spannungen vollständiger.
12 zeigt die Änderung des Chlorid/Acetat-Spitzenflächenverhältnisses in Abhängigkeit von der EI-Periode bei unterschiedlichen angelegten Spannungen für eine Schlinge mit 1 μl. Für dieses Diagramm wurde das Flächenverhältnis bei höchster angelegter Spannung (18 kV) für die kleinste Zeitperiode (0,5s) willkürlich auf eins gesetzt. Während der Bias unter diesen Bedingungen der höchste wäre, wird erwartet, dass der Grenzwert von 0,535 (Acetat/Chlorid-Beweglichkeitsverhältnis) bei höheren Produkten V·t erreicht wird. Dies wurde tatsächlich beobachtet.
Es wurde die Vollständigkeit der Injektion und die Größe des Vorzugs untersucht. 13A und 13B zeigen die Daten von einer geneigten Schlinge mit einem Radius von 1 mm und einem Volumen von etwa 1 μl (3B). Da das genaue Volumen schwierig zu bestimmen war, wird in 13 auf der Ordinate ein injiziertes äquivalentes Volumen, d. h. in diesem Volumen enthaltener Analyt verwendet. Die Ergebnisse sind qualitativ ähnlich den anhand 5 beschriebenen Modellberechnungen. Die Wirksamkeit war jedoch insofern geringer, als eine Zeit von etwa 50 s erforderlich war, um das zu erreichen, was in dem früheren Modell innerhalb von 10 s erreicht wurde. Die Anmelder nehmen an, dass dies aus der Tatsache rührt, dass das vorliegende Modell die Begrenzungen im vertikalen Transport nicht berücksichtigt, d. h. ein 320 μm dicker Film ist schwerlich unendlich dünn. Das breite allgemeine Muster ist jedoch das gleiche wie das im Modell. 13B zeigt, dass bei vollständiger Elektromigration der Bias stark vermindert, aber nicht vollständig beseitigt wird.
Wie theoretisch zu erwarten, wurde beobachtet, dass größere Schlingen zu einer weniger vollständigen Injektion und zu einem größeren Bias führen, wenn die EI während der gleichen Periode bei gleicher Spannung durchgeführt wird. Andererseits ist, weil eine vertikale Planare Schlinge weniger Flüssigkeit hält, bei diesen Schlingen unter den gleichen EI-Bedingungen für den gleichen Schlingenradius die Injektion vollständiger und der Bias geringer.
Da als Ergebnis der EI Hydroxid gebildet wird, wird es in das System injiziert. BGE hat eine endliche Pufferkapazität, und die OH^–-Spitze erscheint somit erst, wenn diese Kapazität überschritten wird. Ein Beispiel ist in 14 gezeigt, bei dem für eine EI-Zeitperiode von 15 s keine Hydroxidspitze sichtbar ist, jedoch bei weitem die größte Spitze bei einer EI-Periode von 25 s. Die integrierte Hydroxid-Spitzenfläche bei EI-Perioden im Bereich von 25 s bis 60 s steht in linearer Beziehung mit der EI-Periode bei einem Wert r² gleich 0,9996. Aus 4 ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen der OH^–-Einleitung und der Zeit. Es ist auch vorhersehbar, dass eine positive Spitze erscheint, weil Hydroxid erstmalig nach einer EI von 20 s auftritt.
Zusammenfassend haben die Anmelder gezeigt, dass wesentliche Verbesserungen der EI und der KE erzielt werden können, wenn die Injektion von einem kleinen endlichen Wolumen erfolgt, bei dem die gesamte Probe einem symmetrischen elektrischen Feld ausgesetzt wird. Tatsächlich kann die Verwendung der hier beschriebenen Mikroreservoir-Elektroden ein zweckmäßigeres und wirksameres Injektionsverfahren bei der KE darstellen als das, was gegenwärtig im Stand der Technik praktiziert wird. Verständlicherweise lassen sich die Ergebnisse der Anmelder bei Verwendung von auf Drahtschlingen gebildeten Filmen auch auf andere Geometrien anwenden, zusätzlich zur Ausbildung hemisphärischer Vertiefungen in einer metallisierten Mikrotiter-Platte. Eine automatische Probenentnahmeanordnung kann mit einer Vielzahl von Mikroreservoir-Elektroden verwendet werden.
Die Anmelder gehen davon aus, dass die vorliegende Erfindung nicht nur die Probenentnahme und Injektion bei der KE und in anderen Trennsystemen verbessern kann, sondern gleichzeitig auch die Erfassungsgrenzen über das hinaus, was mit herkömmlichen Detektoren derzeit erreichbar ist, verbessert. Die Einleitung von H⁺ oder OH^– kann vermutlich durch Verwendung von Membrananordnungen verhindert werden, sollte diese Einleitung ein wesentlicher Faktor werden.
Die beschriebenen Ausführungsformen können modifiziert und variiert werden, ohne vom Umfang der in den nachfolgenden Ansprüchen definierten Erfindung abzuweichen. Zwar wurde die vorliegende Erfindung hauptsächlich mit Bezug auf Tests unter Verwendung eines Kapillaren-Elektrophorese-Trennsystems beschrieben, die vorliegende Erfindung kann jedoch auch in einem Kapillar-Elektrochromatographie-Trennsystem ausgeführt werden

Claims

Verfahren zum vollständigen Injizieren von Analytionen durch Elektromigration in eine Trenn-Kapillarleitung, bei dem die Analytionen einer gewählten Polarität in einer Probe durch Anlegen einer Hochspannung zum Wandern gebracht werden, so dass die Injektion im wesentlichen unabhängig ist von der Innenbeweglichkeit einzelner Analytionen und im wesentlichen unabhängig ist von der Leitfähigkeit der Probe, mit folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines elektrisch leitfähigen Mikroreservoirs, das ein im wesentlichen konstantes endliches und symmetrisch geformtes Haltevolumen begrenzt, in dem ein reproduzierbares Volumen der Probe gehalten wird, (b) Anordnen der Eingangsspitze der Trennkapillare in Kontakt mit einem Teil der Probe am Symmetriezentrum des Mikroreservoirs und (c) Aussetzen der gesamten im elektrisch leitfähigen Mikroreservoir gehaltenen Probe einem symmetrischen elektrischen Feld durch Verbinden eines Leiters der Hochspannung mit dem Mikroreservoir, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochspannung für eine Zeitperiode eingeschaltet wird, die ausreicht, die Analytionen in der Probe der gewählten Polarität im wesentlichen vollständig in die Spitze der Trennkapillare einzuleiten, ohne gleichzeitig ein beachtliches Flüssigkeitsvolumen einzuleiten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe im Schritt (a) ein kleiner aus dem die Probe enthaltenden Behälter entnommener Rest oder Teil ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zeitperiode in Schritt (c) zwischen 30 und 60 Sekunden liegt.
Anwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche in einem elektrophoretischen Trennsystem oder einem kapillar-elektrochromatographischen Trennsystem.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) das Bereitstellen eines Mikroreservoirs umfasst, das gewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus (i) einem Mikroreservoir, hergestellt aus leitfähigem Draht, der zu einer kreisförmigen Schlinge geformt ist, die eine gewünschte Schlingenfläche begrenzt und (ii) einem Mikroreservoir, das einen Basisteil enthält, in dem eine symmetrische halbkugelförmige Vertiefung vorgesehen ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Schritt (a) das Bereitstellen eines Mikroreservoirs umfasst, das aus leitfähigem, in eine kreisförmige Schlinge geformtem Draht hergestellt ist, die eine gewünschte Schlingenfläche begrenzt und eine Schlingenfläche definiert, die in einer Ebene orientiert ist, die gewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus (a) einer Ebene parallel zu einer Längsachse der Trennkapillare und (b) einer von einer Längsachse der Trennkapillare durch einen Winkel zwischen 45° und 90° versetzten Ebene.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Haltevolumen in Schritt (a) ein Volumen kleiner als 2 Mikroliter ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Haltevolumen ein Volumen kleiner als 1 Mikroliter ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Haltevolumen ein Volumen kleiner als 0,5 Mikroliter ist.