DE2554386A1

DE2554386A1 - Elutions-einrichtung

Info

Publication number: DE2554386A1
Application number: DE19752554386
Authority: DE
Inventors: Harold Ernest Ballen; Clifford Lee Kragt
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1974-12-26
Filing date: 1975-12-03
Publication date: 1976-07-08
Also published as: US3989612A; CH612761A5; GB1528604A; JPS5189879A

Description

PATENTANWÄLTE A. GRÜNECKER

DIPL-(NG

H. KINKELDEY

DR ING

W. STOCKMAIR

DR-ING. - AiE(CALrECHi

K. SCHUMANN

DR RER ΜΑΓ OiPL PHYS

P. H. JAKOB

DJPL-ING

G. BEZOLD

DR HER NAT- DiPL-ChEM

MÜNCHEN E. K. WEIL

DR BER OEC INC»

LINDAU

β MÜNCHEN 22

MAXIMILIANSTRASSE 43

3. Dezember 1975 PH 9869

The Upjohn Company

301 Henrietta Street, Kalamazoo, Michigan, USA

Elutions-Einrichtung

Die Erfindung betrifft eine Elutions-Einrichtung zum Eluieren eines gelbsten Stoffes aus einem Elektrophorese-Trenngel mit ersten und zweiten Behältern, die jeweils einen Hohlraum für die Aufnahme einer Pufferlösung und in jedem Hohlraum eine Elektrode aufweisen, und mit einer Aussparung, um ein längliches, dünnes Elektrophorese-Trenngel abgedichtet zwischen den Behältern zu haltern.

Allgemein bezieht die vorliegende Erfindung sich auf ein Verfahren und eine Einrichtung, um durch Elektrophorese eine oder mehrere ausgewählte Fraktionen auszuspülen bzw. zu eluieren, die in einem Elektrophorese-Trägermaterial oder einem Trenngel vorliegen, das ver-

609828/0537

schiedene discrete Bänder bzw. Bereiche von unterschiedlichen Fraktionen enthält.

Ausgezeichnete Fraktionierungen oder Trennungen von Gemischen verschiedener Substanzen, wie beispielsweise Proteine, Glykoproteine, nucleotide, Nukleinsäuren, usw. lassen sich durch Elektrophorese erhalten, wobei Gele als elektrophoretische Trennmatrix eingesetzt werden. Zu diesem Zweck werden Gele aus verschiedenen Materialien, wie beispielsweise Polyakrylamid, Stärke, Agar und Gelatine verwendet. Bevorzugt werden Polyakrylamidgele in Form von langgestreckten Zylindern oder flachen Platten bzw. Tafeln eingesetzt.

Bei der Gelelektrophorese wandern Teilchen mit einer effektiven elektrischen Ladung unter der Einwirkung eines elektrischen Feldes (Potentialgradient), das an das Gel angelegt wird, in dem Gel. Teilchen mit unterschiedlicher Ladung wandern mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel. Bei Teilchen mit gleicher Ladung bewegen sich die größeren Moleküle während ihrer Wanderung durch die Poren der dreidimensionalen Gelstruktur langsamer als die kleineren Moleküle, und zwar wegen des Molekularsiebeffektes. Ein Gemisch von Ausgangsbestandteilen wird also scharf in bestimmte, definierte Fraktionen aufgetrennt, wozu sowohl die Unterschiede in den elektrischen Ladungen der Bestandteile des Ausgangsgemischs als auch die Unterschiede in ihren Molekülgrößen beitragen. Als Folge der Elektrophorese befinden sich die einzelnen Bestandteile des Ausgangsgemischs als getrennte, longitudinal im Abstand angeordnete, im allgemeinen quer verlaufende, diskrete Bänder oder Zonen in dem Gel. In der longitudinalen Eichtung des Gels gemessen, können diese Zonen verschiedene Breiten haben, die im Bereich von ungefähr 1 mm bis ungefähr 1,5 cm liegen. Diese in dem Gel vorliegenden getrennten Fraktionen können festgestellt oder besser sichtbar gemacht werden, indem das Gel mit Fixativ-Farbstoff--, lösungen versetzt wird. Als Alternative hierzu kann das Ausgangsgemisch mit einem Radioisotop gekennzeichnet werr-■ ■ ^:- 609828/0537

den; die getrennten Fraktionen lassen sich dann durch Ermittlung des Radioisotops lokalisieren. Die Gele könnenverschiedenen analytischen Bestimmungen unterworfen werden, wie es auf diesem Gebiet oft durchgeführt wird.

Es wird angestrebt, die einzelnen, als Bänder in dem Trenngel vorliegenden Fraktionen getrennt wiederzuge-. winnen, um die einzelnen Fraktionen in einem Zustand zu erhalten, der für die weitere Analyse geeignet ist. Es aind "bereits Verfahren vorgeschlagen worden , eine ausgewählte Gelfraktion zu extrahieren, indem der GeI-zyiinoer oder die Geltafel in getrennte Segmente zerschnitten wirdj anschließend wird Jedes Segment (oder mehrere entsprechende Gelsegmente aus verschiedenen Trenngelen) homogenisiert; dann wird das Segment mit Wasser oder einer Pufferlösung eluiert, und das Eluat wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren getrennt. Bei diesem Verfahren ergehen sich jedoch nur geringe Ausbeuten. Bei einem anderen Elutionsverfahren wird jedes Gelsegment (oder entsprechende Gelsegmente von verschiedenen Trenngelen) homogenisiert und dann mit einer neuen Gellösung gemischt, die polymerisiert wird, so daß ein neuer Gelzylinder oder eine neue Gelplatte entsteht. Das neue Gel wird dann der Elektrophorese unterworfen, bis die Fraktion durch Freifluß-Elektrophorese aus dem Gel gespült ist. Dieses Verfahren ist jedoch sehr komplex, seine Ausbeute ist gering, und die extrahierte Fraktion ist sehr stark verdünnt.

Weiterhin ist ein Verfahren zur kontinuierlichen Trennung und Elution durch Elektrophorese vorgeschlagen worden. Diese Technik eignet sich als Präparat ions verfahr en, bei dem die Fraktionen in mg-Mengen wiedergewonnen werden. Die Ausrüstung für dieses Verfahren ist jedoch kompliziert und kostspielig. Außerdem läßt sich das Verfahren nicht gut im Laboratorium einsetzen, um mikroanalytische Trennungen (im mg-Bereich) oder ultramikro-

609828/0537

-4- 255A386

analytische 'Trennungen (Nanogramm-oder Pie ograinm-Bereich) durchzuführen»

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Elutions-Einrichtung sowie ein Verfahren zum Eluieren von gelösten Stoffen zu schaffen,mit der "bzw. dem die einzelnen Fraktionen von gelösten Stoffen, die in einem Elektrophorese-Trenngel vorliegen, getrennt und mit hoher Ausbeute wiedergewonnen werden können.

Diese Aufgabe wird bei einer Elutionseinrichtung der angegebenen Gattung dadurch gelöst, daß sich ein Paar seitlich ausgerichteter, durchgehender Elutionsöffnungen von den gegenüberliegenden seitlichen Seiten der Aussparung zu den jeweiligen Hohlräumen erstreckt, wobei die Elutionsöffnungen wenigstens eine Oberflächenabmessung haben, die kurzer als die entsprechende Oberflächenabmessung der Aussparung ist, so daß eine Zone mit begrenzter Fläche der Aussparung direkt durch die Elutionsöffnungen mit den Hohlräumen in Verbindung steht, damit der in der entsprechenden Zone eines in dem Hohlraum angeordneten Elektrophorese-Trenngels vorliegende gelöste Stoff in eine der Pufferlösungen eluierbar ist, indem die Elektroden erregt werden, um einen Potentialgradienten quer zu dem Gel zu erzeugen.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile liegen insbesondere darin, daß eine Elutions-Einrichtung bzw. ein Verfahren geschaffen werden, die insbesondere für die Durchführung von mikroanalytischen und ultramikroanalytischen Trennungen geeignet sind, wobei die gewünschten Fraktionen mit einer sehr hohen Ausbeute wiedergewonnen werden. Außerdem ist die Elutionseinrichtung relativ einfach und läßt sich mit geringen Kosten herstellen; sie ist einfach zu handhaben und zuverlässig sowie stabil beim G&rauch.

609828/0537

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird also ein ausgewähltes Segment eines Elektrophorese-Trenngel, das eine oder mehrere Bänder von Fraktionen oder gelösten Stoffen enthält, auf seinen gegenüberliegenden Seiten in einer Zone, die sich nur über einen Bruchteil der Gesamtoberfläche des Gelsegmentes erstreckt, mit Pufferlösungen in Kontakt gebracht. Die Zone enthält im wesentlichen nur ein Band eines gelösten Stoffes. Ein Potentialgradient wird zwischen den Pufferlösungen angelegt, so daß nur der gelöste Stoff in der Zone durch Elektrophorese in eine der Pufferlösungen wandert. D.h. also, daß sich nur eine Fraktion oder ein Klöster Stoff in der zuletzt erwähnten Pufferlösung befindet und für die Wiedergewinnung aus der Pufferlösung.zur Verfügung steht. Die Einrichtung weist ein Paar Kammern für die Aufnahme der Pufferlösungen, ein Paar Elutionsfenster, die sich zwischen den Kammern befinden, und eine Anordnung auf, um ein Gelsegment sicher zwischen den Penstern zu haltern. Die Elutionsfenster haben durchgehende Öffnungen begrenzter Breite und/oder Höhe, so daß die Pufferlösungen nur mit der Zone des Gelsegmentes in Kontakt kommen können, die ein einziges Band de3 gelösten Stoffes enthält. ¥enn der elektrische Potentialgradient mit Hilfe der Elektroden, die sich in den Kammern befinden, zwischen den Pufferlösungen angelegt wird, kann nur der gelöste Stoff in der Zone, die zu den Pufferlösungen freiliegt, aufgrund der Elektrophorese wandern, so daß sich nur dieser gelöste Stoff in eine der Pufferlösungen bewegt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden, schematischen Zeichnungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 eine idealisierte, isometrische Ansicht

609828/0537

eines Elektrophorese-Trenngels in Form einer flachen Platte, die diskrete Bänder von gelösten Stoffen enthält, wie durch die sdraffierten Flächen angedeutet wird. Diese Figur soll nicht das Produkt irgend eines spezifischen Gel-Elektrophorese-Trennverfahrens darstellen;

Fig. 2 eine explidierte perspektivische Ansicht der Einrichtung nach der Erfindung;

Fig. 3 eine mittlere, horizontale Schnittansicht der Einrichtung nach Fig. 2im zusammengebauten Zustand;

Fig. 4 eine Schnittansicht längs Linie III III von Fig. 3;

Fig. 5 eine einem Teil von Fig. 3 entsprechende Ansicht zur Erläuterung einer modifizierten Ausführungsform, die bei einem Gelsegment verwendbar ist, das aus einem zylindrischen Elektrophorese-Trenngel geschnitten ist;

Fig. 6 eine Vorderansicht der Ausführungsform nach Fig. 5; und

Fig. 7 eine einem Teil von Fig. 3 entsprechende Ansicht zur Erläuterung einer weiteren, modifizierten Ausführungsform.

In Fig. 1 ist eine idealisierte Darstellung des Gelproduktes eines herkömmlichen Elektrophorese-Trennverfahrens gezeigt. Die einzelnen Verfahrensschritte selbst sind bekannt, so daß sie nicht erläutert werden müssen. Das Gel A ist in Form einer flachen Platte bzw. Tafel dargestellt; selbstverständlich läßt sich die Erfindung

609828/0537

jedoch auch, "bei herkömmlichen zylindrischen Elektrophorese-Trenngelen anwenden. Gemäß der Darstellung weist das Gel A vier diskrete Bänder von gelösten Stoffen B, G, D und B auf. Diese Bänder:, sind longitudinal in dem Gel A im Abstand angeordnet und erstrecken sich im allgemeinen q.uer über das Gel. Die Bänder.' sind in Pig. 1 jedoch idealisiert dargestellt, um die Klarheit und Übersichtlichkeit der Zeichnung und der Beschreibung zu erhöhen. In der Praxis kann das Gel eine Vielzahl von Bändern mit verschiedenen Breiten enthalten, die im allgemeinen im Bereich von ungefähr 1mm bis ungefähr 1,5 cm liegen; außerdem können die Bänder in Bezug auf die Vertikale geneigt oder etwas gebogen bzw. gekrümmt sein. Hier soll nur zu den Elektrophorese-Trenngelen gesagt werden, daß die Bestandteile des Ausgangsgemischs getrennt werden und einzeln als diskrete Bänder in der Gelstruktur vorhanden sind.

Um die Fraktion zu gewinnen, die eines der Bänder, wie beispielsweise das Band C in Fig. 1, aufweist, wird das Gel A quer in ein Segment F zerschnitten, welches das Band G sowie auch Teile der Bänder B und D enthält. Dieses Segment F wird dann durch das im folgenden zu beschreibende Verfahren eluiert, um die im Band C vorhandene Fraktion in im wesentlichen reiner Form zu gewinnen.

Wie sich aus den Figuren 2 bis 4 ergibt, weist die EIutions-Einrichtung 10 ein Paar im allgemeinen rechtwinkliger Pufferbehälter 11 und 12 auf. Der Behälter 1.1 enthält Seitenwände 13 und 14 sowie eine Bodenwand T6. Die Wände 13, 14 und 16 bilden einen im allgemeinen rechtwinkligen, inneren Hohlraum 17, der längs seiner axial inneren Seite offen ist. Die axial inneren Oberflächen der TSände 13» 14 und 16 sind flach bzw. eben und koplanar. Die äußere axiale Seite des Hohlraums 17 ist durch eine Endwand bzw. Stirnwand 18 verschlossen.

609828/0537

Bine flexible, elasbische Dichtung 19 ist an den koplanaren, axial inneren Oberflächen der Seitenwände 13 und H und der Bodenwand 16 vorgesehen. Die Dichtung 19 umgibt den Urifaag.des Hohlraums 17 auf drei Seiten, so daß ein lecksicherer bzw. dichter Eingriff mit dem noch zu beschreibenden Elutionsfenster entsteht. Die Dichtung 19 hat nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform einen rohrförmigen Querschnitt und besteht beispielsweise aus einem dünnwandigen Polytetrafluoräthylen-Rohr.

Quer verlaufende Plansche bzw. umgebogene Sander 21 und 22 sind an den Seitenwänden 13 und 14 in der ÜTähe ihrer axial inneren Oberflächen ausgebildet; die Plansche stehen in Richtung aufeinander zu vor, und zwar teilweise über die offene, axial innere Seite des Hohlraums 17. Diese Plansche wirken mit dem Elutionsfenster auf eine Weise zusammen, wie sie im folgenden beschrieben werden soll.

Eine im allgemeinen U-förmige Elektrode 23? beispielsweise ein Platindraht, ist so in dem Hohlraum 17 angeordnet, daß sie sich im Kontakt mit der Stim^zand 18 befindet trad von ihr gehaltert wird. Ein Ende der Elek-_ trode 23 ist an einem Ansehlußteil 24 angebracht, dae an der äußeren Seite der Stirnwand 18 befestigt.ist, vm die Elektrode mit einem Anschluß einer herkömmlichen Quelle für ein Gleichstrom-Blektrophoresepotential zu verbinden* Die Elektrode 23 erstreckt sich im wesentlichen von der Oberseite des Hohlraums zu seinem Boden. 33as andere Bade der Elektrode ~23 ist is die Stirswasd 18 eingebettet und wird von ihr gehaltert.

Ε±ώ Sühlmitteldurchgaag 26 ist in den Seitenwinden 13 und H some der Bodenwaad 16 des BeiiäTtera vorgesehen, um die ^shresä der Elektrophorese erzeugte ohmsche ULrme abzuleiten, feiterhin sind iia de» Se it en wän den mit einem

609828/0537

Gewinde versehene öffnungen 27 ausgebildet, um die Bolzen bzw. Schrauben aufzunehmen, mit denen die einzelnen Teile der Elutionseinrichtung zusammenmontiert werden.

Der andere Pufferbehälter 12 hat im wesentlichen den gleichen Aufbau wie der Pufferbehälter 11, so daß entsprechende Teile mit den gleichen Bezugszeichen, jedoch mit den Zusatz "a" versehen, bezeichnet sind. Die Öffnungen 27a in dein Behälter 12 weisen jedoch kein Gewinde auf.

Ein Elutionsfenster bzw. eine Elutionsöffnung 28 ist in der Nähe der axial inneren Oberfläche des Pufferbehälters 11 so angeordnet, daß sich eine abgedichtete Verbindung bzw. Berührung ergibt. Das Elutionsfenster 28 weist eine flache Platte mit einem in der Mitte angeordneten Vorsprung 29 auf der Seite auf, die dem Hohlraum 17 des Behälters 11 gegenüberliegt. Der Vorsprung 29 ist rechtwinklig ausgelegt; seine Größe ist so bemessen, daß er fest bzw. eng anliegend in den Hohlraum 17 paßt; er erstreckt sich teilweise in den Hohlraum 17, um seine offene Seits abzuschließen. Zu diesem Zweck passen die Seitenränder des Vorsprungs 29 fest bzw. eng anliegend zwischen die Flansche 21 und 22, während der Bodenrand des Vorsprungs eine ähnliche Passung mit dem Bodenrand des Hohlraums 17 aufweist. Die Randbereiche 31 des den Vorsprung 29 umgebenden Elutionsfensters sind flach, so daß sie Fläche-an-Fläche in Eingriff mit den koplauaren, flachen, inneren Oberflächen der Seitenwände 13 und 14- und der Bodenwand 16 des Behälters 11 kommen. Die Dichtung 19 stellt eine fluiddichte Abdichtung zwischen dies.en Teilen her. Bei der in den Figuren 2 bis 4 gezeigten Ausführungsform ist die gegenüberliegende Oberfläche 32 des Elutionsfensters flach. Ein Durchgang 33, der hier als vertikal verlaufender, länglicher Schlitz ausgebildet ist, ist in dem Elutionsfenster 28

609828/0537

ausgebildet, so daß eine Flüssigkeit bzw. ein fluides Medium durchströmen kann. Der Durchgang 33 erstreckt sich vollständig durch den Vorsprung 29, so daß er sich in seinem Mitt elfter eich zu dem Hohlraum 17 öffnet; der Durchgang ist im wesentlichen symmetrisch zwischen den Schenkeln der Elektrode 23 angeordnet. Das Elutionsfenster weist Öffnungen 34 auf, durch welche sich die Bolzen "bzw. Schrauben erstrecken. Außerdem enthält es einen vorstehenden Rand 35, der den Durchgang 33 umgibt, um in die 6-elprobe einzudringen; dadurch läßt sich die Abdichtung verbessern.

Ein zweites Elutionsfenster 36 wirkt in ähnlicher Weise mit dem zweiten Pufferbehälter 12 zusammen. Entsprechende Teile sind mit gleichen Bezugszeichen, jedoch mit dem Zusatz "a" versehen, gekennzeichnet.

Die Schlitze 33 und 33a haben im wesentlichen die gleiche Größe und Form und sind miteinander ausgerichtet. Die Schlitze 33 und 33a haben eine solche Größe und Form, daß sie sich nur über einer ausgewählten Zone des Gelsegmentes Fbefinden und diese freigeben; diese Zone ist ein Bruchteil der Gesamtoberfläche des Segmentes F. Sie bedeckt die gesamte oder einen Bruchteil der Breite des Bandes C.

Ein flaches Abstandsstück 37 ist zwischen den einander gegenüberliegenden, flachen Oberflächen 32 und 32a der Elutionsf enster 28 und 36' vorgesehen, um eine Abdichtung zwischen diesen Teilen herzustellen. Das Abstandsstück weist einen rechtwinkligen Hohlraum 38 mit im-wesentlichen der gleichen Größe wie die Hohlräume 17 und 17a auf; der Hohlraumes hat eine größere vertikale Abmessung als die Durchgänge 33 und 33a. Das Abstandsstück weist Öffnungen 39 auf, durch welche sich die Bolzen bzw. Schrauben erstrecken. Das Segment F. des vorhex· durch Elektrophorese getrennten Gelmaterials wird eng

609828/0537

anliegend in dem Hohlraum 38 aufgenommen, so daß eine ausgewählte Zone dieses Segmentes Fläche-an-Fläche den Durchgängen 33 und 33a in den Elutionsfenstern gegenüberliegt. Das Abstandsstück 37 verhindert, daß das relativ zerbrechliche Gelsegment F allzu stark zusammengedrückt wird, wenn die Einrichtung 10 zusammengebaut wird; dadurch bleibt der Aufbau bzw. die Struktur des Gelsegmentes unverändert. Die Dicke des Gelsegmentes ist jedoch etwas größer als die Dicke des Abstandsstückes 37; wenn also die Teile miteinander verbunden werden, wird das Gelsegment etwas zusammengedrückt, so daß eine Abdichtung zwischen den Oberflächen 32 und 32a der Elutionsfenster entsteht. Das Gelsegment F kann beispielsweise eine Dikke von ungefähr 2mm haben; es kann ungefähr 0,1 mm zusammengedrückt werden, d.h., auf eine Dicke von ungefähr 1,9 mm.

Bei der Benutzung der Einrichtung werden die oben beschriebenen Teile mit Hilfe von Bolzen bzw. Schrauben miteinander verbunden.

längs ihrer oberen Seite ist die Elutionseinrichtung 10 offen. Proben der die gewünschte Fraktion enthaltenden Pufferlösung können von Zeit zu Zeit mittels einer Pipette oder einem ähnlichen Gerät entnommen werden. Am Ende der Elution kann die gesamte Pufferlösung in ähnlicher Weise entnommen werden.

Mit Ausnahme der Elektroden 23 und 23a und der Anschlußteile 24 und 24a sind alle oben beschriebenen Teile aus einem geeigneten, elektrisch isolierenden Material hergestellt; als Material kann beispielsweise ein Polykarbonat-Kunstharz, z. B. Lexan-Kunstharz, ein Produkt der General Elejbric Company, verwendet werden.

In den Figuren 5 und 6 ist eine modifizierte Ausführungs-

60 9 828/0537

25b4386

- "44- —

form dargestellt, bei der das Gelsegment F' die Form eines Halbzylinders hat; diese Form wird dadurch erhalten, daß ein zylindrisches Elektrophorese-Trenngel in seiner Länge aufgeschnitten wird. Es wird kein Abstandsstück 37 verwendet; stattdessen weist eins der Elutionsfenster, in diesem Pail das Fenster 28', einen halbzylindrischen Hohlraum 51 auf, der das G-elsegment F¹ eng anliegend aufnimmt. Statt der vertikalen Schlitze 33 und 33a haben die Elutionsfenster 28' und 36' horizon« tale Schlitze 52 und 52a, so daß längs der vertikalen Ausdehnung des Gelsegmentes P' nur eine ausgewählte Zone freiliegt. Die Schlitze erstrecken sieb/über die gesamte Breite des Gelsegmentes.

Pig. 7 zeigt eine weitere Modifikation, bei der sdeder kein Abstandsstück 37 verwendet wird. Hierbei haben die Elutionsfenster 28*^s und 36^IJ zusammenwirkende Aussparungen 53 und 54 in ihren einander gegenüberliegenden Oberflächen, so daß ein Hohlraum entsteht, um das Gelsegment P aufzunehmen und eng anliegend au halten.

Es sind also verschiedene Ausgestaltungen möglich, um das Gels egment zu halten; außerdem können die Elutionsfenster mit Durchgängen unterschiedlicher Größe, Formen und Ausrichtungen versehen werden, so daß nur eine ausgewählte Zone des Ge!segmentes freiliegt.

Im folgenden soll die Punktionsweise der erfindungsge— mäßen Elutionseinriohtung im einzelnen erläutert werden.

Das frenngel A wird mit der herkömmlichen G-el-Elektrophorese erhalten, Wenn das Gel A die Form eluar flachen 3?afel hat, wie sie in Pig. 1 dargestellt ist, wird das Gel zerschnitten, so daß ein Segment P entsteht welches das Band C und Bereiche der Bänder D und B enthält· 33as

609828/0537

Gelsegiaent wird in dem Halter 37 angeordnet, so daß sich das Band c im wesentlichen senkrecht in den Hohlraum erstreckt. Dann werden die Elutionsfenster 28 und 36 und die Behälter 11 und 12 für die Pufferlösung montiert; diese Teile werden durch die Schrauben 41 miteinander verbunden. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Durchgänge 33 und 33a über einem Teil oder über dem ganzen Band C; sie liegen jedoch nicht über den anderen Bändern in dem Segment P. D.h. also, daß nur das Band C zu den Hohlräumen 17 und 17a freiliegt. Die gesamte Einrichtung wird längs ihrer Seiten und ihres Bodens abgedichtet; dazu werden sowohl die Dichtung 19 als auch die Eandbereiche des Segmentes P verwendet, die etwas elastisch zwischen den einander gegenüberliegenden Oberflächen 32 und 32a der Elutionsfenster zusammengedrückt werden.

Dann werden die Hohlräume mit Pufferlösungen gefüllt, die für die Elektrophorese geeignet sind. Die Pufferlösungen können in Abhängigkeit von der verwendeten, bekannten Technik ausgewählt werden, wobei die Art der zu gewinnden Fraktion, die Art des Gelsystems, der erforderliche pH-Wert und ähnliche Paktoren berücksichtigt werden. Als Puffer werden wässrige Lösungen verwendet, die sauer oder alkalisch sein können; sie haben im allgemeinen eine Konzentration von ungefähr 10 $ der Pufferbestandteile. Zu den geeigneten Pufferbestandteilen gehören Tris~(Hydroxymethyl)-Aminomethan, Borsäure, Glyzin usw.

Die Elektroden 23 und 23a werden nun mit einer Elektrophorese-Gleichstromquelle verbunden. Solche Quellen sind im Handel erhältlich. Sie liefern im allgemeinen bis zu ungefähr. 400 Y und bis zu ungefähr 50 mA. Im allgemeinen wird die Stromintensität reguliert, so daß eine konstante Stromzuführung erfolgt. Dabei werden Ströme

609828/0537

von mehr als 40 elA zweckmäßigerweise vermieden, um die Erzeugung einer zu hohen ohmschen ^T»Värme zu verhindern.

■Während der Elektrophorese werden die Behälter 11 und 12 ständig gekühlt, indem ein Kühlmittel im Kreislauf durch die Durch]änge 26 und 26a geführt wird, so daß sich das Gel nicht überhitzen kann. Dadurch kann mit höheren Strömen gearbeitet werden.

Die Stromzuführung wird solange fortgesetzt, bis der größte Seil der oder die gesamte fraktion, die sich im Kontakt mit den Pufferlösungen befindet, in die Pufferlösung eluiert bzw. ausgespült ist, die sich im Konfekt mit der als positivem Pol dienenden Elektrode befindet. Während dieses Vorgangs wird eine bestimmte Menge ohmsche Wärme erzeugt; diese Wärme wird abgeleitet, indem ein Kühlmittel im Kreislauf durch die Durchgänge 26 und 26a geleitet wird. Im allgemeinen wird die Kühlung so durchgeführt, daß die Temperatur des Gels 40 0 nicht übersteigt. Eine zu starke Erwärmung kann reduziert werden, indem die Stromdichte verringert und die Laufzeit verlängert werden.

Schließlich wird die Energiezuführung beendet, und die Elektrodenpufferlösungen abgezogen bzw. dekantiert. Die Pufferlösung, die sich im Kontakt mit dem positiven Pol befand, enthält die gewünschte Fraktion in im wesentlichen reiner Form. Diese Fraktion kann gewonnen und für die weitere Analyse eingesetzt werden.

Die Größe der gewünschten Fraktion und die Stelle, an der sie dem Trenngel A entnommen werden soll, wird vorher durch ein geeignetes Fixierverfahren festgelegt; dazu kann entweder eine Probe des Gels A oder ein weiteres Trenngel, das unter den gleichen Bedingungen präpariert wurde, mit einem Farbstoff versetzt oder mittels eines radioaktiven oder Ultraviolett-Detektors abgetastet

609828/05 3 7

werden. Wegen der hohen Ileproduzierbarkeit der Slektrophorese-Geltrennungen läßt sich In dieser V/eise die Zone in dem Gel A anzeigen, ais der die gewünschte Fraktion gewonnen werden kann. Die Größe und die Form der Durchgänge 33 und 33a kann so vorher festgelegt werden, um die gewünschte Entnahme einer einzigen Fraktion aus dem Gelsegment F zu erreichen.

Mit der hier te schriet» en en Einrichtung läßt sich das Gelsegment leicht eingehen und mechanisch stabilisieren; außerdem wird die ohmsche Wärme entfernt; schließlich las"sen sich eine gleichmäßige Geometrie des elektrischen Feldes und das hydrostatische Gleichgewicht "beibehalten; alle diese Merkmale erleichtern die Elution.

Die Elution Ist diskontinuierlich und kann sehr gut im Laboratorium durchgeführt werden. Die gewünschte Fraktion wird in sehr viel konzentrierterem Zustand gewonnen als es bei den bisher verwendeten, herkömmlichen Elutionsverfahren der Fall war; dadurch kann die anschließende Gewinnung der Fraktion aus der Pufferlösung einfacher und mit höheren Wiedergewinnungsraten durchgeführt werden. Die Fraktion wird in einer biologisch aktiven Form wiedergewonnen, d.h., sie ist nicht denaturiert, Sie kann analysiert werden, um die Isolierung und Aktivität der Gattung bzw. Spezies zu verifizieren.

Die in Fig. 7 gezeigte Modifikation kann auf die gleiche Weise eingesetzt werden, wie es oben beschrieben wurde. In diesem Fall wird das Gelsegment F in dem Hohlraum gehaltert, der durch die Aussparungen 53 und 54 in den Elutionsfenstern gebildet wird.

Die in den Fig. 5 und 6 dargestellte Modifikation verwendet ein halbzylindrisches Gelsegment F', das erhalten wird, indem ein zylindrisches· Trenngel longitudinal aufgeschnitten wird; dadurch entstehen mehr oder weniger hälbzylindrische Bereiche, während bei der Ausführungs-

609828/0537

form nach den Figuren 2 bis 4 die Platte q.uer zerschnitten wurde. In dieser Ausführungsform enthält das Gelsegment F^f also alle Bänder der Fraktionen, die durch die Gel-Elektrophoresetrennung hergestellt wurden; diese Bänder liegen als einzelne, longitudinal getrennte, im allgemeinen q.uer verlaufende Bänder vor. Deshalb erstrecken sich die Durchgänge 52 und 52a in Querrichtung und haben eine solche Größe und Form, daß nur eins der Bänder oder ein Bereich eines solchen Bandes freiliegt. Die Elution selbst erfolgt auf die gleiche Weise, wie es oben teschrieben wurde.

Im folgenden soll die Funktionsweise der Elutions-Einrichtung nach der Erfindung anhand eines Beispiels erläutert werden.

Als Ausgangssubstanz wird als Elektrophorese-Gel eine Platte aus Polyakrylamid-Gel für die Elektrophorese zur Präparation eines Ei- bzw. Ovin FSH (follikelstimulierendes Hormon) (Papkoff et al., Arch. Biochem., Biophys., 120,434) verwendet, das mit J-131 versetzt war; als Puffer wurde Tris-Borsäure-EDTA mit einem pH-Wert von 8,4 verwendet; die Elektrophorese wurde 3,5 Stunden lang bei 15 mA und einer Spannung von 150 V durchgeführt. Eine Probe der Tafel wird analysiert, indem die Radioaktivität von 1 cm Sektionen der Probe gezählt wird, um die Stelle festzulegen, an der sich das gekennzeichnete Hormon befindet. Dabei wird festgestellt, daß sich das gekennzeichnete Hormon in dem Gel in einem Band von ungefähr 1,0 cm Breite befindet. Eine Elusions-Einrichtung, wie sie in Fig". 2 dargeetellt ist, wird eingesetzt, wobei die Breite der Durchgänge 33 und 33a ungefähr 1cm beträgt. Die Tafel wird zerschnitten, so daß ein Segment mit einer Breite von 3 cm entsteht; das Segment wird in dem HaI-

609828/0537

-Vb-

& 25bA386

ter angeordnet, und anschließend wird die Elusions-Einrichtung zusamengebaut. Eine Pufferlösung von Tris-3orsäure-SDTA mit einem pH-Wert von 8,4 wird in die Kammer 17 eingefüllt, während eine Pufferlösung aus phosphatgepuffertem Salz "bzw. Saline mit einem pH-Wert von 7,4 in die Kammer 17a eingefüllt wird. Die Energiequelle wird für die Elelctrophorese so geschaltet, daß die Elektrode 23 negativ und die Elektrode 23a positiv ist. Die Elektrophorese wird hei 30 mA und 20 V 75 Minuten lang durchgeführt. Es ergeben sich die in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellten Resultate:

Tabelle 1
Rate und Wirkungsgrad der Elution

Zeit (min.)	Teilchen/ min.	YoI. der Pufferprobe (Mikrolioer)	Teilchen/ min, die im Gel zu	Elu tion
			rückbleiben
0	0	25		0
15	5746	25		15
30	13842	25		36
45	25370	25		67
60	28728	25		75
75	32024	25		84
75
Anreiche	38 400 000	30 ml	7 350 000	83
rung am Schluß				-

- Patentansprüche

609828/0537

Claims

Pat en tan sprüche

1. Elutions-£Ln richtung zum Eluieren eines gelösten Stoffes aus einem Elektrophorese-Trenngel mit ersten und zweiten Behältern, die jeweils einen Hohlraum für die Aufnahme einer Pufferlösung und in jedem Hohlraum eine Elektrode aufweisen, und mit einer Aussparung, um ein längliches, dünnes Elektrophorese-Trenngel abgedichtet zwischen den Behältern zu haltern, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Paar seitlich ausgerichteter, durchgehender Elutionsöffnungen (33, 33a) von den gegenüberliegenden seitlichen Seiten der Aussparung (38) zu den jeweiligen Hohlräumen (17, 17a) erstreckt, wobei die Elutionsöffnungen (33, 33a) wenigstens eine Oberflächenabmessung haben, die kürzer als die entsprechende Oberflächenabmessung der Aussparung (38) ist, so daß eine Zone mit begrenzter Fläche der Aussparung (38) direkt durch die Elutionsöffnungen (33, 33a) mit den Hohlräumen (17, 17a) in Verbindung steht, damit der in der entsprechenden Zone eines in dem Hohlraum (17, 17a) angeordneten Elektrophorese-Trenngels vorliegende gelöste Stoff in eine der Pufferlösungen eluierbar ist, indem die Elektroden (23, 23a) erregt werden, um einen Potentialgradienten quer zu dem Gel zu erzeugen.

2. Elutions-Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter (11, 12) einander gegenüberliegende Elutionsfenster (28, 36) aufweisen, die zwischen der Aussparung (38) und den Hohlräumen (17, 17a) angeordnet sind, und daß die Elutionsfenster (28, 36) jeweils einen Elutionsschlitz (33, 33a) enthalten, der eine der Elutionsöffnungen bildet, wobei die Elutionsschlitze (33, 33a) miteinander direkt axial ausgerichtet sind.

3· Elutions-Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2,

609828/0537

2 5 b 4 3 8

dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (38) in einem Abstandsstück (37) vorgesehen ist, das zwischen den Elutionsfenstern (28, 36) angeordnet ist.

4· Elutions-Binrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Behälter (11, 12) ein Paar Seitenwände (13, H), eine Bodenwand (16) und eine Stirnwand (18) aufweist, so daß ein Hohlraum entsteht, der längs der inneren Seiten des Behälters offen ist, wobei das zugehörige Elutionsfenster (28, 36) fluiddicht mit der inneren Seite des Behälter in Eingriff kommt und die offene Seite des Hohlraums im wesentlichen verschließt.

5· Elutions-Sinrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und zweite Behälter (11, 12) und die Elutionsfenster (28, 36) so aneinander befestigt sind, daß die offenen Seiten der Hohlräume einander zugewandt und axial zueinander ausgerichtet sind, wobei die Elutionsfenster (28, 36) mit den Elutionsschlitzen (33, 33a) zwischen den offenen Seiten axial mit den offenen Seiten der Hohlräume ausgerichtet angeordnet sind.

6. Elutions-Sinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich jede Elektrode (23, 23a) im wesentlichen direkt gegenüber ihrem zugehörigen EIutionsschlitz (33, 33a) befindet.

7. Elutions-Binrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß jede Elektrode (23, 23a). ein langgestrecktes, im allgemeinen U-fÖrmiges, elektrisch leitendes Teil aufweist, das symmetrisch in Bezug auf den Elutionsschlitz (33, 33a) in dem zugehörigen Elutionsfenster angeordnet ist.

8. Elutions-Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in den Behältern (11, 12) in-

•6 09828/0537

η ere Kühlleitungen (26, 26a) vorgesehen sind, um den Inhalt der Hohlräume zu kühlen.

9· Elutions-Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elutionsfenster (28, 36) plattenförmige Teile, die gegen die inneren Seiten der Behälter stoßen, sind und Vorsprünge (29, 29a) aufweisen, die teilweise in die Hohlräume vorstehen und ihre offenen Seiten verschließen, wobei die Elutionsschlitze (33, 33a) zwischen den Rändern der Torsprünge ausgebildet sind.

10. Elutions-Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung'(51 oder 53 > 54) in weaigs^esB eiser der einander gegenüberliegenden Oberflächen der Elutionsfenster ausgebildet ist.

11. Elutions-linrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch, gekennzeichnet, daß das Abstandsstück ©iOe XJ-förmige Abstandsplatte ist, die zwischen den einander gegenüberliegenden Oberflächen der Elutionsfenster (28, 36) angeordnet ist.

12. Verfahren zum. Bluieren von gelösten Stoffen aus Elektrophoxese-SrejQDgeleB, dadurch gekennzeichnet, üaB s±ne yqxgeformte, langgestreckte, dünne Elektrophorese—3?reaagelprobe, die wenigstens ein Band des gelösten Stoffes enthält, in einem Halter (37)' für die fielprobe angeordnet wirdj wobei die Probe einen feil eines Elektrophorese-Irenagels aufweist, der durch Gel-Elektrophorese eines Äusgaögsgemischs ύόώ gelöstes Stoffen präpariert wird, iss die Bestandteil« des AüBgasgsgemisclia zu treagea, die ale diskrete Bänder in dem G-el vorliegen, daß Pufferlösuöges

. in direkten Oberflächenkontalrt mit den gegenübexliegenden, seitlichen Oberflächen einer Elutionsflache der Probe gefeaelit werden, die kleider als die S-esamtoberflache der Probe is*t₅ uisd daß ein ö-leichpoteötialgradieiat

603828/0 537

sehen den Pufferlösungen q.uer zu der Elutionsflache der Probe angelegt wird, um nur den gelösten Stoff in eine der Pufferlösungen zu eluieren, der sich in der Slutionsflache der Probe befindet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese-Trenngel-Probe erhalten wird, indem eine langgestreckte, flache Platte aus einem Elektrophorese-Trenngel mit longitudinal im Abstand angeordneten Bändern von gelösten Stoffen in Querrichtung zerschnitten wird, um eine Probe zu gewinnen, deren Länge kleiner als die der Platte ist und die nur einen Teil der Bänder enthält, daß die Probe vertikal ausgerichtet wird, und daß die Pufferlösungen nur mit einer vertikal verlaufenden Elutionsfläche der Probe in Kontakt gebracht werden.

H. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese-Trenngelprobe erhalten wird, indem ein langgestrecktes, zylindrisches Elektrophorese-Trenngel mit longitudinal im Abstand angeordneten Bändern von gelösten Stoffen in seiner länge zerschnitten wird, daß die Probe vertikal ausgerichtet wird, und daß die Pufferlösungen in Kontakt mit einem horizontal verlaufenden Elutionsbereich der Probe gebracht werden.

609828/0537