DE2454105A1 - Vorrichtung zur isotachophoretischen trennung - Google Patents
Vorrichtung zur isotachophoretischen trennungInfo
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Description
2454105 Patentanwälte Liedl, Dr. Pontani, Nöth, Zeitler
Λ 7olo
LKB-"RnDUKTr.P ΛΒ, B R O M M Λ 1. / Schweden
Vorrichtung zur isotachophoretisohen Trennung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf 'eine Vorrichtung
zur isotachophoretischen Trennung, welche eine zwischen zwei Elektroden angeordnete Kapillarsäule aufweist, wobei die der
Trennung unterliegende Probe zwischen einem leitenden bzw. einem Endelektrolyten eingeführt wird und ein Anzeiger zum
Nachweis unterschiedlicher Probezonen in einer Stellung längs der Säule angeordnet ist.
Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer ionisierten
Probe, welche Ionen einer bestimmten Polarität enthält, in der Weise durchgeführt, daß man die Probe in eine zwischen zwei
Elektroden angeordnete Säule einführt, wobei man einen Leiterelektrolyten in denjenigen Teil der Säule einbringt, welcher
sich zwischen der Probe und der Elektrode befindet, gegen welche die Ionen wandern, wenn eine Spannung an die Elektroden angelegt
wird, wobei dieser leitende Elektrolyt Ionen der gleichen Polarität, jedoch mit größerer Beweglichkeit enthält als die Probeionen,
und wobei ein Endelektrolyt in denjenigen Teil der Säule eingeführt wird, welcher sich zwischen der Probe und der anderen
Elektrode .befindet, wobei ferner der Endelektrolyt Ionen dieser Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit
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als die Probeionen enthält. In die gesamte Säule wird auch eine Ionenart der entgegengesetzten Polarität eingeführt, ein sogenanntes
Gegenion. Das Gegenion sollte zweokmäßigerweise Puffereigenschaften
besitzen. Die Isotachophorese ist eingehender beschrieben
beispielsweise in Analytioa Chimica Acta 38 (1967)
Seiten .233 bis 237, wo sie als »Verdrängungselektrophorese" bezeichnet ist, sowie in der deutschen Patentschrift 2 127 391.
Bei einer isotaehophoretischen Trennung von Ionen erzielt man eine große Schärfe beim Trennen und man erhält eine scharfe
Trennungslinie zwischen den Zonen, welohe durch die Ionen gebildet
werden. Die Konzentration der Ionen in den verschiedenen Probezonen ist von der Beweglichkeit jedes entsprechenden Ions
abhängig und demzufolge wird ein bestimmtes Ion im Vergleioh zu
seiner Konzentration im anfänglichen Probengeraisch im allgemeinen
konzentriert. Diese spezifischen Merkmale der Isotachophorese, welche eine Folge der Anwesenheit eines Leiter- bzw. Endelektrolyten,
wie oben beschrieben, sind, machen die isotachophoretische
Trennung sehr vorteilhaft im Vergleich zur allgemeinen Zonenelektrophorese, bei welcher jede Probenlcomponentenzone sich verbreitert
und mit dem Durchführen der Trennung als Ergebnis der Diffusion weniger scharfe Grenzlinien erhält und wo die Konzentration jeder Probenkomponenten sich während der Trennung vermindert.
Die Vorteile der Isotachophorese sind besonders hervorragend in einer Säule, welche aus einem Kapillarrohr besteht, in
welchem stabilisierende Medien wie Gele nicht angewandt zu werden brauchen.
Bei der Durchführung einer isotachophoretischen Trennung ist im allgemeinen ein Anzeiger an der Säule angeordnet, um die erzielten
Zonengrenzlinien nachzuweisen. Ein Zweck dieses Nachweises besteht in der Beurteilung, wann sich als Anzeige vollendeter
Trennung scharfe Zonengrenzlinien zwischen allen Probezonen gebildet haben. Ein anderer Zweck eines solchen Nachweises besteht
in der Führung eines in vielen Fällen gebrauchten Gegenstromes,
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damit die Zonehgrenzlinie zwischen leitungselektrolyt und Probengemisch
in der Säule stationär gehalten wird, wie dies in der oben erwähnten Patentschrift beschrieben ist.
Oft wird eine elektrophoretisch^ Trennung, beispielsweise eine
isocachophoretische Trennung, für analytische Zwecke durchgeführt. Es ist dann von Interesse, die verschiedenen in der Säule
anwesenden Probezonen bis zur höchstmöglichen Schärfe bei Trennung und Nachweis zu studieren. Analytische Trennungen werden
oft mit kleinstmöglichem Probenvolumen durchgeführt. Dies gestattet
kurze Trennungszeit. Bei der analytischen Isotachophorese
verwendet man zweckmäßigerweise eine oben erwähnte Kapillarsäule.
In einer Kapillarsäule ist ein Naohweis bis zur großen Schärfe der Probenkomponentenzoneh relativ einfach zu erzielen,
beispielsweise mittels eines thermischen oder optischen Anzeigers, welcher an der Säule angeordnet ist.
In anderen Fällen wird die elektrophoretische Trennung zu präparativen
Zwecken durchgeführt wenn es gewünscht wird, die unterschiedlichen Probezonen nach der Abtrennung getrennt zu sammeln.
Bei der Zonenelektrophorese in einer Säule hat die präparative Arbeit das Entleeren der Kolonne von seinem Inhalt zur
Folge, nachdem die Abtrennung vollendet und die Elektrodenspannung abgeschaltet ist. Während des Entleerens verbreitern sich
dann die Zonen infolge Diffusion weiter und die Grenzlinien werden
unschärfer, d.h. die Schärfe der Trennung vermindert sich. Präparative Trennungen werden im allgemeinen mit ziemlich großen
Probenvolumina durchgeführt, welche Makrosäulen und relativ lange Trennzeiten erfordern. Der Nachweis bis zu ziemlich guter
Schärfe der Probenkomponentenzonen, wie diese in der Säule nach
vollendeter Trennung vorliegen, könnte nur mit großer Schwierigkeit erzielt werden und der Nachweis bei präparativer Trennung
wird gewöhnlich nach einer Eluierung der Probenkomponenten durchgeführt und zwar mit der genannten Verminderung der Trennschärfe,
Die Eluierung einer Makrosäule wird erschwert durch die Anwesenheit der Stabilisierungsmedien, beispielsweise Gel, welches in
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solchen Säulen bei Trennungen verwendet werden soll.
Verbesserte Schärfe der Abtrennung nach der Eluierung aus einer Makrosäule könnte mittels einer Säule erzielt werden, wo die unterschiedlichen
Probekomponenten, duroh daa elektrische Feld beeinflußt,
zu dem einen Ende der Säule wandern und dann, in richtiger Weise durch das elektrische Feld noch beeinflußt, aus der
Säule eluiert werden. Eine solche Vorrichtung ist in der deutschen
Patentschrift 2 101 885 beschrieben. Diese Vorrichtung ist für Proben im Makromaßstab vorgesehen.
Es ist jedoch wünschenswert, auch sehr klein© Probemengen präparativ
abzutrennen. Eine Vorrichtung zur präparativen isotachophoretischen
Trennung im Mikromaßstabs d.h. unter Benutzung einer Kapillarsäule j ist nicht bekannt.
Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung, mittels welcher isotaohophoretisohe Trennung präparativ im Mikromaßstab
vollzogen werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielt man Trennungen, welche in kurzen Trennzeiten sehr große
Schärfe zeigen. Die getrennten Probekomponentenzonen können beim Nachweis vor dem Sluieren bis zu großer Schärfe nachgewiesen werden.
Erfindungagemäß gabelt sioh von dar Säule ein Shuntrohr ab, welches
vorzugsweise geringeren Querschnitt als die Säule besitzt. Vorzugsweise zweigt das Shuntrohr von der Säule so dicht wie praktisch
möglich an der Stelle ab, an welcher der Nachweis mittels eines Anzeigers durchgeführt wird. Ferner zeigt die erfindungsgemäße
Vorrichtung Einrichtungen zum Schaffen eines Stromes des Leitelektrolyten in der Richtung entgegengesetzt zur Wanderungsrichtung der Probenzonen.
Die Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung
und den Patentansprüchen. Ferner sei die Erfindung un-
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ter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. i
Pig. 1a und b veranschaulicht schematisch daa Prinzip der j Isotachophorese und
Fig. 2 zeigt schematisoh eine bevorzugte AuBführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung,
In den Pig. 1a und 1b bezeichnet die Bezugszahl 1 eine Säule, in welche eine Anode 2 und eine Katho.de 3 eingeführt sind. In
Pig. 1a wird die Probe, welche getrennt werden soll, in denjenigen
Teil der Säule eingeführt, welcher mit S bezeichnet ist. Diese Probe weist Salze mit drei unterschiedlichen Anionen
Gi""f °2~ und G3~ au^» wobei angenommen wird, daß 0^" eine größere
Beweglichkeit besitzt als Cg-I von welchem wiederum angenommen
wird, daß dieses eine größere Beweglichkeit als C,"" besitzt.
Der Teil der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, wird mit dem oben erwähnten Leiterelektrolyten gefüllt, welcher das Anion
A~ aufweist, welohea größere Beweglichkeit besitzt als alle
Anionen der P.robe. Der Teil T der Säule, welcher der Kathode zugewandt
ist, ist mit einem Elektrolyten gefüllt, der ein Anion B~ enthält, welches eine Beweglichkeit besitzt, die geringer ist
als alle interessierenden Anionen in der Probe. In L befindet sich eine Kationenart, ein sogenanntes Gegenion H+, welches
zweckmäßig Puffereigenschaften besitzen sollte. Wenn eine Gleichspannung
an die Elektroden 2 und 3 angelegt wird, so wandern die Kationenarten nach 3 hin und bilden ein gemeinsames Kation für
alle Anionen, während die Anionen zur Anode 2 hinwandern. Als . Folge der unterschiedlichen Beweglichkeit der Anionen steigert
sich dann stufen- und zonenweise die elektrische Feldstärke über die Zonen L, S beziehungsweise T hinweg. Dies führt jedoch dazu,
daß die Anionen in der Zone S gemäß ihrer Beweglichkeit getrennt werden, sodaß die Ionen C1", welche die. größere Beweglichkeit besitzen,
eine Zone bilden, die dem leiterelektrolyten am näohsten ist, woraufhin eine Zone aus dp"* und schließlich eine Zone aus
CU- folgt, welch letztere dem Endelektrolyten am nächsteh ist
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• - 6 -
(siehe Fig. 1b). Natürlich ergeben sich entsprechende Bedingungen bei der Trennung von Kationen.
In Pig. 2 bezeichnet die Bezugsziffer 4 eine Säule aus einem Kapillarrohr, In welchem die Trennung ausgeführt wird. Die Bezugszahl
5 bezeichnet die eine Elektrode, welche sich in einem Elektrodengefäß 6 befindet, welches mit Leiterelektrolyt gefüllt
ist. Es sei angenommen, daß die Wanderung, welohe die Trennung vollzieht, in Richtung des Pfeiles erfolgt. Die Bezugszahl 7 bezeichnet
die andere Elektrode, welche in einem Elektrodengefäß enthalten ist, welches den Endelektroiyten enthält. Derjenige
Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 6 befindet, enthält den Leiterelektrolyten während jener
Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 8 befindet, den Endelektrolyten enthält. Die Säule ist
gegen die Elektrodengefäße durch semipermeable Membranen 9 bzw. 10 abgegrenzt. Die Elektroden 5 und 7 sind mit einer in der Zeichnung
nicht gezeigten Spannungsquelle verbunden. Die Bezugszahl bezeichnet einen Kühlmantel, welcher einen Kühlkanal 12 bildet,
der die Säule umschließt. Der Kühlkanal 12 enthält ein fließfähiges Kühlmedium. Die Bezugszahl 13 bezeichnet eine Lichtwegvorrichtung
mit einem Liohtweg 14» der die Säule von einer in
der Zeichnung nicht gezeigten Lichtquelle her, welche auf der einen Seite des Kühlmantels gelagert ist, zu einem ebenfalls in
der Zeichnung nicht gezeigten photometrischen Anzeiger, der auf der anderen Seite des Kühlmantels gelagert ist, durchquert. In
dichter Annäherung des Lichtweges zweigt von der Säule ein Shuntrohr 15 ab. Das Shuntrohr ist durch einen Zylinder 16 aus Plexiglas
oder dergleichen mechanisch stabilisiert, wobei der Zylinder durch den Kühlmantel 11 durch die Öffnung 17 hindurch geführt
ist. Zwischen dem Kühlmantel und dem Zylinder ist eine Dichtung 18 angebracht. An demjenigen Teil der Säule, welcher
sich zwischem dem Lichtweg 14 und dem Elektrodengefäß 6 befindet, ist eine Pumpe 19 angeordnet. An demjenigen Teil der Säule,
welcher sich zwischem dem Anzeiger und dem Elektrolytgefäß 8 befindet, ist eine Probeneinspritzvorrichtung 20 angeordnet. Die
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Bezugszahl 21 bezeichnet einen Streifen Filterpapier, welcher über in der Fig. nicht gezeigte Rollen läuft, wobei dieser Streifen
eine Samme!vorrichtung für die;erhaltenen Probenkomponenten
bildet.
Bei einer präparativen isotachophoretisohen Trennung wird das
ProbengemiBch in die Säule an der Probeneinspritzvorrichtung 20
eingeführt, welche als Scheidewand ausgebildet sein kann, die durch eine Injektionsspritze durohstoßen wird. Dann sollte nach
allgemeiner Regel der Leiterelektrolyt in die Säule zwischen der
Probe und der Membrane 9» sowie der Bndelektrolyt zwischen der Probe und der Membrane 10 eingeführt werden. Das äußere Ende des
Shuntrohres 15 wird dann durch einen Deokel geschlossen, welcher
in der Zeichnung nicht gezeigt ist. An die Elektroden 5 und 7 wird Spannung angelegt und die Probenkomponenten wandern isotachophoretisch
in Richtung auf die Iiichtwegvorriohtung 13 zu.
Wenn der zur Verfügung stehende Wanderungsabstand zu kurz ist, so kann die Trennung mittels eines öegenstromes vollzogen werden,
welcher durch die Pumpe 19 gemäß der obigen deutschen Patentschrift 2 127 391 erzeugt wird. Bevor die Probenzonen den Anzeiger
passiert haben, wird der Deckel des Shuntrohres 15 abgehoben und die Pumpe 19 beim Zuführen des Streifens 21 in Gang gesetzt.
Unmittelbar nach dem Nachweis werden die Probenkomponentenzonen durch das Shuntrohr 15 herausgeführt. Es ist bevorzugt, daß das
Shuntrohr einen geringeren Querschnitt besitzt als die Säule.
Das Material, welches durch das Shuntrohr hindurch herausgeführt wird, wird durch eine geeignete Sammelvorrichtung gesammelt. Gemäß
einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorriohtung
besteht die Sammeleinrichtung aus einem Träger, welcher mit gegebener Geschwindigkeit am äußeren Ende des Shuntrohres
vorbeigeführt wird und einem zwisohen dem Ende des Rohres und
dem Träger befindlichen Luftspalt. Der Träger besteht zweckmäßig aus einem Streifen porösen Materials, beispielsweise Filterpapier,
welches geeigneten Zufuhrrollen zugeliefert wird. Da isotachophoretische
Bedingungen während des Austretens der Proben-
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komponenten vorliegen sollten, ist zwisohen den Elektroden 5 und
7 Spannung angelegt, welche eine Potentialdifferenz zwischen dem Träger in der Sammelvorrichtung und dem äußeren Ende des Shuntrohres
herbeiführt· Bei einer bestimmten !Tropfengröße, welche
von der Potentialdifferenz und der Breite des Luftapaltes abhängig
ist, springt der gebildete Tropfen auf den Träger über und bildet auf diesem einen kreisförmigen Fleck.
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Claims (4)
1. Vorrichtung zur isotachophoretischen Trennung, welche eine
Säule aufweist, die aus einem Kapillarrohr besteht, welches zwischen zwei Elektroden angeordnet ist, wobei die der Trennung
unterworfene Probe in die Säule zwischen Leit- und
Bndelektrolyte eingeführt wird und ein Anzeiger zum Nachweis unterschiedlicher Probezonen in einer Stellung längs der Säule
angeordnet ist, gekennzeichnet durch ein Shuntrohr (15), welches
sich von der Säule (4) in enger Nachbarschaft der Lage des Anzeigers gabelt, wobei das Shuntrohr (15) einen geringeren Durchmesser
besitzt als die Säule (4)und ein offenes äußeres Ende aufweist, welches mit einem verschließbaren Deckel versehen
ist, sowie Mittel zum Schaffen eines Stromes des Leitelektrolyten in Richtung auf. die Probezonen zu.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sammelvorrichtung für die Probezonen vorgesehen ist, welche
am äußeren Ende des Shuntrohres (15)angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sammelvorrichtung einen"Träger aufweist, welcher mit bestimmter Geschwindigkeit am äußeren Ende des Shuntrohres (15) vorbeigeführt wird und ein Luftspalt zwischen dem Bohrende und
dem Träger vorgesehen ist, wobei ein elektrisches Potential zwischen dem Rohrende und dem Träger aufrecht erhalten ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Filterpapierstreifen(21) besteht.
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