JP3065358B2 - キャピラリー分離システムにおけるマイクロリザーバ電極からの電気移動注入 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 キャピラリー電気泳動（“CE"）およびこれに関連す
るキャピラリースケール技術は、大きな生体分子の分離
および定量を行うための非常に重要な分析技術を提供し
ている。このような技術は小イオンの分離、検出に有用
なものであるが、イオンクロマトグラフィ法が従来支配
的な技術として用いられてきた。最近より効力のあるイ
オンクロマトグラフィ検出技術が発見され、これをキャ
ピラリー電気泳動法に適用できるようになった。

その一つの結果がいわゆる抑制電導度検出キャピラリ
ー電気泳動分離システム（“SuCCESS"）である。“SuCC
ESS"技術を用いることによって、予備濃縮のために特別
の労をかけずに、様々な小イオンの低いμg/L検出限界
値を迅速に出すことができる。（Dasgupta and Baoの米
国特許出願番号5,358,612および5,433,838参照） しかしながら、キャピラリー電気泳動法を用いる場合
には、図１に示すように、紫外・可視部吸収検出を利用
するのがもっとも一般的である。（例えば、“キャピラ
リー電気泳動法"S.F.Y.Li,Elsevier,NY 1992参照）。図
１に示すように、CE分析システム10には分離キャピラリ
ー20が含まれる。そしてこのキャピラリーの末端30は、
検体試料Ａおよび一般的には他の物質Ｘをも含む溶液40
に最初のうちは流体接続されている。溶液40はソース容
器50に入っており、電極55に電気的に接続されている。
電極55は高電圧（“HV"）（一般に数十キロボルト）電
位V1の電源60に電線57で接続されている。第２の電位、
すなわちアース電極155はしばしば最終仕向先容器160中
に設置される。図１のように、キャピラリー20は最終仕
向先容器160に至る前に紫外・可視部検出器90の中を通
過する。

図１に示すように高電圧電源60をキャピラリー20に接
続することによって、検体Ａが右方向矢印で示すように
キャピラリー内で左から右方向へ移動する。このような
移動は電源60を作動させると数秒以内に始まる。この後
電源60のスイッチを切り、キャピラリー20の先端30を移
動電解液80を含む第２容器70中へ移す。電源60は電極55
を介して溶液80とつながっているが、この構成は容器50
に関連して記載した電極55と同じ（まったく同一）であ
ってもよい。電源60を再び作動させると、試料検体の下
流移動が継続する。

この種の電場誘導による検体注入は、電気移動注入あ
るいは界面導電注入（“EI"）と命名されている。

キャピラリー140の末端は、終端電解液リザーバ150に
入った電解液150と流体接続している。電解液160は、移
動電解液80と同じものであることが望ましく、また図示
の実施例ではアース電位に設定されている。

上述したように、EIを行う間、バックグラウンド電解
液（BGE）を満たしたキャピラリーを試料バイアル瓶に
浸した状態で高電圧を印加する。典型的な状況では、電
気浸透と電気泳動運動が同時に機能し、所望のクラスの
検体イオンがキャピラリー中へ導入される。一般に、電
気浸透移動度（μ_eo）が電気泳動移動度（μ_eo）に対し
て小さいい場合に、電気移動予備濃縮を行う条件として
この手法はもっとも適している。これらの条件下では、
かなり大量の液体が同時に入り込むことを回避しつつ十
分大量の検体を導入することができる。EIは、微量分析
に広く利用されている。この手法は紫外・可視部検出と
併用すると特に有効である。なぜなら、検出器90のよう
なCEで一般に用いるオンカラム紫外・可視部吸収検出器
は、分析に必要な十分な試料濃度の検出限界値が比較的
低いためである。小イオンの定量には一般的に間接検出
法を利用するが、これは直接検出法に比べると条件はず
っと不利である。

EIを行う際に、試料のイオン強度が非常に低い場合に
は、検体全体の濃度に対して高い濃度になるように低移
動度イオンを適宜試料に添加した場合に最もよい結果が
得られる。ここで言う“低移動度”とは、分析対象の検
体イオンのいずれよりも低い移動度をもつイオンを意味
する。このような場合、添加イオンは終末（terminatin
g）電解液のように挙動し、電気移動予備濃縮は等速電
気泳動に非常によく似ている。スルフォン酸塩染料中の
残留硫酸塩を定量するときのように、状況によっては高
移動度イオンが分析対象の検体であり、低移動度イオン
がすでに多量に存在している場合もある。このような場
合には、終末電解液を添加する必要はない。有意なイオ
ン強度をもつ試料中に分析対象の検体が低い濃度で存在
する場合には、十分な終末電解液を添加して後者を優勢
な電流担体にしようとすることは実際的ではない。

残念ながら、試料検体濃度と器具設定とが同一の場合
であっても、EIシステム中へ導入される検体の量は試料
導電率によって大きく左右される。このようなことが生
じるのは導電率が電気浸透導入速度に影響を及ぼすため
である。上記ほど直接的ではないが、導電率はまた、試
料にかかる電場の強さの変化によって電気泳動の移動速
度にも影響を与える。さらに、EIは検体自体の移動度に
も依存し、高い移動度をもつイオンに有利なバイアスを
生みだす。ここで“バイアス”が生じるということは、
注入された試料が元の試料と異なることを意味する。こ
の違いは、元々試料中に存在していた試料に対して、分
別注入部分により動きの遅い移動イオンが相対的に不足
したり、より動きの速い移動イオンが相対的に過剰にな
るためである。LeeとYeungらの研究者（Anal.Chem.199
2,64,1226−1231）は、システムに流れる電流をモニタ
ーするという単純なアプローチを押し進めることによっ
て、EIを用いて精密な結果が得られるように改善した
が、彼らの手法は注入に伴いバイアスが生じるという問
題についてはほとんど何も解決していない。

試料導電率がバイアスに依存するという上述の問題に
対処するために、他の試みが先行技術の中で行われてき
た。例えば、分析対象のすべての検体を標準的に添加す
るような、分析対象の検体移動度の全範囲をカバーする
２種類の別の内標準を使用することが提案された。これ
らのアプローチは満足のいくものではなく、また実際、
煩瑣な作業となりかねない。

最後に、先行技術では、キャピラリー中へ試料イオン
を入れるEIという方法が究極的には局所的な電場に依存
するという根本的な事実が見過ごされがちであった。形
状の変化及び／若しくはHV電極とキャピラリーの先端と
の間の分離的距離のちょっとした変化がEIに大きく影響
を及ぼす場合もある。残念ながら、先行技術では信頼性
のある真に左右対照な電場をつくりだすことは困難であ
った。

先行技術では、検体イオンがキャピラリー中へEIによ
って導入される元となる試料の部分標本中の検体の総量
は、実際に導入される検体の総量に対して非常に大き
い。もし本当に少量の試料から十分に長い時間をかけて
EIを行うことが可能であれば、分析対象の検体イオンを
実際にすべてキャピラリー中に悉皆的に（即ち、余すこ
と無く）導入することは原理的には可能であろう。処理
の過程で、試料が脱イオン化されることはなく、また導
電性を失うこともないであろう。電場で発生したH⁺また
はOH^-と、すでに試料中に存在する適当な対イオン、ま
た、EOFにさからって移動しキャピラリーから試料中に
流入するイオンなどが試料の導電状態を維持するので、
脱イオン化あるいは導電率の低下は生じないであろう。

実際、EIを十分に長い時間をかけて行うことができれ
ば、かなりの量のH⁺あるいはOH^-が導入されるであろ
う。残念ながら、先行技術を用いて悉皆的な電気移動を
効果的に実行することは不可能である。

従って、簡単に製造でき、好適には１μＬ未満の液体
容量を持ち、悉皆的な電気移動と電気泳動に利用できる
マイクロリザーバが必要とされる。好適には、このよう
なマイクロリザーバは内部の全試料を容易に対称電場に
かけることができるものであることが望ましい。さら
に、このマイクロリザーバは、試料が入る部分の対称の
中心に分離キャピラリーの入口先端を配置することがで
きるものであることが望ましい。これらの特徴および手
法を取り入れたシステムは、電気移動注入キャピラリー
電気泳動における導電率の影響を低減するという好まし
い結果を生じる。

本発明はそのような方法及び装置を提供するものであ
る。

発明の要約 試料中の所望の極性をもつ検体イオン分離キャピラリ
ー中へ悉皆的に導入することができるマイクロリザーバ
電極を利用することにより、電気移動注入（“EI"）を
用いた分離システムにおけるバイアスによる望ましくな
い影響を低減できる（この分離システムは、電気泳動あ
るいは通電クロマトグラフィーシステムであってもよ
い。）。金属化された基体中に形成されたワイヤループ
または半球体によって有限容積のマイクロリザーバが画
定される。悉皆的な導入に要する時間を短縮するにはマ
イクロリザーバは対称形とするのが望ましい。また分離
キャピラリーの入口端をマイクロリザーバの中心に配置
することが望ましく、これによって悉皆的な導入に要す
る時間を有利に短縮することができる。

マイクロリザーバは導電体であるので、高電圧電源端
子に接続されており、この分離システムの高電圧電極の
一つを構成している。高電圧が印加されると分析試料は
マイクロリザーバ内で電場にかけられ、分離システムに
よって検体の悉皆的な注入が行われる。

この分離システムにおいて悉皆的な電気的注入を実施
すれば、試料中の高速移動イオンが、同じ極性をもつが
低速移動のイオンよりも早くキャピラリー内に入ってく
ることに起因するバイアスの影響を実質的に低減できる
という好ましい結果が得られる。電気移動を用いる悉皆
的な注入により試料の定量的な注入を実質的な結果とし
て得ることができる。この注入方法は試料の導電率に実
質的に依存せず、また、同じ極性をもつ様々な検体イオ
ンのイオン移動度にも実質的に依存せずに行われる。

悉皆的電気注入は、好適には以下のように行う。再現
性があり、かつ、微量（例えば２μＬ未満）の体積をも
つ、好適に対称のマイクロリザーバ電極を用いて、少量
の部分標本すなわち試料の一部を分取する。この部分試
料は、ループ型マイクロリザーバ電極を試料の入った容
器中に浸して取り出すことにより得られる薄膜であって
もよい。マイクロリザーバ電極を一つの電極として用い
所望の時間（例えば30秒から60秒間）EI電位を印加す
る。この時間中に試料中に存在する所望の極性をもつす
べてのイオンが分離キャピラリーの始端部中へ実質的に
定量的に注入される。最初、高速移動イオンが注入さ
れ、これらのイオンが枯渇するにつれて、低速移動イオ
ンがキャピラリー中へ注入される。このような結果が得
られるのはリザーバ容積が比較的小さいことに起因す
る。その結果、高速移動イオンに加えて、より低速で移
動するイオンをより忠実に再現したものを注入された試
料が含むことになるという点でバイアスの影響が低減さ
れる。

本発明の他の特徴及び有利な諸点を以下に記載し、図
面と共に推奨実施例を詳細に明らかにする。

図面の簡単な説明 図１は、先行技術による従来の分離システムを描いた
ものである。

図２は、本発明によるEI分離システムを描いたもので
ある。

図3Aは、本発明による傾斜ループ形状およびそれに関
連する支持ワイヤを用いたマイクロリザーバ電極を開示
する第１実施例を描いたものである。

図3Bは、本発明による、キャピラリー縦軸とループ半
径とが共通平面上にある、平面ループ形状を用いたマイ
クロリザーバ電極を開示する第２実施例を描いたもので
ある。

図3Cは、本発明による、導電基体上に形成された半球
体を含むマイクロリザーバ電極を開示する第３実施例を
描いたものである。

図４は、本発明による、十分に混合した薄膜から得ら
れた数値シミュレーションEIデータを描いたものであ
る。

図５は、本発明による、他の条件は図４と同一にし
た、混合を行わなかった場合に薄膜から得られるEI数値
シミュレーションを描いたものである。

図６は、本発明による、他の条件は図５と同一にし
た、薄膜中の塩化物、酢酸塩および水酸化物の空間分布
をEI時間の関数として描いたものである。

図７は、本発明による、他の条件は図５と同一にし
た、モデルが拡散混合物を含む場合の薄膜から得られる
EIの数値シミュレーションデータを描いたものである。

図８は、本発明による、モデルが拡散混合物を含む場
合の薄膜中の塩化物、酢酸塩および水酸化物の空間分布
をEI時間の関数として描いたものである。

図９は、本発明による、、注入された塩化物と酢酸塩
の分画をループ半径とEI時間との関係として描いたもの
である。

図10Aおよび図10Bは、それぞれ従来のEIおよび本発明
によるループから得られるEIを描いたものである。

図11Aは、本発明による小ループからのEIを描いたも
ので、一定の硝酸塩濃度条件下における酢酸塩の変動を
３桁におよぶ非常に広い動的範囲で示したものである。

図11Bは、本発明による、一定の酢酸塩濃度条件下に
おける硝酸塩の変動を３桁の範囲で描いたものである。

図12は、本発明による、塩化物の酢酸塩に対するピー
ク面積比率を正規化したループEIのデータを、HVとEI時
間の関数として描いたものである。

図13Aは、本発明による、ループ−EIで注入された当
量を、EIの関数として描いたものである。

図13Bは、本発明による、塩化物に対するループ−EI
バイアスをEIの関数として描いたものである。

図14は、本発明による、ループのEIでの遅延によって
生ずる水酸化物の導入を描いたものである。

推奨実施例の詳細な説明 図２に、マイクロリザーバ電極59を備えた、いくぶん
改変したCEシステム10′を示す。本明細書に記載するよ
うに、マイクロリザーバ電極は、約１μＬ以下の容積保
持収容力を持つものとして画定することが望ましく、こ
の電極は先行技術を示す図１の電極55の代わりに、電極
として有利に機能する。このマイクロリザーバ電極の形
状は対称であり、好適には、導電ワイヤで形成されたル
ープ（図3A、3B参照）、あるいは金属基体または導電基
体で画定された半球体であることが望ましい（図3C参
照）。

出願人は、内径74μｍ、外径360μｍ、長さ60cmの溶
融石英キャピラリー20を用いる、完全自動化した特注CE
システムとして、システム10′を使用した。このような
キャピラリーは、アリゾナ州、フェニックスのポリマイ
クロ・テクノロジー（Polymicro Technologies,Phoeni
x,AZ.）で入手することができる。高電圧（“HV"）電源
60は、プログラム制御可能なHV電源、モデルCZE 2000に
よって設けることができ、ニューヨーク州プレインビュ
ーのスペルマンハイボルテージ（Spellman High Voltag
e,Plainview,NY.）から入手できる。可変波長紫外・可
視部オンカラム吸収検出器120あるいは130（LINEAR mod
el 206 PHDサーモセパレーションシステムズ（Thermo S
eparation Systems）から入手可能）を、80386クラスの
パーソナルコンピュータ（不図示）で動くＷ−206デー
タ収集ソフトウェア（LINEAR）と組み合わせて使用し
た。言うまでもなく、別の装置や異なるサイズのキャピ
ラリーを使用することもできる。当業者であれば、シス
テム10に実際にキャピラリー通電クロマトグラフィーシ
ステムが含まれることを認めるであろう。このような場
合には、キャピラリー20は中空管ではなく充填カラムと
なるであろう。

本発明を実施するに際して、キャピラリーの標本ヘッ
ドを試料からの引き出す過程を正確に制御する自動化シ
ステムが特に重要である。図3A及び図3Bに示されたマイ
クロリザーバ電極ループ59様の、ワイヤループに付着し
た薄膜のような再現性のある液量を容器50から引き出す
ことが望ましい。薄膜中に保持される液量を再現性よく
確保するには、この操作をゆっくり行わなければならな
い。出願人の実験では、改変したフラクションコレクタ
ー（model 2110,BIO−RAD,Richmond,CA）をオートサン
プラーとして使用することにより、システムの自動化を
達成した。キャピラリーヘッドを水平及び垂直方向に動
かすために、電動式エアソレノイド弁で作動するいくつ
かの空圧式リニアアクチュエータを使用した。プログラ
ム制御可能なマイクロコントローラ（カリフォルニア州
ロスアンジェルスのミナリック電気（Minarik Electri
c）から入手可能なMicro Master LS装置）によってシス
テムオペレーションを制御した。他の制御システムを代
わりに採用することもできる。これらの構成部分および
サブシステムを集合的に200として図２に一般的に示
す。図２が煩雑になることをさけるために、マイクロリ
ザーバ電極59の物理的な動きは示していない。

キャピラリーの始端部でワイヤループをつくる一般的
手法が出願人の刊行物（Anal.Chem.1996,68,1164−116
8）に開示された。これと対比すると図3Aおよび図3Bに
示した本発明の実施例で使用したループは実質的に大き
く、そのためにかなり製造し易い。手短に言えば，直径
135μｍのステンレス鋼のワイヤを適当なサイズのドリ
ル・ビットの周りに巻き付けることにより直径5/64から
1/8インチのループを最初に作り、その後これを１乃至
２回撚り合わせて保持する。

図3Aと3Bに示すように、ワイヤループを取り入れたマ
イクロリザーバ電極（略して“ループ”）を２つの異な
る形状で使用した。図3Aでは、ループ59のなす平面は分
離キャピラリー20の縦軸に対して45゜から90゜の角度φ
で傾斜している。キャピラリー20に平行な垂直支持ワイ
ヤ64によってループ59が所定位置に保持される。このル
ープが対称形で始端部30の中心が中央部で対称位置に配
置されていることに注目されたい。下部キャピラリー始
端部30の上方数センチのところで、66として描かれてい
る小さなプレキシガラスジグによって支持ワイヤとキャ
ピラリーを保持する。ワイヤループによって高電圧電源
50に導電ワイヤ57が接続される結果、分離システム10′
においてループ59が一つの電極を形成する。ループマイ
クロリザーバ電極を用いる一つの利点は、真に対称な電
場が電極全体に作り出されることである。図3Aの実施例
では、液体からループを引き出したときループ中に保持
される液量はループ平面角がより垂直になるにつれて減
少する。

図3Bの実施例では、ループ59は、キャピラリー始端部
30の周りに形成され、キャピラリーの軸線はループの平
面に対して平行になる。終端ワイヤ68をキャピラリーの
始端部の周りに巻きつけ、接着用エポキシに樹脂によっ
てそこに接着する。

図3Aおよび図3Bの実施例では、ループにつながってい
る突出ワイヤ（すなわち支持ワイヤ）64またはワイヤ57
に対して高電圧の接続を行う。上述したように、結果的
にループ59が図１の電極55の代わりに高電圧電極として
機能する。本実験は逆極性（−HV）に限定して行ったの
でループ電極59を製造するにはステンレス鋼材が適当で
あった。

上述したようにシステム10′で使用するときは、マイ
クロリザーバ電極59は一定の液量（例えば１μＬ以下）
を保持し、マイクロリザーバ全体に均一な電場が与えら
れることが望ましい。図3Aと図3Bに示すような対称ルー
プはこのような目的に合致している。図3Cの実施例で
は、マイクロリザーバ電極59は半球体の窪み68を形成す
る面をもつ導電基体（例えば金属のような）から構成さ
れる。わかり易い例図としてこの基体を矩形で示した
が、円形の基体を代わりに用いてもよい。円形の基体を
用いれば対称性を保つのにさらに役立つであろう。半球
体の窪みは所望の液量（例えば１μＬ未満）を保持する
サイズとし、それによって一定容量の収容力を持つマイ
クロリザーバとして機能する。

一定容量を保持するためには、このようなリザーバに
自己サイホン作用を持たせてもよい。マイクロリザーバ
は導電材で作られているので、ワイヤ57をマイクロリザ
ーバ電極59の基体に接続し、これを電極として機能させ
てもよい。再言するが、キャピラリー20の始端部30はマ
イクロリザーバ半球体68の中心に対称に配置される。こ
の結果、半球体68に保持される試料は対称の電場にかけ
られることになる。

システム10′で使用する試薬は、16M Ωcm以上の特定
の電気抵抗を持つ、脱イオン化した蒸留水（例えばBarn
stead Nanopure）を用いてあらゆる種類の溶液を調製し
た、クロム酸ナトリウム水溶液（5mM）は、クロム酸ナ
トリウム４水和物（Na₂CrO₄4H₂O,A.R.Grade,Mallinckro
dt）から調製した。硫酸（H₂SO₄）0.1Mを用いてpH8.0に
調整した50mMのストックから毎日新しく調製した。セチ
ルトリメチルアンモニウム水酸化物（CTAOH）は、セチ
ルトリメチルアンモニウム塩化物溶液をOH^-型200−400
メッシュDowex 1x8陰イオン交換カラムクロマトグラフ
ィーでイオン交換して調製し、20mMのストックから使用
した。（−HVに印加したアース電極への流れをつくるた
めに）電気浸透流（“EOF"）調節剤としてCTAOHを使用
し、クロム酸塩電解液に添加し、最終的に濃度0.5mMの
溶液を得た。

システム10′を操作する際に、まずキャピラリー20を
BGEで満たし、その後ループ59を洗浄するために始端部3
0を下げて１つの試料バイアル瓶に入れ、そこから引き
出す。そして、キャピラリーを２番目の同じ試料バイア
ル瓶に入れ、ゆっくりと引き出してループ上に試料薄膜
を形成する。次に、キャピラリーを水平に移動し、例え
ば、図２の容器160のような仕向先側の液面と同じ高さ
の位置に置く。この位置で、ループの周りの領域が円筒
状に閉じ、弱い窒素流（20〜25cm³/min）によりCO₂の過
度の侵入が阻止される。高電圧電源60から電気移動電圧
（明示されていない場合、−3kV）を印加した。上述し
たように、マイクロリザーバ59はシステム10′の一方の
電極として機能した。もう一方の電極は電極155に（ま
たは、システムの別の10′場所に）接続した。

所望のEI時間の後、キャピラリーを最初のBGEバイア
ル瓶中に洗浄のため入れ、それを下げて２番目の新しい
BGEバイアル瓶に作業を行うために入れる。電気泳動の
ために−18kVの作業電圧を使用した。従来の試料バイア
ル瓶からEIを行うときと同様の方法でほぼ同じ手順を用
いた。陰イオンの定量を行い、特に記載がなければ試料
はすべてナトリウム塩として塩化物（200μg/L）、硝酸
塩（400μg/L）、蟻酸塩（400μg/L）および酢酸塩（40
0μg/L）の混合物で構成した。

次に、本発明を実施する際に基礎となる原理について
考察する。EIにおいて、電圧Ｖが印加されたとき、長さ
Ｌ、内径r_cのキャピラリー中に時間ｔの間に導入される
イオンｉの量Qiは次式で与えられる。

Q_i（μ_ｉ＋μ_eo）πr_c ²VC_it/L （１） ただし、μ_ｉおよびμ_eoはそれぞれ電気泳動および電
気浸透移動度であり、C_iはイオン種ｉの濃度である。こ
の分析では、キャピラリー先端の電場Ｅはキャピラリー
内部の電場と同一であると仮定されており、従ってこの
値はv/Lで与えられている。この流束はキャピラリー入
口域断面中に生じる。検体ｉのバルクリザーバが非常に
大きいので、ｃ′の値はEIの実行中本質的に不変であ
る。従って、キャピラリー内の検体イオンの移動速度が
キャピラリー先端での検体導入速度に影響を与えないか
ぎり、（１）式のより一般的な公式は以下のようにな
る。

M_i＝dQi/dt＝（Ｅμ_ｉ＋u_eo）aC_i （２） ただし、M_iはキャピラリー始端部の周りの面積ａの中
を通る、キャピラリーの方へのイオンｉの質量輸送速度
（eq/s）であり、イオン種ｉの濃度はC_iである。

実際には、電場Ｅがキャピラリーの内部と外部で同じ
であることはあり得ない。それにもかかわらず、電気浸
透によって導入されたEIの成分は、キャピラリー中に発
生したEOFに支配される。従ってEOFが支配するEIの成分
は、キャピラリーに発生するバルク流体速度μ_eoという
項によって直接的によりよく特定される。Ｅμ_ｉに対し
てμ_eoが非常に小さい場合には、式（２）は明らかに以
下のように単純化される。

M_i＝Ｅμ_iaC_i （３） 次に、キャピラリー先端部における電場の形状および
薄膜抵抗について考察する。単純化された代表的な例と
して、試料が半径r_out厚さｈの薄い円形ディスクで構成
され、キャピラリー始端部がディスクの中心に置かれた
場合のことを考察してみる。r_outに対してｈが小さいか
ぎり、垂直方向に拡散輸送は律速過程ではないと仮定で
きる。

ディスクの周囲面積２πr_outhが一方の電極を構成す
る。薄膜／ディスクがループを構成するワイヤの直径よ
り厚い場合でも電極面積は薄いディスクの全周囲面積に
正確に接近するであろうことに注目されたい。キャピラ
リー断面πr_c ²は、実際上の２番目の電極を表す。ほと
んどの場合、r_cは、r_outに比べて非常に小さい。従っ
て、平面形状の代わりにキャピラリー断面と等しい面積
の半径r_e円筒形状を中心電極が持つように近似してもよ
い。これより、 r_e＝r_c ²/2h （４） 従って、結果的に、最初は環形を満たす均一な抵抗ρ
の媒質を持つ環状電極システムとなる。ここで、 ρ＝1/（Σλ_jC_j） （５） であり、λ_ｊは、（Scm²eq^-1中の）イオンｊの当量導
電率であり、また、C_jは、1cm³当たりのその濃度であ
る。これは、Ωcm中に抵抗ρを与える。イオンｊには、
対象の検体陰イオン（イオンｉ、例えば塩化物）だけで
なく、電気的中性を維持するために媒質中に存在する等
しい濃度の対イオン（例えばナトリウムイオン）も含ま
れる。

この分析において、出願人は分析対象の律速過程をキ
ャピラリー中へのイオンｉの移動であると仮定した。こ
のような場合、（対イオンが薄膜中の検体イオン濃度に
対して非常に大きな濃度で存在する）キャピラリーから
出る対イオンの逆移動は律速段階ではない。EIを行うと
負電位に維持されるループ電極にOH^-という電解生成物
が発生することにも留意しなければならない。ループ薄
膜中の抵抗ρが増加するNaOHの影響を受けるだけでな
く、EI時間に相関して試料イオンの量が増加するにつれ
OH^-もまたそれゆえに導入されてゆく。

次に、ループの電気抵抗の与える影響について考察す
る。内部電極が半径ｒおよび厚さｈを持ち、かつ第２電
極が無限小の距離drの位置にあるならば、内部電極抵抗
dRは次式で与えらえる。

dR＝ρdr/2πrh （６） これより Ｒ＝（ρ/2πｈ）log r （７） 従って、半径r_outおよび内径r_cループを持つ分析対象
の実施例に上記の式をあてはめると、ループの抵抗R
_loopは次式で与えられる。

R_loop＝（ρ/2πｈ）log（r_out/r_e） （８） 次に、キャピラリー中への質量転移について説明す
る。式（３）において、電場Ｅをつぎのように表現する
こともできる。

Ｅ＝dV/dR （９） システム内を流れる電流Ｉは、全印加電圧Ｖと、キャ
ピラリーの電気抵抗（R_cap）ループの抵抗（R_loop）と
の和との関数である。従って、電流の関係式は以下のよ
うになる。

Ｉ＝V/（R_loop＋R_cap） （10） EIを行っている間、総印加電圧は一定のままであり、
また実際のほとんどの印加において、キャピラリーの電
気抵抗（R_cap）は、本質的に不変であり、R_loopよりは
るかに大きい。従って、電流Ｉは本質的に一定のままで
ある。

これより、式（９）は以下のようになる。

Ｅ＝I dR/dr （11） キャピラリー始端部において、式（３）から導かれ、
質量転移が生じる面積ａは、内部円筒形電極の表面積で
あり、また、キャピラリーの断面積に等しい。面積ａは
次のように書くことができよう。

Ａ＝２πr_eh （12） キャピラリー先端でｒ＝r_cおけば、式（６）から次式
が産み出される。

dR/dr＝ρ/2πr_eh （13） 式３、11、12および13を組み合わせることにより、次
の単純な結果が得られる。すなわち M_i＝Ｉρμ_iC_i （14） 本発明の試料薄膜は空間的に十分に混合され均質であ
る。薄膜全体はいつでも十分に混合されていると仮定す
る。水酸化物以外のすべての陰イオンについて、 −dC_i/dt＝M_i/V_f＝Ｉρμ_iC_i/V_f （15） ただしV_f、πr_out ²h与えられるループ薄膜の体積であ
る。

OH^-も、I/F eq/sの速度で薄膜中に生成される。ただ
し、Ｆはファラデー定数である。この結果以下の式が導
かれる。

−dC_OH/dt＝Ｉ（ρμ_OHC_OH−1/F）/V_f （16） 式（５）を展開すると次式となる。

ρ＝ΣC_iλ_ｉ＋C_OHλ_OH＋λ_Na（C_OH＋ΣC_i） （17） 式15、16および17は、連立二階微分方程式の組からな
り、その一般解は存在しない。

しかしながら、この連立方程式は、数値解法により容
易に解くことができる。別段の記述がない限り、以下の
システム特性が仮定されている。すなわち、ループ半径
1mm、試料容量１μＬ、試料組成Cl（200μg/L）、NO₃ ^-
（400μg/L）、HCOO^-（400μg/L）、CH₃COO^-（400μg/
L）、EI電圧−3kV、キャピラリー内径75μｍ、BGE5mM N
a₂CrO_4O60cmのキャピラリー長に対して、計算されたR
_capは、1.008GΩで、これは実験によって得られた電流
値−３μＡと高い近似的一致を示している。

133MHzで作動するペンティアムプロセッサPC上でター
ボベイシック（Borland International製）で書いたコ
ードを用いて計算を行った。反復ステップの時間幅を短
くとることにより溶液の収斂をチェックした。一般に、
反復ステップが100μｓ以下では、有意の変化は得られ
なかった。本明細書に記載されたデータのすべては、こ
のような時間的な反復ステップに基づいたものである。

上記の十分に混合した薄膜を試料として用いる場合に
は、その演算時間は特に要求されるものではないことに
留意されたい。しかし、（本明細書に記載する）EIを行
う間、薄膜組成が同心円状に変化するようなより現実的
な条件の場合には、50μｓの反復ステップで30秒のEIの
シミュレーションを行うために、14時間以上の演算時間
を必要とする。この14時間という演算時間がPCを利用し
た演算の許容可能な上限の時間を表していることはおそ
らく理解できよう。

出願人の分析は以下のアルゴリズムに従って行った。

1. 初期試料組成から、ρの初期値（式17）、R
_loop（式８）、およびＩ（式10）を計算する。

2. 選択した反復時間間隔（式14）内に注入された検体
イオンとOH^-の質量（累積質量）を計算する。

3. 試料薄膜の組成の変化（検体イオンとNaOHについて
の変化（式15と16）、および新しい組成に対する変化の
両方の変化）を計算する。

4. この新しい組成を用いて、上記ステップ１と同じ計
算を行う。

5. 所望の全EI時間シミュレーションが完了するまで、
ステップ２、３、および４を循環して行う。

成分を十分に混合した薄膜についてのこのようなEI数
値シミュレーションを行った結果を図４に示す。EI時間
の増加に伴い、注入されてゆく各検体の総量は、ほぼ指
数関数的にそれぞれの限界値に達する。しかしながら、
注入されたOH^-の量（＊で示す）の方はEI時間の増大に
つれて直線的に増加する。このような条件下では、定量
的に注入される検体はないが、EIの最後の頃には、移動
速度の速い塩化物と硝酸塩はほとんど完全に（それぞれ
96％および95％）注入される。しかしながら、４つの検
体中もっとも移動速度が遅い酢酸塩は約81％程度までし
か注入されない。塩化物対酢酸塩の相対バイアスは、1.
183である。これは言い換えれば、実際に注入された塩
化物の酢酸塩に対する注入量の比率が試料中に元々入っ
ていたそれぞれのイオンの比率よりも大きいことを意味
する。

これと対照的に、試料バイアル瓶から行った従来のEI
の同じ相対バイアスを式（１）から計算すると、得られ
る値は２つの移動度の比の1.866となる。実際に、出願
人もデータとして示していないが実験的にこれを観察し
た。従って、本発明に従ってもしEIを一定の限られた量
の試料で行えば非常に著しいバイアスの減少を期待でき
る。

空間的濃度勾配はBIを行っている間に生じる。上記の
概略的方法論は教育的なものではあるが、いくぶん単純
化しすぎている。現実にはループサイズは有限である。
さらに、各イオンはキャピラリー入口へそれぞれ異なる
速度で比較的速く移動するが、このことによって、薄膜
の組成が時間的にだけでなく空間的にもEI処理の間一定
にならないことが確かめられる傾向にある。

EIを行う間は、キャピラリーの入口近傍でイオンが枯
渇するために補充しなければならない。一方単純なモデ
ルでは、OH^-が実際に薄膜の外周縁近辺で相当量生じて
いる間は、OH^-は薄膜中で即座に混合されるため、この
ことが計算上の薄膜抵抗を低下させると考えられる。そ
の結果、ループ全体の電場およびEIの速度もこの効果が
ないときの期待値に比べて低下する。いくつかのレベル
の洗練された手法をモデルに含んでこれらの現象を説明
することはできるものの、基本モデルに関係する式を分
析的に解くことができない限り数値的解決法に頼らざる
を得ない。

出願人が採った基本的近似は、薄膜が個々に均一な組
成からなるいくつかの薄いセグメントに同心円状に分割
されていると仮定することである。最内側のゾーンはRI
NZONEの半径を持つ。ループの残りは、r_outに到達する
まで、厚さΔｒのセグメントに外向きに分割される。明
記されていない場合、本明細書でのシミュレーションで
は、RINZONEを50μｍと仮定しており、キャピラリーの
内径37.5μｍよりわずかに大きい。ΔＲ値＝10μｍを本
明細書全体を通じて用いる。r_out＝0.1cmに対して、ｎ
＝96の分離ゾーンが生じる。これらのｎ個のゾーンを、
その半径（cm）という観点からr₁、r₂、…r₉₅、r₉₆、と
名付ける。ただし、r₁＝RINZONE、r₂＝r₁＋0.001、r_k＝
r₁＋（ｋ−１）・0.001、r₉₆＝r_outr₀＝０とする。この
ような命名法を採用すると、各ゾーンすなわちシェルの
体積V_kは、次式で与えられる。

V_k＝π（r_k ²−r_k-1 ²）ｈ （18） 各シェルの電気抵抗R_kは式（７）に類似の方法で与え
られる。すなわち R_k＝（ρ/2πｈ）log（r_k/r_k-1） （19） ただし、この場合、r₀は０ではなく、仮定の円筒状中
心電極の半径r_cとする。それにより、R_loopを次式（2
0）から計算する。

次に、式（10）を用いて電流を計算する。最初のステ
ップの間、ゾーンＡ_i,kとＡ_OH,kの各々における、検体
とOH^-のそれぞれの量を以下のように計算することがで
きる。

Ａ_i,kＣ_i,kV_k （21a） Ａ_OH,k＝Ｃ_OH,KV_k （21b） OH^-および検体を表す式は一般に同じであり、差がな
い限りコピーする必要はない。従って、検体を表すすべ
ての式（この式に対して、OH^-を表す対応式が存在す
る）を参照番号の後ろにつけた‘a'によって示し、本明
細書では明示されていない水酸化物に適用される同一の
対応式‘b'を表すものとする。次に以下の手順ステップ
を行う。

6. 反復時間Δｔの間にゾーンｋからゾーンｋ−１まで
転移された検体量ｉ、ΔＡ_i,kを式（14）によって計算
する。

ΔＡ_i,k＝Ｉρ_ｋμ_iC_i,kΔｔ （22a） 7. 各ゾーンの新しい量を次に計算する。

Ａ_i,k（new）＝Ａ_i,k（old）−ΔＡ_i,k＋ΔＡ_i,k （23a） すべての検体に対して、最外側のゾーンｎにおいて、
ΔＡ_i,k＋１をゼロにする。しかしながら、水酸化物が
このゾーンで発生するので、 ΔA_OH,_n+1＝ＩΔt/F （24） となる。

8. キャピラリー内に導入された検体量ΔＡ_i,1、検体
量の累積総量を保持する。

9. 各ゾーンｋについて、ρ_ｋの値を式17に従って計算
し、電流Ｉを式19、20、および10を用いて計算する。

10. 手順ステップ６、７、８、および９を所望のEI時
間に達するまで繰り返す。

図５は、上記の方法を用いて、EIシミュレーションを
描いたものであり、あるモデルによって、５秒間での塩
化物の注入量を予測し、また10秒以内の酢酸塩の注入量
さえも予測した。図６は、EIタイマーの関数としての中
心円中の検体の分布を描いたものである。

図６において、EI時間の経過に伴う検体の半径方向の
分布に注目していただきたい。塩化物と酢酸塩の双方が
外側ゾーンからまず枯渇し、その後ループの中心（すな
わち、一方の有限マイクロリザーバ電極）に接近するに
つれて実際のプラトーに到達する。塩化物は、低速移動
する酢酸塩よりずっと速く姿を消す。外側電極にOH^-が
発生し、このOH^-は外側ゾーンに接近するにつれてほぼ
指数関数的に増加する濃度分布を各時点で示す。この増
加は、EIを行う時間の増加とともに増し、検体イオンと
は本質的に逆の挙動である。最外側のゾーンの検体の残
留濃度は本明細書に記載されているように人為的に高
い。

出願人のモデルは、拡散を説明しようと企図するもの
である。最初一見すると、液相拡散は小さく思われ、電
場支配によるイオンの輸送に対して無視できるように思
われるかもしれない。EIの最初の段階ではこれは事実で
ある。しかし一方で、ほとんど悉皆的な検体導入を行う
場合には拡散輸送には２つの重要な効果がある。まず第
一に、拡散混合は一方向の電気移動に支配される輸送と
は対立するものであり、従って、任意の検体を半定量的
に導入するのに必要な時間を長引かせる。第２に、最外
側のゾーンでEIが行われる後半時間中にNaOH濃度が十分
に高くなるのでゾーンが非常に導電性を持つようにな
り、局所的電位が低くなる。この場合、拡散は最外側の
ゾーンから中心部への（特にOH^-の）輸送を大いに助長
する。セグメントｋからセグメントｋ−１まで拡散によ
って輸送したイオン種ｉの量ΔADi,kが次式で与えら
れ、これによって２つの隣接セグメント間のフィックの
拡散輸送を仮定できる。

ΔＡ_Di,ｋ＝D_i（Ｃ_i,k−Ｃ_i,k−１）a/Δｒ （25a） ただし、D_iは拡散係数（μ_iRT/Fにも等しい）、ａは
２π_k-1hで与えられる輸送界面面積、そして、Δｒは拡
散距離、すなわち、（r_k−r_k-2）/2で与えられる２つの
隣接セグメント間の平均半径距離である。Ｒは、気体定
数で、Ｔは絶対温度を示す。拡散輸送を考慮に入れて式
（22）を修正した形は、次式のようになる。

ΔＡ_i,k＝μΔｔ（Ｉρ_kiC_i,k＋４πRTr_k-1h （Ｃ_i,k−Ｃ_i,k−１）／（Ｆ（r_k−r_k-2））） （26A） 本明細書に以上記載したものと同じ方法に従って反復
計算を行う。図７および図８は、図５と図６に対応する
出力を描いたものであるが、拡散を考慮に入れている。
拡散混合を考慮に入れることにより、EIによる検体導入
の速度を減速することに著しい効果が現れている点に注
目されたい。水酸化物が最外側のゾーンからより多く混
入する点も顕著に認められる。同じ理由により、最外側
のゾーンの人為的残留検体濃度はもはや確認されない。

図７と図８およびそれに対応する図４と図５との間の
違いは、単に拡散効果から生じるもののように思われ
る。検体の電気的移動度は拡散係数に対し直線性を示
す。しかし一方、電気移動が電場に依存する過程である
のに対して、拡散は異なる。従って拡散の相対的な重要
性は、より低いEI電圧が印加されたとき増大する。この
２組の結果の違いは、印加EI電圧の違いがどのようにこ
の過程に影響するかという観点から説明できる。印加電
圧を変更した場合の効果を数値モデルで考察する。式
（１）と対照的に、定電圧条件下における単位時間当た
りの生成物量では、EIより高い印加電圧で行う方がより
効率的である。例えば、酢酸塩については、94.59％
（−6kVで５秒間）対91.33％（−3kVで10秒間）の試料
を導入し、また、99.87％（18kVで５秒間）対99.62％
（9kVで10秒間）の試料を導入する。

出願人はまた、非拡散混合と電気浸透流という観点か
ら効果を説明することを企図した。

確かに、薄膜全体が十分に混合したポット（pot）で
あるという仮定は過度に単純化されている。しかしなが
ら、単なる混合プロセスを拡散として仮定することも不
正確な過程となり得る。

出願人の反復演算手順では、すべての10μｍ厚のセグ
メントの内容は100μ秒毎に均質化されると仮定してお
り、この仮定は、拡散混合のみを考えた場合よりも実質
的に効果的な過程を表している。しかしながら、各反復
ステップでは、計算結果は100μ秒以下で収斂するの
で、このように仮定しても支障は生じない。現実の系で
は、より効果的な混合手段が、特に円盤の最内側部およ
び最外側部に存在すると信じるにたる理由がある。

第一（最内側部）の場合、キャピラリー始端部の存在
が非拡散混合を引き起す可能性があり、第二（最外側
部）の場合、電解ガスの発生が結果的に有意な混合とな
る可能性がある。

最内側および最外側のゾーンを画定する半径距離を選
択することによりこれらの現象を説明することができ
る。なぜなら、このような選択によって反復ステップで
均質化される体積が効果的に変わるからである。出願人
のモデルでは、RINZONEを50μｍと150μｍの間で変化さ
せても、（最外側のゾーン幅とループの半径がそれぞれ
10μｍと1000μｍで一定に保たれている限り）結果にほ
とんど影響はなかった。例えば、10秒間に注入した塩化
物のフラクションは、RINZONEをこの範囲内で増加させ
ても99.4790％から99.4786％まで減少し、酢酸塩に対す
る変化も非常に僅か（91.1068％〜91.1009％）である。

最外側のゾーン幅を変更した場合の効果はもっと顕著
に表れる。この場合、注入された全イオンのフラクショ
ンは、ゾーン幅が増すにつれて減少する。最外側のゾー
ン幅を、10、50、100、200および350μｍとして、RINZO
NEとループ半径をそれぞれ50μｍと1000μｍに保った。
10秒間に注入した塩化物のフラクションは、それぞれ9
9.48％、99,40％、99.04％、97.56％および94.40％で、
酢酸塩のフラクションは、91.11％、90.82％、89.72
％、86.01％、および79.52％であった。最外側のゾーン
幅を変更したときに生じる大きな効果はより理解しやす
い。NaOHがこのゾーンに生成されて有効電磁場の大きな
変化を来し、もしこの変化がより大きな体積全体に生じ
れば、それによって、より大きな体積に影響を与える可
能性がある。

本システムでEIが行われる間の電気浸透流Q_eoは、極
めて小さく、0.500nL/sである。電気浸透流を説明する
ために、所定の反復時間内にEOFによって導入された検
体量は最内側のゾーンの成分と同一の成分に対応すると
いう仮定に立っている。従って、（式（24）の直後の）
ステップ８を修正した形は次のように定式化される。

ｍ_i,inj（new）＝ｍ_i,inj（old）＋ΔＡ_i,k＋Q_eoΔtC
_t,1 （27） ただし、ｍ_i,injは、キャピラリー中へ注入される検
体ｉの量であり、ΔＡ_i,kは式（26）によって与えられ
る。EOFによる薄膜の体積変化は、薄膜厚さｈの相当す
る変化によって説明できる。しかしながら、垂直方向へ
の輸送を限定要因として考えていないので、これはいく
ぶん外面的なステップである。

より重要な点として、薄膜中の検体量の変化および濃
度変化を説明する必要がある。現実の系を描写する正確
な代替手段がないので、各ゾーンの検体濃度に比例する
ように、薄膜全体の検体濃度の変化がキャピラリー中に
注入される検体を反映していると仮定すると Ｃ_i,k（new）＝Ｃ_i,k（old）・ （ｍ_i,rem−Q_eoΔtC_i,1/m_i,rem・（h/（ｈ−Δｈ））
（28） ただしｍ_i,remは、薄膜中の検体ｉの量で、Δｈは次
式で与えられる。

Δｈ＝Q_eoΔt/（πr_out ²） （30） ただし、ｈは薄膜の現在の厚さである。式（28）の右
辺において、初項は量的変化を、第２項は薄膜の厚さを
変えることによって生じる体積の変化を説明している点
に留意されたい。

出願人の実験システムではEOFが非常に遅かったの
で、Q_eoは、3kV、30秒間のEI時間という条件での薄膜体
積のわずか1.5％を説明するにすぎない。このため、出
願人のモデルのこの改善は注目に値する変化にほとんど
つながらない（例えば酢酸塩を添加した10秒のEI時間に
対して、導入フラクションが91.11％から91.33％まで増
加するというような）。しかしながら、より高いEOFで
はより大きな変化が観察される。例えば、EOFが10倍大
きいとき、上記と同じ標品を用いて導入されたフラクシ
ョンは93.42％であった。

上述したように、一定の小さな（好適には体積が約１
μＬ以下の）マイクロリザーバを保持することが望まし
い。出願人のワイヤループは、図3Aと3Bに描かれている
ように、そのようなマイクロリザーバを好適に提供する
ものである。さらに、そのようなマイクロリザーバは、
高電圧電極としてマイクロリザーバ用金属製ループを用
いることにより、内部の試料全体を均一の電場にかける
機能も有する。図3Cに関連して記載した導電半球体状の
他のマイクロリザーバの構成について出願人は検証し
た。

ワイヤーループあるいは半球状のマイクロリザーバの
半径の大きさの影響を考察する。

半径が変化すると試料体積が効果的に変化することは
理解できよう。所定の印加電圧に対して“悉皆的な"EI
を行うには相当の長時間を要する。図９は、注入した塩
化物と酢酸塩のフラクションに対する数値シミュレーシ
ョンの結果をマイクロリザーバのループ半径とEI時間と
の関係として描いたものである。

参考のため、出願人は、本明細書に記載したものと同
じシステムとループ電極とを用いてバイアル瓶から従来
の流体力学的注入および従来のEI注入を行いこれを検証
してみた。

流体力学的注入は時間に対して直線性を示した。例え
ば、N,N−ジメチルホルムアミドを試料として用いた場
合、10秒から90秒の実施でその高さの差は4.7cmであっ
た。

任意の単位でのピーク面積は式（27）によって以下の
ように与えられる。

peak area（arb.units）＝12.39±0.37t（sec） −（19.66±3.78）;r²＝0.9867 （27） Cl^-、NO₃ ^-、HCOO^-、CH3COO^-の微量標準混合液を用い
てバイアル瓶から従来のEIを行った。−3kVの高電圧
で、EI時間を１秒から30秒としたところ、EI時間に対し
て直線的に比例した速度で個々のイオンのすべてが導入
された。個々のr2値は、0.9976（Cl^-）、0.9980（N
O₃ ^-）、0.9968（HCOO^-）、および0.9904（CH₃COO^-）で
あった。試料中の個々の検体の濃度およびその反応因子
はいずれも同じではなかった。従って、等容量試料導入
速度という観点からこの結果を表現するのが都合がよ
い。この速度は、試料イオンの移動度とともに変動し、
0.489±0.008μL/s（Cl^-）、0.443±0.007μL/s（N
O₃ ^-）、0.338±0.007μL/s（HCOO^-）、および0.2373±
0.008μL/s（CH3COO^-）μL/sである。

イオン移動度μ_ｉに対する注入速度dv_injdtの関係は
式（28）によって次のように与えられる。

（dV_inj/d_i）＝（6.69±0.24）・102μ_ｉ −（4.51±1.54）・10^-2,r₂＝0.9975 （28） 上記の結果は、式（１）が予測するものと高い近似的
一致を示している。しかしながらこれらの結果は、この
ような系から期待できる最良の結果であるかもしれず、
より高い電圧を印加したとき式（１）から予測される挙
動から特徴的な変動が観察できる。

出願人は、上記記載の−3kVでの測定値に加えて、印
加EI電圧−6kVで15秒まで、また、−9kVで10秒まで実験
を行った。それぞれの印加電圧において、Cl^-とNO₃（r²
＞0.9970）に関しては、導入された試料の量とEI時間と
の間の関係は直線性を示した。しかしながらHCOO^-につ
いては、r²値は、−9kVで0.9829であり、また、CH₃COO
については、線形r²値は、−6kVで0.96まで、また、−9
kVで0.25まで低下した。

もっと重要な点は、式（１）に基づき、試料導入速度
が印加電圧に直線的に比例することが予期されることで
ある。Cl^-とNO₃ ^-に関しては、導入速度比は予期した結
果1:2:3とは異なり、−3kV、−6kV、および−9kVでそれ
ぞれ1:1.59:1.72および1:1.45:1.50であった。実際、硝
酸塩の導入速度は、−6kVと−9kVとの間で、ほとんど変
動しなかった。蟻酸塩については印加電圧の関数として
観察された比は1:1.25:0.98であった。そして実際に導
入速度は−9kVで減少した。酢酸塩についてはこの効果
はより顕著で、1:0.83:0.05の比が観察された。印加電
圧が最大値のとき、酢酸塩はほとんど導入されず、その
量はEI時間（すなわち上記引用の低いr²）にほとんど依
存しなかった。

酢酸塩の電気化学的還元が上記の挙動を説明する適切
な機構であるとは考えられない。

そうではなく、この還元はキャピラリー始端部近傍で
生じる低速移動イオンの枯渇が原因であると出願人は推
定する。もしそうであれば、検体濃度の減少により状況
の悪化がもたらされる（特により反応性の高いイオンに
とっては）。

図10Aと10Bは、出願人の微量分析標準混合液（図10A
−（ａ））と図10A−（ａ）の溶液、および４倍希釈液
（図10A−（ｂ））の重畳エレクトロフェログラムを用
いた結果を描いたものである。両溶液とも−3kVで30秒
間EIを行った。蟻酸塩および酢酸塩は図10A−（ｂ）の
フェログラムにおいて識別さえできないことに注目され
たい。

一般にこのような挙動は少なくとも定性的に理解でき
るものである。キャピラリーと高電圧電極を試料バイア
ル瓶中に浸しEIを試みる場合、電場は主としてキャピラ
リー先端と電極との間に存在する。従って、試料体積の
ごく小部分に効果的に電場がかかる。

EIの進行につれて、導電率を増大させるために酸ある
いは塩基の電解生成物がさらにこの同じ領域に電場を集
中させる。

一つのループでは、仮想的な連続する同心円状ゾーン
が相互に電気的に実際上直列状態となる。しかし、従来
のEIでは、キャピラリー始端部と電極との間の様々な経
路は実際上並列であって直列ではない。この大きな電場
で検体イオンが補充される大きな機構は拡散である。小
さな拡散係数をもつイオンについてはほとんど移動が生
じない。その結果、バルク溶液内に濃度勾配が発生せず
これがさらに拡散輸送を妨げ、運動が自然停止するとい
う影響を与える。最初検体濃度を低くするかあるいは印
加電場を高くすればバイアスが増加することは明らかで
ある。

次に、出願人のループのような対称のマイクロリザー
バ電極からの電気移動注入（EI）、および移動度に基づ
くバイアスの役割について考察する。ループによるEIの
特に重要な側面は、図10A−（ａ）と図10A−（ｂ）に描
かれたバイアスの型が理論的に予期されるものでもなけ
れば、実験的に観察されるものでもないという点であ
る。図10B−（ｃ）は、図10A−（ｂ）と同じ状況を描い
たものであるが、今回はEIが、（同電圧、同時間で）１
μＬ体積のループから行われるという点が異なる。４つ
のすべての予期されたピークが観察されるだけでなく、
炭酸塩に起因する一つのピークも観察される。

微量分析を改善するために従来のEIではナトリウムペ
ンタンスルフォネートのような終末電解液がしばしば添
加されるが、図10B−（ｄ）のデータについてこれを行
った。ループから行うEIではこのような電解液を添加し
ても何も得られないことは図10Bから明らかである。従
来のEIで見られるこのようなバイアスは電場の形状に関
連すると論理的には言われている。従って出願人は、高
電圧電極としても機能する金属製のブロック（図3C参
照）に入れた体積約10μＬの半球形の窪みに知多を含む
実験を行った。キャピラリー始端部はこの窪みの中心に
置かれた。この結果はループで得られたものときわめて
類似した、すなわち試料に与えられた電場の形状の重要
性を強調するものとなった。

図11Aと図11Bはループから行うEIのダイナミックレン
ジのさらに顕著な例を描いたものである。図11Aでは硝
酸塩を300ppbで一定に保つ一方、酢酸塩を30ppbから30p
pmの間で変動させた。図11Bのデータについては酢酸塩
を200ppbで一定に保ち酢酸塩を同じように変動させた。
移動時間シフトについて補正したピーク面積は、出願人
が本明細書で開示した手法が従来のEIで可能なものより
実質的により大きなダイナミックレンジを有利に提供す
ることを証明している。

3kV〜18kVの範囲で印加電圧を3kV毎に変動させ、9kV
・ｓ〜108kV・ｓの範囲でのVt積についてループから行
うEIによる試料導入の結果を検証した。ループ−EIの結
果は、当明細書で以上記載したようにバイアル瓶−EIで
得られた結果とは極めて異なる。

理論的に予測できるように一定のVt積については、よ
り高い電圧を印加したとき導入はより完全なものとな
る。

図12は、１μＬループに対して異なる電圧を印加した
場合のEI時間の関数として塩化物／酢酸塩ピーク面積比
の変化を描いたものである。このプロットについては、
最大電圧（18kV）が最小時間（0.5秒）印加されたとき
の面積比を単位値として任意に割り当てた。この条件下
では、バイアスが最大になる一方で、より高いVt生成物
での限界値0.535（酢酸塩／塩化物移動度比）にバイア
スが接近することが予想され、実際にそれが観察され
る。

注入とバイアス量の完全さを検証した。図13Aと13B
は、半径約1mmの、およそ１μＬ体積の傾斜ループ（図3
B参照）から得たデータを描いたものである。正確な体
積を測定することは困難であったので、図13では、注入
された等容量（例えば、その体積内に含まれる検体の）
を縦座標として用いている。その結果は、図５に示した
ものと関連して記載したモデル計算と定性的に類似して
いる。しかしながら、前述のモデルで10秒を要したもの
を成し遂げるのに約50秒という時間を要したという点で
効率は低かった。これは現モデルが垂直方向の輸送限界
値を考慮に入れていないという事実の結果であると出願
人は考える。例えば320μｍ厚の薄膜は極微的には少し
も薄いものではない。しかしながら広義の一般的なパタ
ーンはここで用いたモデルのパターンと同一である。図
13Bは、完全に除去されてはいないが、悉皆的電気移動
でバイアスが大きく減少していることを描いたものであ
る。

理論的に予期できるように、より大きなループの利用
は同電圧で同時間EIを行った場合、完全でない注入とよ
り大きなバイアスを生じる結果になることを出願人は観
察した。一方、垂直平面ループでは、入る液量が少ない
ので、同一のループ半径に対して同じEI条件ならば、こ
れらのループからの注入はより完全になりバイアスは減
少する。

EIを行った結果として水酸化物が生成し系中へ注入さ
れる。BGEは有限の緩衝容量を有し、OH^-ピークはこの容
量を超過した後でのみピークとして現れる。図14に一例
を示す。この図で、15秒間のEI時間に対する水酸化物ピ
ークは見られないが、25秒間のEI時間でははるかに大き
いピークが見られる。25秒〜60秒の範囲のEI時間に対す
る積分した水酸化物ピーク面積は、r²値0.9996でEI時間
と直線性を示す相関関係がある。OH^-導入と時間との直
線的相関関係が図４に見られた。水酸化物に起因する明
確なピークがEIを開始して20秒後に最初に現れることも
予測できる。

以上を要約すると、試料全体を少量の限定容積から注
入しそれを好適には対称に電場に曝せば、その結果CEに
おけるEIを実質的に改善されることを出願人は証明し
た。事実、本明細書に記載したマイクロリザーバ電極を
用いることにより、先行技術で現在実施されているもの
に比べてより便利でより有効なCEによる注入法を構成す
ることが可能である。ミクロタイター金属製プレートに
半球形のウェルを形成する発明に加えて、ワイヤループ
上に形成した薄膜を用いる出願人の発明の結果を他の形
状にも適用できることは理解できる。また、様々なマイ
クロリザーバ電極を用いたオートサンプラーの構成を利
用することもできる。

本発明は、CEおよび他の分離システムにおけるサンプ
リングと注入を改善できるのみならず、同時に従来の検
出器で現在利用できる範囲以上に検出限界値を改善する
ものになることを出願人は予想する。もしH⁺やOH^-のよ
うな導入が重要な要因となることがあれば、薄膜構成を
用いることによりH⁺やOH^-イオンの導入を阻止すること
が可能となるであろう。

以下の請求の範囲によって定義される本発明の発明主
題および精神から逸脱することなくこの開示実施例に対
して改変や変形を行うことができる。主として、キャピ
ラリー電気泳動分離システムを用いて行われる分析に関
して説明してきたが、例えば、キャピラリー通電クロマ
トグラフィー分離システムにおいても本発明は実施可能
である。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−160356（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/447 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中の選択された極性をもつ検体イオン
   を、高電圧印加によって分離キャピラリーを通して移動
   させるキャピラリー分離システムにおいて、注入が、前
   記検体イオンの個々のイオンのイオン移動度に実質的に
   依存せず、かつ、試料導電率に実質的に依存しないよう
   に、悉皆的に前記検体イオンを電気移動によって前記キ
   ャピラリー中に導入する方法であって、 （ａ） 前記試料の或る液量を再現可能に保持する、実
   質的に一定の有限の収容体積を画定する電気導電マイク
   ロリザーバを提供し、 （ｂ） 前記マイクロリザーバ中の前記試料の部分と接
   触する、前記分離キャピラリーの入口端を配置し、 （ｃ） 前記高電圧を作り出す一方の極性が印加される
   導線を前記マイクロリザーバに接続し、一定時間前記高
   電圧を加え、前記選択された極性の前記試料中のイオン
   を前記分離キャピラリーの前記入口端中へ実質的に悉皆
   的に導入させる段階を有する方法。
2. 【請求項２】前記システムが電気泳動分離システムであ
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記システムがキャピラリー通電クロマト
   グラフィー分離システムである請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】段階（ａ）が、 （ｉ）所望のループ面積を画定するように、円形ループ
   に形成された導電ワイヤからなり、前記試料をワイヤル
   ープに付着した薄膜として保持するマイクロリザーバ
   と、 （ii）所望の体積を有する半球体空洞が画定されている
   基底部を含むマイクロリザーバ からなるグループから選択されるマイクロリザーバを提
   供することを含む請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】段階（ａ）が、所望のループ面積を画定す
   る円形ループであって、 （ａ）前記分離キャピラリーの縦軸に対して平行な平面
   と、 （ｂ）約45゜〜約90゜の範囲の角度で前記分離キャピラ
   リーの縦軸から位置がずれているいる平面と、 からなるグループから選択される平面に配向されたルー
   プ平面を画定する円形ループに形成された導電ワイヤに
   より製造されたマイクロリザーバを提供することを含む
   請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】前記マイクロリザーバが、対称性を有する
   形状の収容体積を画定する請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】段階（ｂ）が、前記マイクロリザーバの対
   称の中心部分に、前記試料部分と接触して前記分離キャ
   ピラリーの前記入口端を配置することを含む請求項１記
   載の方法。
8. 【請求項８】段階（ａ）が、前記収容体積が、（ａ）約
   ２μＬより小さい体積と、（ｂ）約１μＬより小さい体
   積と、（ｃ）約0.5μＬより小さい体積からなるグルー
   プから選択される体積である請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】試料中の選択された極性をもつ検体イオン
   を、高電圧の印加により分離キャピラリーを通して移動
   させ、前記検体イオンの個々のイオンのイオン移動度に
   実質的に依存せず、かつ、実質的に試料導電率に依存せ
   ずに、前記キャピラリー中に悉皆的に注入する。キャピ
   ラリー電気泳動システムにおいて、 前記試料の或る液量を再現可能に収容するサイズを持つ
   電気的導電マイクロリザーバであって、実質的に一定の
   有限な収容体積を固定するマイクロリザーバと、 前記マイクロリザーバに接続する第１導線と、前記イオ
   ンが前記マイクロリザーバから分離キャピラリーを介し
   て移動する側の前記システムの或る領域に接続する第２
   導線と、を持つ高電圧電源とを有しており、 前記分離キャピラリーが、前記マイクロリザーバ中の前
   記試料部と接触して配置可能な入口端を有し、 前記高電圧の一定時間の印加によって、前記選択された
   極性の前記試料中のイオンが前記分離キャピラリーの前
   記入口端中へ実質的に悉皆的に導入されることを特徴と
   する前記システム。
10. 【請求項１０】前記システムが電気泳動分離システムで
    ある請求項９記載のシステム。
11. 【請求項１１】キャピラリー通電クロマトグラフィー分
    離システムである請求項９記載のシステム。
12. 【請求項１２】所望のループ面積を画定するために、前
    記マイクロリザーバが円形ループに形成されている導電
    ワイヤを含む請求項９記載のシステム。
13. 【請求項１３】前記ループが、 （ａ）前記分離キャピラリーの縦軸に対して平行な平面
    と、 （ｂ）約45゜〜約90゜の範囲の角度で前記分離キャピラ
    リーの縦軸から位置がずれている平面とからなるグルー
    プから選択される平面に配向されたループ平面を画定す
    る請求項12記載のシステム。
14. 【請求項１４】前記マイクロリザーバが、所望の体積を
    持つ半球体の空洞を画定する基底部を含む請求項９記載
    きシステム。
15. 【請求項１５】前記マイクロリザーバが、対称性を有す
    る形状の収容体積を画定する請求項９記載のシステム。
16. 【請求項１６】前記収容体積が、（ａ）約２μＬより小
    さい体積と、（ｂ）約１μＬより小さい体積と、（ｃ）
    約0.5μＬより小さい体積からなるグループから選択さ
    れる体積である請求項９記載のシステム。