DE2559534A1

DE2559534A1 - Isoelektrische fokussierung

Info

Publication number: DE2559534A1
Application number: DE19752559534
Authority: DE
Inventors: William Donner Denckla
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1974-07-10
Filing date: 1975-07-02
Publication date: 1977-02-24
Also published as: SE7507625L; IT1039538B; JPS5130581A; GB1509430A; GB1509429A; US3951777A; DD120596A5; FR2277622A1; CH589853A5; FR2277622B1; DE2529606A1; NL7508260A; DK309875A

Description

Patentanwälte Γ Ι Sep. 19-0

Dr. Franz Lederer
tjpl.-lfig. Reiner F. Meyer . ? ζ 5 9 5 3 4

8000 München 80 ^ ** ^

Uidle-Grahn-Str. 22, Tel. (039) 47 2947

RAIT 4105/13-001

F. Hof&aann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

. · Is ο elektrische Fokus^erung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Yerfahren zur trennung von Anpholyten.

Die Trennung und die Reinigung von komplexen Molekülen von biologischem Interesse war bisher der Gegenstand von einer intensiven Forschung- Da viele dieser Moleküle Ampholyte sind, können sie durch Elektrophorese getrennt werden- Unterwirft man eine Mischung von Ampholyten in Lösung eir_er Gieich-Stromspannung ordnen sich die Ampholyten bei dieser Spannung gemäss ihren isoelektrischen Punkten, was eine Trennung aur Folge hat.

In den letzten Jahren wurde ein verbessertes Yerfahren zur Trennung von Ampholyten, nämlich die isoelektrische Fokussierung, entwickelt. ITach diesem Yerfahren wird durch Verwendung von S3rnthetischen Yerbindungen (hiernach als Trägßrampholytcn

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bezeichnet) ein künstlicher pH-G-radient hergestellt. Each Elektrophorese einer Ampholyten-Mischung in einem derartigen pH-Gradient, welcher als Puffer wirkt, ordnen sich die Ampholyten in diesem Gradient. Genauer gesagt wandert jeder Ampholyt zu dem pH-Wert in dem Gradient, wo er isoelektrisch ist, d.h. seine Uettoladung 0 ist. Die Fokussierung findet an dem Punkt statt, an welchem der pH-Wert mit dem isoelektrischen Punkt des Ampholyten ■übereinstimmt.

Detaillierte Angaben über die Theorie und die Methoden der isoelektrischen Fokussierung sind in Haglund, Methods of Biochemical Analysis, YoI. 19» Seite 1 und Annals of the !Jew York Academy of Sciences, vol. 209, "Isoelectric Focusing and Isotachophoresis" vorhanden.

Vor kurzem sind durch Valmet in der US Patentschrift Ho. 3 616 456 und in Science Tools YoI. 16, Seite 1 (1969) eine Anzahl von Vorrichtungen für die isoelektrische Fokussierung beschrieben worden. Diese Vorrichtungen besitzen eine Anzahl von nacheinander angeordneten -Kammern, in der Regel eine "U-Röhre" oder eine "V-Röhre" .Der Vorteil eines derartigen Systems liegt darin, dass im Falle einer Kontaminierung in einer Kammer (z.B. durch einen festen niederschlag), diese Kontaminierung sich nicht auf das ganze System überträgt. Diese Vorrichtungen funktionnieren mit relativ niedrigen Spannungen von ungefähr 800 bis 2400 Volt und einer aufgenommenen Leistung von ungefähr 15 bis 20 ¥att für eine 45 ml-Einheit. Unter diesen Bedingungen bleiben die Auflösung, die Leistungsfähigkeit und insbesondere die Schnelligkeit der elektrophoretischen Trennung beschränkt, da die Schnelligkeit direkt proportional zur Spannung ist. Andererseits ist die Auflösung proportional zur Quadratwurzel der Spannung. Der Zeitfaktor wird kritisch wenn empfindliche Ampholyte getrennt werden»

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Es "besteht somit ein echtes Bedürfm^ Methoden

zur Verfugung zu haben, welche,mit hoher

Auflösung, grosser Schnelligkeit und einer guten Heproduzierbarkeit, eine präparative Trennung von Ampholyten ermöglichen.

Diese Erfordernisse werden durch die vorliegende Erfindung,welche eine verbesserte Methode zur isoelektrischen Fokussierung in pH-Gradienten betrifft, erfüllt. Diese Methode nacht es möglich, in', grösserem Umfang und mit hoher Auflösung eine schnelle Trennung von Ampholyten zu erreichen. |

Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung .wobei ein Gleichstrom durch eine Ampholyt-Lösung. bestehend aus einer Pxobeampholyt-Mischung, einer einen künstlichen pH-Gradient -erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser, geleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die AmphoIyt-Mischung,

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oder gewünschte Teile davon, ohne wesentliche Verdünnung der isoelektrischen Fokussierung in einer Reihe von mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtungen von immer kleineren Volumen, unterworfen wird.

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Das erfindungsgemässei,- Verfahren

erlaubt- eine Trennung der Ampholyte Ms -zur Grenze dessen,, was mit den im Handel erhältlichen Träger-Ampholyten theoretisch möglich ist- Im Vergleich zu den bekannten Vorrichtungen führt das: erfindungsgemässe Verfahren , zu einer ungefähr 10-fachen Erhöhung der Intensität des elektrischen Feldes pro Wegstrepkeeinheit; einer 30-fachen Erhöhung der insgesamt angelegten elektrischen Spannung; einer 3-fachen Erhöhung der Leistungsfähigkeit; einer 6-fachen Erhöhung des Leistungs-Verbrauchs pro Volumeneinheit und. mehr als einer 300-fachen Erhöhung des totalen Leistungsverbrauchs; einer 8-fachen Erhöhung der Schnelligkeit; und einer 500-fachen Erhöhung der trennbaren Menge an Ampholyt. Polglich kann 'das erf indungsgemässe Verfahren . mit Spannungen von bis.

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zu 100 Kilovolt arbeiten und "bei hoher Leistung 6000 Watt oder mehr verbrauchen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Ampholyten, wobei die Fokussierung unter Bedingungen erfolgt, welche es ermöglichen im Verhältnis zum Volumen der AmphoIyt—Lösung eine hohe aufgenommene Leistung zu haben, wobei die Temperatur· der Lösung relativ konstant bleibt.

In den bereits bekannten Vorrichtungen, wie z.B. in den anfangs erwähnten durch Valmet entwickelten Vorrichtungen, beobachtet man eine bedeutende Erhöhung der Temperatur der Lösung, selbst wenn die Leistungsaufnahme im Verhältnis zum Volumen der Ampholyt-Lösung relativ klein ist.

Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, dass die·Temperatur der Ampholytlösung relativ konstant bleibt·. Viele der biologisch wichtigen Ampholyte sind Proteine und können, sehr leicht durch Hitze denaturiert werden. In der Regel wird bei diesen Substanzen die isoelektrische Fokussierung bei niedrigen Temperaturen, wie z.B. zwischen 0°C und 5⁰G durchgeführt. Auf diese Weise wird das Auftreten einer Denaturierung oder anderer nachteilhafter Auswirkungen vermieden. Eine bedeutende Erhöhung der Temperatur oberhalb dieser Grenze kann in vielen Fällen eine Zerstörung der wertvollen

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"biologischen Aktivität oder Spezifität der zu reinigenden Molekülen zur Folge haben.

In den "bisher bekannten Vorrichtungen, wie z.B. in denjenigen,welche durch Valmet entwickelt wurden, hat man versucht,die Temperaturerhöhung auf Kosten der Leistungsaufnahme auf ein Minimum zu halten.

Es ist bekannt (siehe z.B. Swensson, Acta. Chemica Scandinavica, 15, 425 (1961)),dass das Auflösungsvermögen • eines isoelektrischen Fokussierungssystems direkt proportional zur Quadratwurzel der angelegten Spannung ist.

Während das Auflösungsvermögen technisch nicht vorn Strom abhängt, ist die für die Auflösung notwendige Zeit, d.h. die Zeit nach welcher praktisch ein Aequilibrium erreicht wird, eine Punktion der Leistungsaufnahme d.h. des Wattverbrauchs. Bei Verwendung einer Vorrichtung mit einem geringen Wattverbrauch wird für die isoelektrische Fokussierung eine lange Zeit (etwa 2 Wochen) gebraucht. Wegen der Instabilität* von vielen Ampholyten ist eine Durchführung der Fokussierung während einer langen Zeit unerwünscht. Dies hauptsächlich wenn die Temperatur nicht relativ niedrig gehalten wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren, welches einen hohen Wattverbrauch ohne bedeutende Erhöhung der Temperatur der Lösung erlaubt, macht es möglich, in einer Vorrichtung von vergleichbarem Volumen in viel kürzerer Zeit (ungefähr 1,5 Stunden) eine isοelektrische Fokussierung mit sogar höherer Auflösung durchzuführen.

Wie bereits erwähnt kann gemäss vorliegender Erfindung eine verbesserte isoelektrische Fokussierung dadurch erreicht werden, dass die isoelektrische Fokussierung ohne

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wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Lösung in einer Reihe von Vorrichtungen von immer kleineren Volumen erfolgt.

In den bereits bekannten Vorrichtungen, wie z.B. demjenigen welche durch Valmet entwickelt wurde, war die Anzahl der Kammern in einer bestimmten isoelektrischen Pokussierungseinhe.it für die Auflösung ausschlaggebend. In der Polge hat man das Auflösungsvermögen als das Verhältnis der" Anzahl von pH-Einheiten in dem pH-G-radient zur Hälfte der Anzahl Kammern pro Einheit, definiert. Bei einem pH-G-radient von 7 pH-Einheiten mit 30 Kammern pro Einheit beträgt das Auflösungsvermögen 0,47 pH-Einheiten. Um eine Auflösung von 0,01 pH-Einheiten mit dem gleichen pH-Gradient (7 Einheiten) zu erreichen,benötigt man eine Einheit mit mehr als 1000 Kammern.

Erfindungsgemäss können Auflösungen"von 0,01 pH-Einheiten (theoretische Grenze der Auflösung, welche mit den handelsüblichen Träger-Ampholyten erreichbar ist) erreicht werden, indem man bei Verwendung eines pH-G-radienten von 7 pH-Einheiten, drei immer kleiner werdende Einheiten mit je 10 Kammern d.h. insgesamt 30 Kammern, gebraucht. Ein Kernelement der erfindungsgemässen Methode ist die Verwendung von einer Reihe immer kleiner werdenden Vorrichtungen ohne wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Lösung.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform besitzt jede Reihe von Vorrichtungen die gleiche Anzahl an Kammern und entspricht das Verhältnis des Volumens jeder Einheit zu dem Volumen der folgenden kleineren Einheit der Anzahl Kammern in jeder Einheit,

In einer beispielhaften Ausführungsform können drei Einheiten mit je 10 Kammern und Volumen von je 2100 ml, 23.5 ml und 25 ml verwendet werden. Die rohe Ampholyt-Mischimg

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wird" in eine 2100 ml-Vorrichtung mit· einem Träger-AmphoIyt, welcher einen künstlichen pH-Gradienten von pH 3 "bis pH 10 (7 pH-Einheiten) erzeugt,eingesetzt und der' isoelektrischen Fokussierung unterworfen. Die Kammer (210 ml),welche die gewünschte Substanz enthält,wird bestimmt und ihr Inhalt in die nächste kleinere Vorrichtung (215 ml) überführt.

Um eine quantitative Ueberführung zu erreichen, wird nur eine minimale Verdünnung benötigt. Der pH-Gradient in dieser Vorrichtung beträgt ungefähr 0,7 pH-Einheiten» Die isoelektrische Fokussierung wird wiederholt und die Kammer (ungefähr 22 ml), welche die gewünschte Substanz (pH-Gradient ungefähr 0,07 pH-Einheiten) enthält, wird bestimmt, !fach Ueberführung in die nächste kleinere Vorrichtung (25 ml) wird die Fokussierung wiederholt. Fach der Fokussierung wird die Kammer (ungefähr 2,5 ml), welche die gewünschte Substanz enthält,bestimmt,und diese Substanz, welche nun in einem pH-Gradient von ungefähr 0,0.1 pH-Einheiten enthalten ist, auf konventionelle Art isoliert.

Da gemäss vorliegender Erfindung Vorrichtungen verwendet werden, die eine grössere Leistungsaufnahme ermöglichen, kann die isoelektrisehe .Fokussierung in jedem Schritt in einer relativ kurzen Zeit durchgeführt werden. Ferner kann bei Verwendung von insgesamt 30 Kammern, das gleiche Ergebnis erreicht werden, wie dasjenige, welches bisher nur bei Verwendung einer Vorrichtung mit wenigstens 1000 Kammern theoretisch" möglich war.

Es können auch grössere Vorrichtungen mit Volumen von ungefähr 20 1 verwendet werden, um eine grobe Trennung von grossen Mengen an Substanzen zu erreichen. Diese Substanzen werden dann in immer kleiner werdenden Einheiten - wie bereits beschrieben - gereinigt.

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Ferner zeigt das erfindungsgemässe Verfahren einen weiteren wesentlichen Vorteil gegenüber einem Verfahren in welchem der Inhalt einer Kammer nach isoelektrischen. Fokussierung" verdünnt und in einer gleichgrossen Vorrichtung nochmals fokussiert wird. Die Verdünnung der Ampholyt-Lösung ergibt nämlich eine Reduzierung der 3?uff erungskapazität der Träger—Ampholyte und das Auflösungsvermögen ist in der Folge kleiner.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur verbesserten iso elektrischen Fokussierung mit hoher Leistungsaufnahme "bei ungefähr gleichbleibender Temperatur der Ampholyt—Lösung wird in einer neuen Reihe von Vorrichtungen zur iso elektrischen Fokussierung durchgeführt. Ein Kernelement dieser Vorrichtungen ist ein verbessertes Kühlsystem, das eine leistungsfähige Abkühlung der durch die grosse Leistungsaufnahme erzeugten Hitze bewirkt. ' ■

Diese leistungsfähige Kühlung wird durch, eine sorgfältige Auswahl der Materialien, eine sorgfältige Verteilung der Kühlelemente, die Auswahl einer zum Erreichen einer Stabilität unter hohen Spannungen geeigneten Struktur, eine einfache und billige Konstruktion und eingebaute Sicherheitselemente erreicht.'

Die - .-,.-.- ..-_} Elektrophorese-Vorrichtungen, zur

können
isoelektrischen Fokussierung/enthalten einen rechteckigen, kastenförmigen Behälter (1) zur Aufnahme- der zu trennenden Aapholyt-Lösung, wobei

dieser Behälter einen Boden (2), swei sich gegenüberstehende "·■ Stirnwände (3) und (4) und zwei sich gegenüberstehende"... Vorder- und Hinter wände' (5) und (6) besitzt;

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— IX —

• " zwei Elektroden (7) und (8), -welche mit einer G-leicb.-stromquelle in Verbindung stehen, in der Iahe der sich gegenüberstehenden Stirnwände in diesen Behälter hineinragen;

der Behälter mit einer Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) versehen ist, welche parallel zu den Stirnwänden laufen;

die Wände (9) sich TdIs zum Boden des Behälters erstrecken während die Wände (10) sich bis in die Fähe des Bodens des Behälters erstrecken, wodurch erreicht wird, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich in Verbindung stehenden II—förmigen Kammern unterteilt ist.

Bei diesen Vorrichtungen kann des weiteren vorgesehen sein:

a) um eine minimale absolute Dicke des Wasserfilms in den Schenkeln der U-förmigen Kammern zu erreichen, wird die Distanz zwischen den Wänden der U-förmigen. Kammern so gewählt, dass sie zwischen 1 mm und 3 em liegt. Für Vorrichtungen mit einem Volumen bis zu. 200 ml liegt sie bei ungefähr 1 mm, für Vorrichtungen mit einem Volumen bis zu 2000 ml bei ungefähr 1,5 mni und für Vorrichtungen mit einem Volumen bis zu 20 1 bei ungefähr 3

b) das Verhältnis der Länge von jedem Schenkel einer U-förmigen Kammer zur Distanz zwischen den nebeneinander liegenden Wänden dieser Kammer liegt über 50 zu 1 und vorzugsweise über 100 zu 1; dieses Verhältnis kann sogar noch erhöht werden, wenn die Distanz zwischen den Wänden die unter (a) angegebenen Werte überschreitet:

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c) · das Verhältnis der länge von jedem Schenkel einer

U-förmigen Kammer zur absoluten länge der gesamten Strombahn zwischen den Elektroden liegt unterhalb 1 zu 15;

d) ■ durch Verwendung einer Elektrode in Form einer Metallfolie oder'eines Drahtgitters mit einer zehnfach grösseren Fläche als die Fläche, welche durch die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden und die Breite oder Tiefe der Kammer definiert ist,wird ein elektrisches Feld erzeugt, welches über die ganze Länge der Elektrode symetrisch angeordnet ist;

e) die undurchlässige^ Wände, stehen mit einer Kühlungseinrichtung in Verbindung, damit die Ampholyt-Lösung in der Nähe dieser undurchlässigen Wände einer sehr leistungsfähigen Kühlung unterworfen wird;

f) die gesamte Fläche des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommt ist gegen Starkstrom isoliert;

g) alle inneren Anschlussstellen des Behälters, welche bei ■ Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen, sind durch Verwendung "von wasser- und starkstromresistenten Dichtungen lecksicher abgedichtet.

Eine der grössten Schwierigkeiten, welche bei der isoelektrischen Fokussierung - hauptsächlich wenn hohe Spannungen verwendet werden - auftauchen, ensteht durch das ' Auftreten einer elektro-osmotischen Strömung. Diese starke Wasserströmung von einer Elektrode zur anderen, verdrängt die getrennten Ampholyten von ihren richtigen isoelektrischen Punkten. Wenn der 'Ampliolyt eine relativ geringe I-aöungsdichte besitzt,kann die Verlagerung bis zur Stelle, an welcher die Ladung des Ampholyts eine .elektrostatische Kraft ergibt, welche die Kraft der osmotischen Strömung ausgleicht, ziemlich gross sein.

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Weiter erfolgt die osmotische Strömung hauptsächlich im · Zentrum des Kanals und nimmt in Richtung der Wänden sehr stark ab. Dies hat zur Folge, dass der !Konzentrationsgradient eine kugelförmige Form "besitzt und sich nicht - wie für eine ' maximale Auflösung erwünscht - senkrecht zur -Längsachse erstreckt. Die oben erwähnten Faktoren reduzieren ganz offensichtlich die Fähigkeit der bekannten Vorrichtungen · zur iso-elektrischen Fokussierung, effektiv für analytische oder präparative Zwecke verwendet zu werden.

Es wurde nun gefunden, dass die Effekte der elektroosmqtischen Strömung auf ein Minimum reduziert und iso— elektrische Fokussierungsvorrichtungen gebaut werden können, welche in Bezug auf Zeit, Leistung, Auflösung und G-enauigkeit in der Fähe des theoretisch Möglichen arbeiten. Eine derartige Reduzierung der Effekte der elektro-osmotisclien Strömung wird erreicht, indem man bei der Konstruktion der "vorrichtungen mehreren kritischen dimensionalen Parametern Rechnung trägt.

Die erste kritische Bedingung- -

. ~~- -. .'' " - ■' z. -' is-tjdass der Wasserfilm

in den Schenkeln der F-förmlgen Kammern eine minimale Dicke aufweist. Dies wird erreicht indem eine geeignete kritische Distanz, zwischen d.en Wänden ausgewählt wird. Diese Distanz ist von ungefähr 1 mm für eine Vorrichtung mit einem Volumen bis zu 200 ml, von: ungefähr 1,5 mm für eine Vorrichtung mit einem Volumen bis zu 2000 ml und von ungefähr 5 mm für eine Vorrichtung mit einem Volumen bis zu 20 1,

Das zweite kritische Mei^-kraal ist das Verhältnis der Länge von einem Schenkel einer ü-f Örmigexi Kammer zur Dicke des Wasssrfiinis. Dieses Verhältnis muss grosser sein a.ls 50 zu und vorzugsweise grosser als 100 zu 1. Wenn die Dicke des Wasserfilms die oben erwähnten Werte überschreitet, muss dieses

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Möglichkeiten diese Einstellung in der Praxis durchzuführen da die länge der Schenkel bei jeder Erhöhung der Dicke des Wasserfilms logarithmisch vergrössert werden muss.

Ein weiterer kritischer dimensionaler Parameter, . welcher zu berücksichtigen ist, ist das Verhältnis der Länge eines Schenkels einer U-förmigen Kammer zur absoluten Länge der gesamten Strombahn zwischen den Elektroden. Dieses Verhältnis muss kleiner sein als 1 zu 15. Auf diese Weise kann der Effekt der elektro-osmotischen Strömung, welche dem Ampholyt Konzentrationsgradient eine Kugelform gibt, vermieden werden. Als Folge wird die Auflösung der Vorrichtung erhöht; weil die Wahrscheinlichkeit, dass ein getrennter Ampholyt sich in mehr als in einer Kammer befindet,kleiner, wird.

Die Gestaltung der Elektrode ist ebenfalls ein. wichtiges Merkmal, insbesondere wenn hohe Spannungen verwendet werden. Um ein elektrisches Feld zu erhalten, welches über die ganze Länge der Elektrode symetrisch angeordnet ist, muss eine Elektrode verwendet werden, deren Fläche mindestens zehnfach grosser ist als die Fläche,welche* durch die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden und die Breite oder Tiefe der Kammer definiert ist, d.h. die Querschnittsfläche des WasBerfilms in einem Schenkel der U-förmigen Kammer. Dies wird vorzugsweise durch eine Elektrode in Form einer Metallfolie oder eines Drahtgitters, beispielsweise durch eine Platinfolie oder ein Platingitter, erreicht.

Wenn alle den oben erwähnten Hormonalen bei der Konstruktion einer iso-elektrischen Vorrichtung Rechnung getragen wird funktion.-d.crt diese Vorrichtung praktisch unter den theoretischen Bedingungen. Die gewünschten Ampholyte werden auf schnelle und leistungsfähige Weise getrennt, sie sammeln sich an oder in der Fähe ihrer isoelektrischen Punkte die Di.f er^nr. T-.vTi&c.h&r, zwei Spitzer},

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welche getrennten Ampholyten entsprechen,ist maximal,und das Verhältnis der Fläche einer Spitze zu ihrer Höhe ist ebenfalls maximal.

Eine weitere Verbesserung der Leistungsfähigkeit der

■.. Vorrichtungen kann erreicht werden, indem

man die Absorption von Kohlenstoffdioxyd während der Trennung verhindert. Zu diesem Zweck kann die gesamte Vorrichtung in einen leck-dichten Behälter eingeschlossen *rerden, damit der .Kontakt mit der Luft· verhindert wird- Vielter kann die Vorrichtung mit einer Kohlenstoffdioxyd freien Luft versehen werden, indem man in diese Vorrichtung einen Luftstrom einbläst, welcher - z.B. nach Durchleiten durch eine Aetzlauge - von Kohlenstoffdioxyd befreit wurde.

Eine Eliminierung der Absorption des Kohlenstoffdioxyd s während de$, Verfahrens zur iso-elektrischen Fokussierung dient dazu,eine Verschiebung des pE-G-radienten zu vermeiden.

Ein weitere. Verbesserung in den - ~ ·■

Vorrichtungen wird durch eine Kühlungseinrichtung, welche mit den undurchlässigen Wänden in Verbindung steht, erbracht. Auf diese Weise wird die Ampholyt-Lösung in der Fähe dieser Wände einer leistungsfähigen Kühlung unterworfen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kühlungseinrichtung das Durchfliessen eines Kühlmediums durch Kanäle, welche in den undurchlässigen Wänden angebracht sind und sich von der Vorderwand bis zur Hinterwand der Vorrichtung erstrecken. ' ._

Eine leistungsfähige Kühlung hängt im wesentlichen von den drei nachstehenden Faktoren ab. Der erste Faktor ist die Bildung einer Turbulenz an der Grenzfläche zwischen dem Kühlmedium und den undurchlässigen Wänden- Der zweite Faktor ist der Wärmedurchgang (Induktion) durch die undurchlässigen Wäride. ■ Der dritte Faktor ist die Konvektion, welche -

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wegen einer nicht vollständig regelmässigen Temperatur _ in der Ampholyt-Lösung entsteht.

Die Turbulenz an der Grenzfläche erfolgt durch den Schereffekt des Eühlmediums an den. inneren ¥ando"b er flächen der undurchlässigen Wand. Dieser Schereffekt wird dadurch "verursacht, dass das Kühlmedium mit grosser Geschwindigkeit einen engen,im Inneren der undurchlässigen Wand sich befindlichen Kanal durchfliesst. Damit die Turbulenz stattfindet, sollte die durchschnittliche Geschwindigkeit des Kühlmediums mindestens 30 cm pro Sekunde betragen und der Durchschnitt des Kanals zwischen 1 mm und 3 mm liegen.

Paktoren,welche die Konduktions- und die Konvektions-Effekte beeinflussen,sind die Dicke der undurchlässigen Wände zwischen dem Kühlmedium und der Ampholyt-Lösung, sowie die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden undurchlässigen Wänden. Damit die gewiinsdaten Effekte stattfinden, sollte die Dicke der undurchlässigen Wand zwischen dem Kühlinedium und der Ampholyt-Lösung nicht grosser als 3 mm sein. Diese Dicke liegt vorzugsweise zwischen 0,8 und 2,5 mm. Die Distanz zwischen den undurchlässigen Wänden wird in Abhängig zur Grosse des Behälters in einer Weise vorbestimmt, welche es ermöglicht,durch Beschaffung einer grossen Kontaktfläche mit der Ampholyt-Lösung maximale Konvektions- und Konduktionseffekte zu erreichen.

Andere Faktoren, weiche einen mehr generellen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit der Kühlung der Ampholyt-Lösung haben, sind die Art des Kühlmediums, die Temperatur des Kühlmediums, die Wärmeleitfähigkeit der undurchlässigen Wände , der Ampholyt-Lösung und des Kühlmediums, die Viskosität des Kühlmediums und der Ampholyt-Lösung usw. In der Regel werdendie Temperatur des Kühlmediums sowie andere Parameter wie z.B. der Durchfluss kontrolliert, damit

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die Wärmeabfuhr in Abhängigkeit der Art und der Stabilität der zu trennenden Ampholyte/ optimiert wird. Die Temperatur kann zwischen -60⁰G und +50⁰C liegen, wobei jedoch für die meisten denaturierbaren Ampholyte eine Temperatur zwischen -10⁰C und +10⁰C bevorzugt wird.

Bs können viele übliche Eühlmedia verwendet werden. Einige dieser Eihlmedia sind Kühlflüssigkeiten wie Wasser oder Mischungen von Wasser mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln ,welche eine Erniedrigung des Gefrierpunktes unter den normalen Gefrierpunkt von Wasser ergeben.Für diesen Zweck geeignete organische lösungsmittel sind Aethylenglycol, Iso-* propanol und dergleichen. Weiter können als Kühlmedia fluorierte Kohlenwasserstoffe oder gekühlte Gase wie Luft usw., verwendet werden.

Das Kühlmedium wird vorzugsweise mittels einer Pumpe durch die Kanäle in den undurchlässigen Wänden gefördert. Diese Pumpe wird so eingestellt, dass die oben erwähnte erwünschte Geschwindigkeit erreicht wird- In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kühlmedium auf geeignete Weiso in eine Kammer oder einen Torratsraum, entweder an der · Yorderwand oder an der Hinterwand in die Vorrichtung eingeleitet, durch eine Anzahl von undurchlässigen Wänden geführt und ansschliessend über einen weiteren Yorratsraum aus der Vorrichtung entfernt. Mit Vorteil wird ein geschlossenes Kühlsystem verwendet, wobei das verbrauchte aus der Vorrichtung.entfernte Kühlmedium durch externe Wärmeaustauscheinrichtungen geführt wird, um die Temperatur des Kühlmediums vor einer neuen Einführung in die isoelektrische Fokussierungsvorrichtung wieder herabzusetzen.

Verschiedene Ausführungsformen und weitere Einzelheiten von im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren Vorrichtungen werden in der folgenden Beschreibung unter Berücksichtigung der beiliegenden 70 9 8 08/0290

Figuren näher erläutert:

Figur 1: zeigt schematisch eine erste Ausfuhrungsform der

. _. ^ - Vorrichtung im Schnittj

Figur 2: ist eine Aufsicht der durch Figur 1 veranschaulichten Vorrichtung entlang der Linie 11-11,WoTDeI die Deckplatte entfernt ist;

Figur 3- zeigt schamatiseh eine zweite Ausführungsfbrm der - ~ " ■ — " - . -\ Vorrichtung im Schnitt.

Die , "".■'■—- ·. isoelektrische Fokussierungsvorrichtung, welche durch die Figuren 1, 2 und 3 veranschaulicht wird, "besteht aus einem im wesentlichen rechteckigen, kastenförmigen Behälter (l) zur Aufnahme der zu trennenden Ampholyt-Mischung. Dieser Behälter besitzt einen Boden (2), zwei sich gegenüberstehende Stirnwände (3) und (4) und zwei sich gegenüberstehende Vorder— und Hinterwände (5) und (6). In der Nähe der sich gegenüberstehenden Stirnwände ragen zwei Elektroden (7) und (8), welche· mit einer Gleichstromquelle in Verbindung stehen,in diesen Behälter hinein. Die Elektroden sind Metallfolien oder Drahtgitter, vorzugsweise aus Platin, deren Fläche mehr als zehnmal grosser ist als die Durchschnittsfläche""des Wasserfilms (x . z). Besonders bevorzugte Elektroden sind an Glasträger befestigte Platinfolien. Die Vorrichtung ist mit einer Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) versehen. Diese undurchlässigeμ Wände laufen parallel zu den Stirnwänden und sind so angeordnet, dass die Wände (9) sich bis zum Boden des Behälters erstrecken, während die Wände· (10) sich nur bis in die Fähe des Bodens erstrecken und vorzugsweise ungefähr 1 bis 10 mm davon entfernt sind. Durch diese Anordnung der undurchlässigen Wände , wird erreicht, dass der Behälter in eine Anzahl von kontinuierlich in Verbindung stehenden U-förmigen Kammern unterteilt ist.

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Die Anzahl von TJ-f örnigen Kammern in einer Vorrichtung kann zwischen 3 und mehr als 100 liegen. Eine Vorrichtung enthält jedoch mit Vorteil ungefähr 10 U-förmige Kammern.

In einer "bevorzugten Ausführungsform sind die undurch-' lässigen Wände im wesentlichen hohl und enthalten einen Kanal zum Durchfluss eines Kühlmediums. In der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche durch die !Figuren 1 und 2 illustriert wird, sind die undurchlässigen Wände im wesentlichen rechteckig gestaltet und enthalten einen rechteckigen Kanal zum Durchfluss eines Kühlmediums» In der Ausführungsform, welche durch die, Figur 3 veranschaulicht wird,bestehen die undurchlässigem Wände (9) aus einer Serie von senkrecht angrenzenden.Röhren zum Durchfluss eines Kühlmed iums. In einer weiteren Ausführungsform "bestehen alle undurchlässigen Wände (9) und (10) aus ö.iesen senkrecht sich berührenden Röhren.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform besitzt die .-..·-- =----.-·- -' 'Vorrichtung zusätzliche Kühlelemente (11), welche über den Wänden (9) angeordnet sind, um bei Gebrauch mit der Oberfläche (12) der Amphoiyt-Lösung in Kontakt zu sein. Auf diese Weise erreicht man eine leistungsfähige Kühlung der Amphölyt-Lösung an ihrer Oberfläche, das heisst an einer .Stelle,an der die anderen .Kühlmittel eine minimale Kühlung ergeben. Die Kühlelemente (.11) bestehen in der Regel aus dem gleichen Material wie die undurchlässigen Wände (9) und (10). Die Form dieser Elemente ist nicht kritisch, obwohl ein ringförmiges Rohr bevorzugt wird.

Die kritischen aimensionaier?Parameter sind in Figur 1 angegeben. So werden die Distanz zwischen zwei nebeneinander liegenden Wänden als Σ, die länge eines Schenkels der ü-förmigen Kammer als Y und die Breite oder Tiefe eines Schenkels der U-fönnigen Kammer als Z bezeichnet.

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Wie durch Figur 2 veranschaulicht, wird ein Kühlmedium über ein Vprratsraum (13) in· die Torrichtung eingeleitet. Dieses Kühlmedium fliesst dann· durch eine · Anzahl von undurchlässigen Wänden (9) und (10) und falls erwünscht, durch die zusätzliche Kühlungselemente (11). Schliesslich verlässt dieses Kühlmedium die Vorrichtung ___ iiber einen Torratsraum (14)· Die Torrichtung enthält . ' weiterhin Elemente (15) und (16), welche mit den Torratsräumen (13). und (14) in Verbindung stehen und zum Ein- und Ableiten des Kühlmediums dienen.. Wie bereits erwähnt können verschiedene flüssige oder gasförmige Kühlmedia verwendet werden. Flüssige fluo- . rierte Kohlenwasserstoffe sind besonders bevorzugt, weil sie den elektrischen Strom nicht leiten- Auf diese Weise wird bei den verwendeten hohen Spannungen die Gefahr eines durch einen zufälligen Bruch oder Leckschaden verursachten Kurzschlusses zwischen der (wässerigen) Ampholyte Lösung und dem Kühlmedium, stark vermindert. ■

Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemässen Torriciitung ist, dass alle Flachen des Behälters,_welche bei Gebrauch mit der. Ampholyt-Lösung in Berührung kommen, gegen Starkstrom isoliert sind. Diese Starkstrom-Isolierung sollte eine dielektrische Widerstandsfähigkeit von mindestens 300 ToIt pro 0,001 cm. besitzen. Da die - . .-..·- · r --.s} Torrichtungen mit Spannungen bis zu 100.000 ToIt arbeiten, besteht selbstverständlich ein eindeutiges Bedürfnis innere Oberflächen zu haben, welche den elektrischen Strom nicht leiten und, Vielehe, ohne einen Kurzschluss zu verursachen, gegen die verwendeten hohen Spannungen isoliert und stabil sind.

Wenn Glas für die Isolierung gebraucht wird, erlaubt dessen Festigkeit und dessen Wi^derstandsfähigkeit neben der Verwendung als Isoliermaterial - die zusätzliche Verwendung dieses Glases als Träger für die Bauteile. Falls

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erwünscht, können geeignete Isoliermaterialien dazu verwendet werden, Materialien die nicht isolierend sind, zu beschichten. So können z.B. feste Materialien, wie Metall, mit Glas überdeckt werden. Um die Herstellung der erfindungsgemässen Vorrichtung zu vereinfachen und billiger zu machen, wird mit Vorteil das gleiche Material, wie z.B. Glas, als Isolier-· und als Trägermaterial verwendet.

Ein weiteres Mer>kmal der . .... _.-*. Vorrichtung ist, dass alle, inneren Anschlussstellen des Behälters, welche bei Gebrauch mit der Ampholyt-Lösung in Berührung kommen ,durch Verwendung von wasser— und starkstromresis.tenten Dichtungen lecksicher abgedichtet sind. Wegen der Gefahren, welche mit der Verxiendung von hohen Spannungen verbunden sind,ist das Bedürfnis für derartige lecksichere Dichtungen eindeutig. Eine Undichtigkeit zwischen der Kammer,welche die Arnpholyt-Lösung enthält,und der wässerigen Euhlungsflüssigkeit würde den Bedienungsmann in grosse Gefahr bringen. Die Dichtungen müssen gegenüber den wässerigen Ampholyt-Lösungen resiotent sein und die Fähigkeit besitzen,die verwendeten hohen Spannungen über, längere Zeit auszuhalten. Bevorzugte Dichtungen sind Dichtungen ,welche auf der""Verwendung von Silikon beruhen.

Der Behälter (l) wird vorzugsweise durch einen nichtleitenden Schutzmantel (17) umgeben und mit einer nicht-leitenden Deckplatte (18) überdeckt. Ein bedeutender Vorteil gegenüber den bekannten Vorrichtungen liegt darin, dass in einer bevorzugten Ausführungsform die Deckplatte abnehmbar ist, was während dem Gebrauch eine Probenahme usw. aus den geöffneten U-förmigen Kammern ermöglicht. Um. die Absorption von Ebhlenstoffdiozyd zu vermeiden und dementsprechend die Vorrichtung gegenüber der Luft zu isolieren, kann die Deckplatte mit Dichtungen versehen werden. Weiter kann ein geeignetes Röhrchen zur Einleitung von Luft ,welche von Kohlenstoff-

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dioxyd befreit wurde, durch die Deckplatte hindurchgehen.

: ... - Die ' Vorrichtungen können verschiedene Grossen besitzen.So kann z.B. deren Volumen (totales Volumen .der Ampholyt-Lösung) zwischen 1 ml und 100 Liter liegen. Wie bereits erwähnt, wird.. zur Reinigung von Ampholyt-Mischungen für präparative Zwecke eine Reihe von Vorrichtungen von immer kleineren Volumen verwendet. '.-.z.

Verwendet man mehrere dieser Vorrichtungen der Reihe nach, können Trennungen von Ampholyt-Mischungen in der Größenordnung eines Grams mit einer bisher noch nicht erreichten großen Geschwindigkeit und hohen Auflösung durchgeführt werden.

Eine Art von Ampholytes welche mit den erfindungsgemassen Methoden - ~~ ~~ -_ - ~r- getrennt werden können, sind Proteine, insbesonders diejenige von therapeutischem Interesse. . ' ; - -

Genauer gesagt eignet sich die vorliegende Erfindung zur Trennung von jedem löslichen AmphoIyt,welcher an seinem iso-elektrischen Punkt ohne irreversibele Denatur-ierung zurück- · gewonnen werden kann. Einige dieser Ampholyte sind Enzyme, Hormone, Zellteilchen, Viren, strukturelle Proteine, Proteine aus dem Blut, der G-ehirnflüssigkeit oder dem Harn usw.

Yfie bereits envähnt,wird in der Methode der isoelektrischen Fokussierung durch Verwendung von synthetischen .Verbindungen, die als Träger-Ampholyte bezeichnet werden,

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ein künstlicher pH-Gradient erzeugt, Diese Träger-Ampholyte "besitzen in der Regel ein niedriges Molekulargewicht. Nach der Fokussierung der Substanzen aus der Probe, werden die gewünschten Substanzen von den !räger-Ampholyten durch Utliche chemische oder physikalische Methoden wie z.B. die Dialyse oder die Chromatographie,getrennt.

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Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden durch die nachstehenden Beispielen veranschaulicht.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Geschwindigkeit, welche unter Vervrendung der „■ . " --_ - t Vorrichtungen bei der Trennung von Ampholyt-Mischungen erreicht wird.

Die verwendete Vorrichtung besitzt ein Volumen von 25 ml und enthält IO U-förmige Kammern. Der Behälter ist ausschliesslich aus Glas gebaut, wobei alle Anschlussstellen mit Klebstoff (Dow Corning Έο. 734) abgedichtet sind. Die Bauart der Vorrichtung entspricht derjenigen,welche durch die Figuren 1 und 2 veranschaulicht wird. Die Distanz zwischen den nebeneinander liegenden Wänden der U-xörmigen Kammern, die Dicke der Glaswände zwischen dem Kühlmedium und der Ampholyt-lösung und der Durchmesser der Kühlungskanäle in den Wänden betragen alle 1 mm. Als Kühlmedium wird ein flüssiger fluorierter Kohlenwasserstoff, welcher bei der Einleitung in die Vorrichtung eine Temperatur von 2⁰C besitzt, verwendet. Die Geschwindigkeit der,KühlfIussigkeit in den Kanälen beträgt ungefähr 60 cm pro Sekunde.

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20 mg Vollblut werden in 25 ml Wasser enthaltend ~1$> Ampholine 1KB (pH 3,5-10) gelöst. Die Fokussierung wird bei einer Spannung von 3000 bis 7000 Volt und einer durchschnittlichen Leistuiigsaufnähme von'75 Watt durchgeführt, lach 1,5 Stunden sind " 90?S des Haemoglobins (bestimmt durch Messung der optischen Dichte) in einer der 10 Kammern der Vorrichtung fokussiert. . ~

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Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die hohe Auflösung, welche bei der Verwendung von immer kleiner werdenden Fokussierungseinrichtungen ohne wesentliche Verdünnung der Ampholyt-Mischung erhalten wird:

200 mg von 100 g überstehender Flüssigkeit eines wässrigen Extraktes der Riechwerkzeuge einer Ratte werden der iso-elektrischen Fokussierung unterworfen. Dieses Material wird dialysiert und in 2 Liter einer 0,8 prozentigen Ampholin TiTTR (pH 3-6) enthaltenden Lösung gelöst. Diese Lösung wird dann in eine Vorrichtung, die mit Ausnahme des Fehlens von zusätzlichen Kühlelementen (U), gleicher Bauart ist, wie die j eilige, welche im Beispiel 1 beschrieben wird, eingesetzt. Diese Vorrichtung besitzt ein Volumen von ungefähr 2 Liter und enthält 10 Kammern. Nachdem ein Gleichgewicht erreicht worden ist, wird der Inhalt der 200 ml U-förmigen Kammer, welche den grössten Teil des Riechwerkzeug-Proteins enthält, nach Verdünnung mit 20 ml destilliertem Wasser, in eine 220 ml Vorrichtung gleicher Bauart eingeleitet. Fachdem in dieser Vorrichtung ein Aeq_uilibrium erreicht worden ist, wird der Inhalt der U-förmigen Kammer, welche den grössten Teil des Riechwerkzeug-Proteins enthält, nach Verdünnung mit 3 ml destilliertem Wasser, in eine 25 ml-Vorrichtung eingeleitet. Nachdem in dieser dritten Vorrichtung ein Aequilibrium erreicht worden ist, wird die Verteilung des gewünschten Proteins durch e.in Immunoverfahren und eine diskontinuierliche G-elelektrophorese bestimmt. Der grösste Anteil (90fo) der Aktivität ist in 5 U-förmigen Kammern dieser Vorrichtung, d.h.. in einem Volumen von 11 ml, vorhanden. Vergleicht man dieses Volumen mit dem ursprünglichen Volumen von 2000 ral, entspricht dies einer 50-fachen Konzentration. Das Riechwerkzeug-Protein hat in den 5 Kammern ungefähr eine G-auß'sche Verteilung mit einer Abweichung von - 0,01-0,015 pH-Einheiten. Wach Entfernen der

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Ampholine durch Dialyse wird das Protein dann in einer DEAE-Kolonne gereinigt.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung in einer mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtung, wobei ein Gleichstrom durch eine Ampholyt-Lösung, bestehend aus einer Probeampholyt-Mischung, einer einen künstlichen pH-Gradient erzeugenden Trägerampholyt-Mischung und Wasser, geleitet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Ampholyt-Mischung, oder gewünschte Teile davon, ohne wesentliche Verdünnung der isoelektrischen Fokussierung in einer Reihe von mehrere Kammern enthaltenden Vorrichtungen immer kleineren Volumens unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß solche Vorrichtungen immer kleineren Volumens verwendet werden, die dieselbe Anzahl Kammern besitzen und wobei das Verhältnis des Volumens jeder Vorrichtung zu dem Volumen der nachfolgenden kleineren Vorrichtung ungefähr der Anzahl der Kammern in einer Vorrichtung entspricht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß solche Vorrichtungen verwendet werden, bei denen jeweils ungefähr 10 Kammern je Vorrichtung vorgesehen sind.

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