DE3003191C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein gelscheibenelektrophoretisches
Verfahren zur Analyse eines Probenbestandteils, der
eine Ionenladung trägt, sowie Vorrichtungen zur Durchführung
eines solchen Verfahrens.
Typischerweise umfassen klinische Immunoassayverfahren
das Vermischen einer verdünnten Probe Blutserums, die eine
Spur eines interessierenden Antigens enthält, mit einem aliquoten
Anteil von Antikörper, der dazu hergestellt worden
ist, damit er in spezifischer Weise und ausschließlich mit
dem in Spuren vorhandenen Antigen reagiert. Der Antikörper
wird normalerweise in mäßigem stöchiometrischen Überschuß
über die maximale Menge an Antigen zugesetzt, die man in
der abnormsten von natürlich vorkommenden Proben erwartet.
Die Umsetzung zwischen diesen beiden Molekülarten ist
bimolekular, und ihre Geschwindigkeit ist dem Produkt ihrer
Konzentrationen proportional. Wenn die Konzentration eines
Antigens nur 10-12 g/ml beträgt, wie es für viele natürlich
vorkommende "Hormone" üblich ist, kann die Zeitdauer bis
zur Vervollständigung der Umsetzung über 24 h betragen.
Dieses führt zu unzweckmäßig langdauernden Bestimmungsverfahren.
Außerdem ist bei derartig niedrigen Konzentrationen
das Vermögen, die Umsetzung nachzuweisen, stark gefährdet.
Für derartige Bestimmungen werden Abwandlungen der
berühmten Isotopenverdünnungstechnik angewandt. In ihrer
einfachsten Form wird eine Probe aus einem mit einem
radioaktiven Isotop markierten Antigen dem Gemisch in
einer Menge zugesetzt, die einen leichten Überschuß über
das stöchiometrische Äquivalent des zugesetzten Antikörpers
darstellt. Das markierte Antigen tritt mit dem unmarkierten
Antigen hinsichtlich des Antikörpers in Wettbewerb und wird
im Verhältnis von markiertem zu unmarkiertem Antigen gebunden.
Nach Beendigung der Umsetzung wird der gebildete
Antigen/Antikörper-Komplex nach einer von einer Vielzahl
von Methoden vom nichtumgesetzten Antigen abgetrennt, und
die Radioaktivität einer der beiden oder beider voneinander
getrennter Fraktionen kann zur Bestimmung der Anfangskonzentration
an Antigen in der Serumprobe verwendet werden.
Es ist klar, daß andere markierte Antigene, beispielsweise
fluoreszenzmarkierte, chemilumineszenzmarkierte,
spinmarkierte usw., in analogen Bestimmungsarten verwendet
werden können. Im allgemeinen hängt die Fähigkeit von alternativen
Verfahren zur Konkurrenz mit den Verfahren, die sich
radioaktiver Markierungen bedienen, hinsichtlich der Empfindlichkeit
von der Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens
für Fluoreszenz, Chemilumineszenz usw. ab. Im Gegensatz zu
den Verhältnissen bei der Radioaktivität ist die Empfindlichkeit
vieler Verfahren zur Bestimmung dieser anderen Markierungen
selbst stark konzentrationsabhängig.
Wenn Verfahren, die sich nicht der Isotopenmethode
bedienen, hinsichtlich der Empfindlichkeit vergleichbar
mit den Radioisotopen-Verdünnungsmethoden sind oder gar
eine größere Empfindlichkeit aufweisen, werden sie häufig
bevorzugt. Das Gesundheitsrisiko, das mit der Exposition
von Laborpersonal gegenüber radioaktiven Substanzen verbunden
ist, fällt bei der Verwendung von nichtradioaktiven
Markierungen natürlich fort. Außerdem besitzen die Reagenzien
mit nichtisotopen Markierungen eine längere Lebensdauer,
weil radioaktive Immunoassayreagenzien typischerweise eine
ganz bestimmte und kurze Halbwertszeit aufweisen. Außerdem
lassen die niedrigeren Kosten von nichtradioaktiven Reagenzien
und die einfacheren und weniger kostspieligen Einrichtungen
zu ihrer Bestimmung nichtradioaktive Markierungen
wünschenswerter erscheinen.
Daher würde ein Immunoassayverfahren unter Verwendung
nichtradioaktiver Markierungen, das sowohl das Antigen als
auch den Antikörper auf das 300fache oder darüber anreichert
und daher die Reaktionsgeschwindigkeit um das 90 000fache
oder darüber erhöht, einen enormen Vorteil gegenüber bereits
bestehenden Verfahren darstellen, die stark zweitaufwendig
sind, wie beispielsweise das Verfahren gemäß "Radioimmunoassay
& Related Techniques Methodology & Clinical Application"
von Thorell & Larson, Verlag C. V. Mosby Co., St.
Louis, 1978, Seiten 144, 186, 198, 200.
Trotz der Tatsache, daß das Vorkonzentrieren als zweckmäßig
erkannt worden ist, gibt es bisher kein zweckmäßiges
Mittel zur Herbeiführung dieses Ergebnisses. Reaktionsteilnehmer
können durch Zentrifugieren vorkonzentriert werden,
jedoch ist diese Technik nicht gänzlich zufriedenstellend.
Erstens müssen die vorkonzentrierten Raktionsteilnehmer
häufig teilweise erneut verdünnt werden, wenn sie der
Zentrifuge zur Umsetzung entnommen werden. Zweitens erfordert
dieses Verfahren normalerweise aufwendige Einrichtungen.
Drittens ist das Verfahren unangemessen zeitaufwendig.
Dies trifft besonders für Reaktionsteilnehmer mit niedrigem
Molekulargewicht, wie beispielsweise kleine Antigene, wie
Angiotensin und Haptene, zu.
Eine bekannte Bestimmungsmethode ist durch die Umsetzung
von immunologischen Reaktionsteilnehmern, Antigen
(oder Hapten) einerseits und Antikörper andererseits, innerhalb
einer lokalisierten Zone eines Gelmediums gekennzeichnet.
Die zu untersuchende Substanz wird elektrophoretisch
durch das Gel in Reaktionskontakt mit dem immobilisierten
Reaktionsteilnehmer wanderngelassen. Nach Einstellung
des Gleichgewichtes werden die nichtumgesetzten oder
ungebundenen Substanzen durch weitere Elektrophorese von
dem immobilisierten Reaktionsteilnehmer weggeführt und
damit abgetrennt. Ein derartiges System ist aus der
US-PS 39 66 897 bekannt. Nicht hervor geht aus dieser
Patentschrift jedoch, wie die Reaktionsteilnehmer innerhalb
des gelförmigen Reaktionsmediums vorkonzentriert
werden können.
Der Einsatz der Elektrophorese zur Auftrennung von
Substanzgemischen ist ferner aus US-PS 38 96 021 bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens
zur Durchführung einer raschen Umsetzung mit anfänglich
verdünnten Reaktionsteilnehmern, wobei immunologische
Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben Mediums vorkonzentriert
und umgesetzt werden und Immunoassays kostengünstig
und rasch durchgeführt werden können.
Weiter ist es Aufgabe der Erfindung, Verfahren und
Vorrichtungen zur Durchführung eines empfindlicheren
Assays anzugeben.
Gegenstand der Erfindung sind das in Anspruch 1 angegebene
Verfahren, das in Anspruch 11 angegebene automatische System
und die in Anspruch 21 angegebene Vorrichtung.
Erfindungsgemäß wird eine Vorkonzentrierung beider
Reaktionsteilnehmer der Umsetzung in demselben Medium erzielt,
in dem die Umsetzung durchgeführt wird. Dies beseitigt
den beim Vorkonzentrieren durch Zentrifugieren auftretenden
Nachteil der erneuten Verdünnung. Außerdem werden
erfindungsgemäß die Reaktionsteilnehmer zu Konzentrationen
angereichert, die um ein Vielfaches größer sind
als die im allgemeinen in bisher bekannten Verfahren, die
auf Immunoassays angewandt worden sind, erreichbaren
Konzentrationen. Bei den bekannten Verfahren wird das
höchste Potential zur Erzielung außergewöhnlich hoher
Reaktionsgeschwindigkeiten niemals voll verwirklicht,
weil die Reaktionsteilnehmer nicht in konzentrierter
Form zusammengebracht werden.
Gemäß dem Verfahren und der Vorrichtung der Erfindung
werden scheibenelektrophoretische Techniken sowohl
zum Konzentrieren als auch zum Inkontaktbringen der immunologischen
Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben
Mediums angewandt. Die Verfahren erlauben eine Bewegung
der Reaktionsteilnehmer durch das Medium in genau gesteuerter
Weise. Die Steuerung der Wanderung der Reaktionsteilnehmer
in dem Medium wird dazu verwendet, sie
vor der Weiterwanderung, die zu ihrem Reaktionskontakt
miteinander führt, anzureichern.
Die scheibenelektrophoretischen (disc-elektrophoretic)
Vorrichtungen gemäß der Erfindung besitzen die folgenden
Vorteile:
- 1. Eine 24stündige Immunreaktion kann auf weniger als 1 s abgekürzt werden
- 2. Umgesetzte und nichtumgesetzte markierte Antigene werden automatisch getrennt.
- 3. Bei Verwendung nichtradioaktiver Markierungen wird eine hohe Empfindlichkeit erzielt.
- 4. Vorrichtung und Handhabung sind einfach.
- 5. Die Kosten sind niedrig.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen
näher erläutert, worin
Fig. 1 einen schematischen Schnitt durch eine
typische Vorrichtung zur Durchführung der scheibenelektrophoretischen
Konzentrierung,
Fig. 2 einen schematischen Schnitt durch eine
Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassays gemäß der
Erfindung,
Fig. 3 ein schematisches Diagramm, in dem die
Porengröße in Abhängigkeit von der Länge eines Gradientengels
aufgetragen ist, das in der Vorrichtung zur Durchführung
eines Immunoassays gemäß der Erfindung verwendet
wird, und
Fig. 4 eine schematische perspektivische Ansicht
eines automatisierten Immunoassay-Bestimmungssystems
gemäß der Erfindung
darstellen.
darstellen.
In Fig. 1 ist eine typische scheibenelektrophoretische
Vorrichtung in Form eines schematischen Schnittes dargestellt.
Bei einem typischen Scheiben-Elektrophoreseverfahren,
wie es aus der US-PS 33 84 564 bekannt ist, wird ein Polyacrylamidgel
1 mit großen Poren in einem Glasrohr 2 hergestellt.
Das Gel 1 dient als Medium zur Verhinderung der
Konvektion, behindert jedoch ansonsten die Bewegung von
Ionen in einem angelegten elektrischen Feld nur unbedeutend.
Das Gel wird mit einer beträchtlichen Konzentration (beispielsweise
0,06 M) an einem Salz einer schwachen Base, wie
beispielsweise von Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) mit
Salzsäure mit einem pH-Wert in der Nähe von 6,7 hergestellt
und bildet einen TRIS/HCl-Puffer, bei dem die Ionenarten
TRIS⁺ und Cl- sind. Das Rohr 2 ist derart angeordnet, daß
sein oberes Ende 3 in den oberen Puffer 5 des Behälters 4
reicht und sein unteres Ende 6 in den unteren Puffer 7 des
Behälters 8 eintaucht. Oberer und unterer Behälter 4 bzw. 8
enthalten Puffer 5 bzw. 7 aus einer typischen Lösung von
TRIS und Glycin in einer Konzentration in der Größenordnung
von 0,5 M. Der obere Behälter 4 enthält eine Kathode 9 und
der untere Behälter 8 eine Anode 10, die über Stellung A
eines Schalters 11 mit der Kathode (-) bzw. Anode (+) einer
Spannungsquelle 12 verbunden sind, die in der Lage ist, bei
etwa 200 V Potential zwischen den Elektroden 9 und 10 einige
Milliampere zu liefern.
Wenn ein Gemisch aus serumhaltigem Antigen (Ag), Antikörper
(Ab) und markiertem Antigen (Ag*) mit einer 40%igen
wäßrigen Lösung von Saccharose vermischt wird, um eine
Lösung mit einer Dichte zu erzielen, die beträchtlich größer
ist als diejenige des Puffers 5, kann das Gemisch sehr einfach
unter die Pufferlösung 5 auf die Oberfläche des Gels 1
pipettiert werden.
Wenn der Schalter 11 ist die Stellung A geschlossen
wird, wird ein elektrisches Feld längs der Länge von Gel 1
angelegt. Jegliche Probenmoleküle, die eine insgesamt
negative Ladung tragen, wozu normalerweise die meisten
Serumproteine und Antigene gehören, beginnen nun durch
Gel 1 in dem Rohr 2 nach unten in Richtung auf den anodischen
Behälter 8 zu wandern.
Wie aus der US-PS 33 84 564 und Ornstein, L., Ann.
N. Y. Acad. Sci. 121, Seiten 321-349, (1964) bekannt ist,
reichern sich diese negativ geladenen Spezies in einer
Reihe von nichtdargestellten, benachbarten, scheibenförmigen
Zonen an. Die Spezies mit der höchsten Beweglichkeit
nach der des Chlorions Cl- befindet sich in der vordersten
Zone unmittelbar hinter dem Cl-. Sämtliche andere Anionen
befinden sich in nachfolgenden Zonen in abnehmender Ordnung
ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit, wobei die letzte
Zone von dem langsamsten Anion belegt wird, das eine Mobilität
besitzt, die derjenigen des Glycinations bei etwa
pH 8,9 am nächsten kommt. Die letzte Zone wird von dem
Glycination eingenommen. Das Anion in jeder Zone konzentriert
sich so lange, bis die Zunahme der Leitfähigkeit
dieser Zone einen lokalen Abfall im Potentialgradienten
erzeugt, der ausreicht, um die Geschwindigkeit des Anions
auf diejenige zu vermindern, die genau gleich der des Cl--Ions
in Gel 1 vor der ersten Zone ist. Bei konstantem Strom
von der Spannungsquelle 12 wandert der Stapel von Zonen
danach mit konstanter Geschwindigkeit in intakter Form,
wobei die Dicke jeder Zone konstant bleibt und direkt proportional
der Konzentration der Komponenten in der Ausgangsprobe
ist. Diese Erscheinung wird Stapelbildung beim
Fließgleichgewicht (steady-state-stacking) genannt. Die
Endkonzentration in jeder Zone ist von der Ausgangskonzentration
unabhängig; sie hängt lediglich von der Konzentration
an Chlor--Ionen in Gel 1 ab, die durch die Ausgangsbedingungen
festgelegt wird. Das bedeutet, daß Serumbestandteile,
die anfangs in Konzentrationen von etwa
6 × 10-6 M vorhanden sind, um etwa das 10 000fache angereichert
werden (0,06/6 × 10-6). Diejenigen Bestandteile,
die anfangs in Konzentrationen von 2 × 10-4 M vorhanden
sind, werden um etwa das 300fache angereichert usw,
(Siehe Ornstein, L., Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, Seiten
321-349 (1964)).
Das Verfahren der Stabelbildung beim Fließgleichgewicht
trennt jedoch, während es anreichert, so daß die
typische Vorrichtung gemäß Fig. 1 in unmodifizierter Form
die Antigene (Ag und Ag*) und Antikörper (Ab) nicht zu
einer Umsetzung zusammenbringt.
Die im folgenden im einzelnen beschriebene Erfindung
wird gemäß den oben und in der genannten Literatur erwähnten
Lehren durchgeführt.
Gemäß Fig. 2 besitzt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ein Gel oder eine Membran13,
quer über dem Boden 6 von Gel 1 des Rohres 2. Die Membran 13
besitzt Poren, die groß genug sind, daß sie den Durchtritt
von Ionen, wie beispielsweise Cl-, TRIS⁺ und Antigenen
(Ag), zu gestatten, jedoch gegenüber größeren Ionen, wie
Antikörpern (Ab), undurchlässig sind.
Bei der Durchführung des Assays wird der Antikörper
(Ab) bei Stellung A des Schalters in herkömmlicher elektrophoretischer
Weise unter Verwendung eines TRIS/HCl-Puffers
im Gel 1 zunächst in das Gel 1 eingebracht. Der TRIS/HCl-Puffer
wird außerdem in beiden Behältern 4 und 8 verwendet.
Die Wanderung des Antikörpers (Ab) in Gel 1 führt zu einem
engen, konzentrierten, unbeweglichen Band aus Antikörpern
(Ab) in einer Schicht 14 unmittelbar oberhalb der Membran
13. Danach wird der Schalter 11 in Aus-Stellung umgelegt.
Nunmehr wird der Puffer 5 im Behälter 4 durch TRIS/Glycin
ersetzt und die Serumprobe und markiertes Antigen
(Ag*) mit Saccharose vermischt und auf die Oberfläche 3
von Gel 1 geschichtet. Der Schalter 11 wird erneut in
Stellung A gebracht. Das Probenantigen (Ag) und markiertes
Antigen (Ag*) sowie andere Anionen bilden einen Stapel und
wandern innerhalb des Gels 1, wie oben für Fig. 1 angegeben.
Wenn die konzentrierte Antigenschicht (Ag + Ag*) in
die immobile Antikörperschicht 14 gelangt, erfolgt die
Immunoreaktion. Überschüssiges, nichtumgesetztes Antigen
(Ag + Ag*) tritt durch diese Schicht 14 hindurch in die
Pufferflüssigkeit 7. Die Menge an markiertem Antigen (Ag*)
in Schicht 14 und bzw. oder in der Pufferlösung 7 wird gemessen,
um den Antigengehalt (Ag) der Probe zu bestimmen.
Alternativ kann ein Gel im Rohr 2 gemäß Fig. 1 mit
einem Gradientengel von in Wanderungsrichtung abnehmender
Porengröße hergestellt werden, wie in der Darstellung gemäß
Fig. 3 gezeigt ist.
In dieses Gradientengel gemäß Fig. 3 wird Antikörper
(Ab) in üblicher Weise mit TRIS/HCl-Puffer in Gel 1 eingebracht.
TRIS/HCl-Puffer wird auch in beiden Behältern 4
und 8 verwendet. Dies führt zu einem konzentrierten, immobilen
Band am - nicht dargestellten - Ort, an dem die Porengröße
im Gradientengel dem Durchmesser des Antikörpermoleküls
äquivalent ist (Margulis, J. und Kenrick, K. G.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, Seiten 68 (1976)).
Schalter 11 wird ausgeschaltet. Der obere Puffer 5 wird
nunmehr durch TRIS/Glycin ersetzt.
Das Serumprobenantigen (Ag) und das markierte Antigen
(Ag*) werden mit Saccharose vermischt und nun, wie
oben für Fig. 1 beschrieben, auf die Oberfläche 3 des
Gels 1 geschichtet. Schalter 11 wird in Stellung A eingeschaltet,
und die Probenionen einschließlich der Antigene
(Ag + Ag*) wandern und bilden einen Stapel in dem Gel, wie
oben beschrieben. Wenn die konzentrierte Antigenschicht
in die immobile Antikörperschicht gelangt, erfolgt die
Immunreaktion, und überschüssiges, nichtkombiniertes Antigen
läuft weiter durch die Reaktionsschicht hindurch und
weiter abwärts im Gel. Die Menge an Markierung in der immobilen
oder freien Antigenschicht (nicht dargestellt) oder
in beiden Schichten wird anschließend gemessen.
3) In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung wird die langsamer wandernde Immunspezies
(typischerweise der Antikörper), wie oben im Hinblick auf
das Verfahren gemäß Fig. 1 erwähnt, konzentriert. Der konzentrierte
Antikörper wird teilweise das Gel 1 hinunter
wandern gelassen.
Die Antigene (Ag + Ag*) werden mit einer Saccharoselösung
und mit einer Konzentration an TRIS/HCl von etwa
0,06 M vermischt und auf die Oberfläche 3 von Gel 1 geschichtet.
Schalter 11 wird nun in Stellung A gebracht.
Die Antigene bilden einen Stapel in konzentrierter Form
hinter dem Cl--Ion und überholen die langsamer wandernden
Antikörper.
Eine Immunreaktion findet statt. Die überschüssigen
Antigene bewegen sich an der Umsetzungszone vorbei. Die
Umsetzung wird in den umgesetzten und bzw. oder nichtumgesetzten
Schichten gemessen.
4) Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung wird das System gemäß Fig. 1 derart angeordnet,
daß die Pufferzusammensetzungen in dem oberen und
unteren Behälter 5 bzw. 7 anfänglich unterschiedlich sind.
Beispielsweise enthält der obere Behälter 5 ein langsames
Anion, wie Gylcinat, wie oben beschrieben. Das untere Gefäß
7 enthält nunmehr ein langsames Kation, wie Glucamin
(glucamine). Das Gel 1 enthält das Salz aus einem schnellen
Kation und einem schnellen Anion, wie Ammoniumacetat. Der
pH-Wert der Gellösung wird so eingestellt, wie aus Ornstein,
L., Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, Seite 341 (1964) zu ersehen,
das während des Ansatzes eine immunreaktive Spezies, wie
beispielsweise der Antikörper (Ab) kationisch und die andere
Immunspezies anionisch ist.
Die anionische Spezies, beispielsweise das Probenantigen
(Ag) und das markierte Antigen (Ag*), werden in einer
Saccharoselösung, wie oben erwähnt, aufgebracht und bilden
einen Stapel und reichern sich an, wie oben beschrieben.
Nachdem der Stapel gebildet worden ist, wird der
Schalter 11 ausgeschaltet. Der obere und untere Behälter 4
bzw. 8 werden in - nicht dargestellte - getrennte Gefäße
entleert. Das Gelrohr 2 wird aus dem oberen Behälter 4 entfernt,
umgekehrt und in dieser umgekehrten Stellung in das
Gefäß 8 erneut eingesetzt. Der Puffer 7, der vorher im unteren
Behälter 8 enthalten war, wird nunmehr in den oberen
Behälter 4 gegossen und der Puffer 5 aus dem oberen Behälter
4 in den unteren Behälter 8.
Die kationische Spezies, beispielsweise der Antikörper,
wird in einer Saccharoselösung auf den Oberteil 3 (vorher
Boden 6) des Gels 1 aufgebracht. Der Schalter 11 wird nun
in Stellung B gebracht, und die kationische Spezies bildet
zwischen dem vorauseilenden NH₄⁺-Ion und dem nachfolgenden
Glucamin-Kation in einer hochkonzentrierten Schicht einen
Stapel, der nunmehr nach unten wandert. Die zuvor zu einem
Stapel angeordneten anionischen Antigene (Ag + Ag*) wandern
weiter (aber nun aufwärts). Mit der Zeit treffen sich die
beiden entgegengesetzt wandernden konzentrierten Schichten
aus immunreaktiven Spezies (nicht dargestellt) und reagieren
miteinander. Die Messung wird ausgeführt, wie oben beschrieben.
In Fig. 4 ist ein automatisiertes System zur Durchführung
eines Immunoassays gemäß der Erfindung und insbesondere
gemäß der zuletzterwähnten Methode erläutert.
Ein Gelmaterial 31, das sich zur Unterhaltung einer
immunologischen Reaktion eignet und die Wanderung und Anreicherung
der immunologischen Spezies vor der Umsetzung
gestattet, wird von einem biegsamen Stützband oder Stützgewebe
33 aus Kunststoff gehaltert. Das Gelmaterial 31
wird auf dem Band oder Gewebe 33 gebildet, das von einer
nichtdargestellten Vorratsrolle abgewickelt und anschließend
wieder aus eine nichtdargestellte Aufnahmerolle aufgewickelt
wird.
Das Gel 31 ist in diskreten Abschnitten 32 angeordnet,
von denen jeder für die Durchführung einer einzigen Umsetzung
bestimmt ist. Jeder Abschnitt 32 wird an einer Reihe
von Bearbeitungsstationen vorbeigeführt, die durch die
Pfeile 50, 60, 70 und 80 angedeutet sind und später näher
erläutert werden. Jeder Abschnitt 32 umfaßt ein Paar Vertiefungen
34 bzw. 35. Die Vertiefung 34 erhält Antigene 36
(Ag + Ag*) aus einer über dem Band angeordneten Abgabeeinrichtung
37, während die Vertiefung 35 Antikörper 38 (Ab)
aus einer Ausgabevorrichtung 39 erhält. Beide Ausgabeeinrichtungen
bilden die Ausgabestation 50.
Nachdem ein bestimmter Abschnitt 32 die immunologischen
Reaktionsteilnehmer 36 und 38 aufgenommen hat, wird er zu
einer Station 60 zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer
über das Band 30 geführt. Die immunologischen Reaktionsteilnehmer,
die in die Vertiefungen 34 bzw. 35 eingebracht
worden sind, wandern unter dem Einfluß des elektrischen Feldes
unter der oberen Oberfläche 40 des Gels 31. Das Gel 31
ist durch die aufnehmenden Vertiefungen 34 und 35 so eingerichtet,
daß es die Wanderung der Reaktionsteilnehmer unter
seiner oberen Oberfläche 40 unterstützt, um Oberflächeneffekte
und ein Überlaufen ("spill over") zu eliminieren.
Die Station 60 umfaßt zwei Behälter 41 und 42, die
Pufferlösungen 43 bzw. 44 aus Glycinat (langsames Anion)
und Glucamin (langsames Kation) enthalten, wie oben erwähnt.
Die Ionen der Puffer 43 und 44 werden über die entsprechenden
Benetzungsdochte 45 und 46, die in Flüssigkeitskontakt
mit den entsprechenden Seiten 47 und 48 von Gel 31
stehen, dem Gel 31 angeboten.
Die Wanderung der Ionen wird durch entsprechende Elektroden
51 und 52, die in den Lösungen 43 bzw. 44 angeordnet
sind, bewirkt. Die Spannungsquelle 53 liefert den Elektroden
51 und 52 Strom.
Wie oben erwähnt, enthält das Gel 31 das Salz eines
schnellen Kations und eines schnellen Anions, wie beispielsweise
Ammoniumacetat von einem geeigneten pH-Wert.
Wenn ein Abschnitt 32 von Gel 31 der Station 60 zugeteilt
wird, beginnen die Antigene 36 und Antikörper 38 quer
über das Gel 31 aufeinander zuzuwandern, wie durch die
Pfeile 55 angedeutet. Die immunologischen Reaktionsteilnehmer
36 und 38 reichern sich an und treffen sich anschließend
und reagieren miteinander in einem mittleren Abschnitt 56
von Gel 31. Der Strom von der Spannungsquelle 53 kann während
der Umsetzung zwischen den immunologischen Spezies abgeschaltet
oder verringert werden.
Danach wird der Abschnitt 32 einer zweiten Station 70
zugeführt, die Bestandteile aufweist, die mit denen der
Station 60 gleichartig sind, und bei der ein weiteres elektrisches
Feld quer über das Gel 31 angelegt wird, um umgesetzte
und nichtumgesetzte Bestandteile zu trennen, wie
dargestellt.
Der Abschnitt 32 wird nunmehr an einer Abtastdetektorstation
80 vorbeigeführt, die das markierte Antigen (Ag*)
in dem gebundenen Anteil 66 und bzw. oder dem nichtgebundenen
Anteil 61 mißt, um die Menge an Porbenantigen (Ag) zu
bestimmen.
Diese automatische Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung benötigt keine Umkehrung des Gels 31, wie
oben beschrieben, weil durch die Anordnung des Gels 31 in
einer flachen, horizontalen Lage Gravitationswirkungen eliminiert
worden sind.
Dem geübten Fachmann wird klar, daß ein Teil, wenn
nicht die Gesamtheit der Stationen 50, 60, 70 und 80 miteinander
kombiniert werden kann. Jedoch gestattet das erläuterte
System mit getrennten Stationen einen größeren Durchsatz, da
mehrere Vorgänge zur gleichen Zeit ablaufen können. Auch
können die Reagenzien Ag* und Ab in ein trockenes Gel eingebracht
sein, das kurz vor seiner Verwendung rehydratisiert
wird.
Sämtliche Ausführungsformen der vorliegende Erfindung
führen zu einer Anreicherung eines oder mehrerer der Bestandteile
einer Umsetzung während der elektrophoretischen
Wanderung durch ein Medium mit beschränkter oder fehlender
Konvektion. Die angereicherten Bestandteile werden in reaktiven
Kontakt innerhalb desselben Mediums gebracht, das für
ihre Anreicherung verwendet wird, wodurch die Notwendigkeit
der erneuten Verdünnung und der Überführung eliminiert wird.
Sämtliche Umsetzungen werden ferner innerhalb desselben Mediums
messend verfolgt bzw. überwacht, was ebenfalls sehr
zweckmäßig ist.
In sämtlichen Umsetzungen, auf die sich die Erfindung
bezieht, sind die Bestandteile und immunologischen Spezies
entweder natürliche Ionen oder können durch geeignete chemische
Behandlung ionisch gemacht werden, wie beispielsweise
durch Bindung an ein Zentralion (liganding) oder Derivatbildung
sowie Auswahl des pH-Wertes der Lösung.
Die Umsetzungen können innerhalb des Gelmaterials
durch viele übliche Verfahren, beispielsweise fluorometrisch,
fotometrisch, kolorimetrisch oder sogar isotopisch
usw., messend verfolgt werden.
Medien mit fehlender Konvektion, wie Gele, sind in
den Vorrichtungen zur Steuerung der Wanderung von Materialien
bevorzugt. Gele, die in den Vorrichtungen gemäß
der Erfindung verwendet werden können, können aus üblichen
Materialien ausgewählt werden, wie beispielsweise Sephadex®,
Agarose, Polyacrylamid usw. Die Wanderung in Form eines
Fließgleichgewichtsstapels wird durch die Kohlrausch'sche
Steuerungsfunktion genau gesteuert, um die sehr hohen Konzentrierungen
zu erzielen, die erwünscht sind. Vorzugsweise
sind diese Gele außerdem durchscheinend oder durchsichtig,
so daß die Umsetzung innerhalb des Gels auch optisch überwacht
werden kann.
Claims (28)
1. Scheibenelektrophoretisches Verfahren zur Analyse eines
Probenbestandteils, der eine ionische Ladung trägt, durch
Messen des Ergebnisses einer zwischen dem Probenbestandteil
und einem Reaktionsteilnehmer innerhalb eines porösen Mediums
erfolgenden Umsetzung,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- (a) den Probenbestandteil in das poröse Medium einbringt,
- (b) ein elektrisches Feld quer über das Medium anlegt, um den Bestandteil innerhalb des Mediums wandern und sich in einem ersten Teil davon durch Stapelbildung beim Fließgleichgewicht anreichern zu lassen,
- (c) den angereicherten aufgestapelten Bestandteil weiter durch einen zweiten Teil des Mediums, der den Reaktionsteilnehmer enthält, wandern läßt, um eine Umsetzung damit zu verursachen, und
- (d) die Umsetzung mißt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem
- (e) nichtumgesetzte Anteile des Bestandteils von umgesetzten Anteilen des Bestandteils abtrennt, indem man das elektrische Feld nach der Umsetzung des Bestandteils quer über das Medium anlegt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem
- (f) den Probenbestandteil durch Messung entweder des umgesetzten oder des nichtumgesetzten Anteils des Bestandteils in dem Medium bestimmt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Probe verwendet, die außerdem ein markiertes
Äquivalent des Probenbestandteils enthält, und man in Stufe
(c) den Bestandteil und sein markiertes Äquivalent mit dem
Reaktionsteilnehmer nach dem Prinzip der kompetitiven Bindung
umsetzt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem
- (e) den Reaktionsteilnehmer in das Medium einführt und
- (f) den Reaktionsteilnehmer sich vor seiner Umsetzung mit dem Bestandteil durch Stapelbildung beim Fließgleichgewicht anreichern läßt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man den Reaktionsteilnehmer und den Bestandteil gleichzeitig
durch Stapelbildung beim Fließgleichgewicht anreichert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem den Reaktionsteilnehmer vor Durchführung
der Stufe (b) über das gesamte poröse Medium dispergiert,
wobei der Reaktionsteilnehmer eine andere Mobilität als der
Bestandteil besitzt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem den Probenbestandteil vor seiner Umsetzung
mit dem Reaktionsteilnehmer markiert.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man außerdem die Wanderung des Bestandteils durch den
zweiten Teil des Mediums begrenzt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man in Stufe (f) den Bestandteil und den Reaktionsteilnehmer
innerhalb des Mediums in entgegengesetzter Richtung
der Stapelbildung unterwirft und wandern läßt.
11. Automatisches scheibenelektrophoretisches System zum
Analysieren einer Probe hinsichtlich eines Bestandteils,
der eine Ionenladung trägt, bestehend aus
einem porösen Medium (31), das in einem kontinuierlichen Band (33) zur Aufnahme des Probenbestandteils (36) angeordnet ist,
Mitteln zum Vorwärtsbewegen des Bandes längs eines Beschickungsweges,
einem ersten Mittel (50, 37) längs des Beschickungsweges zum Aufbringen des Probenbestandteils (36) auf das poröse Medium,
einem zweiten Mittel (41, 42, 51, 52, 43, 44) längs des Beschickungsweges zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das poröse Medium, um den Probenbestandteil (36) innerhalb eines ersten Abschnittes des porösen Mediums wandern und sich anreichern zu lassen und ihn anschließend in konzentrierter Form bis zu einem reaktiven Kontakt mit einem Reaktionsteilnehmer (38), der in einem zweiten Abschnitt des porösen Mediums angeordnet ist, relativ wandern zu lassen, und
einem dritten Mittel (80) längs des Beschickungsweges zum Messen der Umsetzung zwischen dem Bestandteil und dem Reaktionsteilnehmer.
einem porösen Medium (31), das in einem kontinuierlichen Band (33) zur Aufnahme des Probenbestandteils (36) angeordnet ist,
Mitteln zum Vorwärtsbewegen des Bandes längs eines Beschickungsweges,
einem ersten Mittel (50, 37) längs des Beschickungsweges zum Aufbringen des Probenbestandteils (36) auf das poröse Medium,
einem zweiten Mittel (41, 42, 51, 52, 43, 44) längs des Beschickungsweges zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das poröse Medium, um den Probenbestandteil (36) innerhalb eines ersten Abschnittes des porösen Mediums wandern und sich anreichern zu lassen und ihn anschließend in konzentrierter Form bis zu einem reaktiven Kontakt mit einem Reaktionsteilnehmer (38), der in einem zweiten Abschnitt des porösen Mediums angeordnet ist, relativ wandern zu lassen, und
einem dritten Mittel (80) längs des Beschickungsweges zum Messen der Umsetzung zwischen dem Bestandteil und dem Reaktionsteilnehmer.
12. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Reaktionsteilnehmer (38) eine andere Mobilität besitzt
als der Bestandteil (36) und praktisch über das gesamte
poröse Medium dispergiert ist.
13. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Band (33) mehrere poröse Medien (31) enthält, die
auf dem Band derart angeordnet sind, daß sie nacheinander
behandelt werden, wenn sich das Band längs des Beschickungsweges
fortbewegt.
14. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das zweite Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes
quer über das poröse Medium nach erfolgter Umsetzung betreibbar
ist, um nichtumgesetzten Bestandteil (36 oder 61)
von umgesetztem Bestandteil (66) zu trennen.
15. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Medium (31) ein Gel ist.
16. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Probenbestandteil (36) und der Reaktionsteilnehmer
(38) Antigene bzw. Antikörper sind.
17. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Probenbestandteil (36) und der Reaktionsteilnehmer
(38) Antikörper bzw. Antigene sind.
18. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe ein markiertes Äquivalent des Probenbestandteils
(36) enthält, das sich mit dem Reaktionsteilnehmer
(38) kompetitiv bindet.
19. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Mittel zum Aufbringen (50) ein Mittel (39) zum Aufbringen
des Reaktionsteilnehmers (38) auf das poröse Medium
(31) umfaßt.
20. System gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes derart
betreibbar ist, daß es den Reaktionsteilnehmer (38) innerhalb
des porösen Mediums vor der Umsetzung wandern und sich
anreichern läßt.
21. Scheibenelektrophoretische Vorrichtung zum Analysieren
einer Probe hinsichtlich eines Bestandteils, der eine ionische
Ladung trägt, bestehend aus
einem porösen Medium (1) zur Aufnahme des Probenbestandteils,
Mitteln zum Einführen des Probenbestandteils in das Medium,
Mitteln (9, 10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Medium, um den Probenbestandteil wandern und sich innerhalb des Mediums in einem ersten Teil davon vor der Umsetzung mit einem in einem zweiten Teil des Mediums angeordneten Reaktionsteilnehmer anreichern und anschließend weiter innerhalb des Mediums in reaktivem Kontakt mit dem Reaktionsteilnehmer wandern zu lassen, und
Mitteln zum Messen der Umsetzung zwischen dem Probenbestandteil und dem Reaktionsteilnehmer.
einem porösen Medium (1) zur Aufnahme des Probenbestandteils,
Mitteln zum Einführen des Probenbestandteils in das Medium,
Mitteln (9, 10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Medium, um den Probenbestandteil wandern und sich innerhalb des Mediums in einem ersten Teil davon vor der Umsetzung mit einem in einem zweiten Teil des Mediums angeordneten Reaktionsteilnehmer anreichern und anschließend weiter innerhalb des Mediums in reaktivem Kontakt mit dem Reaktionsteilnehmer wandern zu lassen, und
Mitteln zum Messen der Umsetzung zwischen dem Probenbestandteil und dem Reaktionsteilnehmer.
22. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Medium (1) ein Gel ist.
23. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Gelmedium einen Porengrößengradienten aufweist.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Medium eine Membran (13) zum Festhalten des Reaktionsteilnehmers
aufweist, die für den zu untersuchenden
Bestandteil durchlässig ist.
25. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß das poröse Medium (1) eine beschränkte Konvektion aufweist.
26. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie außerdem Mittel zum Einführen des Reaktionsteilnehmers
in das poröse Medium (1) aufweist.
27. Vorrichtung gemäß Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie Mittel umfaßt, durch die der Reaktionsteilnehmer
ebenfalls innerhalb des Mediums wandern und sich anreichern
gelassen wird, wenn das elektrische Feld quer über das Medium
angelegt ist.
28. Vorrichtung gemäß Anspruch 27,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie Mittel enthält, durch die der angereicherte Reaktionsteilnehmer
ebenfalls unter dem angelegten elektrischen
Feld in reaktiven Kontakt mit dem Probenbestandteil relativ
weiter wanderngelassen wird.
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