DE69433583T2

DE69433583T2 - Zubereitungen auf Basis von Padina Algen oder ihrer Extrakten, und ihre pharmazeutische, Nährungsmittel oder für die Kultur von Mollusken oder Arthropoden Kulturverwendungen

Info

Publication number: DE69433583T2
Application number: DE69433583T
Authority: DE
Inventors: Gilles Gutierrez
Original assignee: Texinfine SA; Zambon France SA
Current assignee: Texinfine SA; Zambon France SA
Priority date: 1993-11-22
Filing date: 1994-11-21
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2014-11-22
Also published as: FR2712810A1; ATE260671T1; EP0655250B1; PT655250E; ES2220909T3; EP1224871A3; EP1224871A2; DE69433583D1; FR2712810B1; EP0655250A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Algen der Gattung Padina oder eines Extrakts dieser Algen zur Herstellung eines Mittels, das dazu dient, das Kalziumhaltevermögen biologischer Gewebe zu verbessern sowie die Anwendung dieses Mittels in den Bereichen Pharmakologie und Nahrungsmittelherstellung sowie für die Zucht von Weichtieren (Mollusken), die Perlen und Perlmut herstellen, und von Gliederfüßern (Arthropoden).
Es ist eine Vielzahl unterschiedlicher Algen bekannt, von denen einige als kalziumhaltige Algen eingestuft sind, da diese ein stark mit Kalzium angereichertes Gerüst aufweisen, man sagt sie sind „verkrustet".
Diesbezüglich lassen sich die Sphaerococcus coronopifolius (Rotalge, Rhodophyten), Liagora viscida (Rotalge), Halimeda tuna (Grünalge, Chlorophyten) nennen.
Der Erfinder hat festgestellt, dass aus der Vielzahl kalziumreicher Algen die Rhodophyten und insbesondere der Ordnung Dictyotales und insbesondere einige Mitglieder der Gattung Padina, wobei hiervon die Padina pavonica (Pavonia oder Padine) die Bekannteste ist, besondere und erstaunliche Eigenschaften aufweisen, die sich nicht bei anderen Algen dieses Typs finden. So existiert neben der Padina pavonica in der USA eine weitere Variante dieser Art, die üblicherweise als Zonaria bezeichnet wird, und in anderen Regionen der Welt, findet man kalziumreiche Algen dieses Typs wie die Padina vickersiae und die Tonia atomaria usw.
Im Folgenden werden zur Vereinfachung die Algen dieses Typs mit dem Ausdruck „Padina pavonica" bezeichnet, wobei dieser Ausdruck der Gattung Padina entspricht.
Einige dieser Algen haben bereits Anwendung gefunden für die Herstellung von Nahrungsmittelergänzungen. So beschreibt die JP-A-62 087 071 (WPI-Daten DW 8721) deren Verwendung zusammen mit Früchteextrakten und Früchten für eine Schlankheitskur.
Die JP-A-62 099 331 (WPI-Daten WD 8724) beschreibt die Herstellung von Nahrungsmittelergänzung auf der Basis von Karottenblättern, die schließlich von einer oder mehreren Algen, insbesondere Padina-Algen, umhüllt sind, dieses Produkt wird dann als Prophylaxe gegen Krebs verwendet.
Der Erfinder hat überraschenderweise festgestellt, dass diese Algen besondere Eigenschaften aufweisen, durch die es ermöglicht wird, das Anhaften von Kalzium in biologischen Geweben zu verbessern, dies gilt insbesondere für Säugetiere, Weichtiere und Gliederfüßer.
Es konnte ferner festgestellt werden, dass die Wirksamkeit nicht durch die Verdauung der Algen oder deren Extrakte durch proteolytische Enzyme außer Kraft gesetzt wird.
Auszüge von Algen der Art Padina pavonica können als aktiver Wirkstoff in Verbindung mit einem Arzneistoffträger zur Herstellung von pharmakologischen Substanzen verwendet werden, die darauf zielen, Beschwerden, die im Zusammenhang mit dem Kalziumhaltevermögen stehen, zu behandeln. Sie können ferner für Arzneimittel verwendet werden zur Behandlung von Knochenkrankheiten sowie für Arzneimittel, die auf eine Prophylaxe für Gesunde zielen.
Diese Extrakte wiesen eine Wirksamkeit auf, die vergleichbar ist, zu anderen Produkten, welche zur Verbesserung der Kalziumhaltefähigkeit verwendet werden, wie Kalziferol, Calcitonin, Östradiol und Cholecalciferol. Algen der Art Padina pavonica haben außerdem eine interessante Anwendung als Nahrungsmittelergänzung zur Zufuhr von Kalzium.
Schließlich können sie dazu verwendet werden, die Kalziumhaltekraft von Perlmut produzierenden Zellen von Weichtieren zu erhöhen und so die Wachstumsgeschwindigkeit von Aragonit und Calcit in Perlenkulturen und bei der Produktion von Perlmut zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile erschließt sich besser aus der nachfolgenden Beschreibung, die zwar illustrierend, jedoch in keiner Weise beschränkend ist.
Zunächst wird der Herstellungsprozess detailliert beschrieben.
Die Padina pavonica-Algen werden zunächst in unterschiedlichen Wassertiefen zwischen 30 cm und 20 m unter dem Meeresspiegel eingesammelt. Danach werden sie mit Meerwasser gewaschen und von unterschiedlichen Parasiten und Verschmutzungen (anderen Algen, kleinen Tieren, Muschelstücken etc.) befreit und auf gut gelüfteten Gitterrosten getrocknet. Die sich ergebende Trockenmasse entspricht in etwa 20 % der Masse der feuchten Algen.
Gut getrocknet sind die Algen einfach zerkleinerbar, entweder mittels eines Mörsers oder mit Hilfe einer Maschine (Universalzerkleinerer). Der Puder weist einen Kalziumgehalt von ungefähr 10 % auf in Abhängigkeit des Fundorts, der Wassertiefe und des Alters der Pflanze.
100 mg dieses Puders wurden mit 5 ml reinen Ethanols zu einer Suspension verarbeitet. Die Analyse dieser alkoholischen Lösung, die im Folgenden als „Extrakt der Padonia pavonia" (oder Epp) bezeichnet wird, hat jedoch keinen weiteren Gehalt an Kalzium ergeben.
Dieses Epp enthält einen Anteil von 10 mg der Wirksubstanz je 100 mg Algen. Das Epp wurde in vitro an osteoplastischen Zellen (Linie G 292, ECACC) mittels den klassischen Techniken der Zellkulturen, die im Folgenden kurz dargelegt werden, getestet:
Die Zellen werden in einem Eppendort-Gefäß der Größe 75 cm² mit einer Dichte von 2 – 5 × 10⁴ Zellen/cm² angesetzt. Als Milieu dieser Kulturen wurde das Milieu Mc Koy 5 mit fötalem Kalbsserum verwendet. Nach dem Anwachsen werden die Zellen mit Trypsin behandelt, gezählt und dann in Schalen mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung angesetzt. Man gibt in jede der Vertiefungen 0,5 ml Nährlösung hinzu, welche unterschiedliche Anteile von Epp, die zu testen sind, enthalten.
Den Kontrollproben werden in ihrer Nährlösung eine Menge an Alkohol hinzugefügt, die jener entspricht, die durch das Epp bei den Versuchen eingebracht wird.
Die in der Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse sind in ng/ml je 10⁶ Zellen nach 48 Stunden Behandlungszeit angegeben. Die Überwachung der Kalziumaufnahme wurde mittels eines Photospektrometers zur Bestimmung der Adsorption der Gesamtheit des intra- und extrazellulär anhaftenden Kalziums durchgeführt.
Diese Resultate zeigen, dass die Zellen der Referenzprobe 120 ng Kalzium pro eine Million kultivierte Zellen im Milieu Mc Koy fixieren. Nach Behandlung mit einem wässrigen Extrakt aus Padine-Algen kann man keinerlei Veränderungen beobachten.
TABELLE 1
Die Verwendung von 50 μg Epp (alkoholische Lösung) führt zu einer Erhöhung der Kalziumhaltefähigkeit um einen Faktor 3. Diese Erhöhung ist ungefähr 4, wenn man 250 μg Epp (alkoholische Lösung) verwendet.
Die Padina pavonica-Alge wäre jedoch nicht von Interesse für das Kalziumhaltevermögen in Knochen, wenn sie keine einfach durchführbare Behandlung erlauben würde, was die Möglichkeit einer oralen Verabreichung einschließt.
Der Erfinder hat daher die Wirksamkeit von Epp durch die Behandlung der Algen mit unterschiedlichen proteolytischen Verdauungsenzymen (Enzymen aus dem Magen, insbesondere Pepsin) untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengefasst.
Wie man feststellt, existieren keine signifikanten Unterschiede zwischen der Wirksamkeit des Epp aus einer reinen Alge und des Epp aus einer mit einem Magenenzym behandelten Alge.
TABELLE II
Die beobachteten Unterschiede rühren von der Verringerung der Löslichkeit der Wirksubstanz in Alkohol und der Verteilbarkeit in der wässrigen Lösung aufgrund der enzymatischen Behandlung her.
Um schließlich die Experimente zu überprüfen, hat der Erfinder unterschiedliche Algen und insbesondere weitere kalziumreiche Algen getestet, so etwa die Sphaerococcus coronopifolius (SC), Amphiora sp (AS) und Halimeda tuna (HT). Die in Tabelle 3 zusammengefassten Ergebnisse wurden wie folgt erhalten:
Nach einer Behandlung der Algen (Wäsche und Aussonderung der voran stehend genannten Verunreinigung) wurden die Algen getrocknet und jeweils 100 mg Trockenpulver mit 5 ml Alkohol behandelt.
Die entsprechend hergestellten Auszüge mit anderen Algen, kalziumreich oder nicht, wie etwa Fosliella farinosa, Udotea Petiolata, Asparagopsis armata, Dictyota linearis, Codium vermilara führten nicht dazu, dass nennbare Abweichungen von den voran stehend beschriebenen Ergebnissen erkennbar waren.
TABELLE III
Es erschien außerdem wichtig, die Wirksamkeit von Padina pavonica im Vergleich zu üblicherweise verwendeten Mitteln der wichtigsten Markteilnehmer zur Verbesserung des Kalziumhaltevermögens in den Osteoplasten zu ermitteln.
In diesem Zusammenhang hat der Erfinder, da ihm die Wirksubstanz in Epp unbekannt war, mit äußerst präzisen Trockengewichten gearbeitet.
Das Trockengewicht von Epp wurde durch eine Verdunstung des Alkohols bei einer Temperatur von 70°C für 5 Stunden erreicht.
Dieses Produkt wurde dann im Vergleich zu unterschiedlichen anderen Produkten getestet:

– Calcitonin (dessen therapeutische Dosis in der Größenordnung von 10"' M im Plasma ist
– Vitamin D3
– Östradiol
- Nebenschilddrüsenhormon (Hpth).

Die hierdurch erhaltenen Resultate sind in Tabelle IV zusammengefasst.
TABELLE IV
Das erzielte Resultat erlaubt die Aussage, dass die Aktivität von Epp ungefähr dreimal höher als jenes des Calcitonins, in derselben Größenordnung wie jene des Östradiols, zweifach höher als jene von Vitamin D3 und etwa 20fach höher als die Wirksamkeit von Hpth ist.
Um die zu verabreichende Dosis bei Säugetieren und insbesondere bei Menschen festzulegen, hat man zunächst die Alge pur angewandt und im Folgenden das Blutserum mit einer Kultur mit beigefügtem Epp verglichen.
Als wirksame Dosis hat sich im Mittel 250 μg/ml (2,5 / 10000) in einer Lösung mit 100 mg / 5 ml (2 %) herausgestellt.
Das Blutvolumen beträgt ungefähr 5 Liter und besteht zur Hälfte aus Blutserum, dies sind 2,5 l oder 2500 ml für einen Erwachsenen mit einem mittleren Gewicht von 75 kg.
Für einen Erwachsenen ist die Dosis in Gramm: 2500 × 2,5 / 10000 × 2 / 100 = 12,5000 / 1000000 = 12,5 / 1000 dies sind 12,5 mg pro Dosis oder 0,166 mg / kg.
Eine mögliche Giftigkeit dieser Alge wurde daraufhin durch Versuche an Mäusen ausgetestet, wobei das 10-, 100-, 500- und das 1000-fache der Normaldosis verabreicht wurde, dies entspricht 166 mg/kg, was einer Dosis von 12,450 g für einen Erwachsenen entspricht.
Es traten keinerlei Besonderheiten auf und es war unmöglich, den DL 50-Wert (tödliche Dosis für 50 % der Tiere) zu ermitteln.
Daraufhin konnte zu einem klinischen Versuch mit den folgenden Konditionen übergegangen werden:
6 Freiwillige zwischen 37 und 74 Jahren hatten eingewilligt, Tabletten mit folgender Zusammensetzung einzunehmen:

– Puder aus Padina pavonica: 50 mg
– Kieselsäure des Typs Sippernat: 5 mg
– Mikrokristalline Zellulose: Zugabe für eine Tablette von 300 mg.

Die Messung der Knochendichte wurde zur Beginn der Behandlung durchgeführt, die Behandlung dauerte sechs Monate bei einer Gabe von vier Tabletten mit einer Dosis von 50 mg pro Tag. Zwei weitere Knochendichtemessungen wurden zu Beginn des dritten Monats und am Ende des Versuchs durchgeführt.
Der Kalziumgehalt der Knochen wurde mittels des Dual-Photonen-Absorptionsverfahren (mit einem Messgerät vom Typ Lunar DPX der Marke Hologic) an den Lumbalwirbeln L1, L2, L3 und L4 sowie am linken Handgelenk ermittelt. Außerdem wurde eine Röntgenaufnahme dieser Körperstellen durchgeführt, um Arthosen auszuschließen, die die Resultate aufgrund eines Zuwachses an Knochenmasse verfälschen würden (kleine Wachstumsansätze der Knochen aufgrund rheumatischer Erkrankungen).
Das Messgerät drückt als Resultat die Masse an Kalzium pro cm² der durchstrahlten Hautoberfläche aus. Daraus lässt sich die Oberfläche ableiten, unter der sich keine Knochen befinden.
Die Messgenauigkeit beträgt größenordnungsmäßig 10 mg für eine analysierte Fläche von 15,00 cm². Die Messungen haben gezeigt, dass nach 77 Tagen die Masse an Kalzium in der Größenordnung von 1 – 4 % zunimmt.
Eine zweite klinische Studie wurde durchgeführt, um für einen kurzen Zeitraum die Prävention gegen einen Abbau der extrazellulären Matrix im Knochen bei einer Gabe von urinalem Hydroxyprolin und Pyridinolin zu untersuchen.
Diese Schwächung der Knochenmatrix geht Beschwerden durch Osteoporose voraus und wird im Allgemeinen durch einen Kalziumverlust mit zunehmendem Alter verursacht, ohne dass dies pathologisch wäre.
Das Pyridinolin ist ein Marker, der die Rückbildung der Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix des Knochens anzeigt, Hydroxyprolin ist ein Marker für eine extrazelluläre Kollagenmatrix, unter anderem für die extrazelluläre Knochenmatrix. Man konnte außerdem eine signifikante Erhöhung dieser Marker innerhalb einiger Wochen feststellen, was auf eine Knochenumbildung hindeutet.
Es ist außerdem denkbar, andere Verabreichungsformen als Tabletten, beispielsweise Kapseln, Puder oder auch injizierbare oder oral verabreichbare Lösungen zu verwenden.
Man kann sich gut das Interesse vorstellen, das die Algen der Gattung Padina oder Extrakte hieraus zur Herstellung von Arzneimitteln entgegengebracht wird, die dazu bestimmt sind, Knochenkrankheiten zu behandeln und zu lindern, wie etwa Osteoporose, Arthrose und Funktionsstörungen des Kalziumaustausches zwischen Blut und Gewebe, der Narbenbildung nach Operationen oder Unfällen, dem altersbedingten Kalziumverlust wie auch für die Krankheitsprävention bei Gesunden.
Algen der Gattung Padina können ferner interessant sein für die Anwendung in Nahrungsmittelergänzungen mit einer Kalziumbeigabe.
Außerdem hat der Erfinder die Wirksamkeit des Epp für eine bestimmte Anzahl von Weichtieren, insbesondere Muscheln der Klasse Bivalvia, welche Perlmut und Perlen bilden, festgestellt.
Üblicherweise entstehen Perlen in einer Perlenkultur innerhalb von drei Jahren, wobei Perlmut aus einer regelmäßigen Calcitstruktur auf einem Aragonitbett entsteht, die von Strukturproteinen zusammengehalten wird.
Die Versuche wurden mit zwei Arten von Bivalvia-Muscheln durchgeführt: Mytilus provincialis (Perlenmuscheln) und Crasostrea angulata (Perlmutmuschel). Diesen wurde durch Probenentnahme am Schalenrand unter Zuhilfenahme einer Pronaselösung E Zellen entnommen, die daraufhin in einem geeigneten Milieu herangezogen wurden (Lenoir und Mathieu, 1986), wobei diese vor Licht geschützt und bei einer Temperatur von 15° gehalten wurden.
Die Messung des Kalziumgehalts wurde mit Hilfe eines Absorptionsspektrometers durchgeführt, wobei der intra- und extrazelluläre Gesamt-Kalziumgehalt bestimmt wurde.
Die Ergebnisse, ausgedrückt in μg Kalzium pro eine Million Zellen nach 72 Stunden Inkubation, sind nachfolgend in der Tabelle V zusammengefasst.
TABELLE V
Man bemerkt eine signifikante Erhöhung des Gehalts an fixiertem Kalzium, was das Interesse an der Anwendung von Epp in Kulturen von Perlenmuscheln und anderen Perlen und Perlmut herstellenden Weichtieren erklärt.
Die Wirksamkeit von Epp wurde außerdem an Gliederfüßern bestimmt.
Eine Vielzahl von Tieren weist, wie einige Weichtiere, ein Exoskelett auf, das von einer Chinin-Matrix getragen wird. Diese Tiere, die äußere Gelenke aufweisen, werden Gliederfüßer (Arthropoden) genannt. Hierunter findet sich der Artemias, der deshalb von Interesse ist, da er im Labor einfach heran gezüchtet werden kann.
Die Artemias werden im Handel in der Form von Eiern angeboten, die man lediglich in etwas Wasser Einstreuen muss, um deren Schlüpfen zu provozieren. Dies tritt im Verlauf von zwei bis vier Tagen je nach vorliegenden Bedingungen auf. Nach dem Schlüpfen wurden die Larven mit Spirolina-Algen genährt, welche mit notwendigen Zusatzstoffen für die Lösbarkeit des Padina-Extrakts angereichert wurden, wie etwa Betainen und Licithinen...
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VI zusammengefasst.
TABELLE VI
Es ist sehr wahrscheinlich, dass die gewonnenen Resultate ebenfalls für andere Arten von Gliederfüßern gelten.

Claims

Pharmazeutische Zubereitung auf der Basis von Algen oder eines Extrakts hiervon, für die Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung oder Verbesserung der Vorsorge von Knochenkrankheiten wie Osteoporose, Arthose, Funktionsstörungen in Verbindung mit dem Austausch von Kalziumionen zwischen dem Blut und dem Gewebe, der Narbenbildung nach Operationen oder Verletzungen und altersbedingten Kalziumsverlust, dadurch gekennzeichnet, dass diese die Alge der Gattung Padina oder einen Extrakt hiervon enthalten.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Pulver oder dem Extrakt der Alge eine Trägersubstanz oder ein Verdünnungsmittel zugegeben wird, das für eine orale Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Alge der Gattung Padina eine Padina pavonica bezeichnet wird. Zubereitungen auf Basis von Padina Algen oder ihrer Extrakte für pharmazeutische Anwendungen, Nahrungsmittel oder für die Aufzucht von Mollusken oder Arthropoden Zusammenfassung Die Erfindung betrifft eine Pharmazeutische Zubereitung auf der Basis von Algen oder eines Extrakts hiervon, für die Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung oder Verbesserung der Vorsorge von Knochenkrankheiten wie Osteoporose, Arthose, Funktionsstörungen in Verbindung mit dem Austausch von Kalziumionen zwischen dem Blut und dem Gewebe, der Narbenbildung nach Operationen oder Verletzungen und altersbedingten Kalziumsverlust, dadurch gekennzeichnet, dass diese die Alge der Gattung Padina oder einen Extrakt hiervon enthalten.