-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung,
welche die Gesamtheit der Bestandteile von Perlmutt, wenigstens
ein Kollagen und wenigstens ein Proteoglycan umfasst, die Zusammensetzung,
die durch dieses Verfahren erhalten werden kann, und die Verwendung
dieser Letzteren auf den Gebieten sowohl der Pharmazie als auch
der Kosmetik, insbesondere um die Auswirkungen der Hautalterung und/oder
der Alterung der hornartigen Auswüchse aus der Haut (Haare und
sonstige Behaarung, Nägel,
Zähne ...)
zu bekämpfen.
-
Die
Säugetiere
schützen
sich vor der äußeren Umwelt
durch eine Barriere, welche gebildet wird durch die Haut, ein sehr
stark strukturiertes, aus mehreren Schichten bestehendes Gewebe,
welches aber gegenüber
den Angriffen, die auf die Variationen der außerhalb des Körpers liegenden
Umgebung zurückzuführen sind,
empfindlich ist. Diese Situation ist im Tierreich einzigartig, denn
die Fische und die Frösche
sekretieren Schleim, die Vögel
sind mit Federn bedeckt und die Vertebraten auf der Ebene unterhalb
der Säugetiere
und die Säugetiere
mit Ausnahme der aktuelle Hominiden sind von Fellen bedeckt.
-
Der
Mensch hat diese schützenden
Attribute verloren: er hat eine Haut, die er schützen muss und bei der es möglich ist,
diese zu stimulieren, um sie darin zu unterstützen, die Angriffe und die
Alterung zu bekämpfen.
-
Es
ist insbesondere bekannt, dass die Alterung ein physiologisches
Phänomen
ist, welches insbesondere durch ein Dünnerwerden der Haut und einen
Elastizitätsverlust,
welcher insbesondere zum Auftreten von mehr oder weniger tiefen
Falten führt,
zum Ausdruck kommt. Man kann gleichfalls eine oberflächliche
Erschlaffung oder Austrocknung und eine anarchische Pigmentierung
feststellen.
-
Die
Haut umfasst drei Schichten: die Epidermis, die Dermis und in der
Tiefe die Hypodermis.
-
Die äußerste Schutzhülle der
Haut, die Epidermis, die die Dermis eng bedeckt, wird an der Oberfläche aus
dem Stratum corneum gebildet. Das Stratum corneum besteht tatsächlich aus
zwei Schichten: dem Stratum disjunctum an der Oberfläche, dessen
Besonderheit in der Desquamation besteht, und dem Stratum compactum,
der tiefer liegenden, das eine Barriererolle spielt. Die Epidermis,
die, da an der Oberfläche
befindlich, leicht makroskopisch zu beobachten ist, hat den Gegenstand
von zahlreichen Untersuchungen gebildet. Die bekannten Reaktionen
sind jene, die durch bestimmte Agentien der außerhalb des Körpers befindlichen
Umgebung ausgelöst
werden, oder ebenso jene, die aus Anwendungen von Wirkstoffen unterschiedlicher
Herkunft resultieren. Die Zellen der Epidermis resultieren aus der
Aktivität
der Zellen der Basalschicht, die auf einer Basalmembran, welche
die Epidermis von der Dermis trennt, ruhen.
-
Die
Dermis resultiert aus der biosynthetischen Aktivität der Fibroblasten,
die die Bestandteile der extrazellulären Matrix produzieren. Diese
wird aus vier großen
Familien von Makromolekülen
gebildet: den Kollagenen, Elastin, den Strukturglycoproteinen und
den Proteoglycanen. Die Dermis hat die Fähigkeit, auf die von der Epidermis
ausgesandten Signale zu antworten, die im Gegenzug gleichfalls Signale
an die Epidermis sendet. Allgemein gibt es Austausche zwischen diesen
unterschiedlichen Dermis- und Epidermis-Schichten der Haut, die
dazu bestimmt sind, die zelluläre
Erneuerung, den Zusammenhalt und die Hydratisierung der äußeren Schichten
sicherzustellen.
-
Zahlreiche
Wirkstoffe wurden vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Alterung
zu verhüten
oder zu verzögern.
-
Unter
jenen wurde das Perlmutt seit der Antike im Bereich der Ästhetik
und in den traditionellen Arzneibüchern eingesetzt. Außerdem ist
das Perlmutt für
seine Knochen regenerierenden Eigenschaften bekannt.
-
Es
ist insbesondere bekannt, dass das Perlmutt oder der chonchylifere
Aragonit ein biogenes mineralisiertes Gebilde ist; es wird aus einer
organischen Matrix von faserförmigen
und nicht-faserförmigen Substanzen,
die ungefähr
1,7 bis 2% der gesamten Masse repräsentieren (Taylor et al., Bulletin
of the British Museum (National history) Zoology, Ergänzungsband,
3125 S. + 29 Tafeln, 1969), und kristallisiertem Calciumcarbonat in
orthorhombischer Form, welches als Aragonit bezeichnet wird, welches
mit Spurenelementen (Natrium, Magnesium, Lanthan, Zink, Brom, Cäsium, Eisen,
Mangan, Chlor, Kupfer, Kalium, Calcium, Strontium und Schwefel)
assoziiert ist, gebildet. Spezieller liegt die gesamte organische
Phase des Perlmutts in Form einer organischen Matrix vor, welche
aus faserförmigen
Proteinen, welche insbesondere aus altertümlichen Kollagenen, die frei
von Hydroxyprolin und Hydroxylysin sind, und nicht-faserförmigen Proteinen
gebildet wird, besteht. Ungefähr
50% der organischen Matrix des Perlmutts ist wasserlöslich (oder „water
soluble"). Die übrigen 50% können lediglich
nach Entkalkung erhalten werden.
-
Gleichwohl
rufen die Erzeugnisse des Standes der Technik, die durch Mischen
eines Perlmuttpulvers mit einem inerten pulverförmigen Trägermaterial oder Verdünnungsmittel
erhalten worden sind, wie beispielsweise in der Anmeldung WO 97/23231
beschrieben, unerwünschte
Erscheinungen einer Reizung der Haut hervor, die auf das Vorliegen
des Perlmutts in Pulverform (insbesondere von seinem Hauptbestandteil,
dem Aragonit oder CaCO3) zurückzuführen sind.
Der Gehalt an Perlmuttpulver in diesen Erzeugnissen muss folglich
zwingend sehr stark begrenzt werden, um diese Reizungserscheinungen
zu vermeiden. Diese unerwünschten
Reizungserscheinungen haben insbesondere den zu basischen pH dieser
bekannten Erzeugnisse bei Kontakt mit der Haut zur Ursache. Außerdem weisen
die bekannten Erzeugnisse auf der Grundlage von Perlmuttpulver spezielle
Formulierungsprobleme, insbesondere bezüglich der Stabilität (Instabilwerden
von Emulsionen) und der Einstellung des pH auf einen weniger basischen
Wert, auf.
-
Außerdem beschreibt
die Anmeldung WO 97/24133 ein Verfahren zur Herstellung von biologisch
wirksamen Substanzen ausgehend von Perlmutt durch Inkontaktbringen
eines Perlmuttpulvers mit einem wässrigen Lösemittel, ausgewählt unter
reinem, zweifach destilliertem oder pyrogenfreiem Wasser, zu welchem
gegebenenfalls Salze hinzugefügt
worden sind, in welchem man dann die wasserlösliche Fraktion derart abtrennt,
dass lediglich die wässrige
Fraktion gewonnen wird, die folglich im Wesentlichen frei ist von
den mineralischen Bestandteilen und der nicht wasserlöslichen
organischen Phase des Perlmutts. Dieses Verfahren kann folglich
insbesondere nicht die Herstellung einer Zusammensetzung, welche
insbesondere die Gesamtheit der Bestandteile des Perlmutts, insbesondere
die gesamte organische Phase des Perlmutts umfasst, erlauben.
-
Es
wurde jetzt ganz und gar überraschend
und unerwartet festgestellt, dass das Ausführen eines speziellen Verfahrens
erlaubt, eine neue Zusammensetzung zu erhalten, welche nicht nur
die Gesamtheit der Bestandteile des Perlmutts enthält, sondern
auch eine vorteilhafte Kombination von diesen Letzteren mit bestimmten
Verbindungen, die es zumindest erlauben, die Aktivität der Bestandteile
des Perlmutts zu potenzieren, wenn nicht sogar einen Synergieeffekt
bereitzustellen, insbesondere in Hinblick darauf, auf sichtbare
Weise die mit der Alterung der Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus
der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) verbundenen Wirkungen
zu verhüten
und/oder zu verringern.
-
Die
Erfindung hat so ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung
zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die
Schritte umfasst, welche darin bestehen:
- a)
Perlmutt zu einem Pulver mit einer Granulometrie zwischen ungefähr 1 und
ungefähr
300 μm eingeschlossen
zu zerkleinern;
- b) das so erhaltene Perlmuttpulver in innigen Kontakt mit einem
Extraktionsmittel in Form einer wässrig-glycolischen Lösung von
wenigstens einem Kollagen, wenigstens einem Proteoglycan oder einer
Mischung von diesen Letzteren zu bringen; dann
- c) die durch das innige Inkontaktbringen gebildete Extraktionsmischung,
welche die gewünschte
Zusammensetzung bildet, zu gewinnen.
-
Das
Verfahren erlaubt, eine Zusammensetzung in Form der in Schritt b)
erhaltenen Extraktionsmischung zu erhalten.
-
Das
für das
Ausführen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
eingesetzte Perlmutt kann ausgehend von Schalen von Perlmutt erzeugenden
Mollusken und von bestimmten Cephalopoden (beispielsweise dem Nautilus)
erhalten werden. Insbesondere erhält man es ausgehend von Austern,
wie Pinctada maxima.
-
Man
setzt rohen, von den anderen an Polysacchariden und Calcit reichen
Bestandteilen der Schale befreiten Perlmutt ein. Man geht vorzugsweise
von weißem
Perlmutt aus; wenn nicht, muss man einen Schritt einer Entfernung
der Pigmente, die Unverträglichkeiten
hervorrufen können,
vorsehen.
-
Es
handelt sich um ein leicht verfügbares
Ausgangsmaterial, dessen Verwendung keine negativen ökologischen
Auswirkungen auf die natürlichen
Populationen hat. Tatsächlich
stammt der Großteil
dieser Austern oder anderen Perlmutt erzeugenden Mollusken aus einer
Aquakultur.
-
Außerdem wird
ein ergänzender
Vorteil geliefert durch die Tatsache, dass das Ausgangsmaterial
erhalten werden kann ausgehend von Schalen von Austern, welche Perlen
produziert haben; tatsächlich
wird eine Perlauster aus dem Produktionspool entfernt, nachdem sie
nacheinander maximal drei Perlen produziert hat, wohingegen sie
eine dicke Schicht von Perlmutt von hervorragender Qualität (Qualität A) aufweist.
Die Erfindung schlägt
folglich eine ergänzende
Absatzmöglichkeit
für eine
Verwendung des Perlmutts nachgeschaltet zur Perlenkultur vor.
-
Die
Granulometrie des für
die Ausführung
des Verfahrens eingesetzten Perlmuttpulvers liegt zwischen ungefähr 1 und
ungefähr
300 μm eingeschlossen,
wie mittels klassischer Mittel oder Maßnahmen, die im Vermögen der
Fachleute auf diesem Gebiet liegen, wie der Sieb-Technik und/oder
der LASER-Lesetechnik, gemessen.
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsweise
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird das Perlmutt zu einem Pulver mit einer Granulometrie zwischen
ungefähr
50 und ungefähr
100 μm eingeschlossen
zerkleinert.
-
Gemäß einer
anderen besonderen Ausführungsweise
wird das Perlmutt zu einem Pulver mit einer Granulometrie zwischen
ungefähr
15 und ungefähr
50 μm eingeschlossen
zerkleinert, was erlaubt, die Ausbeute zu erhöhen, indem man sich der Größe der kristallinen
Einheit annähert
(beispielsweise ist die Elementareinheit des Perlmutts von Pinctada
maxima der Biokristall, ein sehr voluminöser hexagonaler Aragonit-Kristall
von 9 bis 12 μm).
-
Man
geht insbesondere auf die folgende Weise vor, um das Perlmutt gemäß dem Schritt
a) des vorliegenden Verfahrens zu einem Pulver zu zerkleinern.
-
In
einer ersten Phase wird das rohe Perlmutt von dem äußeren Teil
der Schale (Periostracum) durch Abschleifen oder ein jegliches anderes
nicht-denaturierendes Verfahren befreit.
-
Die
Perlmuttplatten werden dann durch Grobzerkleinerung zu Fragmenten
zerkleinert, um dann eine Mikronisierung vornehmen zu können. Die
Fragmente, welche dazu bestimmt sind, mikronisiert zu werden, haben
vorzugsweise eine Länge
zwischen ungefähr
2 und ungefähr
5 Zentimetern und eine Dicke von ungefähr 0,3 Zentimetern.
-
In
einer zweiten Phase werden diese Fragmente mikronisiert.
-
Das
Perlmutt kann ohne vorab erfolgende Dekontaminierung/Entgiftung
eingesetzt werden. In dem Falle einer vorab erfolgenden Dekontaminierung
führt man
ein sehr schnelles dekontaminierendes Waschen ohne Eintauchen der
Fragmente in einer Natriumhypochlorit-Lösung mit 6,6% aktivem Chlor
(12°) aus.
Die Trocknung muss unverzüglich
erfolgen derart, dass jegliche Spuren von Wasser entfernt werden.
-
Das
Abschleifen muss trocken in ausschließlich für diesen Zweck reservierten
großen
Krügen
aus Zirconium, die zuvor gewaschen (Bleichlauge, Spülen, dann
Waschen mit destilliertem Wasser) und in der Wärme sterilisiert werden, ausgeführt werden.
Die Zerkleinerung erfolgt mittels Zirconium-Kugeln, die ihrerseits ebenfalls
sterilisiert worden sind.
-
Die
Sterilisation des zu Pulver zerkleinerten Perlmutts kann auf zwei
unterschiedliche Weisen ausgeführt
werden:
- – Sterilisation
durch Bestrahlung mit 2,5 Mrad γ-Strahlen;
- – Sterilisation
in der Wärme
während
1 bis 2 Stunden in einem Autoklav bei 100°C.
-
Das
Perlmutt wird erst ab ungefähr
250°C abgebaut
(mineralische/anorganische Matrix und organische Matrix) (Balmain,
Hannoyer und Lopez, „Fourier
transform infrared spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction analyses
of mineral and organic matrix during heating of Mother of Pearl
(Perlmutt) from the shell of the mollusc Pinctada Maxima", J. Biomed. Mater.
Res. (Appl. Biomater.), Band 48(5): 749–754, 1999). Diese Sterilisation
zerstört
folglich dessen verschiedene Bestandteile nicht.
-
Der
Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, dass oben beschriebene Perlmuttpulver in innigen
Kontakt mit einem Extraktionsmittel in Form einer wässrig-glycolischen
Lösung
von wenigstens einem Kollagen, wenigstens einem Proteoglycan oder
einer Mischung von diesen Letzteren zu bringen.
-
Unter „wässrig-glycolische
Lösung" versteht man gemäß der Erfindung
eine Lösung
von Kollagen und von Proteoglycan, welche erhalten wird, indem ein
wässrig-glycolisches
Lösemittel
eingesetzt wird, d.h. allgemein ein Lösemittel in Form einer Mischung
von Wasser und wenigstens einem Glycol.
-
Unter „Glycol" versteht man bekanntermaßen eine
jegliche Verbindung, die die Alkoholfunktion zweimal aufweist. Insbesondere
wird das Glycol, welches eingesetzt werden kann, ausgewählt in der
Gruppe bestehend aus Ethylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol
und den Mischungen von diesen Letzteren.
-
Das
Wasser, welches eingesetzt werden kann, um das wässrig-glycolische Lösemittel
zu bilden, kann reines, zweifach destilliertes, pyrogenfreies, demineralisiertes
Wasser oder ferner entionisiertes Wasser sein.
-
In
dem wässrig-glycolischen
Lösemittel
liegt das Gewichtsverhältnis
Wasser:Glycol vorzugsweise zwischen ungefähr 1:100 und ungefähr 100:1
eingeschlossen, und insbesondere zwischen ungefähr 1:1 und ungefähr 20:1
eingeschlossen.
-
Das
Extraktionsmittel ist vorzugsweise eine wässrig-glycolische Lösung von
wenigstens einem Kollagen.
-
Das
Kollagen, welches in wässrig-glycolischer
Lösung
in dem Extraktionsmittel gemäß der Erfindung eingesetzt
werden kann, kann ein jegliches Kollagen, welches die interzelluläre Sub stanz
des Bindegewebes bildet, im Tierreich verfügbar ist und dem Fachmann auf
diesem Gebiet bekannt ist, sein.
-
Man
setzt insbesondere vorzugsweise ein marines Kollagen ein, d.h. ein
Kollagen, welches von einem Organismus mariner Herkunft, wie den
marinen Vertebraten, stammt. Insbesondere ist das marine Kollagen der
Hauptbestandteil der Bindegewebe des Fisches, wo es eine essentielle
Rolle bei der Struktur der Haut, der Muskeln, der Sehnen und der
Bänder
spielt.
-
Man
kann insbesondere das marine Kollagen „PANCOGENE® MARIN", wie es von der
Firma Gattefossé (Saint
Priest, Frankreich) vertrieben wird, dessen INCI-Bezeichnung „Soluble
Collagen" ist (Bezeichnungsweise
in Japan: „water
soluble collagen";
MHV: 20800CZY0010000) aufführen.
Es handelt sich um ein Kollagen, das aus der Haut von Fischen nicht-geschützter Spezies
der warmen Meere, die zu der Klasse der Knochenfische gehören, extrahiert
wird.
-
Man
kann gleichfalls das marine Kollagen „COLLAGENE NATIF MARIN – Code 690", wie es von der Firma
Laboratoire Industriel de Biologie (Soisy Sous Montmorency, Frankreich)
vertrieben wird, dessen CTFA-Bezeichnung „Amino Collagen Amino Acid" ist, aufführen. Es
handelt sich um ein saures, in Wasser lösliches Kollagen, welches aus
der Haut von Fischen extrahiert wird.
-
Man
setzt vorzugsweise eine Kollagen-Konzentration zwischen ungefähr 0,0001
und ungefähr
50 Gew.-% eingeschlossen und insbesondere zwischen ungefähr 0,01
und ungefähr
15 Gew.-% eingeschlossen bezogen
auf das Gesamtgewicht des Extraktionsmittels ein.
-
Das
Extraktionsmittel ist gleichfalls vorzugsweise eine wässrig-glycolische
Lösung
von wenigstens einem Proteoglycan.
-
Das
Proteoglycan, welches in wässrig-glycolischer
Lösung
in dem Extraktionsmittel gemäß der Erfindung
eingesetzt werden kann, kann ein jegliches Proteoglycan sein, welches
den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, insbesondere ein jegliches
nicht schwefelhaltiges Proteoglycan.
-
Insbesondere
wird das Proteoglycan ausgewählt
in der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat,
Eparansulfat, Keratansulfat und den Mischungen von diesen Letzteren.
-
Die
Hyaluronsäure
ist ganz besonders bevorzugt, wie jene, die von der Firma Laboratoire
Industriel de Biologie (Soisy Sous Montmorency, Frankreich) vertrieben
wird.
-
Die
eingesetzte Proteoglycan-Konzentration liegt vorzugsweise zwischen
ungefähr
0,0001 und ungefähr
40 Gew.-% eingeschlossen und insbesondere zwischen ungefähr 0,01
und ungefähr
10 Gew.-% eingeschlossen bezogen auf das Gesamtgewicht des Extraktionsmittels.
-
Selbstverständlich kann
das Extraktionsmittel außerdem
eine jegliche zusätzliche
Verbindung umfassen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt
ist, die für
den Extraktionsschritt selbst oder in Hinblick auf mögliche Verwendungen
der durch das vorliegende Verfahren hergestellten Zusammensetzung,
wie jene, die nachfolgend beschrieben werden, geeignet ist. Das
Extraktionsmittel kann so beispielsweise außerdem Komplexbildner, wie
EDTA ((Ethylendiamin)-tetraessigsäure) umfassen.
-
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsweise
der Erfindung bringt man das Perlmuttpulver in innigen Kontakt mit
dem Extraktionsmittel gemäß Schritt
b), indem man eine Mischung herstellt, welche aus dem Perlmuttpulver
und dem Extraktionsmittel besteht, so dass sie bezogen auf ihr Gesamtgewicht
ungefähr 20
bis ungefähr
60 Gew.-% eingeschlossen Perlmuttpulver, welches in Schritt a),
wie oben beschrieben, erhalten worden ist, und den Rest Extraktionsmittel,
wie oben beschrieben, umfasst.
-
Das
innige Inkontaktbringen des Perlmuttpulvers mit dem Extraktionsmittel
gemäß dem Schritt
b) des Verfahrens kann insbesondere ausgeführt werden durch Suspendieren
des Perlmuttpulvers in dem Extraktionsmittel unter starkem und homogenem
mechanischem Rühren,
um eine die Extraktion erlaubende Umhüllung der Perlmutt-Teilchen
zu erlauben.
-
Man
kann beispielsweise bei Umgebungstemperatur, d.h. bei einer Temperatur
in der Größenordnung von
20°C, während ungefähr 1 h arbeiten,
aber die Dauern und die Temperaturen können durch den Fachmann auf
diesem Gebiet insbesondere abhängig
von der Ausgangs-Granulometrie
des Perlmuttpulvers angepasst werden.
-
Gemäß einer
anderen Ausführungsweise
kann der Schritt b) des Inkontaktbringens ausgeführt werden durch Hindurchleiten
des Extraktionsmittels unter Druck durch das immobilisierte Perlmuttpulver.
Diese Immobilisierung kann beispielsweise durch eine Säule vom
HPLC-Typ, gegebenenfalls in einer Mischung mit Füll- oder Packsubstanzen, welche
eine bessere Diffusion des Extraktionsmittels erlauben und die Verdichtung
des Perlmuttpulvers verhindern, ausgeführt werden.
-
Ohne
gleichwohl auf irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, wird
angenommen, dass das Vorhandensein des Kollagens und des Proteoglycans
in dem Extraktionsmittel, insbesondere des marinen Kollagens und
von Hyaluronsäure,
die Extraktion von verwandten Verbindungen, die in dem Perlmutt
vorhanden sind, durch ein physikalisch-chemisches Affinitätsphänomen begünstigen
wird mit außerdem
einer Potenzierung der Wirkungen der Bestandteile, die so aus dem
Perlmutt extrahiert werden. Es wird insbesondere angenommen, dass
die Extraktion der altertümlichen
Kollagene des Perlmutts durch das Vorhandensein der marinen Kollagene
begünstigt
werden wird und die Extraktion sowohl der Adhäsionsproteine (Decorin und
Zytokine) als auch der Proteoglycane des Perlmutts durch das Vorhandensein
des gewählten
Proteoglycans begünstigt
werden wird.
-
Wie
dem auch sei, führt
man das innige Inkontaktbringen vorzugsweise bei einer gegebenen
Temperatur während
einer ausreichenden Zeitspanne, um eine praktisch vollständige Extraktion
auszuführen,
aus. Unter „praktisch
vollständige
Extraktion" versteht
man gemäß der Erfindung
die Extraktion von allen extrahierbaren Bestandteilen des Perlmutts
während
dessen Inkontaktbringen mit dem Extraktionsmittel.
-
In
anderen Worten entspricht das Erhalten eines Gleichgewichts der
Gesamtkonzentrationen insbesondere an Kollagenen oder an Proteoglycanen
in der flüssigen
wässrig-glycolischen
Phase der Erzielung dieser „praktisch
vollständigen
Extraktion".
-
Es
liegt folglich im Vermögen
des Fachmannes auf diesem Gebiet, den „praktisch vollständigen" Charakter einer
solchen Extraktion zu bestimmen, beispielsweise durch regelmäßige Messungen
von diesen Gesamtkonzentrationen an Kollagenen oder an Proteoglycanen
in der flüssigen
wässrig-glycolischen
Phase.
-
Wie
dem auch sei, kann der Schritt des Inkontaktbringens vor seinem
Ende eine Ruhephase (Anhalten des Rührens) der Suspension des Perlmuttpulvers
in dem Extraktionsmittel umfassen.
-
Am
Ende des Schritts b) des Inkontaktbringens gewinnt man die Extraktionsmischung,
welche durch das innige Inkontaktbringen gebildet wird, welche die
gewünschte
Zusammensetzung bildet.
-
Diese
Zusammensetzung kann vor einer Verwendung in Form einer wässrig-glycolischen
Suspension so, wie sie ist, aufbewahrt werden. Aus praktischen Gründen der
späteren
Verwendung (Aufbewahrung, Transport, Formulierung u.s.w.) kann man
gleichfalls die flüssige
Phase von der festen Phase dieser Zusammensetzung trennen.
-
So
ist gemäß einer
Variante das erfindungsgemäße Verfahren
dadurch gekennzeichnet, dass man am Ende von Schritt b) die durch
das innige Inkontaktbringen gebildete Extraktionsmischung, die die
gewünschte Zusammensetzung
bildet, gewinnt und man die flüssige
Phase von der festen Phase der Zusammensetzung durch Mittel oder
Maßnahmen,
die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, wie Maßnahmen
einer Ultrafiltration, einer tangentialen Filtration u.s.w. abtrennt.
-
Es
versteht sich, dass die feste und die flüssige Phase, die so voneinander
getrennt wurden, zusammen die Zusammensetzung, die wie oben beschrieben
hergestellt worden ist, bilden. Man kann so vorsehen, dass während einer
späteren
Formulierung unter Verwendung dieser Zusammensetzung mit pharmazeutisch oder
kosmetisch geeigneten Trägermaterialien
die Zusammensetzung aus Bequemlichkeitsgründen im Rahmen der Formulierung
bei einem jeglichen Schritt der Formulierung durch gleichzeitige
oder zeitlich getrennte Zugabe der festen bzw. flüssigen Phase
rekonstituiert werden kann.
-
Die
Erfindung hat gleichfalls eine neue Zusammensetzung, die durch das
Verfahren, wie es oben beschrieben worden ist, erhalten werden kann,
(welche die festen und flüssigen
Phasen umfasst, mit oder ohne Trennschritt, wie oben beschrieben)
zum Gegenstand.
-
Insbesondere
ist diese Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens
in Form einer wässrig-glycolischen
Suspension einer flüssigen
Phase und einer festen Phase umfasst:
- – Aragonit
(CaCO3);
- – Spurenelemente,
ausgewählt
aus der Gruppe, welche aus Natrium, Magnesium, Lanthan, Zink, Brom, Cäsium, Eisen,
Mangan, Chlor, Kupfer, Kalium, Calcium, Strontium, Schwefel und
den Mischungen von diesen Letzteren gebildet wird;
- – faserförmige Proteine
des Perlmutts, insbesondere altertümliche Kollagene des Perlmutts,
die mit den marinen Kollagenen des Extraktionsmittels verwandt sind
(siehe nachfolgend beschriebene 1);
- – nicht-faserförmige Proteine
des Perlmutts, insbesondere Proteine, die mit den Adhäsionsproteinen,
wie Decorin, verwandt sind (siehe nachfolgend beschriebene 2);
- – wenigstens
ein Kollagen, welches nicht aus dem Perlmutt stammt, und/oder wenigstens
ein Proteoglycan, welches nicht aus dem Perlmutt stammt.
-
Es
versteht sich selbstverständlich,
dass man unter „Kollagen,
welches nicht aus dem Perlmutt stammt", und unter „Proteoglycan, welches nicht
aus dem Perlmutt stammt," gemäß der Erfindung
das Kollagen bzw. das Proteoglycan, welche für das Extraktionsmittel des
Schritts b) des vorliegenden Verfahrens eingesetzt werden, versteht.
Ebenso erklärt
sich der Ausdruck „wässrig-glycolische
Suspension" durch
die Tatsache, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung nicht nur
lösliche
Bestandteile (in wässrig-glycolischer Lösung), sondern
auch nicht lösliche
Bestandteile (insbesondere Aragonit) umfasst.
-
Außerdem sind
die Präferenzen,
die vorstehend für
das erfindungsgemäße Verfahren
aufgezählt
worden sind, selbstverständlich
auf diese Zusammensetzung anwendbar.
-
So
ist insbesondere das Kollagen, welches nicht aus dem Perlmutt stammt,
in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
vorzugsweise ein marines Kollagen und insbesondere ein marines Kollagen,
welches in der Gruppe bestehend aus dem „PANCOGENE® MARIN", dem „COLLAGENE
NATIF MARIN – Code
690" und den Mischungen
von diesen Letzteren ausgewählt
wird. Ebenso kann das Proteoglycan, welches nicht aus dem Perlmutt
stammt, ein jegliches Proteoglycan, welches den Fachleuten auf diesem
Gebiet bekannt ist, insbesondere ein jegliches nicht-schwefelhaltiges
Proteoglycan sein und wird insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, welche
aus Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Eparansulfat, Keratansulfat und
den Mischungen von diesen Letzteren gebildet wird, und ist insbesondere
Hyaluronsäure.
-
Wie
dies die nachfolgenden Beispiele detaillierter zeigen, weist diese
Zusammensetzung sehr interessante Eigenschaften gegenüber der
Haut und/oder den hornartigen Auswüchsen aus der Haut (Haare und sonstige
Behaarung, Nägel,
Zähne ...),
insbesondere Eigenschaften einer Geweberegeneration, welche beispielsweise
eine verbesserte Vernarbung erlauben, wie auch Anti-Alterungs-Eigenschaften,
welche erlauben, die mit der Alterung der Haut und/oder der hornartigen
Auswüchse
aus der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) verbundenen Auswirkungen
auf sichtbare Weise zu verhüten
und/oder zu verringern, auf. Auf der Ebene der verschiedenen Zelltypen
der Haut weist sie eine das physiologische Gleichgewicht zwischen
deren verschiedenen Bestandteilen wiederherstellende und regulierende
Wirkung auf. Insbesondere wirken deren organische und anorganische
Bestandteile insbesondere auf mehreren Ebenen auf den Stoffwechsel
der Keratinozyten ein. Diese Zusammensetzung erlaubt eine Restrukturierung
der Epidermis, welche zu einem besseren Schutz der tieferen Schichten
beiträgt.
Die Epidermis wird widerstandsfähiger,
tiefer und steht in kontinuierlicher Wechselwirkung mit der Dermis.
Außerdem
erlaubt diese Zusammensetzung eine Anreicherung an Elastin und an
Kollagenen. Die Haut ist elastischer und fester. Sie ist widerstandsfähig und
ihre Bestandteile erneuern sich in einem gleichmäßigen Rhythmus. Außerdem stabilisiert
diese Zusammensetzung die Pigmentsynthese und begünstigt die
Mikrozirkulation. Schließlich
weist diese Zusammensetzung den Vorteil einer vollständigen Unschädlichkeit
auf und jenen, eine entzündungshemmende
und folglich beruhigende Wirkung zu haben.
-
So
hat die Erfindung gleichfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung
zum Gegenstand, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als
Wirkstoff die neue Zusammensetzung, wie oben beschrieben, welche durch
das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden kann, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
-
Der
pharmazeutisch annehmbare Träger
ist vorzugsweise ein Träger,
der für
eine dermatologische Anwendung geeignet ist.
-
Die
Erfindung hat gleichfalls die Verwendung von dieser neuen Zusammensetzung,
wie oben beschrieben, welche durch das Verfahren, wie oben beschrieben,
erhalten werden kann, für
die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung von Störungen der
Geweberegeneration der Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus
der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) bestimmt ist, zum
Gegenstand.
-
Außerdem hat
die Erfindung die Verwendung der neuen Zusammensetzung, wie oben
beschrieben, welche durch das Verfahren, wie oben beschrieben, erhalten
werden kann, für
die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung von Störungen der
Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus der Haut (Haare und
sonstige Behaarung, Nägel,
Zähne ...),
welche mit dem Altern verbunden sind, bestimmt ist, zum Gegenstand.
-
Schließlich hat
die Erfindung die Verwendung der neuen Zusammensetzung, wie oben
beschrieben, welche durch das Verfahren, wie oben beschrieben, erhalten
werden kann, für
die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung von entzündlichen
Hauterscheinungen bestimmt ist, zum Gegenstand.
-
Die
Erfindung hat ferner eine kosmetische Zusammensetzung zum Gegenstand,
welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die neue Zusammensetzung,
wie oben beschrieben, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden kann, als kosmetisch wirksamen Wirkstoff und einen
kosmetisch annehmbaren Träger
umfasst.
-
Man
kann einen jeglichen kosmetischen Träger, der dem Fachmann auf diesem
Gebiet bekannt ist, einsetzen.
-
Selbstverständlich kann
die kosmetische Zusammensetzung gemäß der Erfindung außerdem Inhaltsstoffe
vom kosmetischen Typ, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt
sind, wie hydratisierende Mittel, lindernde Mittel oder ferner chemische
oder organische Filter, enthalten.
-
Die
pharmazeutischen und kosmetischen Zusammensetzungen, die oben beschrieben
worden sind, können
insbesondere in Form einer Creme, einer Pomade, eines Gels, einer
Lotion, einer Öl-in-Wasser-Emulsion,
einer Wasser-in-Öl-Emulsion
vorliegen oder können
mit einem jeglichen pharmazeutisch oder kosmetisch annehmbaren Vehikel,
wie Liposomen, kombiniert werden.
-
Außerdem hat
die Erfindung die Verwendung der neuen Zusammensetzung, wie oben
beschrieben, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden
kann, für
die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, welche für die kosmetische
Behandlung für
die Geweberegeneration der Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus
der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) bestimmt ist, zum Gegenstand.
-
Außerdem hat
die Erfindung die Verwendung der neuen Zusammensetzung, wie oben
beschrieben, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden
kann, für
die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, welche für die kosmetische
Behandlung der Modifikationen, die mit dem Altern der Haut und/oder
der hornartigen Auswüchse
aus der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) verbunden sind, bestimmt
ist, zum Gegenstand.
-
Die
Erfindung hat schließlich
ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung für die Geweberegeneration der
Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus der Haut (Haare und
sonstige Behaarung, Nägel,
Zähne ...)
zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf
die Haut und/oder die hornartigen Auswüchse aus der Haut (Haare und
sonstige Behaarung, Nägel,
Zähne ...)
die neue Zusammensetzung, wie oben beschrieben, welche durch das
erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden kann, aufträgt.
-
Die
Erfindung hat außerdem
ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung der mit dem Altern der
Haut und/oder der hornartigen Auswüchse aus der Haut (Haare und
sonstige Behaarung, Nägel,
Zähne ...)
verbundenen Modifikationen zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet
ist, dass man auf die Haut und/oder die hornartigen Auswüchse aus
der Haut (Haare und sonstige Behaarung, Nägel, Zähne ...) die neue Zusammensetzung,
wie oben beschrieben, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden kann, aufträgt.
-
Die 1 und 2 stellen
einen Western-Blot einer Zusammensetzung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren
hergestellt worden ist, dar.
-
Die 3 stellt
ein Histogramm der Gesamtzusammensetzung an Aminosäuren der
Protein-Phase einer
durch das erfindungsgemäße Verfahren
hergestellten Zusammensetzung dar.
-
Die 4 und 5 sind
Photographien, die die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf die Synthese von Zytokeratinen durch humane
Keratinozyten veranschaulichen.
-
Die 6 und 7 sind
Photographien, die die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf humane Keratinozyten in Kultur, denen Östradiol
entzogen worden ist, veranschaulichen.
-
Die 8 und 9 sind
Photographien, die die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf die Synthese von Zytokeratinen durch humane
Keratinozyten in Kultur, denen Östradiol entzogen
worden ist, veranschaulichen.
-
Die 10 und 11 sind
Photographien, die die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzung
auf die Synthese von Elastin durch humane Fibroblasten veranschaulichen.
-
Die 12 und 13 sind
Photographien, die die Wirkung der Östrogene auf humane Fibroblasten veranschaulichen.
-
Die 14 und 15 sind
Photographien, die die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzung
auf humane Fibroblasten, denen Östradiol
entzogen worden ist, veranschaulichen.
-
Die 16 ist
ein Histogramm, welches die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf die Melanozyten durch die Modifizierung der
Melanin-Menge, welche durch in Kultur gehaltene Keratinozyten in
Gegenwart der Zusammensetzung eingefangen wird, veranschaulicht.
-
Die 17 und 18 sind
Photographien, welche die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf die durch humane, kultivierte Keratinozyten
eingefangene Melanin-Menge veranschaulichen.
-
Die 19 ist
ein Histogramm, welches die Wirkung der gemäß der Erfindung hergestellten
Zusammensetzung auf die Sekretion von Interleukin 1 (IL-1) durch
die promyelozytären
HL60-Zellen veranschaulicht.
-
Schließlich ist
die 20 ein Histogramm, welches die Untersuchung der
nicht vorhandenen Zytotoxizität
der gemäß der Erfindung
hergestellten Zusammensetzung veranschaulicht.
-
Die
folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung zu veranschaulichen,
dürfen
aber in keinem Falle so interpretiert werden, dass sie deren Umfang
einschränken
könnten.
-
Beispiel 1: Verfahren
zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung
-
Das
eingesetzte Material muss ein Material vom unter Vakuum gut dichten
Typ, vorzugsweise aus Inox, sein. Es muss vorab sauber gewaschen
und gespült
werden derart, dass ein jegliches Risiko von bakteriellen Verunreinigungen
vermieden wird.
-
1.1)
Man setzt Perlmutt von Pinctada maxima, welches bereits von dem äußeren Teil
der Schale (Periostracum) befreit und in Form von unregelmäßigen Fragmenten überführt worden
ist (geliefert von der Firma Pharma Futura, 10, rue de Charonne,
75012 PARIS), ein. Die Fragmente haben eine Größe zwischen 2 und 5 cm Länge und
0,3 cm Dicke.
-
Man
führt ein
sehr schnelles dekontaminierendes Waschen ohne Eintauchen der Fragmente
in einer Lösung
von Natriumhypochlorit mit 6,6% aktivem Chlor (12°), dann eine
unverzügliche
Trocknung derart, dass jegliche Spuren von Wasser entfernt werden,
aus.
-
Das
Schleifen für
die Mikronisierung muss trocken in ausschließlich für diesen Zweck reservierten
großen
Krügen
aus Zirconium, die zuvor gewaschen (Bleichlauge + Spülen + Waschen
mit destilliertem Wasser) und in der Wärme sterilisiert worden sind,
ausgeführt
werden. Die Zerkleinerung erfolgt mittels Zirconium-Kugeln, die
ihrerseits ebenfalls sterilisiert worden sind.
-
Das
so erhaltene mikronisierte Perlmuttpulver weist eine Granulometrie
zwischen 50 und 150 μm
eingeschlossen auf. Es wird dann durch Bestrahlung mit 2,5 Mrad γ-Strahlen
sterilisiert.
-
Das
so hergestellte mikronisierte Perlmuttpulver weist die folgenden
Eigenschaften auf:
– Aussehen: | pulverförmig |
– Farbe: | weiß |
– Geruch: | charakteristisch
für Perlmutt |
– Arsen: | < 1 ppm |
– Schwermetalle: | < 10 ppm. |
Bakteriologische
Analyse:
– Anzahl
von aeroben Keimen: | 1550/g |
– Feuchtigkeitsgehalt | 0,3%. |
-
1.2)
Man stellt die folgende Mischung her: 400 g Perlmuttpulver von Pinctada
maxima, das wie oben beschrieben mikronisiert worden ist (Granulometrie
zwischen 50 und 150 μm
eingeschlossen), werden nach und nach zu 600 ml eines Extraktionsmittels
in Form einer wässrig-glycolischen Lösung (Wasser
und Ethylenglycol gemäß einem
jeweiligen Gewichtsverhältnis
von 10:1), umfassend 0,18 Gew.-% marines Kollagen „PANCOGENE® MARIN" (vertrieben von
der Firma Gattefossé;
Saint Priest, Frankreich; INCI-Bezeichnung: „Soluble Collagen"; Bezeichnungsweise
in Japan: „water
soluble collagen";
MHV: 20800CZY0010000) und 0,2 Gew.-% Hyaluronsäure (vertrieben von der Firma
Laboratoire Industriel de Biologie; Soisy Sous Montmorency, Frankreich)
bezogen auf das Gesamtgewicht des Extraktionsmittels, unter Rühren mit
ungefähr
4000 Umdrehungen/Minute und bei einer Temperatur von ungefähr 20°C zugesetzt.
Nachdem die Zugabe beendet worden ist, behält man das Rühren und
die Temperatur 60 min bei. Das Rühren
muss stark und homogen sein derart, dass alle Teilchen der Mischung
in Kontakt gebracht werden und eine die Extraktion ermöglichende
Umhüllung ermöglicht wird.
-
Man
lässt die
Mischung dann 6 h ruhen.
-
Die
so erhaltene Zusammensetzung besteht aus einer teilchenförmigen,
gebrochen weißen
festen Phase in Suspension in einer flüssigen Phase und mit einem
pH von ungefähr
8.
-
Diese
Zusammensetzung umfasst:
- – Aragonit (CaCO3);
- – marine
Spurenelemente: Natrium, Magnesium, Lanthan, Zink, Brom, Cäsium, Eisen,
Mangan, Chlor, Kupfer, Kalium, Calcium, Strontium und Schwefel (siehe
die nachfolgende Tabelle 1);
- – faserförmige Proteine:
verschiedene Arten von Proteinen, die mit den marinen Kollagenen
verwandt sind, welche als altertümliche
Kollagene des Perlmutts angesehen werden können, und das marine Kollagen „PANCOGENE® MARIN";
- – nicht-faserförmige Proteine:
Proteoglycane, darunter Hyaluronsäure des Perlmutts und des Extraktionsmittels,
wie auch Adhäsionsproteine
des Perlmutts (Decorin rp und Zytokine rp, wobei „rp" „related peptides or proteins" oder „verwandte
Peptide oder Proteine" bezeichnet,
d.h. Peptide oder Proteine, die mit Decorin bzw. dem Zytokin verwandt
sind unter der Maßgabe,
dass sie durch die gegen diese letzteren Moleküle gerichteten Antikörper erkannt
werden).
-
Die
Techniken, die für
die Identifizierung der Peptide und Proteine im Rahmen der Erfindung
eingesetzt werden, sind jene, die in den folgenden Artikeln beschrieben
werden:
- – Elektrophorese – SDS-Page-Methode:
Laemmli-Methode, Nature 1970, 227 680–682;
- – Immuntransfer:
Western-Blot nach Towbin, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76(9): 4350–4354,
und Burnette, W. N., 1981, Analytical Biochemistry 112: 195–203.
-
Die
entsprechenden Western-Blots sind in den 1 und 2 angegeben.
-
Die
Aminosäureanalyse
der Proteinphase zeigt das Vorhandensein von Asparaginsäure, Threonin, Serin,
Glutaminsäure,
Glycin, Alanin, Prolin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin,
Phenylalanin, Histidin, Lysin und Arginin an. Die 3 stellt
ein Histogramm der Gesamtzusammensetzung an Aminosäuren dar.
-
Die
wie oben beschrieben erhaltene Zusammensetzung wird im Folgenden
als „Zusammensetzung
A" bezeichnet.
-
Tabelle
1: Quantitative Analyse der in der Zusammensetzung A enthaltenen
Spurenelemente
-
Beispiel 2: Untersuchung
der Aktivität
der Zusammensetzung A
-
Die
wissenschaftliche, histologische und zytologische Untersuchung,
die entweder in vivo-Tiermodelle oder
Kulturen von humanen Zellen unter Rückgriff auf die Mikroskopie
und auf die modernsten Techniken zur Detektion von Substanzen durch
Immunologie und Immunzytochemie einsetzt, erlaubt gegenwärtig eine
Untersuchung in zellulärem
Maßstab,
die in der Praxis ausgeführt
worden ist, um die aktiven Substanzen dieser Zusammensetzung A experimentell
zu testen.
-
Diese
Untersuchung ist im Wesentlichen an drei Arten von Zellen ausgeführt worden
mit der Maßgabe, dass
diese auf bekannte Weise eine bedeutende Rolle bei der Struktur,
dem Funktionieren und der Pigmentierung des Hautgewebes spielen:
den Keratinozyten, den Fibroblasten und den Melanozyten. Die beiden
Zellarten Keratinozyten und Fibroblasten weisen die Rezeptoren auf,
die für
die aktiven Substanzen der Zusammensetzung A und insbesondere der
Gesamtheit der Bestandteile des Perlmutts, die darin vorhanden sind, spezifisch
sind, was eine Kaskade von Botschaften zur Folge hat, die die Ebene
der tiefsten Schichten der Dermis erreichen können.
-
Die
Untersuchung erstreckte sich nicht nur auf deren morphologisches
Aussehen, sondern auch auf das Verhalten von deren bedeutenderen
Bestandteilen, Kernen und Zytoplasma, welche Zeuge sind für deren Syntheseaktivität und deren
Erneuerungsvermögen.
Das Vorhandensein von bestimmten aktiven Substanzen wie auch jenes
von sekretierten Strukturproteinen wurde gleichfalls identifiziert.
-
1.1) Aktivität der Zusammensetzung
A auf die Keratinozyten: Synthese von Zytokeratinen durch humane
Keratinozyten, die in Gegenwart der Zusammensetzung A kultiviert
werden
-
1.1.1) Methode
-
Die
Keratinozyten sind die am weitesten außen gelegenen Zellen unseres
Körpers.
Sie bilden unsere erste Schutzbarriere. Die Keratinozyten intervenieren,
indem sie passiv und aktiv wirksam werden. Es ist das Bilden einer
Barriere, die die Rolle eines Schutzschilds spielt, auf welche Weise
die Keratinozyten den passiven Schutz ausüben. Dieses Schutzschild wird
ausgehend von entwässerten
und kernlosen Zellen hergestellt. Der starke Zusammenhalt der Zellen
erlaubt, ein sehr homogenes System sicherzustellen. Die Keratinozyten synthetisieren
Substanzen, die Zytokeratine, die sie in ihrem Zytoplasma aufbewahren,
um diese Barriere zu strukturieren. Die Zytokeratine bilden das
interne Gerüst
der Keratinozyten. Dieses interne Gerüst verleiht diesen Zellen ihr
Volumen und erhöht
deren Fähigkeit
zur interzellulären
Kommuni kation und vereinfacht das Einfangen von Melanin. Je reicher
die Epidermis an Zytokeratinen ist, umso effizienter wird sie sein
und der Haut ihr junges Aussehen verleihen. Indem der Kontakt zwischen
den Zellen erleichtert wird, verhindern die Zytokeratine den Verlust
der NMS („Natural
Moisturizing Factors":
natürliche
Hydratisierungsfaktoren, wie Ceramide, Cholesterol und Fettsäuren).
-
Der
aktive Schutz der Haut ist mit der Tatsache verbunden, dass die
Keratinozyten die ersten Zellen unseres Körpers sind, die mit der Außenwelt
in Kontakt stehen. Sie haben folglich ein ganzes Sortiment von Bestandteilen
entwickelt, welche dazu bestimmt sind, unseren Organismus über etwaige
Veränderungen
der Bedingungen unserer Umwelt zu informieren. Dafür sind diese
Zellen in der Lage, Wachstumsfaktoren zu synthetisieren, die dazu
bestimmt sind, die darunter liegenden Zellen der Dermis (Fibroblasten)
zu stimulieren, insbesondere das „PTH related peptide" (PTHrp), welches
hauptsächlich
durch die Keratinozyten synthetisiert wird und dafür bekannt
ist, ein Zelldifferenzierungsfaktor zu sein.
-
Die
eingesetzte Methode war die folgende. Sie setzt eine schnelle halbquantitative
Technik ein, die erlaubt, den Gehalt von jedem der sekretierten
Proteine, die in dem zellulären
Zytoplasma vorhanden sind, zu bestimmen.
-
4 × 104 Zellen werden pro Kammer von 0,9 cm2 (Platte mit 8 Kammern, NUNC) angeimpft
und eine Nacht kultiviert. Nach Spülen mit HBSS-Puffer wird das
Medium mit 1% der Zusammensetzung A oder das Kontrollmedium (mit
0% Zusammensetzung A) zugesetzt (450 μl pro Kammer).
-
Die
Kulturen werden 48 h inkubiert. Nach Entfernung der Überstände und
Spülen
der Kulturen werden die Zellen mit Paraformaldehyd 30 min bei 4°C fixiert,
dann mit PBS-Puffer gespült.
-
200 μl primäre Anti-Zytokeratin-Antikörper werden
zugesetzt. Die Inkubation dauert 30 min bei Umgebungstemperatur.
Dann werden die Überstände entfernt
und die Zellen werden mit PBS gespült.
-
Es
werden 200 μl
sekundäre
Antikörper,
welche den primären
Antikörper
erkennen und mit einem fluoreszierenden Marker, in diesem Falle
Fluorescein, gekoppelt sind, zugesetzt. Nach 30 min Inkubation bei
Umgebungstemperatur werden die Überstände entfernt
und die Zellen werden mit PBS gespült. Die Platten werden dann
eingedeckt, dann mittels des umgekehrten Fluoreszenzmikroskops untersucht
(Detektion von intrazytoplasmatischen Zytokeratinen durch Immunfluoreszenz).
-
Die
Menge an durch die Zellen synthetisierten und so markierten Proteinen,
in diesem Falle Zytokeratine, ist proportional zu der Fluoreszenzintensität, die aus
der immunologischen Markierung resultiert.
-
1.1.2) Ergebnisse
-
Wie
die 4 und 5 zeigen, hat die Zugabe von
0,5% der Zusammensetzung A zu dem Kulturmedium der Keratinozyten
zur Wirkung, die Synthese der Zytokeratine zu erhöhen. Die
Zusammensetzung A stellt die Aktivität der Keratinozyten, die aus
gealterter Haut stammen, wie auch die Sekretion von Zytokeratinen
durch diese Keratinozyten wieder her (Wirkung auf Keratinozyten,
denen Östradiol
entzogen wurde; siehe 6, 7 und 8, 9).
-
Außerdem wird
die Synthese von Calcium-abhängigem
PTHrp durch die Keratinozyten in Gegenwart der Zusammensetzung A
stimuliert. Das PTHrp, welches hauptsächlich durch die Keratinozyten
synthetisiert wird, ist in Gegenwart von Calciumionen, welche durch
die Zusammensetzung A geliefert werden, besonders aktiv und wirkt
in Synergie mit den Zytokinen der gesamten organischen Matrix des
Perlmutts, die in der Zusammensetzung A vorhanden ist.
-
Decorin,
das bedeutende Adhäsionsprotein
der Hautregeneration, wird gleichfalls in Gegenwart der Zusammensetzung
A stimuliert.
-
Die
Cadherine, Calcium-abhängige
Adhäsionsproteine,
sind ebenfalls in großem
Ausmaß für den Zusammenhalt
verantwortlich. Sie werden in Gegenwart der Zusammensetzung A stimuliert.
-
1.2) Aktivität der Zusammensetzung
A auf die Fibroblasten, Elastin-Synthese
-
1.2.1) Synthese von Elastin
durch humane Fibroblasten, die in Gegenwart der Zusammensetzung
A kultiviert werden.
-
Die
eingesetzte Methode ist die gleiche wie jene, die in dem obigen
Paragraph 1.1.1) für
die Untersuchung an den Keratinozyten beschrieben worden ist.
-
Wie
aus den 10 und 11 hervorgeht,
stimuliert die Zusammensetzung A in einer Konzentration von 1% stark
die Elastin-Synthese durch die humanen Fibroblasten.
-
1.2.2) Vergleich der Wirkung
der Östrogene
und von Biocrystal maxima m. auf humane Fibroblasten in Kultur (12, 13, 14 und 15).
-
Die
wenig aktiven reifen Fibroblasten haben eine sehr längliche,
abgeflachte Form und weisen dichte Kerne auf. Die aktiven Fibroblasten
haben Kerne von großer
Größe, abgerundet,
mit voluminösen
Nukleolen, welche den aktiven Syntheseprozess belegen. Der Typ „aktiver
Fibroblast" wird
in den Kulturen von Haut-Explantaten, die einer Frau von 50 Jahren
unter Hormonersatzbehandlung entnommen worden sind, beobachtet.
-
Der
Entzug von Östrogenen
in dem Kulturmedium ruft eine drastische Inaktivierung der Zellen
hervor. Sie sind nicht länger
anhaftend und auch nicht konfluent, bestimmte zeigen einen Beginn
von Pyknose.
-
Die 12 und 14 veranschaulichen
die Wirkung der Zusammensetzung A auf humane Fibroblasten, die aus
Explantaten einer in der Menopause befindlichen Frau von 50 Jahren
(folglich mit geringer Sekretion von Östrogenen) unter Substitutionsbehandlung
stammen.
-
Die 13 und 15 veranschaulichen
die Wirkung der Zusammensetzung A auf humane Fibroblasten, denen Östradiol
entzogen wurde, die aus Explantaten einer in der Menopause befindlichen
Frau von 50 Jahren unter Substitutionsbehandlung stammen.
-
Wie
aus diesen 12 bis 15 hervorgeht,
stellt die Zusammensetzung A, die zu dem Kulturmedium in einer Konzentration
von 1% hinzugesetzt wird, die Aktivität der auf Entzug gesetzten
Fibroblasten vollständig
wieder her. Die Wirkung der Zusammensetzung A ist bemerkenswert:
die Fibroblasten haben einen gut entwickelten, sehr klaren Kern
mit einem hervorragenden Nukleolus. ihre spindelförmigen Zellkörper orientieren
sich und sind konfluent, was diesen Zellaustausche erlaubt. Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten, indem an Zellen, die aus Explantaten
von junger Haut stammten, gearbeitet wurde.
-
1.3) Aktivität der Zusammensetzung
A auf die Melanozyten: Modifizierung der Menge von Melanin, die
durch in Gegenwart der Zusammensetzung A kultivierte Keratinozyten
eingefangen wird.
-
1.3.1) Methode
-
Die
Melanozyten sind die Pigmentzellen, die für die Synthese von Melanin
verantwortlich sind, eines Pigments, das die Ursache für die Farbe
unserer Haut ist. Die melanozytären
Zellen machen ungefähr
2 bis 4% der gesamten Epidermis-Population aus. Die homogene Farbe
der Haut ist auf eine Verteilung des Pigments auf der gesamten Hautoberfläche dank
des Transfers des Melanins in Form von Melanosomen von den sekretorischen
Zellen (Melanozyten) in Richtung der benachbarten Keratinozyten,
die dieses einfangen, zurückzuführen.
-
Die
Methode besteht darin, eine Cokultivierung von Keratinozyten/Melanozyten
mit einer quantitativen Bestimmung des Melanins auszuführen.
-
Die
Keratinozyten und die Melanozyten sind alle beide Zellpopulationen,
die sich auf der Ebene der Epidermis befinden. Sie werden ausgehend
von einer Hautprobe nach Entfernung der Dermis und enzymatischem
Verdau der Epidermis erhalten. Die so isolierten epidermalen Zellen
werden mittels eines Coulter-Counters (Coultronics) gezählt, dann
werden sie in einem klassischen Kulturmedium vom Typ „Dulbecco modified" (Eagle-Medium),
ergänzt
mit Glutamin, Streptomycin/Penicillin und 10% fötalem Kälberserum, in Kultur genommen.
Die Prozentsätze
werden abhängig
von den erhaltenen Ergebnissen eingestellt. Dieses Medium erlaubt
das Überleben
der Melanozyten und der Keratinozyten.
-
Nach
4 Tagen Inkubation in Gegenwart der Zusammensetzung A werden die
Zellen durch eine NaOH/DMSO-Mischung aufgeschlossen, dann wird der Überstand
nach Zentrifugation gewonnen. Das Ablesen erfolgt bei 470 nm.
-
1.3.2) Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt und
werden durch das Histogramm in der 16 angegeben.
-
Tabelle
2: μg Melanin,
das durch die Keratinozyten eingefangen wird
-
Das
Vorhandensein von 1% der Zusammensetzung A ruft bei Vereidung von
punktuellen Konzentrierungen eine signifikante Veränderung
der Verteilung des durch die Keratinozyten eingefangenen Melanins
hervor (siehe die 17 und 18).
-
1.4) Nachweis der Stimulation
der Keratinozyten und der Fibroblasten durch die Zusammensetzung
A durch Immunzytochemie
-
1.4.1) Methode
-
Es
handelt sich um eine schnelle halbquantitative Technik, die erlaubt,
den Gehalt von jedem der Proteine (Zytokeratin und Elastin), die
im zellulären
Zytoplasma vorhanden sind, zu bestimmen. 4 × 104 Zellen
werden pro Kammer von 0,9 cm2 (Platte mit
8 Kammern, NUNC) angeimpft und eine Nacht kultiviert. Nach Spülen mit
HBSS-Puffer wird das Medium mit 1% der Zusammensetzung A oder das
Kontrollmedium (mit 0% Zusammensetzung A) zugesetzt (450 μl pro Kammer).
Die Kulturen werden 48 h inkubiert. Nach Entfernung der Überstände und
Spülen
der Kulturen werden die Zellen mit Paraformaldehyd 30 min bei 4°C fixiert,
dann mit PBS-Puffer gespült.
200 μl Anti-Zytokeratin-
und/oder Anti-Elastin-Antikörper
werden zugesetzt. Die Inkubation dauert 30 min bei Umgebungstemperatur.
Dann werden die Überstände entfernt
und die Zellen werden mit PBS gespült. Es werden 200 μl des sekundären Antikörpers, welcher
mit Fluorescein konjugiert ist, zugesetzt. Nach 30 min Inkubation
bei Umgebungstemperatur werden die Überstände entfernt und die Zellen
werden mit PBS gespült.
Die Platten werden dann eingedeckt, dann mittels des umgekehrten
Fluoreszenzmikroskops untersucht. Die Mengen an durch die Zellen
synthetisiertem Elastin oder Zytokeratin sind proportional zu der
Fluoreszenzintensität.
-
1.4.2) Ergebnisse
-
Das
Hinzufügen
von 1% der Zusammensetzung A zu dem Kulturmedium der Keratinozyten
hat zur Wirkung, die Synthese der Zytokeratine durch die keratinozytären Zellen
der Epidermis zu erhöhen.
Diese Stimulation wurde in bedeutender Weise ab 0,5% der Zusammensetzung
A beobachtet.
-
Wenn
die Fibroblasten in vitro in Gegenwart der Zusammensetzung A (in
einer Konzentration von 1%) inkubiert werden, erlebt man nach 48
h eine sehr deutliche Erhöhung
der Intensität
der Fluoreszenz, welche so eine Stimulation der Synthese des Elastins
durch die Fibroblasten der Dermis zum Ausdruck bringt.
-
1.5) Entzündungshemmende
Aktivität
der Zusammensetzung A: quantitative Bestimmung von Interleukin 1 (IL-1),
welches durch die durch die Zusammensetzung A behandelten promyelozytären HL60-Zellen
sekretiert wird
-
Während eines
Entzündungsprozesses
erlebt man zu allererst eine Wanderung einer großen Anzahl von Entzündungszellen
des peripheren Bluts in Richtung der Entzündungsorte, dann eine bedeutende
Sekretion von bestimmten Zytokinen und insbesondere von IL-1 im
Bereich dieser Stellen. Es wird davon ausgegangen, dass diesem Letzteren
eine bedeutende Rolle zukommt.
-
Im
Rahmen dieser Untersuchung wird die Sekretion von IL-1 gemessen,
indem eine HL-60-Zelllinie
in Gegenwart der Zusammensetzung A verwendet wird.
-
Die
Produktion von IL-1 wird durch Zugabe von Phytohämagglutinin (PHA), welches
ein starker Stimulator der Sekretion von IL-1 ist, zu dem Kulturmedium
verstärkt.
IL-1 wird durch die klassische Technik der immunologischen Quantifizierung
durch ELISA mit Hilfe eines gegen humanes IL-1 gerichteten spezifischen
Antikörpers
quantifiziert.
-
1.5.2) Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt und
werden durch das Histogramm in der 19 dargestellt.
-
Tabelle
3: Nachweis der Wirkung der Zusammensetzung A auf die Produktion
von Interleukin 1 (IL-1, in Picogramm), welches durch die promyelozytären Zellen
sekretiert wird
-
In
Gegenwart von 1% der Zusammensetzung A beobachtet man folglich eine
signifikante Verringerung der Synthese von IL-1, welche so eine
sehr deutliche entzündungshemmende
Wirkung der Zusammensetzung A zum Ausdruck bringt. Diese in vitro-Wirkung
war gleichfalls während
Implantationen, die in vivo bei der Ratte vorgenommen worden waren,
beobachtet worden.
-
1.6) Toxizitätstest.
Nachweis der nicht vorhandenen Toxizität der Zusammensetzung A: M.
T. T.-Test von mitochondrialer Aktivität
-
1.6.1) Methode
-
Es
handelt sich um einen kolorimetrischen Test, der auf der Reduktion
eines Tetrazoliumsalzes (M. T. T.) durch die mitochondriale NADPH-Reduktase
von lebenden Zellen in ein blau-violettes Formazan-Produkt basiert.
-
2 × 104 Zellen in 200 μl Kulturmedium werden in jede
Vertiefung (Platte 96, NUNC) angeimpft, dann eine Nacht inkubiert,
um es diesen zu erlauben, sich gut an den Kunststoff anzuheften.
Nach Spülen
der Zellen mit Medium ohne Serum werden die unterschiedlichen Konzentrationen,
die in dem Kulturmedium enthalten sind (1%, 0,5% und 0,1% der Zusammensetzung
A), oder das Vergleichsmedium (0% Zusammensetzung A) in einer Menge
von 200 μl/Vertiefung
zugesetzt.
-
Nach
48 h Inkubation werden die Überstände entfernt
und die Zellen werden mit HBSS-Puffer gespült. 100 μl Kulturmedium, welches 20%
einer M. T. T.(3-4,5-Dimethylthiazol-2-gamma-1-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; „Thiazolyl
Blue")-Lösung enthält, werden
zu jeder Vertiefung hinzugesetzt. Die Reaktion erfolgt während 2
h in einem Brutschrank bei 37°C
mit 5% CO2.
-
Um
eine bessere Solubilisierung der Formazan-Kristalle zu ermöglichen,
werden 100 μl
0,04 N HCl in Isopropanol zugesetzt, dann wird die Farbreaktion
bei einer Wellenlänge
von 570 nm durch ein Mikroplatten-Lesegerät abgelesen. Die Werte sind
gleichfalls in optischer Dichte ausgedrückt.
-
1.6.2) Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt und
werden durch das Histogramm in der 20 angegeben.
-
Tabelle
4: Gemessene optische Dichten
-
Das
Vorhandensein der Zusammensetzung A in dem Kulturmedium hat folglich
eine bedeutende Erhöhung
der zellulären
mitochondrialen Aktivität
zur Folge. Diese Stimulation der enzymatischen Aktivität ist dosisabhängig: je
höher die
Konzentration an Zusammensetzung A ist, umso höher ist die Aktivität. Jedoch
ist unabhängig
von dem Gehalt des Mediums an Zusammensetzung A die mitochondriale
Aktivität
der Zellen deutlich höher
als jene der nicht durch die Zusammensetzung A behandelten Vergleichszellen.
-
2.7) Schlussfolgerungen
hinsichtlich der in vitro ausgewerteten Aktivität der Zusammensetzung A
-
Die
Zusammensetzung A wirkt direkt auf die oberflächlichsten Schichten der Epidermis.
-
Die
organischen und anorganischen Bestandteile dieses Extrakts kommen
auf mehreren Ebenen in dem Stoffwechsel der Keratinozyten zum Ausdruck,
indem sie auf die Aktivität
der Zellen der Basalschicht wirken.
-
Zuallererst
werden Zellwachstum/Zellvermehrung, die Zellteilung und die Zelldifferenzierung
stimuliert, dann werden die spezifischen Synthesen der Keratinozyten
verstärkt,
insbesondere jene der Zytokeratine und die Mediatorsubstanzen, die
für das
gute Funktionieren der Dermis bestimmt sind, wie beispielsweise PTHrp,
welches die Kaskade von interzellulären Kommunikationen begünstigt.
-
Die
Abfolge der Differenzierung der basalen, sternförmigen, dann granulären Keratinozyten,
wird stimuliert und reguliert ohne Erhöhung der Anzahl der Zellen.
-
Die
regulierte Erhöhung
der Anzahl der Keratinozyten verbessert die Struktur der Epidermis
und die dermo-epidermalen Verbindungen. Die Restrukturierung der
Epidermis trägt
zu einem besseren Schutz der tiefsten Schichten bei.
-
Die
Verbesserung der spezifischen Synthesen, wie jenen der Zytokeratine,
stabilisiert die Pigmentsynthesen und stellt eine physiologische
Wiederherstellung (Verteilung) des Melanins innerhalb der Keratinozyten sicher,
welche durch das Fehlen von punktuellen Konzentrierungen zum Ausdruck
kommt. Die Verbesserung des kutanen Schutzes erfolgt, ohne eine
abnormale Verdickung der Haut zu induzieren, was alles dazu beiträgt, die
schichtenförmigen
Anordnungen von Zellen auf der dermo-epidermalen Verbindung zu vertiefen.
-
Es
ist unter der Gesamtheit der Mediatorsubstanzen, die durch die Keratinozyten
exprimiert werden, dass man Substanzen, welche dazu beitragen, die
Antwort von Zellen auf Aggression und Entzündungen zu verbessern, wie
auch die Kommunikationsfaktoren, welche die physiologischen Austausche
zwischen Epidermis und Dermis erlauben, findet. Die zelluläre Erneuerung
der Epidermis, die 4 bis 6 Wochen beträgt, wird in ihrem physiologischen
Rhythmus aufrechterhalten.
-
Die
Amplifizierung der Synthese der Mediatorsubstanzen erhöht die Rekrutierung
einer ganzen Gruppe von Zellen und es ist unter diesen Mediatorsubstanzen,
dass man das Decorin findet, welches durch die Zusammensetzung A
auf dem Niveau der Epidermis zugeführt wird.
-
2.7.1) Auf dem Niveau
der Epidermis
-
Indem
die Synthese von PTHrp aktiviert wird, wirkt die Zusammensetzung
A auf das Wachstum/die Vermehrung und die Differenzierung der Keratinozyten.
Dieser Effekt ist Calcium-abhängig, woraus
der Nutzen des Vorhandenseins des ionisierten Calciums in der Zusammensetzung
A resultiert.
-
Die
Induktion der Zellteilung und des Mitose-Index im Bereich der Keimschicht
kommt in einer wirklichen Restrukturierung der Epidermis zum Ausdruck,
die widerstandsfähiger,
tiefer wird und in kontinuierlicher Wechselwirkung mit der Dermis,
die sie vor der Dehydratisierung schützt, steht.
-
2.7.2) Auf dem Niveau
der Dermis
-
Die
durch die örtlichen,
im Bereich der Epidermis freigesetzten Mediatorsubstanzen ausgelöste Stimulationskaskade
ruft die Synthese einer sehr umfangreichen extrazellulären Matrix
durch die Fibroblasten hervor. Diese ist sehr strukturiert. Sie
besteht insbesondere aus Proteoglycanen, Kollagen und Adhäsionsproteinen,
insbesondere Decorin, einem Adhäsionsprotein,
welches eine bedeutende Rolle bei den Restrukturierungsphänomenen
der Haut (oder der Regeneration der kutanen Gewebe) spielt. Sie
fängt die
Zytokine und andere Wachstumsfaktoren ein. Diese Beobachtungen wurden
gleichfalls in vivo bei der Ratte festgestellt.
-
Außerdem erlaubt
die Anreicherung an Elastin unter der Einwirkung der Zusammensetzung
A, dessen Fasern in der Bindehautschicht besser orientiert sind,
es den kutanen Geweben, ihre Geschmeidigkeit und ihre Form während physiologischer
Verfallserscheinungen, die entweder durch Mangelzustände und
das Alter oder durch Angriffe, insbesondere Dehnungen, bewirkt werden,
zu bewahren.
-
Die
turgeszenten Fibroblasten werden in dem Bereich der Vorläuferstammzellen
in ausreichender Anzahl rekrutiert, so dass der Effekt, der auf
deren Wirkung zurückzuführen ist,
und deren Anwesenheit dauerhaft sind. Dieser Effekt wird durch eine
verstärkte
Mikrovaskularisierung unterhalten.
-
Die
Haut ist elastischer und fester. Sie ist widerstandsfähig. Ihre
Bestandteile erneuern sich in einem gleichmäßigen Rhythmus.
-
Auf
der Ebene der verschiedenen Zelltypen der Haut weist die Zusammensetzung
A eine das physiologische Gleichgewicht zwischen deren unterschiedlichen
Bestandteilen wiederherstellende und regulierende Wirkung auf. Außerdem weist
sie den Vorteil einer vollständigen
Unschädlichkeit
und jenen, eine entzündungshemmende
und folglich beruhigende Wirkung zu haben, auf.
-
Beispiel
3: Hydratisierende Creme