DE69827417T2

DE69827417T2 - Tizoxanide und/oder Nitazoxanide enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE69827417T2
Application number: DE69827417T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Rossignol
Original assignee: Romark Laboratories LC
Current assignee: Romark Laboratories LC
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: LV12492B; EP1222921B1; SI20149A; EE9900578A; NO995406D0; NO335781B1; EP1005342B1; SK283946B6; CN1158074C; LV12492A; IS5223A; AP1103A; CZ391199A3; AU740022B2; EP1005342A1; SI20149B; NO20021832L; NO313983B1; HU229641B1; PT1005342E

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Formel (I)
und die weiter wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure enthält.
Der Wirkstoff liegt vorzugsweise in Form von Teilchen mit einer kleineren Teilchengröße als 200 μm und einer mittleren Teilchengröße von mehr als 10 μm vor.
Die Erfindung betrifft insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die mit wenigstens einer pharmazeutisch annehmbaren Säure stabilisiert sind.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders nützlich zur Behandlung opportunistischer Infektionen bei Personen mit beeinträchtigten oder unterdrückten Immunsystemen und bei der Behandlung von Infektionen mit Trematoden.
Beschreibung des Standes der Technik
Es besteht ein dringendes Bedürfnis nach der Entwicklung von Verfahren zur Behandlung einer Reihe von parasitischen und bakteriellen Infektionen bei Menschen mit beeinträchtigten Immunsystemen (AIDS, Krebspatienten, ältere Menschen, alternde Menschen, Organtransplantationspatienten auf Immunsuppressiva). Ein weiterer Bereich der Besorgnis sind Trematoden-Infektionen, insbesondere in tropischen Klimazonen. Es besteht somit ein Bedürfnis nach einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die selbst von Menschen mit beeinträchtigtem Immunsystem toleriert werden kann und die selbst in tropischen Umgebungen lagerstabil ist.
Genauer gesagt ist Toxoplasma gondii ein Protozoan und ist unter den häufigsten Ursachen für latente Infektion des zentralen Nervensystems in der ganzen Welt. Viele gesunde Menschen sind mit dem Parasiten infiziert, üblicherweise hält das Immunsystem aber den Organismus unter Kontrolle. T. gondii ist das häufigste opportunistische Pathogen des Gehirns in AIDS-Patienten. Gegenwärtig wird Toxoplasmose ein zunehmendes Problem nicht nur wegen AIDS, sondern auch wegen breiterer Verwendung von Immunsuppressiva (z.B. wie verabreicht an Organtransplantationspatienten). Toxoplasmose wird üblicherweise mit einer Kombination aus Pyrimethamin und Sulfadiazin behandelt. Obgleich die Arzneistoffe wirksam sind, töten sie Zysten des Parasiten nicht ab, so daß die Behandlung als eine Erhaltungsdosis fortgesetzt werden muß. Toxizität fordert oft das Absetzen des Arzneistoffes, insbesondere bei beeinträchtigtem Immunsystem, und dies führt zu Rückfällen. Die Statistiken sind nicht gut, mit berichteten Todesraten von etwa 70 Prozent bei Patienten mit Immundefekterkrankungen und einem durchschnittlichen Überleben von vier Monaten.
Cryptosporidiose wird hervorgerufen durch den mikroskopischen Protozoan-Parasiten Cryptosporidium parvum. Bei Personen mit normalen Immunfunktionen kann die von C. parvum hervorgerufene Diarrhoe intensiv und lang sein, ist aber selbstbeschränkend. Bei AIDS-Patienten ist cryptosporidiale Diarrhoe oft lebensbedrohend. Es wird geschätzt, daß 15 bis 20 Prozent der AIDS-Patienten an diesem Zustand leiden. Bis heute hat es keine konsistent wirksame oder zugelassene Therapie für Cryptosporidiose gegeben.
Das am häufigsten identifizierte Pathogen bei AIDS-Patienten ist Enterocytozoon bieneusi, ein Mikrosporidian-Parasit, der bei nahezu einem Viertel der Patienten zu finden ist. Es scheint nunmehr, daß dieser winzige Parasit sich als die Ursache eines großen Teils der vielen unerklärten Fälle von verminderter Nährstoffresorption, Diarrhoe und Auszehrung erweisen könnte, die bei an HIV erkrankten Patienten zu sehen sind. Es gibt bis heute keine bekannte wirksame Behandlung.
Mehrere andere Spezies von Mikrosporidia infizieren HIV-positive Patienten, einschließlich Encephalitozoon hellem und cuniculi und eine neue Spezies, die als Septata intestinalis bezeichnet wird. Ein kürzlicher Bericht legt nahe, daß disseminierte Mikrosporidia-Infektionen an Bedeutung zunehmen.
Eine Infektion mit dem Parasiten Isospora belli ist klinisch nicht-unterscheidbar von Cryptosporidiose. Häufiger in tropischen Klimazonen ist 1. belli bei weniger als 1% Patienten in den U.S. berichtet worden, obgleich sein tatsächliches Auftreten wahrscheinlich höher ist.
Pneumocystis carinii ist allgemein als ein Protozoan-Parasit klassifiziert worden; einige Studien weisen darauf hin, daß er ein Pilz sein könnte, mit dem er bestimmte genetische Sequenzen teilt. P. carinii infiziert üblicherweise die Lungen (Pneumocystis Carinii Pneumonia (PCP)). Es wird bereichtet, daß Therapie bei etwa 40 bis 60% der Patienten erfolgreich ist, wobei Probleme Arzneistofftoxizität einschließen, insbesondere bei Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem. Unter den vielen schweren Manifestationen bei der Infektion mit menschlichem Immundefektvirus (HIV) bei Kindern sticht PCP wegen eines starken Auftretens, einzigartiger Altersverteilung und häufiger Mortalität heraus. PCP ist die häufigste schwere opportunistische Infektion bei Kindern mit HIV-Infektion; das Auftreten von PCP unter HIV-infizierten Kleinkindern, die keine Prophylaxe erhalten, wird auf wenigstens 12% im ersten Lebensjahr geschätzt. Viele Kinder sterben kurz nachdem sich PCP entwickelt.
Mycobacterium Avium Complex (MAC) bezieht sich auf Infektionen durch eine Familie sehr ähnlicher mycobakterieller Organismen, Mycobacterium avium und M. intracellulare. Wenn MAC bei Leuten mit nicht-beeinträchtigtem Immunsystem auftritt, ist es üblicherweise in Form einer Infektion des Atemwegtraktes. Bei Patienten mit AIDS wird MAC häufig disseminiert (disseminierter MAC oder DMAC) und fast jedes Organsystem kann betroffen sein. In einer kürzlichen Studie wurden MAC-Bakterien in 43% der Patienten gefunden, die 2 Jahre nach einer AIDS-Diagnose überlebten. Für disseminierte MAC ist keine Standardtherapie etabliert worden. Kombinationen von Arzneistoffen werden üblicherweise verschrieben und erfordern, wenn erfolgreich, daß die Behandlung lebenslänglich fortgesetzt wird. Ein wirksamere Behandlung wird dringend benötigt.
Mit HIV infizierte Personen sind besonders anfällig für Infektion durch Mycobacterium tuberculosis, und der Verlauf der Erkrankung ist beschleunigt. Obgleich extrapulmonare Tuberkulose bei nicht mit HIV infizierten Patienten ungewöhnlich ist, tritt sie bei HIV-positiven Menschen häufig auf. Die CDC hat Richtlinien zur Behandlung von TB herausgegeben, die sich dem wachsenden Vorherrschen von mehrfach arzneistoffresistenter TB (MDR-TB) widmen. Mortalität unter AIDS-Patienten mit MDR-TB ist sehr hoch (ungefähr 80%) und das Fortschreiten der Erkrankung ist extrem schnell.
Demgemäß besteht ein dringendes Bedürfnis nach der Entwicklung eines Verfahrens zur Behandlung dieser Infektionen, die so vorherrschend bei Menschen und Tieren und für diese bedrohend sind.
Es besteht auch ein Bedürfnis nach einem breit wirkenden Arzneistoff zur Vereinfachung der Behandlung von Trematoden-Infektionen. Gegenwärtig ist es notwendig, das spezifische Trematoden-Pathogen zu diagnostizieren und dann die Arzneistofftherapie zu verschreiben, die für diese Trematode spezifisch ist. Viele weniger entwickelte Länder sind nicht ausgestattet, um die spezifische Trematode zu diagnostizieren. Die Entwicklung eines breit wirkenden Arzneistoffes würde das Erfordernis einer Diagnose eliminieren.
Schistosoma mansoni, der Pärdenegel, ist der Verursacher von Schistosomiase, der zweitwichtigsten tropischen parasitischen Erkrankung des Menschen (nach Malaria) und der wichtigsten Trematoden-Infektion des Menschen. Schistosoma haematobium ist eine weitere wichtige Spezies, die den Menschen infiziert. Über 200 Millionen Individuen leiden weltweit an Schistosomiase, einschließlich mehrerer hunderttausend Menschen in den Vereinigten Staaten.
Fasciola hepatica, der gemeine Leberegel, ist primär eine Erkrankung von Schafen, aber Menschen sind ihr zufälliger Wirt. Dem Parasit gelingt es, in Gegenwart einer heftigen Immunreaktion des Wirtes zu überleben. Bithionol ist zur Behandlung vorgeschlagen worden, ist aber zur Verwendung in den Vereinigten Staaten nicht zugelassen.
Es besteht somit weiter ein Bedürfnis nach einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die selbst in tropischen Umgebungen lagerstabil ist und die breit wirkend gegen Trematoden ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist nunmehr in Tierstudien und klinischen Studien an Menschen beobachtet worden, daß die Wirksamkeit einer Behandlung unter Verwendung der Verbindungen von Formel (I) und (II) abhängig ist von der Teilchengröße der aktiven Arzneistoffsubstanz und der Stabilität der Verbindungen.
Die beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind geeignet zur Behandlung menschlicher und tierischer Trematoden-Infektionen, die verursacht werden durch Schistosoma, wie etwa Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; Fasciola, wie etwa Fasciola hepatica und Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski; und Dicrocoelium dendriticum, Heterophyses heterophyses und Metagonimus yokogawa.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind auch wirksam zur Behandlung von opportunistischen Infektionen von Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Enterocytzoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis carinii und Toxoplasma gondii bei Personen mit beeinträchtigtem Immunsystem.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer für orale Verabreichung geeigneten Form, als eine feste Dosierungsform, eine flüssige Suspension oder eine Paste, vorliegen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Für ein vollständigeres Verständnis der Natur und Aufgaben der vorliegenden Erfindung sollte Bezug genommen werden auf die folgende detaillierte Beschreibung, zusammengenommen mit den beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 die prozentuale Hemmung und Wirtszelllebensfähigkeit von Nitazoxanid gegen E. intestinalis zeigt.
2 zeigt die prozentuale Hemmung und Wirtszelllebensfähigkeit von Nitazoxanid gegen V. corneae.
3 zeigt die prozentuale Hemmung und Wirtszelllebensfähigkeit von Albendazol gegen E. intestinalis.
4 zeigt die prozentuale Hemmung und Wirtszelllebensfähigkeit von Albendazol gegen V. corneae.
5 und 6 zeigen ein Diagramm von OD-Werten, erhalten für jede T. gondii-Kulturvertiefung, gegen die Konzentration des Arzneistoffes in der Kultur.
7 ist ein Diagramm, das auf Nitazoxanid-Wirksamkeit gegen Mycobakterien, die in einer flüssigen Brühe wachsen, beruht.
8 zeigt den Prozentanteil von aktiven Teilchen mit einer Größe von weniger als ∅ μm.
Detailierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung enthalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
und die weiter eine die Stabilität verbessernde Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Säure enthält.
Die Erfindung betrifft weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Verbindung von Formel II
und eine pharmazeutisch annehmbare Säure in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um den pH besagter pharmazeutischen Zusammensetzung zwischen 2 und 6 einzustellen, wenn besagte pharmazeutische Zusammensetzung mit Wasser in Kontakt gebracht wird, wobei besagter Wirkstoff in der Form von festen Teilchen vorliegt und wobei das Verhältnis des Gewichts der pharmazeutisch annehmbaren Säure zum Gewicht besagter festen Teilchen zwischen 0,01 und 0,5 liegt.
Beispiele für solche Säuren sind: Zitronensäure, Glutaminsäure, Bernsteinsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Methansulfonsäure, Fumarsäure, Adipinsäure, Äpfelsäure und Mischungen derselben. Zitronensäure ist sehr geeignet. Das Vorhandensein besagter Säure verbessert die Stabilität des Wirkstoffes oder der Wirkstoffe.
Das Verhältnis des Gewichts von pharmazeutisch annehmbarer Säure zum Gewicht besagter aktiven festen Teilchen liegt vorzugsweise zwischen 0,03 und 0,2. Vorteilhafterweise ist die Menge an Säure ausreichend zur Einstellung des pHs der Suspension zwischen 2 und 6, vorzugsweise zwischen 3 und 5, am bevorzugtesten zwischen 3,5 und 4,5.
Techniken zur Herstellung von und bevorzugte Beispiele für feste und flüssige Dosierungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzung sind offenbart in WO 95/28393, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist. Die Zusammensetzungen enthalten vorteilhafterweise ein Benetzungsmittel und möglicherweise ein Stärke-Derivat, wie etwa diejenigen, die in US-Patent 5,578,621 offenbart sind, dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme für Offenbarungen möglicher Benetzungsmittel und Stärke-Derivate miteinbezogen ist. Das Benetzungsmittel, wie beschrieben in US 5,578,621 , dient als ein Dispergiermittel.
Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können, entweder als feste oder flüssige Dosierungsformen oder als Pasten oder Salben, fakultativ zusätzliche Wirkstoffe enthalten, wie etwa Antibiotika, antivirale Mittel oder Protonenpumpeninhibitoren. Obgleich es nicht vorteilhaft ist, ist es auch möglich, daß solche pharmazeutischen Formulierungen aktive feste Teilchen der Verbindung von Formel (I) und/oder Verbindung von Formel (II) enthalten, die größer als 200 μm sind.
Die Zusammensetzungen können Hilfsstoffe enthalten, die als solche für den Zweck der Herstellung von für orale Verabreichung geeigneten Formen bekannt sind.
Vorteilhafterweise liegt der Verteilungsfaktor besagter aktiven festen Teilchen, um eine hervorragende Wirksamkeit gegen ein breites Spektrum von Parasiten, Bakterien, Pilzen und Viren zu haben, zwischen 0,8 und 2, vorzugsweise zwischen 1,1 und 1,9, am bevorzugtesten bei mehr als 1,5, wobei besagter Verteilungsfaktor mit der folgenden Formel berechnet wird: F90% = (∅90% – ∅10%)/((∅90% + ∅10%)/2),in der

• F_90% der Verteilungsfaktor bei 90% ist;
•∅_90% die maximale Teilchengröße der Fraktion von Teilchen ist, die 90% besagter aktiven festen Teilchen entsprechen, und
• ∅_10% die maximale Teilchengröße der Fraktion von Teilchen ist, die 10% besagter aktiven festen Teilchen entsprechen.

Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung werden Teilchen einer Verbindung von Formel (I) und/oder (II) mit den hierin oben beschriebenen Verfahren hergestellt und werden dann so vermahlen, daß weniger als 10% besagter aktiven Teilchen größer als 100 μm sind, weniger als 50% besagter Teilchen größer als 50 μm sind und weniger als 10% besagter aktiven Teilchen kleiner als 5 μm in der Größe sind, wobei die mittlere Teilchengröße zwischen 20 und 50 μm liegt. Besagte aktive Teilchen werden dann unter Verwendung einer Mischung granuliert, die aktive feste Teilchen und wenigstens ein Granulierungsmittel enthält. Beispiele für Granulierungsmittel sind: Polyvinylpyrrolidon, Wasser, Alkohol, Saccharose, Hydroxylcellulose und Mischungen davon. Vorteilhafterweise wird wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure während des Granulierungsverfahrens zugegeben.
Die Erfindung betrifft auch feste Dosierungsformen, die eine Zusammensetzung der Erfindung enthalten, wie etwa Tabletten, dispergierbare Tabletten, beschichtete Tabletten, Matrices, etc. Die Dosierungsform der Erfindung enthält zum Beispiel:

• feste aktive Teilchen mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, wobei weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe besitzen, die größer ist als 100 μm, weniger als 50% besagter Teilchen eine Größe besitzen, die größer ist als 50 μm, und weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe besitzen, die kleiner ist als 5 μm, wobei die mittlere Teilchengröße zwischen 20 und 50 μm liegt;
• wenigstens ein Granulierungsmittel;
• wenigstens ein Benetzungsmittel;
• wenigstens eine Stärke-Derivat und
• wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure, die vorzugsweise während des Granulierungsverfahrens zugegeben wird.

Flüssige Dosierungsformen, wie etwa wäßrige Suspensionen der Erfindung, enthalten zum Beispiel:

• als Wirkstoff feste Teilchen, die eine Verbindung von Formel (I) und/oder eine Verbindung von Formel (II) enthalten, mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, wobei weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist 100 μm, weniger als 50% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist als 50 μm, und weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die kleiner ist als 5 μm, und
• wenigstens ein Granulierungsmittel;
• wenigstens ein Benetzungsmittel;
• wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure, wobei der pH der Suspension zwischen 2 und 6, vorzugsweise zwischen 3 und 5, und am bevorzugtesten zwischen 3,5 und 4,5 liegt;
• wenigstens ein Verdickungsmittel, wie etwa ein Xanthangummi, ein Guargummi, kristalline Cellulose, Carrubagummi, Carboxymethylcellulose oder eine Mischung derselben.

Pasten- oder Salbenformen der Erfindung, die geeignet sind für orale Verabreichung, enthalten zum Beispiel:

• als Wirkstoff feste Teilchen, die eine Verbindung von Formel (I) und/oder eine Verbindung von Formel (II) enthalten, mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, wobei weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist als 100 μm, weniger als 50% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist als 50 μm, und weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die kleiner ist als 5 μm, und
• wenigstens ein Benetzungsmittel;
• wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure, wobei der pH der Suspension zwischen 2 und 6, vorzugsweise zwischen 3 und 5, und am bevorzugtesten zwischen 3,5 und 4,5 liegt;
• wenigstens ein Verdickungsmittel, wie etwa ein Xanthangummi, ein Guargummi, kristalline Cellulose, Carrubagummi, Carboxymethylcellulose oder eine Mischung derselben.

Pasten- oder Salbenformen für topische oder intravaginale Applikation enthalten zum Beispiel:

• als Wirkstoff feste Teilchen, die eine Verbindung von Formel (I) und/oder eine Verbindung von Formel (II) enthalten, mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, wobei weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist 100 μm, weniger als 50% besagter Teilchen eine Größe haben, die größer ist als 50 μm, und weniger als 10% besagter Teilchen eine Größe haben, die kleiner ist als 5 μm, und
• wenigstens ein Benetzungsmittel;
• wenigstens eine pharmazeutisch annehmbare Säure, wobei der pH der Suspension zwischen 2 und 6, vorzugsweise zwischen 3 und 5, und am bevorzugtesten zwischen 3,5 und 4,5 liegt;
• Cetylalkohol und/oder Glycerid-Derivate und/oder Propylenglykol;
• wenigstens ein Verdickungsmittel, wie etwa ein Xanthangummi, ein Guargummi, kristalline Cellulose, Carrubagummi, Carboxymethylcellulose oder eine Mischung derselben.

Ein Verfahren zur Behandlung von Infektionen umfaßt die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Desacetylnitaxozanid von Formel (I):
Nitazoxanid (NTZ), die Verbindung von Formel (II), ist der generische Name für 2-(Acetolyloxy)-N-(5-nitro-2-thiazolyl)benzamid, eine Verbindung, die als erstes von Rossignol und Cavier im Jahre 1975 synthetisiert wurde. 2 mg Nitazoxanid können in 1 ml DMSO gelöst werden. Nitazoxanid wird leicht oral absorbiert.
Bis heute gibt es keinen Beleg, daß die Verbindungen von Formel (I) und/oder (II) in breiter Weise wirksam gegen Trematoden-Infektionen sein könnten oder daß sie ausreichend nichttoxisch sein würden, um sogar von Menschen mit beeinträchtigtem Immunsystem toleriert zu werden.
Die Herstellung und bestimmte Verwendungen von Nitazoxanid ist offenbart in US-Patent 3,950,351 sowie in Veröffentlichungen vom jetzigen Erfinder. Desacetylnitazoxanid, die Verbindung von Formel (I), wird manchmal als Tizoxanid oder d-NTZ bezeichnet und ist ein Metabolit von Nitazoxanid.
In WO 95/28393 offenbart der jetzige Erfinder ein Verfahren zur Herstellung der reinen Verbindung von Formel (II) sowie die Verwendung der Zusammensetzung, die eine Mischung von Verbindungen von Formel (I) und (II) enthält.
Es ist nunmehr beobachtet worden, daß feste Teilchen der Verbindung von Formel (I), der Verbindung von Formel (II) oder Mischungen derselben mit einer Teilchengröße zwischen 170 und 520 μm (mittlere Teilchengröße = 352 μm) sehr begrenzte Wirksamkeit haben, wenn sie Tieren oder Menschen oral verabreicht werden. Die Wirksamkeit solcher Teilchen ist existierenden pharmazeutischen Produkten unterlegen und daher für regulatorische oder kommerzielle Zwecke nicht akzeptabel.
Es ist in Hunden auch beobachtet worden, daß die orale Verabreichung einer Einzeldosis von 50 Milligramm pro Kilogramm feste Teilchen der Verbindung von Formel (I) und der Verbindung von Formel (II) mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 5 μm, schwere nachteilige Reaktionen bei den Tieren verursachte.
Es ist nunmehr entdeckt worden, daß, um eine wirksame und sichere Behandlung von Infektionen zu haben, die von Parasiten, Bakterien, Pilzen und Viren bei Menschen und Tieren verursacht werden, die pharmazeutische Zusammensetzung, entweder eine feste Dosierungsform oder eine wäßrige Suspension, die wirksame Dosis des Wirkstoffes in Form von festen Teilchen enthalten muß, die eine Teilchengröße haben, die kleiner ist als 200 μm, und die die Verbindung von Formel (I) und/oder die Verbindung von Formel (II) enthalten, wobei die mittlere Teilchengröße der aktiven festen Teilchen größer als 10 μm ist.
Das Vorhandensein eines hohen Gehalts an Wirkstoffteilchen in einer Größe, die größer ist als 200 μm, in Bezug auf den Gehalt an Teilchen mit einer Größe zwischen 5 und 200 μm, verringert die chemotherapeutische Aktivität der Verbindungen signifikant. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung nicht mehr als 5 Gew.-% aktiver fester Teilchen mit einer Größe, die größer ist als 200 μm. Am bevorzugtesten enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindungen im wesentlichen keine aktiven festen Teilchen mit einer Größe, die größer ist als 200 μm.
Das Vorhandensein eines hohen Gehalts von Wirkstoffteilchen mit einer Größe, die kleiner ist als 5 μm, in Bezug auf den Gehalt an Teilchen mit einer Größe zwischen 5 und 200 μm, kann nachteilige Wirkungen bei Tieren oder bei Menschen hervorrufen. Zusätzlich ist beobachtet worden, daß Teilchen mit einer Größe von weniger als 5 μm schneller vom Magen-Darm-Trakt in den Blutstrom absorbiert werden und daher nicht so wirksam gegen Parasiten, Bakterien, Pilze und Viren sind, die üblicherweise im Magen-Darm-Trakt von Tieren und Menschen leben.
Der Durchschnittsfachmann konnte nicht vorhersagen, daß die Teilchengröße der Verbindung von Formel (I) und der Verbindung von Formel (II) solch einen signifikanten Einfluß auf ihre antimikrobielle Aktivität in Tieren und in Menschen haben würde. In Studien, die vom Erfinder durchgeführt worden sind, haben zum Beispiel solche antiparasitischen Verbindungen wie Albendazol, Mebendazol, Niclosamid, Praziquantel und Metronidazol nicht einen solchen merkbaren Unterschied in der antiparasitischen Aktivität in Tieren oder Menschen gezeigt, der von ihrer Teilchengröße abhängig war. Zusätzlich konnte ein Durchschnittsfachmann nicht vorhersagen, daß Teilchengrößen der Verbindung von Formel (I) und der Verbindung von Formel (II) solch einen nachteiligen Einfluß auf die Fähigkeit von Tieren oder Menschen haben würden, die Verabreichung besagten Wirkstoffes zu tolerieren.
Die Verbindungen) von Formel (I) und (II) kann/können in entweder einer festen Dosierungsform oder einer wäßrigen Suspension verabreicht werden, und es ist bevorzugt, daß die pharmazeutische Zusammensetzung die wirksame Dosis des Wirkstoffes in der Form fester Teilchen von Formel (I) und/oder (II) mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, enthält, wobei die mittlere Teilchengröße besagter aktiven festen Teilchen größer ist als 10 μm, bestimmt mit einem Coulter^® Counter LS 100. Diese Ausrüstung verwendet Laserlicht bei 750 nm, um die Größe von Teilchen von 0,4 bis 900 μm im Durchmesser durch Lichtdiffraktion zu bestimmen. Die Proben werden in Wasser mit einer kleinen Menge an Triton X-100, um die Benetzbarkeit zu erhöhen und das Pulver zu entflocken, gemessen.
Vorteilhafterweise liegt die mittlere Teilchengröße besagter aktiven festen Teilchen zwischen 10 und 100 μm, bevorzugt zwischen 20 und 50 μm. Beispiele für bevorzugte Zusammensetzungen sind:

• eine Zusammensetzung, für die weniger als 10 Gew.-% besagter aktiven festen Teilchen einer Teilchengröße haben, die größer ist als 100 μm;
• eine Zusammensetzung, für die wenigstens 50 Gew.-% besagter aktiven festen Teilchen eine Teilchengröße haben, die kleiner ist als 50 μm.

Vorteilhafterweise liegt die mittlere Teilchengröße besagter aktiven festen Teilchen zwischen 10 und 100 μm, vorzugsweise zwischen 20 und 50 μm. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung haben weniger als 10% besagter aktiven festen Teilchen eine Teilchengröße, die kleiner ist ans 5 μm.
Die Wirkstoff oder die Wirkstoffe, der/die in der festen Dosierungsform oder Suspension verwendet wird/werden, ist/sind vorteilhafterweise eine Mischung von festen Teilchen der Verbindungen von Formel (I) und von Formel (II) mit einer Teilchengröße, die kleiner ist als 200 μm, wobei der Gewichtsanteil der Verbindung von Formel (I) in Bezug auf das Gewicht der Verbindungen von Formel (I) und von Formel (II) besagter Mischung zwischen 0,5 und 20%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 10% ausmacht.
Beschreibung der Darstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
Trockene reine Verbindung von Formel (I) und trockene reine Verbindung von Formel (II) wurden einer Vermahlung und Klassierung mittels eines Gittersiebes unterzogen.
Nach dem Vermahlen hatten die Teilchen der Verbindung von Formel (I), von Formel (II) und Mischungen davon die Teilchengrößenverteilung, die in 8 angegeben ist. 8 zeigt den Prozentanteil von Teilchen mit einer Größe, die kleiner ist als ∅ μm.
Aus besagter Figur ist deutlich, daß:

• weniger als 10 Gew.-% der Teilchen eine Teilchengröße hatten, die kleiner war als ungefähr 5 μm;
• weniger als 10 Gew.-% der Teilchen eine Teilchengröße hatten, die größer war als ungefähr 70 μm;
• die mittlere Teilchengröße ungefähr 40 μm beträgt;
• der Verteilungsfaktor der Teilchen etwa 1,73 ist, wobei besagter Verteilungsfaktor mit der folgenden Formel berechnet wird: F90% = (∅90% – ∅10%)/((∅90% + ∅10%)/2),in der
• F_90% der Verteilungsfaktor bei 90% ist;
• ∅_90% die maximale Teilchengröße der Fraktion von Teilchen ist, die 90% besagter aktiven festen Teilchen entsprechen, und
• ∅_10% die maximale Teilchengröße der Fraktion von Teilchen ist, die 10% besagter aktiven festen Teilchen entsprechen.

Spezifische Beispiele solcher Zusammensetzungen sind in den folgenden Tabellen offenbart. Tabelle 1. Beispiel für eine Zusammensetzung von dispergierbaren Tabletten für orale Verabreichung, die Verbindung von Formel (II) und Verbindung von Formel (I) als Wirkstoffe enthält.

Nitazoxanid (99%) + Desacetylnitazoxanid (1%)	200 mg
mikrokristalline Cellulose
Avicel pH 102, vertrieben von FMV-USA	116 mg
Crospovidon	25 mg
Magnesiumstearat	3 mg
kolloidales Siliciumdioxid	5 mg
Zitronensäure	10 mg
Erdbeeraroma Nr. 877720, vertrieben von Rotiertet	10 mg
Natriumsaccharinat	2 mg

Tabelle 2. Beispiel für eine Zusammensetzung von beschichteten Tabletten für orale Verabreichung, die Verbindung von Formel (II) und Verbindung von Formel (I) als Wirkstoffe enthält.

Nitazoxanid	500 mg
Maisstärke	60 mg
vorverkleisterte Maisstärke	70 mg
Hydroxypropylmethycellulose	5 mg
Saccharose	20 mg
Natriumstärkeglycollat	30 mg
Zitronensäure	25 mg
Talkum	8 mg
Magnesiumstearat	7 mg

Beschichtungen:

Heiße Zuckerlösung oder eine Filmbeschichtung, die auf die Tabletten oder das Granulat aufgesprüht wird, die 500 mg Wirkstoff enthalten. Tabelle 3. Beispiel für eine wäßrige Suspension für orale Verabreichung, die Verbindung von Formel (II) und Verbindung von Formel (I) als Wirkstoffe enthält. Der pH der Suspension betrug etwa 4,1.

Nitazoxanid (98%) + Desacetylnitazoxanid (2%)	2 g
destilliertes Wasser	100 ml
Natriumbenzoat	0,2 g
Saccharose	30,5 g
Xanthangummi	0,2 g
mikrokristalline Cellulose und Carboxymethlylcellulose-Natrium
Avicel RC-591, vertrieben von FMC – USA	0,8 g
Zitronensäure	0,2 g
dihydratisiertes Natriumcitrat	50 mg
Erdbeeraroma Nr. 877720, vertrieben von Robertet	125 mg
Roter Farbstoff Nr. 33 D und C	1 mg

Tabelle 4. Beispiel für eine Paste für orale Verabreichung, die Verbindung von Formel (II) und Verbindung von Formel (I) als Wirkstoffe enthält.

Nitazoxanid (98%) + Desacetylnitazoxanid (2%)	500 mg
Mineralöl	10 g
brauner Zucker	1 g
mikrokristalline Cellulose und Carboxymethlylcellulose-Natrium
Avicel RC-591, vertrieben von FMC	0,8 8
Zitronensäure	0,2 g

Tabelle 5. Beispiel für eine Pasten- oder Salbenformulierung für intravaginale oder topische Anwendung, wobei besagte Paste oder Salbe Verbindung von Formel (II) und Verbindung von Formel (I) als Wirkstoffe enthält.

Nitazoxanid (98%) + Desacetylnitazoxanid (2%)	8 g
Cremaphor A6	2 g
Cremaphor A25	1,5 g
Mineralöl	7 g
Luvitol EHO	7 g
Glycerolmonoester	4 g
Cetylalkohol	3 g
Simeticon	0,5 g
Germaben II	1 g
Propylenglykol	3,5 g
destilliertes Wasser	62,5 g

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind Zusammensetzungen, die ein breites Wirkungsspektrum gegen Parasiten, Bakterien, Pilze und Viren haben, insbesondere wenn sie oral verabreicht werden.
Die Wirksamkeit und die Sicherheit der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin zuvor offenbart sind, waren in Tieren und in Menschen hervorragend. Spezifisch ist in klinischen Studien an Menschen beobachtet worden, daß die Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin zuvor beschrieben sind, signifikant stärker ist bei der Behandlung von parasitischen Infektionen als dieselben Formulierungen, die aktive Verbindung mit Teilchengrößen zwischen 140 und 520 μm (mittlere Teilchengröße = 352 μm) verwenden, selbst wenn die größeren Teilchen Patienten in Dosen verabreicht wurden, die bis zu dreimal höher waren und für längere Zeiträume. Beispiele für erzielte Heilungsraten sind unten in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6. Vergleich der Ergebnisse von klinischen Studien an Menschen unter Verwendung von Verbindungen von Formel (I) und Formel (II) mit Teilchengrößen, die von 170 μm bis 520 μm reichen (Durchschnittswert = 352 μm), mit Ergebnissen, die erhalten wurden unter Verwendung von Formel (I) und Formel (II) mit Teilchengrößen, die von 5 μm bis 200 μm reichen (Mittelwert = 34 μm).
Verbindung von Formel (I) (98%) + Verbindung von Formel (II) (2%)
Für jeden der in Tabelle 6 aufgelisteten Parasiten waren die proportionalen Heilungsraten signifikant besser für die Patienten, die mit aktiven Teilchen zwischen 5 und 20 μm behandelt worden waren, als für diejenigen, die mit aktiven Teilchen behandelt worden waren, die in der Größe von 170 μm bis 520 μm reichen, mit einer statistischen Signifikanz in jedem Fall p < 0,02 (unter Verwendung eines Standard-X²-Tests). Dies war selbst der Fall, obgleich die Dosen des Wirkstoffs mit größerer Teilchengröße üblicherweise, höher waren und die Behandlungsdauer länger war als diejenige, die an die Patienten verabreicht wurden, die pharmazeutischen Zusammensetzungen mit Wirkstoff mit Teilchengrößen erhielten, die kleiner waren als 200 μm. Es gab keine schwerwiegenden nachteiligen Wirkungen, die für irgendeine Patientengruppe berichtet wurde.
Ergebnisse, die ähnlich sind zu denjenigen, die oben für Studien an Menschen beschrieben worden sind, sind auch in Tierversuchen beobachtet wurden.
Zusätzlich sind die nachteiligen Reaktionen, die bei Hunden nach oraler Verabreichung einer Einzeldosis von 50 Milligramm pro Kilogramm Verbindung von Formel (I) und Verbindung von Formel (II) beobachtet wurden, in umfangreichen Studien an Tieren, die Verbindung von Formel (I) und Verbindung von Formel (II) mit einer Teilchengröße zwischen 5 und 200 μm (Mittelwert > 10 μm) verwendeten, nicht beobachtet worden, selbst wenn dieselbe Dosis oder eine höhere Dosis der Verbindungen täglich für 90 Tage oder länger verabreicht wurde.
Überdies waren besagte Zusammensetzungen stabil (selbst wenn sie Temperaturen von 40°C und 65% relativer Feuchte für 6 Monate ausgesetzt wurden oder, im Falle von flüssigen Suspensionen, wenn sie in Wasser unter diesen Bedingungen für 3 Monate suspendiert wurden), wodurch sichergestellt ist, daß die aktiven Inhaltsstoffe sich nicht zersetzen und daß die Zusammensetzung ihre Wirksamkeit für einen Zeitraum nach ihrer Herstellung beibehalten, der geeignet ist für medizinische und kommerzielle Zwecke.
Im folgenden wird die Wirksamkeit der pharmazeutischen Zusammensetzungen gezeigt werden.
BEISPIEL I
CRYPTOSPORIDIUM PARVUM
In einem klinischen Vorversuch wurden 30 AIDS-Patienten mit chronischer cryptosporidialer Diarrhoe mit oralem Nitazoxanid von 500 bis 2000 mg täglich behandelt. Wenn die Diarrhoe fortbesteht, erhielten die Patienten weitere 4 Wochen Nitazoxanid, bis zu 2000 mg pro Tag.
Achtundzwanzig Leute schlossen zwei oder mehr Wochen Therapie ab und 16 von diesen waren auf eine therapeutische Reaktion nach der achten Behandlungswoche evaluierbar. In dieser letzteren Gruppe hatten zwölf Personen eine 50% oder größere Verringerung der täglichen Darmbewegungshäufigkeit und 10 Individuen hatten eine merkbare Verringerung oder Ausrottung des Parasiten im Stuhl, wobei der Organismus bei vier Leuten nicht-nachweisbar wird. Sechs Patienten erfüllten sowohl die klinischen als auch parasitologischen Reaktionskriterien zu ihrem Vorteil.
Patienten, die höhere tägliche Dosen Arzneistoff für längere Zeiträume erhielten, zeigten mit höherer Wahrscheinlichkeit eine positive Reaktion.
Eine open-label-Studie von Nitazoxanid für mit AIDS zusammenhängende cryptosporidiale Diarrhoe dokumentierte verringerte Darmbewegungen bei Personen, die 500, 1000, 1500 oder 2000 mg des Arzneistoffs täglich einnahmen. Versuchsteilnehmer hatten eine mittlere CD4+- Zahl von 42 Zellen/mm³ (Bereich 0 bis 303 Zellen/mm³), im Mittel 6,7 Darmbewegungen täglich für durchschnittlich 15 Monate, Cryptosporidium parvum-Oocysten im Stuhl und keinen anderen offensichtlichen enterischen Pathogene. Bei fast allen Teilnehmern hatte eine Therapie mit Azithromycin oder Paromomycin versagt.
Nach 23 Wochen hatten 9 von 13 eine vollständige klinische Reaktion (ein bis drei überwiegend ausgeformte tägliche Darmbewegungen) und vier von dreizehn hatten eine teilweise klinische Reaktion (wenigstens eine 50%ige Abnahme der Darmbewegungen oder eine Veränderung der Stuhlkonsistenz, so daß wenigstens 75% ausgeformt waren). Zum Ende der Studie hatten acht von elf die Parasiten vollständig ausgerottet und die anderen drei hatten beträchtliche Verringerungen in den Oocysten-Gehalten. Es gab einen Trend zu besserer Reaktion mit Dosen von 1000 mg täglich oder höher und mit längerer Therapie. Zwei Versuchsteilnehmer hatten urtikariale Hautrötungen; mehr als 90% blieben beim Studienregime für mehr als vier Wochen.
BEISPIEL II
CRYPTOSPORIDIUMPARVUM
In-vitro-Dosisinformation:
Nitazoxanid wurde in sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und gegen intakte, mit C. parvum-Oocysten infizierte Zellmonoschichten bei Konzentrationen von 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml und 0,1 μg/ml getestet. Eine zweite Spur wurde durchgeführt, die Nitazoxanid mit den zusätzlichen Konzentrationen 20, 2, 0,2 und 0,02 μg/ml testeten. Diese Konzentrationen wurden erhalten durch Reihenverdünnungen mit vollständigem DMEM-Medium, um eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5% zu ergeben. Die Mediumkontrolle kam auch in Kontakt mit 0,5% DMSO.
Das Experiment verwendete eine Zellkultur von MDBKFSD2-Zellen, gezogen in 7 mm-Kammern, und als Cryptosporidium parvum: GCH1-Oocysten, 5 × 10⁴ pro Vertiefung, und wurde durchgeführt, um Paromomycin (positive Kontrolle) gegen Nitazoxanid (experimenteller Arzneistoff) zu vergleichen. Die Materialien schlossen immunes Anti-Cryptosporidium-parvum-Sporozoit-Kaninchenserum (0,1%) und mit Fluorescein konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (1%) ein.
Toxizitätstest:
200 μl Medium, das Nitazoxanid in Konzentrationen von 100, 10, 1 und 0,1 μg/ml enthielt, und die richtigen Kontrollsubstanzen wurden in zwei Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen eingebracht, die konfluente MDBKF5D2-Zellmonoschichten enthielten, und in zwei Vertiefungen ohne Monoschichten. Der Arzneistoff wurde auf den Monoschichten bei 37°C und 8% CO₂ inkubiert. Nach 24 Stunden (Versuch 1) und 48 Stunden (Versuch 2) wurden MTS (Owen-Lösung) und PMS zu jeder Vertiefung in Konzentrationen von 33 μg/ml bzw. 25 μM zugegeben. Die Platte wurde im Dunkeln in den Inkubator zurückgebracht, um zwei Stunden zu entwickeln. Nach zwei Stunden wurden 100 μl von jedem Überstand auf eine neue Mikrotiterplatte überführt und im ELISA-Ablesegerät bei 490 nm abgelesen. Die Ergebnisse wurden aufgezeichnet und analysiert. Die prozentuale Toxizität wurde berechnet durch Subtrahieren der mittleren optischen Dichte (OD) der Arzneistoff-Überstände von der mittleren optischen Dichte (OD) der Mediumkontroll-Überstände (kein Arzneistoff), wobei durch die OD der Mediumkontrolle dividiert und mit 100 multipliziert wurde.
Intakte C. parvum-Oocysten-Test:
5 × 104 C. parvum-Oocysten pro Vertiefung wurden in Nitazoxanid (100, 20, 10, 2, 1, 0,2, 0,2 und 0,02 μg/ml) bei 37°C (8% CO₂) auf konfluenten MDBKF5D2-Zellmonoschichten inkubiert. Das Infektionsniveau in jeder Vertiefung wurde nach 24 bis 48 Stunden bestimmt und mit einem Immunfluoreszenztest analysiert. Die prozentuale Hemmung wurde berechnet durch Subtrahieren der mittleren Parasitenzahl/10 Felder in den Arzneistoff-Testvertiefungen von der mittleren Parasitenzahl/10 Felder in der Mediumkontrolle (kein Arzneistoff), wobei durch die Mediumkontrollzahl dividiert und dann mit 100 multipliziert wurde.
Ergebnisse:
Versuch 1: 24 Std.
Versuch 2:48 Std.
Einfluß von Nitazoxanid auf intakte C. parvum-Oocysten:
In Versuch 1 führte Nitazoxanid in Konzentrationen von 10, 1 und 0,1 zu Parasitenhemmungsniveaus von 94,4, 77,2 bzw. 51,8% und Zelltoxizitätsniveaus von 65,1, 8,3 bzw. 19,3%. Obgleich nahezu vollständige Hemmung der Parasiteninfektion in 10 μg/ml auftrat, war eine hohe Toxizitätsbewertung evident. Bei 1 μg/ml Nitazoxanid waren Parasitenhemmung und Zelltoxizität günstig im Vergleich zu Paromomycin bei einer Konzentration von 2 mg/ml (77,2% Parasitenhemmung und 8,3% Toxizität für Nitazoxanid bei 1 μg/ml, verglichen mit mit 51% Parasitenhemmung und 23,8% Zelltoxizität für Paromomycin bei 2 mg/ml).
In Versuch 2 wurde der Arzneistoff modifiziert, um bessere Dosisverteilung mit minimaler Toxizität zu erhalten. Folglich blieben die Kulturen für 48 Stunden statt 24 Stunden wie in Versuch 1 lebensfähig. Inkubation für 48 Stunden führte deutlich zu höherer relativer Zelltoxizität, wie deutlich ist aus einer Untersuchung von Paramomycin in beiden Versuchen. Die 20 μg/ml-Konzentration von Nitazoxanid war immer noch zu toxisch nach 48 Stunden Inkubation, obgleich die Zellmonoschicht noch intakt schien. Es ist möglich, daß hohe Toxizität, die die Zellfunktion beeinflussen muß, auch die Parasiteninfektion/-entwicklung beeinflußt. Bei 2 μg/ml Nitazoxanid gab es eine beträchtiche Hemmung der Parasiteninfektion mit relativ niedriger Zelltoxizität. Weitere Verdünnung führte auch zu signifikanter Hemmung und niedriger Toxizität. Bei einer Arzneistoffkonzentration von 2 μg/ml zeigt mäßige Zelltoxizität und inhibitorische Aktivität von 94,90%, daß Nitazoxanid bei 2 μg/ml Paromomycin für in-virto-C. parvum-Infektion bei 2 mg/ml (d.h. 1000-mal höherer Konzentration) überlegen ist.
BEISPIEL III
CRYPTOSPORIDIUM PARVUM
In-vitro-Dosis- und Lagerungsinformation
Vorräte von Nitazoxanid und Desacetylnitazoxanid (NTZ und NTZdes) wurden gegen mit intakten C. parvum-Oocysten und mit excystiertem Sporozoit infizierte Zellmonoschichten bei Konzentrationen von 10, 1, 0,1 und 0,01 μg/ml getestet. Jede Verbindung wurde in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und bis zu den gewünschten Konzentrationen mit sterilem DMEM verdünnt. Jede Konzentration von Nitazoxanid und die Mediumkontrollen enthielten 0,025% DMSO als eine Konstante.
Das Experiment verwendete eine Zellkultur von MDBKFSD2-Zellen, gezogen in 7 mm-Kammer, und als Cryptosporidium parvum: GCH1-Oocysten, 5 × 10⁴ pro Vertiefung, und wurde durchgeführt, um Paromomycin (Positivkontrolle) gegen Nitazoxanid (experimenteller Arzneistoff) zu vergleichen. Die Materialien schlossen immunes Anti-Cryptosporidium-parvum-Sporozoit-Kaninchenserum (0,1 %) und mit Fluorescein konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (1 %) ein.
Toxizitätstest:
200 μl Medium, das Nitazoxanid-Lösung in den zuvor erwähnten Konzentrationen enthielt, und die richtigen Kontrollen wurden in zwei Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen, die konfluente MDBKFD2-Zellmonoschichten enthielten, und zwei Vertiefungen ohne Monoschichten eingebracht. Der Arzneistoff wurde auf den Monoschichten bei 37°C und 8% CO₂ inkubiert. Nach 48 Stunden wurden MTS (Owen-Lösung) und PMS zu jeder Vertiefung in Konzentrationen von 333 μg/ml bzw. 25 μM zugegeben. Die Platte wurde im Dunkeln in den Inkubator zurückgegeben, um für 2 Stunden zu entwickeln. Nach 2 Stunden wurden 100 μl von jedem Überstand auf eine neue Mikrotiterplatte überführt und im ELISA-Ablesegerät bei 490 mit abgelesen. Die Ergebnisse wurden aufgezeichnet und analysiert. Die prozentuale Toxizität wurde berechnet durch Subtrahieren der mittleren optischen Dichte (OD) der Arzneistoff-Überstände von der mittleren OD der Medienkontroll-Überstände (kein Arzneistoff), wobei durch die OD der Mediumkontrolle dividiert und mit 100 multipliziert wurde.
Cytotoxizitätsbewertungen wurden wie folgt zugeordnet: 0,5% Toxizität = 0, 6 – 25% Toxizität = 1, 26 – 50% Toxizität = 2, 51 – 75% Toxizität = 3 und 76 – 100% Toxizität = 4. Als ein Standard werden Cytotoxizitätsbewertungen von 0 oder 1 als annehmbare Toxizitätsniveaus angesehen. Toxizitätsbewertungen von 2, 3 oder 4 werden als hohes Niveau oder Toxizität für die Zellmonoschicht angesehen.
Test an intakten C. parvum-Oocysten:
5 × 104 C. parvum-Oocysten pro Vertiefung werden in den zuvor erwähnten Konzentrationen von Nitazoxanid bei 37°C (8% CO₂) auf konfluenten MDBKF5D2-Zellmonoschichten inkubiert. Das Infektionsniveau in jeder Vertiefung wurde bestimmt und mit einem Immunofluoreszenztest nach 48 Stunden computeranalysiert. Die Prozent Hemmung wurden berechnet durch Subtrahieren der mittleren Parasitenzahl/Feld in den Arzneistoff- Testvertiefungen von der mittleren Parasitenzahl/Feld in der Mediumkontrolle (kein Arzneistoff), wobei durch die Mediumkontrollzahl dividiert und mit 100 multipliziert wird.
Ergebnisse:
C. parvum-Oocysten-Test (48 Std.)
Konz. – μg/ml; Parasit – mittlere Parasitenzahl/Feld (12 Felder analysiert); %Hemmung – % Hemmung der Parasiteninfektion; %Tox – prozentuale Toxizität des Arzneistoffes auf Zellen.
Aus dem obigen kann man sehen, daß die inhibitorische Aktivität von NTZdes dieselbe war wie NTZ von Beispiel II. Sowohl Nitazoxanid als auch Desacetylnitazoxanid waren in vitro gleich wirksam gegen Cryptosporidium parvum, wenn sie parallel mit 98% und 94% Hemmungen mit 10 bzw. 1 μg/ml für jede Verbindung getestet wurden. Für Nitazoxanid war die niedrigste Konzentration 1 μg/ml, was mehr als 90% Hemmung ergab, während 50% Hemmung bei niedrigeren Konzentrationen von Nitazoxanid erhalten werden konnten, wie etwa 0,2, 0,1 und 0,02 μg/ml. Unter denselben experimentellen Bedingungen war Paromomycin, das als Positivkontrolle verwendet wurde, 2000-mal weniger wirksam mit inhibitorischen Konzentrationen im Bereich von 51 bis 83% bei einer Konzentration von 2000 μg/ml.
BEISPIEL IV
E. INTESTINALES UND V. CORNEA
2RK-13-Zellen (Kaninchennieren-Zelllinie) wurden zu Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in einer Konzentration von 2,6 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung zugegeben (1,0 ml Medium; RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin und 5% hitzeinaktiviertem fätalen Rinderserum). Schalen wurden bei 37°C in einen CO₂-Inkubator über Nacht inkubiert, wobei zu diesem Zeitpunkt die Vertiefungen konfluent waren (mit einer Verdopplung würde man 5 × 10⁵ pro Vertiefung schätzen).
Sepata intestinalis-Organismen (gewonnen aus Gewebekultur) wurden zu den Wirtszellen in einem Verhältnis 3:1 zugegeben, verglichen mit den geschätzten Wirtszellen, oder mit 15 × 10⁶ Organismen pro Vertiefung. Diese Verhältnis führt dazu, daß etwa 50% der Wirtszellen infiziert werden.
Arzneistoffe wurden in DMSO, Wasser oder Methanol (abhängig von der Löslichkeit) gelöst, um Vorratslösungen mit 1,0 mg/ml herzustellen. Die Vorratslösungen wurden bei -70°C aufbewahrt. Verdünnungen, die in Experimenten verwendet wurden, wurden in vollständigem Gewebekulturmedium vorgenommen. Alle Verdünnungen werden in Dreifachvertiefungen getestet.
Medium wird alle drei bis vier Tage ersetzt (wobei es frisch verdünnte Arzneistoffe enthält).
An Tag Sechs (nach Zugabe von Parasiten und Arzneistoffen) werden die Zellen auf Toxizität untersucht. Kontrollzellen, denen Arzneistoffe gegeben wurden, aber keine Parasiten, werden auf Konfluenz, Morphologie der Zellen und Vorhandensein von toten oder flottierenden Zellen untersucht. Zellen, die nur mit Parasiten inkubiert worden sind, werden untersucht, um zu bestätigen, daß die Parasiten infektiös sind (d.h. Vorhandensein von parasitophoren Vakuolen). Zellen, die mit den Parasiten und Arzneimitteln inkubiert worden sind, werden auf Wirtszelltoxizität und relative Anzahl von parasitophoren Vakuolen (d.h. hoch, mittel oder niedig) bewertet.
An Tag Zehn wurden 100 μl 10% SDS (0,5% Endkonzentration) zu den Kulturvertiefungen zugegeben, um Wirtszellmembranen aufzubrechen und Freisetzung der Mikrosporidien zu bewirken. Die Gesamtzahl von Parasiten, die in jeder Vertiefung vorhanden sind, wurde durch Auszählen eines Aliquots auf einem Hämacytometer bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als prozentuale Hemmung (relativ zu infizierten Zellen, denen kein Arzneistoff gegeben wurde).
Die Ergebnisse sind in den 1 bis 4 dargestellt.
BEISPIEL V
TOXOPLASMA GONDII
Nitazoxanid und Desacetylnitazoxanid wurden gegen Parasiten getestet und genauer gegen den RH-Stamm von Toxoplasma gondii, erhalten durch Reihendurchgänge in Mäusen. Zellkulturen von MRC5-Fibroblasten (Bio-Merieux, Frankreich), kultiviert in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen, wurden mit T. gondii inokuliert. 200 frisch geerntete Tachyzoiten wurden zu jeder Kulturvertiefung zugegeben, mit Ausnahme von 8 Kontrollvertiefungen (Negativkontrollen). Nach 4 Stunden Inkubation wurden Arzneistoffverdünnungen zu den Kulturen zugegeben.
Nitazoxanid (NTZ) und Desacetylnitazoxanid (DNTZ) wurden in Konzentrationen getestet, die zwischen 8 × 10^–4 und 40 mg/l schwankten. Arzneistoffe wurden gemäß DMSO in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst, anschließend wurden Reihenverdünnungen im Kulturmedium hergestellt. Kein Niederschlag wurde beobachtet.
Arzneistoffverdünnungen wurden zu den Kulturen (8 Vertiefungen für jede Verdünnung) zugegeben, dann wurden die Kulturplatten für 72 Stunden inkubiert. Kulturen wurden dann mit kaltem Methanol fixiert. Feststellung eines Wachstums von T. gondii wurde durchgeführt mit ELISA unter Verwendung eines mit Peroxidase markierten Kaninchen-anti-T. gondii-Antikörpers. Werte für die optische Dichte wurden für jede Vertiefung aufgezeichnet.
Die Ergebnisse werden dargestellt durch Auftragen der OD-Werte, die für jede Kulturvertiefung erhalten wurden, gegen die Konzentration des Arzneistoffs in der Kultur. Statistische Analyse bestand aus der Regressionsanalyse mit 95% Vertrauensintervall und Bestimmung von Dosis-Reaktion-Kurven, aus den für jeden Arzneistoff erzeugten OD-Werten.
Eine Platte wurde mit Giemsa angefärbt, um die cytopathische Wirkung in den Kulturen zu untersuchen.
Drei separate Experimente wurden durchgeführt. In jedem Experiment wurden zwei Kulturplatten für jede Verbindung verwendet; in jeder Kulturplatte wurden 8 Replikatvetiefungen für jede Arzneistoffkonzentration verwendet.
Ergebnisse:
Ähnliche Ergebnisse wurden in den drei Sätzen von Experimenten erhalten. Graphische Darstellungen der Ergebnisse in einem repräsentativen Experiment für jeden Arzneistoff sind in 5a, b, c und 6a, b, c dargestellt.
Nitazoxanid (Figs. 5a, b, c):
Kein inhibitorischer Effekt wurde für Konzentrationen bemerkt, die zwischen 10^–4 mg/l und 0,3 mg/L schwankten. Ein signifikanter Effekt wurde für eine Konzentration von ≥ 0,6 mg/l bemerkt, mit einer vollständigen Hemmung des Toxoplasma-Wachstums für Konzentrationen von ≥ 2,5 mg/l. Eine merkbare Toxizität wurde jedoch auf der Zellmonoschicht für Konzentrationen von ≥ 2,5 mg/l bemerkt.
Mikroskopische Untersuchung der Monoschicht zeigte, daß NTZ bei einer Konzentration von 1,25 mg/l cytopathische Wirkung auf die parasitierten Zellen induzierte, mit einer Vergrößerung der parasitophoren Vakuole und Verringerung der Anzahl der intrazellulären Parasiten. Aus der Regressionsanalyse konnte die 50% inhibitorische Konzentration bei 1,2 mg/l geschätzt werden.
Desacetylnitazoxanid (Figs. 7 a, b, c):
Ähnliche Ergebnisse wurden mit Desacetylnitazoxanid erhalten; kein Effekt für Konzentrationen, die zwischen 10^–4 mg/l und 0,3 mg/l liegen, Hemmung für Konzentrationen von ≥ 0,6 mg/l und merkbare Toxizität für eine Konzentration von ≥ 2,5 mg/l. Die 50% inhibitorische Konzentration konnte bei 1,2 mg/l geschätzt werden.
Die erhaltenen Ergebnisse waren über drei separate Experimente reproduzierbar, mit einer Feststellung des inhibitorischen Effekts des Arzneistoffes auf wiederholten Kulturen für jede Arzneistoffkonzentration.
Sowohl für NTZ als auch für Desacetyl-NTZ konnte eine merkbare Hemmung des Toxoplasma-Wachstums in Konzentrationen von ungefähr 1,2 mg/l beobachtet werden, mit einer Änderung der parasitophoren Vakuole, aber keiner merkbaren Änderung des Parasiten selbst.
Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Arzneistoffe gute Aktivität gegen T. gondii haben und daß eine therapeutische Wirkung in vivo auf der Basis des Erreichens einer Konzentration von ungefähr 1 mg/l in Serum oder Geweben erwartet werden kann.
BEISPIEL VI
MYCOBACTERIA
Es wurde festgestellt, daß Nitazoxanid antimikrobielle Aktivität gegen TB-Organismen hat. Die folgende Tabelle zeigt einen Test auf MIC von Nitazoxanid und Tizoxanid gegen Mycobacterium intracellular mit Agarverdünnungstechnik. Diese Ergebnisse beruhen auf mehreren Experimenten, von denen jedes etwa 3 Wochen dauerte, für die Agarverdünnungsmethode mit Middlebrook-Agar. Die erhaltenen Daten zeigen, daß Nitazoxanid eine MIC gegen die Mycobacteria von 2 μg/ml hat und Tizoxanid eine MIC von 4 μg/ml hat, unter Verwendung eines Standardstamms von Mycobacterium intracellular von der ATCC, unter Verwendung des Standard-Agarverdünnungstest.
MICs von Nitazoxanid und Tizoxaanid gegen Mycobacteria intracellulare
7 ist ein Diagramm auf der Basis des Tests auf die Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen Mycobacteria, die in einer flüssigen Brühe wachsen. Wie verwendeten den kolorimetischen MTS-Test, der uns erlaubt, Wachstum in 4 Stunden, statt 3 Wochen, wie mit der Agarzählmethode, zu bestimmen. Wie man aus den Daten in 7 sehen kann, gab es, wenn Nitazoxanid nach den 72 Std., nachdem die Kultur initiiert worden war, zugegeben wurde, eine sofortige Wirkung auf fortgesetztes Wachstum, verglichen mit dem Wachstum im Kontrollmedium allein. Die 3 μg/ml-Dose von Nitazoxanid stoppt Wachstum für die nächsten 24 Std. und dann gibt es danach ein langsames Wachstum für die nächsten 2 Tage. Die 50 μg/ml-Dosis war vollständig bakteriostatisch während der gesamten 144 Stunden der Kultur.
BEISPIEL VII
CRYPTOSPORIDIUMPARVUM
Die Wirkung von Nitazoxanid wurde gegen Cryptosporidium parvum in experimentell infizierten Mäusen getestet. Nitazoxanid wurde geliefert von Romark Laboratories, L.C. in Tampa, Florida.
Die Gesamtdosis für Menschen (1 g/Tag für 7 Tage, d.h. 7 g) wurde zur Verwendung für Mäuse gemäß Paget und Barnes modifiziert. Die Dosis für Menschen wurde für Mäuse (die ungefähr 20 Gramm wogen) mit 0,0026 multipliziert, um die Gesamtmenge des Arzneistoffes zu erhalten, die für jeden Wirt am Morgen und Abend für 7 aufeinanderfolgende Tage benötigt wird. Jede Maus erhielt 2,6 mg/Tag (7000 mg × 0,0026/7). Die Dosen wurden über den Mund unter Verwendung einer Kunststoffspritze, die mit einer Nadel mit runder Spitze ausgestattet war, verabreicht.
Zwanzig (20) 2 Tage alte säugende Mäuse wurde durch orale Verabreichung von 100.000 Oocysten von Cryptosporidium parvum, der von infizierten Kälbern erhalten wurde, infiziert. Bevor sie den Mäusen verabreicht wurden, wurden die Oocysten unter Verwendung einer Zuckerlösung gemäß der Technik, die von Fayer & Ellis beschrieben ist, konzentriert. Rektale Abstriche von jeder Maus wurden erhalten und täglich untersucht, unter Verwendung der modifizierten Niehl-Neelsen-Anfärbetechnik, beschrieben von Graczyk et al.. Oocysten-Shedding trat in Faeces 2 Tage nach der oralen Infektion der Tiere auf. Am dritten Tag im Anschluß an die Infektion der Tiere erhielten 10 Mäuse 1,3 mg Nitazoxanid, am Morgen und am Abend, für 7 aufeinanderfolgende Tage, während die 10 restlichen Mäuse als unbehandelte Kontrolle gehalten wurden. Rektale Abstriche wurden täglich für jeden der 7 Behandlungstage und für jeden der 7 Tage im Anschluß an das Ende der Behandlung erhalten. Die Oocysten wurden in Öl suspendiert und pro 100 Felder unter einem Mikroskop gezählt.
Ergebnisse:
Die in der folgenden Tabelle dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, daß Nitazoxanid, verabreicht in einer täglichen Dosis von 2,6 mg/Tag für 7 aufeinanderfolgende Tage, wirksam gegen Cryptosporidium parvum bei der Verringerung der Anzahl von Oocysten in den Faeces der infizierten Mäuse war, verglichen mit den Kontrolltieren. Der Testarzneistoff verringerte das Oocysten-Shedding in 6 der 10 behandelten Mäuse am Ende des dritten Behandlungstages. Am Ende der Behandlung an Tag 7 gab es eine vollständige Verringerung des Oocysten-Sheddings, wobei alle Behandlungstiere negative Fäkaluntersuchung hatten, verglichen mit unbehandelten Kontrollmäusen. Diese Wirkung dauerte für wenigstens 7 Tage nach der Behandlung an, wie gezeigt durch negative Untersuchungen, die an den Tagen 3 und 7 nach Ende der Behandlung beobachtet wurden.
BEISPIEL VIII
MYCOBACTERIUM
Nitazoxanid wurde gegen Izoniazid-Antibiotikum verglichen. Das Protokoll verwendete BCG (Bacille de Calmette et Guerin) als einen Mycobacterium-Stamm. Die Empfindlichkeit dieses Stammes war dieselbe wie diejenige von M. tuberculosis, aber dieser Stamm ist harmloser und erfordert nicht das hohe Containment-Niveau eines Tuberkulose-Agens.
4 mg/Maus pro Tag in 0,2 ml Sonnenblumenöl wurden den Mäusen verabreicht. Die Ergebnisse in Mäusen, die mit Nitazoxanid behandelt worden waren, waren vergleichbar mit der Gruppe, die Izoniazid erhielt.
BEISPIEL IX
FASCIOLA HEPATICA
Die in-vitro-Wirksamkeit von Nitazoxanid und Desacetylnitazoxanid wurde gegen Fasciola hepatica getestet.
Reife F. hepatica wurden aus den Gallenvenen von 3 Kalbslebern gewonnen, die wegen Fasciolose am Louisiana Verterinary Medical Diagnostic Laboratory bei Hardy's Meat Packers, Bunkie, LA, für gesundheitsschädlich erklärt worden waren. Die Egel wurden in steriler Kochsalzlösung für 1 Stunde gewaschen und in sterile Kochsalzlösung oder RPM (pH 7,4) für zusätzliche 3 Stunden überführt. Die Egel wurden dann in sterilem RPMI-Kaninchenserum (50:50 v/v) oder sterilem RPMI (pH 7,4) über Nacht bei 37°C mit 5% CO₂ gehalten.
In-vitro-Kultur (37°C, 5% CO₂) wurde gemäß einer Modifikation des Verfahrens von Ibarra und Jenkins (Z. Parasitenkd. 70:655-661, 1984) vorgenommen. Unter Verwendung von Steriltechnik wurden Egel zweimal für 2 bis 3 Minuten in Hanks ausgewogener Salzlösung (pH 7,2) gewaschen und einzeln in Vertiefungen von Linbro-Kulturplatten mit 6 Vertiefungen gegeben, die 10 ml-Aliquote der bezeichneten Verdünnungen des Arzneistoffes in Kulturmedien enthielten. Das letztere bestand aus sterilem 50:50 v/v RPMI-Kaninchenserum mit 2% Kaninchenblut + 100 ppm Penicillin und 100 ppm Streptomycin. Nur Egel, die normale Aktivität und Morphologie hatten, wurden verwendet.
Vorratslösungen von NTZ oder seinem Metaboliten D-NTZ, geliefert von Romark, wurden in DMSO (2000 μg/ml) gelöst und in Kulturmedium verdünnt, unter Verwendung von volumetrischen 100 ml-Kolben, um die spezifizierten Arzneistoffkonzentrationen herzustellen (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 μg/ml). Zwei Kontrollegel wurden in jedem Replikat einbezogen, einer in Kulturmedium mit RBC ohne Medikament und einer in Kulturmedium ohne RBC ohne Medikament.
Egel wurden auf die Wirkungen der Arzneistoffbehandlung, wie nachgewiesen durch Tod, Motilitätsstörungen und morphologische Veränderungen, verglichen mit unbehandelten Kontrollegeln, unter Verwendung einer von hinten beleuchteten Platte und einer beleuchteten Dreifach-Vergrößerungslinse, untersucht.
Ergebnisse:
Experiment 1: Für D-NTZ waren die Egel in den 50 und 100 μg-Behandlungen innerhalb einer Stunde moribund oder tot. 4 von 7 Egeln in der 25 μg-Behandlung waren innerhalb der ersten Stunde moribund, zwei waren aktiv und einer war träge; alle, mit Ausnahme von zwei trägen Egeln, waren nach 3 Stunden tot und nur einem trägen Egel, der nach 4 Stunden lebendig war. Bei 10 μg wurde verringerte Aktivität nach 1, 3 und 4 Stunden bemerkt und alle waren nach 7 Stunden moribund oder tot. Verringerte Aktivität in einigen Individuen war nach 24 Stunden in den 5 μg- und 3 μg-Gruppen mit etwa langsamerem Einsetzen bei 3 μg zu sehen; alle waren nach 50 Stunden tot in den 3 und 5 μg-Behandlungsvertiefungen, mit Ausnahme eines trägen Egels in jeder Gruppe. Eine gewisse Verlangsamung der Aktivität wurde in der 1 μg-Gruppe nach 42 bis 74 Stunden bemerkt und nur 3 aktive und 1 moribunder Egel waren nach 91 Stunden noch lebendig; nach 115 Stunden war nur noch ein träger Egel in der 1 μg-Gruppe lebendig. Die Mortalität in der Kontrollgruppe mit RBC wurde nach 66 Stunden (ein Egel), 91 Stunden (ein Egel) und 115 Stunden (4 Egel) beobachtet. In der Kontrollgruppe ohne RBC waren alle bis Stunde 91 lebendig und einer war bis Stunde 115 tot.
Experiment 2: Für NTZ wurde eine etwas größere Aktivität durch frühere Effekte auf die Motilitätsbewertung und Mortalität in den 8 Replikaten bemerkt, verglichen mit den Ergebnissen für D-NTZ. In den 100, 50 und 25 μg-Gruppen waren alle Egel, mit Ausnahme eines Egels, nach 1 Stunde in der 25 μg-Gruppe tot oder moribund, er war nach 3 Stunden tot. Dosisabhängige Verringerung der Motilität war in jeder der anderen Gruppen mit Medikament zu sehen, beginnend bei Stunde 1. Bei 10 μg überlebt nur ein Egel bis 16 Stunden. In der 5 μg-Gruppe waren nur 3 Egel bis Stunde 6 noch aktiv und keine waren nach 16 Stunden aktiv. Nach 23 Stunden waren nur noch 2 träge Egel in der 3 μg-Gruppe lebendig; diese waren bis Stunde 41 tot. Für die 1 μg-Gruppe starb ein Egel bis Stunde 16, 3 bis Stunde 41 und 5 bis Stunde 74; 3 Egel blieben bis Stunde 91 aktiv und ein Egel hatte bis Stunde 115 Aktivität. In der Kontrollgruppe mit RBC waren 7 von 8 Egeln bis Stunde 74 lebendig, 3 waren bis Stunde 91 lebendig und 2 überlebten bis Stunde 115. In der Kontrollgruppe ohne RBC hatten 6 von 8 Egeln Aktivität bis Stunde 74, 4 waren aktiv bis Stunde 91 und 2 blieben aktiv bis Stunde 115.
Egeltod in den Hochdosisgruppen (25, 50, 100 μg) war schnell und assoziiert mit Kontraktion und ventralem „Verdrehen". Bei niedrigerem Medikamentsniveaus verlangsamten sich die meisten Egel für eine gewisse Zeit und waren entspannter und „abgeflachter", wenn sie moribund oder tot waren.
Kontaminerung wurde in einigen Replikaten, beginnend in Stunde 91 einschränkend für die experimentellen Ergebnisse. Für das D-NTZ-Experiment trat starkes Bakterien- oder Pilz-Überwachstum und assoziierte Mortalität in zwei Replikatplatten in Stunde 115 auf. Für das NTZ-Experiment trat Überwachstum und Egelmortalität in den gesamten Replikatplatten nach Stunde 91 (zwei Replikate) und Stunde 115 (fünf Replikate) auf. Beobachtungen in Stunde 139 wurden wegen allgemeiner Kontimantion der meisten Platten nicht als valide angesehen.
Schlußfolgerungen:
Starke Wirksamkeit bei der Abtötung von Egeln durch Nitazoxanid wurde durch die Experimente mit beiden getesteten Arzneistoffen nahegelegt. Etwas größere Aktivität bei der Abtötung von Egeln gegenüber F. hepatica wurde für Nitazoxanid beobachtet, verglichen mit Desacetylnitazoxanid, dem Hauptmetaboliten, von dem man annimmt, daß er auf dem Leberniveau aktiv ist.
Schneller Egeltod trat innerhalb von 1 Stunde bei in-vitro-D-NTZ-Medikationsraten von > 50 μg ein, innerhalb von 4 Stunden bei 25 μg und nach 6 bis 7 Stunden bei 10 μg. 10 μg könnte eine geeignete Einzelbehandlungs-Zielarzneistoff-Abgaberate sein, wenn pharmakokinetische Daten zeigen, daß Gewebespiegel für > 6 – 8 Stunden nach einer Einzelbehandlung aufrechterhalten werden.
Starke Aktivität bei der Abtötung von Egeln nach 74 Stunden (3 Tagen) wurde für beide Verbindungen mit den 3 und 5 μg-Dosisraten beobachtet. Längeres Überleben, das sich nicht mit Medikament behandelten Kontrollegeln annähert, aber nicht mit dieser gleich ist, wurde auf dem 1 μg-Dosisniveau beobachtet; Zuführung dieses Arzneistoffniveaus an Egel in Lebergeweben für 3 bis 4 Tage könnte daher eine unangemessene therapeutische Wirkung auf die Parasiten haben.
BEISPIEL X
FASCIOLA GIGANTICA
Nitazoxanid wurde gegen unreife und reife Fascioal gigantica in experimentell infizierten Kaninchen getestet.
Mit Fasciola gigantica encystierte Metacercarien (EMC) wurden auf Cellophanfolie nach 28 bis 35 Tagen nach Infektion von L. calludi-Schnecken mit Fasciola gigantica-Miracidium unter Verwendung der Technik, die von Abdel-Ghany beschrieben ist, gesammelt, wobei die Schnecken täglich künstlichem Licht (für 30 Minuten) in sauberem entchloriniertem Leitungswasser ausgesetzt wurden. Die resultierenden encystierten Metacercarien (EMC) wurden bei 4°C in einem Kühlschrank für 5 bis 8 Tage unter der Wasseroberfläche konserviert, bis sie verwendet wurden, um Versuchstiere zu infizieren.
Vierzig (40) Boscat-Kaninchen, die jeweils 1,5 bis 2 kg wogen, wurden in die Studie einbezogen und zwei Behandlungsgruppen mit 20 Tieren zugeordnet.
Tiere aus Gruppe 1 wurden oral mit den 35 bis 40 encystierten Metacercarien infiziert, eingewickelt in ein Salatblatt und auf die Wurzelzunge des Tieres geschoben. Die Mäuler der Tiere wurden mit der Hand geschlossen gehalten, bis die encystierten Metacercarien herunter geschluckt waren. Diese Tiere aus Gruppe 1 wurden verwendet, um die Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen Reifestadien (4 bis 5 Wochen alt) von Fasciola gigantica zu testen.
Tiere aus Gruppe 2 wurden, wie oben angegeben, mit 10 bis 15 encystierten Metacercarien oral infiziert und wurden verwendet, um die Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen die frühen reifen Egel (> 10 Wochen alt) zu testen.
Zehn Tiere aus Gruppe 1 erhielten 35 mg Nitazoxanid, am Morgen und am Abend, für 7 aufeinanderfolgende Tage, 4 Wochen nach ihrer Infektion im unreifen Stadium des Parasitenzyklus. Die 10 übrigen Tiere in Gruppe 1 wurden als unbehandelte Kontrollen gehalten.
Zehn Tiere aus Gruppe 2 erhielten 35 mg Nitazoxanid, am Morgen und am Abend, für 7 aufeinanderfolgende Tage 10 Wochen nach ihrer Infektion im reifen Stadium des Parasiten. Die 10 übrigen Tiere in Gruppe 2 wurden als unbehandelte Kontrollen gehalten.
Alle Tiere wurden bis zum Ende des Experiments mit Trockenfutter gefüttert.
Sieben Tage nach Verabreichung der letzten Dosis Nitazoxanid wurden alle Kaninchen aus jeder Gruppe geopfert. Die Oberfläche der Leber wurde auf das Vorhandensein von nekrotischen wandernden Furchen untersucht, insbesondere im unreifen Stadium des Parasitenzyklus. Diese nekrotischen Flächen wurden unter Verwendung von zwei chirurgischen Nadeln untersucht, um die juvenilen wandernden Egel gemäß der von El-Bahy beschriebenen Technik zu extrahieren. Die Lebern wurden in schmale Stücke insbesondere um die migrierenden Furchen herum geschnitten und unter einem Mikroskop mazeriert, um die existierenden Egel zu extrahieren. Die Bauchhöhle und die Visceraloberflächen wurden mit warmem Wasser gewaschen. Das Wasser wurde dann gesammelt, gesiebt und zur Identifikation juveniler Egel untersucht. Alle gesammelten Parasiten sowie Teile von diesen wurden sowohl in behandelten als auch unbehandelten Tieren sowohl in für Gruppe 1 als auch 2 gezählt. Lebende Egel schienen pinkfarben zu sein, durchscheinend, wobei sie intakte Tegumente zeigten, leicht extrahierbar aus dem Gewebe der Lebern unter Verwendung von warmem Wasser, während tote Egel gräulich waren, lose und eine gebrochene nekrotische Oberfläche zeigten. Die Wirksamkeit von Nitazoxanid wurde unter Verwendung der unten angegebenen Formel berechnet:
wobei: a = die Anzahl der Egel, die aus Faeces in den Kontrolltieren gewonnen wurden
b = die Anzahl der Egel, die aus Faeces in den behandelten Tieren gewonnen wurden.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Studie, wie angegeben in Tabelle 7, zeigen eine merkbare Abnahme der Anzahl unreifer Egel, die aus der Leber von Kaninchen in der behandelten Gruppe gewonnen wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe. Der mittlere Prozentanteil der Verringerung wurde zu 46,77% (Bereich: 40 – 60%) berechnet.
Tabelle 7: Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen unreifen (4 Wochen alten) F. gigantica in experimentell infizierten Kaninchen
Im frühen Reifenstadium ihrer Infektion zeigt Nitazoxanid eine vollständige Wirkung (100% Verringerung) und nach Untersuchung der Leber der behandelten Kaninchen waren im Vergleich mit den unbehandelten Kontrolltieren keine Würmer zu sehen, wie dargestellt in Tabelle 8.
Tabelle 8: Wirksamkeit von Nitzoxanid gegen frühen reifen (10 Wochen alt) F. gigantica in experimentell infizierten Kaninchen
Nitazoxanid, verabreicht als eine 70 mg/Tag-Dosis für 7 aufeinanderfolgende Tage, ist mäßig wirksam gegen unreifes Stadium von Fasciola gigantica und vollständig wirksam gegen das frühe reife Stadium des Parasiten.
BEISPIEL XIII
SCHISTOSOMA
Nitazoxanid wurde gegen Schistosoma mansoni und Schistosoma hematobium in experimentell infizierten Mäusen getestet.
Vierzig (40) weiße Mäuse, die 30 bis 50 Gramm wogen, wurden in zwei Behandlungsgruppen mit 20 Tieren pro Gruppe eingeteilt. Die ersten Gruppe wurde mit 300 bis 500 von Schistosoma mansoni freien aktiven Cercarien infiziert, suspendiert in 0,25 ml destilliertem Wasser und jeder Maus durch interperitoneale Injektion verabreicht. Die zweite Gruppe wurde in derselben Weise infiziert, aber mit Schistosoma hematobium-Cercarien. Diese zwei Gruppen wurden dann für insgesamt 70 Tage im Labor gehalten.
Siebzig Tage nach Infektion der Tiere wurden 10 Mäuse aus jeder Gruppe mit Nitazoxanid als einer 1,3 mg oralen Dosis behandelt, am Morgen und am Abend für 7 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. 7 Tage nach Ende der Behandlung wurden alle Mäuse geopfert und die Würmer wurden aus der Leber jeden Tieres durch Perfusion unter Verwendung von Lauwarmem Wasser (37°C) extrahiert. Die extrahierten Schistosomen wurden für alle Behandlungs- und Kontrolltiere gezählt. Die Wirksamkeit von Nitazoxanid wurde berechnet unter Verwendung der unten angegebenen Formel:
wobei: a = die Anzahl von Schistosomen, die aus Faeces in den Kontrolltieren gewonnen wurden
b = die Anzahl von Schistosomen, die aus Faeces in den behandelten Tieren erhalten wurden.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, die in Tabellen 9 und 10 dargestellt sind, weisen klar darauf hin, daß Nitazoxanid, verabreicht mit einer täglichen Dosis von 2,6 mg/Tag für 7 aufeinanderfolgende Tage, effektiver gegen Schistosoma hematobium war, wobei eine Wurmverringerung von 82,85% beobachtet wurde, verglichen mit den Kontrolltieren, während gegen Schistosoma mansoni nur eine Wurmverringerung von 59,91 % gegenüber den Kontrollmäusen erreicht wurde. Diese Ergebnisse sind konsistent mit denjenigen Berichten von Abaza et al. bei Patienten, bei den Nitazoxanid nicht wirksam gegen S. mansoni war, wie gezeigt durch positive Eizählungen nach Behandlung mit Nitazoxanid.
Tabelle 9: Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen reifen (13 Wochen alt) Schistosoma mansoni in Mäusen
Tabelle 9: Wirksamkeit von Nitazoxanid gegen reifen (13 Wochen alt) Schistosoma hematobium in Mäusen

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
und die weiter eine die Stabilität verbessernde Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Säure enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutisch annehmbare Säure ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Zitronensäure, Glutaminsäure, Bernsteinsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Methansulfonsäure, Fumarsäure, Adipinsäure, Äpfelsäure und Mischungen derselben besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte pharmazeutisch annehmbare Säure Zitronensäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte pharmazeutisch annehmbare Säure Ascorbinsäure ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine Verbindung von Formel II
und eine pharmazeutisch annehmbare Säure in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um den pH besagter pharmazeutischen Zusammensetzung zwischen 2 und 6 einzustellen, wenn besagte pharmazeutische Zusammensetzung mit Wasser in Kontakt gebracht wird, wobei besagter Wirkstoff in der Form von festen Teilchen vorliegt und wobei das Verhältnis des Gewichts der pharmazeutisch annehmbaren Säure zum Gewicht besagter festen Teilchen zwischen 0,01 und 0,5 Liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Gewichts der pharmazeutisch annehmbaren Säure zum Gewicht besagter aktiven festen Teilchen zwischen 0,03 und 0,2 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Zusammensetzung in einer festen Dosisform vorliegt und daß besagte aktive Teilchen in Gegenwart wenigstens eines Granulierungsmittels granuliert sind, um granulierte aktive feste Teilchen zu bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß besagte aktive Teilchen vor dem Granulieren eine Teilchengröße von weniger als 200 μm und eine durchschnittliche Teilchengröße von mehr als 10 μm besitzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagte durchschnittliche Teilchengröße besagter aktiven Teilchen zwischen 10 und 100 μm liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Granulierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Polyvinylpyrrolidon, Wasser, Alkohol, Saccharose, Hydroxylcellulose und Mischungen derselben besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in besagten granulierten aktiven festen Teilchen das Verhältnis des Gewichts der pharmazeutisch annehmbaren Säure zum Gewicht des Wirkstoffs zwischen 0,01 und 0,5 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß besagte pharmazeutisch annehmbare Säure ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Zitronensäure, Glutaminsäure, Bernsteinsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Methansulfonsäure, Fumarsäure, Adipinsäure, Äpfelsäure und Mischungen derselben besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Zusammensetzung in der Form einer Suspension von festen Teilchen von wenigstens einer Verbindung von Formel I und Formel II in einer Flüssigkeit vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte aktive Teilchen vor dem Bilden besagter Suspension in Gegenwart wenigstens eines Granulierungsmittels granuliert sind, um granulierte aktive feste Teilchen zu bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Flüssigkeit Wasser ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der pH besagter Suspension zwischen 2 und 6 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der pH besagter Suspension zwischen 3 und 5 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Zusammensetzung in der Form einer Paste vorliegt, die aktive Teilchen von wenigstens einer Verbindung von Formel I und Formel II, ein Benetzungsmittel und ein Verdickungsmittel umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß besagte pharmazeutisch annehmbare Säure ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Zitronensäure, Glutaminsäure, Bernsteinsäure, Ethansulfonsäure, Essigsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Methansulfonsäure, Fumarsäure, Adipinsäure, Äpfelsäure und Mischungen derselben.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß besagte aktive Teilchen eine Teilchengröße von weniger als 200 μm besitzen, weniger als 10 Gew.-% besagter Teilchen eine Größe von mehr als 100 μm besitzen, weniger als 50% besagter Teilchen eine Größe von mehr als 50 μm besitzen und weniger als 10 Gew.-% besagter Teilchen eine Größe von weniger als 5 μm besitzen.