DE69032029T2

DE69032029T2 - Hybrides protein c

Info

Publication number: DE69032029T2
Application number: DE69032029T
Authority: DE
Inventors: Donald C. Seattle Wa 98155 Foster; Richard D. Seattle Wa 98177 Holly
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1989-12-29
Filing date: 1990-12-28
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2010-12-29
Also published as: EP0506821A1; JP3270462B2; CA2071630C; DE69032029D1; WO1991009960A1; US5766921A; CA2071630A1; EP0506821A4; EP0506821B1; GR3026414T3; AU7168591A; DK0506821T3; ATE163048T1; ES2113878T3; JPH06502986A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Blutproteine und betrifft insbesondere Zusammensetzungen von humanartigen Protein C-Molekülen mit erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen Inaktivierung durch Humanplasma und somit verbesserter Pharmakokinetik in vivo sowie Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen.

Hintergrund der Erfindung

Protein C in seiner aktivierten Form spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Blutkoagulation. Das aktivierte Protein C, eine Serin-Protease, inaktiviert die Koagulationsfaktoren Va und VIIIa durch eine beschränkte Proteolyse. Die bei einer Gewebeverletzung initiierte Koagulationskaskade wird zum Beispiel durch Protein C daran gehindert, in einer ungestörten Kettenreaktion über den Bereich der Verletzung hinaus fortzuschreiten.
Protein C wird in der Leber als ein einzelkettiges Vorläufer-Polypeptid synthetisiert, welches anschließend zu einer leichten Kette von etwa 155 Aminosäuren (Mr = 21.000) und einer schweren Kette von 262 Aminosäuren (Mr = 40.000) prozessiert wird. Die schwere und die leichte Kette zirkulieren im Blut als ein zweikettiges inaktives Protein oder Zymogen, das durch eine Disulfidbindung zusammengehalten wird. Wenn ein Rest von 12 Aminosäuren von dem Amino-Terminus des Abschnitts der schweren Kette des Zymogens in einer durch Thrombin mediierten Reaktion abgespalten wird, wird das Protein aktiviert. Von einem anderen Blutprotein, welches als "Protein S" bezeichnet wird, wird angenommen, daß es die durch Protein C katalysierte Proteolyse von Faktor Va einigermaßen beschleunigt.
Protein C war auch an der Wirkung des Plasminogen-Aktivators vom Gewebe-Typ beteiligt (Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42, 1983). Eine Infusion von aktiviertem Rinderprotein C (APC) führt bei Hunden zu einer verstärkten Aktivität des Plasminogen-Aktivators (Comp und Esmon, J. Clin. Invest. 68:1221-1228, 1981). Andere Studien (Sakata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1121-1125, 1985) zeigten, daß die Zugabe von APC zu gezüchteten endothelialen Zellen zu einer raschen dosisabhängigen Steigerung der fibrinolytischen Aktivität in dem konditionierten Medium führt, was auf Anstiege in der Aktivität sowohl von Urokinase-bezogenen als auch Gewebe-Typ-Plasminogen-Aktivatoren hindeutet. Die APC-Behandlung führt auch zu einer dosisabhängenden Abnahme der Anti-Aktivator-Aktivität. Zusätzlich dazu wird APC bei Studien mit monoklonalen Antikörpern gegen endogenes APC (Snow et al. FASEB Abstracts, 1988) zur Aufrechterhaltung der Durchgängigkeit von Arterien während der Fibrinolyse und zur Begrenzung des Ausmaßes des Gewebe-Infarkts verwendet.
Experimentelle Beweise deuten darauf hin, daß aktiviertes Protein C bei der Behandlung von Thrombosen wertvoll sein kann. Mehrere Studien mit Pavian-Modellen der Thrombose deuteten darauf hin, daß APC in niedrigen Dosierungen bei der Vorbeugung der Fibrinablagerung, Plättchenablagerung und dem Verlust an Zirkulation wirksam sind (Gruber et al., Hemostasis and Thrombosis 374a: abstract 1353, 1987; Widrow et al., Fibrinolysis 2 suppl. 1: abstract 7, 1988; Griffin et al., Thromb. Haemostasis 62: abstract 1512, 1989). Die Verwendung von APC umgeht die Notwendigkeit der in vivo Aktivierung von Protein C, wodurch ein schneller wirkendes therapeutisches Mittel zur Verfügung gestellt wird.
Zusätzlich dazu hat es sich gezeigt, daß exogenes aktiviertes Protein C die koagulopathischen und lethalen Wirkungen von gram-negativer Blutvergiftung verhindert (Taylor et al.,J. Clin. Invest. 19:918-925, 1987). Die aus Studien mit Pavianen erhaltenen Daten legen nahe, daß aktiviertes Protein C eine natürliche Rolle beim Schutz vor Blutvergiftung spielt.
Protein C kann aus Gerinnungsfaktor-Konzentraten (Marlar et al., Blood 59:1067- 1072, 1982) oder aus Plasma (Kisiel, J. Clin. Invest. 64:761-769, 1979) gereinigt und in vitro aktiviert werden, jedoch kann das entstehende Produkt mit solchen infektiösen Mitteln, wie Hepatitis-Virus, Cytomegalovirus oder humanes Immundefizienz-Virus (HIV), verunreinigt sein.
In letzter Zeit wurden Verfahren zur Herstellung von aktiviertem Protein C durch rekombinante DNA-Technologie beschrieben. Foster et al. (veröffentlichte Europäische Patentanmeldung EP 215.548) offenbaren die Herstellung von aktiviertem Protein C durch die Verwendung von gezüchteten Säugetierzellen, die mit einer DNA-Sequenz von Protein C transfiziert sind, aus welcher die Codierungssequenz für das Aktivierungspeptid deletiert worden ist. Foster et al. (EP 266.190) offenbaren die Herstellung von rekombinantem aktivierten Protein C durch Verwendung einer DNA-Sequenz, die für eine APC-Vorstufe mit einer modifizierten Spaltungsstelle codiert.
Außerdem hat natives humanes aktiviertes Protein C (entweder von Plasma abgeleitet oder rekombinant) eine relativ kurze Halbwertszeit, wenn es in vivo verabreicht wird (etwa 20 Minuten), was die Unannehmlichkeit großer Dosierungen oder häufiger Verabreichung bedingt.
Trotz der Fortschritte bei der Herstellung von aktiviertem Protein C, die durch den Einsatz von Gentechnik ermöglicht wurden, bleiben die Ausbeuten gering und das Protein ist gegenüber Abbau und/oder Inaktivierung während des Herstellungsverfahrens anfällig. Somit bleibt für die Fachwelt ein Bedarf an Methoden, die die Herstellung von aktivem aktivierten Protein C in höheren Mengen und insbesondere die Herstellung von Molekülen ermöglichen, die eine deutlich gesteigerte Halbwertszeit in vivo aufweisen. Es ist sehr überraschend, daß die vorliegende Erfindung diese und andere damit in Beziehung stehende Bedürfnisse erfüllt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden neue Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die Protein C enthalten, welches eine leichte Kette und eine humanartige schwere Kette aufweist. Das Protein C kann entweder in seiner Zymogen-Form oder in seiner aktivierten Form vorliegen. Das aktivierte Protein C, welches eine humanartige schwere Kette aufweist, wird im allgemeinen gegen Inaktivierung durch humane Plasmafaktoren, wie etwa humanes alpha-1-Antitrypsin, widerstandsfähiger sein, wenn es mit unverändertem, natürlich vorkommendem Protein C verglichen wird. Die Zusammensetzungen sind bei Verfahren zur Behandlung von Patienten besonders gut verwendbar, wenn sie zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert sind, in welchen sie prophylaktisch oder therapeutisch an Patienten verabreicht werden können, die an einer Vielzahl von Krankheitszuständen leiden. Unter den medizinischen Indikationen sind Defizienzen an Protein C, was eine vererbte Störung oder ein erworbener Zustand sein kann. Andere erworbene Krankheitszustände, die mit den hierin beschriebenen neuen Protein C-Molekülen behandelt werden können, inkludieren z.B. tiefliegende Venenthrombose, Pulmonarembolie, Schlaganfall und Myocardinfarkt. Im letztgenannten Fall kann Protein C gemeinsam mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator verabreicht werden, um eine in vivo Fibrinolyse zu unterstützen, und kann gegeben werden, nachdem der coronare Thrombusverschluß aufgelöst wurde, um einen neuerlichen Verschluß zu verhindern.
In der Regel wird die leichte Kette des neuen Protein C-Moleküls im wesentlichen human sein und die humanartige schwere Kette wird mindestens etwa 200 Aminosäuren einer Schwerketten-Sequenz von humanem Protein C umfassen, welche Sequenz im allgemeinen 262 Reste in der Zymogen-Form und im allgemeinen etwa 250 Reste in der aktivierten Form aufweist. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stammen die nicht-humanen Reste der humanartigen schweren Kette von bovinen Sequenzen. Der Ersatz von humanen Schwerketten-Sequenzbereichen durch bovine Schwerketten-Sequenzen inkludiert die Einführung von Gln-Glu-Ala-Gly-Trp für die humane Aminosäuresequenz Lys- Met-Thr-Arg-Arg; die Einführung der bovinen Sequenz Arg-Asp-Glu-Thr für die humane Sequenz His-Ser-Ser-Arg-Glu-Lys-Glu-Ala; die bovine Sequenz Tyr-Asn-Ala-Cys-Val- His-Ala-Met-Glu-Asn-Lys kommt an die Stelle der humanen Aminosäuresequenz His-Asn- Glu-Cys-Ser-Glu-Val-Met-Ser-Asn-Met; und die bovine Region Lys-Ala-Gln-Glu-Ala-Pro- Leu-Glu-Ser-Gln-Pro-Val wird statt der humanen Schwerketten-Region Arg-Asp-Lys-Glu- Ala-Pro-Gln-Lys-Ser-Trp-Ala-Pro eingesetzt. Es versteht es sich natürlich, daß bestimmte weniger bedeutende Substitutionen, Insertionen oder Deletionen innerhalb des Rahmens der humanen schweren Kette oder in nicht-humanen Regionen vorgenommen werden können, solange das Protein C-Molekül seine biologische Aktivität beibehält. Wünschenswerterweise haben solche Analoga des Protein C z.B. eine erhöhte Resistenz gegen Inaktivierung durch humanes Plasma und somit eine längere Plasma-Halbwertszeit oder eine gesteigerte biologische Wirkung.
In einer anderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung ein rekombinantes chimärisches Protein C-Molekül mit Leicht- und Schwerketten-Polypeptiden, wobei die leichte Kette im wesentlichen human und die schwere Kette im wesentlichen die eines anderen Säugetiers als des Menschen, vorzugsweise des Rindes, ist. Diese Form von Protein C wird im wesentlichen die Aktivität von humanem Protein C aufweisen, wird jedoch gegenüber der Inaktivierung durch humane Plasmafaktoren widerstandsfähiger sein als das natürlich vorkommende humane Protein C. Die Sequenz der schweren Kette dieser Ausführungsform kann im wesentlichen homolog zu der bovinen Schwerketten-Sequenz von Fig. 8 sein; eine bevorzugte Zusammensetzung hat eine amino-terminale Aminosäure der humanen aktivierten schweren Kette (Leu), während der Rest der schweren Kette im wesentlichen bovin ist.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Polynucleotid-Molekül mit vier operativ verbundenen sequenzcodierenden Regionen, die jeweils für ein Pre-Pro-Peptid und einen gla-Bereich eines Vitamin K-abhängigen Plasmaproteins, eine leichte Kette von humanem Protein C ohne Gla-Bereich, ein Peptid, das eine oder mehrere Spaltungsstellen umfaßt, und eine schwere Kette von humanartigem Protein C codieren. Das von diesem Polynucleotid exprimierte Protein C-Molekül ist biologisch aktiv, das heißt, daß es in seiner aktivierten Form imstande ist, die humanen Plasmafaktoren Va oder VIIIa zu inaktivieren, wobei es jedoch selbst eine gesteigerte Widerstandsfähigkeit gegen Inaktivierung durch humane Faktoren, wie etwa alpha-1-Antitrypsin, aufweist. Zur Expression des Protein C- Moleküls werden die Nucleotidsequenzen in Säugetierzell-Linien transfiziert, wie etwa in BHK, BHK 570 und 293, und können mit Sequenzen co-transfiziert werden, welche für an den Spaltungsstellen reaktive Endopeptidasen codieren, wie etwa das KEX2 Gen von Saccharomyces cerevisiae.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 erläutert die Nucleotidsequenz einer cDNA von humanem Protein C und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Proteins. Die negativen Zahlen beziehen sich auf das Pre-Pro-Peptid. Positive Zahlen bezeichnen die Sequenz des reifen Zymogens. Die Diamantrauten bedeuten Consensus N-gebundene Glycosylierungsstellen. Der Pfeil bedeutet die Verbindungsstelle zwischen dem Aktivierungspeptid und der schweren Kette des aktivierten Protein C.
Fig. 2 stellt den Protein C-Expressionsvektor p593 dar. Die verwendeten Symbole sind: 0-1 die 0-1 Karteneinheitssequenz von Adenovirus 5; E der SV40-Verstärker; MLP der größere späte Promotor von Adenovirus 2; L1-3 der dreiteilige Führer von Adenovirus 2; 5' die 5'-Spleißstelle; 3' die 3'-Spleißstelle; p(A) das SV40 späte Polyadenylierungssignal.
Fig. 3 erläutert die Konstruktion des Protein C Expressionsvektors PC962/ZMB-4.
Fig. 4 erläutert die Konstruktion des Vektors ZMB-3.
Fig. 5 erläutert die Ergebnisse der chromogenen Aktivitätsassays an humanen, bovinen und hybriden Protein C-Molekülen. Die Daten für jedes Protein werden auf 100 % Aktivität in Abwesenheit von alpha-1-Antitrypsin normalisiert.
Fig. 6 erläutert die Inaktivierung von humanen und hybriden Protein C-Molekülen durch Humanplasma. Die Ergebnisse sind für jedes Protein normalisiert.
Fig. 7 erläutert den zeitlichen Verlauf der Inaktivierung von humanen und hybriden Protein C-Molekülen durch Humanplasma. Die Ergebnisse sind für jedes Protein normalisiert.
Fig. 8 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der schweren Ketten von humanem und bovinem Protein C. Jede Sequenz ist ab der ersten Aminosäure der jeweiligen schweren Kette numeriert. Der Pfeil bedeutet die Verbindungsstelle zwischen dem Aktivierungspeptid und der schweren Kette des aktivierten Protein C. Innerhalb der bovinen Sequenz bedeutet (.) die Anwesenheit des gleichen Aminosäurerests wie in der humanen Sequenz und (-) bedeutet einen zur Maximierung der Sequenzanordnung eingeführten Spalt.
Fig. 9 erläutert die Inaktivierung von humanen (wt 962), hybriden (LMH), mutanten PC2451, PC2452 und PC3044 Protein C Molekülen durch alpha-1-Antitrypsin. Die Ergebnisse sind für jedes Protein normalisiert.
Fig. 10 stellt den zeitlichen Verlauf über 300 Minuten für die Inaktivierung von aktivierten humanen (wt 962), hybriden (LMH), mutanten PC2451, PC2452 und PC3044 Protein C Molekülen durch Humanplasma dar. Die Ergebnisse sind für jedes Protein normalisiert.
Fig. 11 erläutert einen zeitlichen Verlauf über 60 Minuten für die Inaktivierung von aktivierten humanen (wt 962), hybriden (LMH) und mutanten PC2451 Protein C-Molekülen durch Humanplasma. Die Ergebnisse sind für jedes Protein normalisiert.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

Es werden neue Zusammensetzungen von Protein C zur Verfügung gestellt, die zur Verabreichung an Menschen geeignet sind. Wegen der grundlegenden Rolle, die das Protein C in der Koagulationskaskade spielt, wo es in seiner aktivierten Form als ein Antikoagulans wirkt, besteht eine Vielzahl wesentlicher therapeutischer Anwendungszwecke. Die hierin beschriebenen neuen Zusammensetzungen schaffen eine Möglichkeit zur Erreichung einer verlängerten Halbwertszeit und einer in vivo Stabilität, die mit früheren Zusammensetzungen von Protein C, die aus Humanplasma gereinigt oder durch rekombinante Mittel hergestellt wurden, nicht erreichbar war.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung umfaßt die Zusammensetzung ein hybrides oder chimärisches Protein C Molekül, in welchem die Aminosäuresequenz der leichten Kette im wesentlichen human und die Sequenz der schweren Kette im wesentlichen die eines anderen Säugetiers als eines Menschen ist, wie etwa eines Rindes. Es kann auch wünschenswert oder günstig sein, wenn die amino-terminale Aminosäure der aktivierten schweren Kette aus der humanen Sequenz stammt, wobei sie in der Regel Leucin (Leu) ist. Der Rest der schweren Kette kann zur Gänze die bovine Schwerkettensequenz sein. Es versteht sich, daß eine Bezugnahme hierin auf "Protein C" das Zymogen und die aktivierten Formen inkludiert, wenn dies nicht anders angegeben ist. Protein C Zymogen inkludiert ein Aktivierungspeptid an dem Amino-Terminus der schweren Kette. Das Aktivierungspeptid kann das native humane Aktivierungspeptid, das native bovine Aktivierungspeptid oder ein modifiziertes Aktivierungspeptid sein, wie es hierin geoffenbart ist.
Bei anderen Ausführungsformen werden Protein C-Moleküle produziert, die humanartig in ihrer Natur sind und somit im allgemeinen eine geringere Immunogenität als ein chimärisches Molekül besitzen. Kurze Sequenzen der humanen schweren Kette (wie in Fig. 8 beispielhaft gezeigt), die einzelne Aminosäuren inkludieren, jedoch nicht auf sie beschränkt sind, können durch die entsprechenden Schwerkettensequenzen von Protein C eines anderen Säugetiers als des Menschen ersetzt werden, am besten durch bovine Sequenzen. Das Ziel ist die Erreichung von Protein C Molekülen, die im wesentlichen human sind und die, wenn sie aktiviert sind, eine deutlich größere Halbwertszeit in menschlichem Blut aufweisen, wodurch sie eine weniger häufige Verabreichung und/oder geringere Dosierungen notwendig machen. Wie er hierin verwendet wird, steht der Ausdruck "humanartige schwere Kette" für eine schwere Kette von Protein C, die im wesentlichen homolog zu einer authentischen humanen schweren Kette ist, d.h. zu mindestens etwa 75 % und vorzugsweise etwa 85 bis 95 % identisch ist, insbesondere in jenen Regionen, die in der Spezies relativ konserviert sind, und die mindestens eine Aminosäure-Substitution aufweist. Im allgemeinen ist es bevorzugt, die Wechselwirkung von Protein C mit Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 beizubehalten, indem die grundlegenden Aminosäurereste an den Positionen 191-193 beibehalten werden.
Das hybride oder humanartige Protein C wird durch Züchtung von Säugetierzellen hergestellt, die mit Genen transfiziert sind, die für die hybriden oder humanartigen Moleküle codieren. Die Zellen werden mit einem Expressionsvektor transfiziert, der einen Promotor in operabler Verbindung mit einer DNA umfaßt, die für das Protein C-Molekül codiert. Die transfizierten Zellen werden in einem Medium gezüchtet, welches die Expression des Proteins gestattet, und das Protein C wird dann aus dem Medium isoliert. Das Protein C kann in seiner aktivierten Form oder in der Zymogen-Form hergestellt werden. Wenn es in seiner aktivierten Form hergestellt wird, sollte das Medium so bereitet werden, daß es eine minimale Serummenge enthält oder serumfrei ist, wie es in der Europäischen Patentanmeldung EP 485504 desselben Inhabers beschrieben ist.
Geklonte DNA-Sequenzen, die für humanes Protein C codieren, wurden bereits beschrieben (Foster und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4766-4770, 1984; Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4673-4677, 1985 und Bang et al., US Pat.Nr. 4,775.624. Eine cDNA, die für bovines Protein C codiert, wurde von Long et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5563-5656, 1984 beschrieben. Im allgemeinen werden cDNA- Sequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wegen ihres Mangels an störenden Sequenzen bevorzugt, die zu abweichender RNA-Prozessierung und zu verminderten Expressionsgraden führen können. Komplementäre DNAs, die für Protein C codieren, können aus Bibliotheken gewonnen werden, die aus Leberzellen verschiedener Säugetierarten gemäß Standard-Laboratoriumsverfahren hergestellt wurden. Unter Verwendung von Sonden von boviner oder humaner cDNA kann man die für Protein C von anderen Säugetier- Spezies codierende DNA identifizieren und klonen. Es versteht sich jedoch, daß geeignete DNA-Sequenzen auch von genomischen Klonen erhalten oder gemäß üblichen Verfahren de novo synthetisiert werden können. Wenn partielle Klone erhalten werden, ist es notwendig, sie im geeigneten Leserahmen zusammenzufügen, um einen Klon voller Länge zu produzieren, wobei solche Techniken, wie Endonuclease-Spaltung, Ligation und loop-out Mutagenese, verwendet werden.
Um zum Beispiel bovine cDNA, die für die schwere Kette des Protein C codiert, zu klonen, kann ein humanes Protein C cDNA-Fragment verwendet werden, um eine bovine Leber-cDNA-Bibliothek zu sondieren. Das humane Protein C cDNA-Fragment kann zum Beispiel aus humaner Leber-mRNA unter Einsatz üblicher Methoden hergestellt werden. Andererseits können Sonden entwickelt werden, die auf der veröffentlichten bovinen Protein C cDNA-Sequenz basieren (Long et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5653-5656, 1984). Eine hybride Protein C-Codierungssequenz kann durch Zusammenfügen der humanen Leichtketten-cDNA mit dem nicht-humanen Fragment (z.B. bovin) im richtigen Leserahmen konstruiert werden, um ein Protein mit voller Länge zu produzieren, wobei Spaltung mit geeigneten Restriktionsendonucleasen, Ligation, synthetische Oligonucleotide und loop-out Mutagenese eingesetzt werden.
Bei anderen Ausführungsformen kann die gesamte humane Protein C-Codierungsregion geklont werden und ausgewählte Modifikationen an der Schwerkettensequenz können erfolgen, um die Halbwertszeit und die Stabilität des Moleküls in Humanplasma zu erhöhen, indem es gegen die Inhibierung oder Inaktivierung durch Faktoren im Humanplasma resistent gemacht wird. Die Modifikationen werden auf Bereiche der schweren Kette gerichtet sein, wo die Aminosäuresequenz deutlich von Spezies zu Spezies differiert. So wird die Spezies-Spezifität von humanem alpha-1-Antitrypsin für die humane schwere Kette verwendet, um eine Stelle (oder Stellen), die in der Regel von alpha-1-Antitrypsin in der schweren Kette erkannt wird (werden), der Erkennung weniger zugänglich zu machen und dadurch die Geschwindigkeit zu verringern, mit welcher die Aktivität des Protein C abgebaut wird. In der bovinen Schwerkettensequenz wurden zum Beispiel die folgenden Sequenzen als Stellen identifiziert, die für entsprechende humane Schwerkettenregionen substituiert werden können (Numerierung nach Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4766-4770, 1984 und gemäß der Darstellung von Fig. 8):
(1) von einer bovinen schweren Kette wird die Aminosäuresequenz Gln-Glu-Ala-Gly- Trp (Aminosäuren 19-23 der schweren Kette) für die humane Aminosäuresequenz Lys- Met-Thr-Arg-Arg (Aminosäuren 17-21 der schweren Kette) substituiert;
(2) von einer bovinen schweren Kette wird die Aminosäuresequenz Arg-Asp-Glu-Thr (Aminosäuren 148-151) für die humane Aminosäuresequenz His-Ser-Ser-Arg-Glu-Lys- Glu-Ala (Aminosäuren 146-153) substituiert;
(3) von einer bovinen schweren Kette wird die Aminosäuresequenz Tyr-Asn-Ala- Cys-Val-His-Ala-Met-Glu-Asn-Lys (Aminosäuren 169-179) für die humane Aminosäuresequenz His-Asn-Glu-Cys-Ser-Glu-Val-Met-Ser-Asn-Met (Aminosäuren 171-181) substituiert; und
(4) von einer bovinen schweren Kette wird die Aminosäuresequenz Lys-Ala-Gln-Glu- Ala-Pro-Leu-Glu-Ser-Gln-Pro-Val (Aminosäuren 249-260) für die Reste der humanen schweren Kette Arg-Asp-Lys-Glu-Ala-Pro-Gln-Lys-Ser-Trp-Ala-Pro (Aminosäuren 251-262) substituiert.
Es versteht sich, daß vorzugsweise so wenig Sequenzmodifikationen als möglich vorgenommen werden, um eine erhöhte Resistenz gegen Inaktivierung durch humane Plasmafaktoren zu erzielen. Wünschenswerterweise wird die Region der Substitution so klein als möglich sein, sodaß am bevorzugtesten eine einzelne Aminosäure der schweren Kette von einer Spezies für eine entsprechende Aminosäure der humanen Sequenz substituiert wird. Es können auch Kombinationen von Sequenzregionssubstitutionen erfolgen. Die gesteigerte Widerstandsfähigkeit eines Moleküls gegen den Abbau kann leicht durch allgemein bekannte Verfahren geprüft werden, wie etwa die Widerstandsfähigkeit gegen alpha-1-Antitrypsin oder Humanplasma, wie weiter unten beschrieben wird. Wichtig ist es, daß alle diese Substitutionen die biologische Aktivität des Protein C nicht deutlich herabsetzen. Unter "biologischer Aktivität" wird eine Funktion oder eine Gruppe von Funktionen verstanden, die von aktiviertem humanem Protein C in einem biologischen Zusammenhang (d.h. in einem Organismus oder in einem in vitro Modell hievon) erfüllt wird. Die biologischen Aktivitäten von Proteinen können in katalytische und Effektor-Aktivitäten unterteilt werden. Katalytische Aktivitäten von Vitamin K-abhängigen Plasmaproteinen, wie etwa Protein C, umfassen im allgemeinen spezifische proteolytische Spaltungen anderer Plasmaproteine, die zur Aktivierung oder Desaktivierung der Substrate führen. Effektor-Aktivitäten inkludieren die spezifische Bindung der biologisch aktiven Moleküle an Kalzium, Phospholipid oder andere kleine Moleküle, an Makromoleküle, wie etwa Proteine, oder an Zellen. Effektor-Aktivität erhöht oft oder ist ganz wesentlich für die katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen. Für Protein C ist die biologische Aktivität charakterisiert durch die antikoagulierenden Eigenschaften des aktivierten Proteins. Aktiviertes Protein C inaktiviert den Faktor Va und den Faktor VIIIa in Anwesenheit von saurem Phospholipid und Kalzium. Protein S scheint an der Regulierung dieser Funktion beteiligt zu sein (Walker, ibid.). Es wird angenommen, daß die katalytischen Aktivitäten von Protein C primär in der schweren Kette beheimatet sind. Diese Aktivitäten können leicht unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren geprüft werden.
Zur direkten Herstellung von rekombinantem aktivierten Protein C wird die geklonte DNA-Sequenz so modifiziert, daß jener Abschnitt, der für das Aktvierungspeptid codiert, deletiert oder ersetzt wird. Die entstehende DNA-Sequenz wird für ein Pre-Pro-Peptid, die leichte Kette von Protein C, eine Spaltungsstelle und die schwere Kette von aktiviertem Protein C codieren. Die DNA-Sequenz kann weiter für ein Spacer-Peptid zwischen der leichten und der schweren Kette codieren.
Bei einer Ausführungsform wird die entstehende Sequenz für die leichte und schwere Kette von Protein C, die durch die Sequenz Lys-Arg verbunden sind, codieren. Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, wird die leichte Kette von aktiviertem Protein C so verstanden, daß sie die Aminosäuren 1-149 der in Fig. 1 geoffenbarten Sequenz oder im wesentlichen homologe Sequenzen hiezu oder solche Sequenzen, die C-terminale Extensionen aufweisen, im allgemeinen Extensionen von 1 bis etwa 6 Aminosäuren, umfaßt. Die schwere Kette des aktivierten Protein C wird so verstanden, daß sie das Aktivierungspeptid nicht einschließt (d.h. es wird bei Aminosäure Nr. 170, Leucin, wie in Fig. 1 im Fall von humanem aktiviertem Protein C gezeigt ist, begonnen).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA-Sequenz weiterhin so modifiziert, daß sie eine oder mehrere neue Spaltungsstellen zwischen der leichten und der schweren Kette enthält. Die Spaltungsstelle kann in der Form der Aminosäuresequenz (R&sub1;)n-R&sub2;- R&sub3;-R&sub4; vorliegen, worin R&sub1; bis R&sub4; für Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) und n für eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 stehen. Besonders bevorzugte Sequenzen inkludieren Arg-Arg-Lys- Arg, Lys-Arg-Lys-Arg und Lys-Lys-Arg. Andererseits kann die Spaltungsstelle in der Form von R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-X-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8; vorliegen, worin jeder der Reste R&sub1; bis R&sub8; für Lys oder Arg steht und X eine Peptidbindung oder ein Spacer-Peptid mit 1 bis 12 Aminosäuren darstellt. Spacer-Peptide, die in dieser Hinsicht verwendbar sind, inkludieren die Aminosäuresequenzen Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro, Asp-Thr-Glu-Asp-Gln- Glu-Asp-Gln, Asp-Thr-Asp-Gln, Asp-Gln, Asn-Ile-Leu-Asn und das native Protein C-Aktivierungspeptid mit der Aminosäuresequenz Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp- Pro-Arg. Eine dritte Gruppe von Modifikationen der Spaltungsstelle inkludiert den Ersatz des Aminosäurerestes 154 (His) des nativen humanen Protein C durch einen Aminosäurerest, der aus der aus Lys, Arg und Leu bestehenden Gruppe ausgewählt ist, um eine Spaltungsstellensequenz der allgemeinen Formel Y-Z-R&sub1;-R&sub2; zu ergeben, worin Y für Lys, Arg oder Leu; R&sub1; und R&sub2; für Lys oder Arg stehen und Z eine andere Aminosäure als Lys oder Arg, vorzugsweise Leu, darstellt. Repräsentative Spaltungsstellen-Mutanten, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sein können, sind weiter unten in Tabelle I gezeigt. Die Spaltungsstellen 829, 1058, 1645, 1880, 1953, 1954, 1962, 2043, 2155 und 2274 sind zur direkten Herstellung von aktiviertem Protein C verwendbar. Tabelle I Aminosäuresequenzen der Spaltungsstellen-Mutanten
Eine Modifikation der DNA-Sequenz kann durch stellenspezifische Mutagenese erreicht werden. Die Techniken für die stellenspezifische Mutagenese sind in der Fachwelt allgemein bekannt und werden zum Beispiel von Zoller und Smith (DNA 3:479-488, 1984) beschrieben. Andererseits kann die Protein C-Sequenz vom Wild-Typ enzymatisch gespalten werden, um die native Aktivierungspeptidsequenz und die für die schweren und leichten Ketten codierenden Sequenzen, die an eine synthetisierte DNA-Sequenz gebunden sind, die für eine der oben beschriebenen Spaltungsstellen codiert, zu entfernen.
Wie von den Fachleuten auf diesem Gebiet verstanden werden wird, können auch Varianten und Analoga von Protein C im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Methoden hergestellt werden. Varianten und Analoga von Protein C inkludieren jene, die geringere Aminosäure-Änderungen enthalten, wie etwa solche, die auf genetischen Polymorphismus zurückzuführen sind, und solche, in welchen Aminosäuren eingesetzt, deletiert und/oder substituiert wurden, ohne daß die biologische Aktivität des Proteins deutlich herabgesetzt wurde. Analoga von Protein C inkludieren weiters Proteine, bei denen der amino-terminale Abschnitt des Proteins C (gla-Bereich) durch einen gla-Bereich eines der Vitamin K-abhängigen Plasmaproteine Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin oder Protein S ersetzt ist. Der gla-Bereich überspannt etwa 35-45 Aminosäurereste an den Amino-Termini dieser Proteine, wobei eine C-terminale Grenze im allgemeinen einer Exon-Intron-Grenze in dem respektiven Gen entspricht. Der gla-Bereich von humanem Protein C erstreckt sich von der Aminosäure Nummer 1 der reifen leichten Kette bis etwa zur Aminosäure Nummer 37.
Die DNA-Sequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden für ein Pre-Pro-Peptid an dem Amino-Terminus des hybriden Protein C-Moleküls codieren, um eine gute post-translationelle Prozessierung (z.B. gamma-Carboxylierung der Glutaminsäurereste) und Ausscheidung aus der Wirtszelle zu erreichen. Das Pre-Pro-Peptid kann jenes von Protein C oder von einem anderen Vitamin K-abhängigen Plasmaprotein sein, wie etwa Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin oder Protein S. Im allgemeinen ist es bevorzugt, wenn das Pre-Pro-Peptid und der gla-Bereich aus demselben Protein gewonnen werden.
Die für das hybride Protein C codierende DNA-Sequenz wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt, welcher dann zur Transfektion gezüchteter Säugetierzellen verwendet wird. Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden einen Promotor umfassen, der zur Lenkung der Transkription eines geklonten Gens oder von cDNA befähigt ist. Bevorzugte Promotoren sind u.a. virale Promotoren und zelluläre Promotoren. Virale Promotoren sind u.a. der SV40 Promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) und der CMV-Promotor (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985). Ein besonders bevorzugter viraler Promotor ist der größere späte Promotor von Adenovirus 2 (Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). Zelluläre Promotoren inkludieren den Maus-Kappa-Genpromotor (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) und den Maus VH Promotor (Loh et al., Cell 33:85-93, 1983). Ein besonders bevorzugter zellulärer Promotor ist der Maus- Methallothionein-I-Promotor. (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983). Expressionsvektoren können auch eine Gruppe von RNA-Spleißstellen stromabwärts von dem Promotor und stromaufwärts von der Insertionsstelle für die Protein C-Sequenz selbst enthalten. Bevorzugte RNA-Spleißstellen können aus Adenovirus und/oder Immunglobulin- Genen gewonnen werden. Ebenso in den Expressionsvektoren enthalten ist ein Polyadenylierungssignal, das stromabwärts der Insertionsstelle lokalisiert ist. Besonders bevorzugte Polyadenylierungssignale inkludieren das frühe oder späte Polyadenylierungssignal von SV40 (Kaufman und Sharp, ibid.), das Polyadenylierungssignal der Adenovirus 5 Elb-Region, den humanen Wachstumshormon-Genterminator (DeNoto et al. Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) oder das Polyadenylierungssignal aus dem humanen Protein C-Gen oder dem bovinen Protein C-Gen. Die Expressionsvektoren können auch eine nicht-codierende virale Führungssequenz enthalten, wie etwa den dreiteiligen Führer von Adenovirus 2, der zwischen dem Promotor und den RNA-Spleißstellen lokalisiert ist; sowie Verstärker- Sequenzen, wie etwa den SV40 Verstärker und die Sequenzen, die für die Adenovirus VA RNAs codieren.
Geklonte DNA-Sequenzen werden in gezüchtete Säugetierzellen eingeführt durch zum Beispiel Kalziumphosphat-mediierte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) oder durch Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Zur Identifikation und Selektion von Zellen, die die exogene DNA exprimieren, wird ein Gen, welches einen selektierbaren Phenotyp (einen selektierbaren Marker) beiträgt, im allgemeinen gemeinsam mit dem interessierenden Gen oder der cDNA in die Zellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker inkludieren Gene, die Widerstandsfähigkeit gegen Arzneimittel, wie etwa Neomycin, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist eine Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Sequenz. Selektierbare Marker sind übersichtsmäßig von Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) zusammengestellt. Die Auswahl von selektierbaren Markern liegt wohl innerhalb des Könnens des durchschnittlichen Fachmanns auf diesem Gebiet.
Selektierbare Marker können in die Zelle auf einem getrennten eigenen Plasmid gleichzeitig mit dem interessierenden Gen eingesetzt werden oder sie können mit demselben Plasmid eingesetzt werden. Wenn sie auf demselben Plasmid vorliegen, können der selektierbare Marker und das relevante Gen unter der Steuerung unterschiedlicher Promotoren oder des gleichen Promotors stehen, wobei die letztgenannte Anordnung eine dicistronische Botschaft hervorruft. Konstrukte dieser Art sind in der Fachwelt bekannt (zum Beispiel Levinson und Simonsen, US-Patent 4,713.339). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche DNA, die als "Träger-DNA" bekannt ist, der Mischung, die in die Zelle eingeführt wird, zuzusetzen.
Nachdem die Zellen die DNA aufgenommen haben, werden sie in einem geeigneten Wachstumsmedium in der Regel 1 bis 2 Tage gezüchtet, um die Expression des relevanten Gens zu beginnen. Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet "geeignetes Wachstumsmedium" ein Medium, das Nährstoffe und andere zum Wachstum von Zellen und zur Expression des Protein C-Gens erforderliche Komponenten enthält. Die Medien enthalten im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, essentielle Zucker, Vitamine, Salze, Phospholipide, Protein und Wachstumsfaktoren. Zur Produktion von gamma-carboxyliertem Protein C wird das Medium Vitamin K, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 ug/ml bis etwa 5 ug/ml, enthalten. Es erfolgt dann die Auswahl des Wirkstoffs zur Selektion hinsichtlich des Wachstums der Zellen, die den selektierbaren Marker in stabiler Weise exprimieren. Für Zellen, die mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker transfiziert wurden, kann die Wirkstoffkonzentration gesteigert werden, um hinsichtlich einer erhöhten Kopienzahl der geklonten Sequenzen zu selektieren, wodurch die Expressionsgrade erhöht werden. Klone von stabil transfizierten Zellen werden dann hinsichtlich der Expression von Protein C gescreent.
Bevorzugte Säugetier-Zell-Linien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung inkludieren die Zell-Linien COS-1 (ATCC CRL 1650), Baby-Hamsterniere (BHK) und 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Bevorzugte BHK-Zell- Linien inkludieren die Zell-Linie tk&supmin; ts13 BHK (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), die im folgenden hier als BHK 570 Zellen bezeichnet werden. Die BHK 570 Zell-Linie wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, vor der Einreichung dieser Patentanmeldung unter der ATCC Nummer CRL 10314 hinterlegt. Die Zell-Linie tk&supmin; t513 BHK ist auch von der ATCC unter der Nummer CRL 1632 erhältlich. Zusätzlich dazu kann eine Reihe anderer Zell-Linien für die vorliegende Erfindung verwendet werden, inklusive Rat Hep I (ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Humane Lunge (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9,1), CHO (ATCC CCL 61) und DUKX- Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).
Die Prozessierung von aktivierten Protein C-Präcursoren durch Spaltung hinter einem Lys-Arg Dipeptid zwischen der leichten und der schweren Kette kann durch Einführung des S. cerevisiae KEX2 Gens in die Wirtszelle verstärkt werden, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 319.944 beschrieben wurde. Das KEX2 Gen codiert für eine Endopeptidase, die hinter einer dibasischen Aminosäuresequenz spaltet (Fuller et al., in Leive, Hg., Microbiology 1986, 273-278). Eine gezüchtete Säugetier-Zell- Linie, die mit diesem Gen stabil transfiziert ist, ist somit zur Expression von aktiviertem Protein C geeignet.
Protein C, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, kann durch Affinitäts-Chromatografie auf einer Anti-Protein C Antikörper-Säule gereinigt werden. Die Verwendung von Kalzium-abhängigen monoklonalen Antikörpern, wie sie von Wakabayashi et al. (J. Biol. Chem. 261:11097-11108, 1986) beschrieben ist, ist besonders bevorzugt. Zusätzliche Reinigung kann durch übliche chemische Reinigungsmittel, wie etwa Flüssig-Chromatografie, erreicht werden. Andere Reinigungsmethoden, inklusive Bariumzitrat-Fällung, sind in der Fachwelt bekannt und können zur Reinigung des neuen, hierin beschriebenen Protein C verwendet werden (vgl. allgemein Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Es wird im wesentlichen reines Protein C mit einer Homogenität von mindestens etwa 90 bis 95 % bevorzugt und besonders für pharmazeutische Zwecke bevorzugt ist eine Homogenität von 98 bis 99 % oder höher. Sobald das Protein C teilweise oder bis zur Homogenität gereinigt wurde, kann es therapeutisch eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Protein C-Moleküle und pharmazeutische Zusammensetzungen hievon sind besonders zur Verabreichung an Menschen zur Behandlung einer Vielzahl von Zuständen geeignet, bei denen intravaskuläre Koagulation beteiligt ist. Obwohl zum Beispiel tiefliegende Venenthrombose und Pulmonarembolie mit üblichen Antikoagulantien behandelt werden können, kann das hierin beschriebene Protein C verwendet werden, um das Auftreten von thromboembolischen Komplikationen bei Patienten zu vermeiden, die ein hohes Risiko tragen, wie etwa solche, bei denen chirurgische Eingriffe stattfanden, oder solche mit kongestivem Herzversagen. Da aktiviertes Protein C selektiver ist als Heparin, welches im Körper im allgemeinen dort aktiv ist, wo und wenn Thrombin gebildet wird und Fibrin-Thromben entstehen, wird das Protein C wirksamer sein und weniger leicht die Ursache für Blutungskomplikationen darstellen als Heparin, wenn es prophylaktisch zur Verhinderung von tiefliegender Venenthrombosen verwendet wird. Die Dosis des Protein C zur Prevention von tiefliegender Venenthrombose liegt im Bereich von etwa 100 ug bis 100 mg pro Tag, vorzugsweise 1 bis 10 mg/Tag, und die Verabreichung sollte mindestens etwa 6 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff beginnen und mindestens solange dauern, bis der Patient ambulant behandelt wird. Bei nachgewiesener tiefliegender Venenthrombose und/oder Pulmolarembolie liegt der Bereich der Dosen des Protein C bei etwa 100 ug bis 100 mg als Ladedosis, worauf Aufrechterhaltungsdosen im Bereich von 3 bis 300 mg/Tag folgen. Wegen der geringeren Wahrscheinlichkeit von Blutungskomplikationen durch Protein C-Infusionen kann das Protein C die Heparindosis während oder nach dem chirurgischen Eingriff im Zusammenhang mit Thrombectomien oder Embolectomien ersetzen oder vermindern.
Die erfindungsgemäßen Protein C-Zusammensetzungen werden auch mit vorteil bei der Verhinderung von kardiogenen Embolien und bei der Behandlung von thrombotischen Schlaganfällen eingesetzt. Wegen seiner geringen Möglichkeit, Blutungskomplikationen zu verursachen, und wegen seiner Selektivität kann Protein C Schlaganfallspatienten gegeben werden und kann eine Ausdehnung des okkludierenden Arterienthrombus verhindern. Die verabreichte Menge des Protein C wird bei jedem Patient von der Art und Stärke des Schlaganfalls abhängen, jedoch werden die Dosen im allgemeinen im Bereich der oben vorgeschlagenen liegen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen von aktiviertem Protein C, wie sie hierin zur Verfügung gestellt werden, werden bei der Behandlung von akutem Myokardinfarkt gut verwendbar sein, da aktiviertes Protein C imstande ist, in vivo Fibrinolyse zu verstärken. Aktiviertes Protein C kann mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder mit Streptokinase während der akuten Phasen des Myokardinfarkts verabreicht werden. Nach der Auflösung des okkludierenden Coronarthrombus kann aktiviertes Protein C in den anschließenden Tagen oder Wochen verabreicht werden, um eine neuerliche coronare Occlusion zu verhindern. Bei akutem Myokardinfarkt wird dem Patienten eine Ladedosis von mindestens etwa 1-500 mg aktiviertes Protein C verabreicht, worauf Aufrechterhaltungsdosen von 1-100 mg/Tag folgen.
Das erfindungsgemäße Protein C ist zur Behandlung von disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) entweder in Form des Zymogens oder in aktivierter Form verwendbar. Patienten mit DIC haben in charakteristischer Weise weit verbreitete mikrozirkulatorische Thromben und oft schwere Blutungsprobleme, die aus dem Verbrauch der essentiellen Gerinnungsfaktoren resultieren. Wegen seiner Selektivität wird Protein C die mit DIC zusammenhängenden Blutungsprobleme nicht erschweren, wie dies die üblichen Antikoagulantien tun, sondern wird die Bildung zusäzlicher mikrovaskulärer Fibrinablagerungen verzögern oder inhibieren.
Da die neuen Protein C-Moleküle, die hiemit bereitgestellt werden, im allgemeinen eine längere Halbwertszeit als authentisches humanes Protein C haben, liegt eine signifikante Verwendung dieser Zusammensetzungen in der Behandlung von Personen, die eine ererbte Protein C-Defizienz haben. Solche Patienten, die hinsichtlich ihrer Defizienz homozygot oder heterozygot sind, können an schweren Thrombosen leiden. Sie werden derzeit mit Konzentraten von Faktor IX behandelt, die Protein C enthalten. Zur Behandlung von homozygoten defizienten Personen, bei denen ein durchschnittliches Blutplasmavolumen von etwa 3000 ml angenommen wird und eine gewisse Diffusion in den extravaskulären Raum gestattet wird, kann erfindungsgemäßes Protein C ein- oder mehrfach täglich in Mengen von 1-300 mg täglich verabreicht werden. Heterozygote Personen mit Protein C- Defizienz werden im allgemeinen niedrigere Dauerdosen als homozygote Personen brauchen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung gedacht. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, d.h. intravenös, subcutan oder intramuskulär. Somit stellt diese Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung der in einem verwendbaren Träger, vorzugsweise einem wässerigen Träger, gelösten Protein C-Moleküle enthalten. Es kann eine Vielzahl wässeriger Träger Verwendung finden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Salzlösung, 0,3 % Glycin und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch übliche allgemein bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die entstehenden wässerigen Lösungen können zur Verwendung abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierten Präparate vor der Verabreichung mit einer sterilen wässerigen Lösung vereinigt werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verwendbare Hilfssubstanzen enthalten, wie sie zur Annäherung physiologischer Bedingungen erforderlich sein können, wie etwa pH-Einstellungs- und Puffermittel, Mittel zur Einstellung der Tonizität und dergleichen, wie beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, etc. Die Konzentration von Protein C in diesen Formulierungen kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5 Gew.-%, üblicherweise 1 % oder mindestens etwa 1 % bis hinauf zu etwa 15 Gew.-% oder 20 Gew.-%, und wird in erster Linie gemäß den Fluidvolumina, Viskositäten, etc. je nach der speziellen gewünschten Verabreichungsform ausgewählt.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion so erstellt werden, daß sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 10 mg Protein C enthält. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind bekannt oder für den Fachmann auf diesem Gebiet offenkundig und sind detaillierter zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Science, 16. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA (1982) beschrieben.
Die die Protein C-Moleküle oder einen Cocktail hievon enthaltenden Zusammensetzungen können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits an einer Krankheit gemäß obiger Beschreibung leidet, in einer Menge verabreicht, die zur Heilung oder zu mindestens teilweisem Stillstand der Krankheit und ihrer Komplikationen ausreicht. Eine Menge, die zur Erreichung dessen adequat ist, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung ausreichen, werden von der Schwere der Erkrankung oder Verletzung und dem allgemeinen Zustand des Patienten abhängen, liegen jedoch im allgemeinen im Bereich von etwa 1 mg bis etwa 300 mg Protein C pro Tag, wobei Dosierungen von etwa 5 mg bis etwa 25 mg Protein C pro Tag häufiger eingesetzt werden. Es muß bedacht werden, daß die erfindungsgemäßen Stoffe im allgemeinen bei schweren Erkrankungs- oder Verletzungszuständen verwendet werden, d.h. in lebensbedrohenden oder möglicherweise lebensbedrohenden Situationen. In solchen Fällen ist es im Hinblick auf die Minimierung von Fremdsubstanzen und der verlängerten Halbwertszeit des Protein C in humanem Plasma, welche Fakten durch diese Erfindung erreichbar wurden, möglich und kann vom behandelnden Arzt als wünschenswert erachtet werden, daß beträchtliche Überschüsse dieser Protein C-Zusammensetzungen verabreicht werden.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden die das hybride Protein C enthaltenden Zusammensetzungen einem Patienten verabreicht, der für eine Krankheit empfänglich ist oder auf andere Weise das Risiko eines Krankheitszustands oder einer Verletzung in sich trägt, damit die dem Patienten eigene antikoagulative oder fibrinolytische Fähigkeit unterstützt wird. Eine solche Menge ist als eine "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung werden wieder die genauen Mengen vom Gesundheitszustand des Patienten und dem allgemeinen Spiegel von endogenem Protein C abhängen, werden jedoch meist im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa 250 mg pro 70 Kilogramm Patient, insbesondere etwa 1 mg bis etwa 25 mg pro 70 kg Körpergewicht liegen.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosierungsmengen und Dosierungsmustern vorgenommen werden, die vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Für ambulante Patienten, die tägliche Dosen zur Aufrechterhaltung brauchen, kann das Protein C durch kontinuierliche Infusion unter Verwendung zum Beispiel eines tragbaren Pumpensystems verabreicht werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge des erfindungsgemäßen Protein C ergeben, die zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreicht.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der Erfindung und nicht zu deren Einschränkung angeboten.

BEISPIEL I

Konstruktion von human-bovin-hybridem Protein C

Dieses Beispiel beschreibt den Aufbau einer Codierungssequenz für hybrides Protein C, die für ein hybrides Protein C mit einer humanen Pre-Pro-Sequenz, einer humanen leichten Kette, einem humanen Aktivierungspeptid und der ersten Aminosäure der schweren Kette von humanem aktivierten Protein C codiert, worauf der Rest der Sequenz der schweren Kette des bovinen Protein C anschließt. Im Anschluß an die Ausscheidung aus der Wirtszelle und an die Aktivierung umfaßt das Protein die leichte Kette des humanen Protein C, die durch Disulfidbindung an eine schwere Kette gebunden ist, die die erste Aminosäure (Leucin) der humanen schweren Kette und anschließend die bovine Schwerkettensequenz ab der zweiten Aminosäure (Valin) enthält. Es zeigt sich, daß das hybride Molekül, das in den folgenden Beispielen angegeben ist, erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen die Inaktivierung durch alpha-1-Antitrypsin und andere humane Plasmafaktoren hat.

A. Klonierung von boviner Schwerketten-cDNA

Bovine cDNA, die für die schwere Kette des Protein C codiert, wurde aus einer bovinen Leber-cDNA λgt11 Bibliothek (erhalten von Clontech, Palo Alto, CA 94301) durch Sondierung der Bibliothek mit einem random-primed cDNA-Fragment von humanem Protein C geklont.

1. Herstellung einer humanen Protein C-cDNA-Sonde

Eine cDNA-Sequenz, die für einen Abschnitt von humanem Protein C codiert, wurde nach der Beschreibung von Foster und Davie (ibid.) hergestellt. Kurz gesagt, wurde eine λgt11 cDNA Bibliothek aus humaner Leber-mRNA nach üblichen Verfahren hergestellt. Die Klone wurden unter Verwendung eines ¹²&sup5;I-markierten affinitätsgereinigten Antikörpers für humanes Protein C gescreent und es wurde ein Phage aus positiven Klonen nach der Platten-Lysat-Methode hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, worauf Bandenentwicklung mit einem Cäsiumchlorid-Gradienten folgte. Die cDNA-Inserte wurden unter Verwendung von Eco RI entfernt und in das Plasmid pUC9 subgeklont (Vieira und Messing, Gene 19:259-268, 1982). Die Restriktionsfragmente wurden in die Phagen-Vektoren M13mp10 und M13mp11 (Messing, Meth. Enzymol. 101:20-77, 1983) subgeklont und anschließend nach der Dideoxy-Methode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5464-5467, 1977) sequenziert. Ein Klon, der die der bekannten Partialsequenz von humanem Protein C entsprechende DNA enthielt (Kisiel, ibid., 1979) und für Protein C codierte, wobei bei der Aminosäure 64 der leichten Kette begonnen wurde und über die schwere Kette hinweg und in die 3' nicht-codierende Region fortgesetzt wurde, wurde ausgewählt. Dieser Klon erhielt die Bezeichnung λHC1375. Ein zweiter cDNA-Klon, der für das Protein C von der Aminosäure 24 weg codierte, wurde ebenfalls identifiziert. Das Insert aus dem größeren Klon wurde in pUC9 subgeklont und das Plasmid erhielt die Bezeichnung pHCλ6L. Dieser Klon codiert für einen größeren Teil des Protein C, inklusive der Codierungsregion der schweren Kette, des Terminationscodons und der 3'-nicht-codierenden Region.
Das cDNA-Insert aus λHC1375 wurde unter Verwendung von alpha-³²P dNTPs Nick-translatiert und zur Sondierung einer humanen genomischen Bibliothek im Phagen λCharon 4A verwendet (Maniatis et al., Cell 15:687-702, 1978), wobei das Plaque- Hybridisierungsverfahren von Benton und Davis (Science 196:181-182, 1977) mit der Modifikation von Woo (Meth. Enzymol. 68:381-395, 1979) eingesetzt wurde. Es wurden positive Klone isoliert und plaque-gereinigt (Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4673-4677, 1985). Es wurde Phagen-DNA aus positiven Klonen hergestellt (Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) und mit Eco RI oder Bgl II angedaut und die genomischen Inserte wurden gereinigt und in pUC9 subgeklont. (Die Restriktionsfragmente der genomischen Inserte wurden in M13 Vektoren subgeklont und sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und die DNA-Sequenz des gesamten Gens festzustellen.)
Das cDNA-Insert von pHCλ6L wurde Nick-translatiert und zur Sondierung Bibliothek des Phagen λCharon 4A verwendet. Ein genomischer Klon wurde identifiziert, der mit Sonden hybridisierte, die aus den 5'- und 3'-Enden der cDNA hergestellt worden waren. Dieser Phagen-Klon wurde mit Eco RI angedaut und ein 4,4 kb-Fragment, das dem 5'-Ende des Protein C-Gens entsprach, wurde in pUC9 subgeklont. Das entstehende rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pHCR4.4. Die vollständige DNA-Sequenzanalyse ergab, daß das Insert in pHCR4.4 zwei Exons von 70 und 167 Basenpaaren, die durch ein Intron von 1263 bp voneinander getrennt waren, enthielt. Das erste Exon codiert für die Aminosäuren -42 bis -19; das zweite codiert für die Aminosäuren -19 bis 37. Die Sequenzanalyse bestätigte die DNA-Sequenz des gesamten Protein C-Gens.
Ein genomisches Fragment, das ein den Aminosäuren -42 bis -19 des Pre-Pro-Peptids von Protein C entsprechendes Exon enthielt, wurde isoliert, Nick-translatiert und als eine Sonde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu sichten, die nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (Gene 25:263-269, 1983) aufgebaut war, wobei mRNA aus Hep G2 Zellen verwendet wurde. Diese Zell-Linie stammte von humanen Heptozyten und es hatte sich vorher gezeigt, daß sie Protein C synthetisierte (Fair und Bahnak, Blood 64:194-204, 1984). Zehn positive Klone, die cDNA in die Eco RI Stelle des Phagen λgt11 eingesetzt enthielten, wurden isoliert und mit einer Oligonucleotid-Sonde, die der 5'-nicht-codierenden Region des Protein C-Gens entsprach, gesichtet. Ein Klon war auch mit dieser Sonde positiv und seine gesamte Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Die cDNA enthielt eine 70 bp 5'- untranslatierte Sequenz, die gesamte Codierungssequenz für humanes Pre-Pro-Protein C und die gesamte 3'-nicht-codierende Region, die der zweiten Polyadenylierungsstelle entsprach. Die cDNA-Sequenz und die codierte Aminosäuresequenz sind in Fig. 1 dargestellt.
Die Protein C-cDNA wurde als ein Eco RI-Fragment isoliert und in den Vektor pDX geklont (Hagen et al., US-Patent 4,784.950), wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung EP 266.190 geoffenbart ist. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse gesichtet, um jene zu identifizieren, die das Protein C-Insert in der korrekten Orientierung im Hinblick auf die Promotor-Elemente enthielten, und die Plasmid- DNA (mit der Bezeichnung pDX/PC) wurde aus einem korrekten Klon präpariert. Da das cDNA-Insert in pDX/PC ein ATG-Codon in dem 5'-nicht-codierenden Bereich enthielt, wurde Oligonucleotid-gelenkte Deletionsmutagenese an der cDNA vorgenommen, um die drei Basenpaare zu entfernen. Der entstehende Vektor mit der Bezeichnung p594 enthielt die Protein C-cDNA in operabler Verbindung mit dem größeren späten Promotor von Adenovirus 2 (Fig.2). Dieser Vektor enthielt auch den Replikationsursprung von Adenovirus 5 (Sequenz 0 bis 1 Karteneinheiten), den SV40 Verstärker, den dreiteiligen Führer von Adenovirus 2, einen Satz von RNA-Spleißstellen, ein SV40 Polyadenylierungssignal und ein Dihydrofolat-Reduktase-Gen als selektierbaren Marker.

2. Isolierung des bovinen cDNA-Klons

Unter Verwendung des random-primed 1,7 kb Eco RI-Fragments aus p594, das die humane Protein C-cDNA enthielt, wurde eine bovine Leber-cDNA λgt11 Bibliothek auf Protein C-cDNA sondiert. Es wurde ein boviner Klon identifiziert und als ein Eco RI- Fragment gewonnen und in pUC9 geklont. Das entstehende Plasmid wurde mit Taq I und Exo RI geschnitten und das für die schwere Kette des Protein C codierende Fragment wurde gewonnen.

B. Herstellung der Leichtketten-cDNA von humanem Protein C

Zur Gewinnung einer humanen Leichtketten-cDNA zur endgültigen Vereinigung mit dem bovinen Taq I-Eco RI-Fragment wurde ein entsprechendes Restriktionsfragment aus einer DNA-Sequenz (mit der Bezeichnung PC962) hergestellt, welches für das humane Protein C codierte. Die PC962 DNA wurde aus p594 gemäß obiger Beschreibung hergestellt und enthielt eine DNA-Sequenz, die für zwei zusätzliche Arginin-Reste an der Verbindung zwischen der leichten Kette und dem Aktivierungspeptid von Protein C codierte (Tabelle I). Die geklonte humane cDNA in p594 wurde durch stellenspezifische Mutagenese (im wesentlichen nach der Beschreibung von Zoller und Smith, DNA 3:479-488 (1984)) verändert, wobei das mutagene Oligonucleotid ZC962 (5' AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA GAC A 3') und das Oligonucleotid ZC550 (5' TCC CAG TCA CGA CGT 3') verwendet wurden. Das Plasmid p594 wurde mit Sst I angedaut, das etwa 840 bp- Fragment wurde in M13mp11 geklont und die einzelstrangige Templat-DNA wurde isoliert. Im Anschluß an die Mutagenese wurde ein korrekter Klon durch Sequenzierung identifiziert. DNA in replikativer Form wurde isoliert und mit Sst I angedaut, um das mutagene Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit dem mit Sst I geschnittenen p594 in einer zweiteiligen Ligation verbunden. Klone mit dem in der gewünschten Orientierung eingesetzten Sst I-Fragment wurden durch Restriktionsenzmkartierung identifiziert. Der entstehende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pDX/PC962.
Ein zweiter Expressionsvektor mit der Bezeichnung PC229/962 wurde durch Einsetzen der PC962-cDNA in das Plasmid Zem229 konstruiert. Zem229 ist ein auf pUC18 basierender Expressionsvektor, der eine einmalige Bam HI-Stelle zur Insertion von Fremd- DNA zwischen dem Maus-Metallothionein-I Promotor und dem SV40 Transkriptionsterminator enthält. Zem229 enthält auch eine Expressionseinheit des frühen SV40 Promotors, das Maus-Dihydrofolat-Reduktase-Gen und den SV40 Terminator. Ein Eco RI-Fragment, das die PC962 cDNA aus pDX/PC962 enthielt, wurde über synthetische Eco RI- Bam HI Oligonucleotid-Adapter an Zem229 angeschlossen, das mit Bam HI geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden war. Der entstehende Vektor mit der Bezeichnung PC229/962 ist in Fig.3 dargestellt.
Der Expressionsvektor PC962/ZMB-4 wurde aus Zem229, pDX (Hagen et al., US- Patent 4,784.950) und der PC962 DNA-Sequenz konstruiert.
Zem229 wurde modifiziert, um die Bam HI Klonierungsstelle in eine Eco RI-Stelle umzuwandeln. Das Plasmid wurde zuerst modifiziert, um seine beiden Eco RI-Stellen durch partielle Andauung mit Eco RI zu deletieren, wurde stumpfendig mit DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) und dNTPs verbunden und religiert. Das entstehende Plasmid wurde mit Bam HI angedaut und mit synthetischen Bam HI-Eco RI Adaptern ligiert. Das entstehende Plasmid erhielt die Bezeichnung Zem229R. Zem229R wurde mit HindIII und Eco RI angedaut und das 520 bp-Fragment, das den SV40 und MT-1 Promotor enthielt, wurde entfernt. Das große Fragment von Zem229R wurde dann an das -1100 bp HindIII-Eco RI- Fragment von pDX gebunden, welches den SV40 Promotor/Verstärker, den größeren späten Promotor von Adenovirus und einen Satz von Spleißsignalen enthält, um ZMB-4 zu konstruieren (Fig. 3). Die PC962-Sequenz wurde aus PC229/962 als ein Eco RI-Fragment isoliert, welches dann in ZMB-4 eingesetzt wurde, um PC962/ZMB-4 zu konstruieren (Fig.3).

C. Konstruktion der Codierungssequenz für hybrides Protein C

Die Codierungssequenz für human-bovines Protein C wurde durch Verbindung eines Eco RI-Sst II-Fragments von humaner Leichtketten-cDNA (aus PC962/ZMB-4) an ein Taq I-Eco RI-Fragment von boviner Schwerketten-cDNA unter Verwendung eines synthetischen Linkers aufgebaut. Der Linker wurde durch Annealing der Oligonucleotide ZC2228 (5'GGCTCGT 3') und ZC2229 (5'CGCCGAGCAGC 3') konstruiert. Das von der entstehenden Sequenz codierte hybride Protein hatte die Aminosäuresequenz von humanem Protein C von der ersten Aminosäure der schweren Kette mit dem anschließendem Rest der bovinen schweren Kette: (H Pre-Pro)-(H L-Kette)-Spaltungsstelle (RRKR)-(H Aktivierungspeptid)-Leu-(B H-Kette), wobei die Sequenz an der Verbindung human-bovin folgende ist: HUMAN BOVIN
Die hybride cDNA wurde durch Vereinigung der cDNA-Fragmente und des Linkers mit dem mit Eco RI angedauten Vektor ZMB-3 in einer vierteiligen Ligation zusammengebaut. Der Expressionsvektor ZMB-3 wurde aus Zem228 (EP 319.944) und pDX (Hagen et al., US-Patent 4,784.950) konstruiert. Zem228 ist ein auf pUC18 basierender Expressionsvektor, der eine einmalige Bam HI-Stelle zum Einsetzen von Fremd-DNA zwischen dem Maus-Metallothionein-I-Promotor und dem SV40-Transkriptiosterminator enthält. Zem228 enthält auch eine Expressionseinheit, die den frühen SV40 Promotor, das Neomycinresistenz-Gen und den SV40-Terminator enthält. Somit steht in Zem228 das eingesetzte Gen unter der Steuerung des Metallothionein-I-Promotors und des SV40-Terminators und der Vektor kann mit dem Antibiotikum Neomycin selektiert werden. Um seine beiden Eco RI-Stellen zu entnehmen, wurde Zem228 durch teilweise Andauung mit Eco RI, stumpfendige Verbindung mit DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) und dNTPs, Religation, Andauung mit Bam HI und Ligation mit Bam HI-Eco RI Adaptern modifiziert, um das Plasmid Zem228R zu konstruieren. Zem228R wurde mit Hind III und Eco RI angedaut und das 520 bp-Fragment, das den SV40 und die MT-1 Promotoren enthält, wurde entfernt. Das große Fragment von Zem228R wurde dann an das 1100 bp Hind III-Eco RI- Fragment von pDX angeschlossen, welches den SV40-Promotor/Verstärker, den größeren späten Promotor von Adenovirus und einen Satz von Spleißsignalen enthält. Der entstehende Vektor erhielt die Bezeichnung ZMB-3 (Fig. 4).
Der Vektor ZMB-3, der die Codierungssequenz für das hybride human-bovine Protein C enthält, wurde in tk&supmin;ts13 BHK Zellen (ATCC CRL 1632) transfiziert. Die Transfektanten wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10 % fötales Rinderserum und 500 ug/ml G-418 enthielt, selektiert. Die konditionierten Medien wurden geerntet und das rekombinante Protein C wurde durch Immuno-Affinitäts-Chromatografie auf einer PCL-2-Sepharose-Säule gereinigt. Diese Säule wurde durch Kopplung eines monoklonalen Antikörpers (mit der Bezeichnung PCL-2), der für die Ca&spplus;&spplus;-gebundene leichte Kette von Protein C spezifisch war, an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) vorbereitet. Die Proben wurden auf die Säule in Anwesenheit von 10 mM CaCl&sub2; aufgebracht. Die Säule wurde mit 50 mM Tris HCl, 1,0 M NaCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH 7,5, gewaschen. Das Protein C wurde aus der Säule mit 15 mM EDTA in 50 mM Tris- HCl, pH 7,5, eluiert.

BEISPIEL II

Resistenz des hybriden Protein C gegen Inaktivierung

Die Fähigkeit eines Protein C-Inhibitors, wie alpha-1-Antitrypsin, zur Inhibierung von aktiviertem bovinen Protein C (erhalten von Enzyme Research Labs, South Bend, IN) und immunoaffinitäts-gereinigtem aktivierten rekombinanten humanen Protein C (von Baby- Hamsternieren-Zellen mit pDX/PC962 transfiziert) wurde mit der Inhibierung des aktivierten human-bovinen Protein C-Hybrids verglichen. Zur Aktivierung der Protein C-Moleküle wurde jedes derselben mit Protein C-Aktivator aus Agkistrodon contortrix contortrix (ACC-C erhalten von W. Kisiel, Univ. von New Mexico; vgl. Kisiel et al., J. Biol. Chem. 262:12607-12613 (1987)) kombiniert.
Zur Prüfung der Resistenz gegen Inaktivierung wurde eine 200 ul Lösung jedes Proteins (50 ug/ml in TBS [50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl] + 15 mM EDTA) mit 60 ng ACC-C und 5 ul BSA (50 mg/ml) vereinigt. Die Mischungen wurden 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Eine 20 ul Probe von jedem aktivierten Protein C wurde mit 5 ul BSA (50 mg/ml) und 0, 20, 40 oder 80 ul alpha-1-Antitrypsin 1 mg/ml (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in TBS bis zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 105 ul vereinigt. Die Mischungen wurden 18 1/2 Stunden bei 37ºC inkubiert, dann wurden 20 ul jeder Probe mit 80 ul 1 mM chromogenem Substrat (#336 Spectrozyme PCA, erhalten von American Diagnostica) vereinigt und bei Raumtemperatur etwa 10 Minuten inkubiert. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse, die in Fig. 5 gezeigt sind, deuten darauf hin, daß sowohl bovines als auch bovin-humanes hybrides Protein C gegen die Inaktivierung resistent waren, während aktiviertes humanes Protein C durch alpha-1-Antitrypsin leicht inaktiviert wurde.

BEISPIEL III

Resistenz von hybridem Protein C gegen Inaktivierung durch Humanplasma

Die Inaktivierung von bovin-humanem Protein C und humanem Protein C (PC962) durch Humanplasma wurde geprüft. Die Untersuchungen wurden im wesentlichen nach den Angaben von Beispiel II mit den folgenden Veränderungen vorgenommen.
Das bovin-humane hybride Protein C und Humanprotein C PC962 wurden durch Inkubation von 7,5 ug jedes Stoffes oder eines BSA-Vergleichs mit 375 ng ACC-C in 100 ul TBS/BSA während 90 Minuten bei 37ºC aktiviert. 20 Mikroliter Proben von aktiviertem Protein C wurden in die Vertiefungen von 96-er Mikrotiterplatten eingebracht, worauf 0, 5, 10 oder 20 ul humanes Zitrat-Plasma in jede Vertiefung zugesetzt wurden. Die Probenvolumina wurden mit TBS/BSA auf 100 ul eingestellt und die Platten wurden bei 37ºC über Nacht (16 Stunden) inkubiert. Die Assays wurden durch Entnahme von 20 ul (zweifach) aus jeder Probe und Zugabe derselben zu 80 ul chromogenem Substrat (0,75 mM) entwickelt. Die Extinktion bei 405 nM wurde nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Ergebnisse, die in Fig. 6 gezeigt sind, deuten darauf hin, daß die Aktivität von humanem Protein C wesentlich rascher abnahm als die des hybriden Protein C, wenn die Proteine humanem Plasma ausgesetzt waren. Das aktivierte hybride Protein C schien in Abwesenheit von Plasma eine etwa 3-fach größere chromogene Aktivität aufzuweisen als das aktivierte humane Protein C. Das hybride Protein schien auch eine etwa 4-fach größere Halbwertszeit zu haben als das humane Protein.
Die Geschwindigkeiten der Inaktivierung von hybriden und humanen Protein C-Molekülen durch Humanplasma wurden dann verglichen. Die Assays wurden im wesentlichen nach der obigen Beschreibung durchgeführt, wobei 7,5 ug PC962 oder hybrides Protein C, die über Nacht (18 Stunden) mit 37,5 ng ACC-C in 100 ul TBS/BSA bei 37ºC aktiviert worden waren, verwendet wurden. Eine 10 ul Probe von beiden Stoffen wurde entnommen und zu 190 ul TBS/BSA zugesetzt. Die Mischungen wurden auf Eis gelegt, dann wurden jeweils 250 ul humanes Zitrat-Plasma zugesetzt und die Assays bei 37ºC inkubiert. Es wurden Proben (20 ul) zu den Zeitpunkten 0, 105, 185 und 240 Minuten entnommen und zu 80 ul chromogenem Substrat zugesetzt, worauf wie oben die Extinktion bei 405 nm bestimmt wurde.
Die Ergebnisse, die in Fig. 7 gezeigt sind, deuten darauf hin, daß die Halbwertszeit des hybriden Protein C in humanem Plasma etwa dreimal so groß war als die von humanem aktiviertem Protein C. Das hybride Protein und das humane aktivierte Protein C hatten etwa gleichwertige Antikoagulationswirkung in Humanplasma. Das deutet darauf hin, daß das bovin-humane hybride Protein C zur Behandlung von Menschen insofern besonders gut geeignet ist, als geringere oder weniger häufige Dosen von Protein C an einen Patienten verabreicht werden müssen, wodurch Kosten und Unbequemlichkeiten der Therapie für den Patienten vermindert werden.

BEISPIEL IV

Antikoagulierende Wirkung von hybridem Protein C

Die antikoagulierende Wirkung des aktivierten hybriden Protein C-Moleküls von Beispiel I wurde mit der von nativem humanen APC in dem APTT-Assay verglichen. Zwei Mikrogramm isoliertes hybrides Protein C oder rekombinantes PC962 wurden mit 50 ng ACC-C in 100 ul TBS vereinigt. Die Mischungen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann mit 100 ul normalem Humanplasma und 100 ul Actin FS (Dade, Miami, FL) vereinigt. Die entstehenden Mischungen wurden 100 Sekunden bei 37ºC inkubiert, worauf 100 ul aktiviertes Protein C in TBS zugesetzt wurden. Nach weiteren 100 Sekunden bei 37ºC wurden 100 ul 1 M CaCl&sub2; zu jeder Probe zugesetzt und die Gerinnungszeiten gemessen. Die Ergebnisse, die in Tabelle II gezeigt sind, deuten darauf hin, daß das hybride Protein C in Humanplasma eine antikoagulierende Wirkung hat, die mit der von nativem humanen Protein vergleichbar ist. Tabelle II

BEISPIEL V

Substitutionen von bovinen Sequenzen in die humane schwere Kette

A. Substitutionen im Zymogen Protein C

Zur Herstellung eines Protein C-Moleküls mit einer im wesentlichen humanen schweren Kette sowie erhöhter Stabilität und erhöhter Halbwertszeit in Humanplasma im Vergleich zu authentischem humanen aktivierten Protein C werden Sequenzen der schweren Kette von bovinem Protein C anstelle entsprechender Sequenzen der humanen schweren Kette substituiert.
Bei einer Modifikation der humanen schweren Kette erfolgt die Substitution der Aminosäuren der bovinen schweren Kette Gln-Glu-Ala-Gly-Trp (Aminosäuren 19-23: Numerierung nach Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4766-4770 (1984), wie in Fig. 8 gezeigt, für die Aminosäuren Lys-Met-Thr-Arg-Arg in der humanen schweren Kette (Aminosäuren 17-21; Numerierung nach Foster et al., id. und gemäß der Darstellung von Fig. 8). Zur Codierung der substituierten Aminosäuren wurde stellenspezifische Mutagenese mit dem synthetischen Oligonucleotid ZC2451 (5' CTC ATT GAT GGG CAG GAG GCT GGA TGG GGA GAC AGC CC 3') verwendet. Das Protein C Sst I Fragment von pDX/PC962 (Beispiel I) wurde in den Vektor M13mp10 geklont (Messing, Meth.Enzymol. 101:20-77 (1983)). Die einzelstrangige Templat-DNA wurde gemäß obigen Angaben hergestellt und unter Verwendung des Oligonucleotids ZC2451 im wesentlichen nach der Beschreibung von Zoller und Smith, DNA 3:479-488 (1984) stellengelenkter Mutagenese unterworfen, wobei die Zwei-Primer-Methode mit dem Oligonucleotid ZC550 eingesetzt wurde. Die positiven Klone wurden selektiert und zur Bestätigung der Mutagenese sequenziert. Die mutagenisierte Sequenz wurde aus der in replikativer Form vorliegenden DNA als ein Pst I-Sst I Fragment gewonnen. Dieses Fragment wurde in einer vierteiligen Ligation mit einem 592 bp Eco RI Pst I-Fragment aus dem Plasmid PC962/ZMB-4 (welches die 5' Protein C Codierungssequenz enthält), einem 700 bp Sst I-Eco RI-Fragment aus dem Plasmid PC962/ZMB-4 (welches die 3' Protein C Codierungssequenz enthält) sowie dem mit Eco RI angedauten und phosphatasierten ZMB-4 verbunden. Die Plasmide wurden hinsichtlich korrekter Insertorientierung durch Restriktionsenzymabbau gesichtet. Ein korrektes Plasmid wurde ausgewählt und zur Transfektion von tk&supmin;ts13 BHK Zellen (ATCC CRL 1632) durch Kalziumphosphat-Copräzipitation gemäß der Beschreibung in Beispiel I verwendet. Die Protein C produzierenden Transfektanten wurden mit 500 nM Methotrexat 2-3 Tage nach der Transfektion selektiert und es wurden Zellen-konditionierte Medien hergestellt. Das modifizierte Protein C wurde aus den Kulturüberständen gemäß obiger Beschreibung gereinigt. Die Empfindlichkeit des modifizierten Protein C gegenüber der Inaktivierung durch alpha-1-Antitrypsin und Humanplasma-Faktoren wurde geprüft, wie weiter unten beschrieben wird.
Eine andere Modifikation der humanen schweren Kette, die entweder getrennt oder gemeinsam mit anderen hierin beschriebenen Substitutionen erfolgt, ist die Substitution der bovinen Aminosäuren Arg-Asp-Glu-Thr (Reste 148-151 der schweren Kette) für die Aminosäuren His-Ser-Ser-Arg-Glu-Lys-Glu-Ala der humanen schweren Kette (Reste 146-153 der humanen schweren Kette) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids ZC2452 (5' GCT GGG GCT ACA GAG ACG AGA CCA AGA GAA ACC GC 3'). Das Sst I-Eco RI Fragment von pDX/PC962 (Beispiel I) wurde in den Vektor M13mp10 geklont. Die einzelstrangige Templat-DNA wurde hergestellt und einer stellengelenkten Mutagenese mit ZC2452 unterworfen, wobei die Zwei-Primer-Methode gemäß obiger Beschreibung verwendet wurde. Die positiven Klone wurden selektiert und zur Bestätigung der Substitution sequenziert. Das mutagenisierte Sst I-Eco RI Fragment wurde dann aus der in phagen-replikativer Form vorliegenden DNA neuerlich isoliert und in einer vierteiligen Ligation mit einem 330 bp Eco RI-Sal I Fragment aus dem Plasmid PC962/ZMB-4 (das die 5' Protein C Sequenz enthält), einem 730 bp Sal I-Sst I Fragment aus dem Plasmid PC962/ZMB-4 (das den Mittelteil der Protein C Sequenz enthält) und dem mit Eco RI angedauten und phosphatasierten ZMB-4 verbunden. Die Plasmide wurden hinsichtlich korrekter Insertorientierung durch Restriktionsenzymabbau gesichtet und eine korrekte Konstruktion wurde selektiert. Es erfolgte Transfektion gemäß obiger Beschreibung und das Protein C, das die modifizierte Stelle enthielt, wurde aus dem konditionierten Medium von erfolgreichen Transfektanten geerntet. Die Empfindlichkeit von in der schweren Kette modifiziertem Protein C gegen Inaktivierung wird mit der von unmodifiziertem Protein C gemäß obiger Beschreibung verglichen.
Eine Substitution der bovinen Sequenz Tyr-Asn-Ala-Cys-Val-His-Ala-Met-Glu-Asn- Lys (Aminosäuren 169-179 der schweren Kette) für die humane Schwerkettensequenz His- Asn-Glu-Cys-Ser-Glu-Val-Met-Ser-Asn-Met (humane Schwerkettenreste 171-181) wurde verwendet, um erhöhte Resistenz des Protein C-Moleküls gegenüber Inaktivierung zu schaffen. Das Sst I-Eco RI Fragment von pDX/PC962 wurde in den Vektor M13mp10 geklont, einzelstrangige Templat-DNA wurde hergestellt und dann erfolgte stellengelenkte Mutagenese mit synthetischem Oligonucleotid ZC3044 (5' CCC GTG GTC CCG TAC AAT GCA TGT GTC CAT GCC ATG GAA AAC AAG GTG TCT GAG AAC ATG CTG 3'), wobei die Zwei-Primer-Methode gemäß obiger Beschreibung verwendet wurde. Wie oben wurden die positiven Klone selektiert und zur Bestätigung der Mutagenese sequenziert. Die in replikativer Form (RF) vorliegende DNA aus einem positiven Klon wurde mit Sst I und Eco RI angedaut und die 700 bp Bande wurde gewonnen.
Zur Konstruktion des Expressionsvektors für die 3044 Mutante wurde das 700 bp Fragment mit dem mit Eco RI angedauten, mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsintestinalien behandelten Zem229R, dem 335 bp Eco RI-Sal I Protein C Fragment von PC229/962 und dem 730 bp Sal I-Sst I Protein C Fragment aus PC229/962 ligiert. Eine korrekte Konstruktion mit der Bezeichnung PC3044/Zem229R wurde durch Andauung mit Bgl II, Eco RI, Pst I und Ava II identifiziert.
Der Vektor PC3044/Zem229R wurde in BHK 570 Zellen transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen in 1 uM Methotrexat aufgespalten. Nach zweiwöchigem Wachstum wurden die Zellen durch einen Immunfilter-Assay mit einem monoklonalen Antikörper gegen die schwere Kette von humanem Protein C und einem zweiten Peroxidase-konjugierten Kaninchen Anti-Maus Antikörper gesichtet. Die positiven Klone wurden unter Verwendung des Substrats ECL (Amersham) festgestellt. Einzelne positive Klone wurden herausgenommen und expandiert und die konditionierten Medien wurden gesammelt. Das mutante Protein wurde aus den Medien unter Verwendung von Kalzium-abhängigem monoklonalen Antikörper PCL-2 gereinigt und untersucht, wie weiter unten beschrieben wird.
Die Aminosäurereste 249-260 der schweren Kette des bovinen Protein C (Lys-Ala- Gln-Glu-Ala-Pro-Leu-Glu-Ser-Gln-Pro-Val) werden unter Verwendung von stellengelenkter Mutagenese für die humanen Schwerkettenreste 251-262 (Arg-Asp-Lys-Glu-Ala- Pro-Gln-Lys-Ser-Trp-Ala-Pro) substituiert. Das Sst I-Eco RI Protein C Fragment von pDX/PC962 wurde in den Vektor M13mp10 geklont, eine einzelstrangige Templat-DNA wurde hergestellt und mit dem synthetischen Oligonucleotid ZC2454 (5' GGG CAC ATC AAA GCT CAG GAG GCC CCT CTT GAG AGC CAG GTG CCT TAG CGA CCC 3') einer stellengelenkten Mutagenese unterworfen, wobei die Zwei-Primer-Methode gemäß obiger Beschreibung verwendet wurde. Die positiven Klone wurden selektiert und zur Bestätigung der Mutagenese sequenziert und das mutagenisierte Sst I-Eco RI Fragment wurde neuerlich aus RF DNA isoliert. Das mutagenisierte Fragment wurde dann zur Konstruktion eines Expressionsvektors für die zymogene Form von Protein C verwendet. Der Vektor wurde konstruiert, indem das mutagenisierte RF-Fragment, das 592 bp Eco RI-Pst I Fragment aus PC962/ZMB-4, das 460 bp Pst I-Sst I Fragment aus PC962/ZMB-4 und das mit Eco RI angedaute und phosphatasierte ZMB-4 zusammenligiert wurden. Der entstehende Vektor wurde dann zur Transfektion von tk&supmin;ts13 BHK Zellen gemäß obiger Beschreibung verwendet und die Zellen wurden in 1 uM Methotrexat selektiert. Die erfolgreichen Transfektanten wurden identifiziert und gezüchtet und das Protein wurde aus zellen-konditionierten Medien gereinigt und auf die Widerstandsfähigkeit gegen alpha-1-Antitrypsin untersucht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, daß das mutante 2454 Konstrukt keine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen das alpha-1-Antitrypsin im Vergleich zu humanem aktivierten Protein C aufwies.

B. Protein-Kennzeichnung

Humanes Protein C (PC962), das human-bovine Hybrid (LMH), 2451, 2452 und 3044 wurden auf ihre Widerstandsfähigkeit gegen alpha-1-Antitrypsin und Humanplasma gemäß der allgemeinen obigen Beschreibung untersucht. Die Proteine wurden 3 Stunden in ACC-C bei 37ºC (unter Verwendung eines Verhältnisses von 100:1 Protein C:ACC-C) inkubiert, um sie zu aktivieren. Die Proteinkonzentrationen wurden so eingestellt, daß etwa gleiche chromogene Aktivitäten erreicht wurden (auf PC962 standardisiert).
Die Widerstandsfähigkeit gegen alpha-1-Antitrypsin (AAT) wurde unter Verwendung von 140 ul Reaktionsvolumina in TBS (pH 7,4), mit einem Gehalt an 140 ug/ml BSA und 800 ng aktiviertes Protein C sowie von 0 bis 80 ug ATT bestimmt. Die Mischungen wurden 16 Stunden bei 37ºC inkubiert, dann wurden 20 ul Proben aus jedem Röhrchen entnommen und zu 80 ul 1 mM Spectrozyme PCa (American Diagnostica) in Mikrotiterplatten zugesetzt. Nach etwa 20 Minuten wurde die A&sub4;&sub0;&sub5; der Reaktionsmischungen abgelesen. Eine Kurve der relativen chromogenen Aktivität in Abhängigkeit von der alpha-1-Antitrypsin Konzentration ist in Fig. 9 dargestellt. Es ist etwa die dreifache Menge alpha-1-Antitrypsin zur Inhibierung der Mutanten 2451 um 50 % im Vergleich zu 962 (humanes Wild- Typ Protein C), zu Mutante 2452 und zu Mutante 3044 erforderlich. Es bestand im wesentlichen keine Inhibierung des Hybrids LMH.
Der zeitliche Verlauf der Inaktivierung der Protein C-Mutanten in Humanplasma wurde bestimmt und mit dem Wild-Typ verglichen. 50 Mikroliter aktiviertes Protein C (27 ug/ml) wurden zu 200 ul vereinigtem humanem Zitrat-Plasma zugesetzt. Die Mischungen wurden bei 37ºC inkubiert. Es wurden Proben mit 50 Mikroliter entnommen und 0, 30, 75, 120 und 300 Minuten auf Eis gelegt. 20 Mikroliter von jeder Probe zu jedem Zeitpunkt wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten übertragen und mit 80 ul 1 mM Spectrozym PCa versetzt. Die A&sub4;&sub0;&sub5; wurde nach einigen Minuten abgelesen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. PC2451 war ähnlich dem Hybrid LMH, wobei es im wesentlichen resistenter gegenüber Inaktivierung als die Mutante 3044 war, die ihrerseits resistenter als 2452 und der Wild-Typ war.
Die Versuche über den zeitlichen Verlauf der Inaktivierung in Humanplasma wurden für das Hybrid LMH, den Wild-Typ PC962 und die Mutante PC2451 wiederholt, wobei die Assays im wesentlichen wie oben vorgenommen wurden, jedoch Punkte bei den Zeiten 0, 15, 30 und 60 Minuten genommen wurden und die Proben unmittelbar in 60 ul eiskaltem TBS, das einen Gehalt von 5 mM EDTA aufwies, verdünnt wurden. 20 Mikroliter 4 mM Spectrozym PCa wurden zugesetzt und die A&sub4;&sub0;&sub5; wurde nach einigen Minuten abgelesen. Die Ergebnisse, die in Fig. 11 gezeigt sind, bestätigten, daß sowohl die Mutante PC2451 als auch das Hybrid LMH im wesentlichen resistenter gegen Inaktivierung waren als das humane Wild-Typ Protein C.

C. Substitutionen in aktiviertem Protein C

Eine DNA-Sequenz, die für eine Vorstufe von aktiviertem Protein C mit der Spaltungsstellensequenz Arg-Arg-Lys-Arg codierte, wurde durch Mutagenese der Wild-Typ Protein C-Sequenz konstruiert. Die entstehende Sequenz (mit der Bezeichnung 1058) war analog der für PC962 codierenden, jedoch fehlte der für das Aktivierungspeptid codierende Abschnitt. Die Aminosäuresequenz an der Verbindung zwischen der leichten und schweren Kette des Proteins 1058 ist in Tabelle 1 dargestellt.
Die Protein C-Sequenz, die in Plasmid p594 vorliegt, wurde in einer einzigen Mutagenese verändert, um die Codons für das Aktivierungspeptid zu deletieren und die Arg-Arg Codons an der Prozessierungsstelle einzusetzen. Es wurde eine Mutagenese nach Standardverfahren an dem 870 bp Sst I Fragment aus p594 vorgenommen und in einen M13 Phagenvektor geklont, wobei die Oligonucleotide ZC1058 (5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3') und ZC550 (5' TCC CAG TCA CGA CGT 3') verwendet wurden.
Eine DNA-Sequenz, die für eine Vorstufe von aktiviertem Protein C codiert, die die Linker-Sequenz Lys-Lys-Arg-Ala-Asn-Ser-Arg-Arg-Lys-Arg zwischen der leichten (Aminosäuren 1-149) und der schweren Kette enthielt, wurde konstruiert. Dieses Konstrukt erhielt die Bezeichnung PC2274 (Tabelle 1).
Zur Konstruktion der Sequenz PC2274 wurde das PC1058 Sst I Fragment in M13mp10 eingesetzt und gemäß Standardverfahren mit dem Oligonucleotid ZC2274 (5'GAG AAG AAG CGC GCC AAC TCC AGA AGA AAA CGA CT 3') mutagenisiert. Die mutagenisierte RF DNA wurde mit Pst I und Sst I angedaut und das 430 bp Fragment wurde gewonnen.
Der Expressionsvektor für aktiviertes Protein C wurde durch Ligation des 430 bp Pst I-Sst I Fragments aus der PC2274 RF, des ZC2454-mutagenisierten Sst I-Eco RI Fragments (Beispiel V.A), des 592 bp Eco RI-Pst I Fragments aus PC962/ZMB-4 und des mit Eco RI angedauten und phosphatasierten ZMB-4 konstruiert. Ein Vektor mit der gewünschten Insertorientierung wurde durch Restriktionsenzymabbau identifiziert und wurde gemäß obiger Beschreibung verwendet, um tk&supmin;ts13 BHK Zellen zu transfizieren.
Aus den obigen Ergebnissen ist es eindeutig, daß Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, die im wesentlichen die Aktivität von humanem Protein C aufweisen und dabei eine Widerstandsfähigkeit gegen Inaktivierung durch alpha-1-Antitrypsin und Humanplasma-Faktoren zeigen. Diese Ergebnisse sind besonders ermutigend, da modifizierte Protein C-Moleküle nun als therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzungen verwendet werden können, die eine erhöhte Stabilität in humanem Plasma aufweisen und dementsprechend eine erhöhte Halbwertszeit im Vergleich zu Präparaten von humanem Protein C haben, die aus Plasma gereinigt oder durch rekombinante Mittel hergestellt sind. Die Wirksamkeit, Bequemlichkeit und die ökonomischen Vorteile durch geringere Dosierungen und weniger häufige Verabreichung sind nur einige der Vorteile, die durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erbracht werden.
Obwohl die vorangehende Erfindung detailliert anhand der Beschreibung und der Beispiele für die Zwecke eines besseren Verständnisses beschrieben wurden, ist es eindeutig, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angeschlossenen Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Ein rekombinantes Zymogen-Protein C Molekül, das eine leichte Kette und eine humanartige schwere Kette umfaßt, welche schwere Kette eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in der Sequenz der schweren Kette des humanen Protein C von Fig. 8 enthält, wobei das genannte Protein C Molekül in aktiviertem Zustand imstande ist, die humanen Plasmafaktoren Va und VIIIa zu inaktivieren, und im Vergleich zu natürlich vorkommendem aktivierten humanen Protein C eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen die Inaktivierung durch humanes Plasma oder alpha-1-Antitrypsin zeigt.

2. Ein rekombinantes aktiviertes Protein C Molekül, das eine leichte Kette und eine humanartige schwere Kette umfaßt, welche schwere Kette eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in der Sequenz der schweren Kette des humanen Protein C von Fig. 8 enthält, wobei das genannte aktivierte Protein C Molekül imstande ist, die humanen Plasmafaktoren Va und VIIIa zu inaktivieren und im Vergleich zu natürlich vorkommendem aktivierten humanen Protein C eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen die Inaktivierung durch humanes Plasma oder alpha-1-Antitrypsin zeigt.

3. Das Molekül nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die leichte Kette im wesentlichen eine leichte Kette von humanem Protein C ist.

4. Das Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 3, in welchem eine oder mehrere der genannten Aminosäuresubstitutionen in der Sequenz der humanen schweren Kette der Sequenz einer bovinen schweren Kette entsprechen.

5. Das Molekül nach Anspruch 4, in welchem mindestens eine der Sequenzen der bovinen schweren Kette folgende ist: Aminosäuren 19-23, Gln-Glu-Ala-Gly-Trp; Aminosäuren 148-151, Arg-Asp-Glu-Thr; Aminosäuren 169-179, Tyr-Asn-Ala-Cys-Val- His-Ala-Met-Glu-Asn-Lys; oder Aminosäuren 249-260, Lys-Ala-Gln-Glu-Ala-Pro-Leu- Glu-Ser-Gln-Pro-Val; und substituiert ist für die humanen Schwerketten-Aminosäuren 17- 21, Lys-Met-Thr-Arg-Arg,; Aminosäuren 146-153, His-Ser-Ser-Arg-Glu-Lys-Glu-Ala; Aminosäuren 171-181, His-Asn-Glu-Cys-Ser-Glu-Val-Met-Ser-Asn-Met; bzw. Aminosäuren 251-262, Arg-Asp-Lys-Glu-Ala-Pro-Gln-Lys-Ser-Trp-Ala-Pro, wobei die Nummern der Aminosäuren denen von Fig. 8 entsprechen.

6. Das Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welchem die erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen die Inaktivierung durch humanes Plasma mindestens doppelt so groß ist wie die von humanem Protein C.

7. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Protein C Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen physiologisch annehmbaren Träger umfaßt.

8. Das Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Therapie.

9. Verwendung des Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheitszuständen in Verbindung mit Protein C Mangel, Thrombose der tiefen Venen, Lungenembolie, Schlaganfall und Myocardinfarkt.

10. Ein Polynukleotidmolekül, das für ein Protein C Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.

11. Ein Polynukleotidmolekül mit vier operativ verbundenen sequenzcodierenden Regionen, die jeweils für ein Pre-Pro-Peptid und einen gla-Bereich eines Vitamin K-abhängigen Plasmaproteins, eine leichte Kette ohne gla-Bereich von humanem Protein C, ein Peptid, das eine oder mehrere Spaltungsstellen umfaßt, und eine schwere Kette von humanartigem Protein C, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in der Sequenz der schweren Kette des humanen Protein C von Fig. 8 aufweist, codieren, wobei das genannte Polynukleotid bei der Expression für ein biologisch aktives Protein C Molekül codiert, das im Vergleich zu natürlich vorkommendem aktivierten humanen Protein C eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Inaktivierung durch humanes Plasma oder alpha-1- Antitrypsin zeigt.

12. Das Polynukleotidmolekül nach Anspruch 11, bei welchem das eine oder mehrere Spaltungsstellen umfassende Peptid R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-x-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8; umfaßt, worin jeder der Reste R&sub1;-R&sub8; für Lys oder Arg steht und x eine Peptidbindung oder ein Spacer-Peptid von 1-12 Aminosäuren ist.

13. Die Polynukleotidsequenz nach Anspruch 11, bei welcher das eine oder mehrere Spaltungsstellen umfassende Peptid (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4; umfaßt, worin jeder der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für Lys oder Arg steht und n = 0, 1, 2 oder 3.

14. Eine Säugetier-Zell-Linie, die mit dem Polynukleotidmolekül nach einem der Ansprüche 11 bis 13 transfiziert ist.

15. Ein Verfahren zur Herstellung des Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem eine Säugetierzelle mit einem Expressionsvektor transfiziert wird, der einen Promotor in operabler Verbindung mit einem DNA-Molekül, das für das rekombinante Zymogen-Protein C Molekül codiert, enthält, die Zelle in einem die Expression des Proteins gestattenden Medium gezüchtet und das Protein isoliert wird.