JPH06502986A

JPH06502986A - ハイブリッドプロテインｃ

Info

Publication number: JPH06502986A
Application number: JP3502949A
Authority: JP
Inventors: フォスター，ドナルド　シー．; ホリー，リチャード　ディー．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1989-12-29
Filing date: 1990-12-28
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: EP0506821A1; JP3270462B2; CA2071630C; DE69032029D1; WO1991009960A1; US5766921A; CA2071630A1; EP0506821A4; EP0506821B1; GR3026414T3; AU7168591A; DE69032029T2; DK0506821T3; ATE163048T1; ES2113878T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリッドプロティンＣ発明の分野本発明は一般的には血液タンパク質に関し、より詳しくはヒト血漿による不活性化に対する耐性が増加され、従って生体内における薬物動態が改善されたヒト様プロティンＣ分子の組成物、およびそのような組成物の製造方法に関する。

発明の背景プロティンＣは活性形態で血液凝固の調節において重要な役割を果たす。活性プロティンＣはセリンプロテアーゼであって、限定タンパク質分解により凝固因子Ｖａと■ａを不活性化する。組織の負傷によって開始される凝固カスケードは、例えば、プロティンＣにより無制御の連鎖反応において負傷領域を越えて進行しないように防止される。

プロティンＣは一本鎖前駆体ポリペプチドとして肝臓で合成され、その後約１５５アミノ酸の軽鎖（Ｍｒ＝　２１．０００）と約２６２アミノ酸の重鎮（Ｍｒ− ４０，０００）にプロセシングされる。

重鎮と軽鎖はジスルフィド結合により合体された二本鎖の不活性タンパク質、すなわちチモーゲンとして血液中を循環する。トロンビンにより媒介される反応において該チモーゲンの重鎮部分のアミノ末端から１２アミノ酸が切断されると、タンパク質が活性化状態になる。「プロティンＳ」と呼ばれるもう１つの血液タンパク質は、どういうわけか第Ｖａ因子のプロティンＣ触媒タンパク質分解を促進すると考えられる。

プロティンＣはまた、組織型プラスミノーゲン活性化因子の作用にも関係している（ＫｉｓｉｅｌおよびＦｕｊｉｋａｗａ、　ＢｅｈｒｉｎｇＩｎｓｔ、　Ｍｉｔｔ、　７３：２９−４２．１９８３）　、イヌへのウシ活性プロティンＣ（ＡＰＣ）の注入はプラスミノーゲン活性化因子の活性の増加を引き起こす（ＣａｍｐおよびＥｓｍｏｎ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

６８：　１２２１−１２２８．１９８１）　、他の研究（５ａｋａｔａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１１２１−１１２５．１９８５）は、培養した内皮細胞へのＡＰＣの添加が、ウロキナーゼ関連型と組織型の両方のプラスミノーゲン活性化因子の活性増加を反映する、順化培地中のフィブリン溶解活性の迅速な用量依存性増加を引き起こすことを示した。ＡＰＣ処理は抗活性化因子活性の用量依存性減少ももたらす。更に、内因性ＡＰＣに対するモノクローナル抗体を使った研究（Ｓｎｏｗら、ＦＡＳＥＢ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　１９８８）は、ＡＰＣがフィブリン溶解中の動脈の開通性を維持し且つ組織梗塞の程度を制限するのに関係があるとしている。

実験証拠は活性プロティンＣが血栓症の治療に臨床的に利用できることを示唆する。ヒヒ血栓症モデルを使った幾つかの研究はＡＰＣがフィブリン沈着、血小板沈着および循環の低下の防止に低用量で効果的であることを示した（　Ｇｒｕｂｅｒら、クト７．１９８８　；　Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ　６２：アブストラクト１５１２．１９８９）。ＡＰＣの利用はプロティンＣの生体内活性化の必要を回避し、従ってより迅速に作用する治療薬を提供する。

加えて、外因性活性プロティンＣがグラム陰性敗血症の凝固障害および致死作用を防止することか示されている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、１９：９１８−９２５．１９８７）　。ヒヒを使った研究から得られたデータは、活性プロティンＣか敗血症に対して保護する本来の役割を果たすことを示唆している。

６４ニア６１−７６９．１９７９）から精製しそして試験管内で活性化することができるが、得られる生成物は肝炎ウィルス、シトメガロウイルスまたはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のような感染性物質が混入していることがある。

より最近になって、組換えＤＮＡ技術による活性プロティンＣの生産方法が記載されている。Ｆｏｓｔｅｒら（ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ　２１５，５４８　）は、活性化ペプチドのコード配列が削除されているプロティンＣＤＮＡ配列によりトランスフェクトされた培養哨乳動物細胞を使うことによる、活性プロティンＣの生産を開示している。Ｆｏｓｔｅｒら（ＢＰ　２６６、１９０）は、変更された開裂部位を有するＡＰＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を使った組換え活性プロティンＣの生産を開示している。

更に、生来のヒト活性プロティンＣ（血漿由来または組換え体のいずれか）は生体内に投与すると比較的短い半減期を有しく約２０分）、多量のまたは頻繁の投与という不便さを免れない。

遺伝子操作技術の利用により活性プロティンＣ生産の発展が可能になったにもかかわらず、収率は低いままであり、タンパク質は生産工程中に分解および／または不活性化を受ける。よって、より高レベルでの活性プロティンＣの生産、特に実質的に増加された生体内半減期を有する分子の生産を可能にする方法に対する要望が残存している。全＜驚＜べきことに、本発明はそれらの要望および他の関連する要望を満たす。

発明の要約軽鎖およびヒト様重鎮を有するプロティンＣを含んで成る新規組成物が提供される。プロティンＣはそのチモーゲン形態または活性形態のいずれかであってもよい。ヒト様重鎮を有する活性プロティンＣは、一般に、未変更の天然のプロティンＣに比べて、ヒト血漿因子、例えばヒトα−１−抗トリプシンによる不活性化に対する抵抗性が大きいだろう。該組成物は、医薬組成物に製剤すると患者の処置方法において特に有用である。医薬組成物は、様々な病気状態を有する個体に予防的にまたは治療的に投与することができる。適応症としては特に、遺伝的障害または後天的状態であり得るプロティンＣ欠損症がある。本明細書に記載の新規プロティンＣ分子で処置することができる他の後天性病気状態としては、例えば、深静脈血栓症、肺塞栓症、発作および心筋梗塞が挙げられる。後者では、プロティンＣは、生体内フィブリン溶解を増強するために組織プラスミノーゲン活性化因子と共に投与することができ、そして閉塞性の冠動脈血栓か溶解した後に再閉塞を防止するために投与することができる。

典型的には、新規プロティンＣ分子の軽鎖は実質的にヒトであり、そしてヒト様重鎮はヒトプロティンＣ重鎖配列からの少なくとも約２００アミノ酸を含んで成るだろう。ここで前記重鎮配列は、チモーゲン形態では通常約２６２残基であり活性形態では約２５０残基である。ある好ましい態様では、ヒト様重鎮の非ヒト残基はウシの配列に由来する。ウシ重鎮配列によるヒト重鎮配列領域の置換は、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐによりヒトアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇを置換すること：ウシ配列Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ −Ｔｈｒによりヒト配列Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａを置換すること：ウシ配列Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓでヒトアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔを置換すること；およびウシ領域Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌでヒト重鎮領域Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏを置換することを包含する。もちろん、プロティンＣ分子が生物活性を保持する限りにおいて、ヒト重鎮フレームワークまたは非ヒト領域中に少しの置換、挿入または削除を行うことができることは理解されるだろう。望ましくは、そのようなプロティンＣ類似体は、例えば、ヒト血漿による不活性化に対する抵抗性の増加、従ってより長い血漿半減期、または生物活性の増加を有するであろう。

別の態様によれば、本発明は軽鎖および重鎮ポリペプチドを有する組換えキメラプロティンＣ分子に関し、ここで軽鎖は実質的にヒトであり、そして重鎮は実質的にヒト以外の哺乳動物、好ましくはウシのものである。この形態のプロティンＣはヒトプロティンＣの活性を実質的に有するであろうが、生来のヒトプロティンＣよりもヒト血漿因子による不活性化に対する抵抗性が大きいだろう。この態様の重鎮の配列は図８のウシ重鎮配列と実質的に相同であることができる：好ましい組成は、ヒト活性重鎮のアミノ末端アミノ酸（Ｌｅｕ）を有するが重鎮の残りは実質的にウシである。

別の態様によれば、本発明はビタミンに依存性血漿タンパク質のプレープロペプチドとｇｌａ領域、ｇｌａ領域を欠くヒトプロティンＣ軽鎖、１または複数の開裂部位を含むペプチドおよびヒト様プロティンＣ重鎖をそれぞれコードする４つの作用可能に連結された配列を含んで成るポリヌクレオチド分子に関する。このポリヌクレオチドにより発現されるプロティンＣ分子は生物学的に活性であり、即ち、活性形態ではヒト血漿因子Ｖａまたは■ａを不活性化することができ、更にそれ自体α−１−抗トリプシンのようなヒト因子による不活性化に対する抵抗性が増加されている。プロティンＣ分子を発現させるために、前記ヌクレオチド配列を使って哺乳動物細胞系、例えば８１（Ｋ　、　ＢＨＫ　５７０および２９３　ｍ胞をトランスフェクトせしめ、そして開裂部位に反応性であるエンドペプチダーゼをコードする配列、例えばサツカロミセス・セレビシトランスフェクトせしめることかできる。

図面の簡単な説明図１は、ヒトプロティンＣｃＤＮＡのヌクレオチド配列および該タンパク質の推定アミノ酸配列を示す。負の番号はプレープロペプチドに与えられる。正の番号は成熟チモーゲンの配列に与えられる。ダイヤ印は共通のＮ結合グリコジル化部位を指す。矢印は活性化ペプチドと活性プロティンＣ重鎖の接合点を指す。

図２はプロティンＣ発現ベクターｐ５９４を描写する。使用した記号は、Ｏ−１：アデノウイルス５０−１地図単位配列；Ｅ：ＳＶ４０エンハンサ−；ＭＬＰ：アデノウイルス２主要後期プロモーター；　Ｌｌ−３：アデノウイルス２三分節系リーダー；５’：５’スプライス部位；３’：３’スプライス部位；　ｐ（Ａ）　：　ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルである。

図３はプロティンＣ発現ベクターＰＣ９６２／ＺＭＢ−４の作製を示す。

図４はベクターＺＭＢ−３の作製を示す。

図５は、ヒト、ウシおよびハイブリッドプロティンＣ分子における色素生成活性の結果を示す。各タンパク質のデータはα−１−抗トリプシンの非存在下での１００％活性に対して標準化されている。

図６は、ヒト血漿によるヒトおよびハイブリッドプロティンＣ分子の不活性化を示す。結果は各タンノくり質について標準化されている。

図７は、ヒト血漿によるヒトおよびハイブリッドプロティンＣ分子の不活性化の時間推移を示す。結果は各タンパク質について標準化されている。

図８は、ヒトプロティンＣとウシプロティンＣの重鎮のアミノ酸配列の比較を示す。各配列はそれぞれの重鎮の最初のアミノ酸から番号付けされている。矢印は活性化ペプチドと活性プロティンＣ重鎖との接合点を指す。ウシ配列では、（、）はヒト配列と同じアミノ酸残基の存在を示し、そして（−）は配列の整列を最大にするために導入されたギャップを示す。

図９は、α−１−抗トリプシンによるヒト（ｗｔ　９６２）、ハイブリッド（ＬＭＨ）　、変異体ＰＣ２４５１，ＰＣ２４５２およびＰＣ３０４４プロティンＣ分子の不活性化を示す。結果は各タンパク質について標準化されている。

ｌＮｌ０は、ヒト血漿による活性ヒト（ｗｔ　９６２）、ハイブリッド（ＬＭＨ）　、変異体ＰＣ２４５１，ＰＣ２４５２およびＰＣ３０４４プロティンＣ分子の不活性化についての３００分間に渡る時間推移を示す。

結果は各タンパク質について標準化されている。

図１１は、ヒト血漿による活性ヒト（ｗｔ　９６２）、ハイブリッド（ＬＭＨ）および変異体ＰＣ２４５１プロティンＣ分子の不活性化についての６０分間に渡る時間推移を示す。結果は各タンパク質について標準化されている。

特定の実施態様の記載ヒトへの投与に適当である新規プロティンＣ組成物が提供される。プロティンＣは活性形態で凝固カスケードにおいて抗凝固物質として作用する重要な役割を果たすため、多様な重要な療法用途を有する。本明細書に記載の新規組成物は、ヒト血漿から精製されたまたは組換え方法により生産された従来のプロティンＣ組成物では達成することができない、生体内での延長された半減期と安定性を達成する可能性を提供する。

本発明の１つの観点では、該組成物は、軽鎖のアミノ酸配列が実質的にヒトであり、そして重鎮の配列が実質的にヒト以外の哺乳動物、例えばウシのものである、ハイブリッド（またはキメラ）プロティンＣ分子を含んで成る。活性重鎮のアミノ末端アミノ酸がヒト配列由来、典型的にはロイシン（Ｌｅｕ）であることが望ましいかまたは好都合であることもある。重鎮の残りは完全にウシ重鎮配列のものであることができる。本明細書中の「プロティンＣ」なる言及は、他に特記しない限りチモーゲン形態および活性形態を含むことを意味する。プロティンＣチモーゲンは重鎮のアミノ末端に活性化ペプチドを含む。活性化ペプチドは生来のヒト活性化ペプチド、生来のウシ活性化ペプチド、または本明細書に開示されるような変更活性化ペプチドであることができる。

別の態様では、性質がヒト様であり、従って一般にキメラ分子よりも小さい免疫原性を有するプロティンＣが製造される。ヒト重鎮（例えば図８に示されるような）の短い配列（単一アミノ酸を包含するがそれに限定されない）を、ヒト以外の哺乳動物のプロティンＣからの対応する重鎮配列、便利にはウシ配列により置き換えることができる。この目的は、実質的にヒトであって、そして活性化した時にヒト血液中で実質的に長い半減期を有し、従って頻繁でない投与および／または少量の用量を必要とする、プロティンＣ分子を獲得することである。本明細書で使用する時、「ヒト様重鎮」なる用語は、本来のヒト重鎮に実質的に相同であり、即ち特に種間で比較的保存されている領域中で、少なくとも約７５％、好ましくは約８５〜９５％が同一であり、そして少な（とも１つのアミノ酸置換を含むプロティンＣ重鎖を指すことを意味する。

一般に、１９１〜１９３位の塩基性アミノ酸残基を保持することによりプロティンＣとプラスミノーゲン活性化因子との相互作用を保持することが好ましい。

ハイブリッドまたはヒト様プロティンＣは、ハイブリッドまたはヒト様分子をコードする遺伝子によりトランスフェクトされた培養哺乳動物細胞により生産される。該細胞を、プロティンＣ分子をコードするＤＮＡに作用可能に連結されたプロモーターを含んで成る発現ベクターによりトランスフェクトする。該タンパク質の発現を許容する培地中でトランスフェクト細胞を培養し、次いで該培地からプロティンＣを単離する。プロティンＣは活性形態またはチモーゲン形態で生産され得る。それが活性形態で生産される場合、本発明者ら自身の同時係属出願第０７／３９２．８６１号（これは参考として本明細書に組み込まれる）において記載されたように、培地は最少量の血清を含むかまたは無血清であるように調製されるだろう。

ヒトプロティンＣをコードするクローン化ＤＮＡ配列は記載されている（ＦｏｓｔｅｒおよびＤａｖｉｅ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

４、７７５．６２４号：この各々は参考として本明細書に組み込まれる）。ウシプロティンＣをコードするｃＤＮＡはＬｏｎｇら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：　５５６３−５６５６．１９８４により記載されている（これは参考として本明細書に組み込まれる）。一般に、ｃＤＮＡ配列は、変型したＲＮＡプロセシングや発現レベルの減少を引き起こし得る介在配列を欠くため、本発明における使用に好ましい。プロティンＣをコードする相補的ＤＮＡは、標準的実験手順に従って様々な哺乳動物種の肝細胞から調製したライブラリーから得ることができる。ウシまたはヒトｃＤＮＡからのプローブを使って、別の哺乳動物種のプロティンＣをコードするＤＮＡを同定し、クローニングすることができる。しかしながら、適当なりＮＡ配列をゲノムクローンから得ることもでき、または常法に従って新たに合成することもてきることは理解されるだろう。もし部分的クローンが得られたら、エンドヌクレアーゼ開裂、連結およびループアウト突然変異誘発といった技術を使って、それらを正しい読み枠において連結して全長クローンを生成することが必要である。

例えば、プロティンＣ重鎖をコードするウシｃＤＮＡをクローニングするためには、ヒトプロティンＣｃＤＮＡ断片を使ってウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーを探査することができる。ヒトプロティンＣｃＤＮＡ断片は、例えば常法を使って、ヒト肝臓ｍＲＮＡから調製することができる。あるいは、発表されたウシプロティンＣｃＤＮＡ配列（Ｌｏｎｇら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

することができる。ハイブリッドプロティンＣコード配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼでの消化、連結、合成オリゴヌクレオチドおよびループアウト突然変異誘発を使って、ヒト軽鎖ｃＤＮＡを正しい読み枠において非ヒト断片（例えばウシ）に連結せしめて全長タンパク質を生成することにより作製することができる。

別の態様では、完全なヒトプロティンＣコード領域をクローニングし、そしてそれをヒト血漿中の因子による阻害または不活性化に対して抵抗性にすることによってヒト血漿中の該分子の半減期および安定性を増加させるように特定の変更を重鎮配列に行うことができる。前記変更は、アミノ酸配列が種間で実質的に異なる重鎮の領域に向けられるだろう。ヒト重鎮に対するヒトα−１−抗トリプシンの種特異性を使って、重鎮中のα−１−抗トリプシンにより典型的に認識される部位を認識されにくくシ、それによってプロティンＣの活性が分解される速度を抑制する。ウシ重鎮配列では、例えば、対応するヒト重鎮領域を置換することができる部位として次したのと同様である）：（１）ウシ重鎮アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（重鎮アミノ酸１９〜２３）によりヒトアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ −Ａｒｇ（重鎮アミノ酸１７〜２１）が置換される：（２）ウシ重鎮アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　（アミノ酸１４８〜１５１）によりヒトアミノ酸配列Ｈｉｓ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　（アミノ酸１４６〜１５３　）が置換される；（３）ウシ重鎮アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ　（アミノ酸１７１〜１８１）によりヒトアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ　（アミノ酸１６９〜１７９）が置換される；そして（４）ウシ重鎮アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　（アミノ酸２４９〜２６０）によりヒト重鎖残基Ａｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ− Ｌｙ　ｓ　−５ｅｒ−Ｔｒ　ｐ−Ａ　１ａ−Ｐ　ｒ。

（アミノ酸２５１〜２６２）が置換される。

ヒト血漿因子による不活性化に対する増加された抵抗性を提供するのにできる限り少ない配列変更を行うことが好ましいことは理解されよう。望ましくは、置換領域ができる限り小さく、最も好ましいのは成る種の単一重鎖アミノ酸によりヒト配列の対応アミノ酸を置換するものであろう。配列置換の組合せを使ってもよい。分解に対する分子の抵抗性の増加、例えばα−１−抗トリプシンまたはヒト血漿に対する抵抗性の増加は、後述のような周知の方法を使って容易にアッセイすることができる。そのような置換はいずれもプロティンＣの生物活性を実質的に低下させないことが重要である。「生物活性」とは、生物学的環境中（即ち生物体内またはそれの試験管内モデル）で活性プロティンＣにより行われる機能または一連の機能を意味する。タンパク質の生物活性は触媒活性とエフェクター活性とに分類することができる。ビタミンに依存性血漿タンパク質、例えばプロティンＣの触媒活性は、基質の活性化または不活性化を引き起こす別の血漿タンパク質の特異的タンパク質分解的開裂を含む。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂質もしくは他の小分子への、タンパク質のような巨大分子への、または細胞への生物活性分子の特異的結合を包含する。エフェクター活性は、生理的条件下ではしばしば触媒活性を増強するかまたは触媒活性に不可欠である。プロティンＣについては、生物活性は活性タンパク質の抗凝固性質により特徴づけられる。活性プロティンＣは、酸性リン脂質とカルシウムの存在下で第Ｖａ因子と第■ ａ因子を不活性化する。プロティンＳはこの機能の調節に関与すると思われる（Ｗａｌｋｅｒ、前掲）。プロティンＣの触媒活性は主として重鎮にあると思われる。それらの活性は周知の方法を使って容易にアッセイすることができる。

組換え活性プロティンＣを直接生産するために、クローン化ＤＮＡ配列を変更して活性化ペプチドをコードする部分を除去または置換する。得られたＤＮＡ配列はプレープロペプチド、プロティンＣの軽鎖、開裂部位および活性プロティンＣの重鎮をコードするだろう。該ＤＮＡ配列は更に軽鎖と重鎮との間にスペーサーペプチドをコードしてもよい。

−態様では、得られた配列は配列Ｌｙｓ−Ａｒｇにより連結されたプロティンＣの軽鎖と重鎮をコードするだろう。本明細書中で使用する時、プロティンＣの軽鎖は、図１に開示される配列のアミノ酸１〜１４９もしくはそれと実質的に相同である配列、またはＣ末端の延長を有するそのような配列、通常は１〜約６アミノ酸の延長を有する配列を含むと解釈される。

活性プロティンＣの重鎮は、活性化ペプチドを含まないものと解釈される（即ちヒト活性プロティンＣの場合には図１に記載のようなアミノ酸番号１７０のロイシンで始まる）。

好ましい態様では、ＤＮＡ配列は軽鎖と重鎮の間に１または複数の新規開裂部位を含むように更に変更される。開裂部位はアミノ酸配列（Ｒｔ）、−Ｒ２−Ｒ， −Ｒ，の形であることができ、ここでＲ３−Ｒ４はリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）であり、モしてｎは０〜３の整数である。特に好ましい配列としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、　Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒｇおよびＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇが挙げられる。あるいは、開裂部位配列はＲ，− Ｒ２−Ｒ３−Ｒ，−Ｘ−Ｒ。

−Ｒ−−Ｒｔ−Ｒｓの形であることができ、ここでＲ１−Ｒ８の各々はＬｙｓまたはＡｒｇであり、そしてＸはペプチド結合または１〜１２アミノ酸のスペーサーペプチドである。この点で有用なスペーサーペプチドとしては、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＡＳ＋）−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ、　Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、　Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ、　Ａｓｐ−Ｇｌｎ、　Ａｓｐ −［１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、およびアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−挙げられる。開裂部位変更の第三グループは、一般式Ｙ−Ｚ−Ｒ。

−Ｒ２（ここでＹはＬｙｓ、　ＡｒｇまたはＬｅｕであり；Ｒ１とＲ２はＬｙｓまたはＡｒｇであり：そしてＺはＬｙｓまたはＡｒｇ以外のアミノ酸、好ましくはＬｅｕである）の開裂部位配列を与える、Ｌｙｓ。

ＡｒｇおよびＬｅｕから成る群から選択されたアミノ酸残基による生来のヒトプロティンＣのアミノ酸残基１５４　（Ｈｉｓ）の置換を含む。本発明において有用である代表的な開裂部位変異体を下の表工に示す。開裂部位８２９．１０５８．１６４５．１８８０．１９５３゜１９５４、１９６２．２０４３．２１５５および２２７４が活性プロティンＣを直接生産するのに有用である。

１．４９　１５５　１７０５９４（野生　ヒトプロティンＣＥ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｖ− Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−工−Ｄ−’ル巴Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−カスＥ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｅ−Ｄ− Ｑ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−■■ Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−■ｕＥ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｅ−Ｄ− Ｑ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−２銭Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−に− Ｒ−Ｌ−坦ｎＥ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−坦ａＥ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ− ２録Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ｌ− 銭ＵＥ−に−Ｒ−に−ＲＬ− ム■ Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｎ−工−Ｌ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｒ− Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ａ−Ｎ−５−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−ＤＮＡ配列の変更は部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。部位特異的突然変異誘発の技術は当業界で公知であり、例えばＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ（ＤＮＡ　３：　４７９−４８８．１９８４）により記載されている。あるいは、野生型プロティンＣ配列を酵素的に開裂せしめて、生来の活性化ペプチド配列を除去し、そして重鎮と軽鎖をコードする配列を上記の開裂部位のうちの１つをコードする合成りＮＡ配列と結合せしめてもよい。

当業者により理解されるように、本発明の組成物および方法の範囲内でプロティンＣの変異体および類似体も製造することができる。プロティンＣの変異体および類似体には、重要でないアミノ酸変化を含むもの、例えば遺伝的多形性によるもの、並びに該タンパク質の生物活性を実質的に低下させることな（アミノ酸が挿入、削除および／または置換されているものが含まれる。プロティンＣ類似体としては更に、プロティンＣのアミノ末端部分（ｇｌａ領域）が、ビタミンに依存性血漿タンパク質である第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンまたはプロティンＳのうちの１つのｇｌａ領域により置換されているタンパク質が挙げられる。ｇｌａ領域はそれらのタンパク質のアミノ末端の約３５〜４５アミノ酸残基に及び、Ｃ末端境界は通常各遺伝子中のエキソンーイントロン境界に対応する。

本発明の範囲内で使用されるＤＮＡ配列は、適切な翻訳後プロセシング（例えばグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を獲得するために、ハイブリッドプロティンＣ分子のアミノ末端にプレープロペプチドをコートするたろう。プレープロペプチドはプロティンＣのものであるか、または別のビタミンに依存性血漿タンパク質、例えば第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビンもしくはプロティンＳのものであることができる。プレープロペプチドとＩｌａ領域が同じタンパク質から得られるのが通常好ましい。

ハイブリッドプロティンＣをコードするＤＮＡ配列は適当な発現ベクター中に挿入され、次いで培養哺乳動物細胞をトランスフェクトせしめるのに使われる。本発明を実施するのに使われる発現ベクターは、クローン化遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモーターを含むだろう。好ましいプロモーターはウィルス性プロモーターと細胞性プロモーターを包含する。ウィルス性プロモーターとしては、５Ｖ４０５３０、１９８５）が挙げられる。特に好ましいウィルス性プロモーターは、アデノウィルス２由来の主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２：１３０４−１３１９．１９８２）である。細胞性プロモーターとしては、マウスに遺伝子プロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１ニア０４１−７０４５．１９８３）およびマウスｖＨプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅ１１３３：８５〜９３．１９８３）が挙げられる。特に好ましい細胞性プロモーターはメタロチオネインＩプロモーター（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：８０９−８１４．１９８３）である。発現ベクターは、プロモーターの下流であって且つプロティンＣ配列自体の挿入部位より上流に、−組のＲＮＡスプライス部位を含むこともできる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウィルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。

発現ベクター中に更に含まれるのは、挿入部位の下流に置かれるポリアデニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、前掲）、アデノウィルス５６１ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネータ−（ＤｅＮｏｔｅら、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

９：３７１９−３７３０．１９８１）およびヒトプロティンＣ遺伝子もしくはウシプロティンＣ遺伝子由来のポリアデニル化シグナルか挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に置かれる非コードウィルスリーダー配列、例えばアデノウィルス２三分節系リーダー：並びにエンハンサ− 配列、例えばＳＶ４０エンハンサ−およびアデノウィルスＶＡＲＮＡをコードする配列を含んでもよい。

クローン化ＤＮＡ配列は、例えばリン酸カルシウム媒介トラ４６７、１９７３）またはエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、鴎ＢＯＪ、　ｌ：８４１− ８４５．１９８２）により、培養哺乳類細胞に導入される。外来ＤＮＡを発現する細胞を同定および選択するために、通常、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択マーカー）が着目の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートといった薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーはジヒドロ集酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）配列である。選択マーカーはＴｈ１ｌｌｙにより概説されている（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｓｔｏｎｅｈａｍ、　ＭＡ　：これは参考として本明細書に組み込まれる）。選択マーカーの選択は当業者の普通の技術水準の十分範囲内である。

選択マーカーは、別々のプラスミド上において着目の遺伝子と同時に導入することができ、またはそれらを同一プラスミド上において導入することもできる。同一プラスミド上の場合、選択マーカーと着目の遺伝子は異なるプロモーターの支配下にあっても同一プロモーターの支配下にあってもよい。

後者の配置は２シストロンメツセージを生じる。このタイプの構成物は当業界で既知である（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４．７１３．３３９号並びに）。細胞に導入される混合物に「キャリヤーＤＮＡ　Ｊとして知られる追加のＤＮＡを加えることも有利である。

細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらを適当な増殖培地中で典型的には１〜２日間増殖して着目の遺伝子の発現を開始させる。本明細書中で使用する時、「適当な増殖培地Ｊなる用語は、細胞の増殖およびプロティンＣ遺伝子の発現に必要な栄養素および他の成分を含有する培地を意味する。該培地は一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン、塩類、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含有する。γ−カルボキシル化されたプロティンＣの生産のためには、培地は約０．１μｇ／ｒＩＬ１〜約５μｇ／ｍＩの濃度でビタミンＫを含むだろう。次いで薬剤選択を適用して、安定な様式で選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択を行う。増幅可能な選択マーカーによりトランスフェクトされている細胞に対しては、薬剤濃度を増加させてクローン化配列のコピー数の増加について選択し、それによって発現レベルを増加させる４ユとができる。次いで安定にトランスフェクトされた細胞のクローンをプロティンＣの発現についてスクリーニングする。

本発明において使用される好ましい培養哺乳動物細胞としては、ＣＯ３−１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）　、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）および２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３　：　Ｇｒａｈａｍら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

３６：５９−７２．１９７７）細胞系が挙げられる。好ましいＢＨＫ細胞細胞量ｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞細胞量ａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：１１０６−１１１０．１９８２；これは参考として本明細書に組み込まれる）であり、以後ＢＨＫ　５７０細胞と呼称される。ＢＨＫ　５７０細胞系は本特許明細書の出願前にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗ口叶、、　Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２）にＡＴＣＣ受託番号Ｃ１ｉ’Ｌ　１０３１４のもどに寄託されている。ｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞細胞量託番号ＣＲＬ１６３２のもとにＡＴＣＣから入手することもできる。更に、多数の他の細胞系を本発明において利用することができ、そのようなものとしてＲａｔ　Ｈｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）　、Ｒａｔ　Ｈｅｐ　ＩＩ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）　、ＴＣＭＫ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３９）　、ヒト肺（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ　９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）軽鎖と重鎖の間のＬｙＳ−Ａｒｇジペプチドの後ろでの開裂による活性プロティンＣ前駆体のプロセシングは、ヨーロッパ特許出願公開ＢＰ　３１９．９４４に記載されたような宿主細胞へのす子は、二塩基性アミノ酸配列の後ろで切断するエンドペプチダーゼをコードする（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９８６．　Ｌｅｉｖｅｍ、　２７３−２７８　）。

従って、この遺伝子で安定にトランスフェクトされた培養哺乳動物細胞系は、活性プロティンＣを発現せしめるのに有用である。

本発明に従って生産されるプロティンＣは抗プロティンＣ抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ　ら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６１：１１０９７−１１１０８．１９８６　）により記載されたようなカルシウム依存性モノクローナル抗体の利用が特に好ましい。常用の化学的精製手段、例えば液体クロマトグラフィーにより、追加の精製を行うことができる。クエン酸バリウム沈澱を含む他の精製方法が当業界で公知であり、本明細書に記載の新規プロティンＣの精製に適用することができる（概して、５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ，、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、。

１９８２を参照のこと）。医薬用途には、少なくとも約９０〜９５％均質の実質的に純粋なプロティンＣが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上均質か最も好ましい。所望であれば部分的にまたは均質まで精製されれば、プロティンＣを療法的に利用することができる。

本発明のプロティンＣ分子およびそれの医薬組成物は、血管内の凝固に関係する様々な状態を処置するためのヒトへの投与に特に有用である。例えば、深静脈血栓症や肺動脈塞栓症は従来の抗凝固物質で治療することかできるが、本明細書に記載のプロティンＣは危険性の高い患者、例えば手術を受ける患者またはうっ血性心不全を有する患者における血栓塞栓合併症の発生を防ぐのに用いることができる。活性プロティンＣは、トロンビンが生成されそしてフィブリン血栓が形成される時および場所で体内で全身的に活性であるヘパリンよりも選択的であるので、プロティンＣは深静脈血栓症の防止のため予防的に使用するとヘパリンよりも効果的であり、しかも出血性合併症を引き起こす可能性が小さいだろう。深静脈血栓症の予防のためのプロティンＣの用量は、約１００μｇ　＝　１００■／日、好ましくは１〜１０■／日の範囲内であり、そして投与は手術を受ける少な（とも約６時間前に投与を開始し、少なくとも患者が歩行可能になるまで続ける。慢性の深静脈血栓症および／または肺動脈塞栓症では、プロティンＣの用量は負荷量として約ｌＯＯμｇ〜１００■の範囲であり、次いで維持量として約３〜３００■／日の範囲である。プロティンＣ注入から出血性合併症が発生する可能性が低いため、プロティンＣは血栓摘出術または塞栓摘出術と共同して手術中または手術後のヘパリンに取って代わるかまたはヘパリンの用量を減らすことができる。

本発明のプロティンＣ組成物は、心臓性塞栓の予防および血栓性発作の治療においても相当な有用性を有するだろう。

出血性合併症を引き起こす可能性が低いことおよび選択性のため、プロティンＣは発作患者に投与することができ、閉塞性の動脈血栓の広がりを防止することができる。プロティンＣの投与量は発作の性質と重さに依存して患者ごとに異なるであろうが、用量は通常上記に与えたものの範囲内であろう。

本明細書に提供される活性プロティンＣの医薬組成物は、生体内でのフィブリン溶解を増強する活性プロティンＣの能力のため、急性心筋梗塞の治療においても有用であろう。活性プロティンＣは、心筋梗塞の急性期の間に組織プラスミノーゲン活性化因子またはストレプトキナーゼと共に投与することができる。閉塞性の冠状動脈血栓が溶解した後、冠状動脈の再閉塞を防ぐために、その後の数日間または数週間活性プロティンＣを投与することができる。急性心筋梗塞の場合には、活性プロティンＣ少なくとも約１〜５００■の負荷量に次いで１〜１００■ ／日の維持量が患者に与えられる。

本発明のプロティンＣは、チモーゲン形態または活性形態のいずれかで散在性血管向凝固（ＤＩＣ）の治療に有用である。ＤＩＣを有する患者は特徴として広範な微小循環系血栓を有し、そしてしばしば必須凝固因子の涸渇に起因する深刻な出血問題を抱えている。プロティンＣはその選択性のため、従来の抗凝固物質がそうであるようなりＩＣに関係する出血問題を悪化させることはなく、しかも他の微小循環のフィブリン沈着の形成を遅らせるかまたは阻止するだろう。

本明細書に提供される新規プロティンＣ分子は本来のヒトプロティンＣよりも長い半減期を有するので、それらの組成物の重要な用途は遺伝的プロティンＣ欠損症を有する人の処置である。そのような患者（欠損症に対して同型接合であっても異型接合であってもよい）は重度の血栓症を患っていることがある。彼らは現在プロティンＣを含む第■因子濃縮物で維持されている。同型接合欠損症個体の治療には、約３．０００−の平均血漿容量と仮定しそして血管外間隙中への幾らかの拡散を考慮すると、本発明のプロティンＣは一日１〜３００■のレベルで１日１回または複数回投与することができる。異型接合プロティンＣ欠損症は通常、同型接合よりも低い維持量を必要とするだろう。

医薬組成物は予防および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または局部投与用のものである。好ましくは医薬組成物は非経口的に、即ち静脈内、皮下または筋肉内的に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解されたプロティンＣ分子の溶液を含んで成る非経口投与用組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、０．４％食塩溶液、０．３％グリシン等を使うことができる。それらの組成物は常用の公知の滅菌技術により滅菌してもよい。得られた水溶液は使用のため包装するか、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は使用前に無菌の水溶液と混合すればよい。該組成物は、適当な生理的条件に必要な場合、医薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調節剤、緩衝剤、張度（浸透圧）調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を更に含むことができる。それらの組成物中のプロティンＣの濃度は広範囲で異なることができ、即ち約０．５重量％はどの低濃度から、１５または２０重量％はどの高濃度までに及び、これは選ばれた特定の投与形式に従って、主に液量、粘度等により選択されるだろう。

静注用の典型的医薬組成物は、２５０艷の無菌リンガ−溶液とｌＯ■のプロティンＣを含有するように作製することができる。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は、当業者にとって既知であるかもしくは明白であり、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、第１６版、　ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　１Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８２）　（これは参考として本明細書に組み込まれる）中に詳細に記載されている。

プロティンＣ分子またはその混合物を含有する医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的適用では、組成物は、上述したような病気に既にかかっている患者に、該病気とその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治療的有効量」として定義される。この用途に有効な量は、病気または負傷の重さおよび患者の一般状態に依存するであろうが、通常は１日あたりプロティンＣ約１■〜約３００■の範囲であろう。１日あたりプロティンＣ約５■〜約２５■の用量がより普通に使われるてあろう。本発明の物質は一般に重い病気または負傷状態、即ち生命にかかわる状態または潜在的に生命にかかわる状態において使うことかできることを念頭に置かなければならない。そのような場合、ヒト血漿中の異物の最小化とプロティンＣの半減期の延長を考慮すると、実質的過剰量のプロティンＣ組成物を投与することが可能であり、治療する医師によって望ましいと感じられるだろう。

予防的適用では、ハイブリッドブクテインＣを含む組成物は、患者自身の抗凝血能力またはフィブリン溶解能力を増強するために、負傷もしくは病気状態にかかりやすいかまたはその危険がある患者に投与される。そのような量は「予防的有効量」と定義される。この用途では、正確な量は患者の健康状態および内在性プロティンＣの通常レベルに依存するが、通常は体重７０ｋｇあたり約０．５■〜約２５０■、特に体重７０ｋｇあたり約１■〜約２５■の範囲であろう。

該組成物は一回または複数回投与することができ、用量レベルとパターンは治療する医師により選択されるだろう。毎日維持レベルを必要とする外来患者については、プロティンＣは例えば携帯式ポンプシステムを使った連続注入により投与することができる。いずれにしても、医薬組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明のプロティンＣを提供すべきである。

次の実施例は例示の目的で与えられ、限定目的ではない。

実施例Ｉヒト−ウシハイブリッドプロティンＣの作製この実施例は、ヒトブレープロ配列、ヒト軽鎖、ヒト活性化ペプチドおよびヒト活性プロティンＣ重鎖の最初のアミノ酸とウシプロティンＣ重鎖配列の残部をコードするハイブリッドプロティンＣコード配列の作製を記載する。宿主細胞からの分泌と活性化後、該タンパク質は、ヒト重鎮の最初のアミノ酸（Ｌｅｕ）に次いで２番目のアミノ酸（Ｖａｌ）からのウシ重鎮配列を含む重鎮にジスルフィド結合したヒトプロティンＣ軽鎖配列を含んで成る。実施例においてこのハイブリッド分子を示し、次いでα−１−抗トリプシンおよび他のヒト血漿因子による活性化に対する増加された抵抗性を有することをウシ肝臓ｃＤＮＡλｇｔｌｌライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ。

ＣＡ　９４３０１から入手した）から、ランダムプライムヒトプロティンＣｃＤＮＡ断片を使って該ライブラリーを探査することにより、プロティンＣウシ重鎮をコードするウシｃＤＮＡをクローＦＯＳｔｅｒおよびＤａｖｉｅ　（前掲）により記載されたようにしてヒトプロティンＣの一部分をコードするｃＤＮＡを調製した。簡単に言えば、常法によりヒト肝臓ｍＲＮＡからλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ヒトプロティンＣに対する！［■−標識アフィニティー精製抗体を使ってクローンをスクリーニングし、プレープロ−ト法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１９８２　：　これは参考として本明細書に組み込まれる）により陽性クローンからファージを調製し、そして塩化セシウム勾配によってバンド沈降せしめた。Ｅｃｏ　Ｒ１を使ってｃＤＮＡ挿入断片を取り出し、プラスミドｐＵＣ９（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　１９：　２５９−２６８゜１９８２）中にサブクローニングした。制限断片をファージベクターＭ１３ｍｐｌＯとＭ１３ｉｎｐＨ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：２０−７７、１９８３）中にサブクーニングし、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６４−５４６７゜１９７７）により配列決定した。ヒトプロティンＣの既知部分配列（Ｋｉｓｉｅｌら、前掲、　１９７９）と一致するＤＮＡを含み、モして軽鎖のアミノ酸６４て始まり重鎮を経て３′非コード領域に及ぶプロティンＣをコードするクローンを選択した。このクローンをλＨＣｌ３７５と命名した。アミノ酸２４からプロティンＣをコードする第二のｃＤＮＡクローンも同定した。大きい方のクローンからの挿入断片をｐＬｌｃＱ中にサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＨＣ λ６Ｌと命名した。このクローンは、重鎮コード領域、終結コドンおよび３′非コード領域を含むブ０ティンＣの主要部分をコードする。

λＨＣ１３７５からのｃＤＮＡ挿入断片をα−”Ｐ　ｄＮＴＰｓを使ってニックトランスレーションせしめ、該断片を用いて、Ｗｏｏ　（Ｍｅｔｈ。

１９６：１８１−１８２．１９７７）を使ってファージλＣｈａｒｏｎ　４Ａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｅ１ｌ　１５：６８７−７０２．１９７８）中のヒトゲノムライブラリーを探査した。陽性クローンを単離し、プラーク精製した（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：４６７３−４６７７゜１９８５　；これは参考として本明細書に組み込まれる）。

陽性り中）をＥｃｏ　Ｒ１またはＢｇｌ　ＩＩで消化し、ゲノム挿入断片を精製し、ｐＵｃ９中にサブクローニングした。（このゲノム挿入断片の制限断片をＭ１３ベクター中にサブクローニングし、そして配列決定してそれらの同一性を確かめ、遺伝子全体のＤＮＡ配列を確立した。）ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入断片をニックトランスレーションせしめ、該断片を用いてファージλＣｈａｒｏｎ　４Ａライブラリーを探査した。該ｃＤＮＡの５ ′末端と３′末端から作ったプローブにハイブリダイズする１つのゲノムクローンが同定された。このファージクローンをＥｃｏ　ＲＩで消化し、プロティンＣ遺伝子の５′末端に相当する４、４ｋｂ断片をｐＵＣ９中にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドをｐＨＣＲ４，４と命名した。

完全ＤＮＡ配列分析は、ｐＨＣＲ４，４中の挿入断片が１２６３塩基対（ｂｐ）のイントロンにより隔てられた７０　ｂｐと１６７　ｂｐの２つのエクソンを含むことを明らかにした。第一のエクソンはアミノ酸−４２〜−１９をコードし；第二のエクソンはアミノ酸−１９〜−３７をコードする。配列分析によって完全なプロティンＣ遺伝子のＤＮＡ配列が確証された。

プロティンＣのプレープロペプチドのアミノ酸−４２〜−１９に相当するエクソンを含むゲノム断片を単離し、ニックトランスレーションし、そしてＨｅｐ　Ｇ２細胞からのｍＲＮＡを使ってＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの技術（Ｇｅｎｅ　２５：　２６３−２６９．１９８３）により作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使った。この細胞系はヒト肝細胞に由来し、プロティンＣを合成することが以前に示されている（ＦａｉｒおよびＢａｈｎａｋ、　Ｂｌｏｏｄ　６４：　１９４−２０４．１９８４）　、ファージλｇｔｌｌの［Ｅｃｏ　Ｒ１部位に挿入されたｃＤＮＡを含んで成る１０個の陽性クローンが同定された。これらをプロティンＣ遺伝子の５′非コード領域に相当するオリゴヌクレオチドプローブを使ってスクリーニングした。１つのクローンかこのプローブでも陽性であったので、その全ヌクレオチド配列を決定した。該ｃＤＮＡは７０　ｂｐの５′非翻訳配列、ヒトプレープロープロティンＣの全コード配列、および２番目のポリアデニル化部位に相当する全３′非コード領域を含んだ。該ｃＤＮＡ配列とコードされるアミノ酸配列を図１に示す。

ヨーロッパ特許出願公開ＢＰ　２６６、１９０号（参考として本明細書に組み込まれる）において開示されたようにしてプロティンＣｃＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ［断片として単離しベクターｐＤＸ　（Ｈａｇｅｎら、米国特許第４．７８４．９５０号；これは参考として本明細書に組み込まれる）中にクローニングした。制限分析により組換えプラスミドをスクリーニングし、プロモーター要素に関して正しい方向でプロティンＣ挿入断片を有するものを同定し、正しいクローンからプラスミドＤＮＡ　（ｐＤＸ／ＰＣと命名）を調製した。ｐＤＸ／ＰＣ中のｃＤＮＡ挿入断片は５′非コード領域中にＡＴＧコドンを含むので、該ｃＤＮＡにおいてオリゴヌクレオチド指令欠失変異誘発を行って３塩基対を除去した。得られたｐ５９４と命名したベクターは、アデノウィルス２主要後期プロモーターに作用可能に連結されたプロティンＣＣＤＮＡを含んだ（図２）。このベクターは更にアデノウィルス５複製開始点（０−１地図単位配列’）　、ＳＶ４０エンハンサ −、アデノウィルス２三分節系リーダー、−組のＲＮＡスプライス部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んだ。

２、ウシｃＤＮＡクローンの単離ヒトプロティンＣｃＤＮＡを含むｐ５９４からのランダムプライム１．７ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒｒ断片を使って、ウシ肝臓ｃＤＮＡλｇｔｌｌライブラリーをプロティンＣｃＤＮＡについて探査した。ウシクローンをＥｃｏ　ＲＩ断片として同定および回収し、ｐＬＩＣｅ中にクローニングした。得られたプラスミドをＴａｑ　ＩとＥｃｏ　Ｒ［で切断し、プロティンＣ重鎖をコードする断片を回収した。

Ｂ、ヒトプロティンＣ軽鎖ｃＤＮＡの調製最終的にウシＴａｑ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ１断片に結合させるヒト軽鎖ｃＤＮＡを得るために、ヒトプロティンＣをコードするＤＮＡ配列（ＰＣ９６２と命名）から適当な制限断片を調製した。ＰＣ９６２ＤＮＡは上述のｐ５９４から作製され、プロティンＣの軽鎖と活性化ペプチドとの間の接合部に２つの追加のアルギニン残基をコードするＤＮＡ配列を含んだ（表Ｉ）。ｐ５９４中のクローン化ヒトｃＤＮＡを、変異原性オリゴヌクレオチドＺＣ９６２（５’　ＡＧＴＣＡＣＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣＡ　３”）とオリゴヌクレオチドＺＣ５５０（５’　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３”）を使って部位特異的突然変異誘発（本質的にはＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、ＤＮＡ　３：４７９−４８８．１９８４により記載されている）により変更した。プラスミドｐ５９４を５ｓｔＩて消化し、約８４０　ｂｐの断片をＭ１３ｍｐＨ中にクローニングし、一本鎖鋳Ｉ　ＤＮＡを単離した。突然変異誘発後、正しいクローンを配列決定により同定した。複製可能型ＤＮＡを単離し、５ｓｔＩで消化し、そして変異断片を回収した。この断片を２部分連結において５ｓｔＩで切断されたｐ５９４と連結せしめた。所望の方向で挿入された５ｓｔＩ断片を有するクコーンを制限酵素マツピングにより同定した。得られた発現ベクターをｐＤＸ／ＰＣ９６２と命名した。

ＰＣ９６２ｃＤＮＡをプラスミドＺｅｍ２２９に挿入することにより、ＰＣ２２９／９６２と称する第二の発現ベクターを作製した。Ｚｅｍ２２９は、マウスメタロチオネイン−■プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間に外来ＤＮＡの挿入のためのユニークＢａｍ旧部位を含むｐＵｃ１８由来の発現ベクターである。Ｚｅｍ２２９は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびＳＶ４０ターミネータ−の発現単位も含む。

ｐＤＸ／ＰＣ９６２由来のＰＣ９６２ｃＤＮＡを含むＥｃｏ　Ｒ１断片を、Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍ　Ｈ１合成オリゴヌクレオチドアダプターを使って、ＢａｍＨ［で切断されホスファターゼ処理されているＺｅｍ２２９に連結せしＺｅｍ２２９、ｐＤＸ　（Ｈａｇｅｎら、米国特許第４．７８４．９５０号、これは参考として本明細書に組み込まれる）およびＰＣ９６２ＤＮＡ配列から発現ベクターＰＣ９６２／ＺＭＢ−４を作製した。

Ｚｅｍ２２９を変更してＢａｍ旧クローニング部位をＥｃｏ　Ｒ１部位に変換した。まず該プラスミドを、Ｅｃｏ　ＲＩでの部分消化、ＤＮＡポリメーラーゼエとｄＮＴＰｓでの平滑末端化および再連結により変更して２つのＥｃｏ　ＲＩ部位を削除した。生じたプラスミドをＢａｍＨ［で消化し、合成りａｍ　Ｈｌ−Ｅｃｏ　Ｒ１アダプターと連結せしめた。得られたプラスミドをＺｅｍ２２９Ｒと命名した。

Ｚｅｍ２２９ＲをＨｉｎｄｌ［とＥｃｏ　ＲＩで消化し、ＳＶ４０プロモーターとＭＴ−１プロモーターを含む５２０　ｂｐ断片を除去した。次いでＺｅｍ２２９Ｒの大断片をｐＤＸの〜１１００　ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［−Ｅｃｏ　Ｒ１断片（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサ−、アデノウィルス主要後期プロモーター、および−組のスプライスシグナルを含む）と連結せしめ、ＺＭＢ−４を作製した。ＰＣ２２９／９６２からＰＣ９６２配列を単離し、次いでこれをＺＭＢ−４中に挿入してＰＣ９６２／ＺＭＢ−４を作製した（図３）。

Ｃ，ハイブリッドプロティンＣコード配列の作製合成リンカ−を使ってヒト軽鎖ｃＤＮＡのＥｃｏ　Ｒ１−５ｓｔＩＩ断片（ＰＣ９６２／ＺＭＢ−４から）をウシ重鎖ｃＤＮＡのＴａｑ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ［断片と連結せしめることにより、ヒト−ウシプロティンＣコード配列を作製した。該リンカ−は、オリゴヌクレオチドＺＣ２２２８（５’　ＧＧＣＴＣＧＴ　３’）とＺＣ２２２９（５’　ＣＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣ３’）をアニーリングすることにより作製した。得られた配列によりコードされるハイブリッドプロティンＣは、ヒトプロティンＣの軽鎖アミノ酸配列から重鎮の最初のアミノ酸を経てウシ重鎮の残部まで・　（Ｈプレープロ）−（ＨＬ鎖）−開裂部位（ＲＲＫＲ）−（Ｈ活性化ペプチド）　−Ｌｅｕ　−（Ｂ　Ｈ鎖）を有する。ここでヒト−ウシ接合部の配列は下記の通りである：ｃＤＮＡ断片とリンカ−を４部分連結においてＥｃｏ　Ｒ［消化ベクターＺＭＳ−３と連結せしめることにより、ハイブリッドｃＤＮＡを構築した。発現ベクターＺＭＢ−３は、Ｚｅｍ２２８　（ＥＰ　３１９．９４４）とｐＤＸ　（Ｈａｇｅｎら、米国特許第４．７８４．９５０号：参考として本明細書に組み込まれる）から作製した。プラスミドＺｅｍ２２８は、マウスメタロチオネイン−■プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間に外来ＤＮＡの挿入のためのユニークＢａｍ　８１部位を含むｐＵｃ１８由来の発現ベクターである。Ｚｅｍ２２８は、ＳＶ４０初期プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ターミネータ−を含んで成る発現単位も含む。従って、Ｚｅｍ２２８では挿入された遺伝子はマウスメタロチオネイン−■プロモーターとＳＶ４０ターミネータ− の支配下にあり、該ベクターを抗生物質ネオマイシンにより選択することができる。Ｅｃｏ　ＲＩての部分消化、ＤＮＡポリメラーゼＩ　〔フレノウ断片〕とｄＮＴＰｓを使った平滑末端化、再連結、ＢａｍＨでの消化、およびＢａｍ　Ｈｌ −Ｅｃｏ　Ｒ［アダプターとの連結によりＺｅｍ２２８を変更して２つのＥｃｏ　Ｒ［部位を削除し、プラスミドＺｅｍ２２８Ｆ！を作製した。プラスミドＺｅｍ２２８ＲをＨｉｎｄＩＩＩと１Ｅｃｏ　Ｒ１て消化し、ＳＶ４０とん（Ｔ−１プロモーターを含む５２０　ｂｐ断片を除去した。Ｚｅｍ２２８Ｒの大断片をｐＤＸの〜１１００　ｂｐ　ＨｉｎｄＩ［−Ｅｃｏ　Ｒ［断片ＣＳＶ４０プロモーター／エンハンサ−、アデノウィルス主要後期プロモーター、および−組のスプライスシグナルを含む）と連結せしめた。得られたベクターをＺＭＢ−３と命名した（図４）。

ハイブリッドヒト−ウシプロティンＣコード配列を含むＺＭＢ−３ベクターを用いてｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２）をトランスフェクトせしめた。１０％ウシウシ血清と５００μｇ／ｉのＧ−４１８を含むダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でトランスフェクトントを選択した。順化培地を収得し、ＰＣＬ−２−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラム上での免疫アフィニティークロマトグラフィーにより組換えプロティンＣを精製した。このカラムは、プロティンＣのＣａ−結合軽鎖に特異的なモノクローナル抗体（ＰＣＬ−２と命名）をＣＮＢｒ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）に結合することにより調製した。１０ｍＭＣａＣＬの存在下で試料を該カラムに適用した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１．０Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２．　ｐＨ７，５を使ってカラムを洗浄した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５中の１５ｍＭ　ＥＤＴＡを使ってプロティンＣをカラムから溶出せしめた。

実施例■ 活性ウシプロティンＣ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、　５ｏｕｔｈＢｅｎｄ、　ＩＮから入手）および免疫アフィニティー精製した活性組換えヒトプロティンＣ（ｐＤＸ／ＰＣ９６２によりトランスフェクトせしめたベビーハムスター腎臓細胞から）を阻害するプロティンＣ阻害剤α−１−抗トリプシンの能力を、活性ヒト−ウシプロティンＣハイブリッドの阻害と比較した。プロティンＣ分子を活性化するために、各々をアゲキストロトン・コ（ＡＣＣ−Ｃ；　ニューメキシコ大学のＷ、　Ｋ１５ｉｅｌから入手；　Ｋ１５ｉｅｌら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１２６０７−１２６１３　（１９８７）を参照のこと）と混合した。

不活性化に対する抵抗性をアッセイするために、各タンノ々り質の溶液（ＴＢＳ　［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１］＋１５ｍＭＥＤＴＡ中５０　μｇ／ｒｒＬｌ）　２００μｆを６０ｎｇのＡＣＣ−Ｃおよび５ｔｔｌのＢＳＡ　（５０■／−）と混合した。この混合物を３７°Ｃで９０分間インキュベートした。各活性プロティンＣの２０μ！試料を５μ！のＢＳＡ　（５０■／ｍｌ’）およびＴＢＳ中１■／ｒＩＬｌのα−１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　０．２０゜４０または８０μｌと混合して１０５μ！最終反応容量にした。この混合物を３７°Ｃで１８．５時間インキュベートし、次いで各試料２０ｔｔｌ！を８０μｌの１ｍＭ色素生成基質（＃３３６　Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　ＰＣａ　：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから入手）と混合し、室温で約１０分間インキュベートした。発色を４０５　ｎｍて測定した。

図５に示した結果は、活性ヒトプロティンＣはα−１−抗トリプシンにより容易に不活性化されたが、ウシおよびウシ−ヒトハイブリッドは不活性化に抵抗性であったことを示す。

ヒト血漿によるウシ−ヒトプロティンＣおよびヒトプロティンＣ（ＰＣ９６２）の不活性化を調べた。実験は実施例■に概説したものと実質的に同じようにして行ったが、次の変更を伴った。

各７．５μｇまたはＢＳＡ対照を１００μｌのＴＢＳ／ＢＳＡ中で３７５ｎｇのＡＣＣ−Ｃと共に３７°Ｃで９０分間インキュベートすることにより、ウシ−ヒトハイブリッドプロティンＣおよびＰＣ９６２ヒトプロティンＣを活性化した。

活性化したプロティンＣの２０μｌ試料を９６ウエルのミクロタイタープレートのウェルに添加し、次いで０．５．１０または２０μｌのクエン酸塩加ヒト血漿を各ウェルに加えた。試料の量をＴＢＳ／ＢＳＡで１００μβに調整し、プレートを３７°Ｃで一晩（１６時間）インキュベートした。各試料から２０μ！（二重反復において）を取り、それらに８０μβの色素生成基質（０，７５ｍＭ）を添加した。室温で約１０分間インキュベートした後、４０５　ｎｍでの吸光度を測定した。

図６に示した結果は、タンパク質をヒト血漿に暴露すると、ヒトプロティンＣの活性がハイブリッドプロティンＣのものよりもずっと速く減少したことを示す。

血漿の非存在下では活性ハイブリッドプロティンＣは活性ヒトプロティンＣよりも約３倍大きい色素生成活性を有するらしい。更にハイブリッドプロティンＣはヒトプロティンＣよりも約４倍長い半減期を有するらしい。

次いてヒト血漿によるハイブリッドおよびヒトプロティンＣ分子の不活性化の速度を比較した。実質的には上述の通りに、ただし１００μｌのＴＢＳ／ＢＳＡ中で３７．５０ｇのＡＣＣ−Ｃにより３７°Ｃで一晩（１８時間）活性化した７、５μｇのＰＣ９６２またはノへイブリッドプロティンＣを使って行った。各々からｌＯμｌ試料を取り、　１９０μβのＴＢＳ／ＢＳＡに添加した。混合物を氷上に置き、次いて２５０μ！のクエン塩酸加ヒト血漿を各々に加え、３７°Ｃでインキュベートした。０．１０５．１８５および２４０分目に試料（２０μりを取り、８０μ！の色素生成基質に添加し、そして上記と同様にして４０５　ｎｍでの吸光度を測定した。

図７に示した結果は、ヒト血漿中での）＼イブリ・ノドプロティンＣの半減期がヒト活性プロティンＣのものの約３倍であったことを示唆する。ハイブリッドプロティンＣおよびヒト活性プロティンＣのヒト血漿中での抗凝固活性はほぼ同等であった。このことは、ウシーヒトノ１イプリ・ノドプロティンＣが、患者に投与するのにより少量またはより少ない頻度のプロティンＣが必要であり、それによって患者に対する治療の費用および不便さが減るであろうという点で、ヒトの処置において特に有用であろう。

実施例■ 実施例Ｉの活性ハイブリッドプロティンＣ分子の抗凝固活性をＡＰＴＴアッセイにおいて生来のヒトＡＰＣのものと比較した。

２μｇの単離したハイブリッドプロティンＣまたは組換えＰＣ９６２を１００μ ｆのＴＢＳ中で５０ｎｇのＡＣＣ−Ｃと混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いて１００μｌの正常ヒト血漿および１００μｉ’のＡｃｔｉｎ　ＦＳ　（Ｄａｄｅ、　Ｍｉａｍｉ、　ＰＬ）と混合した。生じた混合物を３７°Ｃで１００秒間インキュベートし、次いでＴＢＳ中の活性プロティンＣＩ００μｌを添加した。

更に３７℃で１００秒間インキュベートした後、各試料に１００μｌのＩＭ　ＣａＣ１□を加え、凝固時間を測定した。表■に示した結果は、ハイブリッドプロティンＣが生来のヒトプロティンＣのものに匹敵するヒト血漿中の抗凝固活性を有することを示す。

表■ 凝固時間（秒）２０　６４、６　６２．８４０　７３、６　６９．２６０　８３、６　７６、７８０　８４、９　８２．３１００　８８、４　９０．３！嬶奥ｙ実質的にはヒト重鎮を有しそして本来のヒト活性プロティンＣと比較するとヒト血漿中ての安定性の増加および半減期の増加を有するプロティンＣ分子を作製するために、ウシプロティンＣの配列により対応するヒト重鎮の配列を置き換えた。

ヒト重鎮の１つの変更は、ウシ重鎮アミノ酸Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ− Ｔｒｐ　（アミノ酸１９〜２３：ナンバリングはＦｏｓｔｅｒら、して本明細書に組み込まれる）に従っており、図８に示した通りである〕によるヒト重鎮中のアミノ酸Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（アミノ酸１７〜２１．ナンバリングはＦｏｓｔｅｒら、前掲に従い、図８に示した通りである）の置換である。置換アミノ酸をコードするために、合成オリゴヌクレオチドＺＣ２４５１（５’ＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＧＣＣＣ３’　）を使って部位特異的突然変異誘発を行った。ｐＤＣ／ＰＣ９６２（実施例Ｉ）のプロティンＣ５５ｔＩ断片をベクターＭ１３ｍｐｌＯ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：２０ −７７　（１９８３）　；これは参考として本明細書に組み込まれる〕中にクローニングした。上述したようにして一本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、本質的にはＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、ＤＮＡ　３：　４７９−４８８　（１９８４）　（参考として本明細書に組み込まれる）に記載された通りに、オリゴヌクレオチドＺＣ２４５１とオリゴヌクレオチドＺＣ５５０を使った２プライマー法を用いて、部位特異的突然変異誘発せしめた。陽性のクローンを選択し、配列決定して突然変異誘発を確かめた。

複製可能型ＤＮＡからＰｓｔ　Ｉ　−Ｓｓｔ　Ｉ断片として変異配列を回収した。この断片を４部分連結において、プラスミドＰＣ９６２／２ＭＢ−４からの〜５９２　ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｐｓｔ　Ｉ断片（５′プロテインＣコ一ド配列を含む）、プラスミドＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜７００　ｂｐ　Ｓｓｔ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ１断片（３′プロテインＣコ一ド配列を含む）、およびＥｃｏ　ＲＩで消化されホスファターゼ処理されたＺＭＢ−４と連結せしめた。制限酵素消化により正しい挿入断片の方向についてプラスミドをスクリーニングした。正しいプラスミドを選択し、該プラスミドを用いて実施例■に記載の通りにリン酸カルシウム共沈法によりｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２）をトランスフェクトせしめた。プロティンＣを産生ずるトランスフェクシントを、トランフフエクシコン後２〜３日目に５００ｎＭメトトレキセートで選択し、そして細胞順化培地を調製した。上述した通りに細胞上清から変異プロティンＣを精製した。α−１＝抗トリプシンおよびヒ１へ血漿因子による不活性化に対する変異プロティンＣの感受性を後述の通すアッセイした。

本明細書に記載のその他の置換と別々にまたは合同して行われるヒト重鎮のもう１つの変更は、合成オリゴヌクレオチドＺＣ２４５２（５’　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡＡＣＣＧＣ３’　）を使ったウシアミノ酸Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　（重鎖残基１４８〜１５１　）によるヒト重鎮アミノ酸Ｈｉｓ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（ヒト重鎖残基１４６〜１５３）の置換である。

ｐＤＸ／ＰＣ９６２（実施例Ｉ　）　（７）　Ｓｓｔ　Ｉ　−Ｅｅｏ　ＲＩ断片をベクターＭ１３ｍｐ１０４月＝クローニングした。上述したように一本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、２プライマー法を用いて２Ｃ２４５２を使って部位特異的突然変異誘発せしめた。陽性のクローンを選択し、配列決定して置換を確かめた。ファージの複製可能型ＤＮＡから変異誘発されたＳｓｔ　Ｉ　−Ｅｅｏ　ＲＩ断片を再単離し、該断片を４部分連結において、プラスミドＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜３３０　ｂｐＥｃｏ　Ｒ［−Ｓａｌ　Ｉ断片（５′プロティンＣ配列を含む）、プラスミドＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜７３０　ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｓｓｔ　Ｉ断片（プロティンＣ配列の中央部分を含む）、およびＥｃｏ　Ｒ１で消化されホスファターゼ処理されたＺＭＢ−４と連結せしめた。制限酵素消化により正しい挿入断片の方向についてプラスミドをスクリーニングし、正しい構成物を選択した。上記と同様にトランスフェクションを行い、そして成功したトランスフェクシントの順化培地から変更部位を含むプロティンＣを数便した。

次いて後述の通り不活性化に対する重鎮変更プロティンＣの感受性を未変更のプロティンＣのものと比較する。

ウシ配列Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａ　１ａ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ−Ｈｉ　ｓ　−Ａ　ｌａ −Ｍｅ　ｔ　−Ｇ　１ｕ−Ａｓｎ−Ｌｙ　ｓ（重鎮アミノ酸１６９〜１７９）によるヒト重鎖配列Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（ヒト重鎖残基１７１〜１８１）の置換は、不活性化に対するプロティンＣ分子の抵抗性の増加を提供するために使った。ｐＰＤ／ＰＣ９６２のＳｓｔ　Ｉ　−Ｅｃ。

ＲＩ断片をベクターＭ１３ｍｐｌＯ中にクローニングし、−重鎖鋳型ＤＮＡを調製し、上述の２プライマー法を用いて合成オリゴヌクレオチドＺＣ３０４４（５ ’　ＣＣＣＧＴＧ　ＧＴＣＣＣＧ　ＴＡＣＡＡＴ　ＧＣＡ　ＴＧＴＧＴＣＣＡＴ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＣＴＧ　３”）を使って部位特異的突然変異誘発せしめた。上述した通りに陽性クローンを選択し、配列決定して変異誘発を確かめた。

１つの陽性クローンからの複製可能型（ＲＦ）　ＤＮＡを５ｓｔＩとＥｃｏ　Ｒ［で消化し、そして７００　ｂｐのバンドを回収した。

３０４４変異体用の発現ベクターを作製するために、前記７００ｂｐ断片を、Ｅｃｏ　Ｒ１で消化され子ウシ腸アルカリホスファターゼ処理されたＺｅｍ２２９Ｒ、ＰＣ２２９／９６２からの３３５　ｂｐ　Ｅｅｏ　ＲＩ　−３ａＩＩプロティンＣ断片、およびＰＣ２２９／９６２からの７３０　ｂｐＳａｌ　Ｉ　−５ｓｔＩプロティンＣ断片と連結せしめた。Ｂｇｌ　ＩＩ　。

Ｅｃｏ　Ｒ［、Ｐｓｔ　ＩおよびＡｖａ　Ｉ［での消化により正しい構成物を同定し、ＰＣ３０４４／Ｚｅｍ２２９Ｒと命名した。

ＰＣ３０４４／Ｚｅｍ２２９Ｒを用いてＢＨＫ　５７０細胞をトランスフェクトせしめた。２日後、細胞をｌμＭメトトレキセート中に分配した。２週間の増殖後、ヒトプロティンＣの重鎮に対するモノクローナル抗体とペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス第二抗体を使ったイムノフィルターアッセイにより細胞をスクリーニングした。ＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使って陽性クローンを検出した。個々の陽性クローンを採取し、増殖させ、順化培地を集めた。カルシウム依存性モノクローナル抗体ＰＣＬ−２を使って該培地から変異タンパク質を精製し、後述のようにアッセイした。

部位特異的突然変異誘発を使って、ヒト重鎖残基２５１〜２６２（Ａｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｔｒ　ｐ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ）をウシプロティンＣ重鎖のアミノ酸残基２４９〜２６０　（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− ３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）により置換する。

まず、ｐＤＸ／ＰＣ９６２のＳｓｔ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ［プロティンＣ断片をベクターＭｌａｍｐｌＯ中にクローニングし、合成オリゴヌクレオチドＺＣ２４５４（５’　ＧＧＧ　ＣＡＣＡＴＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣＣＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＧＡＧＣＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＴＡＧ　ＣＧＡ　ＣＣＣ３ ’　）を使って上述の２プライマー法を用いて部位特異的突然変異誘発にかけた。陽性クローンを選択し、配列決定して変異誘発を確かめ、そしてＲＦＤＮＡから変異Ｓｓｔ　Ｉ　−Ｅｃｏ　ＲＥ断片を単離した。該変異断片を使ってプロティンＣのチモーゲン形態のための発現ベクターを作製した。該ベクターは、変異ＲＦ断片、ＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜５９２　ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片、ＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜４６０ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｓｓｔ　Ｉ断片、およびＥｃｏ　Ｒ［で消化されホスファターゼ処理されたＺＭＢ −４を連結せしめることにより作製した。

次いで得られたベクターを用いて上述した通りにｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞をトランスフェクトせしめた。成功したトランスフェクトントを同定し、培養し、細胞順化培地からタンパク質を精製し、そしてα−１−抗トリプシンに対する抵抗性についてアッセイした。結果は、２４５４変異体構成物がヒト活性プロティンＣに比べてα−１−抗トリプシンに対する抵抗性の増加を示さなかったことを指摘する。

Ｂ、タンパク質の特徴づけ上記に概説した通りに、ヒトプロティンＣ（ＰＣ９６２）　、ヒト−ウシハイブリッド（ＬＭＨ）　２４５１．２４５２および３０４４を、α−１−抗トリプシンおよびヒト血漿に対する抵抗性について試験した。タンパク質をＡＣＣ−Ｃ中で３７°Ｃにて３時間インキュベートシ（プロティンＣ：ＡＣＣ−Ｃ１００：１の比を使って）、それらを活性化した。はぼ等しい色素生成活性（ＰＣ９６２に対して標準化される）を与えるようにタンパク質濃度を調整した。

１４０μ！の反応液量を使って１４０μｇ／−のＢＳＡおよび８００ｎｇの活性プロティンＣおよびＯ〜８０μｇのα−１−抗トリプシン（ＡＴＴ）を含むＴＢＳ　（ｐＨ７，４）中で、ＡＴＴに対する抵抗性を測定した。混合物を３７°Ｃで１６時間インキュベートし、次いで２０μ！試料を各試験管から取り出し、ミクロタイタープレート中の８０ｕｌの１　ｍＭ　Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　ＰＣａ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ−ｉｃａ）に添加した。約２０分後、反応混合物の／１４ｏｓを読んだ。α−１−抗トリプシン濃度に対する相対的色素生成活性のプロットを図９に示す。９６２（野生型ヒトプロティンＣ）、変異体２４５２および変異体３０４４に比べると、変異体２４５１を５０％阻害するのに約３倍のα−１−抗トリプシンが必要であった。ハイブリッドＬＭＨは本質的に全く阻害されなかった。

ヒト血漿中でのプロティンＣの不活性化についての時間推移を測定し、野生型と比較した。５０μｌの活性プロティンＣ（２７μｇ／ｍＪ）を２００μｌの貯留クエン酸塩前ヒト血漿に添加した。混合物を３７°Ｃでインキュベートした。０．３０．７５．１２０および３００分後に５０μ！試料を取って氷上に置いた。

各時点の試料からの２０μｌをミクロタイタープレート中の８０μ！の１　ｍＭ　Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　Ｐｅａに添加した。数分後Ａａｏｓを読んだ。結果を図１Ｏに示す。ＰＣ２４５１はハイブリッドＬＭ）ｔと同様であり、２４５２や野生型よりも抵抗性であった変異体３０４４よりも不活性化に対する抵抗性が実質的に大きかった。

ヒト血漿中での不活性化の時間推移実験をヒト／’％イブ＋Ｊ・ソドしＭＨ、野生型ＰＣ９６２および変異体ＰＣ２４５１において繰り返した。該アッセイは上記と本質的に同じであるが、０．１５．３０および６０分の時点で試料を取り、即座に５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む氷ン令ＴＢＳ　６０ｕβ中に希釈した。２０μ！の４ｍＭ　Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　ＰＣａを添加し、数分後Ａ４゜、を読んだ。図１１に示される結果は、変異体ＰＣ２４５１とハイブリッドＬＭＨの両者がヒト野生型プロティンＣよりも不活性化に対して実質的に大きい抵抗性を有することを確証した。

Ｃ９活性プロティンＣにおける置換野生型プロティンＣ配列の突然変異誘発により、開裂部位配列Ａｒｇ−Ａｒｇ− Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する活性プロティンＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を作製した。生じた配列（１０５８と命名）（まＰＣ９６２をコードする配列に類似しているが、活性化ペプチド゛をコードする部分を欠いた。１０５８タンノくり質の軽鎖と重鎖との間の接合部のアミノ酸配列は表工に示されている。

プラスミドル５９４中に存在するプロティンＣ配列を単一突然変異誘発において変更せしめ、活性化ペプチドコドンを肖ＩＩ除しそしてプロセシング部位にＡｒｇ−Ａｒｇコドンを挿入した。変異誘発は、Ｍ１３ファージベクター中にクローニングされたｐ５９４からの８７０　ｂｐ　Ｓｓｔ　Ｉ断片上で、オリゴヌクレオチドＺＣ１０５８（５’　ＣＧＣＡＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴＧＧＧ３’）とＺＣ５５０（５’　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３’）を使って標準法に従って行った。

軽鎖（アミノ酸１〜１４９）と重鎮との間にリンカ−配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する活性プロティンＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を作製した。この構成物をＰＣ２２７４と命名した（表１）。

ＰＣ２２７４配列を作製するために、ＰＣ１０５８Ｓｓｔ　Ｉ断片をＭ１３ｍｐｌＯに挿入し、そしてオリゴヌクレオチドＺＣ２２７４（５°ＧＡＧ　ＡＡＧＡＡＧ　ＣＧＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴ　３” ）を使って標準法に従って突然変異誘発せしめた。変異誘発されたＲＦ　ＤＮＡをＰｓｔ　Ｉと５ｓｔＩで消化し、〜４３０　ｂｐ断片を回収した。

ＰＣ２２７４ＲＦからの〜４３０　ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｓｓｔ　Ｉ断片、ＺＣ２４５４て変異誘発されたＳｓｔ　Ｉ　−Ｂｃｏ　Ｒ［断片（実施例Ｖ、Ａ）、ＰＣ９６２／ＺＭＢ−４からの〜５９２　ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ［−Ｐｓｔ　Ｉ断片、およびＥｃｏＲＩで消化されホスファターゼ処理されたＺＭＢ−４を連結せしめることにより、活性プロティンＣ発現ベクターを作製した。所望の挿入断片方向を有するベクターを制限酵素消化により同定し、これを使って上述の通りにｔｋ−ｔｓ１３　ＢＨＫ細胞をトランスフェクトせしめた。

上記の結果から、ヒトプロティンＣの活性を実質的に有する一方でα−１−抗トリプシンおよびヒト血漿による不活性化に対する抵抗性を有する組成物が提供されることは明白である。それらの結果は、変更されたプロティンＣ分子が、血漿から精製されるかまたは組換え手段により製造されるヒトプロティンＣ調製物に比べた時、ヒト血漿中での増加された安定性を有し、従って増加された半減期を有する治療または予防用組成物として使用できるという点て、特に励みになる。

本発明の組成物により付与される利点の中でも特に、低用量で且つ低頻度の投与の効能、簡便性および経済性かある。

今まで理解の明確化の目的で本発明を説明および例により幾分詳細に記載してきたが、添付の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を実施できることは明らかであろう。

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補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月２５日

Claims

【特許請求の範囲】

１．軽鎖およびヒト様重鎖を有するプロテインＣを含んで成る組成物。
２．前記軽鎖がヒトである、請求項１に記載の組成物。
３．前記ヒト様重鎖がヒトプロテインＣ重鎖配列からの少なくとも約２００アミノ酸を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
４．非ヒトアミノ酸配列がウシプロテインＣ重鎖配列からのものである、請求項３に記載の組成物。
５．ウシ重鎖アミノ酸配列【配列があります】によりヒト重鎖配列【配列があります】が置換されており、前記配列はそれぞれ図８のアミノ酸１９〜２３および１７〜２１に相当する、請求項４に記載の組成物。
６．ウシ重鎖アミノ酸配列【配列があります】によりヒト重鎖配列【配列があります】が置換されており、前記配列はそれぞれ図８のアミノ酸１４８〜１５１および１４６〜１５３に相当する、請求項４に記載の組成物。
７．ウシ重鎖アミノ酸配列【配列があります】によりヒト重鎖配列【配列があります】が置換されており、前記配列はそれぞれ図８のアミノ酸１６９〜１７９および１７１〜１８１に相当する、請求項４に記載の組成物。
８．ウシ重鎖アミノ酸配列【配列があります】によりヒト重鎖配列【配列があります】が置換されており、前記配列はそれぞれ図８のアミノ酸２４９〜２６０おおよび２５１〜２６２に相当する、請求項４に記載の組成物。
９．前記プロテインＣがチモーゲンである、請求項１に記載の組成物。
１０．前記プロテインＣが活性形態である、請求項１に記載の組成物。
１１．前記プロテインＣが実質的に純粋である、請求項１に記載の組成物。
１２．軽鎖およびヒト様重鎖を含んで成る組換えチモーゲンプロテインＣ分子であって、前記重鎖が図８のヒトプロテインＣ重鎖配列中に１または複数のアミノ酸置換を含み、前記プロテインＣ分子は活性化されるとヒト血漿因子ＶａおよびＶＩＩＩａを不活性化することができ、そして天然の活性ヒトプロテインＣに比べてヒト血漿またはα−１−抗トリプシンに対する増加された抵抗性を有することを特徴とする分子。
１３．前記軽鎖が実質的にヒトプロテインＣ軽鎖である、請求項１２に記載の分子。
１４．前記ヒト重鎖配列中の１または複数のアミノ酸置換がウシ重鎖配列に相当する、請求項１２に記載の分子。
１５．前記ウシ重鎖配列のうちの少なくとも１つがアミノ酸１９〜２３の【配列があります】；アミノ酸１４８〜１５１の【配列があります】；アミノ酸１６９〜１７９の【配列があります】；またはアミノ酸２４９〜２６０の【配列があります】であり、そしてそれぞれヒト重鎖アミノ酸１７〜２１の【配列があります】；アミノ酸１４６〜１５３の【配列があります】；アミノ酸１７１〜１８１の【配列があります】；またはアミノ酸２５１〜２６２の【配列があります】が置換されており、ここでアミノ酸番号は図８のものに相当する、請求項１４に記載の分子。
１６．前記ヒト血漿による不活性化に対する増加された抵抗性がヒトプロテインＣのものより少なくとも２倍大きい、請求項１２に記載の分子。
１７．軽鎖およびヒト様重鎖を含んで成る組換え活性プロテインＣ分子であって、前記重鎖が図８のヒトプロテインＣ重鎖配列中に１または複数のアミノ酸置換を含み、前記活性プロテインＣ分子はヒト血漿因子ＶａとＶＩＩＩａを不活性化することができ、そして天然の活性ヒトプロテインＣに比べた時、ヒト血漿またはα−１−抗トリプシンによる不活性化に対する増加された抵抗性を有することを特徴とする分子。
１８．前記軽鎖が実質的にヒトプロテインＣ軽鎖である、請求項１７に記載の活性プロテインＣ分子。
１９．前記ヒト重鎖配列中の１または複数のアミノ酸置換がウシ重鎖配列に相当する、請求項１７に記載の活性プロテインＣ分子。
２０．前記ウシ重鎖配列のうちの少なくとも１つがアミノ酸１９〜２３の【配列があります】；アミノ酸１４８〜１５１の【配列があります】；アミノ酸１６９〜１７９の【配列があります】；またはアミノ酸２４９〜２６０の【配列があります】であり、そしてそれぞれヒト重鎖アミノ酸１７〜２１の【配列があります】；アミノ酸１４６〜１５３の【配列があります】；アミノ酸１７１〜１８１の【配列があります】；またはアミノ酸２５１〜２６２の【配列があります】が置換されており、ここでアミノ酸番号は図８のものに相当する、請求項１７に記載の活性プロテインＣ分子。
２１．前記ヒト血漿による不活性化に対する増加された抵抗性がヒトプロテインＣのものより少なくとも２倍大きい、請求項１７に記載の分子。
２２．軽鎖および重鎖ポリペプチドを含んで成る生物学的に活性なキメラプロテインＣ分子であって、前記軽鎖がヒトプロテインＣ軽鎖に実質的に相同であり、そして重鎖がヒト以外の哺乳動物からのプロテインＣ分子の重鎖に実質的に相同である、キメラプロテインＣ分子。
２３．前記重鎖の配列が図８に記載のウシ重鎖配列に実質的に相同である、請求項２２に記載のキメラプロテインＣ分子。
２４．前記重鎖のアミノ末端アミノ酸がＬｅｕである、請求項２２に記載のキメラプロテインＣ分子。
２５．前記分子が活性化ペプチドを含んで成るチモーゲンである、請求項２２に記載のキメラプロテインＣ分子。
２６．前記活性化ペプチドが実質的にヒトである、請求項２５に記載の分子。
２７．前記活性化ペプチドが【配列があります】である、請求項２６に記載の分子。
２８．前記分子が活性形態である、請求項２２に記載のキメラプロテインＣ分子。
２９．実質的に純粋である、請求項２２に記載のキメラプロテインＣ分子。
３０．患者においてプロテインＣ欠損症を処置する方法であって、前記患者に予防的または治療的有効量の請求項１，１２または２２のいずれか−項に記載のプロテインＣ組成物を投与することを含んで成る方法。
３１．患者においてフイブリン溶解を促進する方法であって、前記患者に治療的有効量の請求項１，１２または２２のいずれか−項に記載のプロテインＣ組成物を投与することを含んで成る方法。
３２．患者において血栓症を治療または予防する方法であって、前記患者に予防的または治療的有効量の請求項１，１２または２２のいずれか一項に記載のプロテインＣ組成物を投与することを含んで成る方法。
３３．有効量の請求項１，１２または２２のいずれか−項に記載のプロテインＣ組成物と生理学的に許容される担体とを含んで成る医薬組成物。
３４．ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のプレープロペプチドとｇｌａ領域、ｇｌａ領域を欠くヒトプロテインＣ軽鎖、１または複数の開裂部位を含むペプチド、およびヒト様プロテインＣ重鎖をそれぞれコードする作用可能に連結された４つの配列コード領域を含んで成るポリヌクレオチド分子であって、発現されると生物学的に活性なプロテインＣ分子をコードするポリヌクレオチド分子。
３５．前記ヒト様重鎖がヒトプロテインＣ重鎖配列からの少なくとも約２００アミノ酸を含んで成る、請求項３４に記載のポリヌクレオチド分子。
３６．非ヒトアミノ酸配列がウシプロテインＣ重鎖配列からのものである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド分子。
３７．前記ウシ重鎖配列のうちの少なくとも１つがアミノ酸１９〜２３の【配列があります】；アミノ酸１４８〜１５１の【配列があります】；アミノ酸１６９〜１７９の【配列があります】；またはアミノ酸２４９〜２６０の【配列があります】であり、そしてそれぞれヒト重鎖アミノ酸１７〜２１の【配列があります】；アミノ酸１４６〜１５３の【配列があります】アミノ酸１７１〜１８１の【配列があります】；またはアミノ酸２５１〜２６２の【配列があります】が置換されており、ここでアミノ酸番号は図８のものに相当する、請求項３６に記載のポリヌクレオチド分子。
３８．前記１または複数の開裂部位を含むペプチドがＲ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４− Ｘ−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８を含んで成り、ここでＲ１〜Ｒ３の各々はＬｙｓまたはＡｒｇであり、そしてＸはペプチド結合または１〜１２アミノ酸のスペーサーペプチドである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド分子。
３９．前記１または複数の開裂部位を含むペプチドが（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３− Ｒ４を含んで成り、ここでＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４の各々はＬｙＳまたはＡｒｇであり、そしてｎは０，１，２または３である、請求項３４に記載のポリヌクレオチド分子。
４０．前記（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４が【配列があります】である、請求項３９に記載のポリヌクレオチド分子。
４１．請求項３４のポリヌクレオチド分子によりトランスフェクトされた哺乳動物細胞系。
４２．前記細胞系がベビーハムスター腎臓細胞系または２９３細胞系である、請求項４１に記載のトランスフェクトされた細胞系。
４３．前記細胞系がＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１０３１４のＢＨＫ５７０である、請求項４１に記載のトランスフェクトされた細胞系。
４４．前記細胞系がエンドペプチダーゼをコードするサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＥＸ２遺伝子により同時トランスフェクトされる、請求項４１に記載の哺乳動物細胞系。
４５．ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のｇｌａ領域；ｇｌａ領域を欠くヒトプロテインＣ軽鎖；１または複数の開裂部位を含むペプチド；およびヒト様プロテインＣ重鎖をそれぞれアミノ末端からカルボキシ末端まで含んで成るタンパク質であって、活性形態では、天然の活性ヒトプロテインＣと比べた時、ヒト血漿またはα−１ −抗トリプシンによる不活性化に対して増加された抵抗性を有することを特徴とするタンパク質。