DE69126049T2

DE69126049T2 - Vektoren und Zusammensetzungen zur Expression von Glykosilationsmutanten des menschlichen Proteins-C

Info

Publication number: DE69126049T2
Application number: DE69126049T
Authority: DE
Inventors: Bruce Edward Gerlitz; Brian William Grinnell
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1991-02-22
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2011-02-23
Also published as: ATE153069T1; EP0443874A2; FI910854A; DE69126049D1; PT96853A; AU7130791A; NZ237199A; CA2036894A1; EP0443874A3; IE910611A1; NO910719L; JPH04211380A; IL97311A0; CN1055560A; FI910854A0; CA2036894C; DK0443874T3; US5460953A; YU31891A; EP0443874B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA Verbindungen und rekombinante DNA Klonierungsvektoren, die für neue Zymogenformen von humanem Protein C kodieren. Diese Zymogene wurden so verändert, daß das Glycosylierungsmuster im Vergleich zum Wildtyp des humanen Protein C Zymogens drastisch verändert ist. Die Glycosylierungen können eine wichtige Rolle bei der Proteinsekretion- und funktion spielen, insbesondere wenn die Kohlenhydratreste große Mengen an Sialinsäure enthalten. Die neuen erfindungsgemäßen Zymogene wurden so konstruiert, daß jede der Glycosylierungsstellen individuell verändert wurde. Die Expressionsvektoren liefern ein einfaches und effizientes Mittel zur Expression dieser humanen Protein C Zymogene in rekombinanten Wirtszellen. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Herstellung von Protein C Zymogenformen, die nach der Aktivierung eine höhere amidolytische und gerinnungshemmende Aktivität aufweisen, als die native Form. Diese neuen Zymogenformen von humanem Protein C unterscheiden sich von den in der Technik bekannten durch die Aminosäuresequenz der verschiedenen Glykosylierungsstellen. Diese neuen Protein C Zymogenformen bieten bei der Behandlung von Blutstörungen, die die Gerinnung betreffen, spezielle Vorteile.
Das Protein C, ein Vitamin K abhängiges Plasmaprotein, ist für die Kontrolle der Hämostase von wesentlicher physiologischer Bedeutung. Das Protein C wird als inaktives Molekul synthetisiert, das hierin unreifes Protein C genannt wird. Unreifes Protein C durchläuft eine komplexe Prozessierung, die zu vielen verschiedenen inaktiven Molekülen führt, wie es unten ausführlicher beschrieben ist. Inaktive, sekretierte Formen von Protein C werden hierin als Protein C Zymogen bezeichnet. Die Aktivierung von Protein C findet im Blut durch eine einen Thrombomodulin-Thrombin-Komplex beinhaltende Reaktion statt. Aktiviertes Protein C ist zusanunen mit dessen Cofaktor Protein 5 ein Antikoagulans mit wichtiger physiologischer Bedeutung. Aktiviertes Protein C kann intravaskuläre Thrombose verhindern und die Ausbreitung von vorhandenen Gerinnseln kontrollieren. Der Wirkmechanismus der aktivierten Form von Protein C und der Aktivierungsmechanismus des inaktiven Zymogens in die aktive Protease wurden in den letzten Jahren aufgeklärt (Zusammenfassung siehe J. E. Gardiner und J. H. Griffin, Progress in Hematology, Band XIII, Seiten 265-278, Herausgeber Elmer B. Brown, Grune and Stratton, Inc., 1983 und N.L. Esmon, 1989, Proc.Hemost. Thromb. 9: 29-55).
Die Aktivierung von Protein C bezieht Thrombin mit ein, die letzte Serinprotease in der Gerinnungskaskade und ein membranassoziiertes Glycoprotein von Endothelzellen, Thrombomodulin genannt. Thrombomodulin bildet einen engen, stöchiometrischen Komplex mit Thrombin. Thrombomodulin wechselt vollkommen die funktionellen Eigenschaften von Thrombin, wenn es mit Thrombin komplexiert ist. Thrombin verklumpt normalerweise Fibrinogen, aktiviert Blutplättchen und wandelt die Gerinnungscofaktoren V und VIII in ihre aktivierten Formen Va und VIIIa um. Schließlich aktiviert Thrombin Protein C, aber nur sehr langsam und ineffizient und die Aktivierung ist ferner durch physiologisches Ca²&spplus; gehemmt. Im Gegensatz dazu verklumpt mit Thrombomodulin komplexiertes Thrombin Fibrinogen nicht, aktiviert die Blutplättchen nicht oder wandelt die Gerinnungsfaktoren V und VIII nicht in ihre aktivierten Entsprechungen Va und VIIIa um, sondern wird zu einem sehr effizienten Aktivator von Protein C Zymogen in Gegenwart von physiologischem Ca²&spplus;. Die Geschwindigkeitskonstante der Protein C Zymogen Aktivierung durch Thrombemodulin-Thrombin ist über 1 000 fach höher als die Geschwindigkeitskonstante von Thrombin alleine.
Um zu verstehen, wie aktiviertes Protein C die Blutgerinnung herunterreguliert, wird im folgenden eine kurze Beschreibung des Gerinnungsenzymsystems bereitgestellt. Das Gerinnungssystem betrachtet man am besten als eine Kettenreaktion, die die sequentielle Aktivierung von Zymogenen in aktive Serinproteasen beinhaltet. Diese Kettenreaktion bildet schließlich das Enzym Thrombin, das durch limitierte Proteolyse Plasmafibrinogen in das unlösliche Gel Fibrin umwandelt. Die zwei Schlüsselereignisse in der Gerinnungskaskade sind die Umwandlung von Gerinnungsfaktor X in Xa durch den Gerinnungsfaktor IXa und die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin durch den Gerinnungsfaktor Xa. Beide Reaktionen laufen an Zelloberflächen ab, die bedeutendste ist die Blutplättchenoberfläche, und beide Reaktionen benötigen Cofaktoren. Die wichtigsten Cofaktoren des Systems, die Faktoren V und VIII, zirkulieren im System als relativ inaktive Vorläufer, aber wenn die ersten wenigen Moleküle Thrombin gebildet sind, wirkt Thrombin zurück und aktiviert die Cofaktoren durch limitierte Proteolyse. Die aktivierten Cofaktoren Va und VIIIa beschleunigen sowohl die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin als auch die Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa um etwa fünf Größenordnungen. Aktiviertes Protein C wirkt vorzugsweise auf die Gerinnungscofaktoren Va und VIIIa, die aktivierten Formen der inaktiven Gerinnungscofaktoren V und VIII, um sie proteolytisch abzubauen, zu hydrolysieren und unwiederbringlich zu zerstören. Die Gerinnungsfaktoren V und VIII sind im Gegensatz dazu in vivo sehr schlechte Substrate für aktiviertes Protein C.
Ein wichtiger Cofaktor für aktiviertes Protein C ist Protein S, ein weiteres Vitamin K abhängiges Plasmaprotein. Das Protein 5 steigert die durch aktiviertes Protein C vermittelte Hydrolyse der Faktoren Va und VIIIa im wesentlichen 25fach.
Das Protein C ist als ein wertvolles therapeutisches Mittel anerkannt (siehe beispielsweise Bang et al., US- A 4 775 624 vom 4. Oktober 1988, dessen Beschreibung hiermit eingeführt ist). Aktiviertes Protein C ist ein neues antithrombetisches Mittel mit einem breiteren therapeutischen Index, als erhältliche Antikoagulantien, wie Heparin und die oralen Antikoagulantien vom Hydroxycumarin-Typ. Weder Protein C Zymogen noch aktiviertes Protein C ist wirksam, bevor Thrombin gebildet wird, da Thrombin zur Umwandlung der Gerinnungsfaktoren V zu Va und VIII zu VIIIa benötigt wird, und die aktivierten Formen dieser zwei Cofaktoren sind das bevorzugte Substrat für aktiviertes Protein C. Thrombin wird ebenfalls zur Aktivierung von Protein C Zymogen benötigt, da ohne dem Thrombemodulin-Thrombin-Komplex das Protein C Zymogen nicht in dessen aktive Entsprechung umgewandelt wird.
Aktiviertes Protein C ist ein Antikoagulans auf Abruf, da aktiviertes Protein C durch Inaktivierung der Cofaktoren Va und VIIIa arbeitet. Da Thrombin benötigt wird, um die Faktoren V und VIII in ihre aktivierten Entsprechungen Va und VIIIa umzuwandeln, wirkt Protein C nur als Antikoagulans nachdem Thrombin gebildet wurde. Herkömmliche Antikoagulantien behalten im Gegensatz zu aktiviertem Protein C einen konstanten Antikoagulationszustand während der Zirkulation solange bei, wie sie dem Patienten gegeben werden, wobei das Risiko für Blutungskomplikationen stark gegenüber dem von Protein C oder aktiviertem Protein C erhöht ist. Aktiviertes Protein C ist daher ein Antikoagulans auf Abruf mit breiter klinischer Anwendbarkeit zur Verwendung als Alternative zu Heparin und den Hydroxycumarinen.
Bei manchen Krankheitszustanden, wie der erblichen Protein C Defizienz, besitzt das Protein C Zymogen eine große therapeutische Bedeutung. Bei congenitaler homozygoter Protein C Defizienz sterben betroffene Personen in der frühen Kindheit an Purpura fülminans, einer oft tödlichen Form der disseminierten intravaskulären Koagulation. Bei heterozygoter Protein C Defizienz leiden betroffene Personen an schweren wiederkehrenden thromboembolischen Vorfällen. Es ist klinisch allgemein anerkannt, daß Plasmaproteinkonzentrate, die für die Behandlung der Hämophihe B oder Faktor IX Defizienz entwickelt sind und die Protein C als Verunreinigung enthalten, in der Vorbeugung und der Behandlung von intravaskulärer Gerinnung bei heterozygoter Protein C Defizienz wirksam sind. Anormal niedrige Protein C Mengen sind ebentalls bei thrombetischen Zuständen, wie disseminierter intravaskulärer Koagulation, und bei Krankheitszuständen mit zur Thrombose, wie schwererem Trauma, größeren chirurgischen Eingriffen und Krebs, festgestellt worden.
Um die Aktivierung von Protein C und die Erfindung zu verstehen, wird im folgenden die kodierende Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für unreifes humanes Protein C gezeigt. Diese Aminosäuresequenz und bestimmte Teile hiervon werden zum Zweck der Erfindung auch als "natives humanes Protein C" bezeichnet.
worin A für Desoxyadenyl steht, G für Desoxyguanyl steht, C für Desoxycytidyl steht, T für Thymidyl steht, ALA für Alanin steht, ARG für Arginin steht, ASN für Asparagin steht, ASP für Asparaginsäure steht, -COOH für den Carboxyterminus steht, CYS für Cystein steht, GLN für Glutamin steht, GLU für Glutaminsäure steht, GLY für Glycin steht, HIS für Histidin steht, H&sub2;N für den Aminoterminus steht, ILE für Isoleucin steht, LEU für Leucin steht, LYS für Lysin steht, MET für Methionin steht, PHE für Phenylalanin steht, PRO für Prolin steht, SER für Serin steht, THR für Threonin steht, TRP für Tryptophan steht, TYR für Tyrosin steht und VAL für Valin steht.
Die oben angegebene DNA Sequenz wurde aus CDNA Klonen abgeleitet, die aus Protein C kodierender humaner Leber MRNA hergestellt wurden. Der Fachmann erkennt, daß die degenerierte Art des genetischen Codes die Konstruktion vieler verschiedener DNA Sequenzen ermöglicht, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Die oben angegebene CDNA Sequenz für unreifes humanes Protein C ist daher nur eine von vielen möglichen für unreifes humanes Protein C kodierenden Sequenzen. Bei der Herstellung der CDNA Klone werden eine 5'- Poly-G-Sequenz, eine 3'-Poly-C-Sequenz und sowohl 5' als auch 3' PstI Restriktionsschnittstellen an den Enden der für Protein C kodierenden CDNA konstruiert. Zwei dieser CDNA Klone werden zur Konstruktion eines DNA Moleküls verändert, das sowohl die kodierende Sequenz für unreifes humanes Protein C als auch Teile der für die untranslatierte MRNA an den 5' und 3' Enden der kodierenden Region kodierende DNA enthält. Dieses DNA Molekül wird zur Herstellung von Plasmid pHC7 in die PstI Schnittstelle von Plasmid pBR22 inseriert. Das Plasmid pHC7 enthält daher die obige kodierende Sequenz und, erneut nur einen Strang des Moleküls darstellend, diese zusätzlichen Sequenzen:
und
jeweils an den 5' und 3' Enden des kodierenden Strangs der für unreifes humanes Protein C kodierenden Sequenz. Aufgrund der komplementären Art der DNA Basenpaarung ist die Sequenz eines Stranges eines doppelsträngigen DNA Moleküls ausreichend, um die Sequenz des Gegenstranges festlegen zu können. Das Plasmid pHC7 kann herkömmlich aus E. coli K12 RR1/pHC7 isoliert werden, einem Stamm, der hinterlegt und so zum Teil der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois, wurde. Eine Kultur von E. coli K12 RR1/pHC7 kann vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15926 frei bezogen werden. Eine Restriktionsschnittstellen- und Funktionskarte von Plasmid pHC7 ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt.
Unreifes Protein C kann auch schematisch, wie im folgenden gezeigt, dargestellt werden.
prä-pro - die Aminosäurereste 1-42 von unreifem humanem Protein C kodieren das Signalpeptid und das Propeptid von humanem Protein C, welche zur Sekretionssteuerung und gamma-Carboxylierung von Protein C wichtig sind.
LC - die Aminosäurereste 43-197 von unreifem Protein C, einmal posttranslational modifiziert, bilden die leichte Kette (LC) sowohl des zweikettigen Zymogens (gebildet aus dem einkettigen Zymogen durch Entfernen des KR Dipeptids, wie unten erläutert) als auch von aktivierten Protein C Formen.
KR - die Aminosäurereste 198-199 von unreifem humanem Protein C. Diese Reste dürften entfernt werden (aus Homologiegründen zu Protein C vom Rind), möglicherweise durch einen zweistufigen Prozeß, der eine erste Spaltung (entweder zwischen den Resten 197-198 oder 199-200) gefolgt durch einen Angriff einer Carboxypeptidase oder Aminopeptidase unter Bildung von zweikettigem Protein C umfaßt.
AP - die Aminosäurereste 200-211 von unreifem Protein C bilden das Aktivierungspeptid, das von den Zymogenformen entfernt wird, um aktiviertes Protein C zu erhalten.
AHC - die Aminosäurereste 212-461 von unreifem Protein C, einmal posttranslational modifiziert, bilden die aktivierte schwere Kette (AHC) von aktivem Protein C.
HC - die schwere Kette der zweikettigen Protein C Zymogenform, einmal posttranslational modifiziert, stellt die Aminosäurereste 200-461, das Ap und die AHC dar.
Humanes Protein C Zymogen ist ein Serinproteasevorläufer, der in der Leber synthetisiert wird und im Blut vorkommt. Zur Entfaltung der vollständigen biologischen Aktivität benötigt Protein C posttranslationale Modifikationen, die Vitamin K abhängig sind. Das reife, zweikettige, durch Disulfidbrücken verbundene Protein C Zymogen entsteht aus einem einkettigen Zymogen durch limitierte Proteolyse. Diese limitierte Proteolyse dürfte die Abspaltung und Entfernung der Aminosäurereste 199 und 199 beinhalten. Die Aktivierung des zweikettigen Zymogens in die aktive Serinprotease beinhaltet die proteolytische Spaltung einer ARG-LEU Peptidbindung (Reste 211 und 212). Diese letztere Spaltung entläßt ein Dodecapeptid (Reste 200-211), das Aktivierungspeptid, das den Aminoterminus der größeren (schweren) Kette des zweikettigen Zymogenmolekuls bildet. Das Protein C ist signifikant glycosyliert. Das reife Enzym enthält 15-23 % Kohlenhydrate. Das Protein C enthält auch einige ungewöhnliche Aminosäuren, einschließlich gamma-Carboxyglutaminsäure und β-Hydroxyasparaginsäure (Erythro-L- β-hydroxyaspartat). Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla) wird durch gamma-Glutamylcarboxylierung aus Glutaminsäureresten mit Hilfe der mikrosomalen Carboxylase der Leber hergestellt, wozu Vitamin K als Cofaktor benötigt wird.
Die Aktivierung von humanem Protein C kann auch schematisch dargestellt werden und ist im folgenden gezeigt. Der Fachmann erkennt, daß die Reihenfolge der Schritte im Schema nicht notwendigerweise den Weg in vivo widerspiegelt. Prä-pro-LC-KR-AP-AHC unreifes Protein C posttranslationale Modifikation, das heißt gamma-Carboxylierung von bestimmten Glutaminsäureresten, β-Hydroxylierung eines Asparaginsäurerests und Glycosylierung Sekretion, Entfernung der Reste 1-42, was mehr als eine proteolytische Spaltung erfordern kann einkettiges Zymogen Entfernung der Reste 198-199, etwa 90 % des im humanen Blut gefündenen Protein C Zymogens ist die zweikettige Form (S-S = Disulfidbrücke) zweikettiges Aktivierung durch Thrombin-Thrombomodulin aktiviertes Protein C
Die vorliegende Erfindung liefert neue Verbindungen, Vektoren, Transformanden und Verfahren zur rekombinanten Expression von neuen Protein C Zymogenen.
Zum Zweck der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung werden folgenden Ausdrücke folgendermaßen definiert.
Ad2LP - der hauptsächliche späte Promotor des Adenovirus Typ 2
Aminosäurereste in hierin beschriebenen Proteinen oder Peptiden werden wie in der folgenden Tabelle abgekürzt: Tabelle I
ApR - der ampicillinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
BK - DNA des BK Virus
Enh oder Enhancer - der Enhancer des BK Virus
ep oder SV40ep- ein DNA Segment, das den frühen SV40 Promotor des T-Antigen-Gens, die T- Antigenbindungsstellen, den SV40 Enhancer und den SV40 Replikationsursprung enthält gamina-Carboxylierung - eine Reaktion, die eine Carboxylgruppe an das gnmma-Kohlenstoffatom von Glutaminsäuren anhängt
gamma-carboxyliertes Protein - ein Protein, in dem einige Glutaminsäurereste einer gamma- Carboxylierung unterzogen wurden
GBMT Transkriptionseinheit - eine modifizierte Transkriptionskontrolleinheit, die enthält den P2 Enhancer des BK Virus in geringem Abstand zum stromaufwärts liegenden regulatorischen Element des hauptsächlichen späten Promotors des Adenovirus (MLTF), nämlich dem hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus 2, ein Poly-GT-Element, das zur Stimulierung dieses Promotors positioniert ist, und eine DNA Sequenz, die die gespleißte dreiteilige Signalsequenz des Adenovirus enthält. Die GBMT Transkriptionseinheit findet man auf einem 900 Basenpaare umfassenden HindIII Restriktionsfragment von Plasmid pGT-h.
IVS - eine ein Intron kodierende DNA, auch intervenierende Sequenz genannt
MMTpro - der Promotor des Metallothionin-1-Gens der Maus
unreifes Protein - nach Transation eines MRNA Transkripts gebildetes Polypeptid vor jeglichen posttranslationalen Modifikationen. Posttranslationale Modifikationen, wie gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten und Hydroxylierung von Asparaginsäureresten können jedoch stattfinden, bevor ein Protein vollständig von einem MRNA Transkript translatiert ist.
NeoR - das Neomycinresistenz verleihende Gen, das auch zur Resistenzvermittlung gegenüber dem Antibiotikum G418 verwendet werden kann
pA - eine für ein Polyadenylierungssigual kodierende DNA Sequenz
Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription von DNA in RNA steuert
Protein C Aktivität - jede Eigenschaft von humanem Protein C, die für proteolytische, amidolytische, esterolytische und biologische (gerinnungshemmende oder profibrinolytische) Aktivitäten verantwortlich ist. Verfahren zur Austestung einer gerinnungshemmenden Aktivität eines Proteins sind in der Technik gut bekannt, das heißt siehe Grinnell et al., 1997, Biotechnology 5:1189.
Rekombinanter DNA Klonierungsvektor - jedes Agens, einschließlich aber nicht nur beschränkt auf chromosomal integrierende Agentien, autonom replizierende Plasmide und Phagen, das ein DNA Molekül umfaßt, in das ein oder mehrere zusätzliche DNA Segmente eingesetzt werden können oder wurden.
Rekombinanter DNA Expressionsvektor - jeder rekombinante DNA Klonierungsvektor, in den ein Promotor eingebaut und zur Expressionssteuerung eines Genprodukts positioniert wurde.
Rekombinanter DNA Vektor - jeder rekombinante DNA Klonierungs- oder Expressionsvektor.
Replikon - eine DNA Sequenz, die die autonome Replikation eines Plasmids oder eines anderen Vektors kontrolliert und erlaubt.
Restriktionsfragment - jede lineare DNA Sequenz, die durch die Wirkung einer oder mehrerer Restrikuonsendonukleasen entstanden ist.
empfindliche Wirtszelle - eine Wirtszelle, die nicht in Gegenwart eines verabreichten Antibiotikums oder einer anderen toxischen Verbindung olme einem DNA Segment wachsen kann, das dagegen Resistenz verleiht
TcR - der tetracyclinresistente pHänotyp oder das diesen verleihende Gen
Transformation - die Einführung von DNA in eine Empfangerwirtszelle, die den Genotyp der Empfangerzelle ändert.
Transformand - eine Empfangerwirtszelle, die einer Transformation unterzogen wurde.
Translationsaktivierungssequenz - jede DNA Sequenz, einschließlich der, die eine Ribosomenbindungsstelle und ein Translationsstartcodon, wie 5'-ATG-3', kodiert, die für die Translation eines MRNA Transkripts in ein Peptid oder Polypeptid sorgt
Zymogen - ein enzymatisch inaktiver Vorläufer eines proteolytischen Enzyms. Das hierin verwendete Protein C Zymogen betrifft sekretierte, inaktive Formen, ob einkettig oder zweikettig, von Protein C.
Die Figur 1 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC Q097. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung sind die Figuren nicht exakt im Maßstab gezeichnet.
Die Figur 2 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC-Q248.
Die Figur 3 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC-Q313.
Die Figur 4 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC-Q329.
Die Figur 5 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pGTC.
Die Figur 6 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pGT-d.
Die Figur 7 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pGT-h.
Die vorliegende Erfindung liefert DNA Verbindungen, die für die Expression von neuen Zymogenformen von humanem Protein C kodieren. Einige Verfahren zur Herstellung von nativem humanem Protein C Zymogen und nativem humanem Protein C wurden beschrieben (siehe Bang et al., US-A 4 775 624 vom 4 Oktober 1988 und EP-A 0215 548, die hiermit eingeführt sind). Diese dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren sorgen für die Expression von Zymogenformen von humanem Protein C, die sich in der Aminosäuresequenz nicht von den Zymogenformen unterscheiden, die in humanem Blut vorkommen. Bei einer Expression in bestimmten eukaryontischen Zellinien, wie der humanen Nierenzellinie 293, wird das native humane Protein C Zymogen mit einem neuen Glycosylierungsmuster sekretiert, das sich von dem der in humanem Blut gefundenen Zymogenform unterscheidet. Die vorliegende Erfindung liefert Zymogenformen von humanem Protein C, die aufgrund ortsspezifischer Veränderungen in der Aminosäuresequenz ein verändertes Glycosylierungsmuster aufweisen. Bei einer Aktivierung weisen diese Zymogenformen eine erhöhte amidolytische und gerinnungshemmende Aktivität im Vergleich zu nativem humanem Protein C auf.
Die vorliegende Erfindung liefert auch DNA Verbindungen, rekombinante DNA Expressionsvektoren, transformierte Zellinien und Verfahren zur rekombinanten Expression dieser neuen Zymogenformen von humanem Protein C. Das Verfahren zur Herstellung dieser Zymogenformen von humanem Protein C ist gekennzeichnet durch
(A) Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Vektor, wobei der Vektor umfaßt
(i) eine DNA Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuresequenz vom Aminoterminus zum Carboxyterminus folgende Aminosäuresequenz umfaßt
worin R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub2; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub3; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN und R&sub4; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, mit der Maßgabe, daß R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht alle für ASN stehen, und
(ii) einen Promotor, der zur Expressionssteuerung dieser DNA Sequenz positioniert ist,
(B) Kultivierung dieser in Schritt (A) transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression dieser DNA Sequenz geeignet sind, und
(C) Gewinnung dieses Protein C Zymogens aus dieser Kultur.
Das Verifihren und die im Verfahren brauchbaren Verbindungen werden später ausführlicher beschrieben.
Die Erfindung liefert auch DNA Verbindungen zur Verwendung im Herstellungsverfahren dieser neuen Zymogenformen von humanem Protein C. Diese neuen Verbindungen kodieren alle ein Prä-Propeptid, das ein Signalpeptid zur Sekretionssteuerung und ein Propeptid von einem gamma-carboxylierten Protein (durch die Wirkung einer Vitamin K-abhängigen Carboxylase) umfaßt. Solche Propeptidsequenzen sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Suttie et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 634-637. Vorzugsweise und zur Konstruktionserleichterung stammen sowohl die Signalpeptid kodierende Sequenz als auch die Propeptid kodierende Sequenz von der Aminosäuresequenz eines Prä-Propeptids eines gamma-carboxylierten Proteins. Beispiele für solche gamma-carboxylierten Proteine sind unter anderem Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin, Protein S, Protein Z und Protein C. Eine DNA Sequenz, die das Prä-Propeptid von humanem Protein C kodiert, ist für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren am meisten bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen umfassen ferner die kodierende Sequenz für die leichte Kette von humanem Protein C direkt anschließend stromabwärts positioniert und im Leserahmen mit der das Prä- Propeptid kodierenden Sequenz. Die leichte Kette von humanem Protein C enthält die Aminosäurereste 43 bis einschließlich 197 von unreifem Protein C, wie dies oben im Hintergrundabschnitt gezeigt ist. Die aminoterminalen Teile der Vitamin K abhängigen Plasmaproteine, wie der aminoterminale Teil der leichten Kette von Protein C, weisen Calciumbindungsstellen auf. Die Calcium-bindenden Domänen dieser Plasmaproteine, wie Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin und Protein S können ähnlich verwendet werden (siehe EP-A 0 215 548 auf den Seiten 12 und 13) und sind äquivalent zur Calcium-bindenden Domäne der leichten Kette von humanem Protein C. Bei einer neuen Zymogeform (Q097) der vorliegenden Erfindung wurde der Asparaginrest an der Position 139 der leichten Kette in einen Glutaminrest umgewandelt, wobei die Glycosylierungsstelle entfernt wird.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen umfassen ferner die kodierende Sequenz für das Dipeptid LYS-ARG (KR), das stromabwärts unmittelbar anschließend und im transiationalen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz der leichten Kette positioniert ist. Ein dibasisches Dipeptid, wie LYS-ARG liegt im unreifen Protein am carboxyterminalen Ende der leichten Kette. Die Orientierung des LYS-ARG Dipeptids im exprimierten Protein ist für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht relevant. Dibasische Dipeptide, wie LYS-LYS oder ARG- ARG sind zum LYS-ARG Dipeptid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung äquivalent. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist jedoch das Dipeptid LYS-ARG, das das Dipeptid des nativen humanen Protein C ist, bevorzugt.
Unmittelbar stromabwärts der Codons für das LYS-ARG Dipeptid liegt die kodierende Sequenz des Aktivierungspeptids. Der Fachmann erkennt, daß die erfindungsgemäßen Zymogene sich primär von den nativen Zymogenformen von humanem Protein C unterscheiden, wie dies später beschrieben ist.
Andere Aminosäuresubstitutionen können zusätzlich zur Substitution an der Position 139 der leichten Kette auch die amidolytische und gerinnungshemmende Aktivität des entstehenden Zymogens fördern. Der Ausdruck "entstehendes Zymogen" wird verwendet, um anzudeuten, daß obwohl die Substitutionen in Bezug auf die Aminosäurepositionen in unreifem humanem Protein C beschrieben sind, das unreife humane Protein C erst sekretiert werden muß (was zur Entfernung der Aminosäurereste 1 bis 42 führt), um eine Zymogenform zu erhalten. Die Substitution des Asparaginrests an der Position 139 (im unreifen humanem Protein C) gegen einen Glutaminrest führt so zu einem neuen Zymogen der vorliegenden Erfindung. Die Substitution des Asparaginrests (in der aktivierten schweren Kette) an den Positionen 290, 355 oder 371 gegen einen Glutaminrest führt ebenfalls zu einer neuen erfindungsgemäßen Zymogenform.
Daher entstehen die bevorzugten neuen Zymogenformen von humanem Protein C der vorliegenden Erfindung durch die Prozessierung und Sekretion von unreifen humanen Protein C Molekülen mit der im folgenden gezeigten Aminosäuresequenz
worin R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub2; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub3; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN und R&sub4; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, mit der Maßgabe, daß R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht alle für ASN stehen.
Das neue Zymogen Q097 enthält eine Substitution des Asparaginrests an der Position 139 gegen einen Glutaminrest. Das Zymogen Q248 tauscht den Asparaginrest an der Position 290 durch einen Glutaminrest aus. Das Zymogen Q313 tauscht den Asparaginrest an der Position 355 aus, während das Zymogen Q329 den Asparaginrest an der Position 371 durch einen Glutaminrest austauscht.
Der Fachmann erkennt, daß aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl von DNA Verbindungen das oben gezeigte Polypeptid kodieren können. Daher sind die später und in den begleitenden Beispielen beschriebenen Konstruktionen der bevorzugten erfindungsgemäßen DNA Verbindungen, Vektoren und Transformanden nur erläuternd und beschränken den Schutzurufang der Erfindung nicht. Zusätzlich ist die Substitution von GLN anstelle von ASN erläuternd und beschränkt den Schutzumfang der Erfindung nicht, da andere Substitutionen mit der Ausnahme von CYS und PRO verwendet werden können. Darüberhinaus erkennt der Fachmann, daß verschiedene einzelne Aminosäuresubstitutionen der vorliegenden Erfindung unter Bildung von anderen neuen Zymogenen kombiniert werden können.
Alle erfindungsgemäßen DNA Verbindungen werden durch ortsspezifische Mutagenese des humanen Protein C Gens hergestellt. Die mutagenisierten für Zymogen kodierenden Moleküle werden dann in eukaryontische Expressionsvektoren so inseriert, daß die Expression der Zymogengene durch den hauptsächlichen späten Promotor des Adenovirus 2 gesteuert wird. Die Vektoren enthalten auch das P2 Enhancerelement des BK Virus zur Förderung der Expression vom Promotor positioniert. Die Vektoren wurden in Escherichia coli K12 AG1 Zellen transformiert und hinterlegt und am 9. Januar 1990 zum Bestandteil der Northern Regional Research Laboratones in Peoria, Illinois, 61604 gemacht. Die spezifischen Kulturen und Hinterlegungsnummern finden sich in Tabelle II. Tabelle II
Die Kulturen werden erhalten und die Plasmide werden mittels herkömmlicher Techniken isoliert und können dann direkt in eukaryontische Wirtszellen zur Produktion der Zymogenformen von humanem Protein C transfiziert werden. Es ist bevorzugt, die Plasmide in Zellen zu transformieren, die das unmittelbar frühe E1A Genprodukt des Adenovirus exprimieren, da der auf den Vektoren vorkommende BK Enhancer zur Förderung der Expression am effizientesten in Gegenwart von EIA fünktioniert. Der Fachmann erkennt, daß viele Wirtszellen ein unmittelbar frühes Genprodukt eines großen DNA Virus exprimieren oder zur Expression hiervon gebracht werden können. Bevorzugte Zellinien sind die humane Nierenzellinie 293 (erhältlich von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573) oder der syrischen Hamsterzellinie AV12- 664 (ATCC 9595). Die embryonale humane Nierenzellinie 293 ist am meisten bevorzugt.
Um noch höhere Expressionsmengen zu erhalten, können die für die verschiedenen Zymogenformen von Protein C kodierenden Gene aus den hinterlegten Vektoren herausgeschnitten und in einen Vektor ligiert werden, der die GBMT Transkriptionskontrolleinheit enthält. Genauer gesagt kann das Plasmid pGT-h, das das Hygromycinresistenz-verleihende Gen enthält, von der NRRL (in E. coli K12 AG1) unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18592 erhalten werden. Das Plasmidrückgrad wird durch einen Verdau des Plasmids mit dem Restriktionsenzym BclI nach einer Isolierung der Plasmid DNA aus einem dam-Methylase negativen Stamm von E. coli, wie GM48 (NRRL B-15725) geöffnet. Die neuen Zymogengene können jeweils aus den entsprechenden Plasmiden über einen BclI Verdau entfernt werden. Das Vektorrückgrad wird gereinigt und dephosphoryliert und dann wird jedes der neuen erfindungsgemaßen Zymogengene in die BclI Schnittstelle ligiert. Die Plasmide, die die neuen zur Expression hinter die GBMT Transkriptionseinheit positionierten Zymogengene enthalten, werden dann in 293 Zellen transformiert, kultiviert und die neuen Zymogene können aus der Kultur durch Techniken gereinigt werden, die in der Technik gut bekannt sind. Ein Verfahren zur Reinigung von humanem Protein C aus der Zellkultur ist in Yan, EP-A 0 363 126 vom 11. April 1990 beschrieben, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt wird.
Die erfindungsgemaßen Verbindungen enthalten auch Zymogenformen, die nach der Sekretion der erfindungsgemaßen unreifen Proteine gebildet werden. Daher umfassen die erfindungsgemäßen Verbindungen kodierende DNA Sequenzen, Expressionsvektoren, die die Expression dieser Sequenzen steuern, unreife Proteine, die durch die Translation von MRNA Transkripten gebildet werden, die aus diesen kodierenden Sequenzen erzeugt wurden, Zymogene, die durch eine Sekretion dieser unreifen Proteine gebildet werden und aktivierte Derivate von bestimmten Zymogenen.
Die erfindungsgemaßen DNA Verbindungen können auch chemisch oder durch Kombination von Restriktionsfragmenten oder durch eine Kombination von bekannten Techniken synthetisiert werden. DNA Synthesegeräte sind ebenfalls erhältlich und können zur Konstruktion der erfindungsgemaßen Verbindungen verwendet werden.
Die beispielsgemäßen Vektoren der Erfindung enthalten den BK Enhancer positioniert, um die Transkription der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz vom hauptsächlichen späten Adenoviruspromotor aus zu stimulieren. Der Fachmann erkennt, daß eine große Anzahl an eukaryontischen Promotoren, Enhancern und Expressionsvektoren in der Technik bekannt ist und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann. Der Fachmann erkennt ebenfalls, daß ein eukaryontischer Expressionsvektor auch ohne ein Enhancerelement fünktionieren kann. Der Schlüsselaspekt der vorliegenden Erfindung beruht nicht auf dem bestimmten Enhancer, falls einer verwendet wird, oder dem Promotor, der zur Expressionssteuerung des Protein C Zymogens verwendet wird, sondern beruht auf der neuen kodierenden Sequenz und den entsprechenden Proteinen, die aus dieser Sequenz gebildet werden.
Die Auswähl der Vektorelemente, wie Promotoren, Enhancer und Selektionsmarker, kann jedoch großen Einfluß auf die schließlichen Proteinmengen haben, die von einer eukaryontischen Wirtszelle gebildet werden. Die EP-A 0 245 949 vom 19. November 1987, das hiermit eingeführt ist, beschreibt mehrere Expressionsvektoren für natives Protein C Zymogen, die den BK Enhancer zur Stimulation eines eukaryontischen Promotors verwenden, der zur Expressionssteuerung von unreifem humanem Protein C positioniert ist. Diese Vektoren steuern besonders hohe Expressionsmengen, wenn sie in eukaryontische Zellen transformiert werden, die auch ein unmittelbar frühes Genprodukt eines großen DNA Virus exprimieren, wie das E1A Genprodukt des Adenovirus. Wie es aus den hierin beschriebenen beispielsgemäßen Vektoren pGT-Q097-h, pGT-Q248-h, pGT-Q313-h und pGT-Q339-h ersichtlich ist, ist das GBMT-E1A Genproduktexpressionsverfahren zur Verwendung in den erfindungsgemaßen Vektoren besonders bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung in einer bestimmten eukaryontischen Wirtszelle beschränkt. Eine Vielzahl an eukaryontischen Wirtszellen ist von Sammlungen, wie der American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD 20852, erhältlich und zur Verwendung mit den erfindungsgemaßen Vektoren geeignet. Die Auswahl einer bestimmten Wirtszelle hängt in gewissem Maße von dem speziellen Expressionsvektor ab, der zur Expressionssteuerung der für Protein C kodierenden DNA Verbindungen der Erfindung verwendet wird. Da das unreife humane Protein C und unreife humane Protein C Derivate der Erfindung einer wesentlichen posttranslationalen Modifikation unterzogen werden, sind manche Wirtszellen jedoch stärker zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Vektoren bevorzugt. Die EP-A 0 245 949 und Grinell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189 beschreiben, daß Adenovirus-transformierte, humane embryonale Nierenzellen besonders zur Verwendung bei der rekombinanten Herstellung von gamma-carboxylierten Proteinen, wie humanem Protein C, bevorzugt sind. Eine solche Adenovirus-transformierte, humane embryonale Nierenzellinie ist die 293-Zellinie, die unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573 von der ATCC erhalten werden kann. Die 293-Zellinie ist auch zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Vektoren bevorzugt.
Die Vorteile bei der Herstellung eines gamma-carboxylierten Proteins, wie humanem Protein C Zymogen in einer Adenovirus-transformierten Zellinie, sind jedoch nicht auf die Adenovirus-transformierten humanen embryonalen Nierenzellen beschränkt. Tatsächlich sind Adenovirus-transformierte Zellen im allgemeinen außergewöhnliche Wirte zur Herstellung von gamma-carboxyliertem humanem Protein C. Eine besonders bevorzugte Zellinie dieses Typs ist die AV12-664 (hierin später "AV12") Zellinie, die von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 9595 erhalten werden kann. Die AV12 Zellinie wurde durch Injektion von humanem Adenovirus 12 in das Genick eines syrischen Hamsters und Isolierung von Zellen aus dem entstehenden Tumor hergestellt. Das Beispiel 3 beschreibt später die Transformation sowohl der 293- als auch der AV12 Zellinie mit dem beispielsgemäßen Vektor pGT-Q097-h.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können in eine Vielzahl an eukaryontischen, speziell Säugetierwirtszellen transformiert und dort exprimiert werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren, die keinen Selektionsmarker besitzen, mit dem stabile eukaryontische Transformanden zu isolieren und zu identifizieren sind, sind nicht nur für Versuchsassays, sondern auch zum Zweck der Cotransformation brauchbar, ein Verfahren, das in der US-A 4 399 216 vom 26. August 1983 beschrieben wurde, die hiermit eingeführt ist. Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch Sequenzen enthalten, die die Replikation in E. coli erlauben, da es im allgemeinen effizienter ist, Plasmid DNA aus E. coli zu präparieren, als aus anderen Wirtsorganismen.
Die Expression der in den erfindungsgemäßen Vektoren enthaltenen kodierenden Sequenzen für humanes Protein C tritt in solchen Wirtszellen auf, in denen der bestimmte Promotor zusammen mit dem Strukturgen funktionsfähig ist. Beispielhafte zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Wirtszellen sind in Tabelle III zusammen mit passenden Bemerkungen aufgeführt. Tabelle III
* American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 10852-1776
Wie in Tabelle III gezeigt, besitzen viele Säugetierwirtszellen die notwendige Zeilmaschinerie zur Erkennung und richtigen Prozessierung des Signalpeptids in den erfindungsgemäßen unreifen Proteinen und liefern die posttranslationalen Modifikationen, wie Glycosylierung, gamma-Carboxylierung und β-Hydroxylierung, wie sie bei im Blut vorkommendem humanem Protein C beobachtet werden. Wie oben erwännt, erfolgt jedoch eine optimale posttranslationale Prozessierung von HPC in Adenovirus transformierten Zellen. Eine große Vielzahl an später diskutierten Vektoren existiert für die Transformation solcher eukaryontischer Wirtszellen, aber die später beispielhaft dargestellten bestimmten Vektoren sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Die Vektoren vom pSV2 Typ enthalten Segmente des SV40 Genoms, die eine definierte eukaryontische Transkriptionseinheit bilden: Einen Promotor (ep), eine intervenierende Sequenz (IVS) und eine Polyadenylierungsstelle (pA). In Abwesenheit des SV40 T-Antigens transformieren Plasmidvektoren vom pSV2 Typ Säugetierund andere eukaryontische Wirtszellen durch Integration in die chromosomale DNA der Wirtszelle. Es wurde eine Vielzahl an Plasmidvektoren vom pSV2 Typ konstruiert (siehe Eukaryotic Viral Vektors, herausgegeben von Gluzman, publiziert durch die Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York, 1982), wie die Plasmide pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg und pSV2-β-Globin, worin der SV40 Promotor die Transkription eines inserierten Gens steuert. Diese Vektoren sind zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen geeignet und sind entweder von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland oder von dem Northern Regional Research Laboratory (NRRL) in Peoria, Illinois, erhältlich.
Das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) enthält ein Dihydrofolatreduktasegen (dhfr) der Maus unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors. Unter geeigneten Bedingungen ist vom dhfr Gen bekannt, daß es im Wirtschromosom vervielfältigt oder kopiert wird. Diese Vervielfältigung, in einem zusammenfassenden Artikel von Schimke, 1984, Cell 37:705-713 beschrieben, kann direkt an das dhfr Gen anschließende DNA Sequenzen, wie eine erfindungsgemäße für unreifes humanes Protein C kodierende Sequenz, miteinbeziehen und kann daher zur Produktionssteigerung der erfindungsgemäßen Protein C Zymogene verwendet werden.
Die zur Expression von unreifem Protein C und Protein C Zymogenen der Erfindung in Säugetier- und anderen eukaryontischen Wirtszellen konstruierten Plasmide können eine große Vielzahl an Promotoren verwenden. Die vorliegende Erfindung ist in keinster Weise durch die Verwendung bestimmter, hierin beispielhaft dargestellter eukaryontischer Promotoren beschränkt. Promotoren, wie der späte SV40 Promotor oder die von Bucher et al., 1986, Nuc. Acids Res. 14(24): 1009 beschriebenen eukaryontischen Promotoren, oder Promotoren von eukaryontischen Genen, wie beispielsweise das östrogeninduzierbare Hühnerovalbumingen, die Interferongene, das glucocorticoidinduzierbare Tyrosinaminotransferasegen, das Thymidinkinasegen und die hauptsächlichen frühen und späten Adenovirusgene, können leicht isoliert und zur Verwendung in rekombinanten DNA Expressionsvektoren modifiziert werden, die zur Herstellung von humanem Protein C Zymogen in eukaryontischen Wirtszellen entwickelt wurden. Eukaryontische Promotoren können auch in Serie geschaltet zur Expressionssteuerung einer erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz verwendet werden. Des weiteren sind sehr viele Retroviren bekannt, die eine große Bandbreite an eukaryontischen Wirtszellen infizieren. Die langen terminalen Sequenzwiederholungen in der Retrovirus DNA kodieren oft eine Promotoraktivität und können daher zur Expressionssteuerung der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen verwendet werden.
Das Plasmid pRSVcat (ATCC 37152) enthält Teile der langen terminalen Sequenzwiederholungen des Rous Sarcoma Virus (RSV), einem Virus, von dem bekannt ist, daß es Hühnerzellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Die langen terminalen Sequenzwiederholungen des RSV können auf einem 0,76 kb NdeI-HindIII Restriktionsfragment von Plasmid pRSVcat isoliert werden. Der Promotor in den langen terminalen Sequenzwiederholungen von RSV (Gorman et al., 1982, P.N.A.S. 79:6777) ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Das Plasmid pMSVi (NRRL B-15929) enthält die langen terminalen Sequenzwiederholungen des Maus Sarcoma Virus (MSV), einem Virus, von dem bekannt ist, daß es Mäusezellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Diese Wiederholungssequenzen sind zur Verwendung als Promotor in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Der Metallothioninpromotor der Maus (MMT) ist auch zur Verwendung in eukaryontischen Wirtszellen gut beschrieben worden und ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Vektoren geeignet. Der MMT Promotor kommt auf dem 15 kb Plasmid pdBPV-MMTneo (ATCC 37224) vor, das als Ausgangsmaterial zur Konstruktion anderer erfindungsgemäßer Plasmide dienen kann.
Viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden beispielsgemäßen DNA Sequenzen und Plasmide sind möglich. Beispielsweise erlaubt die Degeneriertheit des genetischen Codes den Austausch von Nukleotiden innerhalb der Polypeptid-kodierenden Regionen, wie auch im Translationsstopsignal, ohne Veränderung der Polypeptid-kodierenden Sequenz. Solche austauschbaren Sequenzen können aus der bekannten Aminosäure- oder DNA Sequenz von humanem Protein C abgeleitet werden und können durch Befolgung herkömmlicher synthetischer Verfahren oder ortsspezifischer Mutageneseverfahren hergestellt werden. Synthetische Verfahren können im wesentlichen gemäß den Verfahren von Itakura et al., 1977 Science 198:1056 und Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:5765 ausgeführt werden. Daher ist die vorliegende Erfindung in keinster Weise auf die bestimmten beispielhaft dargestellten DNA Sequenzen und Plasmide beschränkt.
Nach der Transformation eines erfindungsgemäßen Vektors in eine eukaryontische Wirtszelle kann man Transformanden auf der Grundlage eines selektionierbaren Phänotyps selektionieren. Dieser selektionierbare Phänotyp kann entweder durch einen auf dem Expressionsvektor oder auf einem anderen, mit dem Expressionsvektor cotransformierten Vektor vorhandenen Selektionsmarker der Wirtszelle verliehen werden. Wenn einmal Transformanden selektiert sind, ist es wünschenswert, die Transformanden zu identifizieren, die die größten Mengen an gewünschtem, vom Expressionsvektor kodierten, Protein exprimieren. Eine solche Identifizierung ist besonders nach einem Cotransformationsverfahren wichtig, das eine Anzahl Transformanden erzeugt, die nur das den Selektionsmarker enthaltende Plasmid und somit nicht den Expressionsvektor enthalten. Im späteren Beispiel 4 ist nicht nur ein Protokoll zur Identifizierung von Zellen, die ein gewünschtes Protein exprimieren und sekretieren, sondern auch zur Quantifizierung der sekretierten Proteinmenge relativ zu den anderen mittels des Verfahrens untersuchten Zellen beschrieben. Das Protokoll erlaubt auch die Isolierung von lebensfähigen Zellen, die die höchsten Mengen eines gewünschten Proteins sekretieren.
Verfahren zur Aktivierung der Zymogenformen von humanem Protein C zu aktiviertem Protein C (APC) sind alt und in der Technik gut bekannt. Das Protein C kann durch Thrombin alleine, durch einen Thrombin/Thrombomodulin-Komplex, durch Russels Vipergift oder durch eine Vielzahl anderer Mittel aktiviert werden. Die Aktivität von humanem Protein C Zymogenen kann nach einer Thrombinaktivierung entweder durch amidolytische Gesamttests oder durch Antikoagulationstests gemessen werden. Die Thrombinaktivierung und die Protein C Tests (amidolytisch und gerinnungshemmend) werden gemäß der Beschreibung von Grinnell et al., 1987, Biotechnology 5: 1187-1192 durchgeführt, wobei die gesamte Beschreibung hiervon hiermit eingeführt ist. Die spezifischen amidolytischen Aktivitäten von humanem Protein C Kohlenhydratmutanten sind in der Tabelle IV beschn eben. Tabelle IV
a bestimmt durch Dividieren der Menge an aktiviertem Protein C, die durch den APTT Test bestimmt wurde, durch die Menge, die durch den amidolytischen Test bestimmt wurde.
bnicht durchgeführt
c relative amidolytische Aktivität verglichen mit nativem APC, der Faktor der relativen gerinnungshemmenden Aktivität.
Die im Test der Tabelle IV verwendeten Zymogenmoleküle werden durch einen ELISA Test mittels monoklonaler Antikörper quantifiziert, die nicht mit den Mutanten oder Derivaten im selben Ausmaß wie das Wildtypmolekül reagiert haben können, mit dem die Antikörper erzeugt wurden. Daher führte eine weitere Aufreinigung und Quantifizierung auf der Grundlage des Proteingehalts zu den in Tabelle V gezeigten Daten. Tabelle V
Die erste Zahl in Klammern ist der Zunahmefaktor der Aktivität gegenüber aus Plasma stammendem HPC. Die Anzahl an unabhängigen Proben (n), die doppelt oder dreifach bestimmt wurden, ist angegeben.
Zusätzlich zur erhöhten gerinnungshemmenden Aktivität der in Tabelle V beschriebenen Derivate zeigt die Mutante Q313 eine erhöhte Affinität für Thrombin, was zu einer dreifachen Erhöhung der Aktivierungsgeschwindigkeit durch Thrombin alleine oder im Komplex mit dem Cofaktor Thrombomodulin führt. Diese Erhöhung der Geschwindigkeit ist zur Herstellung einer empfindlicheren Zymogenform von Protein C für die klinische Verwendung und auch zur Verbesserung des Bildungsverfahrens der Protein C Zymogenspaltung unter Bildung des aktivierten Protein C brauchbar. Die kinetischen Aktivierungsparameter von Zymogen Q313 sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI
Die Ergebnisse sind das Mittel von drei unabhängigen Bestimmungen. Die Werte werden durch eine nicht-lineare Regressionsanalyse bestimmt.
Das aktivierte Protein C weist wesentliche antithrombotische Eigenschaften bei der Verhinderung der Ausdehnung von intravenösen Thromben, bei der Verhinderung der Bildung von arteriellen Thromben und bei der Verhinderung von Tod und Organversagen durch Gram-negative Sepsis, Endotoxämie und disseminierter intravaskulärer Koagulation auf. Von besonderer Bedeutung ist, daß die erhöhte fünktionale Aktivität der erfindungsgemaßen aktivierten Protein C Derivate reduzierte Dosierungen bei den obigen klinischen Indikationen mit potentiell erhöhtem Sicherheitsspielraum erlauben.
Die erfindungsgemäßen aktivierten rekombinanten Protein C Zymogene sind zur Prävention und Behandlung einer großen Vielzahl an erworbenen Krankheitszuständen brauchbar, welche umfassen intravaskuläre Koagulation, einschließlich Thrombose der tiefen Venen, Lungenembohe, periphere arterielle Thrombose, Embolien, die vom Herzen oder peripheren Arterien ausgehen, akuten Myokardinfarkt, Schlaganfälle und disseminierte intravaskuläre Koagulation. Diese Protein C Derivate können auch zur Behandlung einer wesentlichen Anzahl an Patienten mit heterozygoten Protein C Defizienzen, die eine wiederkehrende Thrombose der tiefen Venen zeigen, und im Fall von homozygot Protein C defizienten Patienten mit Purpura fulminans wirksam verwendet werden. Eine attraktive therapeutische Indikation für aktiviertes Protein C ist die Verhinderung der Thrombose tiefer Venen und der Lungenembolie, die derzeit mit niedrigen Heparindosen behandelt werden.
Ähnlich können die erfindungsgemäßen Protein C Derivate zur Behandlung von Embolien verwendet werden, die von Thromben in den peripheren Arterien, ganz besonders den Halsschlagadern, ausgehen, die derzeit unbefriedigend mit den derzeit benutzten Therapien behandelt oder verhindert werden, welche Arzneimittel, die zur Unterdrückung der Blutplättchenfünktion fähig sind, orale Blutgerinnungshemmstoffe oder Kombinationen davon enthalten.
Die erfindungsgemäßen aktivierten Derivate sind zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts aufgrund ihrer profibrinolytischen Eigenschaften nach einer Aktivierung brauchbar. Diese aktivierten Derivate können mit Gewebsplasminogenaktivator während der akuten Phase des Myokardinfarkts verabreicht werden. Nachdem der Herzgefaß-verschließende Thrombus aufgelöst ist, können die aktivierten Derivate für weitere Tage verabreicht werden, um einen akuten Myokardreinfarkt zu verhindern.
Aktiviertes Protein C ist für die Behandlung von disseminierter intravaskulärer Koagulation nützlich. In ausgedehnten klinischen Studien wurden Heparin und die oralen Antikoagulantien Patienten mit disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) verabreicht, aber die Ergebnisse waren enttäuschend. Bei disseminierter intravaskulärer Koagulation haben Protein C, wie auch die erfindungsgemäßen aktivierten Derivate, einen deutlichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Blutgerinnungshemmstoffen.
Herkömmliche blutgerinnungshemmende Arzneimittel, speziell Warfarin, sind bei der Behandlung von invasiven malignen Tumoren nützlich. Viele Tumorzellen produzieren Substanzen, die die Aktivierung des Blutgerinnungssystems auslösen, was lokale Fibrinablagerungen zur Folge hat. Diese Fibrinablagerungen wirken als "Nester", in denen sich Krebszellen teilen können, um Metastasen zu bilden. Es ist jedoch nicht möglich, Warfarin oder andere herkömmliche Antikoagulantien in Kombination mit intensiveren und wirksameren Chemotherapieformen zu verabreichen, da eine solche Therapie immer einen starken Abfall in der Anzahl der Blutplättchen hervorruft, und mit Warfarin-Therapie gekoppelte Thrombozytopenie setzt den Patienten einem unakzeptabel hohen Risiko für ernsthafte Blutungskomplikationen aus. Die erfindungsgemäßen Protein C Derivate sind, wie aktiviertes Protein C, selektiver als herkömmliche Antikoagulantien und haben einen weit höheren therapeutischen Index entweder als Heparin oder als die oralen Antikoagulantien und können daher einem thrombozytopenischen Patienten relativ sicher verabreicht werden, was wiederum die Behandlung von Patienten mit invasiven Krebsformen mit effektiver und intensiver Chemotherapie in Kombination mit einem erfindungsgemäßen aktivierten Protein C Derivat ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Zymogene und deren aktivierte Entsprechungen können gemäß bekannter Verfahren zu pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden, wobei ein humanes Protein C Zymogen oder aktiviertes Protein C der Erfindung im Gemisch mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert wird. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich anderer Humanproteine, beispielsweise humanes Serumalbumin, sind beispielsweise in Remington's Pharmazeutical Sciences 16. Ausgabe, 1980. Mack Publishing Co.. herausgegeben von Osol et al., beschrieben, das hiermit eingeführt wird. Solche Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge eines Protein C Zymogens oder einer aktivierten Entsprechung zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen zur wirksamen Verabreichung an den Empfänger herzustellen. Die Protein C Zusammensetzung kann parenteral oder durch andere Verfahren, die ihre Übertragung in einer wirksamen Form in den Blutstrom sicherstellen, verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Verfahren und beschreiben die Konstruktionsprotokolle für repräsentative Verbindungen, Vektoren und Transformanden der Erfindung ohne diese hierdurch zu beschränken.

Beispiel 1

Isolierung von Plasmid pLPC-Q097

Lyophilisierte E. coli K12 AG1/pLPC-Q097 werden vom Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604 unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18608 erhalten. Die lyophilisierten Zellen werden in Röhrchen dekantiert, die 10 ml LB Medium (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl pro Liter, pH wird auf 7,5 eingestellt) enthalten und dann zwei Stunden bei 32ºC inkubiert, wonach die Kulturen auf 50 µg/ml Ampicillin gebracht werden und bei 37ºC über Nacht inkubiert werden.
Ein kleiner Teil der Ubernachtkultur wird auf 50 µg/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten (LB Medium mit 15 g/l Bacto-Agar) so ausplattiert, daß Einzelkolonieisolate von E. coli K12 AG1/pLPC-Q097 erhalten werden. Die erhaltene Einzelkolonie wird in 10 ml LB Medium geimpft, das 50 µg/ml Ampicillin enthält und bei 37ºC über Nacht unter starkem Schütteln inkubiert. Die 10 ml Übernachtkultur wird in 500 ml LB Medium geimpft, das 50 µg/ml Ampicillin enthält und unter starkem Schütteln bei 37ºC inkubiert, bis die Kultur die stationäre Phase erreicht.
Das folgende Verfahren ist von Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory) übernommen.
Die Zellen werden durch Zentrifügation bei 4 000 x g für 10 Minuten bei 4ºC geerntet und der Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird in 100 ml eiskaltem STE Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,8 und 1 mM EDTA) gewaschen. Nach dem Waschen wird das Zellpellet in 10 ml Lösung 1 (50 mM Glucose, 25 mM Tris- HCl pH 8,0 und 10 mM EDTA) resuspendiert, worin 5 mg/ml Lysozym enthalten sind und bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen. Zwanzig ml Lösung 2 (0,2 N NaOH und 1 % SDS) werden dann zu den lysozymbehandelten Zellen gegeben und die Lösung wird vorsichtig durch Kippen gemischt. Das Gemisch wird für 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Fünfzehn ml eiskaltes 5 M Kaliumacetat pH 4,8 werden zum lysierten Zellgemisch gegeben und die Lösung wird durch Kippen gemischt. Die Lösung wird für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die 5 M Kaliumacetatlösung wird durch Zugabe von 11,5 mi Eisessig zu 28,5 ml Wasser und 60 ml 5 M Kaliumacetat hergestellt, wobei die entstehende Lösung in Bezug auf Kalium 3 M ist und in Bezug auf Acetat 5 M ist.
Das lysierte Zellgemisch wird in einem Beckman SW27 (oder einem Äquivalent hiervon) bei 20 000 Upm für 20 Minuten bei 4ºC zentrifügiert. Der Zell-DNA-Debris bildet am Boden des Röhrchens ein Pellet. Etwa 36 ml Überstand werden gewonnen und 0,6 Volumina Isopropanol werden zugegeben, vermischt und die entstehende Lösung wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifügation bei 12 000 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Der Überstand wird verworfen und das DNA Pellet wird bei Raumtemperatur mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Die Ethanolwasclilösung wird dekantiert und das Pellet wird in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Das Pellet wird dann in 8 ml TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA) resuspendiert.
Acht Gramm CsCl werden zur DNA Lösung gegeben. Etwa 0,8 ml einer 10 mg/ml Lösung Ethidiumbromld in Wasser werden zu jeweils 10 ml CsCl-DNA Lösung gegeben. Die schließliche Dichte der Lösung beträgt etwa 1,55 g/ml und die Ethidiumbromidkonzentration beträgt etwa 600 µg/ml. Die Lösung wird in ein Beckman Typ 50 Zentrifügenröhrchen überführt, bis oben mit Paraffinöl aufgefüllt, verschlossen und bei 45 000 Upm für 24 Stunden bei 20ºC zentrifugiert. Nach der Zentrifugation sind zwei DNA Banden bei normalem Licht sichtbar. Nach Entferung des Deckels vom Röhrchen wird die untere DNA Bande mittels einer Spritze mit einer Hypodermisnadel Nr.21 entfernt, die durch die Seite des Zentrifügenröhrchens eingeführt wird.
Das Ethidiumbromid wird durch mehrere Extraktionen mit wassergesättigtem 1-Butanol entfernt. Das CsCl wird durch Dialyse gegen TE Puffer entfernt. Nach den Extraktionen mit gepuffertem Phenol und Chloroform wird die DNA gefällt, mit 70 %igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Etwa 1 mg des Plasmids pLPC- Q097 wird erhalten und bei 4ºC in TE Puffer bei einer Konzentration von etwa 1 µg/µl gelagert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC-Q097 ist in Figur 1 der Zeichnungen gezeigt. Auf dieselbe Weise werden die Plasmide pLPC-Q248, pLPC-Q313 und pLPC-Q329 aus ihren entsprechenden Wirtszellen isoliert, die ebenfalls beim NRRL erhältlich sind. Restriktions- und Funktionskarten jedes dieser Plasmide sind in den Zeichnungen gezeigt.

Beispiel 2

Konstruktion von Plasmid pGT-Q097-h

Die Plasmide pLPC-Q097, pLPC-Q248, pLPC-Q313 und pLPC-Q329 können direkt in eukaryontische Wirtszellen (vorzugsweise 293-Zellen) zur Bildung von großen Mengen an humanen Protein C Zymogenen verwendet werden. Es kann sogar eine größere Expressionsmenge und eine erhöhte Sekretion des Produkts erhalten werden, wenn das für das mutierte Zymogen kodierende Gen in einen Vektor so ligiert wird, daß die Expression des Gens von der GBMT Transkriptionseinheit gesteuert wird.
Das Plasmid pGTC ist ein solcher Vektor, worin das Wildtypgen für das humane Protein C Zymogen von der GBMT Transkriptionseinheit gesteuert wird. Das Wildtypgen für Protein C kann leicht aus dem Vektor auf einem BclI Restriktionsfragment entfernt werden und alle erfindungsgemäßen Gene können in den Vektor auf einem BclI Restriktionsfragment inseriert werden. Der Verdau der Plasmid DNA mit BclI wird durch die Methylierung am Adenin in der Sequenz 5'-GATC-3' gehemmt. Daher wird das Plasmid pGTC aus E. coli Wirtszellen präpariert, denen eine Adeninmethylase fehlt, wie sie vom dam-Gen kodiert wird, dessen Produkt den Adeninrest in der Sequenz 5'-GATC-3' methyliert. E. coli K12 GM48 (NRRL B-15725) besitzt keine fünktionsfahige dam- Methylase und ist so ein geeigneter Wirt zur Präparation der Plasmid pGTC DNA als Ausgangsmaterial bei der Konstruktion von Derivatplasmiden.
E. coli K12 GM48 Zellen werden kultiviert und zur Transformation kompetent gemacht und das Plasmid pGTC wird zur Transformation der E. coli K12 GM48 Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 verwendet. Die transformierten Zellen werden auf Ampicillin enthaltendem L-Agar plattiert und wenn die Ampicillin-resistenten E. coli K12 GM48/pGTC Transformanden Kolonien gebildet haben, wird eine solche Kolonie zur Präparation der Plasmid pGTC DNA im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 verwendet. Etwa 1 nig Plasmid pGTC DNA wird erhalten und in etwa 1 ml TE Puffer suspendiert. Dieses Verfahren wird zur Herstellung der Plasmid DNA von pGT-h und pGT-d verwendet. Das Plasmid pGT-d enthält die GBMT Transkriptionseinheit ohne ein Gen an der BclI Schnittstelle, so daß jedes Gen leicht inseriert werden kann. Das Plasmid pGT-d enthält auch das dhfr-Gen der Maus, so daß jeder Transformand mittels des Methotrexatresistenzphänotyps selektiert oder amplifiziert werden kann. Das Plasmid pGT-h enthält die GBMT Transkriptionseinheit, eine BclI Schnittstelle zur leichten Insertion eines Gens von Interesse und das Hygromycinresistenz-verleihende Gen. E. coli K12 AG1 Stämme, die jeweils eines dieser Plasmide enthalten, wurden am 18. Januar 1990 beim NRRL hinterlegt. Die Stämme sind unter den Hinterlegungsnummern NRRL B-18591 (für E. coli K12 AG1/pGT-d), NRRL B-18592 (für E. coli K12 AG1/pGT-h) und NRRL B18593 (für E. coli K12 AG1/pGTC) erhältlich. Restriktions- und Funktionskarten dieser Plasmide sind in den Zeichnungen gezeigt.
Etwa 10 µl der aus GM48 Zellen präparierten pLPC-Q097 DNA werden mit 20 µl 10fach BclI Restriktionspuffer (100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1,5 M KCl, 100 mM MgCl&sub2; und 10 µl DTT), 20 µl 1 mg/ml RSA, 5 µl Restriktionsenzym BclI ( 50 Einheiten, nach der Definition von Bethesda Research Laboratories (BRL), wovon alle hierin verwendeten Restriktionsenzyme erhalten werden) und 145 µl Wasser gemischt und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die hierin beschriebenen Restriktionsenzymreaktionen werden routinemäßig durch Phenol und Chloroformextraktionen beendet, wonach eine Fällung der DNA, ein Ethanolwaschschritt und die Resuspendierung der DNA in TE Puffer erfolgt. Die verdaute DNA wird dann auf einem präparativen 1 % Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und das etwa 1400 Basenpaar lange Restriktionsfragment, das das mutierte Gen enthält, wird mittels eines BioRad Prep A-Gene Kits gemäß Angaben des Herstellers gereinigt.
Das Plasmid pGT-h wird dann aus E. coli K12 AG1/pGTC (NRRL B-18592) im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 1 isoliert und in GM48 vermehrt und gemäß der Beschreibung von Beispiel 2 isoliert. Die Plasmid pGT-h DNA wird dann mit dem Restriktionsenzym BclI verdaut, wie dies oben beschrieben ist und dann wird das große Vektorfragment isoliert und gereinigt. Dieses Vektorfragment wird mit TE (pH 8,0) auf ein Volumen von 90 µl gebracht und dann werden 10 µl (0,05 Einheiten) alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm zur Dephosphorylierung der Vektorenden zugegeben. Das Gemisch wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, dann werden 10 µl 500 mM EGTA zugegeben und die Reaktion wird bei 65ºC für 45 Minuten zur Inaktivierung des Enzyms inkubiert. Die Reaktion wird dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, gewaschen und in 20 µl Wasser resuspendiert.
Etwa 7 µl (10 ng) des BclI-verdauten Vektorrückgrads werden dann mit etwa 1 µl (100 ng) des 1400 Basenpaar langen BclI Restriktionsfragments von Plasmid pLPC-Q097, 1 µl 10fach Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 500 µg/ml RSA) und 1 µl T4 DNA Ligase gemischt. Die Ligation wird dann bei 16ºC für 12 bis 16 Stunden inkubiert. Die Ligationsreaktion kann zu Plasmiden führen, die das Gen für das mutierte Zymogen zur Transkription von der GBMT Transkriptionseinheit orientiert enthalten, oder zu Plasmiden, worin das Gen in der entgegengesetzten Richtung ligiert ist. Die Plasmide, die das Gen in der richtigen Orientierung zur Transkription enthalten, werden als Plasmid pGT-Q097-h bezeichnet.
Eingefrorene kompetente E. coli K12 AG1 Zellen erhält man von Stratagene, 3770 Tansey Road, San Diego, California 92121. Etwa 5 µl der Ligationsreaktion werden mit einem Aliquot von 100 µl kompetenten Zellen gemischt, dann wird das Zell-DNA Gemisch für eine Stunde auf Eis inkubiert, für 45 Sekunden bei 42ºC eineni Hitzeschock unterzogen und dann für etwa 2 Minuten auf Eis gekühlt. Das Zell-DNA Gemisch wird in 1 ml SOC Medium in Falcon 2059 Röhrchen verdünnt und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Aliquots mit 100 µl werden auf Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert, bis Kolonien erscheinen.
Die Kolonien werden einzeln kultiviert und die Plasmid DNA der einzelnen Kolonien wird durch Restriktionsanalyse untersucht. Die Plasmid DNA Isolierung wird in einem kleineren Maßstab gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt, wobei der CsCl Schritt weggelassen wird, bis die korrekten E. coli K12 AGl/pGT- Q097-h Transformanden identifiziert sind. Dann wird eine hochgereinigte Plasmidpräparation im großen Maßstab durchgeführt. Gemäß der Beschreibung der Beispiele 1 und 2 können alle Gene der mutierten Zymogene leicht in einen der GBMT Vektoren unter Bildung der Plasmide pGT-Q097-h, pGT-Q248-h, pGT-Q313-h und pGT-Q329- h kloniert werden.

Beispiel 3

Herstellung von Transformanden der Adenovirus-transformierten humanen embryonalen Nierenzellinie 293 und von Transformanden der Adenovirus-transformierten syrischen Hamsterzellinie AV12 mit Plasmid pGT-Q097-h

Die humane embryonale Nierenzellinie 293 ist von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1573 erhältlich. Die Adenovirus-transformierte syrische Hamsterzellinie AV12 ist ebenfalls von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 9595 erhältlich. Das unten beschriebene Transformationsverfahren bezieht sich auf 293-Zellen als Wirtszellinie, das Verfahren kann jedoch allgemein auf die meisten eukaryontischen Zellinien, einschließlich der AV12 Zellinie, und auf die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren angewendet werden.
Die 293-Zeilen werden von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 1573 in einer 25 mm² Kulturflasche erhalten, die eine geschlossene Schicht von etwa 5,5x 10&sup6; Zellen in Eagle's Minimum Essentia Medium (Gibco) mit 10 % hitzeinäktiviertem Pferdeserum enthält. Die Kulturflasche wird bei 37ºC inkubiert und das Medium wird zweimal wöchentlich gewechselt. Das Medium besteht aus DMEM (Gibco), das mit 10 %igem fetalem Kälberserum, 50 µg/ml Gentamicin und 10 µg/ml AquaMEPHYTON Phytonadion-Vitamin K&sub1; (Merck Sharp and Dome, Merck and Co., Inc., West Point, PA 19486) versetzt ist. Die Zellen werden durch Entfernen des Mediums, Waschen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco), Zugabe von 0,25 % Trypsin (0,2 g/l EDTA enthaltend) für 1-2 Minuten, Waschen mit frischem Medium, Ansaugen und Verteilen in neue Kulturflaschen in einem Subkultivierungsverhältnis von 1:5 oder 1:10 subkultiviert.
Einen Tag vor der Transformation werden 0,7 x 10&sup6; Zellen pro 100 mm Platte ausgebracht. Sterile, Ethanol-gefällte Plasmid DNA wird, in TE Puffer gelöst, zur Herstellung einer 2fach DNA-CaCl&sub2; Lösung verwendet, die 25 µg/ml der transformierenden Plasmid DNA und 250 mM CaCl&sub2; enthält. Es wird 2fach HBSS hergestellt, das 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Natriumphosphat enthält, wobei der pH auf 7,05-7,15 eingestellt wird. Die 2fach DNA-CaCl&sub2; Lösung wird tropfenweise zu einem gleichen Volumen sterilem 2fach HBSS gegeben. Eine sterile Einmilliliterplastikpipette mit einem Wattestopfen wird in das 2fach HBSS enthaltende Mischungsröhrchen eingebracht und Blasen werden durch Hineinblasen eingebracht während die DNA zugegeben wird. Das Calciumphosphat-DNA Präzipitat kann sich für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln bilden.
Das Präzipitat wird dann durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Plastikpipette gemischt und ein ml (pro Platte) Präzipitat wird direkt in 10 ml des Wachstumsmediums gegeben, das die Empfangerzellen bedeckt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wird das Medium durch frisches Medium ersetzt und die Zellen werden für weitere 72 Stunden vor Anlegen des Selektionsdrucks inkubiert. Für Plasmide, die keinen in eukaryontischen Zellen funktionsfähigen Marker enthalten, verwendet das Transformationsverfahren ein Gemisch von Plasmiden: Den erfindungsgemaßen Expressionsvektor, dem ein Selektionsmarker fehlt und den Expressionsvektor, der einen in eukaryontischen Zellen funktionsfähigen Selektionsmarker enthält. Eine Vielzahl an Vektoren sind zur Verwendung in solchen Cotransformationssystemen erhältlich und beinhalten die Plasmide pSV2-dhfr (ATCC 37146), pSV2- neo (ATCC 37149), pSV2-gpt (ATCC 37145) und pSV2-hyg (NRRL B18039). Das Plasmid pSV2-hyg verleiht eukaryontischen Wirtszellen Resistenz gegenüber Hygromycin B. Diese Cotransformationstechnik erlaubt die Selektion von Zellen, die das Plasmid mit dem Selektionsmarker enthalten. Diese Zellen werden weiter untersucht, um Zellen zu identifizieren, die beide transformierende Plasmide enthalten. Natürlich umfaßt die vorliegende Erfindung auch Expressionsvektoren, die einen Selektionsmarker für eukaryontische Zellen enthalten und daher kein Cotransformationsverfahren benötigen.
Für mit Plasmiden transfizierte Zellen, die das Hygromycinresistenz verleihende Gen enthalten, wi das Plasmid pGT-Q097-h, wird Hygromycin B zum Wachstumsmedium in einer Endkonzentration von etwa 200 µg/ml gegeben. Die Zellen werden dann bei 37ºC für 2-4 Wochen mit einem Mediumwechsel in 3 bis 4 Tagesintervallen inkubiert. Die entstehenden hygromycinresistenten Kolonien werden in einzelne Kulturflaschen zur Charakterisierung gegeben. Das Plasmid pSV2-neo verleiht gegenüber Neomycin (G418 wird ebenfalls anstelle von Neomycin verwendet) eine Resistenz und die Selektion von G418-resistenten Kolonien wird im wesentlichen gemaß dein Selektionsverfahren für hygromycinresistente Zellen durchgeführt, außer daß G418 in einer Endkonzentration von 300 µg/ml zugegeben wird.
Die Verwendung des Dihydrofolatreduktase (dhfr) Gens oder des Methotrexatresisitenz verleihenden Derivats des dhfr-Gens (dhfr-mtx) als Selektionsmarker zur Einführung eines Gens oder Plasmids in eine dhfr- defiziente Zellinie und die anschließende Verwendung von Methotrexat zur Vervielfältigung der Kopiezahl des Plasmids ist in der Literatur gut dokumentiert. 293-Zellen sind dhfr positiv, so daß 293-Transformanden, die Plasmide mit dem dhfr Gen enthalten, nicht allein auf der Grundlage des dhfr-positiven Phänotyps selektioniert werden, welcher die Fähigkeit zum Wachstum in Medien ist, denen Hypoxanthin und Thymin fehlen. Zellinien, denen ein funktionelles dhfr-Gen fehlt und die mit dhfr-enthaltenden Plasmiden transformiert werden, können auf der Grundlage des dhfr positiven Phänotyps selektioniert werden. Obwohl die Verwendung von dhfr als selektionierbarer und amplifizierbarer Marker in dhfr-bildenden Zellen nicht gut untersucht ist, würde der Beleg in der Literatur nahelegen, daß dhfr als Selektionsmarker und zur Genvervielfaltigung in dhfr-bildenden Zellen verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung ist nicht durch den auf den Expressionsvektoren verwendeten, Selektionsmarker beschränkt. Darüberhinaus können amplifizierbare Marker verwendet werden, wie Methallothioningene, Adenosindesaminasegene oder Vertreter der Familie der multigenen Resistenz, beispielhaft vom P- Glycoproteingen vertreten.
Die Transformation der 293- Zellinie mit den Plasmiden pGT-Q097-h, pGT-Q248-h, pGT-Q313-h und pGT-Q329-h ergibt mehrere Transformanden. Diese Transformanden werden wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert.

Beispiel 4

Selektion von Zellen., die Zymogenmutanten von humanem Protein C sekretieren

Die in Beispiel 3 erhaltenen hygromycinresistenten Transformanden werden auf 100 mm² Gewebekulturplatten in einer Dichte von einigen hundert Zellklonen pro Gewebekulturplatte gezogen. Das Medium wird dekantiert, und die Zellen werden zwei Mal mit 5 ml Teilen von Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco) gewaschen. Eine Lösung von sterilem 0,45 %igem Agar (Sigma Typ 4 Agarose, Katalognummer A3643, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) wird durch Mischen von 1 ml 1,8 %igem Agar (47ºC) mit 3 ml Dulbecco's Modified Eagle's (DME) Salzen (Gibco) (37ºC) hergestellt und 2 ml dieser 0,45 %igen Agarlösung werden über die Zellen geschichtet.
Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schuell, Inc., Keene, NH 03431) werden gekocht und dann 2 Stunden autoklaviert, um das Netzmittel zu entfernen, das für die Zellen toxisch ist. Die Filter werden dann auf die Agarschicht gelegt und nachdem Luftblasen entfernt worden sind, werden die Platten bei 37ºC für 1-3 Stunden inkubiert. Die Filter, die vorher zur Erkennung der ursprünglichen Orientierung auf der Platte markiert wurden, um so die spätere Identifizierung der Kolonien zu erleichtern, werden dann entfernt und in PBS (50 mM Tris-HCl pH = 7,2 und 150 mM NaCl) gelegt.
Um die Zellen während der Analyse der Filter lebensfähig zu halten, werden die Zellen mit 8 ml eines Gemisches überschichtet, das enthält 2 ml 1,8 %igen Agar (47ºC), 2 ml DME Salze (37ºC) und 4 ml DME Salze mit 20 % fetalem Rinderserum (37ºC). Die Zellen werden dann in einen 37ºC Inkubator gestellt.
Alle Waschschritte und Reaktionen werden auf den Filtern ausgeführt, während sich die Filter auf einer schüttelnden Plattform befinden. Die Filter werden zuerst durch eine Inkubation bei Raumtemperatur in 5 % Milch enthaltendem PBS geblockt. Die Filter werden dann viermal in PBS gewaschen (5 Minutenlwaschschritt). Ein 10 µg/ml in 2,5 %igem Rinderserumalbumin polyklonaler biotinylierter Ziege-anti-human-Protein C Antikörper wird auf den Filter gegeben (in ausreichender Menge um den Filter zu bedecken), welcher dann bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert wird.
Die Reinigung von Protein C zur anschließenden Herstellung eines Antikörpers gegen Protein C kann, wie bei Kisiel, 1979, J. Clin. Invest. 64:761 beschrieben, ausgeführt werden. Der polyklonale Antikörper kann durch das in Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry von E.A. Kabat beschriebene Verfahren, 1968 durch Hold, Rhinehart und Winston veröffentlicht, hergestellt werden. Ein monoklonaler Antikörper, der ebenfalls zur Verwendung im Test geeignet ist, kann, wie von Köhler und Milstein, 1975, Nature 256:495 beschrieben oder wie in US-A 4 696 895, EP-A 0 205 046, Laurell et al., 1985 Febs 191(1):75, Suzuki et al., 1985, J. Biochem. 97:127-138 und EP-A 0 138 222 beschrieben, hergestellt werden. Das Avidin D und die biotinylierte Meerrettichperoxidase (HRP), die im Test verwendet werden, werden in einem Vectastain Kit (Vector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010) bezogen. Das Biotin wird ebenfalls von den Vector Laboratories, Inc. bezogen.
Die Filter werden viermal mit PBS bei 4ºC gewaschen. Dann werden Avidin D und die biotinylierte Meerettichperoxidase vorbereitet und zugegeben, wie durch die Vorschriften des Herstellers im Vectastain (Vector Laboratories) Kit angegeben. Die Filter werden mit dem HRP-konjugiertem Avidin D für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert (längere Inkubationszeit, das heißt über Nacht, kann bei kleinen Mengen an sekretiertem Protein verwendet werden), und dann werden die Filter vier Mal mit PBS bei 4ºC gewaschen.
Um die Indikatorfarbe auf den Filtern zu entwickeln, werden etwa 30 mg Reagenz zur HRP- Farbentwicklung (4-Chlor-1-naphthol, Sigma) in eiskaltem 100 %igem Methanol gelöst, zu 50 ml PBS und 30 µl 30 %igem H&sub2;O&sub2; gegeben. Dieses Gemisch wird zu den Nitrozellulosefiltern gegeben, die bei Raumtemperatur inkubiert werden, bis die Farbe sich entwickelt. Kolonien, die das meiste humane Protein C Zymogen sekretieren, werden auf den Filtern nicht nur durch das früheste Auftreten der Farbe, sondern auch durch dunklere Flecken auf dem Filter sichtbar.
Nachdem die Filter entwickelt wurden, werden die Filter erneut mit den ursprünglichen Platten verglichen, um festzustellen, welche Kolonien zu den Flecken auf dem Filter gehören. Die Kolonien, die das meiste erfindungsgemäße humane Protein C Zymogen sekretieren, werden dann ausgewählt und zur Herstellung des Zymogens verwendet.
Der Fachmann erkennt, daß der obige Test nur das Identifizierungsverfahren der stark sekretierenden Zellinien verdeutlicht. Eine Vielzahl an Testverfahren kann erfolgreich im Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann eine zweifache Antikörperreaktion verwendet werden, in der der biotinylierte Ziegen-anti-Protein C Antikörper durch einen Ziege-anti-Protein C Antikörper (Ig G) und einen biotinylierten anti-Ziege IgG Antikörper ersetzt wird.
Die Zymogenmutanten können aus den Zellkulturen gereinigt werden. Der Überstand wird von den Zellen entfernt, die das rekombinante Produkt exprimieren und auf einer Pharmacia Fastflow-Q Säule gereinigt. Etwa 1 ml Harz wird mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA und 4 mM Benzunidin äquilibriert. Der Kulturüberstand wird durch die Zugabe von Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA und 4 mM Benzamidin auf pH 7,4 gebracht. Die Uberstand wird in einer Säule auf das Harz aufgetragen und mit drei Säulenvolumina Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA gefolgt von 3 Säulenvolumina 20 mM Tris (HCl), 0,15 M NaCl und 4 mM Benzamidin gewaschen. Das rekombinante Produkt wird von der Säule mit einem Elutionspuffer eluiert, der 10 mM CaCl&sub2; in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl und 5 mM Benzamidin enthält.
Die spezifische Aktivität des Produkts wird gemäß dem Verfahren von Grinnell at al., (1987), Biotechnology 5: 1189-1192 folgendermaßen bestimmt: Das konzentrierte und dialysierte Produkt aus dem Säuleneluat wird zuerst mit einem immobilisierten Thrombin-Thrombomodulin-Komplex aktiviert, dann wird die amidolytische Aktivität des Produkts durch die Hydrolyse eines Tripeptidsubstrats S-2366 (erhältlich von Helena Labs) gemessen. Die gerinnungshemmende Aktivität des Produkts wird durch die Verlängerung einer aktivierten partiellen Thromboplastinzeit mittels Reagentien von Helena bestimmt.

Claims

1. Rekombinante DNA Verbindung, die eine für ein Protein kodierende Sequenz umfaßt, wobei das Protein vom Aminoterminus bis zum Carboxyterminus die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

worin R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub2; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub3; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN und R&sub4; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, mit der Maßgabe, daß R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht alle für ASN stehen.

2. Rekombinanter DNA Expressionsvektor, der die DNA Verbindung nach Anspruch 1 enthält.

3. Vektor nach Anspruch 2, worin R&sub1; für GLN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für ASN steht.

4. Vektor nach Anspruch 3, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Plasmid pLPC-Q097 (NRRL B- 18608) und Plasmid pGT-Q097-h, erhältlich durch Ligation des etwa 1400 bp BclI Fragments von pLPC-Q097 in das mit BclI verdaute pGT-h (NRRL B-18592).

5. Vektor nach Anspruch 2, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für GLN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für ASN steht.

6. Vektor nach Anspruch 5, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Plasmid pLPC-Q248 (NRRL B- 18609) und Plasmid pGT-Q248-h, erhältlich durch Ligation des BclI Fragments von pLPC-Q248 in das mit BclI verdaute pGT-h (NRRL B-18592).

7. Vektor nach Anspruch 2, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für GLN steht und R&sub4; für ASN steht.

8. Vektor nach Anspruch 7, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Plasmid pLPC-Q313 (NRRL B- 18610) und Plasmid pGT-Q313-h, erhältlich durch Ligation des BclI Fragments von pLPC-Q313 in das mit BclI verdaute pGT-h (NRRL B-18592).

9. Vektor nach Anspruch 2, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für GLN steht.

10. Vektor nach Anspruch 9, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Plasmid pLPC-Q329 (NRRL B- 18611) und Plasmid pGT-Q329-h, erhältlich durch Ligation des BclI Fragments von pLPC-Q329 in das mit BclI verdaute pGT-h (NRRL B-18592).

11. Eukryontische Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 2 transformiert ist.

12. Eukaryontische Wirtszelle nach Anspruch 11, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus 293/pLPC- Q097, 293/pLPC-Q248, 293/pLPC-Q313, 293/pLPC-Q329, 293/pGT-Q097-h, 293/pGT-Q248-h, 293/pGT- Q313-h und 293/pGT-Q329-h, wobei diese 293 Zellinie die humane embryonale Nierenzellinie 293 (ATCC CRL 1573) ist und diese Plasmide wie oben definiert sind.

13. Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer Zymogenform von humanem Protein C nach einer Sekretion aus einer eukaryontischen Wirtszelle, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

(A) Transformation einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA Vektor, wobei der Vektor umfaßt

(i) eine DNA Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuresequenz vom Aminoterminus zum Carboxyterminus folgende Aminosäuresequenz umfaßt

worin R&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub2; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, R&sub3; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN und R&sub4; aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus ASN und GLN, mit der Maßgabe, daß R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht alle für ASN stehen, und

(ii) einen Promotor, der zur Expressionssteuerung dieser DNA Sequenz positioniert ist

(B) Kultivierung dieser in Schritt (A) transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression dieser DNA Sequenz geeignet sind, und

(C) Gewinnung dieses Protein C Zymogens aus dieser Kultur.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die in Schritt (B) kultivierte Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus 293/pLPC-Q097, 293/pLPC-Q248, 293/pLPC-Q313, 293/pLPC-Q329, 293/pGT-Q097-h, 293/pGT- Q248-h, 293/pGT-Q313-h und 293/pGT-Q329-h Wirtszellen, wobei diese Wirtszellen wie oben definiert sind.

15. Zymogenform von humanem Protein C, worin die Aminosäuresequenz umfaßt

16. Zymogenform von humanem Protein C nach Anspruch 15, worin R&sub1; für GLN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für ASN steht.

17. Zymogenform von humanem Protein C nach Anspruch 15, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für GLN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für ASN steht.

18. Zymogenform von humanem Protein C nach Anspruch 15, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für GLN steht und R&sub4; für ASN steht.

19. Zymogenform von humanem Protein C nach Anspruch 15, worin R&sub1; für ASN steht, R&sub2; für ASN steht, R&sub3; für ASN steht und R&sub4; für GLN steht.