DE69004964T2 - Zellenzuchtverfahren für die produktion von aktiviertem protein-c. - Google Patents
Zellenzuchtverfahren für die produktion von aktiviertem protein-c.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Plasmaproteine und Verfahren zur Produktion dieser Proteine und spezieller Zellkulturverfahren zur Produktion von Proteinen mit im wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C.
- Protein C ist ein Zymogen, oder Vorläufer, einer Serin-Protease, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Blutgerinnung und bei der Erzeugung fibrinolytischer Aktivität in vivo spielt. Es wird in der Leber als ein einzelkettiges Polypeptid synthetisiert, das beträchtliche Weiterverarbeitung durchläuft, um zu einem Zwei-Ketten-Molekül zu führen, das eine schwere (Mr = 40.000) und eine leichte (Mr = 21.000) Kette umfaßt, die von einer Disulfidbindung zusammengehalten werden. Die zirkulierende 2-Ketten-Zwischenstufe wird zur biologisch aktiven Form des Moleküls, bekannt als "aktiviertes Protein C" (APC), durch die Thrombin-mediatisierte Abspaltung eines 12 Reste langen Peptids (auch bekannt als das Aktivierungspeptid) vom Amino-Terminus der schweren Kette umgewandelt. Die Abspaltungsreaktion wird in vivo durch Thrombomodulin, einem Endothelialzell-Cofaktor, verstärkt (Esmon und Owen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2249-2252, 1981).
- Protein C ist ein Glykoprotein, das ungefähr neun Reste Gamma- Carboxyglutaminsäure (Gla) und ein Äquivalent Beta-Hydroxyasparaginsäure enthält, die durch post-translationale Modifikationen von Glutaminsäure- bzw. Asparaginsäureresten gebildet werden. Die post-translationale Bildung von spezifischen Gamma-Carboxyglutaminsäureresten in Protein C erfordert Vitamin K. Diese unüblichen Aminosäurereste binden Calcium-Ionen, und man glaubt, daß sie für die Wechselwirkung von Protein C mit Phospholipid verantwortlich sind, die für die biologische Aktivität von Protein C erforderlich ist.
- Im Gegensatz zur gerinnungsfördernden Wirkung anderer Vitamin K-abhängiger Plasmaproteine, wie etwa Faktor VII, Faktor IX und Faktor X, wirkt aktiviertes Protein C als ein Regulator des Gerinnungsprozesses über die Inaktivierung von Faktor Va und Faktor VIIIa durch begrenzte Proteolyse. Die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa durch APC ist abhängig vom Vorhandensein von sauren Phospholipiden und Calcium-Ionen. Es ist berichtet worden, daß Protein S diese Aktivität durch Beschleunigung der APC-katalysierten Proteolyse von Faktor Va reguliert (Walker, J. Biol. Chem. 255:5521-5524, 1980).
- Protein C ist auch in Verbindung gebracht worden mit der Wirkung von Gewebe-Plasminogenaktivator (Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42, 1983). Infusion von Rinder-APC in Hunde führt zu erhöhter Plasminogenaktivator-Aktivität (Comp und Esmon, J. Clin. Invest. 68:1221-1228, 1981). Andere Studien (Sakata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1121- 1125, 1985) haben gezeigt, daß die Zugabe von APC zu kultivierten Endothelialzellen zu einem schnellen, dosisabhängigen Anstieg in der fibrinolytischen Aktivität in den konditionierten Medien führt, was Anstiege in der Aktivität von sowohl Urokinase-verwandten als auch Gewebe- Plasminogenaktivatoren widerspiegelt. APC-Behandlung führt auch zu einer dosisabhängigen Abnahme in der Anti- Aktivatoraktivität.
- Experimenteller Nachweis zeigt, daß aktiviertes Protein C bei der Behandlung von Thrombose klinisch nützlich ist. Die Verwendung von APC umgeht die Notwendigkeit der in-vivo-Aktivierung von Protein C, wodurch ein schneller wirkendes therapeutisches Mittel bereitgestellt wird.
- Zusätzlich hat es sich gezeigt, daß exogenes Protein C die koagulopathischen und lethalen Wirkungen von gramnegativer Septikämie verhindert (Taylor et al., J. Clin. Invest. 79:918- 925, 1987). Aus Studien mit Pavianen gewonnene Daten legen nahe, daß aktiviertes Protein C eine natürliche Rolle beim Schutz gegen Septikämie spielt.
- Protein C kann aus Gerinnungsfaktorkonzentraten (Marlar et al., Blood 59:1067-1072, 1982) oder aus Plasma (Kisiel, J. Clin. Invest. 64:761-769, 1979) gereinigt und in vitro aktiviert werden, aber dies ist ein komplexes und teures Verfahren, und das resultierende Produkt kann mit solchen infektiösen Agenzien, wie Hepatitis-Virus, Cytomegalo-Virus oder menschlichem Immundefekt-Virus (HIV) kontaminiert sein. Vor kürzerer Zeit sind Verfahren zur Produktion von aktiviertem Protein C durch rekombinante DNA-Technologie beschrieben worden. Foster et al. (veröffentliche europäische Patentanmeldung EP 215,548) offenbaren die Produktion von aktiviertem Protein C durch die Verwendung kultivierter Säugetierzellen, die mit einer Protein C-DNA-Sequenz transfiziert sind, aus der die Kodierungsseguenz für das Aktivierungspeptid deletiert worden ist. Foster et al. (EP 266,190) offenbaren die Produktion von rekombinantem aktivierten Protein C unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die einen APC-Vorläufer mit einer modifizierten Schnittstelle kodiert. Außerdem offenbaren Bang et al. (EP 319,312) ein Verfahren zur Produktion von aktiviertem menschlichen Protein C durch Kultivieren von Säugetierzellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der Protein C kodiert, in einem Kulturmedium, das 10 % Serum enthält.
- Trotz der Fortschritte bei der Produktion von aktiviertem Protein C, die durch die Verwendung der Gentechnologie möglich gemacht worden sind, bleiben die Ausbeuten niedrig und das Protein unterliegt Abbau und/oder Inaktivierung während des Produktionsverfahrens. Somit besteht ein Bedürfnis in der Technik nach Verfahren, die die Produktion von intaktem, biologisch aktivem aktivierten Protein C bei höheren Gehalten ermöglicht.
- Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren zur Produktion von aktiviertem Protein C. Die Verfahren umfassen allgemein Kultivieren von Säugetierzellen, die stabil transfiziert sind mit einem Expressionsvektor, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, der operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die aktiviertes Protein C kodiert, in einem Kulturmedium, wobei besagtes Medium nicht mehr als 0,1 % Serum enthält, und Isolieren des von den Zellen produzierten aktivierten Proteins C. In einer Ausführungsform ist das Medium im wesentlichen serumfrei.
- In einem Aspekt kodiert die DNA-Sequenz außerdem für die Aminosäuresequenz R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-X-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8; zwischen den leichten und schweren Ketten des aktivierten Proteins C, wobei jedes von R&sub1;-R&sub8; Lysin oder Arginin ist und X eine Peptidbindung oder ein spacer-Peptid mit 1-12 Aminosäuren ist.
- In einem anderen Aspekt kodiert die DNA-Sequenz außerdem für die Aminosäuresequenz (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;, wobei jedes von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Lys oder Arg ist und n = 0, 1, 2 oder 3 ist, zwischen den leichten und schweren Ketten des aktivierten Proteins C.
- In noch einem anderen Aspekt sind die Zellen außerdem transfiziert, um das Saccharomyces cerevisiae-KEX2-Gen zu exprimieren.
- Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.
- Figur 1 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der vollständigen cDNA von menschlichem Protein C und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Protein C. Pfeile zeigen Schnittstellen für die Entfernung des Verbindungsdipeptids und Aktivierungspeptids.
- Figur 2 veranschaulicht den Protein C-Expressionsvektor p594. Verwendete Symbole sind 0-1, der Adenovirus 5-Replikationsursprung; E, der SV40-Verstärker; MLP, der Adenovirus-2-majorlate-Promotor; L1-3, der Adenovirus-2-tripartite-Leader; 5', 5'-Spleißstelle; 3', 3'-Spleißstelle; p(A), Polyadenylierungssignal.
- Figur 3 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmiden, die das S. cerevisiae-KEX2-Gen enthalten.
- Figur 4 veranschaulicht Gelelektrophorese von rekombinantem aktivierten Protein C aus Zellen, die in Gegenwart (Spuren 5- 7) oder Abwesenheit (Spuren 9-11) von Serum gezüchtet wurden. Spur 2, Molekulargewichts-Marker.
- Figur 5 veranschaulicht die Plasmide pZMB-1 und pZMB-2. Verwendete Symbole schließen ein neo, das Neomycinresistenz- Gen; SV40 term, SV40-Terminator; SV40 prom; SV40-Promotor. Andere Symbole werden verwendet wie in Figur 2.
- Figur 6 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pPC1645/229R. DHFR bedeutet das Dihydrofolat-Reduktase-Gen; MT-1 bedeutet den Mäuse-Metallothionein-1-Promotor. Andere Symbole werden verwendet wie in den Figuren 2 und 5.
- Vor der Darlegung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die hier im weiteren verwendet werden sollen, anzugeben.
- Biologische Aktivität: Eine Funktion oder ein Satz von Funktionen, die von einem Molekül in einem biologischen Zusammenhang (d.h. in einem Organismus oder in einer in-vitro- Reproduktion desselben) ausgeführt wird (werden). Biologische Aktivitäten von Proteinen können unterteilt werden in katalytische und Effektor-Aktivitäten. Katalytische Aktivitäten von Vitamin K-abhängigen Plasmaproteinen umfassen allgemein spezifische proteolytische Spaltungen anderer Plasmaproteine, was zu Aktivierung oder Desaktivierung der Substrate führt. Effektor-Aktivitäten schließen spezifische Bindung der biologisch aktiven Moleküle an Calcium, Phospholipide oder andere kleine Moleküle, an Makromoleküle, wie etwa Proteine, oder an Zellen ein. Effektor-Aktivität verstärkt oft, oder ist wesentlich für, katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen.
- Für aktiviertes Protein C ist biologische Aktivität gekennzeichnet seine gerinnungshemmenden Eigenschaften. Aktiviertes Protein C inaktiviert Faktor Va und Faktor VIIIa in Gegenwart von sauren Phospholipiden und Calcium. Protein S scheint bei der Regulierung dieser Funktion involviert zu sein (Walker, aaO). Die katalytischen Aktivitäten von Protein C liegen in der schweren Kette.
- Expressionsvektor: Ein DNA-Molekül, das unter anderem eine DNA-Sequenz, die ein Protein von Interesse (oder eine Insertionsstelle für solch eine Sequenz) kodiert, zusammen mit einem Promotor und anderen Sequenzen, die die Expression des Proteins erleichtern, enthält. Expressionsvektoren enthalten außerdem genetische Information, die für ihre Replikation in einer Wirtszelle sorgt, entweder durch autonome Replikation oder durch Integration in das Wirtsgenom. Beispiele für Expressionsvektoren, die üblicherweise für rekombinante DNA verwendet werden, sind Plasmide und bestimmte Viren, obgleich sie Elemente von beiden enthalten können. Sie können auch einen selektionierbaren Marker einschließen.
- Stabil transfiziert: Der Zustand, in dem exogene DNA in Zellen eingeführt worden ist und die Zellen die exogene DNA exprimieren und sie auf ihre Nachkommenschaft übertragen können. Stabile Transfektion wird im allgemeinen durch Transfizieren von Zellen mit einem selektionierbaren Marker (z.B. einem Medikamentenresistenz-Gen) und Ausüben von Selektionsdruck erreicht. Eine Population stabil transfizierter Zellen ist klonal identisch, da sie von einer einzelnen transfizierten Vorläuferzelle abgeleitet ist. Die exogene DNA kann in das Chromosom der stabil transfizierten Zelle integriert sein oder kann extrachromosomal gehalten werden. Im Gegensatz dazu sind Zellen, die exogene DNA transient exprimieren, ein Mischpopulationen, die Zellen einschließt, die die DNA nicht aufgenommen haben, und Zellen, die die DNA nicht auf ihre Nachkommenschaft übertragen können.
- Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Produktion eines Proteins zur Verfügung, das gamma-carboxyliert ist und biologische Aktivität von aktiviertem Protein C besitzt, durch die Verwendung von kultivierten Säugetierzellen, die transfiziert sind, um das Protein zu exprimieren. Die Zellen werden mit einem Expressionsvektor transfiziert, der einen Promotor umfaßt, der operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die aktiviertes Protein C kodiert. Die transfizierten Zellen werden in einem Medium kultiviert, das so hergestellt worden ist, daß es eine minimale Serummenge enthält oder im wesentlichen serumfrei ist, und aktiviertes Protein C wird aus dem Medium isoliert.
- Klonierte DNA-Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren, sind beschrieben worden (Foster und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4766-4770, 1984; Foster et al., Proc. Natl. Acad. USA 82: 4673-4677, 1985 und Bang et al., U.S. Pat. No. 4,775,624). Eine cDNA, die Rinder-Protein C kodiert, ist von Long et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5653-5656, 1984, beschrieben worden. Im allgemeinen sind cDNA-Sequenzen zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung bevorzugt, weil ihnen Zwischensequenzen fehlen, die zu abweichender RNA- Verarbeitung und verringerten Expressionsniveaus führen können. Komplementäre DNAs, die Protein C kodieren, können aus Banken erhalten werden, die gemäß standardmäßigen Laboratoriumsverfahrens aus Leberzellen hergestellt worden sind. Man wird jedoch verstehen, daß geeignete DNA-Sequenzen auch aus Genom-Klonen erhalten werden können oder de novo gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden können. Wenn partielle Klone erhalten werden, ist es notwendig, sie im richtigen Leserahmen zusammenzufügen, um einen Klon in voller Länge zu produzieren, unter Verwendung solcher Techniken, wie Endonukleasespaltung, Ligation und loop-out-Mutagenese.
- Um aktiviertes Protein C zu produzieren, wird die klonierte DNA-Sequenz modifiziert, um denjenigen Teil, der das Aktivierungspeptid kodiert, zu deletieren oder zu ersetzen. Die resultierende DNA-Sequenz wird ein Präpropeptid, die leichte Kette von Protein C, eine Verarbeitungsstelle und die schwere Kette von aktiviertem Protein C kodieren. Die DNA-Sequenz kann weiter ein spacer-Peptid zwischen den leichten und schweren Ketten kodieren. In einer Ausführungsform wird die resultierende Sequenz die leichten und die schweren Ketten von Protein C, die verknüpft sind durch die Sequenz Lys-Arg kodieren. Wie hierin verwendet, versteht man unter der leichten Kette von aktiviertem Protein C so verstanden, daß sie Aminosäuren 1-149 der in Figur 1 offenbarten Sequenz umfaßt oder im wesentlichen dazu homologe Sequenzen oder solche Sequenzen mit C-terminalen Extensionen. Die schwere Kette von aktiviertem Protein C wird so verstanden, daß sie nicht das Aktivierungspeptid enthält (d.h., daß sie bei Aminosäure Nr. 170, Leucin, beginnt, wie in Figur 1 dargestellt). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz außerdem so modifiziert, daß sie eine neue Schnittstelle zwischen den leichten und schweren Ketten einschließt. Die Schnittstelle kann in der Form der Aminosäuresequenz (R&sub1;)n-R&sub2;- R&sub3;-R&sub4; vorliegen, wobei R&sub1; bis R&sub4; Lysin (Lys) oder Arginin (Arg) sind und n eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist. Besonders bevorzugte Sequenzen schließen Arg-Arg-Lys-Arg, Lys-Arg-Lys- Arg und Lys-Lys-Arg ein. Alternativ kann die Schnittstelle die Form R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-x-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8; besitzen, wobei jedes von R&sub1;-R&sub8; Lys oder Arg ist und X eine Peptidbindung oder ein spacer-Peptid mit 1 bis 12 Aminosäuren ist. Spacer-Peptide, die in dieser Hinsicht brauchbar sind, schließen die Aminosäuresequenzen Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro, Asp-Thr-Glu-Asp- Gln-Glu-Asp-Gln, Asp-Thr-Asp-Gln, Asp-Gln, Asn-Ile-Leu-Asn und das Aktivierungspeptid nativen Proteins C mit der Aminosäuresequenz Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro- Arg ein. Eine dritte Gruppe von Schnittstellenmodifikationen schließen den Ersatz von Aminosäurerest 154 (His) von nativem Protein C durch einen Aminosäurerest eine der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lys, Arg und Leu besteht, um eine Verarbeitungssequenz der allgemeinen Formel Y-Z-R&sub1;-R&sub2; zu ergeben, wobei Y Lys, Arg oder Leu ist; R&sub1; und R&sub2; Lys oder Arg sind; und Z eine andere Aminosäure als Lys oder Arg ist, vorzugsweise Leu.
- Modifikation der DNA-Sequenz kann durch ortsspezifische Mutagenese erhalten werden. Techniken für ortsspezifische Mutagenese sind in der Technik gut bekannt und von z.B. Zoller und Smith (DNA 3:479-488, 1984) beschrieben. Alternativ kann die Wildtyp-Protein-C-Sequenz enzymatisch gespalten werden, um die native Aktivierungspeptidsequenz zu entfernen, und die Sequenzen, die die schweren und leichten Ketten kodieren, mit einem synthetisierten Aktivierungspeptid verknüpft werden, das eine der oben beschriebenen Schnittstellen enthält.
- Wie die Fachleute auf diesem Gebiet verstehen werden, können die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um Varianten und Analoge von aktiviertem Protein C herzustellen. Varianten und Analoge von aktiviertem Protein C schließen diejenigen ein, die geringfügige Aminosäureänderungen enthalten, wie etwa diejenigen aufgrund von genetischem Polymorphismus, und diejenigen, in denen Aminosäuren hinzugefügt, deletiert oder ersetzt worden sind, ohne die biologische Aktivität des Proteins im wesentlichen zu verändern. Analoge zu aktiviertem Protein C schließen außerdem Proteine ein, bei denen der aminoterminale Bereich von Protein C (Gla-Domäne) durch eine Gla-Domäne eines der Vitamin-K- abhängigen Plasmaproteine Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin oder Protein S ersetzt ist.
- Wie oben angemerkt, werden DNA-Sequenzen zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung ein Präpropeptid am Aminoterminus des Vorläufers zu aktiviertem Protein C kodieren, um richtige post-translationale Verarbeitung (z.B. Gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten) und Sekretion aus der Wirtszelle zu erhalten. Das Präpropeptid kann dasjenige von Protein C oder von einem anderen Vitamin-K- abhängigen Plasmaprotein sein, wie etwa Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin oder Protein S.
- Die DNA-Sequenz, die aktiviertes Protein C kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert, der seinerseits verwendet wird, um kultivierte Säugetierzellen zu transfizieren. Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden einen Promotor umfassen, der die Transkription eines klonierten Gens oder von cDNA steuern kann. Bevorzugte Promotoren schließen virale Promotoren und zelluläre Promotoren ein. Virale Promotoren schließen den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) und den CMV-Promotor (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) ein. Ein besonders bevorzugter viraler Promotor ist der major-late-Promotor aus Adenovirus 2 (Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-13199, 1982). Zelluläre Promotoren schließen den Mäuse-Kappa-Gen-Promotor (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) und den Mäuse-VH-Promotor (Loh et al., Cell 33:85-93, 1983) ein. Ein besonders bevorzugter zellulärer Promotor ist der Metallothionein-I-Promotor (Palmiter et al., Science 222:809- 814, 1983). Expressionsvektoren können auch einen Satz von RNA-Spleißstellen enthalten, die flußabwärts vom Promotor und flußaufwärts von der Insertionsstelle für die Sequenz für aktiviertes Protein C oder innerhalb der Sequenz für aktiviertes Protein C selbst angeordnet sind. Bevorzugte RNA- Spleißstellen können aus Adenovirus- und/oder Immunglobulin- Genen erhalten werden. Ebenfalls enthalten in den Expressionsvektoren ist ein Polyadenylierungssignal, das flußabwärts der Insertionsstelle angeordnet ist. Besonders bevorzugte Polyadenylierungssignale schließen das early- oder late-Polyadenylierungssignal aus SV40 (Kaufman und Sharp aaO), das Polyadenylierungssignal aus der Adenovirus-5-Elb-Region oder den Terminator des Gens für menschliches Wachstumshormon (DeNoto et al. Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) ein. Die Expressionsvektoren können auch eine nicht-kodierende virale Leader-Sequenz einschließen, wie etwa den Adenovirus-2- tripartite-Leader, angeordnet zwischen dem Promotor und den RNA-Spleißstellen; und Verstärker- sequenzen, wie etwa den SV40-Verstärker und die Sequenzen, die die Adenovirus-VA-RNAs kodieren.
- Klonierte DNA-Sequenzen werden in kultivierte Säugetierzellen durch z.B. Calciumphosphat-mediatisierte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52:456-467, 1973) oder Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982) eingeführt. Um Zellen, die die exogene DNA exprimieren, zu identifizieren und auf diese zu selektionieren, wird im allgemeinen zusammen mit dem Gen oder der cDNA von Interesse ein Gen in die Zellen eingeführt, das einen selektionierbaren Phänotyp verleiht (ein selektionierbarer Marker). Bevorzugte selektionierbare Marker schließen jene ein, die Resistenz gegen Medikamente, wie etwa Neomycin, Hydromycin und Methotrexat, verleihen. Der selektionierbare Marker kann ein amplizierbarer selektionierbarer Marker sein. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektionierbarer Marker ist eine Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Sequenz. Ein besonders bevorzugter amplifizierbarer Marker ist die DHFRr-cDNA (Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495- 2499, 1983). Selektionierbare Marker sind im Überblick dargestellt von Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) und die Wahl von selektionierbaren Markern liegt klar innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmannes.
- Selektionierbare Marker können in die Zelle auf einem separaten Plasmid zur gleichen Zeit wie das Gen von Interesse eingeführt werden, oder sie können auf demselben Plasmid eingeführt werden. Wenn auf demselben Plasmid, können der selektionierbare Marker und das Gen von Interesse unter der Kontrolle verschiedener Promotoren oder desselben Promotors stehen, wobei die letztere Anordnung eine dicistronische Botschaft erzeugt. Konstrukte diesen Typs sind in der Technik bekannt (z.B. Levinson und Simonsen, U.S.-Patent 4,713,339). Es ist auch vorteilhaft, zusätzliche DNA, bekannt als "carrier-DNA", zur Mischung zuzusetzen, die in die Zellen eingeführt wird.
- Nachdem die Zellen die DNA aufgenommen haben, werden sie in einem geeigneten Wachstumsmedium typischerweise 1-2 Tage gezüchtet, um mit dem Exprimieren des Gens von Interesse zu beginnen. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "geeignetes Wachstumsmedium" ein Medium, das Nährstoffe und andere Bestandteile, die für das Wachstum von Zellen erforderlich sind, enthält. Medien schließen im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, essentielle Zucker, Vitamine, Salze, Phospholipide, Protein und Wachstumsfaktoren ein. Medikamentenselektion wird dann angewendet, um auf das Wachstum von Zellen zu selektionieren, die den selektionierbaren Marker in einer stabilen Art und Weise exprimieren. Für Zellen, die mit einem amplifizierbaren selektionierbaren Marker transfiziert worden sind, kann die Medikamentenkonzentration stufenweise erhöht werden, um auf eine erhöhte Kopienzahl der klonierten Sequenzen zu selektionieren, wodurch Expressionsniveaus erhöht werden. Klone von stabil transfizierten Zellen werden dann auf Expression von aktiviertem Protein C gescreent.
- Bevorzugte Säugetierzellinien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen die Zellinien COS-1 (ATCC CRL 1650), BMK und 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) ein. Eine bevorzugte BHK-Zellinie ist die tk&supmin;ts13-BHK-Zellinie (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982). Zusätzlich kann eine Anzahl anderer Zellinien innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Ratten-Hep-I-(ATCC CRL 1600), Ratten-Hep-II-(ATCC CRL 1548), TCMK-(ATCC CCL 139), menschliche Lungen-(ATCC CCL 75.1), menschliche Hepatom-(ATCC HTB-52), Hep-G2-(ATCC HB 8065), NCTC 1469-(ATCC CCL 9.1) und DUKX-Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).
- Verarbeitung von Vorläufern für aktiviertes Protein C durch Schneiden nach einem Lys-Arg-Dipeptid zwischen den leichten und schweren Ketten kann erhöht werden, indem das S. cerevisiae-KEX2-Gen in die Wirtszelle eingeführt wird. Das KEX2-Gen kodiert eine Endopeptidase, die nach einer zweibasigen Aminosäuresequenz spaltet (Fuller et al., in Leive, Hrg., Microbiology: 1986, 273-278, 1986). Eine kultivierte Säugetierzellinie, die mit diesem Gen stabil transfiziert ist, ist somit für das Exprimieren von aktiviertem Protein C brauchbar.
- In einer bevorzugten Ausführungsform werden Säugetierzellen, die stabil transfiziert worden sind, um aktiviertes Protein C zu exprimieren, über einen Zeitraum, vorzugsweise bis Konfluenz, in serumhaltigen Medien (z.B. Medien, die von etwa 1 % bis etwa 10 % Serum enthalten) gezüchtet, dann in Medium überführt, das so formuliert ist, daß es nicht mehr als 0,1 % Serum enthält. Die Erfinder haben entdeckt, daß Verringern oder Eliminieren von Serum aus den Medien die Ausbeute an aktiviertem Protein C aus stabil transfizierten Zellen erhöht. Eine Vielzahl von serumfreien Zellkulturmedien sind in der Technik bekannt (siehe z.B., Barnes und Sato, Cell 22: 649- 656, 1980; Barnes, Biotechniques 5: 534-542, 1987; und Kataloge der American Type Culture Collection, Rockville, MD.). Kulturmedien sind auch erhältlich von einer Anzahl kommerzieller Lieferanten. Ein besonders bevorzugtes Kulturmedium in dieser Hinsicht ist eine Mischung aus 50 % von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 50 % von Hams F12, enthaltend 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 50 mg/l Penicillin, 50 mg/l Streptomycin, 100 mg/l Neomycin, 5 mg/l Insulin, 3 ug/l Selen, 10 mg/l Fetuin, 20 mg/l Transferrin und 25 mM HEPES-Puffer pH 7,2 enthält. Das Transferrin kann durch Rinderserumalbumin (1 g/l) oder Fleischhydrolysat (z.B. Primatone RL , Sheffield Products, Norwich, NY; 2,5 g/l) ersetzt werden. Das Medium kann auch Serum enthalten, vorzugsweise fötales Rinderserum, mit bis zu 0,1 %. Es ist bevorzugt, daß das Kulturmedium auch Vitamin K enthält, um die Bildung von Gamma-Carboxyglutaminsäureresten zu erleichtern. Konzentrationen von Vitamin K im Bereich von 5 ng/ml bis 5 ug/ml sind ausreichend, wobei 1 ug/ml bevorzugt ist. Die Zellen werden in dem Medium mit minimalem (< /=0,1 %) Serum oder serumfreien Medium für bis zu etwa 7 Tage gehalten, wobei während dieser Zeit das Medium abgeerntet und das aktivierte Protein C isoliert wird. Die Zellen werden dann in Medien zurückgegeben, die einen hohen Serumgehalt enthalten, und man läßt sie das Wachstum wiederaufnehmen. Wie von den Fachleuten auf diesem Gebiet anerkannt werden wird, können die Zellen alternativ in serumfreien Medien ohne die Notwendigkeit anfänglichen oder anschließenden Wachstums in der Gegenwart von Serum gezüchtet werden.
- Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die allgemein in der Technik verwendet werden. In dieser Hinsicht ist es bevorzugt, die Zellen bei zwischen 36ºC und 40ºC unter Bedingungen zu kultivieren, die einen pH zwischen 6,8 und 8,0 halten, vorzugsweise etwa pH 7,2. Der pH kann durch die Verwendung einer Vielzahl von Puffersystemen, die in der Technik bekannt sind, gehalten werden. Ein bevorzugtes Puffersystem umfaßt das Kultivieren der Zellen in einem Bicarbonatpuffer in einem befeuchteten Inkubator, der CO&sub2; enthält, vorzugsweise etwa 5 % CO&sub2;.
- Aktiviertes Protein C, das gemäß der Erfindung hergestellt ist, kann durch Affinitätschromatographie auf einer Anti- Protein-C-Antikörpersäule gereinigt werden. Die Verwendung von Calcium-abhängigen monoklonalen Antikörpern, wie beschrieben von Wakabayashi et al. (J. Biol. Chem. 261:11097-11108, 1986), ist besonders bevorzugt. Zusätzliche Reinigung kann durch herkömmliche chemische Reinigungsmittel erreicht werden, wie etwa Hochleistungsflüssigkeitchromatographie (HPLC). Andere Reinigungsverfahren, einschließlich Bariumcitrat-Ausfällung, sind in der Technik bekannt und können auf die Reinigung von rekombinantem aktivierten Protein C angewendet werden.
- Das aktivierte Protein C, das gemäß der Erfindung hergestellt worden ist, kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen für örtliche oder intravenöse Anwendung verwendet werden, im allgemeinen in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Trägermittel oder Verdünnungsmittel. Bevorzugte Trägermittel und Verdünnungsmittel schließen physiologische Kochsalzlösung und steriles Wasser ein. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch Stabilisatoren und Adjuvantien enthalten. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können zum Gebrauch abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor Verabreichung mit einer sterilen wäßrigen Lösung kombiniert wird.
- Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht zum Zwecke der Einschränkung angeboten.
- Restriktionsendonukleasen und andere DNA-Modifikationsenzyme (z .B. T4-Polynukleotid-Kinase, Kalbs-Alkalinphosphatase, DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment), T4-Polynukleotid-Ligase) wurden erhalten von Bethesda Research Laboratories (BRL) und New England Biolabs und wurden verwendet, wie vom Hersteller vorgeschrieben, sofern nicht anders angegeben.
- Oligonukleotide wurden auf einem DNA-Synthesizer Applied Biosystems Model 380A synthetisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese auf denaturierenden Gelen gereinigt. E. coli-Zellen wurden transformiert, wie von Maniatis et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13- und pUC- Klonierungsvektoren und Wirtsstämme wurden erhalten von BRL.
- Eine cDNA-Kodierung für einen Teil von menschlichem Protein C wurde hergestellt, wie von Foster und Davie (aaO) beschrieben. Kurz gesagt wurde eine λgt11-cDNA-Bibliothek aus mRNA der menschlichen Leber mit herkömmlichen Methoden hergestellt. Klone wurden unter Verwendung eines mit ¹²&sup5;I markierten, affinitätsgereinigten Antikörpers zu menschlichem Protein C gescreent, und Phagen wurden hergestellt aus positiven Klonen mit der Plattenlysatmethode (Maniatis et al., aaO), gefolgt von Banding auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten. cDNA-Inserts wurden unter Verwendung von Eco RI entfernt und in Plasmid pUC9 subkloniert (Vieira und Messing, Gene 19:259-268, 1982). Restriktionsfragmente wurden in die Phagenvektoren M13mp10 und M13mp11 subkloniert (Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983) und mit der Didesoxymethode sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977). Ein Klon, der DNA enthielt, die einer bekannten Teilsequenz von menschlichem Protein C entsprach (Kisiel aaO, 1979) und Protein C beginnend an der Aminosäure 64 der leichten Kette und sich erstreckend über die schwere Kette und in die 3'-Nichtko- dierungsregion hinein kodierte, wurde ausgewählt. Dieser Klon wurde bezeichnet mit λHC1375. Ein zweiter cDNA-Klon, der für Protein C von Aminosäure 24 an kodierte, wurde ebenfalls identifiziert. Das Insert aus dem größeren Klon wurde in pUC9 subkloniert und das Plasmid wurde mit pHCλ6L bezeichnet. Dieser Klon kodiert einen Großteil von Protein C, einschließlich der Kodierungsregion der schweren Kette, des Terminationscodons und der 3'-Nichtkodierungsregion.
- Das cDNA-Insert aus λHC1375 wurde unter Verwendung von α-³²P- DNTPs nick-transliert und verwendet, um eine menschliche Genombibliothek in Phage λCharon 4A (Maniatis et al., Cell 15:687-702, 1978) unter Verwendung des Plaque-Hybridisierungsverfahrens von Benton und Davies (Science 196:181-182, 1977), wie modifiziert von Woo (Meth. Enzymol. 68:381-395, 1979), zu sondieren. Positive Klone wurden isoliert und plaque-gereinigt (Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4673-4677, 1985, hierin durch Bezugnahme miteinbezogen). Phagen-DNA, hergestellt aus positiven Klonen (Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984), wurde mit Eco RI oder Bgl II verdaut und die Genom- Inserts wurden gereinigt und in pUC9 subkloniert. Restriktionsfragmente der Genom-Inserts wurden in M13-Vektoren subkloniert und sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und die DNA-Sequenz des gesamten Gens zu bestimmen.
- Das cDNA-Insert von pHCλ6L wurden nick-transliert und verwendet, um die Phage-λCharon-4A-Bibliothek zu sondieren. Ein Genom-Klon wurde identifiziert, der an Sonden hybridisierte, die aus den 5'- und 3'-Enden der cDNA hergestellt waren. Dieser Phagen-Klon wurde mit Eco RI verdaut und ein 4,4 kb-Fragment, das dem 5'-Ende des Protein-C-Gens entspricht, wurden in pUC9 subkloniert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde mit pHCR4.4 bezeichnet. Vollständige DNA-Sequenzanalyse enthüllte, daß das Insert in pHCR4.4 zwei Exons mit 70 und 167 Basenpaaren einschloß, die von einem Intron mit 1263 bp getrennt wurden. Das erste Exon kodiert Aminosäuren -42 bis -19; das zweite kodiert die Aminosäuren -19 bis -37. Sequenzanalyse bestätigte die DNA- Sequenz des gesamten Protein-C-Gens.
- Ein Genom-Fragment, das ein Exon enthielt, das den Aminosäuren -42 bis -19 des Präpropeptids von Protein C entsprach, wurde isoliert, nick-transliert und als eine Sonde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu sondieren, die mit der Technik von Gubler und Hoffman (Gene 25:263-269, 1983) unter Verwendung von mRNA aus Hep G2-Zellen aufgebaut worden war. Diese Zelllinie wurde aus menschlichen Hepatocyten abgeleitet und von ihr war früher gezeigt worden, daß sie Protein C synthetisiert (Fair und Bahnak, Blood 64:194-204, 1984). Zehn positive Klone, die cDNA umfaßten, die in die Eco RI-Stelle von Phage λgt11 inseriert war, wurden isoliert und mit einer Oligonukleotidsonde gescreent, die der 5'-Nichtkodierungs- region des Protein-C-Gens entsprach. Ein Klon war auch positiv mit dieser Sonde und seine gesamte Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die cDNA enthielt 70 bp 5'-nicht-translierte Sequenz, die gesamte Kodierungssequenz für menschliches Präproprotein C und die gesamte 3'-Nichtkodierungsregion, entsprechend der zweiten Polyadenylierungsstelle. Die cDNA- Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Figur 1 dargestellt.
- Die cDNA-Sequenz, die Protein C kodiert, wurde durch ortsspezifische Mutagenese verändert, um den Teil zu deletieren, der das Aktivierungspeptid kodiert. Die Aminosäuresequenz der Verknüpfung zwischen den leichten und schweren Ketten des kodierten APC-Vorläufers, bezeichnet mit 829, ist in Tabelle 1 dargestellt. Die veränderte Sequenz wurde dann in tk&supmin;ts13-BHK- und 239-Zellen transfiziert, und stabil transfizierte Zellen wurden selektioniert. Aktives Protein C wurde in Kulturmedienproben aus beiden Zellinien nachgewiesen. Tabelle 1 Aminosäuresequenzen von Schnittstellen-Mutanten
- TEXT FEHLT
- Die Protein-C-cDNA wurde als ein Eco RI-Fragment isoliert und in den Vektor pDX kloniert, wie in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP 266,190 offenbart. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse gescreent, um diejenigen zu identifizieren, die das Protein-C- Insert in der richtigen Orientierung im Hinblick auf die Promotor-Elemente besitzen, und Plasmid-DNA (bezeichnet mit pDX/PC) wurde aus einem richtigen Klon hergestellt. Weil das cDNA-Insert in pDX/PC ein ATG-Codon in der 5'-Nichtkodierungsregion enthielt (siehe Figur 1), wurde oligonukleotidgerichtete Deletionsmutagenese auf der cDNA durchgeführt, um die drei Basenpaare zu entfernen. Der resultierende Vektor, bezeichnet mit p594, enthält die Protein-C-cDNA operabel verknüpft mit dem Adenovirus-2-major-late-Promotor (Figur 2). Dieser Vektor enthält auch den Adenovirus-5-Replikationsursprung (0-1 Karteneinheitensequenz) , den SV40-Verstärker, den Adenovirus-2-tripartite-Leader, einen Satz von RNA- Spleißstellen, ein SV40-Polyadenylierungssignal und ein Dihydrofolat-Reduktase-Gen als einen selektionierbaren Marker.
- Um die das Aktivierungspeptid kodierende Sequenz zu deletieren, wurde Plasmid p594 mit Sst I verdaut und das 880 bp lange Fragment wurde gereinigt und in die Sst I- Stelle von M13mp10 (Messing, Methods Enzymol. 101:20-78) inseriert. Die 12 Aktivierungspeptid-Codons wurden durch oligonukleotid- gerichtete Deletionsmutagenese (Zoller und Smith, DNA 3:479-488, 1984) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC829 (5' CTG AAA CGA CTC ATT GAT 3') deletiert. Replikativform-DNA wurde hergestellt aus mutanten Phagenklonen und verdaut mit SstI. Das Protein-C-Fragment ( 840 bp) wurde isoliert und in mit Sst I verdauten p594 inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden auf richtige Orientierung des Sst I-Fragments durch Restriktionskartierung unter Verwendung von Bgl II gescreent. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und mit pPC829 bezeichnet. Plasmid pPC829 wurde sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Kodierungssequenz zu verifizieren.
- Plasmid pPC829 wurde co-transfiziert in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen (mit Plasmid pSVDHFRT (Lee et al., Nature 294:228-232, 1982)) und 293-Zellen (mit pKO-neo) durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, Virology 52:456-467, 1973). Nach 48 Stunden wurden die Kulturmedien geerntet und durch enzymverknüpften immunsorbierenden Test (ELISA) unter Verwendung des affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers untersucht, der bei der anfänglichen Identifikation der cDNA- Klone verwendet wurde, und/oder eines monoklonalen Antikörpers, der direkt gegen die schwere Kette von Protein C gerichtet ist. Der affinitäts- gereinigte Antikörper zu menschlichem Protein C (100 ug/ml in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;, pH 9,6) wurde zu jeder Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS (5 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,15 M NaCl), das 0,05 % Tween-20 enthielt, gewaschen, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen und wurden mit 100 ul 1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween 20 in PBS bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platten wurden mehrfach mit PBS gespült, luftgetrocknet und bei 4ºC aufbewahrt. Um Proben zu untersuchen, wurden 100 ul jeder Probe für 1 Stunde bei 37ºC in den beschichteten Vertiefungen inkubiert, und die Vertiefungen wurden mit 0,05 % Tween-20 in PBS gespült. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37ºC mit einem Biotin-konjugierten polyklonalen Schafs-Antikörper gegen Protein C (30 ng/ml) in PBS, das 1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween-20 enthielt, inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gespült und für 1 Stunde bei 37ºC mit Avidinkonjugierter Alkalin-Phosphatase in PBS, das 1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween-20 enthielt, inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gespült und Alkalinphosphatase-Aktivität wurde durch die Zugabe von 100 ul Phosphatase-Substrat (Sigma 104; 600 ug/ml in 10 % Diethanolamin, pH 9,8, das 0,3 mM MgCl&sub2; enthält) gemessen. Die Extinktion bei 405 nm wurde aus einem Mikrotiterplatten- Lesegerät abgelesen. Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Zur selben Zeit wurden Kulturen 1:5 in Medien aufgeteilt, die 500 ul/ml G418 (293-Zellen) oder 250 nM Methotrexat (tk&supmin;ts13- BHK-Zellen) enthielten. TABELLE 2 TRANSIENTE EXPRESSION VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (ELISA) Zellinie Protein C ng/ml in Medien
- Nachdem sie 10 Tage in Gegenwart von selektiven Medien gezüchtet worden waren, wurden stabil transfizierte Kolonien durch Immunfiltertest (McCracken und Brown, BioTechniques, 82- 87, März/April 1984) auf Produktion von aktiviertem Protein C gescreent. Platten wurden mit PBS oder No-Serum-Medium (DMEM plus 1x PSN-Antibiotikamischung, 5 ug/ml Vitamin K) gespült. Teflon -Netz (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) wurde dann über die Zellen gelegt. Nitrocellulosefilter wurden mit PBS oder No-Serum-Medium in geeigneter Weise angefeuchtet und über das Netz gelegt. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Filter entfernt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Filterpuffer gegeben (50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 150 mM NaCl, 0,25 % Gelatine). Die Filter wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rütteln in Biotin-markiertem polyklonalen Schafs-anti-Protein-C- Antikörper (1 ug/ml in Filterpuffer) inkubiert. Filter wurden dann im selben Puffer gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rütteln in Avidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase (Boehringer-Mannheim) (verdünnt 1:1000 im Filterpuffer) inkubiert. Filter wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,25 % Gelatine, 0,4 % Sacrosyl, 0,05 % NP-40, dann in H&sub2;O gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden in Farbreagenz (60 mg HRP-Farbentwicklungsreagenz [Bio- Rad], 20 ml Methanol, 100 ul H&sub2;O&sub2; in 100 ml 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Überführen der Filter in H&sub2;O gestoppt.
- Positive Kolonien wurden aussortiert und in selektiven Medien (die, je nachdem, 500 ug/ml G418 oder 250 nM Methotrexat enthielten) für 10 Tage gezüchtet. Kulturmedien wurden mit Chromogen-Test auf APC-Aktivität untersucht. Medienproben wurden zu Mikrotiter-Vertiefungen zugegeben, die 100 ul 0,2 mM Spektrozyme PCa (American Diagnostica #336) und 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl enthielten. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert und die A&sub4;&sub0;&sub5; wurde nach verschiedenen Zeitintervallen gemessen. Medien aus positiven 292-Zellkolonien zeigten konsistent höhere Aktivität mit dem chromogenen Substrat für APC, als dies Kontrollmedien taten, die mit nichttransfizierten 293-Zellen über denselben Zeitraum (10 Tage) inkubiert worden waren.
- Eine DNA-Sequenz, die einen Vorläufer für aktiviertes Protein C kodiert, mit der Schnittstellensequenz Arg-Arg-Lys-Arg, wurde durch Mutagenese der Wildtyp-Protein-C-Sequenz konstruiert. Die resultierende Sequenz wurde mit 1058 bezeichnet. Die Aminosäuresequenz dieses Vorläufers an der Verknüpfung zwischen den leichten und schweren Ketten ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Die Protein-C-Sequenz, die in Plasmid p594 vorliegt, wurde in einer Einzel-Mutagenese verändert, um die Codons für das Aktivierungspeptid zu deletieren und die Arg-Arg-Codons an der Verarbeitungsstelle zu inserieren. Mutagenese wurde auf dem 870 bp langen Sst I-Fragment aus p594 ausgeführt, das in M13mp11 kloniert wurde. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde isoliert und unter Verwendung von Oligonukleotiden ZC1058 (5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3') und ZC550 (5' TCC CAG TCA CGA CGT 3') mutagenisiert.
- Die mutagenisierte Sequenz wurde aus Replikativform-DNA als ein Sst I-Fragment isoliert. Das mutagenisierte Fragment wurde mit mit Sst I geschnittenem p594 verknüpft, um Expressionsvektor pDX/PC1058 zu konstruieren. Der Vektor wurde mit dem Calciumphosphatverfahren (im wesentlichen wie beschrieben von Graham und van der Eb, aaO) mit pSV2-DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) in tk&submin;ts13-BHK-Zellen co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10 % fötales Kalbsserum, 1x PSN-Antibiotikamischung (Gibco 600- 5640), 2,0 mM L-Glutamin und Vitamin K (5 ug/ml) enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden in 250 nM Methotrexat (MTX) über 14 Tage selektioniert. Das Protein wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Säule gereinigt, die durch Kopplung von 7 mg polyklonalem Schafs-Antikörper gegen menschliches Protein C an 2 Gramm CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) hergestellt worden war. Zellkulturmedium wurde auf die Säule aufgebracht und die Säule wurde mit 100 ml TBS (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) gewaschen. Das aktivierte Protein C wurde mit TBS eluiert, das 3 M KSCN enthielt, oder mit pH 11,5-Puffer (25 mM Kaliumphosphat, pH 11,5, 0,2 M NaCl, 2 % Tween-80, 0,5 % NaN&sub3;).
- Das Saccharomyces cerevisiae-KEX2-Gen wurde aus einer Hefe- Genombibliothek durch Screening von transformierten kex2- Mutantenzellen auf Produktion einer α-Faktor-Halo auf einem Rasen geeigneter Testerzellen isoliert. Ein Klon wurde erhalten, der alle berichteten Defekte von kex2-Mutanten (Mating, α-Faktor-Produktion, Maturation von Killer-Toxin und Sporulation in einem homozygoten diploiden Stamm) komplementierte. Das Gen wurde in einen pUC-Vektor unter Kontrolle des Hefe-GAL1-Promotors subkloniert. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit p1515, ist bei der American Type Culture Collection unter Zugangsnummer 67569 hinterlegt worden. Wie in Figur 3 dargestellt, wurde p1515 mit Hind III verdaut und ein 2,1 kb langes Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde an mit Hind III geschnittenen pUC18 ligiert, um Plasmid pUC18/KEX2 zu konstruieren. Das KEX2-Fragment (2,1 kb) wurde dann aus pUC18/KEX2 durch teilweises Verdauen des Plasmids mit Hind III und bis zur Vervollständigung mit Bam HI isoliert. Der Rest der KEX2- Sequenz wurde dann als ein 0,43 kb langes Fragment aus einem Bam HI + Hind III-Verdauungsprodukt von p1515 isoliert. Die zwei KEX2-Fragmente wurden dann in die Bam HI-Stelle der Vektoren Zem228 und Zem229 ligiert. (Zem229 ist ein Expressionsvektor auf der Basis von pUC18, der eine einzige Bam HI-Stelle für die Insertion von klonierter DNA zwischen dem Mäuse-Metallothionein-I-Promotor und dem SV40- Transkriptionsterminator enthält. Dieser Vektor enthält auch eine Expressionseinheit, die den SV40-early-Promotor, das Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase-Gen und den SV40-Terminator umfaßt. Zem228 ist ähnlich zu Zem229, enthält aber ein Neomycinresistenz-Gen anstelle des DHFR-Gens. Somit steht das inserierte Gen in Zem228 unter der Kontrolle des Metallothionein-I-Promotors und des SV40-Terminators und der Vektor kann mit dem Antibiotikum G418 selektioniert werden.) Die resultierenden Plasmide wurde bezeichnet mit KEX2/Zem228 bzw. KEX2/Zem229.
- Ein in hohem Maße Protein C produzierender pDX/PC1058- transfizierter tk&supmin;ts13-BHK-Klon (pDX/PC1058-3//BHK) wurde mit dem Calciumphosphatverfahren mit KEX2/Zem228 transfiziert. Transfizierte Zellen wurden mit 500 ug/ml G418 und 250 nM Methotrexat selektioniert.
- Ein selektionierter Klon, bezeichnet mit KEX2-1058//BHK, wurde über 24 Stunden puls-markiert mit ³&sup5;S-Cystein in cysteinfreiem DMEM (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), das 1 % fötales Kalbsserum enthielt. Die Kulturmedien wurden gesammelt und auf das Vorhandensein von Einzelketten- und Doppelketten-Protein C durch Immunausfällung mit einem monoklonalen Antikörper zu Protein C untersucht. Zweihundertfünfzig ul Medien wurden mit 10 ug Antikörper kombiniert und die Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. 100 ul Staph A-Zellsuspension (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der Pellet wurde in 60 ul Gelpuffer, der 1 % β-Mercaptoethanol enthielt, erneut suspendiert. Die Suspension wurde für 3 Minuten auf 100ºC erhitzt, dann auf einem SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen. Proteine wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Der KEX2-1058//BHK-Klon zeigte ungefähr 100 % Spaltung des Proteins in die Doppelkettenform.
- Eine stabil transfizierte BHK-Klon-Zellinie, bezeichnet mit KEX2-1058 #3-5, wurde bei 37ºC in einer 5 %igen CO&sub2;-Atmosphäre in Zellfabriken (Nunc, Thousand Oaks, CA) bis zu Konfluenz in einem Medium, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, gezüchtet, dann ließ man es in Medium wachsen, das 1 % Serum enthielt. Das konditionierte Medium wurde durch Dekantieren entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 500 ml PBS gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in serumfreies Medium überführt, das 50 % DMEM, 50 % Hams F12, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 1x PSN-Antibiotikamischung (Gibco Laboratories), 5 mg/l Insulin, 3 ug/l Selen, 10 mg/l Fetuin, 20 mg/l Transferrin und 25 mM HEPES-Puffer pH 7,2 enthielt. Alle Medien enthielten 1 ug/ml Vitamin K. Nach drei bis vier Tagen Wachstum wurde das Medium abgeerntet und die Zellen wurden in Medium überführt, das 1 % Serum enthielt.
- Aktiviertes Protein C wurde aus serumfreien und serumhaltigen Medien durch Immunaffinitätschromatographie auf einer PCL-2- Sepharose-Säule gereinigt. Die Säule wurde aufgebaut durch Kopplung eines monoklonalen Antikörpers (bezeichnet als PCL- 2), der für die Ca&spplus;&spplus;-gebundene leichte Kette von Protein C spezifisch ist, an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Die konditionierten Medien wurden filtriert und etwa 90fach unter Verwendung eines Konzentrators Amicon DC10L (Amicon, Danvers, MA) vor Reinigung konzentriert. Die konzentrierten Proben auf die Säule in Gegenwart von 10 mM CaCl&sub2; aufgebracht. Die Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl, 1,0 M NaCl, 10 mM CaCl&sub2;, pH 7,5, gewaschen. Aktiviertes Protein C wurde aus der Säule mit 15 mM EDTA in 50 mM Tris-HCl pH 7,5 eluiert.
- Aktiviertes Protein C, das von Zellen produziert wurde, die in serumfreiem Medium und Medium, das 1 % Serum enthielt, kultiviert worden waren, wurde unter Verwendung der BCA- Methode quantifiziert (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Biologische Aktivität des Proteins wurde bestimmt durch Verfolgen der Verlängerung von APTT mit gepooltem Normalplasma als Substrat. Kurz gesagt wurde der APTT-Test durchgeführt, indem 100 ul Normalplasma mit verschiedenen Verdünnungen (100 ul Volumen) von rekombinantem APC bei 37ºC für 50 Sekunden inkubiert wurden, gefolgt von Inkubation mit 100 ul Act in FS (Dade, Miami, FL) bei 37ºC für 100 Sekunden. 100 ul 25 mM CaCl&sub2; wurden dann zugegeben und die Gerinnungszeit wurde bestimmt.
- Ergebnisse von Mehrfachbestimmungen sind in Tabelle 3 dargestellt. Werte sind abgerundet auf zwei signifikante Stellen. TABELLE 3 BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON REKOMBINANTEM APC Gerinnungszeit (Sekunden) Serum Experiment
- Die Proteine wurden auch durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, Nature 227: 680, 1970) charakterisiert. Wie in Figur 4 dargestellt, ist rekombinantes aktiviertes Protein C, das von Zellen produziert wird, die in serumfreiem Medium kultiviert worden sind, überwiegend vorhanden als eine Spezies mit einem Molekulargewicht von ungefähr 68 kDa (Spuren 9-11). Im Gegensatz dazu enthält APC aus Zellen, die in Gegenwart von 1 % Serum kultiviert worden sind, signifikante Mengen einer Spezies mit einem Molekulargewicht von mehr als 93 kDa (Spuren 5-7), was darauf hindeutet, daß sich in der Gegenwart von Serum ein hochmolekularer APC-Inhibitorkomplex bildet.
- Diese Daten zeigen, daß Produktion von rekombinantem aktivierten Protein C in serumfreien Medien zu erhöhten Gehalten an intaktem, biologisch aktivem Protein führt, verglichen mit Produktion in Gegenwart von herkömmlichen Serumgehalten.
- Die Kodierungssequenz von Protein C wurde verändert, um die Aminosäure 153-169 zu entfernen, was zu einem Vorläufer für aktiviertes Protein C mit einer Verknüpfung zwischen leichter Kette und schwerer Kette zwischen den Aminosäuren 152 und 170 führt. Die Sequenz dieses Vorläufers für aktiviertes Protein C, bezeichnet mit 1962, ist dargestellt in Tabelle 1.
- Oligonukleotidgerichtete Mutagenese wurde ausgeführt auf einer Matrize, die das Sst I-Fragment von p594, in der richtigen Orientierung in die Sst I-Stelle von M13mp10 inseriert umfaßt. Einzelsträngige Matrizen-DNA wurde aus dem p594/mp10- Phagenklon hergestellt. Oligonukleotidgerichtete Mutagenese wurde ausgeführt auf der Matrize unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1962 (5' GAG AAG AAG CGC CTC ATT GAT GGG 3') und ZC550. Positive Phagenklone wurden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Phagenklon wurde mit 1962 bezeichnet.
- Replikativform-DNA wurden aus Phagenklon 1962 hergestellt und wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 0,4 kb lange mutagenisierte Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 (Beispiel 2E) wurde mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 562 bp Protein-C-Fragment zu isolieren. Ein 700 bp langes Sst I- Eco RI-Protein-C-Fragment wurde aus PC1869/229R erhalten (einem Plasmid auf der Basis von Zem229R, das die p594- Protein-C-Kodierungssequenz umfaßt, wobei aber das Arg(Rest 157)-Codon durch ein Lys-Codon ersetzt ist. Plasmid Zem229R ist ähnlich zu Zem229, mit der Ausnahme, daß die Eco RI- Stellen, die in Zem229 vorliegen, durch Teilverdauung, Stumpfendigmachen durch Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und dNTPs, gefolgt von Religation, zerstört worden sind und eine einzelne Eco RI-Stelle an der Bam HI- Stelle durch Verdauung mit Bam HI und Religation mit Bam HI- Eco RI-Adaptern geschaffen wurde). Plasmid pZMB-2 (Figur 5) wurde durch Verdauung mit Eco RI linearisiert. (Plasmid pZMB-2 ist ähnlich zu Zem229R, enthält aber den SV40-Verstärker, den Adenovirus-2-major-late-Promotor, den Adenovirus-2-tripartite- Leader und 5'- und 3'-Spleißstellen, ersetzt für den MT-1- Promotor, unter Verwendung eines Sst I-Hind III-Adapters.) Das 0,4 kb lange Pst I-Sst I-Fragment aus Phagenklon 1962, das 700 bp lange Pst I-Eco RI-Fragment aus pC1869/229R, das 562 bp lange Sst I-Eco RI-Fragment aus PC229/962 und das linearisierte pZMB-2 wurden in einer Vier-Teile-Ligation verknüpft. Ein Plasmid mit dem Insert in der richtigen Orientierung wurde bezeichnet mit pPC1962/ZMB-2.
- Plasmid pPC1962/ZMB-2 wurde durch Calciumphosphat-Mitfällung in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden in DMEM gezüchtet, das 10 % fötales Kalbsserum, 1x PSN- Antibiotikamischung (Gibco), 2,0 mM l-Glutamin und 5 ug/ml Vitamin K enthielt. Die Zellen wurden in 500 nM Methotrexat über 15 Tage selektioniert und die resultierenden Kolonien wurden mit dem Immunfilter-Test gescreent. Die am stärksten reagierenden Kolonien wurden durch Zylinderklonierung aussortiert und einzeln in 10 cm-Platten gezüchtet. Als die Kulturen nahezu konfluent waren, wurden Protein-C- Produktionsniveaus durch ELISA gemessen.
- Ein in hohem Maße Protein C produzierender pPC1962/ZMB-2- Transfektant wurde mit KEX2/ZMB-1 transfiziert. (KEX2/ZMB-1 umfaßt die KEX2-Kodierungssequenz, inseriert in den Vektor ZMB-1 an der einzigen Eco RI-Stelle. ZMB-1, dargestellt in Figur 5 ist ähnlich zu ZMB-2, wurde aber aus Zem228R konstruiert. Zem228R wurde aus Zem228 hergestellt, wie oben für die Konstruktion von Zem229R beschrieben.) Cotransfizierte Zellen wurden selektioniert und Medienproben wurden gesammelt. Aktiviertes Protein C wurde in Medienproben aus mit pPC1962-KEX2/ZMB-1 co-transfizierten Zellen nachgewiesen.
- Eine DNA-Sequenz, die ein acht Aminosäuren langes spacer- Peptid kodiert, das von Arg-Arg-Lys-Arg-Verarbeitungssignalen an der Verknüpfung zwischen den leichten und schweren Ketten von Protein C flankiert ist (bezeichnet mit 1645), ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Das mutante Molekül wurde erzeugt durch Verändern der klonierten cDNA durch ortsspezifische Mutagenese (im wesentlichen wie beschrieben von Zoller und Smith, DNA 3:479- 488, 1984) unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids ZC962 (5' AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA GAC A 3') und des Oligonukleotids ZC550 (5' TCC CAG TCA CGA CGT 3'). Plasmid p594 wurde verdaut mit Sst I, das ungefähr 87 bp lange Fragment wurde in M13mp10 kloniert und eine einzelsträngige Matrizen-DNA wurde isoliert. Im Anschluß an die Mutagenese wurde ein richtiger Klon durch Sequenzierung identifiziert. Replikativform-DNA wurde isoliert und wurde mit Sst I verdaut, um das mutagenisierte Fragment zu isolieren. Dieses mutagenisierte Fragment wurde mit mit Sst I geschnittenem p594 in einer Zwei-Teile-Ligation verknüpft. Klone mit dem Sst I- Fragment, inseriert in der gewünschten Orientierung, wurden durch Restriktionsenzymkartierung identifiziert. Der resultierende Expressionsvektor wurde bezeichnet mit pDX/PC962 (Figur 6).
- Plasmid pDX/PC962 wurde mit Sal I und Sst I verdaut und das gereinigte 730 bp lange Fragment wurde in M13mp10 inseriert, das durch Verdauung mit Sal I und Sst I linearisiert worden war. Synthetische Oligonukleotide ZC1645 (5' GAA GAC CAA ACA ACA AAA CGG CTC ATT GAT 3') und ZC550 wurden verwendet, um die einzelsträngige Matrizen-DNA durch ortsgerichtete in-vitro- Mutagense (Zoller und Smith, aaO) zu mutagenisieren. Die mutanten Phagenklone wurden einer Didesoxy-Sequenzierung unterzogen, um die Mutagenese zu bestätigen. Replikativform (rf)-DNA aus einem bestätigten mutanten Phagenklon, bezeichnet mit 1645, wurde hergestellt und wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das 410 bp lange Fragment zu isolieren.
- Plasmid pDX/PC962 wurde mit Eco RI verdaut und das Protein-C- Fragment wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde, über Oligonukleotid-Adaptoren, an mit Phosphatase behandeltes, mit Bam HI geschnittenes Plasmid Zem229 gebunden. Das resultierende Plasmid, PC229/962 (Figur 6), wurde mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 592 bp lange Protein-C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde ebenfalls mit Eco RI und Sst I verdaut, um das 700 bp lange Protein-C-Fragment zu isolieren. Das 411 bp lange Protein-C-Fragment aus der 1645- rf, das 592 bp lange Protein-C-Fragment aus PC229/962 und das 700 bp lange Protein-C-Fragment wurden in einer Vier-Teile- Ligation mit Zem229R verknüpft, das zuvor mit Eco RI linearisiert und mit Kalbs-Intestinalphosphatase behandelt worden war, um Selbstligation zu verhindern. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und wurde bezeichnet als pPC1645/229R (Figur 6).
- Plasmid pPC1645/229R wurde in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, aaO) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden Selektion mit 1 uM Methotrexat unterworfen und Medien wurden mit ELISA auf Protein C untersucht. Ein positiver Klon wurde in DMEM gezüchtet, das mit 10 % fötalen Kalbsserum und 1 uM Methotrexat ergänzt worden war, bis die Zellen Konfluenz erreichten. Die konfluenten Zellen wurden auf DMEM umgestellt, das mit 1 % fötalem Kalbsserum und 1 uM Methotrexat ergänzt worden war. Medien wurde alle 1 bis 2 Tage über einen Zeitraum von 7 Tagen gesammelt und bei -20ºC eingefroren. Die eingefrorenen Medienproben wurden aufgetaut und durch 0,45 uM- Filter filtriert, um alle Zelltrümmer zu entfernen. Festes Calciumchlorid wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und festes Natriumazid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % (Gewicht/Volumen) zugegeben. Protein C wurde aus den Medien unter Verwendung einer monoklonalen Antikörpersäule gereinigt, die für die Calciuminduzierte Konformation von Protein C spezifisch war. Die behandelten Medienproben wurden auf die Säule aufgebracht und Protein C wurde mit TBS, das 10 mM EDTA enthielt, eluiert. Protein-C-Konzentrationen wurden durch Extinktion bei 280 nm und durch ELISA bestimmt.
- Aktiviertes Protein C, hergestellt aus pPC1645/229R- transfizierten Zellen, wurde mit einer äquivalenten Menge von pC229/962-Protein C unter Verwendung eines Chromogentests verglichen. Ein ug affinitätsgereinigtes Protein C, verdünnt in 40 ul TBS + EDTA, wurde zu jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen zugegeben. Vierzig ul 2 mM Spectrozyme PCa (American Diagnostica Inc., New York, NY) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei 37ºC inkubiert, bis eine ausreichende Farbentwicklung auftrat. Aktivität wurde als ein Anstieg in der Extinktion bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß das aktivierte Protein C, das aus pPC1645/229R- transfizierten Zellen hergestellt worden war, 5-10 % aktiver war als das von PC229/962 produzierte Protein C.
- Die 1645-DNA-Sequenz wurde weiter modifiziert, um die erste, zweite, siebente und achte Aminosäure des spacer-Peptids zu entfernen. Einzelsträngige 1645-Matrizen-DNA wurde ortsgerichteter in-vitro-Mutagenese (Zoller und Smith, aaO) unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden ZC1880 (5' AAA CGA GAC ACA GAC CAA AGA AGA 3') und ZC550 unterworfen. Positive Phagenklone wurden einer Didesoxy-Sequenzierung unterworfen, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Klon wurde identifiziert und wurde mit 1880 bezeichnet (Tabelle 1).
- Replikativform-DNA, hergestellt aus Klon 1880, wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 0,4 kb lange Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 562 bp lange Protein-C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wurde ebenfalls mit Eco RI und Pst I verdaut, um das 700 bp lange Protein-C-Fragment zu isolieren. Das 411 bp lange Protein-C-Fragment aus der 1880-rf, die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus PC229/962 und mit Eco RI verdauter Zem229R wurden in einer Vier-Teile-Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und wurde mit pPC1880/229R bezeichnet.
- Plasmid pPC1880/229R wurde in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen transfiziert. Analyse von Medienproben aus transfizierten Zellen zeigte, daß aktiviertes Protein C produziert wurde.
- Die Kodierungssequenz für das spacer-Peptid in der 1645- Sequenz wird geändert, um das zweite bis siebente Aminosäurecodon zu entfernen. Einzelsträngige 1645-Matrizen- DNA wird hergestellt und ortsgerichteter in-vitro-Mutagenese unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1954 (5' GAG AAG AAA ACG AGA CCA AAG AAG AAA AC 3') und ZC550 unterworfen. Positive Klone werden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Klon wird selektioniert und mit 1954 bezeichnet (Tabelle 1).
- Replikativform-DNA wird aus 1954 hergestellt und mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 400 bp lange mutagenisierte Protein-C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wird mit Eco RI und Pst I und mit Sst I und Eco RI verdaut, um das 562 bp lange Eco RI-Pst I-Fragment und das 700 bp lange Protein-C- Fragment zu isolieren. Das ungefähr 0,4 kb lange Protein-C- Fragment aus der 1954-rf, die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus pPC229/962 und der mit Eco RI verdaute pZem229R werden in einer Vier-Teile-Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wird selektioniert und mit pPC1954/229R bezeichnet.
- Plasmid pPC1954/229R wird in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, aaO) transfiziert. Zellen werden selektioniert und auf die Produktion von aktiviertem Protein C untersucht.
- Die Kodierungssequenz für das spacer-Peptid in der 1645- Sequenz wird verändert, um das erste bis achten Aminosäurecodon zu entfernen, was zu einer Fusion zwischen dem ersten und zweiten Satz von Arg-Arg-Lys-Arg-Aminosäurecodons, die in 1654 vorliegen, führt. Die Aminosäuresequenz an der Verknüpfung der leichten und der schweren Kette des kodierten Proteins (bezeichnet mit 1953) ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Einzelsträngige 1645-Matrizen-DNA wird ortsgerichteter in- vitro-Mutagenese unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC1953 (5' ACC TCA GAA GAA AAC GAA GAA GAA AAC GGC TCA T 3') und ZC550 unterworfen. Positive Klone werden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen. Ein positiver Klon wird selektioniert und mit 1953 bezeichnet. Replikativform-DNA wird aus Klon 1953 hergestellt und wird mit Sst I und Pst I verdaut, um das ungefähr 0,4 kb lange mutagenisierte Protein-C-Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wird mit Eco RI und Pst I oder Sst I und Eco RI verdaut, um das 562 bp lange Eco RI-Pst I-Fragment und das 700 bp lange Protein-C-Fragment zu isolieren. Das ungefähr 400 bp lange Protein-C-Fragment aus der 1953-rf, die 700 bp und 562 bp langen Fragmente aus PC229/962 und mit Eco RI verdauter Zem229R werden in einer Vier-Teile-Ligation verknüpft. Ein richtiges Plasmid wird selektioniert und mit pPC1953/229R bezeichnet.
- Plasmid pPC1953/229R wird tk&supmin;ts13-BHK-Zellen durch Calciumphosphat-Mitfällung (Graham und van der Eb, aaO) transfiziert. Zellen werden selektioniert und auf die Produktion von aktiviertem Protein C untersucht.
- Ein Vorläufer für aktiviertes Protein C wird konstruiert, in dem die Sequenz, die das Aktivierungspeptid kodiert, entfernt ist und ein Arg-Codon zwischen den Aminosäurecodons 150 und 151 von nativem Protein C inseriert ist. Die Aminosäuresequenz der Verknüpfung von leichter und schwerer Kette des kodierten Proteins (bezeichnet mit 2043) ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Einzelsträngige Matrizen-DNA wird aus Phagenklon 1962 hergestellt und ortsgerichteter in-vitro-Mutagenese unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide ZC2043 (5' AGC CGG ATG GAG AAG AGG AAG CGC CTC ATT GC 3') und ZC550 unterworfen. Positive Klone werden sequenziert, um die Mutagenese zu bestätigen. Replikativform-DNA wird aus einem bestätigten Phagenklon hergestellt und wird mit Pst I und Sst I verdaut, um das ungefähr 0,4 kb lange mutagenisierte Fragment zu isolieren. Plasmid PC229/962 wird mit Eco RI und Pst I und mit Sst I und Eco RI verdaut. Die resultierenden 562 bp langen Eco RI-Pst I- und 700 bp langen Eco RI-Sst I- Protein-C-Fragmente werden gewonnen. Plasmid ZMB-2 wird durch Verdauung mit Eco RI linearisiert. Das 0,4 kb lange Pst I-Sst I-Fragment wird mit dem 562 bp langen Eco RI-Pst I-Fragment und dem 700 bp langen Sst I-Eco RI-Fragment und dem linearisierten ZMB-2 in einer Vier-Teile-Ligation verknüpft. Ein Plasmid, das das Insert in der richtigen Orientierung enthält, wird mit pPC2043/ZMB-2 bezeichnet.
- Plasmid pPC2043/ZMB-2 wird in tk&supmin;ts13-BHK-Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen werden auf die Produktion von aktiviertem Protein C untersucht.
Claims (10)
1. Verfahren für die Produktion von aktiviertem Protein C,
welches umfaßt:
Kultivieren von Säugetierzellen, die stabil transfiziert sind
mit einem Expressionsvektor, der einen Transkriptionspromotor
umfaßt, der operabel mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die
aktiviertes Protein C kodiert, in einen Kulturmedium und
Isolieren des von den Zellen produzierten aktivierten Proteins
C,
dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Medium nicht mehr als 0,1
% Serum enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Medium im
wesentlichen serumfrei ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte Zellen
Babyhamster-Nierenzellen sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte DNA-Sequenz
außerdem für die Aminosäuresequenz R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;-X-R&sub5;-R&sub6;-R&sub7;-R&sub8;
zwischen den leichten und schweren Ketten von besagten
aktivierten Protein C kodiert, wobei jedes von R&sub1;-R&sub8; Lysin oder
Arginin ist und X eine Peptidbindung oder ein spacer-Peptid
mit 1-12 Aminosäuren ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte DNA-Sequenz
außerdem für die Aminosäuresequenz (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;, wobei jedes
von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Lys oder Arg ist und n = 0, 1, 2 oder 3
ist, zwischen den leichten und schweren Ketten von besagten
aktivierten Protein C kodiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei besagte DNA-Sequenz für
die Aminosäuresequenz Arg-Arg-Lys-Arg zwischen den leichten
und schweren Ketten von besagtem aktivierten Protein C
kodiert.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte Zellen außerdem
transfiziert sind, um das Saccharomyces cerevisiae-KEX2-Gen zu
exprimieren.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Kulturmediun
außerdem Vitamin K umfaßt.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 und 6, wobei besagte
Zellen außerdem transfiziert sind, um das Saccharomyces
cerevisiae-KEX2-Gen zu exprimieren.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte Zellen
Babyhamster-Nierenzellen sind.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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