JP2728240B2 - ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法 - Google Patents
ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血液凝固防止作用を有する新規な一本鎖の
プロテインＣ変異体に関する。
プロテインＣ変異体に関する。
技術的背景 ヒトプロテインＣはヒト血漿中に存在するセリンプロ
テアーゼ前駆体である。
テアーゼ前駆体である。
プロテインＣはトロンボモジュリンに結合したトロン
ビンにより限定分解をうけ、活性型プロテインＣとな
り、血液凝固系の第VIIIa因子及び第Va因子をカルシウ
ムイオンの存在下に失活させ血液凝固を阻害しまたティ
ッシュプラスミノゲンアクティベーターインヒビター
（以下、PAI）を阻害しその結果、線溶系を昂進するこ
とが知られている。ヒトプロテインＣをコードするcDNA
の塩基配列は1985年にFosterらによって決定され、報告
されている（D.C.Foster et al,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 82,4673−4677（1985））。
ビンにより限定分解をうけ、活性型プロテインＣとな
り、血液凝固系の第VIIIa因子及び第Va因子をカルシウ
ムイオンの存在下に失活させ血液凝固を阻害しまたティ
ッシュプラスミノゲンアクティベーターインヒビター
（以下、PAI）を阻害しその結果、線溶系を昂進するこ
とが知られている。ヒトプロテインＣをコードするcDNA
の塩基配列は1985年にFosterらによって決定され、報告
されている（D.C.Foster et al,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 82,4673−4677（1985））。
ヒトプロテインＣはアミノ末端から6,7,14,16,19,20,
25,26及び29位にグルタミン酸残基を有する。これらは
翻訳後ビタミンＫ依存性の修飾によって、そのガンマ位
の炭素がカルボキシル化される。そのγ−カルボキシグ
ルタミン酸を含む領域（以下本明細書で「グラドメイ
ン」と称する）は、主として、カルシウムイオン（C
a++）を介して、細胞膜上の負に荷電したリン脂質と複
合体を形成する際に働くとされている。このグラドメイ
ンの働きについては文献「代謝」第19巻，第９号（198
2）に詳しい総説が述べられている。
25,26及び29位にグルタミン酸残基を有する。これらは
翻訳後ビタミンＫ依存性の修飾によって、そのガンマ位
の炭素がカルボキシル化される。そのγ−カルボキシグ
ルタミン酸を含む領域（以下本明細書で「グラドメイ
ン」と称する）は、主として、カルシウムイオン（C
a++）を介して、細胞膜上の負に荷電したリン脂質と複
合体を形成する際に働くとされている。このグラドメイ
ンの働きについては文献「代謝」第19巻，第９号（198
2）に詳しい総説が述べられている。
本発明の課題 本発明の課題は、ヒトプロテインＣのアミノ酸配列の
一部を変異させトロンビン／トロンボモジュリンによる
活性化を遅らせひいてはその活性持続時間を遅効させる
ことのできる新しいプロテインＣ変異体を提供すること
である。
一部を変異させトロンビン／トロンボモジュリンによる
活性化を遅らせひいてはその活性持続時間を遅効させる
ことのできる新しいプロテインＣ変異体を提供すること
である。
発明の背景及び構成 血液凝固の過程は、最終的にはフィブリン凝塊の形成
に至るまでの種々の血液成分、組織因子の複雑な連鎖相
互反応から構成される。一般に、血液凝固においては血
液中に存在する不活型の前駆体蛋白質即ちザイモゲンが
それ自体他の活性化血液凝固因子によって活性化を受け
次のザイモゲンを活性化するという一連のカスケードを
経て最終的にフィブリノゲンがフィブリンに変化しフィ
ブリンによる血液凝塊が形成される。
に至るまでの種々の血液成分、組織因子の複雑な連鎖相
互反応から構成される。一般に、血液凝固においては血
液中に存在する不活型の前駆体蛋白質即ちザイモゲンが
それ自体他の活性化血液凝固因子によって活性化を受け
次のザイモゲンを活性化するという一連のカスケードを
経て最終的にフィブリノゲンがフィブリンに変化しフィ
ブリンによる血液凝塊が形成される。
フィブリン凝塊が形成される最終段階では、補助因子
である活性型Va因子存在下で、プロトロンビンが一種の
蛋白質分解酵素である活性型Xa因子によってトロンビン
へと活性化され、これがさらにフィブリノゲンをフィブ
リンに変えるとともに、正のフィードバックとして不活
性型VIII因子と不活性型Ｖ因子を活性化して凝固反応を
加速させる。しかし一方で、負のフィードバックとして
も作用し、不活性型プロテインＣを活性型プロテインＣ
に変え、このものは更に活性型Va,VIIIa両因子を分解不
活化し抗凝固因子として働く（W.Kisiel et al,Bioche
m.,16,5824−5831,（1977）;R.A.Marlar,A.J.Kleiss an
d J.H.Griffin,Blood 59,1067−1072,（1982））。
である活性型Va因子存在下で、プロトロンビンが一種の
蛋白質分解酵素である活性型Xa因子によってトロンビン
へと活性化され、これがさらにフィブリノゲンをフィブ
リンに変えるとともに、正のフィードバックとして不活
性型VIII因子と不活性型Ｖ因子を活性化して凝固反応を
加速させる。しかし一方で、負のフィードバックとして
も作用し、不活性型プロテインＣを活性型プロテインＣ
に変え、このものは更に活性型Va,VIIIa両因子を分解不
活化し抗凝固因子として働く（W.Kisiel et al,Bioche
m.,16,5824−5831,（1977）;R.A.Marlar,A.J.Kleiss an
d J.H.Griffin,Blood 59,1067−1072,（1982））。
さらに活性型プロテインＣはPAIを不活化しプラスミ
ノゲンからのプラスミンの生成を結果的に促すことによ
り、ひいてはプラスミンによるフィブリンの凝塊の分解
を促進して抗凝固的のみならず線溶的にも働く（Y.Saka
ta et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,82,1121−1125,（198
5））。
ノゲンからのプラスミンの生成を結果的に促すことによ
り、ひいてはプラスミンによるフィブリンの凝塊の分解
を促進して抗凝固的のみならず線溶的にも働く（Y.Saka
ta et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,82,1121−1125,（198
5））。
このプロテインＣの活性化は、プロテインＣがトロン
ビン及び内皮細胞表面のトロンボモジュリンと結合する
と著しく促進される（C.T.Esmon and W.G.Owen,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78,2249−2252（1981））。プロテイ
ンＣの血中濃度が低レベルである患者は、血栓症を起こ
しやすい（J.H.Griffin et al,J.Clin.Invest.68,1370
−1373（1981）;J.H.Griffin et al,Blood 60,261−264
（1982）;P.C.Comp et al,J.Clin.Invest.74,2082−208
8,（1984））。プロテインＣを完全に欠損するホモ型患
者の場合、新生児期に重篤な胎児性血栓症を発症するこ
とがある（U.Selingsohn et al,New Engl.J.Med.,310,5
59−562（1984））。
ビン及び内皮細胞表面のトロンボモジュリンと結合する
と著しく促進される（C.T.Esmon and W.G.Owen,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78,2249−2252（1981））。プロテイ
ンＣの血中濃度が低レベルである患者は、血栓症を起こ
しやすい（J.H.Griffin et al,J.Clin.Invest.68,1370
−1373（1981）;J.H.Griffin et al,Blood 60,261−264
（1982）;P.C.Comp et al,J.Clin.Invest.74,2082−208
8,（1984））。プロテインＣを完全に欠損するホモ型患
者の場合、新生児期に重篤な胎児性血栓症を発症するこ
とがある（U.Selingsohn et al,New Engl.J.Med.,310,5
59−562（1984））。
プロテインＣは、23％の糖を含有する、分子量62Kダ
ルトンの、ビタミンＫ依存性の修飾、即ちアミノ末端領
域にあるグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化をうけ
る抗血液凝固因子であり（W.Kisiel,J.Clin.Invest.64,
761−769,（1979））、一種のセリンプロテアーゼの前
駆体蛋白質として血漿中に３〜４μg/mlの濃度で存在す
る。通常分子量41KダルトンのＨ−鎖と分子量21Kダルト
ンのＬ−鎖が一本のジスルフィド結合で架橋された状態
で存在するが、約10％はＨ−鎖とＬ−鎖が分離せずペプ
チド結合でつながった状態でも存在することが知られて
いる（E.Kisiel,J.Clin.Invest.64,761−769,（197
9））。Ｌ−鎖はヒトの場合、９個のγ−カルボキシグ
ルタミン酸（Gla）残基と１個のβ−ヒドロキシアスパ
ラギン酸（HO−Asp）残基を含有する。この９個のGla残
基を有する部分は同蛋白質のアミノ末端に局在し、グラ
ドメイン領域と呼ばれ、同蛋白質の活性化及び活性それ
自身に必要である。
ルトンの、ビタミンＫ依存性の修飾、即ちアミノ末端領
域にあるグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化をうけ
る抗血液凝固因子であり（W.Kisiel,J.Clin.Invest.64,
761−769,（1979））、一種のセリンプロテアーゼの前
駆体蛋白質として血漿中に３〜４μg/mlの濃度で存在す
る。通常分子量41KダルトンのＨ−鎖と分子量21Kダルト
ンのＬ−鎖が一本のジスルフィド結合で架橋された状態
で存在するが、約10％はＨ−鎖とＬ−鎖が分離せずペプ
チド結合でつながった状態でも存在することが知られて
いる（E.Kisiel,J.Clin.Invest.64,761−769,（197
9））。Ｌ−鎖はヒトの場合、９個のγ−カルボキシグ
ルタミン酸（Gla）残基と１個のβ−ヒドロキシアスパ
ラギン酸（HO−Asp）残基を含有する。この９個のGla残
基を有する部分は同蛋白質のアミノ末端に局在し、グラ
ドメイン領域と呼ばれ、同蛋白質の活性化及び活性それ
自身に必要である。
ヒトプロテインＣの全アミノ酸配列はそのcDNA及びゲ
ノムDNAの配列よりすでに知られており本発明者達もす
でにヒトプロテインＣをコードする遺伝子のDNA配列を
その発現のために種々のプロモーターに接続し動物細胞
において生産することに成功し、これを特願昭62−9634
1号として特許出願している。遺伝子のコードするアミ
ノ酸配列によれば、プレプロプロテインＣは42個のアミ
ノ酸残基からなるプレプロリーダー配列、155個のアミ
ノ酸残基からなるＬ−鎖、Lys−Argからなる接続ジペプ
チド（connecting dipeptide）さらに活性化において除
去される12個のアミノ酸残基、そして最後に250個のア
ミノ酸残基からなるＨ−鎖からなることが知られる。
ノムDNAの配列よりすでに知られており本発明者達もす
でにヒトプロテインＣをコードする遺伝子のDNA配列を
その発現のために種々のプロモーターに接続し動物細胞
において生産することに成功し、これを特願昭62−9634
1号として特許出願している。遺伝子のコードするアミ
ノ酸配列によれば、プレプロプロテインＣは42個のアミ
ノ酸残基からなるプレプロリーダー配列、155個のアミ
ノ酸残基からなるＬ−鎖、Lys−Argからなる接続ジペプ
チド（connecting dipeptide）さらに活性化において除
去される12個のアミノ酸残基、そして最後に250個のア
ミノ酸残基からなるＨ−鎖からなることが知られる。
このプレプロプロテインＣは、遺伝子より翻訳生産
後、まず−10位のAla後方で開裂され塩基性の極めて高
い９個のアミノ酸残基よりなるプロペプチドを有するザ
イモゲンの状態となる。細胞中に分泌されるときさらに
−１位のArgの後方で開裂をうけアミノ末端がAla−Asn
−Ser−となる。血液中を循環するときは、さらに＋156
位のLysと＋157位のArgからなる接続ペプチドがある種
のプロテアーゼによって除去され、最終的にトロンビン
とトロンボモジュリンによって169位のArgの後方で開裂
を受け活性型プロテインＣとなる。しかし、生体内では
一本鎖型前駆体から二本鎖型への移行は何等かの理由で
不完全でありマイナー成分として、ヒトの場合、約５〜
15％のプロテインＣは一本鎖型として存在する（J.P.Mi
letich,et al,Blood,62,Suppl.1,306a（1983））。これ
が、単に不完全なプロセッシングの結果なのか、血液凝
固線溶機構の調節に何等かの特別な役割を果たしている
のか詳細な解析はまだなされていない。しかし我々は、
一本鎖型プロテインＣは二本鎖型プロテインＣよりも活
性化を受ける速度が遅く、従ってその効果が遅効的で延
長する可能性に着目し本発明を完成した。
後、まず−10位のAla後方で開裂され塩基性の極めて高
い９個のアミノ酸残基よりなるプロペプチドを有するザ
イモゲンの状態となる。細胞中に分泌されるときさらに
−１位のArgの後方で開裂をうけアミノ末端がAla−Asn
−Ser−となる。血液中を循環するときは、さらに＋156
位のLysと＋157位のArgからなる接続ペプチドがある種
のプロテアーゼによって除去され、最終的にトロンビン
とトロンボモジュリンによって169位のArgの後方で開裂
を受け活性型プロテインＣとなる。しかし、生体内では
一本鎖型前駆体から二本鎖型への移行は何等かの理由で
不完全でありマイナー成分として、ヒトの場合、約５〜
15％のプロテインＣは一本鎖型として存在する（J.P.Mi
letich,et al,Blood,62,Suppl.1,306a（1983））。これ
が、単に不完全なプロセッシングの結果なのか、血液凝
固線溶機構の調節に何等かの特別な役割を果たしている
のか詳細な解析はまだなされていない。しかし我々は、
一本鎖型プロテインＣは二本鎖型プロテインＣよりも活
性化を受ける速度が遅く、従ってその効果が遅効的で延
長する可能性に着目し本発明を完成した。
本発明のヒトプロテインＣ変異体は、天然のヒトプロ
テインＣの156及び157番目のアミノ酸配列Lys−Argと異
なるアミノ酸配列を有することを特徴としている。水溶
性及び酸−塩基性の点を考慮すると、リジン−アルギニ
ンをセリン、アスパラギンおよびグルタミンよりなる群
から選ばれる２種のアミノ酸残基の配列で置換するのが
好適である。Asn−Ser,Ser−Asn,Gln−Ser,Ser−Gln,As
n−Gln,Gln−Asn等でLys−Argを置換することが適当で
ある。
テインＣの156及び157番目のアミノ酸配列Lys−Argと異
なるアミノ酸配列を有することを特徴としている。水溶
性及び酸−塩基性の点を考慮すると、リジン−アルギニ
ンをセリン、アスパラギンおよびグルタミンよりなる群
から選ばれる２種のアミノ酸残基の配列で置換するのが
好適である。Asn−Ser,Ser−Asn,Gln−Ser,Ser−Gln,As
n−Gln,Gln−Asn等でLys−Argを置換することが適当で
ある。
本発明のプロテインＣ変異体は、それをコードするDN
Aを用いて遺伝子工学的に製造される。そのDNAは、既に
知られているプロテインＣをコードするDNAの一部を合
成DNA断片で置換して作成することができる。
Aを用いて遺伝子工学的に製造される。そのDNAは、既に
知られているプロテインＣをコードするDNAの一部を合
成DNA断片で置換して作成することができる。
このようにして得られた遺伝子は、発現のためのプロ
モーター等を組み込んで発現ベクターとし常法によって
宿主中で発現させられる。宿主としては、蛋白質のグリ
コシル化、γ−カルボキシル化あるいはβ−ヒドロキシ
化等の翻訳後修飾が可能である真核細胞を用いることが
望ましい。
モーター等を組み込んで発現ベクターとし常法によって
宿主中で発現させられる。宿主としては、蛋白質のグリ
コシル化、γ−カルボキシル化あるいはβ−ヒドロキシ
化等の翻訳後修飾が可能である真核細胞を用いることが
望ましい。
発現のための好ましい宿主細胞はCHO細胞、BHK細胞の
ような動物細胞が挙げられる。遺伝子の組み換え、発現
のために必要とされる機能領域の結合、宿主細胞への形
質転換、発現、生成物の分離精製方法はいかなる方法に
よっても行うことができる。
ような動物細胞が挙げられる。遺伝子の組み換え、発現
のために必要とされる機能領域の結合、宿主細胞への形
質転換、発現、生成物の分離精製方法はいかなる方法に
よっても行うことができる。
発明の効果 本発明で得られる一本鎖型ヒトプロテインＣ変異体は
第Va因子及び第VIIIa因子の失活及びPAIの中和作用を有
し、かつ血液中での活性化が正常の二本鎖型プロテイン
Ｃより遅くその効果が遅効的で延長される。
第Va因子及び第VIIIa因子の失活及びPAIの中和作用を有
し、かつ血液中での活性化が正常の二本鎖型プロテイン
Ｃより遅くその効果が遅効的で延長される。
以下に本発明を実施例によって説明する。本発明の実
施例においては、本発明者等が特願昭62−96341号特許
出願において作成したヒトプロテインＣをコードする遺
伝子及び特願昭62−96340号特許出願において作成した
該遺伝子を組み込んだ発現ベクター並びに蛋白質の遺伝
子工学的な、新しい製造方法を用いた。それらについて
は、参考例として説明されている。なお以下の実施例及
び参考例は、本発明を限定するものではない。
施例においては、本発明者等が特願昭62−96341号特許
出願において作成したヒトプロテインＣをコードする遺
伝子及び特願昭62−96340号特許出願において作成した
該遺伝子を組み込んだ発現ベクター並びに蛋白質の遺伝
子工学的な、新しい製造方法を用いた。それらについて
は、参考例として説明されている。なお以下の実施例及
び参考例は、本発明を限定するものではない。
参考例１（pCs1の構築） 本発明者等は特願昭62−96341号においてヒトプロテ
インＣをコードする1389bpの遺伝子の両端に、EcoR I部
位とSmaI及びHind III部位が付加された遺伝子を得た。
インＣをコードする1389bpの遺伝子の両端に、EcoR I部
位とSmaI及びHind III部位が付加された遺伝子を得た。
この遺伝子は、Foster等がProc.Natl.Acad.Sci.USA.8
2,4673−4677（1985）において発表したヒトプロテイン
Ｃの遺伝子配列をもとにして、コードされるアミノ酸を
変更しない範囲で塩基配列の一部を変更したものであ
る。
2,4673−4677（1985）において発表したヒトプロテイン
Ｃの遺伝子配列をもとにして、コードされるアミノ酸を
変更しない範囲で塩基配列の一部を変更したものであ
る。
この遺伝子をpUC9（ファルマシア社等より市販）より
本発明者等が改良した、pUC9と同じポリリンカー部位
と、Pvu Iを消失せしめたアンピシリン耐性遺伝子を持
つプラスミドベクターの、EcoR IとHind IIIの間に組み
込んでプラスミドpPC1を作成した。このプラスミドは大
腸菌K12/Om225に形質転換し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第1858号（FERM BP−1858）とし
て寄託された。
本発明者等が改良した、pUC9と同じポリリンカー部位
と、Pvu Iを消失せしめたアンピシリン耐性遺伝子を持
つプラスミドベクターの、EcoR IとHind IIIの間に組み
込んでプラスミドpPC1を作成した。このプラスミドは大
腸菌K12/Om225に形質転換し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第1858号（FERM BP−1858）とし
て寄託された。
更に特願昭62−96341号において、このヒトプロテイ
ンＣをコードする遺伝子から、発現ベクターpCs1が構築
された。すなわち、プラスミドpBR322の2.3KbpのPvu II
−EcoR I断片（これはアンピシリン耐性遺伝子及び複製
開始部位を含む）に、SV40アーリープロモーターを含む
断片、遺伝子を挿入するためのポリリンカー及びSV40ア
ーリーmRNAポリアデニレーションサイトを含む断片を結
合させたプラスミドpSVA stop1をポリリンカー内にある
Xba Iサイトで切断しT4DNAポリメラーゼにより平滑末端
とした。次にpPC1をEcoR I及びSma Iで消化し、プロテ
インＣ遺伝子を含む1.4KbpのDNA断片をアガロースゲル
電気泳動により単離精製しT4DNAポリメラーゼにより平
滑末端にした後、先に述べたプラスミドpSVA stop1の平
滑末端にT4DNAリガーゼによりライゲートした。
ンＣをコードする遺伝子から、発現ベクターpCs1が構築
された。すなわち、プラスミドpBR322の2.3KbpのPvu II
−EcoR I断片（これはアンピシリン耐性遺伝子及び複製
開始部位を含む）に、SV40アーリープロモーターを含む
断片、遺伝子を挿入するためのポリリンカー及びSV40ア
ーリーmRNAポリアデニレーションサイトを含む断片を結
合させたプラスミドpSVA stop1をポリリンカー内にある
Xba Iサイトで切断しT4DNAポリメラーゼにより平滑末端
とした。次にpPC1をEcoR I及びSma Iで消化し、プロテ
インＣ遺伝子を含む1.4KbpのDNA断片をアガロースゲル
電気泳動により単離精製しT4DNAポリメラーゼにより平
滑末端にした後、先に述べたプラスミドpSVA stop1の平
滑末端にT4DNAリガーゼによりライゲートした。
組み換えDNAプラスミドを調べてプロテインＣ遺伝子
がSV40アーリープロモーターに対して発現可能な方向に
組み込まれたクローンを選択しpCs1とした。これは大腸
菌K12/Om225に形質転換し微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1473号（FERM BP−1473）として寄託されてお
り、その制限酵素地図は第２図に示されている。
がSV40アーリープロモーターに対して発現可能な方向に
組み込まれたクローンを選択しpCs1とした。これは大腸
菌K12/Om225に形質転換し微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1473号（FERM BP−1473）として寄託されてお
り、その制限酵素地図は第２図に示されている。
参考例２（pCs4の構築） 特願昭62−96340号においては、このpCs1からpCs4が
構築されている。このpCs4はSV40アーリープロモーター
の上流及びポリＡシグナルの下流にBst XIサイトが導入
されている。このBst XIサイトは、Bst XIで切断され
て、その両端に なる非対称的な粘着性末端を生ずるよう工夫されてい
る。そして、このような末端を有する遺伝子を結合させ
るときは必ず同じ方向に結合する。この性質を利用し、
プロテインＣの発現に必要な単位（プロモーター＋プロ
テインＣ遺伝子＋ポリＡシグナル）を多数個同一方向に
結合させたうえ動物細胞に導入して発現させることによ
ってプロテインＣを高収率で生産することができる。pC
s4の製法を以下に略述する。
構築されている。このpCs4はSV40アーリープロモーター
の上流及びポリＡシグナルの下流にBst XIサイトが導入
されている。このBst XIサイトは、Bst XIで切断され
て、その両端に なる非対称的な粘着性末端を生ずるよう工夫されてい
る。そして、このような末端を有する遺伝子を結合させ
るときは必ず同じ方向に結合する。この性質を利用し、
プロテインＣの発現に必要な単位（プロモーター＋プロ
テインＣ遺伝子＋ポリＡシグナル）を多数個同一方向に
結合させたうえ動物細胞に導入して発現させることによ
ってプロテインＣを高収率で生産することができる。pC
s4の製法を以下に略述する。
pCs1をEcoR Iで消化した断片に、化学的に合成された
下記の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
下記の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
〔ｐはライゲーションのために５′末端に結合したリ
ン酸基、□はBst XIの認識部位、↓は同酵素の切断部位
を示す。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたpCs1のEcoR
Iによる切断面と結合するが、EcoR Iサイトが再生しな
い塩基配列としてある。これは次の工程で生ずるEcoR I
サイトがユニークサイトとなるようにするためである。
右側はXho Iによる断面と結合する部分である。
ン酸基、□はBst XIの認識部位、↓は同酵素の切断部位
を示す。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたpCs1のEcoR
Iによる切断面と結合するが、EcoR Iサイトが再生しな
い塩基配列としてある。これは次の工程で生ずるEcoR I
サイトがユニークサイトとなるようにするためである。
右側はXho Iによる断面と結合する部分である。
ライゲーション産物をXho Iで消化した後再びライゲ
ートした。EcoR Iで切断されたpCs1の両端に各１個の合
成オリゴヌクレオチドが結合し、その両端でライゲート
されて（この際Xho Iサイトが生成する）環状のプラス
ミドとなる。
ートした。EcoR Iで切断されたpCs1の両端に各１個の合
成オリゴヌクレオチドが結合し、その両端でライゲート
されて（この際Xho Iサイトが生成する）環状のプラス
ミドとなる。
つぎに、生じたプラスミドをPvu IIで部分消化する。
pCs1中には２つのPvu IIサイトがあるので、両方で切断
されたもの、どちらか一方において切断されたもの、及
び全く切断されなかったものの混合物が得られるので、
アガロースゲルを用いた電気泳動法によりサイズフラク
ショネーションして、SV40アーリープロモーターの上流
に位置するPvu IIのみが切断されたものを単離する。単
離されたDNA鎖に、化学的に合成された下記の化学構造
を有する二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
pCs1中には２つのPvu IIサイトがあるので、両方で切断
されたもの、どちらか一方において切断されたもの、及
び全く切断されなかったものの混合物が得られるので、
アガロースゲルを用いた電気泳動法によりサイズフラク
ショネーションして、SV40アーリープロモーターの上流
に位置するPvu IIのみが切断されたものを単離する。単
離されたDNA鎖に、化学的に合成された下記の化学構造
を有する二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。
〔記号は上記に同じ。右側はEcoR Iによる切断面と結
合する部分である。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたプラスミド
DNA鎖のPvu IIサイトと結合し、Pvu IIサイトは再生し
ない塩基配列としてある。ライゲーション産物をEcoR I
で消化した後、再びライゲートした。Pvu IIで切断され
たプラスミドDNA鎖の両端に各１個の合成オリゴヌクレ
オチドが結合し、この両端でライゲートして（この際Ec
oR Iサイトが生成する）環状のプラスミドとなる。得ら
れたプラスミドをXho I及びEcoR Iで切断し、その断片
をpHSG396（宝酒造（株）から購入。クロラムフェニコ
ール耐性のマーカーを持つ）をXho I及びEcoR Iで切断
したものにクローニングする。このようにして得られた
クロラムフェニコール耐性のプロテインＣ発現ベクター
プラスミドをpCs4と命名した。その制限酵素地図は、第
１図のpCs10と実質上同一である。
合する部分である。〕 オリゴヌクレオチドの左側は、切断されたプラスミド
DNA鎖のPvu IIサイトと結合し、Pvu IIサイトは再生し
ない塩基配列としてある。ライゲーション産物をEcoR I
で消化した後、再びライゲートした。Pvu IIで切断され
たプラスミドDNA鎖の両端に各１個の合成オリゴヌクレ
オチドが結合し、この両端でライゲートして（この際Ec
oR Iサイトが生成する）環状のプラスミドとなる。得ら
れたプラスミドをXho I及びEcoR Iで切断し、その断片
をpHSG396（宝酒造（株）から購入。クロラムフェニコ
ール耐性のマーカーを持つ）をXho I及びEcoR Iで切断
したものにクローニングする。このようにして得られた
クロラムフェニコール耐性のプロテインＣ発現ベクター
プラスミドをpCs4と命名した。その制限酵素地図は、第
１図のpCs10と実質上同一である。
実施例１（pCs10の構築） ヒトプロテインＣの156番目のリジンと157番目のアル
ギニンは、pCs1及びpCs4のプロテインＣ遺伝子の後方の
Bgl IIサイトとSac IIサイトの間に位置している。その
Lys−ArgをAsn−Serに置換するため、５′−末端がBgl
II制限酵素粘着末端、３′−末端がSac II制限酵素粘着
末端である次の合成DNA断片を作成した。
ギニンは、pCs1及びpCs4のプロテインＣ遺伝子の後方の
Bgl IIサイトとSac IIサイトの間に位置している。その
Lys−ArgをAsn−Serに置換するため、５′−末端がBgl
II制限酵素粘着末端、３′−末端がSac II制限酵素粘着
末端である次の合成DNA断片を作成した。
〔下線の部分が接続ペプチドLys−Arg〔AAACGA〕に変
わって導入されたAsn−Ser〔AACTCC〕に対応する。他の
アミノ酸配列は元のものと変わらない。〕 PCNS−α鎖とPCNS−β鎖は、アプライドバイオシステ
ム社製のDNA合成機で合成した。PCNS−α鎖とPCNS−β
鎖を40nmoleずつ凍結乾燥し、160μｌのH2Oに溶かし、
おのおの16μｌをとり10倍濃度のPNKバッファー（500mM
Tris−Cl,pH7.6,100mM MgCl2,10mM 2−mercaptoethano
l,25mM ATP）２μｌ、続いて２μｌのT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ５ユニットを加え37℃１時間反応させた。両
反応液から10μｌとり混合し65℃10分間放置後45分かけ
て徐々に室温に戻しアニーリングさせた。
わって導入されたAsn−Ser〔AACTCC〕に対応する。他の
アミノ酸配列は元のものと変わらない。〕 PCNS−α鎖とPCNS−β鎖は、アプライドバイオシステ
ム社製のDNA合成機で合成した。PCNS−α鎖とPCNS−β
鎖を40nmoleずつ凍結乾燥し、160μｌのH2Oに溶かし、
おのおの16μｌをとり10倍濃度のPNKバッファー（500mM
Tris−Cl,pH7.6,100mM MgCl2,10mM 2−mercaptoethano
l,25mM ATP）２μｌ、続いて２μｌのT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ５ユニットを加え37℃１時間反応させた。両
反応液から10μｌとり混合し65℃10分間放置後45分かけ
て徐々に室温に戻しアニーリングさせた。
一方pCs4をCla I及びXba Iで消化して得られた356bp
の断片（上記のBgl IIサイト、Sac IIサイトを含む）を
pHSG396（Takeshita et al,Gene,61,63−74（1987））
にサブクローニングし、p396pCC1−Xb/5と名付けた。こ
れをBgl II及びSac IIで消化し、上記で合成したDNA断
片をライゲートした。ついでこのようにして得られたプ
ラスミドからCla I−Xba I断片を切り出し、もとのpCs4
の同断片を置換してプラスミドpCs10を作成した。
の断片（上記のBgl IIサイト、Sac IIサイトを含む）を
pHSG396（Takeshita et al,Gene,61,63−74（1987））
にサブクローニングし、p396pCC1−Xb/5と名付けた。こ
れをBgl II及びSac IIで消化し、上記で合成したDNA断
片をライゲートした。ついでこのようにして得られたプ
ラスミドからCla I−Xba I断片を切り出し、もとのpCs4
の同断片を置換してプラスミドpCs10を作成した。
pCs10は、接続ジペプチドLys−ArgがAsn−Serに転換
したプロテインＣ変異体をコードし発現するプラスミド
である。その制限酵素地図は第１図に示されている。
したプロテインＣ変異体をコードし発現するプラスミド
である。その制限酵素地図は第１図に示されている。
pCs10に含まれているプロテインＣ変異体をコードす
るDNA配列とそのアミノ酸配列は表１に示されている。
るDNA配列とそのアミノ酸配列は表１に示されている。
参考例３（pHSG293の構築） 特願昭62−96340号においては、選択マーカーとして
のネオ遺伝子を有し、pCs10と同じ非対称性粘着性末端
を生ずるBst XIの認識部位を有するpHSG293が構築され
ている。これは先に説明したpCs10より得られるプロテ
インＣの変異体の発現に必要な単位と両者の転写方向が
同一方向に結合させることによって、意図する遺伝子が
導入された形質転換株を選択することを可能にするもの
である。以下にpHSG293の製法を以下に略述する。
のネオ遺伝子を有し、pCs10と同じ非対称性粘着性末端
を生ずるBst XIの認識部位を有するpHSG293が構築され
ている。これは先に説明したpCs10より得られるプロテ
インＣの変異体の発現に必要な単位と両者の転写方向が
同一方向に結合させることによって、意図する遺伝子が
導入された形質転換株を選択することを可能にするもの
である。以下にpHSG293の製法を以下に略述する。
大腸菌の中ではカナマイシン耐性を示し、真核細胞中
ではG418（ジェネテイシン）耐性を示すネオ遺伝子が組
み込まれているコスミドベクターであって、ATCCに3730
1として寄託されているpHSG274をBst XIで消化すると次
のフローシートに示したように切断される。
ではG418（ジェネテイシン）耐性を示すネオ遺伝子が組
み込まれているコスミドベクターであって、ATCCに3730
1として寄託されているpHSG274をBst XIで消化すると次
のフローシートに示したように切断される。
ついで、その切断された断片をフローシートに示した
合成オリゴヌクレオチドとライゲートする。その結果Bs
t XIは消滅する。ついでHind IIIで消化すると、コスミ
ドベクターに含まれているHind III−Bst XI部分及び反
復結合した余分の合成フラグメントが除去される。この
ようにして得られたものをライゲートした。合成オリゴ
ヌクレオチドの左側がコスミドベクター中のHind IIIで
切断された切断面と結合した環状プラスミドが得られ
る。
合成オリゴヌクレオチドとライゲートする。その結果Bs
t XIは消滅する。ついでHind IIIで消化すると、コスミ
ドベクターに含まれているHind III−Bst XI部分及び反
復結合した余分の合成フラグメントが除去される。この
ようにして得られたものをライゲートした。合成オリゴ
ヌクレオチドの左側がコスミドベクター中のHind IIIで
切断された切断面と結合した環状プラスミドが得られ
る。
なお、合成オリゴヌクレオチド中のXba IはpHSG274と
pHSG293を分別するために導入されたものである。合成
オリゴヌクレオチド中のlacオペレーターは、コスミド
パッケージング後にカナマイシンによる選択と同時に、
Ｘ−gal存在下にブルーコロニーとなる形質転換株を識
別することを可能とする。
pHSG293を分別するために導入されたものである。合成
オリゴヌクレオチド中のlacオペレーターは、コスミド
パッケージング後にカナマイシンによる選択と同時に、
Ｘ−gal存在下にブルーコロニーとなる形質転換株を識
別することを可能とする。
このプラスミドをpHSG293と命名した。その制限酵素
地図は第３図に示されている。
地図は第３図に示されている。
以下の実施例においては、pCs10より得られるプロテ
インＣ変異体の発現用遺伝子とpHSG293から得られるネ
オ遺伝子とをBst XIの非対称性の粘着性末端を利用して
同一方向に多数個結合させた。
インＣ変異体の発現用遺伝子とpHSG293から得られるネ
オ遺伝子とをBst XIの非対称性の粘着性末端を利用して
同一方向に多数個結合させた。
ついで、この直鎖状の遺伝子を、ファージ粒子でイン
ビトロパッケージングし、大腸菌に感染させた。これを
ネオ遺伝子に由来するカナマイシン耐性の選択マーカー
を利用して選択し、得られたコロニーから目的の組み換
え体コスミドDNAをもったものを選択した。このように
して得られた組み換え体コスミドDNAを常法に従ってCHO
細胞及びBHK細胞に導入し、ネオ遺伝子に由来するG418
耐性を利用して選択する。このようにして得られる上記
細胞はその培養プロテインＣ変異体を効率良く生産し
た。
ビトロパッケージングし、大腸菌に感染させた。これを
ネオ遺伝子に由来するカナマイシン耐性の選択マーカー
を利用して選択し、得られたコロニーから目的の組み換
え体コスミドDNAをもったものを選択した。このように
して得られた組み換え体コスミドDNAを常法に従ってCHO
細胞及びBHK細胞に導入し、ネオ遺伝子に由来するG418
耐性を利用して選択する。このようにして得られる上記
細胞はその培養プロテインＣ変異体を効率良く生産し
た。
実施例２ 一本鎖変異型プロテインＣ発現単位断片の試験管内で
のタンデム増幅及び大腸菌細胞内での大量調製 実施例１で述べられた、pCs10DNAをBst XIで消化する
と、2.2Kbの大きさのDNA断片と2.1Kb大きさのベクター
部分の断片が生じるので、両断片を分離精製することは
実際上不可能である。そのため、pCs10DNAを一度EcoR I
制限酵素で消化開裂し4.3Kbの線状DNAにした後、このEc
oR IサイトにEcoR Iで同様に開裂した約9.1KbのpHSG11
を挿入した（pHSG11はpHSG1の派生体でその単一のBst X
IサイトがDNAポリメレースで破壊されている。pHSG1はp
SC101の温度感受性変異体でT.Hashimoto−Gotoh and M.
Sekiguchi,J.Bacteriology,131,405−412,（1977）に記
載されている。）。この結果できたプラスミドは13.4Kb
のサイズで11.2Kbのベクター断片と2.2Kbのプロテイン
Ｃの発現断片を含み、前者のDNA断片はpCs10由来のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子とpHSG11由来のテトラサイ
クリン耐性遺伝子をコードする。これを、pCs11と名付
けた。pCs11DNAをBst XIサイト消化し、0.7％アガロー
スゲル電気泳動で分離し、目的とする2.2Kb断片を切り
出し精製した。このDNA断片2.0μｇを、同じくBst XI消
化しカーフインテスティンアルカリフォスターゼ（calf
intestine alkaline phosphatase）処理した0.1μｇの
pHSG293コスミドDNA断片と混合し５ユニットのT4DNAリ
ガーゼを含む10μｌの反応溶液中で12℃にて一夜連結反
応を行った。
のタンデム増幅及び大腸菌細胞内での大量調製 実施例１で述べられた、pCs10DNAをBst XIで消化する
と、2.2Kbの大きさのDNA断片と2.1Kb大きさのベクター
部分の断片が生じるので、両断片を分離精製することは
実際上不可能である。そのため、pCs10DNAを一度EcoR I
制限酵素で消化開裂し4.3Kbの線状DNAにした後、このEc
oR IサイトにEcoR Iで同様に開裂した約9.1KbのpHSG11
を挿入した（pHSG11はpHSG1の派生体でその単一のBst X
IサイトがDNAポリメレースで破壊されている。pHSG1はp
SC101の温度感受性変異体でT.Hashimoto−Gotoh and M.
Sekiguchi,J.Bacteriology,131,405−412,（1977）に記
載されている。）。この結果できたプラスミドは13.4Kb
のサイズで11.2Kbのベクター断片と2.2Kbのプロテイン
Ｃの発現断片を含み、前者のDNA断片はpCs10由来のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子とpHSG11由来のテトラサイ
クリン耐性遺伝子をコードする。これを、pCs11と名付
けた。pCs11DNAをBst XIサイト消化し、0.7％アガロー
スゲル電気泳動で分離し、目的とする2.2Kb断片を切り
出し精製した。このDNA断片2.0μｇを、同じくBst XI消
化しカーフインテスティンアルカリフォスターゼ（calf
intestine alkaline phosphatase）処理した0.1μｇの
pHSG293コスミドDNA断片と混合し５ユニットのT4DNAリ
ガーゼを含む10μｌの反応溶液中で12℃にて一夜連結反
応を行った。
このようにしてできたライゲーションプロダクツ５μ
ｌをとり、Strategene社製のインビトロパッケイジング
キットを用いてラムダファージ粒子の中にパッケージし
た。反応は、同社のマニュアルにある指示に従って行っ
た。このファージ粒子を大腸菌Ｋ−12株のDH−１細胞に
感染させ、25μg/mlのカナマイシンを含む寒天培地上で
成育させた。生じたコロニーをカナマイシンを含む100m
l液体培地にうつし一夜37℃で更に成育させ菌細胞を回
収しプラスミドDNAを標準的な方法で大量精製し約10μ
ｇの環状DNAを得た。この環状DNAは分子の大きさが約45
KbありこれをBst XIで消化しアガロースゲル電気泳動上
で発現断片とコスミッド断片に分離しそれぞれのDNA断
片の大きさとバンドの濃さの比から計算して８コピーの
発現断片が含まれていたものを選びpCNS701と名付け
た。pCNS701は一本鎖変異型のプロテインＣを動物細胞
で発現する遺伝子のほかにコスミドベクターpHSG293由
来の抗生物質G418耐性の遺伝子を有する。
ｌをとり、Strategene社製のインビトロパッケイジング
キットを用いてラムダファージ粒子の中にパッケージし
た。反応は、同社のマニュアルにある指示に従って行っ
た。このファージ粒子を大腸菌Ｋ−12株のDH−１細胞に
感染させ、25μg/mlのカナマイシンを含む寒天培地上で
成育させた。生じたコロニーをカナマイシンを含む100m
l液体培地にうつし一夜37℃で更に成育させ菌細胞を回
収しプラスミドDNAを標準的な方法で大量精製し約10μ
ｇの環状DNAを得た。この環状DNAは分子の大きさが約45
KbありこれをBst XIで消化しアガロースゲル電気泳動上
で発現断片とコスミッド断片に分離しそれぞれのDNA断
片の大きさとバンドの濃さの比から計算して８コピーの
発現断片が含まれていたものを選びpCNS701と名付け
た。pCNS701は一本鎖変異型のプロテインＣを動物細胞
で発現する遺伝子のほかにコスミドベクターpHSG293由
来の抗生物質G418耐性の遺伝子を有する。
実施例３ 変異体蛋白質の動物細胞における生産とそのプロテイ
ンＣ様活性の確認 試験管内でタンデム増幅された遺伝子発現単位断片DN
Aを分子あたり８コピー含むpCNS701コスミドDNAを新生
仔ハムスター腎細胞（BHK）及びチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞（CH0−dhfr-）へ以下のように導入した。即
ち、上記細胞１×106個を100mmの直径の組織培養皿（フ
ァルコン社製,3001）にBHK細胞の場合はダルベッコー修
正培養液（DME、10％非働化処理牛胎児血清及び40μg/m
lプロリンを含有）またはCHO細胞の場合はヌクレオシド
類を含む最少必須培養液（MEM＋α、10％非働化処理牛
胎児血清を含有）8ml中において、37℃、５％CO2/95％
空気の気相下において20時間程加温し、20％程度のコン
フルエンス密度となるまで増殖させた。この培養皿１枚
分を形質転換するため、７μｇのpCNS701を900μｌの14
0mM NaCl,0.75mM NaHPO4,25mM HEPES（pH7.1）に溶か
し、60μｌの2M CaCl2を加え撹拌し室温に30分間放置し
た。これを、960μｌ取り、直接上記培養皿内の培養液
中に滴下し37℃,24時間加温してDNAを細胞内に導入し
た。次に、培養液を新鮮な培養液8mlと交換し更に18時
間培養した。導入後計42時間後に細胞をトリプシン/EDT
A処理によって回収し、これを10枚の培養皿に均等に分
配し400μg/mlのG418（Gibco社製）を含む8mlの同様の
培養液中で７〜14日間培養した。ここで、pCNS701DNA1
μｇあたりBHK細胞では85個、CHO細胞では57個のG418耐
性のコロニーを得た。各コロニーは単離してクローン化
した後、１×106個の細胞を0.1μg/mlのビタミンＫを含
む培養液を含む、60mmの直径の組織培養皿（ファルコン
社製,3002）に移し、24時間インキュベーション後に細
胞がコンフルエントになった時新鮮な0.1μg/mlのビタ
ミンＫを含む培養液と交換し、更に24時間培養後培養液
上清を回収し組換え蛋白質の生産量を羊の抗ヒトプロテ
インＣ抗体を使ったELISA法で以下のように測定した。
ンＣ様活性の確認 試験管内でタンデム増幅された遺伝子発現単位断片DN
Aを分子あたり８コピー含むpCNS701コスミドDNAを新生
仔ハムスター腎細胞（BHK）及びチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞（CH0−dhfr-）へ以下のように導入した。即
ち、上記細胞１×106個を100mmの直径の組織培養皿（フ
ァルコン社製,3001）にBHK細胞の場合はダルベッコー修
正培養液（DME、10％非働化処理牛胎児血清及び40μg/m
lプロリンを含有）またはCHO細胞の場合はヌクレオシド
類を含む最少必須培養液（MEM＋α、10％非働化処理牛
胎児血清を含有）8ml中において、37℃、５％CO2/95％
空気の気相下において20時間程加温し、20％程度のコン
フルエンス密度となるまで増殖させた。この培養皿１枚
分を形質転換するため、７μｇのpCNS701を900μｌの14
0mM NaCl,0.75mM NaHPO4,25mM HEPES（pH7.1）に溶か
し、60μｌの2M CaCl2を加え撹拌し室温に30分間放置し
た。これを、960μｌ取り、直接上記培養皿内の培養液
中に滴下し37℃,24時間加温してDNAを細胞内に導入し
た。次に、培養液を新鮮な培養液8mlと交換し更に18時
間培養した。導入後計42時間後に細胞をトリプシン/EDT
A処理によって回収し、これを10枚の培養皿に均等に分
配し400μg/mlのG418（Gibco社製）を含む8mlの同様の
培養液中で７〜14日間培養した。ここで、pCNS701DNA1
μｇあたりBHK細胞では85個、CHO細胞では57個のG418耐
性のコロニーを得た。各コロニーは単離してクローン化
した後、１×106個の細胞を0.1μg/mlのビタミンＫを含
む培養液を含む、60mmの直径の組織培養皿（ファルコン
社製,3002）に移し、24時間インキュベーション後に細
胞がコンフルエントになった時新鮮な0.1μg/mlのビタ
ミンＫを含む培養液と交換し、更に24時間培養後培養液
上清を回収し組換え蛋白質の生産量を羊の抗ヒトプロテ
インＣ抗体を使ったELISA法で以下のように測定した。
アフィニティ精製したヒトプロテインＣに対する羊の
ポリクローナル抗体（５μｇ蛋白質/ml）を96穴マイク
ロタイタープレート（Patra社製）の各穴に50μｌづつ
入れ、室温で１時間放置した。次に、PBS（phosphate b
uffered saline,pH7.2）中に１％牛血清アルブミン（BS
A）を含む250μｌの溶液を各穴に加え更に室温、30分間
放置後、各穴の溶液を吸引除去し次いでPBSで４回洗浄
したのち空気乾燥後４℃に保存した。この抗体でコート
された上記テストプレートの各穴に上記上清サンプル液
40μｌを投じ、室温、１時間放置した。次いでサンプル
液を吸引除去し200μlPBSで４回洗浄後西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRP）標識の羊抗ヒトプロテインＣ抗体4
0μｌを各穴に投じ室温１時間放置した。抗体を除去しP
BSで４回洗浄後1mg/ml orthophenyldiamine（OPD）、0.
006％H2O2を含む、クエン酸緩衝液50μｌを各穴に投じ
室温10〜15分間放置後、赤褐色の生成をELISAプレート
リーダー装置（ダイナテック社製）で測定した。第２表
に示されたG418形質転換体のうち約47％が0.5μg/ml以
上のプロテインＣ産生量を示した。特に、BHK細胞由来
のＢ−７クローンとCHO細胞由来のＣ−５クローンでは
それぞれ0.74μg/mlと0.94μg/mlの産生を示した。
ポリクローナル抗体（５μｇ蛋白質/ml）を96穴マイク
ロタイタープレート（Patra社製）の各穴に50μｌづつ
入れ、室温で１時間放置した。次に、PBS（phosphate b
uffered saline,pH7.2）中に１％牛血清アルブミン（BS
A）を含む250μｌの溶液を各穴に加え更に室温、30分間
放置後、各穴の溶液を吸引除去し次いでPBSで４回洗浄
したのち空気乾燥後４℃に保存した。この抗体でコート
された上記テストプレートの各穴に上記上清サンプル液
40μｌを投じ、室温、１時間放置した。次いでサンプル
液を吸引除去し200μlPBSで４回洗浄後西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRP）標識の羊抗ヒトプロテインＣ抗体4
0μｌを各穴に投じ室温１時間放置した。抗体を除去しP
BSで４回洗浄後1mg/ml orthophenyldiamine（OPD）、0.
006％H2O2を含む、クエン酸緩衝液50μｌを各穴に投じ
室温10〜15分間放置後、赤褐色の生成をELISAプレート
リーダー装置（ダイナテック社製）で測定した。第２表
に示されたG418形質転換体のうち約47％が0.5μg/ml以
上のプロテインＣ産生量を示した。特に、BHK細胞由来
のＢ−７クローンとCHO細胞由来のＣ−５クローンでは
それぞれ0.74μg/mlと0.94μg/mlの産生を示した。
次に、プロテインＣの生理学的活性を調べるため、ヒ
トプロテインＣ抗血液凝固活性定量キット（ベーリング
ベルケ社製,Cat.No.2576,2577,OTXA11）を用いて、上記
培養液上清のプロテインＣ様活性を調べた。その結果、
クローンＢ−７とＣ−５では、対照に用いたヒト血漿の
2.7％及び11.0％の活性が見られた。
トプロテインＣ抗血液凝固活性定量キット（ベーリング
ベルケ社製,Cat.No.2576,2577,OTXA11）を用いて、上記
培養液上清のプロテインＣ様活性を調べた。その結果、
クローンＢ−７とＣ−５では、対照に用いたヒト血漿の
2.7％及び11.0％の活性が見られた。
実施例４ 変異型組換え体ヒトプロテインＣの一本鎖状態の確認 クローンＢ−７とＣ−５の形質転換細胞を60mmの直径
の組織培養皿（ファルコン社製,3002）１枚あたり１×1
06細胞となるように播き前記のウシ血清を含む培養液中
でコンフルエント密度になるまで３〜４日間培養した
後、培養皿を血清のない培養液にて２回洗い、さらに同
培養液の中で24時間培養した。この培養上清1mlを取り3
33μｌの100％トリクロロ酢酸を加え撹拌後０℃で30分
間放置しエッペンドルフ卓上遠心機で室温で15分間遠心
沈澱させる。この沈澱物を20μｌのサンプルバッファー
（65mM Tris−HCl,pH6.8,3％SDS,10％ Glycerol,2％ 2
−mercaptoethanol,0.004％ Bromophenol blue）に溶か
し約１μｌの飽和したトリズマベース液を加えてpHを7.
0〜7.5に調整する。この20μｌの懸濁液は0.5〜１μｇ
の蛋白質を含有する。これを10％ SDS−PAGEによる電気
泳動にかけ、25mMトリス−192mMグリシン（pH8.3）−20
％エタノール中で電気泳動的にナイロンフィルターに吸
着させ、ウエスタンブロッティング（Western blottin
g）を行った。フィルターは、その後３％ゼラチンを含
む20mM Tris−HCl（pH7.5）−500mM NaCl中で、室温、6
0分間固定した後、一次抗体としてヤギ抗ヒトプロテイ
ンＣ抗体、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）標識したウサギ抗ヤギIgG抗体を用いた間接法に
より、ヒトプロテインＣを特異的に染色した。２−merc
aptoethanolによる還元処理を施した試料の場合、ヒト
血漿由来のプロテインＣでは、Ｈ−鎖のα鎖，β鎖に対
応する分子量40Kダルトン付近の２本のバンドとＬ−鎖
に対応する分子量21Kダルトンのバンドが主に認めら
れ、Ｈ−鎖とＬ−鎖がつながった62Kダルトンの一本鎖
プロテインＣのバンドは僅かにみとめられるにすぎな
い。この発明で得られた、Ｂ−7,C−５株では、いずれ
の場合も、分子量62Kダルトンのバンドのみが認めら
れ、Ｈ−鎖、Ｌ−鎖に相当するバンドは認められなかっ
た（第４図レーン１と２参照）。これらの結果は、血漿
由来のヒトプロテインＣ及びCHO細胞で生産された組換
えヒトプロテインＣではＨ−鎖とＬ−鎖の接続ペプチド
がLys−Argであるのに対し、BHK細胞、CHO細胞で生産さ
れた該組換え体変異型ヒトプロテインＣは接続ペプチド
がAsn−Serに置換されたためプロテアーゼによって消化
されなくなったと解釈される。
の組織培養皿（ファルコン社製,3002）１枚あたり１×1
06細胞となるように播き前記のウシ血清を含む培養液中
でコンフルエント密度になるまで３〜４日間培養した
後、培養皿を血清のない培養液にて２回洗い、さらに同
培養液の中で24時間培養した。この培養上清1mlを取り3
33μｌの100％トリクロロ酢酸を加え撹拌後０℃で30分
間放置しエッペンドルフ卓上遠心機で室温で15分間遠心
沈澱させる。この沈澱物を20μｌのサンプルバッファー
（65mM Tris−HCl,pH6.8,3％SDS,10％ Glycerol,2％ 2
−mercaptoethanol,0.004％ Bromophenol blue）に溶か
し約１μｌの飽和したトリズマベース液を加えてpHを7.
0〜7.5に調整する。この20μｌの懸濁液は0.5〜１μｇ
の蛋白質を含有する。これを10％ SDS−PAGEによる電気
泳動にかけ、25mMトリス−192mMグリシン（pH8.3）−20
％エタノール中で電気泳動的にナイロンフィルターに吸
着させ、ウエスタンブロッティング（Western blottin
g）を行った。フィルターは、その後３％ゼラチンを含
む20mM Tris−HCl（pH7.5）−500mM NaCl中で、室温、6
0分間固定した後、一次抗体としてヤギ抗ヒトプロテイ
ンＣ抗体、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）標識したウサギ抗ヤギIgG抗体を用いた間接法に
より、ヒトプロテインＣを特異的に染色した。２−merc
aptoethanolによる還元処理を施した試料の場合、ヒト
血漿由来のプロテインＣでは、Ｈ−鎖のα鎖，β鎖に対
応する分子量40Kダルトン付近の２本のバンドとＬ−鎖
に対応する分子量21Kダルトンのバンドが主に認めら
れ、Ｈ−鎖とＬ−鎖がつながった62Kダルトンの一本鎖
プロテインＣのバンドは僅かにみとめられるにすぎな
い。この発明で得られた、Ｂ−7,C−５株では、いずれ
の場合も、分子量62Kダルトンのバンドのみが認めら
れ、Ｈ−鎖、Ｌ−鎖に相当するバンドは認められなかっ
た（第４図レーン１と２参照）。これらの結果は、血漿
由来のヒトプロテインＣ及びCHO細胞で生産された組換
えヒトプロテインＣではＨ−鎖とＬ−鎖の接続ペプチド
がLys−Argであるのに対し、BHK細胞、CHO細胞で生産さ
れた該組換え体変異型ヒトプロテインＣは接続ペプチド
がAsn−Serに置換されたためプロテアーゼによって消化
されなくなったと解釈される。
第１図はpCs10の制限酵素地図である。 第２図はpCs1の制限酵素地図である。 第３図はpHSG293の制限酵素地図である。 第４図は動物細胞の培養上清中に生産されたヒトプロテ
インＣ変異体のウエスタンブロッティングのパターンで
ある。 レーン1:B−７株の培養液上清 レーン2:C−５株の培養液上清 レーン3:ヒト血漿から精製したプロテインＣ レーンM:蛋白分子量マーカー （上から97Kd,68Kd,43Kd及び25Kdと18Kdの融合したバン
ド）
インＣ変異体のウエスタンブロッティングのパターンで
ある。 レーン1:B−７株の培養液上清 レーン2:C−５株の培養液上清 レーン3:ヒト血漿から精製したプロテインＣ レーンM:蛋白分子量マーカー （上から97Kd,68Kd,43Kd及び25Kdと18Kdの融合したバン
ド）
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】天然のヒトプロテインＣの156および157番
目のアミノ酸配列リジン−アルギニンがセリン、アスパ
ラギンおよびグルタミンよりなる群から選ばれる２種の
アミノ酸残基の配列で置き換えられていることを特徴と
する一本鎖のヒトプロテインＣ変異体。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列リジン−アルギニンがア
スパラギン−セリンで置き換えられている請求項１記載
のヒトプロテインＣ変異体。 - 【請求項３】請求項１記載のヒトプロテインＣ変異体を
コードするDNA。 - 【請求項４】請求項３記載のDNAを用いるヒトプロテイ
ンＣ変異体の遺伝子工学的製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18453888 | 1988-07-26 | ||
| JP63-184538 | 1988-07-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02167096A JPH02167096A (ja) | 1990-06-27 |
| JP2728240B2 true JP2728240B2 (ja) | 1998-03-18 |
Family
ID=16154955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1179140A Expired - Lifetime JP2728240B2 (ja) | 1988-07-26 | 1989-07-13 | ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2728240B2 (ja) |
| KR (1) | KR910003095A (ja) |
| AU (1) | AU3890689A (ja) |
| DK (1) | DK366589A (ja) |
| FI (1) | FI893545A (ja) |
| IE (1) | IE892412L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0506821B1 (en) * | 1989-12-29 | 1998-02-04 | Zymogenetics, Inc. | Hybrid protein c |
| IL97311A0 (en) * | 1990-02-23 | 1992-05-25 | Lilly Co Eli | Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c |
| US20010006967A1 (en) * | 1992-09-21 | 2001-07-05 | Stanley M. Crain | Method of simultaneously enhancing analgesic potency and attenuating adverse side effects caused by tramadol and other bimodally-acting opioid agonists |
| SV1999000067A (es) * | 1998-06-01 | 2000-07-06 | Lilly Co Eli | Proteina humana c polipeptida ref. x-12279 |
| AU1751801A (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-30 | Eli Lilly And Company | Protein c derivatives |
| KR100576180B1 (ko) * | 2002-07-27 | 2006-05-03 | 주식회사 한화 | 비폭발성 에멀젼 조성물 |
| AU2003280316A1 (en) * | 2002-11-11 | 2004-06-03 | Maxygen Aps | Zymogen-like protein c polypeptides |
| WO2023119230A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | L'oreal | Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use |
| KR20230101310A (ko) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 주식회사 한화 | 저비중 에멀젼 폭약 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| EP0215548B2 (en) * | 1985-06-27 | 1998-01-07 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| PT87688B (pt) * | 1987-06-12 | 1992-09-30 | Hoechst Japan | Processo para a preparacao de proteina hibrida c |
-
1989
- 1989-07-13 JP JP1179140A patent/JP2728240B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-21 EP EP89113414A patent/EP0352651A1/en not_active Withdrawn
- 1989-07-24 FI FI893545A patent/FI893545A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-07-25 KR KR1019890010508A patent/KR910003095A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-07-25 DK DK366589A patent/DK366589A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-07-25 PT PT91268A patent/PT91268A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-07-25 AU AU38906/89A patent/AU3890689A/en not_active Abandoned
- 1989-07-25 IE IE892412A patent/IE892412L/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK366589A (da) | 1990-01-27 |
| FI893545A0 (fi) | 1989-07-24 |
| PT91268A (pt) | 1990-02-08 |
| AU3890689A (en) | 1990-02-01 |
| IE892412L (en) | 1990-01-26 |
| JPH02167096A (ja) | 1990-06-27 |
| FI893545A (fi) | 1990-01-27 |
| DK366589D0 (da) | 1989-07-25 |
| EP0352651A1 (en) | 1990-01-31 |
| KR910003095A (ko) | 1991-02-26 |
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