JP3045307B2

JP3045307B2 - 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法

Info

Publication number: JP3045307B2
Application number: JP2512234A
Authority: JP
Inventors: アショクカマー，アナー; シー．フォスター，ドナルド
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1990-08-07
Publication date: 2000-05-29
Anticipated expiration: 2015-05-29
Also published as: CA2064774C; DE69004964T2; EP0485504B1; AU6295390A; IE66340B1; ES2047946T3; DE69004964D1; ATE97958T1; DK0485504T3; CA2064774A1; JPH04507347A; EP0485504A1; WO1991002065A1; IE902912A1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、一般的に血漿タンパク質及びそれらのタン
パク質の生成方法、及びより特定には、ヒト活性化プロ
テインＣと同じ生物学的活性を実質的に有するタンパク
質を生成するための細胞培養方法に関する。

発明の背景プロテインＣは、血液凝集の調節及びインビボでの
繊維素溶解性活性の生成に重要な役割を演じるセリンプ
ロテアーゼのチモーゲン又は前駆体である。それは、ジ
スルフィド結合により一緒に保持されているＨ鎖（Mr＝
40,000）及びＬ鎖（Mr＝21,000）を含んで成る二本鎖分
子を発生するための相当のプロセッシングを受ける一本
鎖ポリペプチドとして肝臓において合成される。循環性
二本鎖中間体は、Ｈ鎖のアミノ末端から12−残基ペプチ
ド（活性化ペプチドとしても知られている）のトロンビ
ン介在切断により、“活性化プロテインC"（APC）とし
て知られる分子の生物学的活性形に転換される。切断反
応は、トロンボモジュリン、すなわち内皮細胞補因子に
よりインビボで増強される（Esmon and Owen,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78:2249〜2252,1981）。

プロテインＣは、それぞれグルタミン酸及びアスパラ
ギン酸の翻訳後変性により形成される、γ−カルボキシ
グルタミン酸（Gla）の約９個の残基及びβ−ヒドロキ
シアスパラギン酸の１つの残基を含む糖タンパク質であ
る。プロテインＣにおける特定のγ−カルボキシグルタ
ミン酸残基の翻訳後変性は、ビタミンＫを必要とする。
これらのまれなアミノ酸残基は、カルシウムイオンに結
合し、そしてプロテインＣの生物学的活性のために必要
とされる、プロテインＣとリン脂質との相互作用を担当
するように思われる。

他のビタミンＫ−依存性血漿タンパク質、たとえば第
VII因子、第IX因子及び第Ｘ因子の凝集促進作用に対し
て対照的に、活性化プロテインＣは、限定されたタンパ
ク質加水分解による第V a因子及び第VIII a因子の不活
性化を通して凝集工程の調節物として作用する。APCに
よる第V a及び第VIII a因子の不活性化は、酸性リン脂
質及びカルシウムイオンに依存する。プロテインＳは、
第V a因子のAPC−触媒されたタンパク質加水分解を促進
することによって、この活性を調節することが報告され
ている（Walker,J.Biol.Chem.255:5521〜5524,1980）。

プロテインＣはまた、組織タイプのプラスミノーゲン
活性化因子の作用に包含されて来た（Kisiel and Fujik
awa,Behring Inst.Mitl.73:29〜42,1983）。犬へのウシ
APCの注入は、高められたプラスミノーゲン活性化因子
活性をもたらす（Comp and Esmon,J.Chin.Invest.68:12
21〜1228,1981）。他の研究（Sakataなど.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 82:1121〜1125,1985）は、培養された内
皮細胞へのAPCの添加が、ウロキナーゼ関連及び組織タ
イププラスミノーゲン活性化因子の両者の活性の上昇に
影響を及ぼす、ならし培地における繊維素溶解性活性の
急速な投与量依存性上昇を導びくことを示した。APC処
理はまた、抗−活性化因子の活性の投与量依存性上昇を
もたらす。

実験証拠は、活性化されたプロテインＣが血栓症の処
理に臨床的に有用であることを示す。APCの使用は、プ
ロテインＣのインビボ活性化の必要性を回避し、従っ
てより早く作用する治療剤を提供する。

さらに、外因性活性化プロテインＣは、グラム陰性敗
血症の凝固障害及び致死効果を妨げることが明らかにさ
れた（Jaylorなど、J.Clin.Invest.79:918〜925,198
7）。ヒヒによる研究から得られたデータは、活性化さ
れたプロテインＣが敗血症に対する保護において生得の
役割を演じることを示唆する。

プロテインＣは、凝血因子濃縮物（Marlarなど.,Bloo
d 59:1067〜1072,1982）又は血漿（Kisiel,J.Clin.Inv
est.64:761〜769,1979）から精製され、そしてインビ
トロで活性化されるが、しかしこれは複雑で、且つ高価
な工程であり、そして得られた生成物は、感染性物質、
たとえば肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス又はヒト
免疫欠損ウィルス（HIV）により汚染され得る。つい最
近、組換えDNA技法による活性化されたプロテインＣの
生成方法が記載されている。Fosterなど．（公開された
ヨーロッパ特許出願EP215,548）は、活性ペプチドのた
めのコード配列が欠失されているプロテインC DNA配列
によりトランスフェクトされた培養哺乳類細胞の使用に
よる活性化プロテインＣの生成を開示する。Fosterな
ど．（EP266,190）は、変性された切断部位を有するAPC
前駆体をコードするDNA配列を用いて、組換え活性化プ
ロテインＣの生成を開示する。

遺伝子工学の使用により可能にされた活性化プロテイ
ンＣ生成の前進にもかかわらず、収量は低いままであ
り、そしてタンパク質は、生成工程の間、分解及び／又
は不活性化を受ける。従って、損われていない生物学的
に活性な活性化プロテインＣのより高いレベルで生成を
可能にする方法の必要性が当業界において存在する。

発明の開示手短に言及すれば、本発明は、活性化プロテインＣの
生成方法を開示する。その方法は一般的に、培養培地
（該培地は0.1％よりも高くない血清を含む）におい
て、活性化プロテインＣをコードするDNA配列に操作可
能に結合される転写プロモーターを含んで成る発現ベク
ターにより安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞
を培養し、そしてその細胞により生成された活性化プロ
テインＣを単離することを含んで成る。１つの態様にお
いて、培地は実質的に血清を含まない。

１つの観点において、DNA配列は、活性化プロテイン
ＣのＬ鎖とＨ鎖との間に、アミノ酸配列R₁−R₂−R₃−R₄
−Ｘ−R₅−R₆−R₇−R₈（ここで個々のR₁〜R₈は、リシン
又はアルギニンであり、そしてＸは１〜12個のアミノ酸
のペプチド結合又はスペーサーペプチドである）をさら
にコードする。

もう１つの観点において、DNA配列は、活性化プロテ
インＣのＬ鎖とＨ鎖との間にアミノ酸配列、（R₁）_ｎ−
R₂−R₃−R₄（ここで個々のR₁,R₂,R₃及びR₄はLys又はArg
であり、そしてｎは0,1,2又は３である）をさらにコー
ドする。

さらにもう１つの観点において、細胞は、サッカロマ
イセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）K
EX2遺伝子を発現するためにさらにトランスフェクトさ
れる。

本発明の他の観点は、次の詳細な説明及び図面から明
らかになるであろう。

図面の簡単な説明第１図は、完全なヒトプロテインＣのcDNAのヌクレオ
チド配列及びプロテインＣの推定されるアミノ酸配列を
示す。矢印は、連結するジペプチド及び活性化ペプチド
の除去のための切断部位を示す。

第２図は、プロテインＣ発現ベクターp594を示す。使
用される記号は、０−1,すなわち複製のアデノウィルス
５起点;E,すなわちSV40エンハンサー;MLP,すなわちアデ
ノウィルスの２つの後期プロモーター;L1−3,すなわち
アデノウィルス２トリパーティト（３分節系）リーダ
ー;5′，すなわち５′スプライト部位;3′，すなわち
３′スプライス部位;p（Ａ），すなわちポリアデニル化
シグナルである。

第３図は、S.セレビシアエ KEX2遺伝子を含むプラス
ミドの構成を示す。

第４図は、血清の存在（レーン５〜７）又は不在（レ
ーン９〜11）下で増殖された細胞からの組換え活性化プ
ロテインＣのゲル電気泳動を示す。レーン２は、分子量
マーカーである。

第５図は、プラスミドpZMB−１及びpZMB−２を示す。
使用される記号は、neo,すなわちネオマイシン耐性遺伝
子;SV40term,すなわちSV40ターミネーター;SV40prom,す
なわちSV40プロモーターである。他の記号は第２図にお
けるように使用される。

第６図は、プラスミドpPC1645/229Rの構成を示す。DH
FRは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を示し;MT−１
はマウスメタロチオネイン−１プロモータを示す。他の
記号は、第２及び５図におけるようにして使用される。

発明を実施するための最良の態様本発明を示す前、この後に使用される一定の用語の定
義を示すことが、その理解を助けるであろう。

生物学的活性：生物学的環境（すなわち生物又はその
インビトロファクシミル）において分子により行なわ
れる機能又は機能の組。タンパク質の生物学的活性は、
触媒活性及びエフェクター活性に分けられ得る。ビタミ
ンＫ依存性血漿タンパク質の触媒活性は一般的に、基質
の活性化又は不活性化をもたらす、他の血漿タンパク質
の特異的タンパク質加水分解性切断を包含する。エフェ
クター活性は、カルシウム、リン脂質又は他の小さな分
子、高分子、たとえばタンパク質、又は細胞への生物学
的活性の分子の特異的結合を包含する。エフェクター活
性は、時々、生理学的条件下で触媒活性を増強し、又は
そのために不可欠である。

活性化されたプロテインＣに関して、生物学的活性
は、その抗凝集性質により特徴づけられる。活性化され
たプロテインＣは、酸性リン脂質及びカルシウムの存在
下で第V a因子及び第VIII a因子を不活性化する。プロ
テインＳは、この機能の調節に包含されると思われる
（Walker,前記）。活性化プロテインＣの触媒活性は、
Ｈ鎖にある。

発現ベクター：中でも、プロモーター及びタンパク質
の発現を促進する他の配列と共に、当該タンパク質をコ
ードするDNA配列（又はそのような配列のための挿入部
位）を含むDNA分子。発現ベクターは、自律複製により
又は宿主ゲノム中への組込みにより、宿主細胞における
それらの複製を提供する遺伝子情報をさらに含む。組換
えDNAのために通常使用される発現ベクターの例は、プ
ラスミド及び一定のウィルスであり、但しそれらは両者
の要素を含むことができる。それらはまた、選択可能な
マーカを含むことができる。

安定してトランスフェクトされる：外因性DNAが細胞
中に導入され、そしてその細胞がその外因性DNAを発現
し、そしてそれらの子孫にそれらをパルすることができ
る条件。安定トランスフェクションは一般的に、細胞を
選択可能なマーカー（たとえば薬物耐性遺伝子）により
トランスフェクトし、そして選択的な圧力を適用するこ
とによって達成される。安定してトランスフェクトされ
た細胞の集団（単一のトランスフェクトされた前駆体細
胞に起因する）は、クローン的に同一である。外因性DN
Aは安定してトランスフェクトされた細胞の染色体中に
組込まれ、又は染色体外で維持され得る。対照的に、外
因性DNAを一時的に発現する細胞は、そのDNAを取り込ま
なかった細胞及びそれらの子孫にDNAを渡すことができ
ない細胞を含む混合された集団である。

本発明は、γ−カルボキシレート化され、そしてタン
パク質を発現するためにトランスフェクトされた培養哺
乳類細胞の使用を通して活性化プロテインＣの生物学的
活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。細胞
は、活性化プロテインＣをコードするDNA配列に操作可
能に結合されるプロモーターを含んで成る発現ベクター
によりトランスフェクトされる。トランスフェクトされ
た細胞は、最少量の血清を含み又は実質的に血清を含ま
ないように調製された培地で培養され、そして活性化プ
ロテインＣはその培地から単離される。

ヒトプロテインＣをコードするクローン化されたDNA
配列は記載されている（Foster and Davie,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 81:4766〜4770,1984;Fosterなど.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 82:4673〜4677,1985及びBangなど.,
アメリカ特許第4,775,624号）。ウシプロテインＣをコ
ードするcDNAは、Longなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:5653〜5656,1984により記載されている。一般的に、
cDNA配列は、RNAプロセッシング及び減じられた発現レ
ベルを回避するように誘導することができる介在配列の
欠失により、本発明内での使用のために好ましい。プロ
テインＣをコードする相補的DNAは、標準の実験工程に
従って肝臓細胞から調製されたライブラリーから得られ
る。しかしながら、適切なDNA配列はまた、ゲノムクロ
ーンから得られ又は従来の方法に従って始めから合成さ
れ得ることが理解されるであろう。一部のクローンが得
られる場合、エンドヌクレアーゼ切断、連結及びループ
−アウト変異誘発のような技法を用いて、十分な長さの
クローンを生成するために、読み枠を整合してそれらを
連結することが必要である。

活性化プロテインＣを調製するために、クローン化さ
れたDNA配列が変性され、活性化ペプチドをコードする
部分が欠失され又は置換される。得られるDNA配列は、
プレ−プロペプチド、プロテインＣのＬ鎖、プロセッシ
ング部位及び活性化プロテインＣのＨ鎖をコードするで
あろう。DNA配列は、Ｌ鎖とＨ鎖との間にスペーサーペ
プチドをさらにコードすることができる。１つの態様に
おいて、得られる配列は配列Lys−Argにより連結される
プロテインＣのＬ及びＨ鎖をコードするであろう。本明
細書に使用される場合、活性化プロテインＣのＬ鎖は、
第１図に開示される配列又はそれに実質的に相同の配
列、又はＣ−末端延長を有するそのような配列のアミノ
酸１〜149を含むことが理解される。活性化プロテイン
ＣのＨ鎖は、活性化ペプチドを含まない（すなわち第１
図に示されるように、アミノ酸番号170でのロイシンか
ら始まる）ことが理解される。好ましい態様において、
DNA配列は、Ｌ鎖とＨ鎖との間に新規切断部位を含むよ
うにさらに変性される。切断部位は、アミノ酸配列
（R₁）_ｎ−R₂−R₃〜R₄（ここでR₁−R₄はリシン（Lys）
又はアルギニン（Arg）であり、そしてｎは０〜３の整
数である）の形で存在することができる。特に好ましい
配列は、Arg−Arg−Lys−Arg,Lys−Arg−Lys−Arg及びL
ys−Lys−Argを包含する。他方、切断部位は、R₁−R₂−
R₃−R₄−Ｘ−R₅−R₆−R₇−R₈（ここで個々のR₁〜R₈はLy
s又はArgであり、そしてＸは１〜12個のアミノ酸のペプ
チド結合又はスペーサーペプチドである）の形のもので
あり得る。ここで有用なスペーサーペプチドは、アミノ
酸配列Asp−Thr−Glu−Asp−Gln−Glu−Asp−Gln−Val
−Asp−Pro,Asp−Thr−Glu−Asp−Gln−Glu−Asp−Gln,
Asp−Thr−Asp−Gln,Asp−Gln,Asn−Ile−Leu−Asn,及
びアミノ酸配列Asp−Thr−Glu−Asp−Gln−Glu−Asp−G
ln−Val−Asp−Pro−Arg有する天然のプロテインＣ活性
化ペプチドを包含する。切断部位変性の第３グループ
は、Lys,Arg及びLeuから成る群から選択されたアミノ酸
残基と天然のプロテインＣのアミノ酸残基154（His）と
の置換を包含し、一般式Ｙ−Ｚ−R₁−R₂（ここでＹはLy
s,Arg又はLeuであり;R₁及びR₂はLys又はArgであり；そ
してＺはLys又はArg以外のアミノ酸、好ましくはLeuで
ある）で表わされるプロセッシング部位配列を付与す
る。

DNA配列の変性は、部位特異的変異誘発により得られ
る。部位特異的変異誘発の技法は、当業界において良く
知られており、そしてたとえばZuller and Smith（DN
A ３:479〜488,1984）により記載されている。他方、
野生型プロテインＣ配列は、天然の活性化ペプチド配
列、及び前記切断部位の１つを含む合成された活性化ペ
プチドに連結されるＨ鎖及びＬ鎖もコードする配列を除
去するために酵素的に切断され得る。

当業界により理解されるように、本発明の方法はま
た、活性化プロテインＣの変異体及び相同体を生成する
ためにも使用され得る。活性化プロテインＣの変異体及
び相同体は、少々のアミノ酸変化を含むもの、たとえば
遺伝的多型現象によるもの、及びアミノ酸がタンパク質
の生物学的活性を実質的に変えないで付加され、欠失さ
れ、又は置換されているものを包含する。活性化プロテ
インＣ相同体は、ビタミンＫ−依存性血漿タンパク質第
VII因子、第IX因子、第Ｘ因子、プロトロンビン又はプ
ロテインＳの１つのglaドメインにより置換されたプロ
テインＣアミノ末端部分（glaドメイン）を有するタン
パク質をさらに包含する。

上記のように、本発明内に使用するためのDNA配列
は、適切な後翻訳プロセッシング（たとえばグルタミン
酸残基のγ−カルボキシル化）及び宿主細胞からの分泌
を得るために、活性化プロテインＣ前駆体のアミノ末端
でプレープロペプチドをコードするであろう。プレープ
ロペプチドは、プロテインＣ又は他のビタミンＫ−依存
性血漿タンパク質、たとえば第VII因子、第IX因子、第
Ｘ因子、プロトロンビン又はプロテインＳのペプチドで
あり得る。

次に、活性化プロテインＣをコードするDNA配列は、
培養された哺乳類細胞をトランスフェクトするために使
用される、適切な発現ベクター中に挿入される。本発明
の実施に使用するための発現ベクターは、クローン化さ
れた遺伝子又はcDNAの転写を方向づけることができるプ
ロモーターを含むであろう。好ましいプロモーターは、
ウィルスプロモーター及び細胞プロモーターを含む。ウ
ィルスプロモーターは、SV40プロモーター（Sabramani
など.,Mol.Cell.Biol.１:853〜864,1981）及びCMVプロ
モーター（Boshartなど.,Cell 41:521〜530,1985）を
包含する。特に好ましいウィルスプロモーターは、アデ
ノウィルス２からの主な後期プロモーターである（Kauf
man and Sharp,Mol.Cell.Bio.２:1304〜13199,1982）。
細胞プロモーターは、マウスカッパ遺伝子プロモーター
（Bergmanなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7041〜70
45,1983）及びマウスV_Hプロモーター（Lohなど.,Cell
33:85〜93,1983）を包含する。特に好ましい細胞プロモ
ーターはメタロチオネイン−Ｉプロモーターである（Pa
lmiterなど.,Science 222:809〜814,1983）。発現ベク
ターはまた、プロモーターの下流に及び活性化プロテイ
ンＣ配列のための挿入部位の上流に又は活性化プロテイ
ンＣ配列自体内に位置する一組のRNAスプライス部位を
含むことができる。好ましいRNAスプライス部位は、ア
デノウィルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ら
れる。その挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シ
グナルは、また発現ベクターに含まれる。特に好ましい
ポリアデニル化シグナルは、SV40からの前記又は後期ポ
リアデニル化シグナル（Kaufman and Sharp,前記）、
アデノウィルス5Elb領域又はヒト成長ホルモン遺伝子タ
ーミネーターからのポリアデニル化シグナル（DeNotoな
ど.Nac.Acids Res.９:3719〜3730,1981）を包含する。
発現ベクターはまた、プロモーターとRNAスプライス部
位との間に位置する非コードウィルスリーダー配列、た
とえばアデノウィルス２、３分節系トリーダー；及びエ
ンハンサー配列、たとえばSV40エンハンサー及びアデノ
ウィルスVA RNAをコードする配列を含むことができる。

クローン化されたDNA配列は、たとえばリン酸カルシ
ウム介在のトランスフェクション（Wiglerなど.,Cell
14:725〜732,1978;Corsaro and Pearson,Somatic Cell
Genetics 52:456〜467,1973）又はエレクトロポレーシ
ョン（Neamannなど.,EMBO J.１:841〜845,1982）によ
り、培養された哺乳類細胞中に導入される。外因性DNA
を発現する細胞を同定し、そして選択するために、選択
できる表現型を付与する遺伝子（選択可能マーカー）が
一般的に、当該遺伝子又はcDNAと共に細胞中に導入され
る。好ましい選択可能マーカーは、薬物、たとえばネオ
マイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキセートに対し
て耐性を付与する遺伝子を含む。選択可能マーカーは、
増幅できる選択可能マーカーであり得る。好ましい増幅
できる選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（DHFR）配列である。特に好ましい増幅可能マーカー
は、DHFR^rcDNA（Simonsen and Levinson,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:2495〜2499,1983）である。選択可能マ
ーカーは、Thilly（Mamsalian Cell Technology,Butter
worth Publishers,Stoneham,MA）により再調査されてお
り、そして選択可能マーカーの選択は、当業者の熟練の
レベル以内にある。

適切なマーカーは、対称の遺伝子と同時に、別々のプ
ラスミドに基づいて細胞中に導入され得、又はそれらは
同じプラスミド上に導入され得る。同じプラスミド上
に、選択可能マーカー及び当該遺伝子が異なったプロモ
ーター又は同じプロモーターの制御下で存在する場合、
後者の配置は、ジシストロン性メッセージを生成する。
このタイプの構造体は当業界において知られている（た
とえば、Levinson and Simonsen,アメリカ特許第4,713,
339号）。細胞中に導入される混合物に、“キャリヤーD
NA"として知られてる追加のDNAを添加することがまた好
都合である。

細胞がDNAを取り込んだ後、それらは、対称の遺伝子
の発現を開始するために、適切な増殖培地中で典型的に
は１〜２日間、増殖せしめられる。本明細書に使用され
る場合、用語“適切な増殖培地”とは、栄養物及び細胞
の増殖のために必要とされる他の成分を含む培地を意味
する。培地は一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ
酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び
成長因子を含む。次に、薬物選択が適用され、選択可能
マーカーを適切な態様で発現する細胞の増殖が選択され
る。増幅可能な選択可能マーカーによりトランスフェク
トされた細胞のためには、薬物濃度が、クローン化され
た配列の高められたコピー数を選択するために段階的な
態様で高められ、それによって発現レベルが高められ
る。次に、安定してトランスフェクトされた細胞のクロ
ーンが、活性化プロテインＣの発現のためにスクリーン
される。

本発明に使用するための好ましい哺乳類細胞系は、CO
S−１（ATCC GRL 1650）,BHK及び293（ATCC CRL 157
3;Grahamなど.,J.Gen.Virol.36:59〜72,1977）細胞系を
包含する。好ましいBHK細胞系は、tk^-ts13BHK細胞系（W
aechter and Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:110
6〜1110,198）である。さらに、多くの他の細胞系、た
とえばRat Hep I（ATCC CRL 1600）,Rat Hep II（ATCC
CRL 1548）,TCMK（ATCC CCL 139），ヒト肺（ATCC CCL
75.1），ヒト肝癌（ATCC HTB−52）,Hep G2（ATCC HB 8
065）,NCTC 1469（ATCC CCL 9.1）及びDUKX細胞（Urlau
b and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216〜422
0,1980）が本発明内で使用され得る。

Ｌ鎖とＨ鎖との間のLys−Argジペプチドの後の切断に
よる活性化プロテインＣ前駆体のプロセッシングは、S.
セレビシアエ KEX2遺伝子を宿主細胞中に導入すること
によって増強され得る。そのKEX2遺伝子は、二塩基性ア
ミノ酸配列の後を切断するエンドペプチダーゼをコード
する（Fallerなど.,Levie出版者,Microbiology:1986,27
3〜278,1980）。従って、この遺伝子により安定してト
ランスフェクトされた培養哺乳類細胞系は、活性化プロ
テインＣを発現するために有用である。

好ましい態様において、活性化プロテインＣを発現す
るために安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞
が、血清含有培地（たとえば約１％〜約10％の血清を含
む培地）中で、ある期間、好ましくは集密度まで増殖さ
れ、次に0.1％以下の血清を含むように配合された培地
に移される。本発明者は、培地からの血清の低下又は排
除が安定してトランスフェクトされた細胞からの活性化
プロテインＣの収率を高めることを発見した。種々の血
清不含細胞培養培地が当業界において知られている（た
とえば、Barnes and Sato,Cell 22:649〜656,1980;Bar
nes,Biotechniques ５:534〜542,1987;及びAmerican T
ype Culture Collection,Rockcille,MDのカタログを参
照のこと）。培養培地はまた、多くの商業的供給者から
入手できる。これに関する特に好ましい培養培地は、50
％ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）、及び1mMのピ
ルピン酸ナトリウム、2mMのＬ−グルタミン、50mg/の
ペニシリン、50mg/のストレプトマイシン、100mg/
のネオマイシン、5mg/のインシュリン、３μg/のセ
レン10mg/のフェチュイン、20mg/のトランスフェリ
ン及び25mMのHEPES緩衝液（pH7.2）を含む50％Ham・F12
の混合物である。トランスフェリンは、ウシ血清アルブ
ミン（1g/）又は肉加水分解物（たとえば、Primatone
RL,Sheffield Products,Norwich,NY;2.5g/）によ
り交換され得る。培地はまた、血清、好ましくはウシ胎
児血清を0.1％まで含むことができる。好ましくは、培
養培地はまた、γ−カルボキシグルタミン酸残基の形成
を促進するためにビタミンＫを含む。5ng/ml〜５μg/ml
の範囲でのビタミンＫの濃度が十分であり、そして１μ
g/mlの濃度が好ましい。細胞は、最少（0.1％か又はそ
れ以上）血清又は血清を含まない培地に約７日間維持さ
れ、この間、培地は収穫され、そして活性化プロテイン
Ｃが単離される。次に細胞は、高レベルの血清を含む培
地に戻され、そして増殖の再開を可能にされる。当業者
により認識されるように、細胞は初め、血清を含まない
培地で又は続いて血清の存在下で増殖せしめられる。

細胞は、一般的に当業界で使用される条件下で培養さ
れる。これに関しては、好ましくは、細胞は、約6.8〜
8.0、好ましくは約7.2のpHを維持する条件で、36℃〜40
℃で培養される。そのpHは、当業界において知られてい
る種々の緩衝液系の使用を通して維持され得る。好まし
い緩衝液系は、CO₂、好ましくは約５％のCO₂を含む湿潤
されたインキュベーター中において、炭酸水素緩衝液で
の細胞の培養を包含する。

本発明に従って生成された活性化プロテインＣは、抗
−プロテインＣ抗体カラム上でのアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製され得る。Wakabayashi:など．
（J.Biol.Chem.26）:11097〜11108,1986）により記載さ
れているようにカルシウム依存性モノクローナル抗体の
使用が特に好ましい。追加の精製が、従来の化学的精製
手段、たとえば高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）
により達成され得る。クエン酸バリウム沈殿を包含する
精製の他の方法は、当業界において知られており、そし
て組換え活性化プロテインＣの精製に適用され得る。

本発明に従って生成された活性化プロテインＣは、一
般的に、生理学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と
組合して、局部的又は静脈内適用のための医薬組成物に
使用され得る。好ましいキャリヤー及び希釈剤は、塩溶
液及び殺菌水を包含する。医薬組成物はまた、安定剤及
びアジュバントも含むことができる。得られる水溶液
は、使用のためにパッケージされ、又は無菌条件下で濾
過され、そして凍結乾燥せしめられ、前記凍結乾燥され
た調製物は、投与の前、無菌水溶液と共に混合される。

次の例は、例示的であって、本発明を制限するもので
はない。

例制限エンドヌクレアーゼ及び他のDNA変性酵素（たと
えばT4ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリホスフ
ァターゼ、DNAポリマラーゼＩ（クレノウフラグメン
ト）、T4ポリヌクレオチドリガーゼ）を、Bethesda Re
search Laboratories（BRL）及びNew England Biola
bsから得、そして特にことわらない限り、製造業者によ
り指図されるようにして使用した。

オリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems Model
380A DNA合成機上で合成し、そして変性ゲル上での
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。E.コ
リ細胞を、Maniatisなど．（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Cold Spring Habor Laboratory,1982）
により記載されているようにして形質転換した。M13及
びpUCクローニングベクター及び宿主菌株を、BRLから得
た。

例１ヒトプロテインＣをコードするDNA配列のクローニングヒトプロテインＣの一部をコードするcDNAを、Foster
and Davie（前記）により記載されているようにして
調製した。簡単に言えば、λgt11cDNAライブラリーを、
従来の方法によりヒト肝臓mRNAから調製した。クローン
を、¹²⁵I−ラベルされたアフィニティー精製された、ヒ
トプロテインＣに対する抗体を用いてスクリーンし、そ
してファージを、プレート溶解方法（Maniatisなど.,前
記）により陽性クローンから調製し、続いて塩化セシウ
ムグラジエントにゆだねた。cDNA挿入物を、EcoR Iを用
いて除去し、そしてプラスミドpUC9（Vieira and Messi
ng,Gene 19:259〜268,1982）中にサブクローンした。
制限フラグメントを、ファージベクターM13mp10及びM13
mp11（Messing,Meth.in Enzynology 101:20〜77,198
3）にサブクローンし、そしてジデオキシ方法（Sanger
など.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463〜5467,1977）
により配列決定した。ヒトプロテインＣの既知の一部の
配列に対応するDNAを含み（Kisiel,前記、1979）、そし
てＬ鎖のアミノ酸64で始まり、そしてＨ鎖を通して、そ
して３′非コード領域に延長するプロテインＣをコード
したクローンを選択した。このクローンをλHC1375と命
名した。アミノ酸24からのプロテインＣをコードする第
2cDNAをまた同定した。大きなクローンからの挿入物をp
UC9中にサブクローンし、そしてそのプラスミドをpHCλ
6Lとして命名した。このクローンは、プロテインＣの主
要部分、たとえばＨ鎖コード領域、終結コドン及び３′
非−コード領域をコードする。

λHC1375からのcDNA挿入物を、α−³²PdNTPを用いて
ニックトランスレーションし、そしてWoo（Meth.Enzymo
l.68:381〜395,1979）により変性されたようなBenton a
nd Davis（Science 156:181〜182,1977）のプラークハ
イブリダイゼーション方法を用いて、ファージλCharon
4A（Maniatisなど.,Cell 15:687〜702,1978）における
ヒトゲノムライブラリーをプローブするために使用し
た。陽性クローンを単離し、そしてプラーク精製した
（Fosterなど.,Proc.Natl.Acod.Sci.USA 82:4673〜467
7,1985,引用により本明細書に組込まれる）。陽性クロ
ーンから調製されたファージDNA（Silhavyなど.,Experi
ments with Gene Fusion,Cold Spring Harbor Laborato
ry,1984）をEcoR I又はBgl IIにより消化し、そしてそ
のゲノム挿入体を精製し、そしてpUC9にサブクローンし
た。そのゲノム挿入体の制限フラグメントをM13ベクタ
ー中にサブクローンし、そしてそれらの同一性を確認
し、そして全体の遺伝子のDNA配列を確立するために配
列決定した。

pHCλ6LのcDNA挿入体をニックトランスレーション
し、そしてファージλCharon4Aライブラリーをプローブ
するために使用した。cDNAの５′及び３′末端から製造
されるプローブにハイブリダイズした１つのゲノムクロ
ーンを同定した。このファージクローンをEcoR Iにより
消化し、そしてプロテインＣ遺伝子の５′末端に対応す
る4.4kbのフラグメントをPUC中にサブクローンした。得
られる組換えプラスミドをpHCR4.4として命名した。完
全なDNA配列の分析は、pHCR4.4における挿入体が1263bp
のイントロンにより分離される70及び167個の塩基対の
２つのエキソンを含むことを示した。第１エキソンはア
ミノ酸−42〜−19をコードし；第２エキソンはアミノ酸
−19〜37をコードする。配列分析は、全プロテインＣ遺
伝子のDNA配列を確証した。

プロテインＣのプレ−プロペプチドのアミノ酸−42〜
−19に対応するエキソンを含むゲノムフラグメントを単
離し、ニックトランスレーションし、そしてHepG2細胞
からのmRNAを用いて、Gubler and Hoffman（Gene 2
5:263〜269,1983）の技法により構成されたcDNAライブ
ラリーをスクリーンするためにプローブとして使用し
た。この細胞系は、ヒト肝細胞に由来し、そしてプロテ
インＣを合成することがこれまで示されている（Fair a
nd Bahnak,Blood 64:194〜204,1984）。ファージλgt1
1のEcoR I部位中に挿入されたcDNAを含んで成る10個の
陽性クローンを単離し、そしてプロテインＣ遺伝子の
５′非−コード領域に対応するオリゴヌクレオチドプロ
ーブによりスクリーンした。１つのクローンがまた、こ
のプローブに対して陽性であり、そしてその全体のヌク
レオチド配列を決定した。そのcDNAは、70bpの５′末翻
訳配列、ヒトプレ−プロ−プロテインＣのための全コー
ド配列及び第２ポリアデニル化部位に対応する全３′非
−コード領域を含んだ。cDNA配列及び推定されるアミノ
酸配列が第１図に示される。

例２活性化プロテインＣの発現 A.pPC829の構成及び発現プロテインＣをコードするcDNA配列を、部位特異的変
異誘発により変性し、活性化ペプチドをコードする部分
を欠失せしめた。829として命名される、コードされたA
PC前駆体のＬ鎖とＨ鎖との間の連結部のアミノ酸配列
が、第１表に示される。次に、変性された配列を、tk^-t
s13BHK及び293細胞中にトランスフェクトし、そして安
定してトランスフェクトされた細胞をスクリーンした。
活性プロテインＣを、両細胞系からの培養培地サンプル
に検出した。

プロテインＣのcDNAを、EcoR Iフラグメントとして単
離し、そして公開されたヨーロッパ特許出願EP266,190
に開示されているようにしてベクターpDX中にクローン
化した。組換えプラスミドを、制限分析によりスクリー
ンし、プロモーター要素に関して正しい配向でプロテイ
ンＣ挿入体を有するものを同定し、そしてプラスミドDN
A（pDX/PCとして命名された）を、正しいクローンから
調製した。pDX/PCにおけるcDNA挿入体は、５′非−コー
ド領域におけるATGコドンを含むので（第１図を参照の
こと）、特定オリゴヌクレオチド欠失変異誘発を、３個
の塩基対を除去するためにcDNAに対して行なった。p594
として命名される得られたベクターは、アデノウィルス
２主要後期プロモーターに操作可能的に結合されたプロ
テインCcDNAを含む（第２図）。このベクターはまた、
複製のアデノウィルス５′起点（０−１地図単位配
列）、SV40エンハンサー、アデノウィルス２、３分節系
トリーダー、一組のRNAスプライス部位、SV40ポリアデ
ニル化シグナル及び選択可能マーカーとしてのジヒドロ
葉酸レダクターゼ遺伝子を含む。

活性化ペプチドをコードする配列を欠失するために、
プラスミドp594をSst Iにより消化し、そして約880bpの
フラグメントを精製し、そしてM13mp10（Messing,metho
cls Enzymol.101:20〜78,1983）のSst I部位中に挿入し
た。12個の活性化ペプチドコドンを、変異性オリゴヌク
レオチドZC829（５′CTG AAA CGA CTC ATT GAT
３′）を用いて、特定オリゴヌクレオチド欠失変異誘発
（Zoller and Smith,DNA,３:479〜488,1984）により欠
失せしめた。複製形DNAを変異体ファージクローンから
調製し、そしてSst Iにより消化した。プロテインＣフ
ラグメント（約840bp）を単離し、そしてSst I−消化さ
れたp594中に挿入した。得られたプラスミドを、Bgl II
を用いての制限地図により、Sst Iフラグメントの正し
い配向についてスクリーンした。正しいプラスミドを選
択し、そしてpPC829として命名した。プラスミドpPC829
をスクリーンし、所望するコード配列の存在を確証し
た。

プラスミドpPC829を、リン酸カルシウム同時沈殿法
（Graham and Van der Eh,Virology 52:456〜467,197
8）により、tk^-ts13BHK細胞〔プラスミドpSVDHFRT（Lee
など.,Nature 294:228〜232,1982）を含む〕及び293細
胞（pKO−neoを含む）中に同時トランスフェクトした。
48時間後、培養培地を収穫し、そしてcDNAクローン及び
／又はプロテインＣのＨ鎖に対して向けられたモノクロ
ーナル抗体の初期同定に使用されるアフィニティー精製
されたポリクローナル抗体を用いて、酵素結合イムノソ
ルベントアッセイ（ELISA）によりプロテインＣについ
てアッセイした。アフィニティー精製されたヒトプロテ
インＣに対する抗体（0.1MのNa₂CO₃（pH9.6）において1
00μg/ml）を、96−ウェルマイクロタイタープレートの
個々のウェルに添加し、そしてプレートを４℃で一晩イ
ンキュベートした。ウェルを、0.05％のTween−20を含
むPBS（5mMのリン酸塩緩衝液、pH7.5,0.15MのNaCl）に
より三度洗浄し、未結合抗体を除去し、そして１％のウ
シ血清アルブミン、0.05％のTween20のPBS溶液100μ
と共に４℃で一晩インキュベートした。プレートを、PB
Sにより数度すすぎ、空気乾燥せしめ、そして４℃で貯
蔵した。サンプルをアッセイするために、個々のサンプ
ル100μを、被覆されたウェルにおいて、37℃で１時
間インキュベートし、そしてウェルをPBS中、0.05％のT
ween−20溶液によりすすいだ。次に、プレートを、１％
ウシ血清アルブミン及び0.05％Tween−20を含むPBS中、
プロテインＣ（30ng/ml）に対するビチオン−結合の羊
ポリクローナル抗体と共に37℃で１時間インキュベート
した。ウェルをPBSによりすすぎ、そして１％ウシ血清
アルブミン及び0.05％のTween−20を含むPBS中、アビジ
ン接合のアルカリホスファターゼと共に37℃で１時間イ
ンキュベートした。ウェルをPBSによりすすぎ、そして
アルカリホスファターゼ活性を、ホスファターゼ基質
（Sigma104;0.3mMのMgCl₂を含む10％のジエタノールア
ミン（pH9.8）溶液中において600μg/ml）100μの添
加により測定した。405nmでの吸光度を、マイクロタイ
タープレートリーダー上で読み取った。結果は第２表に
示される。同時に、培養物を、500μg/mlのG418（293細
胞）又は250nMのメトトレキセート（tk^-ts13BHK細胞）
を含む培地中に1:5で分けた。

選択培地の存在下で10日間増殖した後、安定してトラ
ンスフェクトされたコロニーを、イムノフィルターアッ
セイ（McCracken and Brown,Bio Techniques,82〜87,3
月/4月、1984）により活性化プロテインＣ生成について
スクリーンした。プレートを、PBS又は血清不含培地（D
MEM＋１×PSN抗生物質混合物、５μg/mlのビタミンＫ）
によりすすいだ。次に、Teflonメッシュ（Spectrum M
edical Industries,Los Angeles,CA）を、細胞上に置い
た。ニトロセルロースフィルターをPBS又は血清不含培
地により適切に湿潤し、そしてメッシュ上に置いた。37
℃での４時間インキュベーションの後、フィルターを除
き、そしてフィルター緩衝液（50mMのトリス、pH7.4,5m
MのEDTA,0.05％のNP−40,150mMのNaCl,0.25％のゼラチ
ン）に室温で30分間置いた。フィルターを、ビオチンに
よりラベルされた羊抗−プロテインＣポリクローナル抗
体（フィルター緩衝液において１μg/ml）中において、
振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次にフ
ィルターを同じ緩衝液により洗浄し、そしてアビジン接
合のホースラディシュペルオキシダーゼ（Boehringer−
Mannheim）（フィルター緩衝液により1:1000に希釈され
ている）中において、振盪しながら室温で１時間インキ
ュベートした。フィルターを50mMのトリス−HCl,pH7.4,
5mMのEDTA,1MのNaCl,0.25％のゼラチン、0.4％のサクロ
シル、0.05％のNP−40、次に水により洗浄した。洗浄さ
れたフィルターを、彩色試薬（60mgのHRP色進行試薬〔B
io−Rad〕、20mlのメタノール、50mMのトリス〔pH7.4〕
100ml中、H₂O₂100μ、150mMのNaCl）中でインキュベ
ートした。その反応を、フィルターを水に移すことによ
って停止せしめた。

陽性コロニーを取り出し、そして選択培地（50μg/ml
のG418又は250nMのメトトレキヤートを適切に含む）中
で10日間増殖せしめた。培養培地を、クロモゲンアッセ
イによりAPC活性についてアッセイした。培地サンプル
を、50mMのトリス（pH7.5）中、0.2mMのSpectrozyme P
Ca（American Diagnostica ＃336）,150mMのNaClの溶液
100μを含むマイクロタイターウェルに添加した。プ
レートを、37℃でインキュベートし、そしてA₄₀₅を種々
の間隔で測定した。陽性の293細胞コロニーからの培地
は、トランスフェクトされていない293細胞と共に同時
期間（10日）インキュベートされた対照培地の活性より
も高い活性を、APCのためのクロモゲン基質により示し
た。

B.pDX/PC1058の構成及び発現切断部位配列Arg−Arg−Lys−Argを有する活性化プロ
テインＣ前駆体をコードするDNA配列を、野生型プロテ
インＣ配列の変異誘発により構成した。得られた配列を
1058として命名した。Ｌ鎖とＨ鎖との間の連結点でのこ
の前駆体のアミノ酸配列が第１表に示される。

プラスミドp594に存在するプロテインＣ配列を、１回
の変異誘発で変性し、活性化ペプチドのためのコドンを
欠失し、そしてプロセッシング部位でArg−Argコドンを
挿入した。変異誘発は、M13mp11中にクローン化され
る、p594からの870bpのSst Iフラグメントに対して行な
った。一本鎖鋳型DNAを単離し、そしてオリゴヌクレオ
チドZC1058（５′CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA
CGA CTC ATT GAT GGG ３′）及びZC550（５′TC
C CAG TCA CGA CGT ３′）を用いて変異誘発し
た。

変異誘発された配列を、Sst Iフラグメントとして複
製形DNAから単離した。その変異誘発されたフラグメン
トを、Sst I切断されたp594に連結し、発現ベクターpDX
/PC1058を構成した。そのベクターを、リン酸カルシウ
ム方法（Graham and van der Eb,前記により記載さ
れているような）により、pSV2−DHFR（Subramaniな
ど.,Mol.Cell.Biol.１:854〜864,1981）を有するtk^-ts1
3BHK細胞中に同時トランスフェクトした。そのトランス
フェクトされた細胞を、10％ウシ胎児血清、１×PSN抗
生物質混合物（Gibco 600−5640）、2.0mMのＬ−グル
タミン及びビタミンＫ（５μg/ml）を含むダルベッコの
変性イーグル培地（DMEM）中で増殖した。細胞を、250n
Mのメトトレキセート（MTX）中において14日間選択し
た。タンパク質を、ヒトプロテインＣに対する羊ポリク
ローナル抗体7mgをCNBr−活性化セファロース4B（Pharm
acia Inc.,Piscataway,NJ）2gにカップリングすること
によって調製されたカラム上でのアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製した。細胞培養培地をカラムに
適用し、そしてカラムをTBS（50mMのトリス、pH7.5,150
mMのNaCl）100mlにより洗浄した。活性化プロテインＣ
を、3MのKSCNを含むTBSにより又はpH11.5の緩衝液（25m
Mのリン酸カリウム、pH11.5,0.2MのNaCl,2％のTween−8
0,0.5％のNaN₃）により溶出した。

C.KEX2トランスフェクトされた細胞系におけるpDX/PC10
58からの活性化プロテインＣの発現サッカロマイセスセレビシアエ KEX2遺伝子を、適
切なテスター細胞の層上でのα−因子haloの生成につい
て、形質転換されたKex2変異体細胞をスクリーンするこ
とによって酵母ゲノムライブラリーから単離した。Kex2
変異体のすべての報告された欠陥（接合、α−因子産
生、キラー毒素の成熟及びホモ接合性二倍体株における
胞子形成）を補足された１つのクローンを得た。その遺
伝子を、酵母GAL1プロモーターの制御下でpUCベクター
中にサブクローン化した。p1515と命名された得られる
プラスミドを、1987年12月３日に寄託番号第67569号と
してATCCに寄託した。第３図に示されるように、p1515
をHind IIIにより消化し、そして2.1kbのフラグメント
を回収した。このフラグメントを、Hind IIIにより切断
されたpUC18に連結し、pUC18/KEX2を構成した。次に、K
EX2フラグメント（2.1kb）を、前記プラスミドをHind I
IIにより一部、及びBamH Iにより完全に消化することに
よってpUC18/KEX2から単離した。次にKEX2配列の残り
を、p1515のBamH I＋Hind III消化物から0.43kbのフラ
グメントとして単離した。次に、２つのKEX2フラグメン
トを、ベクターZem228及びZem229のBamH I部位に連結し
た。（Zem229は、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモー
ターとSV40転写ターミネーターとの間にクローン化され
たDNAの挿入のためのユニークなBamH I部位を含むpUC18
基礎の発現ベクターである。このベクターはまた、SV40
初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺
伝子及びSV40ターミネーターを含んで成る発現単位を含
む。Zem228は、Zem229に類似するが、しかしDHFR遺伝子
の代わりに耐ネオマイシン性遺伝子を含む。従って、Ze
m228においては、挿入された遺伝子はメタロチオネイン
−Ｉプロモーター及びSV40ターミネーターの制御下に存
在し、そしてそのベクターは抗生物質G418により選択さ
れ得る。）得られたプラスミドを、それぞれKEX/Zem228
及びKEX2/Zem229として命名した。

高いプロテインＣ産生pDX/PC1058−トランスフェクト
されたtk^-ts13BHKクローン（pDX/PC1058−3//BHK）を、
リン酸カルシウム法を用いて、KEX2/Zem228によりトラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、50
0μg/mlのG418及び250nMのメトトレキセートにより選択
した。

KEX2−1058//BHKとして命名された選択されたクロー
ンを、１％のウシ胎児血清を含むシステイン不含DMEM
（Gibco Laboratories,Grand Island,NY）中において、
24時間、³⁵S−システインによりパルス−ラベルした。
培養培地を集め、そしてプロテインＣに対するモノクロ
ーナル抗体による免疫沈殿により、一本鎖及び二本鎖プ
ロテインＣの存在についてアッセイした。200及び50μ
の培地を、抗体10μｇと共に組合し、そしてその混合
物を37℃で１時間インキュベートした。100μのStaph
A細胞懸濁液（Pharmcia,Piscataway,NJ）を添加し、そ
してその混合物を37℃で１時間インキュベートした。細
胞を遠心分離によりペレット化し、そしてそのペレット
を、１％のβ−メルカプトエタノールを含むゲル緩衝液
60μに再懸濁した。その懸濁液を３分間、100℃に加
熱し、次にSDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
せしめた。タンパク質を、オートラジオグラフィーによ
り可視化した。KEX2−1058//BHKクローンは、そのタン
パク質の二本鎖形へのほぼ100％の切断を示した。

KEX2−1058＃３−５として命名された、安定してトラ
ンスフェクトされたBHKクローン細胞系を、10％のウシ
胎児血清を含む培地中において、細胞工場（Kunc,Thous
and Oaks,CA）で、５％のCO₂雰囲気下で37℃で増殖せし
め、次に１％の血清を含む培地中での増殖を可能にし
た。ならし培地を、デカントすることによって除去し、
そして細胞をPBS500mlにより２度、洗浄した。その洗浄
された細胞を、50％のDMEM,50％のHam'sF12,1mMのピル
ビン酸ナトリウム、2mMのＬ−グルタミン、１×PSN抗生
物質混合物（Gibco Laboratories）、5mg/のインシ
ュリン、３μg/のセレン、10mg/のフェチュイン、2
0mg/のトランスフェリン及び25mMのHEPES緩衝液（pH
7.2）を含む血清不含培地に移した。すべての培地は、
１μg/mlのビタミンＫを含んだ。３〜４日の増殖の後、
培地を収穫し、そして細胞を、１％の血清を含む培地に
移した。

活性化プロテインＣを、PCL−２−セファロースカラ
ム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーによ
り、血清を含まない及び血清を含む培地から精製した。
このカラムは、CNBr−活性化セファロース（Pharmacia
Piscataway,NJ）にプロテインＣのCa²⁺結合Ｌ鎖に対し
て特異的なモノクローナル抗体（PCL−２として命名さ
れる）をカップリングすることによって構成された。な
らし培地を濾過し、そして精製の前に、Amicon DC10L
濃縮機（Amicon,Danvers,MA）を用いて約90倍に濃縮し
た。その濃縮されたサンプルを、10mMのCaCl₂の存在下
でカラムに適用した。カラムを、10mMのトリス−HCl,1.
0MのNaCl,10mMのCaCl₂溶液（pH7.5）により洗浄した。
活性化プロテインＣを、50mMのトリス−HCl（pH7.5）
中、15mMのEDTA溶液によりカラムから溶出した。

血清を含まない培地及び１％の血清を含む培地中で培
養された細胞により生成された活性化プロテインＣを、
BCA方法（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）を用いて
定量化した。タンパク質の生物学的活性を、基質として
のプールされた正常な血漿によるAPTTの延長が結果とし
て生じることによって、決定した。手短に言えば、APTT
アッセイが、組換えAPCの種々の希釈溶液（体積100μ
）と共に正常な血漿100μを37℃で50秒間インキュ
ベートし、続いて、Actin FS（Dade,Miami,FL）100μ
と共に37℃で100秒間インキュベートすることによっ
て実施された。次に、25mMのCaCl₂100μを添加し、そ
して凝集時間を決定した。複数の測定の結果が第３表に
示される。値は、２つの有効数字に四捨五入されてい
る。

タンパク質をまた、SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（Laemmli,Nature 227:680,1970）により特徴づ
けた。第４図に示されるように、血清を含まない培地で
培養された細胞により生成された組換え活性化プロテイ
ンＣは、約68kDaの分子量を有する種（レーン９〜11）
として主に存在する。対照的に、１％の血清の存在下で
培養された細胞からのAPCは、93KDa以上の分子量を有す
る種（レーン５〜７）の有意な量を含み、高分子量APC
−インヒビター複合体が血清の存在下で形成することを
示唆する。

これらのデータは、血清を含まない培地における組換
え活性化プロテインＣの生成が、従来レベルの血清の存
在下での生成に比較して、損われていない、生物学的に
活性なタンパク質の高収率をもたらすことを示唆する。

D.KEX2トランスフェクトされた細胞におけるpPC1962/ZM
B−２からの活性化プロテインＣの発現プロテインＣのコード配列を変性し、アミノ酸153〜1
69を除去し、アミノ酸152と170との間にＬ鎖−Ｈ鎖連結
部を有する活性化されたプロテインＣ前駆体をもたらし
た。この活性化プロテインＣ前駆体（1962として命名さ
れる）の配列は、第１表に示される。

特定オリゴヌクレオチド変異誘発、M13mp10のSst I部
位中に、適切な配向で挿入されたp594のSst Iフラグメ
ントを含んで成る鋳型に対して行なった。一本鎖鋳型DN
Aを、594/mp10ファージクローンから調製した。特定オ
リゴヌクレオチド変異誘発を、合成オリゴヌクレオチド
ZC1962（５′GAG AAG AAG CGC CTC ATT GAT GGG
３′）及びZC550を用いてその鋳型に対して行なっ
た。陽性ファージクローンを、その変異誘発を確かめる
ために配列決定した。陽性ファージクローンを、1962と
して命名した。

複製形DNAを、ファージクローン1962から調製し、そ
してSst I及びPst Iにより消化し、約0.4kbの変異誘発
されたフラグメントを単離した。プラスミドPC229/962
（例2E）を、EcoR I及びPst Iにより消化し、562bpのプ
ロテインＣフラグメントを単離した。700bpのSst I−Ec
oR IプロテインＣフラグメントを、PC1869/229R（p594
プロテインＣコード配列を含むが、但しLysコドンによ
り置換されたArg（残基157）コドンを有するZem229R−
基礎のプラスミド）から得た。プラスミドZem229Rは、Z
em229に類似するが、但し、Zem229に存在するEcoR I部
位は、部分的消化により破壊され、DNAポリマラーゼＩ
（クレノウフラグメント）及びdNTPによる処理によりブ
ラント末端化され、続いて再連結され、そしてユニーク
EcoR I部位が、BamH Iによる消化及びBamH I−EcoR Iア
ダプターによる再連結によりBamH I部位で創造された。
プラスミドpZMB−２（第５図）を、EcoR Iによる消化に
より線状化した。（プラスミドpZMB−２はZem229Rに類
似するが、しかしSV40エンハンサー、アデノウィルス２
主要後期プロモーター、アデノウィルス２、３分節系ト
リーダー、及びSst I−Hind IIIアダプターを用いてMT
−１プロモーターについて置換された５′及び３′スプ
ライス部位を含む。）ファージクローン1962からの約0.
4kbのPst I−Sst Iフラグメント、Pc1869/229Rからの70
0bpのPst I−EcoR Iフラグメント、PC229/962からの562
bpのSst I−EcoR Iフラグメント及び線状化されたpZMB
−２を、４部連結で連結した。正しい配向でその挿入体
を有するプラスミドを、pPC1962/ZMB−２として命名し
た。

プラスミドpPC1962/ZMB−２を、リン酸カルシウム同
時沈殿法により、tk^-ts13BHK細胞中にトランスフェクト
した。トランスフェクトされた細胞を、10％のウシ胎児
血清、１×PSN抗生物質混合物（Gibco）、2.0mMのＬ−
グルタミン及び５μg/mlのビタミンＫを含むDMEM中で増
殖した。細胞を500nMのメトトレキセート中で15日間選
択し、そして得られたコロニーを、イムノフィルターア
ッセイによりスクリーンした。最っとも集中的に反応す
るコロニーを、シリンダークローニングにより取り出
し、そしてそれぞれ10cmのプレート中で増殖した。培養
物がほぼ集密性になる場合、プロテインＣの生成レベル
を、ELISAにより測定した。

高いプロテインＣ産生pPC1962/ZMB−２トランスフェ
クタントを、KEX2/ZMB−１によりトランスフェクトし
た。（KEX2/ZMB−１は、ユニークEcoR I部位でベクター
ZMB−１中に挿入されたKEX2コード配列を含んで成る。
第５図に示されるように、ZMB−１は、ZMB−２に類似す
るが、しかしそれはZem228Rから構成された。Zem228R
は、Zem229Rの構成のために、上記のようにしてZem228
から調製された。）同時トランスフェクトされた細胞を
選択し、そして培地サンプルを集めた。活性化プロテイ
ンＣを、pPC1962−KEX2/ZMB−１トランスフェクト細胞
からの培地サンプルに検出した。

E.pPC1645/Zem229Rの構成及び発現プロテインＣのＬ鎖とＨ鎖との間の結合部分でArg−A
rg−Lys−Argプロセッシングシグナルを末端に有する８
個のアミノ酸のスペーサーペプチドをコードするDNA配
列（1654と命名された）は、第１表に示される。

変異体分子を、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドZC
962（５′AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA GAC A
3′）及びオリゴヌクレオチドZC550（５′TCC CAG TC
A CGA CGT ３′）を用いて、部位特異的変異誘発（Z
oller and Smith,DNA ３:479〜488,1984により実質的
に記載されているようにして）によりクローン化された
cDNAを変性することによって生成した。プラスミドp594
をSst Iにより消化し、約87bpのフラグメントをM13mp11
中にクローン化し、そして一本鎖鋳型DNAを単離した。
変異誘発の後、正しいクローンを配列決定することによ
って同定した。複製形DNAを単離し、そしてSst Iにより
消化し、変異誘発されたフラグメントを単離した。この
変異誘発されたフラグメントを、２部連結でSst I切断
されたp594に連結した。所望する配向で挿入されたSst
Iフラグメントを有するクローンを、制限酵素地図によ
り同定した。得られた発現ベクターを、pDX/PC962とし
て命名した（第６図）。

プラスミドpDX/PC962をSal I及びSst Iにより消化
し、そして精製された730bpのフラグメントを、Sal I及
びSst Iによる消化により線状化されたM13mp10中に挿入
した。合成オリゴヌクレオチドZC1645（５′GAA GAC
CAA ACA ACA AAA CGG CTC ATT GAT ３′）及び
ZC550を用いて、部位特異的インビトロ突然変異誘発（Z
oller and Smith,前記）により一本鎖鋳型DNAを変異
誘発した。変異体ファージクローンを、ジデオキシ−配
列決定にゆだね、突然変異誘発を確証した。1645として
命名された、確証された変異体ファージクローンからの
複製形（rf）DNAを調製し、そしてSst I及びPst Iによ
り消化し、411bpのフラグメントを単離した。

プラスミドpDX/PC962をEcoR Iにより消化し、そして
プロテインＣフラグメントを回収した。このフラグメン
トを、オリゴヌクレオチドアダプターを通して、ホスフ
ァターゼ処理された、BamH I−切断プラスミドZem229に
連結した。得られたプラスミドPC229/962（第６図）
を、EcoR I及びPst Iにより消化し、592bpのプロテイン
Ｃフラグメントを単離した。プラスミドPC229/962をま
た、EcoR I及びSst Iにより消化し、700bpのプロテイン
Ｃフラグメントを単離した。1645rfからの411bpのプロ
テインＣフラグメント、PC229/962からの592bpのプロテ
インＣフラグメント及び700bpのプロテインＣフラグメ
ントを、EcoR Iにより線状化され、そして自己連結を妨
げるためにウシ腸ホスファターゼにより処理されたZem2
29Rと共に４部連結で連結した。正しいプラスミドを選
択し、そしてpPC1645/229R（第６図）と命名した。

プラスミドpPC1645/229Rを、リン酸カルシウム同時沈
殿法（Graham and van der Eb,前記）により、th^-t
s13BHK細胞中にトランスフェクトした。トランスフェク
トされた細胞を、１μＭのメトトレキセートによる選択
にゆだね、そして培地をELISAによりプロテインＣにつ
いてアッセイした。陽性クローンを、10％ウシ胎児血清
及び１μＭのメトトレキセートにより補充されたDMEM中
で、細胞が集密性に達するまで増殖せしめた。その集密
性細胞を、１％ウシ胎児血清及び１μＭのメトトレキセ
ートにより補充されたDMEMに移した。培地を７日間にわ
たって、１〜２日ごとに集め、そして−20℃で凍結し
た。その凍結された培地サンプルを融解し、そして0.45
μｍのフィルターに通し、すべての細胞残骸を除去し
た。固体塩化カルシウムを添加し、5mMの最終濃度に
し、そして固体アジ化ナトリウムを添加し、0.02％（重
量／体積）の最終濃度にした。プロテインＣを、プロテ
インＣのカルシウム誘発配向に対して特異的なモノクロ
ーナル抗体カラムを用いて培地から精製した。処理され
た培地サンプルをカラムに適用し、そしてプロテインＣ
を、10mMのEDTAを含むTBSにより溶出した。プロテイン
Ｃ濃度を、280nmでの吸光度及びELISAにより決定した。

pPC1645/229Rトランスフェクトされた細胞から生成さ
れた活性化プロテインＣを、クロモゲンアッセイを用い
て、PC229/962プロテインＣの等量と比較した。40μ
のTBS＋EDTAに希釈されたアフィニティー精製プロテイ
ンC1μｇを、96−ウェルプレートの個々のウェルに添加
した。2mMのSpectrozyme Pca（American Diagnostica
Inc,New York,NY）40μを個々のウェルに添加し、そ
して十分な色が展開するまで、37℃でインキュベートし
た。活性を、405nmでの吸光度の上昇として測定した。
その結果は、pPC1645/229R−トランスフェクトされた細
胞から生成された活性化プロテインＣが、PC229/962に
より生成されたプロテインＣよりも５〜10％より活性的
であることを示した。

F.pPC1880/229Rの構成及び発現 1645DNA配列をさらに変性し、スペーサーペプチドの
第１、第２、第７及び第８アミノ酸を除去した。一本鎖
1645鋳型DNAを、合成オリゴヌクレオチドZC1880（５′A
AA CGA GAC ACA GAC CAA AGA AGA ３′）及びZ
C550を用いて、インビトロで部位特異的変異誘発（Zo
ller and Smith,前記）にゆだねた。陽性ファージク
ローンをジデオキシ配列決定にゆだね、変異誘発を確認
した。陽性クローンを同定し、そして1880として命名し
た（第１表）。

クローン1880から調製された複製形DNAを、Sst I及び
Pst Iにより消化し、約0.4kbのフラグメントを単離し
た。プラスミドPC229/962を、EcoR I及びPst Iにより消
化し、562bpのプロテインＣフラグメントを単離した。
プラスミドPC229/962をまた、EcoR I及びPst Iにより消
化し、700bpのプロテインＣフラグメントを単離した。1
880rfからの411bpのプロテインＣフラグメント、PC229/
962及びEcoR I消化されたZem229Rからの700bp及び562bp
のフラグメントを、四部連結で連結した。正しいプラス
ミドを選択し、そしてpPC1880/229Rと命名した。

プラスミドpPC1880/229Rを、tk^-ts13BHK細胞中にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞からの
培地サンプルの分析は、活性化されたプロテインＣが生
成されたことを示した。

G.pPC1954/229Rの構成及び発現 1645配列におけるスペーサーペプチドのためのコード
配列を変更し、第２〜第７アミノ酸コドンを除去した。
一本鎖1645鋳型DNAを調製し、そして合成オリゴヌクレ
オチドZC1954（５′GAG AAG AAA ACG AGA CCA AA
G AAG AAA AC3′）及びZC550を用いて、インビトロ
で部位特異的変異誘発にゆだねた。陽性クローンを配列
決定し、変異誘発を確証した。陽性クローンを選択し、
そして1954と命名した（第１表）。

複製形DNAを1954から調製し、そしてSst I及びPst I
により消化し、約400bpの変異誘発されたプロテインＣ
フラグメントを単離した。プラスミドPC229/962をEcoR
I及びPst I並びSst I及びEcoR Iにより消化し、562bpの
EcoR I−Pst Iフラグメント及び700bpのプロテインＣフ
ラグメントを単離した。1954rfからの約0.4kbのプロテ
インＣフラグメント、pPC229/962及びEcoR I−消化され
たpZem229Rからの700bp及び562bpのフラグメントを、四
部連結により連結した。正しいプラスミドを選択し、そ
してpPC1954/229Rと命名した。

プラスミドpPC1954/229Rを、リン酸カルシウム同時沈
殿法（Graham and van der Eb,前記）により、tk^-t
s13BHK細胞中にトランスフェクトした。

H.pPC1953/229Rの構成及び発現 1645配列におけるスペーサーペプチドのためのコード
の配列を変性し、第１〜第８アミノ酸コドンを除去し、
1645に存在するArg−Arg−Lys−Argアミノ酸コドンの第
１及び第２組間での融合をもたらした。コードされたタ
ンパク質のＬ−Ｈ鎖連結でのアミノ酸配列（1953と命名
された）を、第１表に示す。

一本鎖1645鋳型DNAを、合成オリゴヌクレオチドZC195
3（５′ACC TCA GAA GAA AAC GAA GAA GAA AAC
GGC TCA T3′）及びZC550を用いて、インビトロで
の部位特異的変異誘発にゆだねる。陽性クローンを配列
決定し、変異誘発を確証する。陽性クローンを選択し、
そして1953と命名する。複製形DNAをクローン1953から
調製し、そしてSst I及びPst Iにより消化し、約0.4kb
の変異誘発されたプロテインＣフラグメントを単離す
る。プラスミドPC229/962を、EcoR I及びPst I又はSst
I及びEcoR Iにより消化し、562bpのEcoR I−Pst Iフラ
グメント及び700bpのプロテインＣフラグメントを単離
する。1953rfから約400bpのプロテインＣフラグメン
ト、PC229/962及びEcoR I消化されたZem229Rからの700b
p及び562bpフラグメントを、四部連結により連結する。
正しいプラスミドを選択し、そしてpPC1953/229Rと命名
する。

プラスミドpPC1953/229Rを、リン酸カルシウム同時沈
殿法（Graham and van der Eb,前記）によりkt^-ts1
3BHK細胞中にトランスフェクトする。細胞を選択し、そ
して活性化されたプロテインＣの生成についてアッセイ
する。

I.pPC2043/ZMB−２の構成活性化されたプロテインＣ前駆体を構成し、ここで活
性化ペプチドをコードする配列を除去し、そしてArgコ
ドンを天然のプロテインＣのアミノ酸コドン150と151と
の間に挿入する。コードされたタンパク質のＬ−Ｈ鎖連
結部でのアミノ酸配列（2043と命名された）は、第１表
に示される。

一本鎖鋳型DNAを、ファージクローン1962から調製
し、そして合成オリゴヌクレオチドZC2043（５′AGC C
GG ATG GAG AAG AGG AAG CGC CTC ATT GC3′）及びZ
C550を用いて、インビトロでの部位特異的変異誘発にゆ
だねる。複製形DNAを、確証されたファージクローンか
ら調製し、そしてPst I及びSst Iにより消化し、約0.4k
bの変異誘発されてフラグメントを単離した。プラスミ
ドPC229/962を、EcoR I及びPst I並びにSst I及びEcoR
Iにより消化する。得られる562bpのEcoR I−Pst I及び7
00bpのEcoR I−Sst IプロテインＣフラグメントを回収
する。0.4kbのPst I−Sst Iフラグメントを、562bpのEc
oR I−Pst Iフラグメント、700bpのSst I−EcoR Iフラ
グメント及び線状化されたZEB−２と四部連結により連
結する。正しい配向で挿入体を含むプラスミドを、pPC2
043/ZMB−２と命名する。

プラスミドpPC2043/ZMB−２を、tk^-ts13BHK細胞中に
トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞
を、活性化されたプロテインＣの生成についてアッセイ
する。

本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来
たが、前記から、種々の変性が、本発明の範囲内で行な
われ得る。従って、本発明は、制限的ではない。

フロントページの続き (72)発明者フォスター，ドナルドシー. アメリカ合衆国，ワシントン 98155, シアトル，ノースイーストワンハンドレッドエイティファーストストリート 3002 (56)参考文献特開昭63−42699（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開319312（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】活性化プロテインＣの生成方法であって：活性化されたプロテインＣをコードするDNA配列に操作
可能に連結された転写プロモーターを含んで成る発現ベ
クターにより安定してトランスフェクトされた哺乳類細
胞を、0.1％よりも高くない血清を含む培養培地中で培
養し；そして前記細胞により生成される活性化プロテインＣを単離す
ることを含んで成る方法。
【請求項２】前記培地が血清を実質的に含まない請求の
範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記細胞が赤んぼうのハムスターの腎細胞
である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】前記DNA配列が、前記活性化されたプロテ
インＣのＬ及びＨ鎖の間でアミノ酸配列R₁−R₂−R₃−R₄
−Ｘ−R₅−R₆−R₇−R₈（ここで個々のR₁〜R₈はリシン又
はアルギニンであり、そしてＸは１〜12個のアミノ酸の
ペプチド結合又はスペーサーペプチドである）をさらに
コードする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】前記DNA配列が、アミノ酸配列（R₁）_ｎ−R
₂−R₃−R₄（ここでR₁,R₂,R₃及びR₄の個々はLys又はArg
であり、そしてｎは0,1,2又は３である）を、前記活性
化されたプロテインＣのＬ及びＨ鎖間でさらにコードす
る請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】前記DNA配列が、前記活性化されたプロテ
インＣのＬ及びＨ鎖間でアミノ酸配列Arg−Arg−Lys−A
rgをコードする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】前記細胞が、サッカロマイセスセレビシ
アエ KEX2の遺伝子を発現するために、さらにトランス
フェクトされる請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項８】前記培養培地がビタミンＫをさらに含んで
成る請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】活性化プロテインＣの生成方法であって：活性化されたプロテインＣをコードするDNA配列であっ
て、前記活性化されたプロテインＣのＬ及びＨ鎖間にア
ミノ酸配列Arg−Arg−Lys−Argをさらにコードし、そし
て前記細胞はサッカロマイセスセレビシアエ KEX2遺
伝子を発現するためにさらにトランスフェクトされてい
るDNA配列に操作可能に連結された転写プロモーターを
含んで成る発現ベクターにより安定してトランスフェク
トされた哺乳類細胞を、血清を実質的に含まない培養培
地で培養し；そして前記細胞により生成された活性化プロテインＣを単離す
ることを含んで成る方法。
【請求項１０】前記細胞が赤んぼうのハムスターの腎細
胞である請求の範囲第９項記載の方法。