JPH03501921A - 改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良タンパク質分子、並びにその製造及び活性化方法発明の背景 本発明は、プロティンＣ１並びにプロティンＣを製造するための組換えＤＮＡ法 の使用、に関する。

凝血カスケードは、傷害に応答して生ずる多数の血漿タンパク質の関与する一連 の反応である。これらの血漿タンパク質の一つであるプロティンＣは、血液系に おける２つの重要なメカニズム、すなわち血餅形成及び血餅溶解が適当なバラン スを保って、出血が余りに長く続かずしかも傷害を受けた特定部位以外の場所て 凝血しないようにする働きがある。

プロティンＣはその活性型において、血液凝固経路に。

おける２つの補因子、Ｖａ因子及び■ａ因子を不活性化する。プロティンＣは、 プロト−ロンビン及び■因子、■因子、Ｘ因子を含めた他のビタミンに一依存性 凝固因子とかなりの相同性を持ったアミノ酸配列を有する（Ｆｏｓｔｅｒ他、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８２．　４８７３頁（ １９８５）　）。プロティンＣ１■因子、■因子、Ｘ因子、及びプロトロンビン は、通常肝臓に存在する特異的酵素によって各タンパク質の７−カルボキシグル タミン酸ドメインのグルタミン酸残基がγ−カルボキシル化されて、翻訳後に修 飾されるという点で類似している。これらのタンパク質はかかる修飾を受けない 限り不活性である。例えばヒト■因子をコードする遺伝子でマウス繊維芽細胞Ｌ ｔｋ細胞を形質転換することに関して（Ａｎｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ　３１５． ８Ｈ頁（１９８５）　）　、著者らは以下のように述べている。

「１つの細胞系統が詳細に特徴付けられて、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫固相測定法； ｅｎｚｙｇｅ−１１ｎｋｅｄ　１ａ＋ｇｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）で 検出可能ななヒト■因子を分泌したが、分泌された■因子は硫酸バリウムに吸収 されなかった。・・・このように、発現プラスミドはタンパク質産生に機能して いることが証明された。しかしながら予想゛されたように、このマウス繊維芽細 胞の系統は生物学的活性に必要とされるヒト■因子のＮ末端グルタミル残基のγ −カルボキシル化に必要な酵素を欠いている。」 著者らは同じプラスミドをラット肝がん細胞系統Ｈ４−１１−Ｅ−Ｃ３中に形質 転換させたところ、γ−カルボキシル化機能性■因子が産生じたと報告している 。

ヒートプロティンＣをコードする遺伝子が単離、クローン化、及び配列決定され ている（　Ｆｏｓｔｅｒ他、Ｐｒ０ｅ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ　８２　、　４６７３頁（１９ε５）　、Ｂｅｃｋｍ ａｎｎ他、Ｎａｃ　。

Ａｃａｄ、Ｒｅｓ、　１８．５０３　（１９８５）　）　ｏ活性型タンパク質が ヒト肝がん細胞（ＨＥＰＧ−２）細胞系統中（Ｌｉｔｔｌｅ他、１９８５年、第 １０回インターナショナル・コングレスΦオン・トロンボシス・アンド・ヘモス タシス、要旨集０９８９）　、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ） 細胞系統中（Ｌ１ｔｔ＋ｅ他、１９８５年、第１Ｏ回インターナショナル・コン で、４３％のタンパク質が活性であると報告されている。

トロンビンによるインビトロでのプロティンＣチモーゲンの活性化は１０年以上 も前の文献に記載されている（Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６５８２４−５８ ２１頁（１９７７）　）　、　しかしながら、この活性化に関する実験条件に対 しては余り注意が払われなかった。ある文献の著者は比較的低イオン強度化で活 性化を行っているが（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６４７６１−７６９頁（１ ９７９）　）　、別の文献の著者は、恐らくトロンビン活性が塩で刺激されるこ とを示唆した文献（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２０２６３−７５頁（１９８０）　）に応 じたものと思われるが、イオン強度を１１００−１５０ｉ　ＮａＣｊ２まで増加 させている（Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８８５８１Ｊ５３４頁（１９Ｈ） ）。これらの塩に関する条件は、可溶性トロンビンとセファロースビーズに結合 したトロンビンとを（ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ　４５４１３−４ １９頁（１９８７）　）　、或いはトロンボモデニリンとの複合体を形成したト ロンビンと内皮細胞上に見い出されるトロンビンレセプターとを（Ｊ、Ｃｌ１ｎ 。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７３９Ｈ−９７２頁（１９８４））識別するために変化させて はいない。さらに、最近報告されたヘビ毒抽出物による組換えプロティンＣチモ ーゲンの活性化（Ｔｈｒｏ■ｂｏｓ　ｉ　５ＲｅｓｅａｒＣｈ　４７８５−９１ 頁（１９８７）　）は低塩濃度でのトロンビン活性化の半分しかもたらさなかっ た。本発明の目的の一つは、活性化の改良方法を提供することである。

本発明の概要 本発明は、一般的には、真核生物（好ましくは哺乳類）のメタロチオネインプロ モーターの転写制御下にヒトプロティンＣを巳−ドするＤＮＡ配列を含むベクタ ーにしてウシ乳頭腫ウィルスの形質転換領域６９％以上をさらに含むベクターを 供し、該ベクターで真核生物のホスト細胞をトランスフェクションさせ、トラン スフェクションさせた細胞を担体粒子に付着させ、担体粒子に結合させた細胞を 培地中で培養して組換えプロティンＣを生産させ、該培地又は該細胞から該組換 えプロティンＣを単離することを特徴とする組換えヒトプロティンＣを製造する 方法に関する。

本発明の上記の特徴は、ミクロ担体培養と組合せて用いた発現系が、ａ織培養に おける同一発現系で生産した時の活性よりもかなり高い生物学的活性を存するプ ロティンＣを生産するという我々の発明に基づく。プロティンＣチモーゲンを活 性化型のプロティンＣに活性化する改良方法はこの発見に関連したものである。

好ましい哺乳類細胞は鰯歯動物（例えばラット又はマウス）の細胞、例えばマウ スＣ１２７細胞、マウス骨髄腫細胞、及びラット肝癌細胞である。Ｃ１２７細胞 は、それが容品にトラスフェクション及び培養できるという点、及び選択しなく ても高いコピー数（細胞当り１００コピーを超える）でプロティンＣ含有プラス ミドを維持することができるという点で特に存利である。

本発明の好ましいベクターは、ＤＮＡ（ゲノム又はｃＤＮＡ）及びウシ乳頭腫ウ ィルス（ＢＰＶ）ゲノム（ｎｏνＩｅｙ他の米国特許第４４１９４８５号に記載 、その内容は引用によって本明細書に取り込まれる）の形質転換領域の６９％以 上、より好ましくはそのゲノム全体を含む。好ましくは、プロティンＣをコード するＤＮＡの下流にはＳＶ４０のＤＮＡフラグメント、好ましくはポリアデニル 化部位が存在する。

以下でより詳細にべろように、本発明の一つの実施態様における組換え細胞によ って産生されるプロティンＣは、−４番目の位置にアルギニン残基を有する点で 天然に存在する分子とは異なっており、かかる修飾を行うとプロセッシングに幾 分かの改良が見られ、かつ哺乳類細胞中での発現の増加が観察された。本発明の 別の好ましい実施態様は、この修飾に関連させて、−５番目の位置のアルギニン をグルタミン酸で置換したものである。

本明細書中で用いる「組換えプロティンＣ」という用語は酵素の活性化型のみな らず不活性なプロティンＣ前駆体をも指すものである。プロティンＣは細胞内で １本鎖として合成された後、インビボにて４つの部位で切断される。グリシン残 基とスレオニン残基との間の第１の切断によって、細胞内の区画への輸送に必要 とされるシグナルペプチドが除去される。アルギニン残基とアラニン残基との間 の第２の切断によってγ−カルボキシラーゼ系によるタンパク質認識に必要とさ れる「プロペプチド」片が除去される。アルギニン残基とリジン残基との間の第 ３の切断によって、ジスルフィド結合で結合した重鎮（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）が 生じる。完全に活性化された酵素を生じる第４の切断はＨ鎖のＮ末端から１２個 のアミノ酸セグメントを切り取る。実際に起こっているかどうかは現在のところ 不明であるが、酵素の活性化はさらに別の切断をもたらす可能性がある。この１ ５６番目のアミノ酸（リジン）及び１５７番目のアミノ酸（アルギニン）を切り 取る切断は、成熟型２本鎖ウシプロティンＣの場合と同様に、カルボキシ末端の アミノ酸としてロイシンを与える。簡略化のため、第３図は１５６番目と１５７ 番目のアミノ酸の存在を示して描かれている。

我々の作製したある組換えプロティンＣ（「新型」プロティンＣと名付だ、下記 参照）の場合、精製画分中に存在するプロティンＣは第４の切断を受けているに もかかわらず第３の切断は受けておらず、天然に存在する活性プロティンＣとは 構造的に区別される生物学的に活−性な２本鎖分子を形成することを、我々は発 見した。

本発明は以下でより詳細に述べるように、医療用として有用な生物学的に活性な γ−カルボキシル化プロティンＣを供する。好ましくは、本発明の組換えプロテ ィンＣは９５１１量％よりも高い純度、より好ましくは９８重量％よりも高い純 度にある。

プロティンＣチモーゲンの完全な活性化は、理想的にはセファロースビーズに結 合させたトロンビンにより低イオン強度下においてのみ得られることを我々は発 見した。予想もしなかったが、このときの活性は、従来受は入れられて来た１０ ０−１５０ｍＭ　ＮａＣｆの条件下で観察される活性の２倍であった。

本発明の他の特徴や利点は、以下の好ましい実施態様の説明、並びに請求の範囲 から明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は２つのヒトプロティンＣのｃＤＮＡクローンを図示したものである。

第２図は上記クローンの１つの５′末端配列である。

第３図は組換えプロティンＣのプロセッシングを説明する図である。

第４図及び第５図は中間ベクターＰｒｏＣ−５及びＢＰｖ発現ベクターの構築法 を図示したものである。

６図はプロティンＣの濃度と凝血時間との間の関係をグラフで示したものである 。

７図はヘビ毒とトロンビン−セファロースビーズ活性化とを比較したものである 。

詳細な説明及び最良の態様 一般的方法 以下に述べる手順において、先ず成熟型プロティンＣの一部に対して作製したオ リゴヌクレオチドとハイブリッド形成するクローンから、ヒトプロティンＣの一 部をコードするｃＤＮＡ配列を単離した。次にこのクローンから得たフラグメン トを、全タンパク質をコードするｃＤＮ＾配列を含んだクローンの同定用第２プ ローブとして用いた。その発現ベクターへの挿入を促進するため、完全ｃＤＮＡ をインビトロ突然変異誘発によって修飾して５′末端のスプライシングされてい ないイントロンを除去した。これらのステップを以下でより詳細に説明する。

プロティンＣに対するｃＤＮＡ 第１図を参照すると、ｐＡ１２３は哺乳類細胞中でのプロティンＣ発現用の発現 ベクター中に挿入するために処理されたプラスミドである。プラスミドｐＡ１２ ３は全プロティンＣコード領域（第１図の太線部分）を含み、さらにＮ末端イン トロン（これは以下で説明するようにして除去された）をも含む。第１図にはｐ Ａ４６も示しであるが、これは以下で述べるように、ｐＡ１２３を得るために用 いた３５０塩基対（ｂｐ）のプローブを与えるｃＤＮＡ含有プラスミドである。

翻訳開始点（、ＡＴＧ（−４２））と成熟型タンパク質の１番目のアミノ酸残基 （Ａｌａ（１））との間の配列は「プレプロ」配列を表わす。第３図を参照する と、プロセッシングの一２５番目の残基と一２４番目の残基との間で切断するこ とを発見した。この第１の切断は「シグナルｊペプチドすなわち「ブレ」ペプチ ドを除去する。第２のプロセッシングによる切断は、未知の機構によって一１番 目の残基と１番目の残基との間で起こり、成熟型り鎖のＡｌａで始まる１本鎖プ ロティンＣをもたらす。さらにプロセッシングされると、プロティンＣは「新型 」プロティンＣと名付けた天然には存在しない活性種を生じるように切断される 。

２つのポリアデニル化及びプロセッシング部位は第１図の３′末端にＰｏ１ｙ（ Ａ）として示した。第２の＾ＴＧ開始部位の上流の、遺伝子の５′末端近くに唯 一のＳｔｕ　１部位が存在する（第２図に示した）。この第２の開始部位は３８ 個のアミノ酸ポリペプチドの出発点を表わし、プロティンＣ遺伝子に対するｃＤ ＮＡ中のスプライシングされていないイントロンの一部によってコードされてい る。

ｐＡ４Ｂは、プロティンＣ配列のアミノ酸６４−７７に対して作製したオリゴヌ クレオチドプローブを用いて、ヒト肝ＭａｃＤＮＡライブラリーから得たプラス ミドクローンである。プロティンＣ遺伝子の５′末端はｐＡ４Ｂを欠いているの で、その３５０塩基対の５’Ｐｓｔ−■フラグメントをｃＤＮＡライブラリーの 再プローブとして用いて、完全なｃＤＮＡクローンｐＡ１２３を得た。

ｃＤＮＡのＡＴＧ開始開始コドン付記列がＸｈｏ　Ｉ部位を与えるように修正さ れていること、並びに修正された配列の上流のＤＮＡが欠失し、ｃＤＮＡクロー ンのイントロンが除去されていることを除いては、前駆体ＰｒｏＣ−３（第４図 ）に類似したＰｒｏＣ−５（第６図）のような発現ベクター中への、プロティン Ｃに対するｃＤＮＡの挿入を促進するために、ｐＡ１２３の誘導体を以下に述べ るようにして作製した。

成人肝臓ｃＤＮＡライブラリー ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＭｉｃｈｅｌｓｏｎ他（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｊ、ｔｌＳＡ　８０４７２頁（１９１１３）　）によ って記載されているような慣用的方法によって構築される。ここで用いた方法は 、塩酸グアニジンの存在下でヒト肝臓をホモジナイズし、次いでオリゴ（ｃｌＴ ）−セルロースに２回通過させることによってポリ（Ａ）　ＲＮＡを単離するこ とを含んでいた。次にｃＤＮＡを胎盤ＲＮアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎｓ バイオチック、ウィスコンシン州、マジソン）の存在下で肝臓＠ＲＮＡから合成 した。４００ヌクレオチドよりも長いｃＤＮＡがアルカリ性ショ糖勾配遠心分離 によつて単離され、２本目の鎖の合成は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ ｔ）　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（ベーリンガーマンハイム ）の存在下に行った。得られた二重鎖ｃＤＮＡを８１ヌクレアーゼ（シグマ）で 処理し、４００塩基対（ｂｐ）より長いサイズの二重鎖ＤＮＡの画分を中性ショ 糖密度勾配中で沈降させて得た。このｃＤＮＡの３′末端にｄｃホモポリマー束 を加え、次にこの３′末端にｄＣをつないだｃＤＮＡを、Ｐｓｔ　Ｉで切断し３ ′末端にｄＧをつないだプラスミドベクターｐＫ７２１ｇ　（Ｔａｌｍａｄｇｅ 他、Ｇｅｎｅ　１２．２３５頁（ＩＨ（１））とハイブリッド形成させ、Ｅ、　 ｃｏ目ＭＣ１０６１株（旧ｃｈｅｌｓｏｎａＰｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８０．４７２頁（１９８３）　）を形質転換させた後でテトラサ イクリン耐性コロニーを選択した。およそ１２００００の独立した組換えクロー ンが元のプレートから得られたが、これらは回収してそれ以上増幅させずにグリ セロールストックとして一７０℃で貯蔵した。

ｃＤＮＡライブラリーからのｐＡ４Ｂとｐ＾１２３の単離オリゴヌクレオチドプ ローブは、標準固相リン酸トリエステル法を用い、プロティンＣのアミノ酸６４ −７７をコードする配列と相補的に作製した。このプローブは５’　ＴＧＡＡＧ ＣＴＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧ 　３’の配列を有していた。

オリゴヌクレオチドプローブと相同のＤＮＡをもつコロニーを同定するために、 ３２Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドを用いてニトロセルロースフィルター（ ミリボア）ＩＡ）ＩＹ）上でスクリーニングした。インキニベーション温度が４ ０℃であるということを除けば、Ｗｏｏｄ　ｓ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　、＾ｃａ ｄ、ｓｃ１．７９：５Ｂ８１頁（１９８２））の記載した方法で、フィルターを 予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成させた。このプローブとハイブリッ ド形成するクローンｐＡ４６を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析によって特徴付 けたところ、Ｆｏｓｔｅｒの上記文献に記載された配列全体に加えて５′末端の ４２ｂｐを含むことが判明した（第１図）。Ｐｓｔ　Ｉクローニング部位と内部 Ｐｓｉ　１部位を用いて５′欠欠失列（第１図）を含む３５０ｂＰフラグメント を単離した。このフラグメントをニックトランスレーションによって標識し、上 記成人ヒト肝＊　ｅＤＮＡライブラリ−のスクリーニング用プローブとして用い た。およそ１２００００のクローンをこのプローブでスクリーニングしたところ 、幾つかの陽性クローンが単離された。単離したクローンの大部分はｐＡ４Ｂと 同一であったが、クローンの１つｐＡ１２３はｐ＾４Ｂよりもかなり大きく、プ ロティンＣを完全にコードする配列に加えて２４３ｂｐの５′不翻訳配列及びＢ Ｏｂｐの３′不翻訳配列を含んでおり、３′不翻訳配列における最初のポリアデ ニル化部位のみ含んでいた。

ＰｒｏＣ−３の構築 プロティンＣｅＤＮＡを発現ベクター中に挿入するために、ユニークな制限酵素 部位をプロティンＣクローンの５′及び３′末端上に導入」５なくてはならなか った。その制限酵素部位、Ｘｈｏｌは自然界では非常に稀で、プロティンＣをコ ードする配列中には存在しない。この制限酵素は形質転換性ＢＰＶウィルスを含 むベクター中に遺伝子を挿入するために以前から用いられていた。プロティンＣ ｃＤＮＡにおける制限酵素部位の種類と分布のために、末端にＸｈｏ　１部位を 導入するには殻つもの工程から成る構築が必要であった。用いた工程は第４図に 示したが、以下のようにして実施した。ｐＡｊ２３を５ｔｕｌ／Ａｖａｌで消化 したが、５ｔｕｌ部位はプロティンＣｅＤＮＡ配列中には一つしかなく　、ＡＴ ＩＩ；から１ａ４ｂｐ上流の５′不翻訳配列中に位置している。＾ｖ　ａ、　１ 部位はＴＡＧ終結コドンから約２５［１ｂｐ上流のｅＤＮＡのコード領域中に位 置している（第１図）。

この５ｔｕｉ／Ａｖａｌフラグメントはアガロースゲルのスライスから電気泳動 的溶出によって精製した。

ｐＡ１２３をＰｓｔｌでも消化してｌ１８０ｂｉ）の７ラグメントを単離した。

このＨＯｂｐフラグメントは、ＡＴＣ開始コドンから５１ｆｌｉｂｐ下流のコー ド領域中のＰｓｉ　１部位、及びＴＡＣ終結コドンから１０ｂｐ下流の３′不翻 訳領域中のＰｓｔ１部位を含む。Ｐｓｔｌ　−Ｐｓｔｌフラグメントをプラスミ ドベクターｐｔｌｃ９のＰｓｔ１部位にクローン化した。キメラｐＵＣ９の雑多 なりローンを単離して、挿入の方向性について試験した。

１つの単離されたクローン、ＰｒｏＣ−１において、Ｐｓｔｌフラグメントの５ ’Ｐｓｔ１部位はプラスミドベクターにおけるＥｅｏＲ１部位の近くに位置して いた。このクローンを！Ｓａａ、Ｉｑ次いでＡｖａｌで消化して、５ｔｕｌ　− Ａｖａｌフラグメントと混合して連結させた。Ａｖａｌプラント末端同士を連結 し、Ｓｔｕ！と５ｅａｌとのプラント末端同士も同様に連結した。得られるキメ ラプラスミド、ＰｒｏＣＪはＩＩＩ所づつしかないＥｅｏＲｌ及び旧ｎｄＩＩＩ 制限酵素部位によって限定されるプロティンＣに対する再構成コード配列を含む 。次項で述べる特定部位の突然変異誘発のために、ＰｒｏＣ−２中のプロティン Ｃコード領域を旧ｎｄｍ　／　ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、Ｍ１３ベク ター％　ａｐｌ＆にクローン化した。このクローンをｍＰｒｏｃ−２と名付けた 。

Ｈｊｎａｍ　／　ＥｅｏＲｉでこのプラスミドの消化し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラ ーゼ１で末端を埋め、そのＤＮＡにＸｈｏｌリンカ−を連結させると、５ｖａａ １部位をＸｈｏ１部位に変えたｐＵｃ９ベクター中にクローン化し得る分子が得 られる。得られたプラスミドＰｒｏＣ−３は大量培養で成育させて＝、　Ｘｈｏ ｌ−プロティンＣ−Ｘｈｏｌ　ＤＮＡフラグメントの材料を提供する。ＰｒｏＣ −３の配列が操作の間にうつかり変わっていないことを確認するために、Ｐｒｏ ｅ−３０Ｘｈｏ１部位及びＡｖａ１部位の周りの配列を決定した。このような配 列分析の結果はこのような変化は何ら起こっていないことを示していた。

ＰｒｏＣ−５の構築 ＰｒｏＣ−５の構築法を第４図及び第５図に示した。プロティンＣのｅＤＮＡの ５′末端を合成オリゴヌクレオチド（オリゴＢ）を用いて変化させた（これは第 ２図に示した配列中の下線部である）。このオリゴヌクレオチドの配列は天然の プロティンＣのｃＤＮ＾配列と一致しない２箇所の塩基対（星印で示す）を含ん でおり、この部分はプロティンＣｅＤＮＡの翻訳開始メチオニンの直ぐ５′側に Ｘｈｏｌ制限酵素部位を提供する。この部位は、ｃＤＮＡクローンＰｒｏＣ−３ の３′末端に導入したＸｈｏ　１部位と共に、ＲＰＶ発現ベクター中へのクロー ン化に適した１本のＸｈｏｌフラグメント上に全プロティンＣコート領域を与え た。この突然変異を達成するために、先ずｆ’ｒｏｅ−２のＥｅｏＲＩ−旧ｎｄ ｍ挿入フラグメントをに、１１３フア一ジベクターｍｐｌａ中にサブクローン化 させた（得られたクローンはｐＵｃ９　ＰｒｏＣ−２クローンと区別するために ｍＰｒｏｃ−２と名付けた。第４図参照）。次にｍＰｒｏｃ−２の一重鎖型を単 離して、以下に示すように、オリゴＢを用いて特定部位突然変異誘発法によりて 塩基対を変化させた。ハイブリッド形成分析によって、突然変異を同定し、クロ ーン（口５’　ＸｈｏＰｒｏＣ−２と命名）が大量に分離された。

ｍＰｒｏｃ−２中にＸｈｏ１部位を導入するために、５ｕＤの一重鎖ｍＰｒｏＣ −２（１００−２００ｎｇ　／　ｕ　１１　）を、Ｌ’ｊｕｌの再蒸留水及び３ ａＤの０．２ＭＴｒｆｉｓ、　ｐＨ１，４，０，１Ｍ　ＭｇＣｆ１．０．５ＮＮ ａＣＤ及び１１０ｆｆ１　Ｄ丁Ｔ中で、５μｇのキナーゼ処理したオリゴＢ（下 記参照、８０ｕｇ／μｇ）でアニールした。混合物を６５℃で６分、３７℃で６ ０分、室温で１０分、次いで次のステップまで０℃でインキュベートした。

ファージＤＮＡの２本目の鎖は５０ｕｇの３０１Ｍ　Ｔｒｆｓ　、　ｐＨ７，５ ，１０ｗＭ　）Ｉｇｃ１！　、　２μＭβ−メルカプトエタノール、１０ｕりの １０ｕＭ　ＡＴＰ、　３　ｕ　ＤのＥ、ｅｏｌｉポリメラーゼ（クレノーフラグ メント）、５μｌ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、（２Ｕ＝８２ ／’ｕＯ）　、２　μｆＪの［ａ　Ｐ］ｄＡＴＰ、及びそれぞれ１Ｍｇの１００ 膠）ｌ　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ％ｄｃＴＰ、　ｄＴＴＰを加えることによ、フて 合成した。室温で１５分間インキュベートした後、混合物をＩＢ”ｃで１晩放置 した。

プライマー及び伸長反応で二重鎖とならないベクターのバックグランドを低下さ せるために、上記伸長１００ｍＭ　Ｔｒｊｓ、ｐＨ７，５，７ｕｌの８１ヌクレ アーゼ（０，５Ｕ／μＩ）及び再蒸留水５５３μｇと混合し、８７℃で１分間イ ンキュベートし、次に６５℃で１０分間インキュベートした。次に、この５１処 理した伸長反応液８５ｍ１を８００ｍ１のコンピテントＪＭｆ０１　（Ｅ、ｃｏ ｌｊ細胞）中に形質転換させた。対照として、Ｓｌによって処理していない伸長 反応液２ｍｌもＪＭＩＯＩ中に形質転換させた。

突然変異体を、Ｓ１処理した伸長反応液からのプラークを含むプレート上でフィ ルターリフトを用いて固定した。オリゴＢを３２Ｐ−ＡＴＰで高い比放射能とな るまで酵素的にリン酸化し、　７５０−Ｍ　ＮａＣ１１％１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　ｐＨ１，２，１０ｄＥＤＴＡ、　５倍デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’ｓ） 液、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ　、及び５０μｇ／μｇＥ 、ｅＯＩｆ　ｔＲＮＡ中におけるハイブリッド形成用プローブとして用いた。フ ィルターは３７℃で４時間予備ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成は、 酵素的にリン酸化されたオリゴＢ　Ｌ、５　Ｘ　１０５ｃＨ／　ｍｌを用い３７ ℃で１晩行ったこと以外は同じ条件の下で行った。ハイブリッド形成後、フィル ターは４２℃、５０℃、５４℃及び最後に５７℃で洗浄した。各洗浄物は０．５ 倍ＳＳＣ中に３０分分間−た。得られたフィルターを３時間オートラジオグラフ ィ分析にかけ、そのオートラジオグラフを培養プレートに１列に並べ、２４個の 潜在的に陽性（すなわちある程度のハイブリッド形成を示す）プラークを選んで ５　ｍｌ培地中で１晩ｓ５’　ＸｈｏＰｒｏＣ−２導入物とＰｒｏＣ−３の導入 ３’　−Ｘｈｏ末端とを、一箇所しかないＮａａ１部位で２つのフラグメントを 切断することによって連結した。

特表千３−５０１９２１　（６） その結果得られたｐＬＩｃ９プラスミド、ＰｒｏＣ−４を単離し、その特性を明 らかにした。一般に行われる新規なベクターの分析の慣例的部分は、構造に用い た全ての制限酵素部位が適切に再生されているかどうかを決定することである。

この場合、ＰｒｏＣ−４の作製に用いたＮａｅ１部位は再生されていなかった。

この問題を修正するために、ＰｒｏＣ−４のＢｇｌ　ＩＩ−旧ｎｄ　ｍフラグメ ントを第５ａ図に示したように、ＰｒｏＣ−３かその同じフラグメントに置き換 えた。Ｎａａ１部位はＰｒｏｃ−３からのフラグメント上に含まれている。最終 的クローンＰｒｏＣ−５はその完全さを確めるために制限酵素地図分析及びＤＮ Ａ配列決定によってチェックした。

ＰｒｏＣ−Ｇｌｎ−Ａｒｇの構築 ビタミンに依存性タンパク質の保存されたプロペプチド配列を比較すると、プロ ティンＣだけがプロペプチド配列の一４位にアルギニン残基をもたない唯一のも のであることが分る。Ｂｅｎｔｌｅｙ他（Ｃｅ１１４５，３４３頁（１９８Ｂ＞ ）は、因子１ｘのプロペプチドの一４″−位にアルギニン残基が存在しないと不 安定なプロ因子中間体を生じるとの仮説を立てた。

このようにプロプロチインＣの適切なプロセッシング（すなわち、哺乳類細胞中 における＋１位での切断ンを促進するために、プロティンＣの４位のイソロイシ ン残基を、後述のような特定部位突然変異誘発法によってアルギニン残基に変え た。さらに、この突然変異は非常にアルギニンの多い配列をもたらすので、−５ 位のアルギニン残基を、再び特定部位突然変異誘発法によってグルタミンに変え た。（多量に分泌されるタンパク質であるブレプロトロンビンは一５位にグルタ ミンを有する）。

これらの変異を以下に示す。

アミノ酸位置　−５−４−３−２−１ 野生型プロテイ、ンＣａｒｇ　ｉｓｏ　ａｒｇ　Ｉｙｓ　ａｒｇＰｒｏＣ−Ｇｌ ｎ−Ａｒｇ　ｇｉｎ　ａｒｇ　ａｒｇ　Ｉｙｓ　ａｒｇこのように変化を加えた タンパク質は野生型のタンパク質よりも良好にプロセッシングされるだけでなく 、より効率的な成熟型タンパクのγ−カルボキシル化を可能にする。

Ｐｒｏｐ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ作製に用いる方法を第５Ｃ図に図示した。プロティン ＣｃＤＮＡのプロペプチド末端に、元のＤＮＡ配列に基づいた合成オリゴヌクレ オチド（オリゴＣ）を用いて変化を加えた。オリゴＣの配列は３’　ＧＧ　ＣＴ Ｇ　ＧＴＴＧＡＣ’ＧＴＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＣＯＧ　５’であ る。この配列は天然のプロティンＣｃＤＮＡと一致しない３塩基対を含んでいる 。この配列を２図に示し３４１−３７２に番号付けられる。この配列はプロティ ンＣにおいて２つのアミノ酸の変化をコードしており、１つは一４位のイソロイ シンをアルギニンにもう１つは一５位のアルギニンをグルタミンにするものであ る。突然変異を行うためにＰｒｏＣ−５の１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−）１１ｎｄ Ｉｎフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ−）ｆｉｎｄ■処理した５ｐｉｌｌに連 結してｍＰｒｏ−５を作製した。　ｍＰｒｏｃ−５の一重鎮型を単離し、上記塩 基対に、オリゴＣを用いた特定部位突然変異誘発法、及びＰｒｏＣ−５の作製に 関する上記方法（すなわちクレノーフラグメント及びＴ４　ＤＮＡリガーゼによ る処理）によって変化を加えた。突然変異はハイブリッド形成分析及び大量に単 離したクローン（ＰｒｏＣ−ＧＩｒ＋−Ａｒｇと名付けた）によって同定した。

ＰｒｏＣの発現ベクターへの挿入 修飾ｃＤＮＡは適当な哺乳類発現ベクター中に挿入させることができる。好まし い発現ベクターは、１９１ｉ５年１０月１日に出願されたＷｅｔ　らの米国特許 出願番号第７８２８８８号、及び）ｌｓｕｉｎｇ他のＪ、Ｍｏ１．ａｎｄ　Ａｐ ｐ、Ｇｅｎｅｔ、２４９７頁（ＩＨ４）に記載されているＢＰＶベクターである 。このベクターは、挿入遺伝子がそこから転写され得るマウスメタロチオネイン プロモーターと、哺乳類細胞のトランスフェクションを効果的にするためのウシ 乳頭腫ウィルスＤＮＡとを含む。ＣＬｌ１３ａｘＢＰＶ（第４ｂ図）は、ＳＶ４ ０から得られる後プロモーターポリアデニル化配列をも含んでいるが、この配列 はプロティンＣの発現を促進し、かつ転写終結配列として機能する。１図示した 発現プラスミドはＥ、ｃｏｌｊプラスミドｐＭＬの一部も含んでいるが、これは 原核生物系と真核生物系との往来を可能にする。ホスト細胞中にこれらのプラス ミドを維持するための選択は必要なく、高いコピー数ｃ　ｉｏｏコピー／細胞の 程度）で維持される。

ＰｒｏＣ−５中でＸｈｏｌリンカ−を連結したプロティンＣ配列は、Ｘｈｏｌに よる消化及び挿入バンドの切断によってアガロースゲルから単離された。このフ ラグメントを次に、第５ｂ図に示したように、２つのＢＰＶベクターのそれぞれ れのＸｈｏ　１部位にクローン化した。これらのベクターを次に、Ｅ、ｅｏｌｉ 　８８１０１株中に形質転換し、大量培養した。

ＤＮＡは哺乳類細胞にトランスフェクションする前にＣｓＣｆ１密度勾配遠心法 によって精製した。発現ベクターットの制限酵素消化によってチェ”／りした。

最終的に作ｒＡＩＩ、たベクターを第４ｂ図に示す。簡略化のために、発現ベク トルの名前はＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶＰＰｒｏＣ及びＣＬＨ３ａｘＢＰＶＰｒｏＣ のそれぞれについてＰＣＭａ及びＰＣ８ｂと省略した。ｒ　ＰＣＪはＰｒｏｔｅ ｉｎ　Ｃの略称であり、「Ｎ１」及びｒＳＪは四ＩｙＡ付加配列の超厚を表わし 、（メタロチオ÷イン（ｈ、ｉ　）叉は５Ｖ４０（Ｓ）、ｒａＪは本明！１１書 中で述べたように、５′　−イントロンの除去されたプロティンＣｅＤＮＡを指 すのに対して、ｒｂＪはスプライシングされていないイントロンを表わす。これ らのベクターの名に先行ｒる追加の文字は、ＤＮＡがトランスフェクトされる細 胞系統を示したものである（すなわち、　Ｃｌ２７に対しでは５日間毎日、２セ ツ！・のＣ１２７細胞へのトランスフェクションを以下のようにして行なつた。

（５日のＰＣＭａのトランスフェクション４２−　］、　００　ｍ＋ａプレート 、及びＰＣ８ａの５つのトランスフェクション４２−１００ｉ＋Ｃ１２７上皮細 胞（市販されている）をｓ　Ｈｓｕｉｎｇ他の上記文献に記載されているような 、１０％ウシ胎児血清（少量のビタミンに１約１μｇ　／　ｍｌ　ｓを含む）、 ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０ａＭグルタミンを添加したようなダ ルベツコ修正イーグル（ＤＭＥ）培地中に維持した。

これらの細胞はエポキシドリ夛りターゼ活性を有するので、産生ずるプロティン Ｃの７−カルボキシル化に関してビタミンＫを再生し、かつ有効に利用すること ができる。元々Ｆａｚａ　９６７から単離され（Ｋｌｌｌａｒｙ他３８、５２３ 頁（ｉ９８４））　、又ビタミンにの存在下で活性プロトロンビンを生じること が既に示されている（　Ｇｒａｖｅｓ他、Ｂｆｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９、２ ６６頁（１９８０））肝カｌｖ　細Ｄｉ　系ａＦＡＯ−１０１Ｐｌ？Ｔ−．　０ ｔｌＡｒ”）　モ＊　タ使用ｔ　６　ｍ　、！：カＴ　キル。エポキシドレダク ターゼ活性をもつ他の鰯歯動物細胞１４例えばＮＩＨ　３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　 ＣＣＬ９２）も使用することができる。この活性のない細胞では培地に大量のビ タミンＫを加える必要があり、タンパク質のγーカルボキシル化は効率が悪く、 生物学的に不活性なプロティンＣを大量に生じる。これらの細胞によるビタミン にの蓄積も起こり、細胞の他の酵素系を阻害する恐れがある。

Ｃ１２７細胞は、ｌｓｕｌｎｇ他の上記文献で修正されたＶ目ｇｅｔ他、Ｃｅ１ ｌ　１１，２２３頁（１９７７）記載の方法に従ッテ、担体としてサケ***細胞 を用い、ｌ０１１５、及び２０μｇの３つの別々のトランスフェクションによっ てＰＣＭｂでトランスフェクトさせた。トランスフェクションさせた翌日、細胞 を培養プレートに分植したが、プレートの幾つかはカバーグラスを含んでいた。

トランスフェクション後３臼目と４　１Ｅ目にカバーグラスを取り出して、プロ ティンＣ抗体で染色した。２つのセットの対照実験を行った。最初の対照は、非 プロティンＣベクターでトランスフェクトさせたＣｌ２７細胞の培養であってカ バーグラス上に分植した。第２の対照は、試験細胞（下記）とは異なってホルム アルデヒド固定後にＮＰ−４０で透過性としていないプロティンＣ感染細胞であ った。対照細胞は免疫螢光が最小か全くなかった。反対に、透過させたプロティ ンＣ感染培養細胞は染色されているのがはっきりと判別できた。

これは恐らくプロティンＣベクターの遇途的発現に起因すると思われる。（４日 目の細胞は３日目の細胞よりも染色度が低かった）。

トランスフェクション後２過目に、トランスフェクトされた細胞コロニーをフィ ルターリフト分析法によってスクリーニングした。多くの陽性コロニーがこの方 法によって同定された。同様に処理された対照細胞はこの分析法では陰性であっ た。フィルター分析法により陽性であった７９のコロニーが採取され、Ｔ−２５ フラスコに移され・１０μｉｔ　／　ｍｌビタミンＫを含有する培地中で培養さ せた０これらのクローンの中で、７２のクローンが培養液上清のＥＬＩＳＡ分析 によってスクリーニングされた◎最良０３１クローンをＴ−７５フラスコに通し た。２４時間の細胞数と産生レベルとを１セツトのフラスコで計測し、他方重複 するＴ−７５フラスコを保持して産生レベルを４８時間毎に検定した。典型的に はＴ−７５フラスコは培地１０ｍ１中におよそ４　Ｘ　１０Ｂ個の細胞を含んで いた。これらの細胞を１０日間検定をした。下の表１は４つの最良の産生細胞系 統を示したもので２４時間につき細胞当り分泌されるプロティンＣ抗原のグラム 数として表わした。下の表２は、培養液”１　ｍｌ当りのｎｇプロティンＣとし て表わした６つの細胞系統の産生レベルを示したものである。表に示されている ように、２つの細胞系統、ＰＣト４’ｅとＰＣＭ−８ｂは常に１μ＆／　ｍｌ　 ／　２４時間（１■／ｆｌ培地／日）を越えるレベルで産生じた。

表　１ プロティンＣ抗原発現細胞系統 Ｐ　ＣＭ　−４ｄ　５．４０Ｘ　ｔｏ”表　２ プロティンＣ抗原発現細胞系統 Ｐ　ＣＭ−４ｅ　２０５８　２２７９ ＰＣＭ−４ｂ　１３１８　２９１ Ｐ　ＣＭ−４３１１４５１０８４ １０８４ＰＣ９７ｇ　測定せず Ｐ　ＣＭ−４ｂ　１２２４　２７ｇ４ ＰＣＭ−４ｄ　７９１　測定せず 組換えプロティンＣの精製 典型的な精製方法は以下の通りである。組換えプロティンＣを含む無血清培地２ ０１にＴｖｅｅｎ　８０を加えて０．０１％とする。次にこの液体をサルトリウ ス・サルドブラン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　５ａｒｔｏｂｒａｎ）　０．５　μＭ 濾過カートリッジを通して濾過し、粒子や残渣を除去して清澄とする。濾過後、 培地のｐ）ｌを１．ＯＭＨｃＤの添加によって５．０に調整する。次に、液体は ５０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｎａ０Ａｃ）、ｐＨ８，０１５０Ｉｌ＋Ｍ　ＮａＣ１ ／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液で予め平衡化しておいた直径５． ０ｃｍ、ベッド容量１００ｍ１のＱ−セファロースファーストフローカラム（フ ァルマシア）にかけた。カラムに流す流速はさほど重要ではないが、通常２０ｍ １Ｚ分である。培地をのせた後、カラムを８−１０ベツド容量の５０ｍＭ酢酸ナ トリウム（Ｎａ０Ａｃ）、ｐＨ７，０１５０ｃＭ　ＮａＣ＃／　０．０１％Ｔｖ ｅｅｎ　８０を含む緩衝液で洗浄した。５００　ｒａＭＮａＣΩ／　０．０１％ Ｔｖｅｅｎ１５０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　ｐＨ７，０の段階的溶出緩衝液をカラム に流し、２０ｍ１の両分を同県した。ピークのプロティンＣ画分は、市販のプロ ティンＣＥＬＩＳＡキット（ダイイグノスタチ力やスターゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃａＳｔａｇｏ））を用いてカラム画分をアッセイすることによって同定した 。ピーク画分をプールした。二〇カラムがらの組換えプロティンＣの回収率は一 般に９５−１００％である。

Ｑ−セファロースカラムからプールした画分をｌ　０ａＮＴｒｉｓ、　ｐＨ８， ０／１０１Ｍ　ＣＡＣＮ　２／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液で１ ：１に稀釈した。この物質は５０ｇＭ　Ｔｒｌｓ−ｐＨ７，５／１５０ｏＭＮａ ＣＪ７　／　５＋ａＭ　Ｃａ（Ｊ！　２／　０．０５７０　Ｔｗｅｅｎ　８０を 含む緩衝液で予め平衡化させておいたイムノアフィニティ力ラムにかけた。イム ノアフィニティ力ラムは、ビーズ１ミリリットル当り抗体５　ｍｇの割合で、標 準手法に従って、ヒトプロティンＣ特異性モノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化 セファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させることによって作製する。モノク ローナル抗体はカルシウム依存性である。すなわち、カルシウムイオン存在下で のみプロティンＣと結合する。抗体は慣用的方法によってつくられる。カラムの 直径は５ｃｌｌ１１で、ベッド容量はプールされたＱ−セファロース画分中のプ ロティンＣ１ｍｇ当りのベッド容量１ｍｌの割合とした。組換えプロティンＣを のせた後、カラムは８−１０ベツド容量の５０ｔａＨＴｒｌｓ、ｐＨ７，５／１ ５０ｍＭ　ＮａＣ１）　１５ｇＭ　（ａｃｆｌ　２１０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８ ０を含む緩衝液で洗浄した。次に、カラムは８−１Ｏベツド容量の５０ｍＭＴｒ ｌｓ、ｐ）１７．５／２．０ＭＮａＣＮ　／　２１ＭＣａＣ４Ｊ　２／　０．（ １１％Ｔｖｅｅｎ　Ｈを含む緩衝液で洗浄する。組換えプロティンＣは、１００ 　ｍＭグリシン／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０　ｐＨ４，０を含む緩衝液を用 いてカラムから溶出させた。カラムからの溶出液は両分に集め１１１０の容量の １．ＯＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝 液を添加して中和したこのカラムからの組換えプロティンＣの回収率は典型的に は８０％である。

約９８％以上の純度を必要とする場合は、上記のように精製したプロティンＣを さらに以下の方法を用いて精製してもよい。イムノアフィニティ力ラムからの組 換えプロティンＣを１００ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　ｐＨ６，０／８０ｉｅＭ　Ｎａ Ｃ１１０，０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液を用いて１：１に稀釈する。次 に、この物質を、５０ｇＭ　Ｎａ０Ａｃ、ｐｎｅ、ｏハ５ｍＭ　ＮａＣΩ／　０ ．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液で予め平衡化した３０ｍ１（ベッド容量 ）、直径２．５　ａｎのＤＥＡＥ−）リスアクリル（ＬＫＢ）カラムにかける。

試料をのせた後カラムを８−１Ｏベツド容量の５０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　ｐＨ６ ，０７１５ｍＭ　ＮａＣ１ｔ　／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液で 洗浄する。次に、組換えプロティンＣを５０＋ｅＭＮａＯＡｃ、　ｐ）１［１， ［ｌ／７５０ｍＭ　ＮａＣ１１／　０．０１％Ｔｖｅｅｎ　８０を含む緩衝液で バッチ溶出した。

このカラムからの組換えプロティンＣの回収率は一般に９５−１００％である。

このようにして得られる組換えプロティンＣは以下のプロトコルから判断すると ９９％以上の純度であった。精製プロティンＣ２，０−２，５μｇを８Ｘｌ。

Ｘ　Ｏ，０８ｃｍの還元性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにのせ、標準Ｌａｅｍ ｍ　Ｉ　Ｉ法によって電気泳動を行った。次に、ゲルを標準クーフシ−ブルー法 によって染色した。次に洗浄したゲルはレーザーデンシトメトリーでスキャンし て組換えプロティンＣ及び不純物バンドを定量した。

組換え物質はプロティンＣの天然のＬ鎖及び２本のＨ鎖のバンドと共に移動する 主要タンパク質を含んでいた。

これらのバンドに加えて、恐らく１本鎖プロティンＣに対応するより高分子量の バンドが存在する。このバンドにおける物質の量は、抗体カラムに流した培地の 量よりもむしろ培地中で発現したプロティンＣのレベルにより密接に対応してい る。同様のゲルのデンシトメーターの記録から、染色された物質の約７０％がこ の高分子量バンドの中に存在することが判明した。

精製した組換えプロティンＣは凝血分析法でその生物学的活性を測定した。この 分析法は、プロティンＣのγ−カルボキシグルタミン酸残基に依存性を有するた めに選択した。プロティンＣの凝血を分析するためのプロトコルは以下で詳細に 述べる。使用する標準物質は、Ｄｒ。

Ｊｏｈａｎ　５ｔｅｎｆｌｏ　（バンド大学（υｎ１ｖｅｒｓ！ｔｙ　ｏｒ　Ｌ ｕｎｄ）、スウェーデン、マルモ）の提供によるこの上なく高度に精製されたヒ トプロティンＣである。

第６図は典型的な標準曲線を示し、表３は標準物質及び組換えプロティンＣ試料 の平均凝血時間を示している。試料＃３はプロタックＣ（ＰｒｏｔａｃＣ）の存 在下及び不存在下の両方で測定した。プロタックＣのない場合には、凝血時間は 緩衝液単独の場合と区別がつかず、このことは試料がプロティンＣ活性化剤によ って活性化され、活性化型のプロティンＣは標準中に存在しないことを示してい る。各試料のプロティンＣ含量についてのＥＬＩＳＡ値を比較した時、＃３及び ＃４がおよそ５０％の生物学的活性を有していたのに対して、＃５は大体７５％ の生物活性を有していた。これらの両分の生物学的活性が異なる理由は不明であ る。これは精製に用いたモノクローナル抗体はＣａ”＋依存性であり、しかもプ ロティンＣにおけるＣａ”＋結合領域の１つはγ−カルボキシグルタミン酸残基 を含むので、十分にγ−カルボキシル化されてい・ないプロティンＣの画分はカ ラムに対する結合新和力が弱く、十分にγ−カルボキシル化された分子よりも早 く溶出するからであるとも考え得る。γ−カルボキシル化の程度と凝血分析法に おける生物学的活性は直接的な関連性がある。

表　３ プロティンＣ依存性凝結試験 平均凝血　プロティンＣ ５１０５，９４ ６１３２，４５ ＃３　（１：　５）　７７．２　９．９（補正値）＃３（１：５）　３７．１　 ０ −プロタック ＃４（１：５）　８８．５　１１．３（補正値）＃５　（１：　５）　５９．９ 　８．２（補正値）ミクロ担体を用いたプロティンＣの製造プロティンＣは以下 のようにしてミクロ担体上で生育させたＣＰＭ−４ｅ細胞から製造した。

マイクロキャリアスピナー（Ｂｅｌｌｅｏ　ＧＩａｓｓ　Ｃｏ、）を洗浄し、空 気乾燥し、シリコン処理しくシグマコート、シグマ・ケミカル・カンパニー）、 乾燥した。次に、スピナーはガラス蒸留水で十分にすすいだ。

サイトデックス３（ファルマシア）不活性高分子ミクロ担体ビーズを各スピナー に加え、次にスピナーはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で最終作業容量の２分の１に まで満【２だ。ビーズは室温で膨潤させ、その後デカントシてＰＢＳで２度すす ぎ、スビ）−容量を最終作業容量の２分の１に戻Ｉ７た。次に７、スピナーにゆ るくふたを１７、オート・りｌノーズにか１．ブるために準偏し１、！２１　’ Ｃで１・・、２時間蒸気滅菌した。室温まで冷却した後、　））ＢＳを最終作業 容ユの２０？６まで捨てで、ＤＭＥ、培地を加えて最終的容量にしｔ、−０得ら れた培地を３７℃で５分間撹拌し、た後、ビーズを沈降させ、その」置端の８０ ％を１０９６ウシ胎児血清を含む新鮮なりＭＥ培地で置き換えた。

集密的回転瓶からのトリグシ〕／処理１、たばかりのＰＣＭ−４ｅ細胞をスピナ ー培地中に加えた（最初の細胞濃度−１−２Ｘ　１０’細胞／ｍｌ）。培地は次 に磁気撹拌器のｊ二に置き（撹拌速度−１リツトル容器について４．５ｒｐｅｉ ）−１細胞を３７℃で増殖させた。接種後３日日から細胞濃度が１．−２Ｘ　１ ０６細胞／ｍｌになるまで２日毎に成育培地の８０９５を新しい培地と取り換え た（細胞は核を計数して数えた）。

次に、培地細胞はビタミンＫ１１ｏμＨ／ｍｌを添加した無ＩＧ−１血清培地で 成育培地を置き換えてプロティンＣ産生期に導いた。この後、培地は２４時間毎 に新鮮な培地と置き換えた。容器の酸素オーバーレイは２０％に維持された。試 料をダイイアグノスチ力・スターゴ・アセ−ラブロチインＣＥＬＩＳＡキットを 用いてプロティンＣ抗原についてアッセイｌ、た。この条件下では、１リツトル スピナーフラスコは６ｍｇ／ｎ／２４時間の平均発現レベルに３０日間保ち得る ことが判明した。培地からビタミンに１を除去するか、酸素オーバーレイを４０ ％に増やすとプロティンＣ産生が減少した。

３つのプロティンＣミクロ担体産物から採取される試料の生物学的活性は以前に 述べられた凝血検定法を用いて測定した。少数の試料が低い（約３０％）生物学 的活性を示したけれども、殆んどの試料が１００％に近い生物学的活性と高いＧ ｌａ含Ｑ（タンパク質１モルにつき５モル）を示した。逆に、ビタミンＫ　、不 存在下にミクロ担体法によフて産生させたプロティンＣは生物学的活性を全く承 さず、Ｇｌａ含量は低かった。ミクロ担体上でなく１１織培養でビタミンＩ（存 在下に増殖させた細胞からのＰＣＭ−４ｅの条件付き培地から分離したプロティ ンＣはＧｌａ含量は高いが生物学的活性は一貫して低かった。

用途 本発明の組換えプロティンＣは、先天的及び後天的ブロチインＣ欠乏症患者の治 療に使用することができる。

現在有効な治療法のない先天的プロティンＣ欠乏症で１６．０００人に１人が苦 しんでおり、そのうちの７５％が２５才から３５才に発病する再発性の血栓崩壊 を経験している。

後天的プロティンＣ欠乏症はビタミンに欠乏症、肝臓疾患、散在住血管内凝固（ 血栓が全身にできる状態）である人に起り、又は術後期に起ることもある。股関 節を手術した患者は、米国では１年に１８７，０００名に上るが、しばしば手術 後大体５日間はプロティンＣレベルが減少した。この術後期の間、これらの患者 は深部静脈血栓症の危険性が高く、プロティンＣを正常レベルに戻すとこの危険 性が低くなると期待される。

プロティンＣの別の治療への応用は、線維素溶解剤、特に組織プラスミノーゲン 活性化因子（ＴＰＡ）への補助療法としてである。プロティンＣとＴＰＡとの同 時投与は必要とされるＴＰＡレベルを減らし、従って、心臓血管系患者の対偶効 率のより高い治療法が得られると期待される。

本発明のプロティンＣは薬学的に受容できる担体物質、例えば塩類と混合され経 口的、静脈内或いは患部組織への注入によって投与される。プロティンＣ欠乏症 （血中プロティンＣの正常値の５０％未満と定義）の治療に関しては、少なくと も１，５　ミリ当量／　ｍｌまで血中レベルが上るような十分なプロティンＣを 投与する（３ミリ当量／　ｍｌが正常である）。一般に平均的な成人でプロティ ンＣを約１０−１００ｍｇ、最も好ましくは約６０ｍｇ投与する必要がある。

プロティンＣのまた別の可能性を有する用途としては、インビトロでの抗凝血剤 としての用途がある。

現在、採血された血液はクエン酸ナトリウムかＥＤＴＡで抗凝血化される。この 血液を大量輸血するとクエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡが毒として作用すること がある。天然物質であるプロティンＣはこのような毒作用をもたないと考えられ る。

第２、同じような用途は手術中の「再循還」血液の場合である。手術中に腹部及 び胸部で通常失われる血液は機械に吸引され、そこで洗浄されて、患者に再投与 される。この血液はクエン酸ナトリウムやＥＤＴＡで抗凝血化され、長い手術の 間患者は毒作用を受けなければならない。このような血液を抗凝結化するため、 クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡに代えて活性型のプロティンＣを用いると、患 者がこのような毒作用を受け−るのを防ぐことができる。

寄託 ベクターＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶＰＲＯＣは、１９８６年７月２４日にＥ、Ｃｏ１ １株中で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ５ン（ＡＴＣＣ）、メリ ーランド州、ロックビルに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６７Ｌ６４とされた。

プロティンＣのユニークな特性 ベクターＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶＰＲＯＣ”ｉ’形質転換されり０１２７ホスト細 胞で産生されるプロティンＣは炭水化物部分の中にα−１−３ガラクト一ス結合 を含み、その結合は、ヒト免疫グロブリンとのその反応性によって照明されるよ うに、ヒト血液型Ｂ決定因子と類似している。この結合は、通常免疫グロブリン に存在すると考えられる免疫反応性の増加による霊長類におけるインビボ半減期 の増加のような追加の生物学的特性をプロティンＣ分子に与えている。同一のプ ロティンＣｃＤＮＡ配列を組込んだ適当なベクターで形質転換したＣＨＯ細胞は 、α−１−３がラクトース結合を有するプロティンＣを産生せず、それに伴った 生物学的利点をもったプロティンＣを産生じない。

プロティンＣ凝血検定プロトコル 組換えプロティンＣの生物学的活性を測定するために現在用いられているプロト コルを以下に示す。

材料： １、抗凝固Ｃ活性剤（Ａｓｅｒｌｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、 ）　−この試薬はマムシ毒から得られるプロティンＣ活性剤であるＰＩ？０ＴＡ ＣＣを含み、これはＡＰＴＴ試薬と共に共凍結乾傑する。

２、プロティンＣ欠乏血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ。

Ｉｎｃ、）−凍結乾燥標品 ３、正常ヒト血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、） −凍結乾燥。プロティンＣ抗原は、プールされた正常なヒト血漿標品を１００％ として用いて免疫電気拡散（Ｌａｕｒｅｌｌロケット法）によって測定した。

４、イミダゾール−緩衝溶液、１０倍濃縮物（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓ ｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、）５、ウシ血清アルブミン（シグマ＃　Ａ　−７６３８） ６、０．０２５）Ｉ塩化化成ルシウム溶液７　Ｃｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ　ＸＣ（ Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　−自動化写真光 学的凝血装置。

アッセイプロトコル １、抗凝固Ｃ活性剤を１．５ｍｌの精製水で再構成する。

２、プロティンＣ欠乏血漿を１．５ｍｌの精製水で再構成する。完全に再構成す るためには使用前に室温に１５分間血漿を置く。使用まで氷上で貯蔵する。

３、正常ヒト血漿を０．５ｍｌの精製水で再構成する。完全に再構成するために は使用前に室温に１５分間血漿を置く。使用まで氷上に貯蔵する。

４、装置の電源を入れてＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｄｅ　Ｘｃ装置に以下のようなアッ セイパラメーターを導入した。

テスト：　ＡＰＴＴ　空白時間：２０秒ポンプ１ｖｏｌ　ニア５μＪｌ　活性化 時間：３００秒ポンプ２ｖｏｌニア５μｇ　最大凝血検出時間＝１５０秒５、精 製水で１０倍濃縮物を稀釈することによって緩衝液を調製し、１倍溶液を得て、 １　ｇｇ　／　ｍｌの濃度までＢＳＡを溶解する。この溶液は予め用意しておき 、４℃で２週間も貯蔵する。

６、再構成したヒト血漿から血漿プロティンＣ標準液（推定濃度３μｇプロティ ンＣ）を以下のようにして調製する。

−８００ｎｇ／　ｍｌプロティンＣを含有する貯蔵溶液は、１．２ｍｌイミダゾ ール−ＢＳＡ緩衝液で正常ヒト血漿８（１０ｇｇを稀釈することによって調製す る。

残る標準溶液は貯蔵溶液から調製した。

Ｏｎｇ１０＋１　−　２００ｇｇ ｔｌｉＯｎｇ／ｍｌ　５０μｊ２　４５０μＤ１２０　ｎｇ／ｍｌ　１００μｉ ｆ　４００μｆ１２４０　ｎｇ／ｍｌ　２００ｇｇ　３００μｌ１１３６０　ｎ ｇ／ｍ１　３００μ０　２００μＤ４８０　ｎｇ／ｍｌ　４００ｕ　ｆｌ　１０ ０μｍ７、抗凝血Ｃ活性他剤及塩化カルシウムの試薬貯蔵器を各々第１及び第２ 分配ポンプにつないで操作のためのＣＯａｇ−Ａ−）ｌａｔｅを調製する。管に 液体を流し気泡をすべて除いたことを確認する。実験を行う前に気泡について管 をチェックし必要ならば管に液体を入れ直す。

８、検定トレーの適当なウェルに以下の試薬をピペットで入れて標準液／試料の 凝血時間を検定する（２通り）ニ ア５μｐプロティンＣ欠乏血漿 ＋７５μｇ標準液又は試料 各検定トレーは１２個の試料ウェルをもつ。

９、検定トレーを装置に置き、反応を開始させる。検定の残りは自動的に行われ 、次の順序に従うニア５μｇ抗凝血Ｃ活性剤 ３７℃で５分インキュベートする ＋７５μΩ塩化カルシウム（（１，０２５Ｍ）凝血時間を測定する。

１０、試料中のプロティンＣの濃度は、２次方程式に基づくデータを計算して、 曲線にフィツトさせるコンピュータプログラムを用いて標準から決定した（［プ ロティンＣ〕−ＡＸ　Ｃ１ｉ血時間３２＋Ｂｘ　［凝血時間〕＋Ｃ）。

方程式に対するデータの相関係数は一般に０．９８より大きく、データ変換に関 連した誤差を減じている。

検定実施： 検定の実施は内部対照として役立ち、全ての検定に含まれる精製プロティンＣ標 品によってモニターする。

内部検定変動性（ｎ　−２８）は現在的１０％の変動係数をもつ。内部対照に関 する検定の精度（ｎ　−１１）は変動係数は１０９６以下である。既知の比活性 をもつ標準プロティンＣ標品がないことから検定のゆ力Ｃみは知られていない。

プロティンＣアミド分解法 Ａ、試薬及び緩衝液 １、サンプル稀釈緩衝液： ５倍ストック：　Ｄ、２５Ｍ　Ｔｒｌｓ　Ｃ，ｌ！　、ｐ）１ｇ、０；　０．５ Ｎ　ＣａＣ（１０，５％ＢＳＡ　、新鮮なストックを無菌濾過し、４℃で貯蔵す る。

作業：５倍ストックを再蒸留水で１：５に稀釈する。

緩衝液１００μＮ当りＴｈｒｏｖｅ　５ｔｏｐ　４μＥｌを加える。

２、イミダゾール緩衝液： 溶液Ａ　：　Ｔｒｌｓ３．０３グラム；イミダゾール１．７グラム；蒸留水１． ＯＯｍ＋中にＩＮＨＣＦ　５０ｍ１゜溶液Ｂ　：　Ｔｒｌｓ４．０４グラム；イ ミダゾール２．２７グラム：蒸留水１００ｍ１中にＮａＣ！１１．９５グラム。

ＹＯ倍作業：２５℃でｐ、１１８．４の溶液２００　ｍｌを得るために溶液Ａど 溶液Ｂを混ぜる。濃縮液を得るためにＮａＣ１２３，４グラムを２００ｍ１の溶 液に加える。イオン強度−３，０゜４℃で貯蔵する。

ｎｌ！Ｊ：、を惠Ｍ　：　１ｏ倍濃縮物の水における！　−０，３：　１／１． ０稀釈。

３、　Ｔｈｒｏｗ　Ｓｔ、ｏｐ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉ、ａｇｎｏｓｔｉｅ ａ＞　ｏ水工ｍｌ中に１ボトル（１，０ｇ店ｏｌｅ）　７ｉｇ取り出し、３週間 まで４℃で貯蔵する。

４、　Ｓｐｅｃｌｒｏｚｙｍｅ　ＰＣａ　（＾ｒＤｅｒｌｅａｎ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｌｅａ）。水２６５ｍ１中に１ボトル（１，０ｇモル）を取り出し３週間ま で冷凍し、て保存するか或いは数カ月間分υｊし、凍結する（度々ではない）。

Ｉう　、　手　順 １、活性化プロティンＣのストックを基１′−４稀釈用緩衝液中で稀釈しｓ　５ 　ｍ　’Ｃ１／　ｍｌのストックをつくる。

２、５　ｍＵ／ｍｌのストックを用いて１乃至４０ｔｎＬｌ／ウエルの標準曲線 をつくる（′１つのウェル当り１υｕＯを添加させると仮定）。使用するまで氷 の上に保存する。

３．９６のウェルを有する柔軟なＦａｌｅｌプレートを用意し、各ウェルに以下 のものを添加する。

８０μＪ７１−ＯＪイミダゾール緩衝液標準又は試料　１０ｇｇ ｓｐｅｃｔｒｏｚｙＩＩｅ　ＰＣａ　１０ｇｇ４．３７℃で３０分間インキュベ ートする。

５、氷酢酸２０μｇを用いて反応を停止させる８、　４０５ｇｍで吸収を読み取 る トロンビンビーズ検定 トロンビン−セファ０−スビーズ： 固定化したトロンビンは、製造業者の指示に従って精製したウシトロンビン（シ グマＴ　７５１３．２１９［ｉＵ　／　ＩＩｌｇ）をＣＮＢｒ−活性化セファロ ース４Ｂ（ファルマシア）に結合することによって作成した。

未反応部位をブロックするためにエタノールアミンを用いたタンパク質の定量的 結合が得られた。活性トロンビンの収率は下記のトロンビン検定法によって測定 したところ１↓也均３３−４０％であ・フた。結合したビーズの活性は固定化し たビーズの８Ｏ−１２０Ｕ　／　ｍｌの範囲内であった。

アミド分解検定 名反応は１．５ｍｌのエッペンドルフ遠心チューブ中で行う。トロンビン（シグ マＴ　７５１８）をクエン酸塩５０ｍＭ、　ｐ＋（８，５，／ＮａＣｌ　１５０ ｇＭ／Ｔｖｅｅｎ　８０　Ｑ、０１％中で０．ＩＵ／ｍｌに稀釈する。ビ・−ズ スラリ−（固定化ビーズ１ｍｌにつき緩衝液１ｍ１）を一般に４００分の１に稀 釈されるｏ　ＳｐｅｅｔｒｏｚｙｍｅＴｌ（（、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｌａｇｎ ｏｓｔｌｅａ）は１バイアル当り１ｍｌの再蒸留水中に懸濁させる。

標準曲線 ０　５Ｑａｌ　Ｏμｍ２００μｇ　５０Ｂｇ１　５０μｍ　１０Ｂｇ１９０μｍ １５０μｇ３５０μｍ　３０μ４７　１７０μｍ　５０ｕｇＢ　５０μｊ！６０ μＪ７　１４０μｆ１５０μ１１０　５０ｕ　１　１００ｕ　ＩＩ　１００ｕρ 　５０μρｅａｄｓ ５０ｕｇ２５μ９　１７５μ！Ｊ５０Ｂｇ５０μｆ１５０μＮ　１５０Ｂｆ１５ ０ｕｇ３７℃で撹拌しながら３０分間インキュベートする。反応は氷酢酸２０μ ｐを加えて停止させる。スピンビーズはエツペンドルフ微量遠心器中で１分間沈 降させる。２５０ｕｌを取って４０５■の分光光度計中で測定する。ビーズ上の トロンビン活性を可溶性トロンビンと比較する。

プロティンＣ活性化 精製又は部分精製したプロティンＣチモーゲンを５ｍＷ　Ｔｒｌｓ−Ｈｃｌ　（ ｐＨ８，３、範囲一　ｐＨ７，ＤＪ、５）　；　１　ｍＭ　ＥＧＴＡを含む緩衝 液１００倍容量に対して透析する。プロティンＣ試料の塩含量を低くするため透 析用緩衝液を新しく緩衝液と１回取り換える。

トロンビン−セファロースビーズは製造業者（ファルマシア）から入手できる「 ハンドブック・オブ・アフィニティ・クロマトグラフィ」に記載されているよう に、湿潤状態で充填したＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）１ ｍｌ当りト。ンビン（シグマ）２５ｏユニツトを結合することによって作成した 。トロンビン−セファロースビーズは、湿潤状態で充填したビーズ１　ｍＭ当り 緩衝液１　ｍｌの割合で５０ｍＭクエン酸ナトリウムＣｐＨ６，５）　；１５０ 　ｔａＭ　ＮａＣｌ及び０．０１％Ｔｖｅｅｎ８０を含む緩衝液中に４０”Ｃで 保存した（長期間保存する場合には０．０５％アジ化ナトリウムを緩衝液に加え る）。ビーズに結合したトロンビン活性の単位（ユニット）は、合成基質み製造 業者記載しているように、合成色素生成基質、ＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅＴ）Ｉ（ Ａｇｅｒｆｃａｎ　Ｄｊａｇｎｏｓｔｌｃａ）を用いて決定された。一般に、ビ ード上でのトロンビン活性の回収率は３０−６０％であった。

プロティンＣチモーゲンの活性化は約１（ｌ乃至１０００μｇのプロティンＣ濃 度及び１ｍｌ当り約１乃至２ｏユニツトのトロンビン濃度で有利に行われた。１ 価カチオン濃度（例えば、Ｎａ”、Ｋ”）は５ｏ■Ｈ以下に保つのが理想的で、 インキュベーションは３７℃で２〜６時間で行った。

第７図は蛇毒活性化及び本発明のトロンビン−セファローズビーズによって活性 化される２つの標品ＡＢ８．ＡＢ９（ＡとＢおのおの２回試験した）の結果を比 較する。発明の利点は一目瞭然である。

ポリプロピレン製スクリューキャップ管に下記のものを加えた。５倍活性化用緩 衝液２００　ｕｎ　（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪＩ！　、ｐ）ｌ　；　８． ４．０．０５％Ｔｗｅｅｍ８０）　；　５０ＢＭ　ＥｃＴＡ２０　ｕ　１ニトロ ンビン−セファロ−ススラリ−１２５μｆ！（スラリー−１ｍ１充填ビーズに対 して１３ｍ１緩衝液）：透析したプロティンＣチモーゲン１．０ａｇ　；及び最 終容量が１．０ｍｌとなるように蒸留脱イオン水。

管をしっかりとふたをし、絶えず撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートし た。インキユベートした後、トロンビンビーズは臨床用遠心機で５分間遠心して 除いた。活性化されたプロティンＣ上清は静かにデカントし、ＥＬＩＳＡ（Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｆｃａ　Ｓｔａｇｏ）によるアッセイ、及びプランフォードタンパ ク質アッセイ（Ｂｒａｎｄｆ’ｏｒｄ、Ｍ：Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｂｅｍ　７２．２４Ｂ頁（１９７Ｂ）によってタンパク質濃度について 、また前記のようにアミド分解及び凝血検定における活性について測定した。

以下の結果が得られたニ プロティンＣ活性化 試験１　試験２　試験３ 天然９Ｃ’　９８Ｂ　＋１５３４４８　＋４０　４５０　＋４７日数３　ＰＢＳ ２４７０±８５　３４８±６８　２２５±４５日数３　０Ｃ３３４７１±３５　 ３４５±２８　２８０±７４試験４　試験５ 天然　ｐＣ１１４１±１０　１０９７±３１２日数３　ＦＢ９２８７９　±１１ ３　４２９±２４日数３　ＤＯ８３８４９±１１２　４６８　±５１１、冷却沈 殿した正常な貯蔵血漿から免疫精製された。

２、前記の寄託ベクターで形質転換されたＣ１２７細胞のから精製し、１０％ウ シ胎児血清を成長期の間に与えた。

３８前記の寄託ベクターで転換されたＣ１２７細胞の５０１１マルビシ醗酵器で つくられる３日目の条件培地から精製し、１０％ドナー小ウシ血清を成長期の間 に与えた。

プロティンＣに対するー’ＨＤ標準規格８８ノロ２２は定義によるとり、８１１ Ｕ／ｍｌをもち、３μｇプロティンＣ／　ｍｌ血漿の　−の平均をとると、２７ ３１０．／ａｇに相当し、全ての場合に本発明の組換えプロティンＣよりも相当 低い。

Ｆ工ＣＩＪＲＥ　２ ｒｃｒｃｃＡｃｃｒｃｃｍｃｒａ。ｃｃａｃｃｃａｃｒｃ７ｃａｃｃｒｃａｃｃ ｃｃｃａｃｃｒａｃａｃｃｃｃｃｃａｃｃｃｃ云ＩＧ　３ａ ＩＧ　３ｂ ｉＧ　３ａ ＦＩＧ　５ｂ ＦＩＧ　５ｃ ＦＩＧ　６ ＦＩＧ　７ 手続補正書輸発） 平成２年９月７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．精製プロテインＣの生物学的活性の５０％以上、もしくはプロテインＣに関 する世界保健機関（ＷＨＯ）の標準規格（８６／６２２）の活性の約１００％以 上、の活性を有する組換えヒトプロテインＣを製造する方法にして、（ａ）真核 生物のメロチオネインプロモーターの転写制御下にヒトプロテインＣをコードす るＤＮＡ配列を含むベクターにして、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換領域の６９ ％以上をさらに含むベクター、を供する工程、（ｂ）上記ベクターで真核生物の ホスト細胞をトランスフェクションさせる工程、 （ｃ）上記のトランスフェクションさせた細胞を担体粒子に付着させる工程、 （ｄ）上記の担体粒子に結合させた細胞をビタミンＫ添加培地中で培養して上記 組換えプロテインＣを生産させる工程、及び （ｅ）上記培地又は上記細胞から上記組換えプロテインＣを単離する工程、 を含む方法。 ２．前記ベクターが前記ウシ乳頭腫ウィルスのゲノム全体を含む、請求項１記載 の方法。 ３．前記担体粒子が不活性高分子ビームである、請求項１記載の方法。 ４．前記培養が、前記細胞に約４０％未満のレベルで酸素を送ることを含む、請 求項１記載の方法。５．前記担体粒子に結合させた細胞を前記培養時に撹拌して 細胞を浮游状態に保つ、請求項１記載の方法。 ６．前記ベクターが前記ヒトプロテインＣをコードするＤＮＡのＣ末端コード端 と前記ウシ乳頭腫ウィルスゲノムＤＮＡとの間にＳＶ４０ＤＮＡの断片を含む、 請求項５記載の方法。 ７．前記ＳＶ４０ＤＮＡの断片が前記ヒトプロテインＣをコードするＤＮＡの発 現に関するポリアデニル化部位を含む、請求項６記載の方法。 ８．工程（ｅ）で単離されたプロテインＣを、１価カチオン濃度が約５０ｍＭ未 満の条件下に、ビーズに結合したトロンビンで活性化する工程をさらに含む、請 求項１記載の方法。 ９．前記真核生物のホスト細胞がＣ１２７細胞である、請求項１記載の方法。 １０．請求項１記載の方法で発現させた組換えヒトプロテインＣ。 １１．請求項９記載の方法で発現させた組換えヒトプロテインＣ。 １２．−４位にアルギニンを有する組換えプロプロテインＣ。 １３．プロプロテインＣをコードするＤＮＡにして、−４位にアルギニンをコー ドするＤＮＡ。 １４．−５位にグルタミンを有する粗換えプロプロテインＣ。 １５．プロプロテインＣをコードするＤＮＡにして、−４位にグルタミンをコー ドするＤＮＡ。 １６．９５重量％より高い純度にある組換えヒトプロテインＣ。 １７．組換えプロテインＣが９８重量％より高い純度にある、請求項１３記載の 組換えプロテインＣ。 １８．組換えプロテインＣが９８重量％より高い純度にある、請求項１４記載の 組換えプロテインＣ。 １９．請求項１１記載の方法で製造し、α−１−３ガラクトース結合を含む、組 換えプロテインＣ。 ２０．α−１−３ガラクトース結合を含む組換えプロテインＣ。 ２１．天然のヒトブロテインＣよりも長いインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）での半減期 を有する請求項２０記載のタンパク質。 ２２．天然のヒトプロテインＣよりも長いインビボでの半減期を有する組換えプ ロテインＣ。